CN103088009A - 一种多肽及其在小分子调控蛋白积累程度中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽及其在小分子调控蛋白积累程度中的应用。本发明提供了一种多肽，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列7自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质或序列9自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将(a)或(b)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一个新的多肽UbRDDK，其可以与目的蛋白融合，将融合后的蛋白导入拟南芥中，UbRDDK可以大幅降低融合蛋白的背景积累。

Description

一种多肽及其在小分子调控蛋白积累程度中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多肽及其在小分子调控蛋白积累程度中的应用。

背景技术

蛋白质是执行细胞功能的重要组分，从分子水平研究蛋白质的功能是生命科学的核心问题。常用的方法是通过对蛋白质的表达水平造成扰动然后观察细胞后继的表型，从而推测其作用方式。例如，遗传学通过鉴定具有表型的突变体然后通过遗传分析其基因型来研究蛋白质编码基因的功能；反向遗传学的手段则通过RNAi等方法影响特定基因的mRNA转录水平，进而观察表型。这些核酸水平的研究方法具有固有的优势，如特异性高，可在基因组水平靶定单个基因乃至单个核苷酸的序列；简便易行，通过成熟的分子生物学手段即可；而且同样的方法可以用于研究不同种蛋白质的功能。但是这些方法也有局限性，例如：敲除重要的基因会有致死效应；转基因所需时间较长；对于冗余基因，敲除单个基因无可见表型。尤其对于研究蛋白质功能而言，这些方法只能通过间接手段影响蛋白质的合成，无法直接控制蛋白质的功能，而且作用时间长，很难用于鉴定蛋白质的直接作用靶点。

小分子可以与蛋白质结合，调控蛋白质的活性。例如激动剂与特异受体结合后能激发相应生理效应，而拮抗剂可以与激动剂竞争受体结合位点从而抑制激动剂的作用效果。小分子可以非常迅速的调控蛋白质功能，而且作用方式可逆，作用效果可以调节。此外作用方式灵活，通过控制小分子的浓度即可以控制激活或抑制作用效果，方便实现时间上和空间上的可调控性。但是针对目的蛋白筛选小分子耗时且花费不菲，而且针对不同的蛋白质需要重新筛选新的小分子，这使得使用小分子研究蛋白质功能的应用只局限于某些相对成熟的药物及其靶蛋白的研究中。

Banazynski等尝试使用小分子Shield1来调控蛋白质的积累程度(Banaszynski et al.,2006)。通过突变，他们筛选出一种FKBP12的突变体，命名为DD（Destabilized Domain），DD在没有Shield1时是不稳定的，在细胞中的本底积累水平很低。与Shield1结合稳定了DD的构像，使得DD在细胞内积累。通过调控Shield1浓度可以快速、可调节和可逆的控制蛋白质水平。这一系统已经在许多物种中得到应用，例如：哺乳动物，果蝇，酵母，以及原生动物(Armstrong and Goldberg,2007;Herm-

et al.,2007)等等，表明调控DD不稳定性的机制是相当保守的。

在植物领域的研究中，直接作用于蛋白质水平的研究工具还很少有报道。目前已经有人尝试将DD Shield1系统应用于植物领域，却发现DD融合不能够使DD融合蛋白完全降解。在未经Shield1处理时，转基因植物中依然存在较高背景的DD融合蛋白积累。

EGFP是一个被广泛应用的荧光蛋白质，在特定激发光的激发下发出绿色荧光。AvrRpm1是一个由病原菌Pseudomonas syringae分泌至拟南芥细胞内的三型分泌系统型效应蛋白，它会引发RIN4（RPM1-interacting protein4,）的磷酸化。拟南芥细胞中的抗病蛋白RPM1监测到RIN4的修饰（磷酸化），继而引发细胞死亡，即所谓超敏反应（Mackey,et al.,2002）。拟南芥转基因植物中用地塞米松诱导表达avrRPM1会引发依赖于RPM1的细胞死亡（Torneroet al.,2010）。

MYB75是一个拟南芥内源的转录因子，正调节花青素合成途径相关基因表达。过表达MYB75的转基因拟南芥由于花青素的过量积累会导致叶片、茎、根等组织呈现紫色(Borevitzet al.,2000)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多肽。

本发明提供的多肽，是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列2自N末端第1-185位的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列7自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质或序列9自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将(a)或(b)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述（a）为UbRDDK，（b）为UbRDDK-HA。

编码上述多肽的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下(1）-(4）中任一种的DNA分子：

(1）编码区为序列表中序列1自5’末端第1-555位所示的DNA分子；

(2）编码区为序列表中序列6或序列8自5’末端第1-651位所示的DNA分子；

(3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的相关蛋白的DNA分子；

(4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

上述（1）为UbRDDK的编码DNA分子，（2）为UbRDDK-HA的编码DNA分子。

含有上述多肽的融合蛋白也是本发明保护的范围。

上述融合蛋白为上述多肽与目的蛋白融合得到的融合蛋白。

上述融合蛋白中，上述融合为上述多肽的C端与所述目的蛋白N端融合；

所述目的蛋白和对应的所述融合蛋白如下1）-3）中任一种：

1）所述目的蛋白为EGFP蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；

2）所述目的蛋白为AvrRpm1蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列7；

3）所述目的蛋白为MYB75蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列9。

上述多肽、上述DNA分子在调控目的蛋白在生物体内的稳定性中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述调控目的蛋白在生物体内的稳定性为降低目的蛋白在生物体内的累积；

上述降低目的蛋白在生物体内的累积为使导入生物体的外源目的蛋白在生物体内的表达量降低，但不影响外源目的蛋白的编码基因在生物体内的转录量；

所述生物体为植物，所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物。

本发明的另一个目的是提供一种控制目的蛋白在植物体内累积量的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将上述多肽和目的蛋白融合，得到融合蛋白；

2）将所述融合蛋白导入目的植物中，得到转基因植物A；

3）用小分子Shield1处理所述转基因植物A，得到转基因植物B；

所述转基因植物B（处理后）体内目的蛋白的累积量大于所述转基因植物A（处理前）。

上述方法中，所述小分子Shield1处理所述转基因植物A的方法为如下1）或2）或3）：

1）将含有所述小分子Shield1的溶液注射到所述转基因植物A叶片中；

2）将所述转基因植物A在含有所述小分子Shield1的水溶液中浸泡；

3）将含有所述小分子Shield1的溶液喷雾到所述转基因植物A叶片表面；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明的实验证明，本发明发现了一个新的多肽UbRDDK，可以与目的蛋白融合，将融合后的蛋白导入拟南芥中，UbRDDK可以消除融合的目的蛋白的背景积累，UbRDDK融合的目的蛋白的积累依然受Shield1浓度调节，并且UbRDDK与多种蛋白质融合均不影响目的蛋白质正常功能。UbRDDK Shield1系统可应用于拟南芥中蛋白质功能的研究。

附图说明

图1为DD-EGFP、EGFP-DD、DDK-EGFP和UbRDDK-EGFP在转基因拟南芥植物中的背景蛋白积累比较

图2为DD赋予拟南芥中绿色荧光蛋白依赖于Shield1的稳定性

图3为拟南芥中UbRDDK融合蛋白以依赖于Shield1的方式积累

图4为Shield1处理引发转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥的细胞死亡

图5为转DD-AvrRpm1拟南芥和转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥的表型分析

图6为Shield1调控转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥体内花青素含量

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的引物如下表1所示：

表1为实验中使用的引物

引物名称	引物序列
		EGFP-BamHI-for	TTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG
EGFP-SpeI-rev	AATTACTAGTCTTGTACAGCTCGTCCATG
		DD-SpeI-for	AATTACTAGTATGGGAGTGCAGGTGGAAACCATC
DD-NotI-rev	AATTGCGGCCGCTTATTCCGGTTTTAGAAGCTCCACATC
		RDDK-BS-for	TAGGATCCAACCGCGGAGGCCGCGGAGTGCAGGTGGAAACCATC
DDK-NcoI-rev	ATCCATGGCCTTTTCCGGTTTTAGAAGCTCCACATC
		DD-BamHI-for	AATTGGATCCATGGGAGTGCAGGTGGAAACCATC
DDK-NcoI-rev	AATTCCATGGTCTTTTCCGGTTTTAGAAGCTCCAC
		Ub-BglII-for	ATATAGATCTATGCAAATCTTCGTAAAGACCCTGAC
DDK-HA-rev	GAACATCGTATGGGTAGTCGACCTTTTCCGGTTTTAGAAGCTCCAC
		DDK-HA-for	GTGGAGCTTCTAAAACCGGAAAAGGTCGACTACCCATACGATGTTC

HA-BamHI-rev	ATGGATCCAGCGTAATCTGGAACGTCATATGGA
		AvrRpm1-NcoI-for	TATCCATGGGCTGTGTATCGAGCACTTC
AvrRpm1-NotI-rev	ATAAGAATGCGGCCGCAAAGTCATCTTCTGAGTCAGACTGAAC
		AvrRpm1-BamHI-for	ATGGATCCATGGGCTGTGTATCGAGCACTTC
MYB75-BamHI-NcoI-for	AATGGATCCATGGAGGGTTCGTCCAAAGG
		MYB75-NotI-C-rev	GCGGCCGCCTAATCAAATTTCACAGTCTC
ACT7-for	GGTGAGGATATTCAGCCACTTGTCTG
		ACT7-rev	TGTGAGATCCCGACCCGCAAGATC
DD-83-for	CCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTC
		EGFP-60-for	CGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTC
EGFP-718-for	ACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG

实施例1、UbRDDK多肽及其编码基因的获得

为了消除DD融合的渗漏现象，降低DD融合蛋白本底水平对于实验的干扰，利用N-endrule为DD引入一个N端精氨酸作为额外降解信号，新型的融合标签被称为RDDK(引入的方法见Bachmai,1986;Rajagopalan,2005;Varshavsky,2000)，即构建Ubiquitin精氨酸DD融合蛋白质，同时在C端添加一个赖氨酸作为潜在的泛素接受基团；Ubiquitin在翻译后即迅速被细胞内源的泛素C端水解酶切割，形成具有N端不稳定精氨酸的DD，得到UbRDDK多肽。

UbRDDK多肽的氨基酸序列为序列表中的序列2自N末端第1-185位氨基酸，该多肽的编码基因UbRDDK的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第1-555位核苷酸。

上述多肽的核苷酸序列和氨基酸序列均可合成。

实施例2、UbRDDK多肽及其编码基因的应用

一、UbRDDK多肽调控目的蛋白EGFP在植物体内的积累水平

人工合成序列1、序列3、序列4和序列5：

序列1所示的DNA分子为UbRDDK-EGFP，序列1自5’末端第1-555位核苷酸为UbRDDK，序列1自5’末端第559-1275位核苷酸为EGFP；其中，序列1自5’末端第1-228位核苷酸为Ub，序列1自5’末端第229-555位核苷酸为RDDK。UbRDDK-EGFP编码的蛋白UbRDDK-EGFP的氨基酸序列为序列表中的序列2，序列2自N’末端第1-185位氨基酸为UbRDDK，序列2自N’末端第187-425位氨基酸为EGFP。

序列3所示的DNA分子为DD-EGFP，序列3自5’末端第1-324位核苷酸为DD，序列3自5’末端第328-1047位核苷酸为EGFP（序列3和序列1的区别仅在于将序列1的UbRDDK替换为DD)。

序列4所示的DNA分子为EGFP-DD，序列4自5’末端第1-717位核苷酸为EGFP，序列4自5’末端第724-1047位核苷酸为DD。

序列5所示的DNA分子为DDK-EGFP，序列5自5’末端第1-327位核苷酸为DDK，序列5自5’末端第331-1050位核苷酸为EGFP。

1、重组载体的构建

1）对照重组载体pCB302-DD-EGFP和pCB302-EGFP-DD的构建

以EGFP为报告蛋白质，检测DD的N端和C端融合该蛋白导致的背景积累，构建载体pCB302-DD-EGFP和pCB302-EGFP-DD。

（1）pCB302-DD-EGFP（DD的C端融合EGFP）

A、构建基础载体pUC57-DD质粒和pUC57-Ub质粒

pUC57-DD质粒为将序列表中的序列3自5’末端第1-324位所示的DD(或将序列表中的序列4自5’末端第724-1047位所示的DD)插入pUC57载体(Genscript，目录号SD1176)的BamHI和NcoI酶切位点间得到的载体。

pUC57-Ub质粒：将序列表中的序列1自5’末端第1-228位核苷酸Ub插入pUC57载体的BamHI和NcoI酶切位点间得到的载体。

B、pCB302-DD-EGFP的构建

pCB302-DD-EGFP为将序列表中序列3所示的DD-EGFP插入pCB302质粒的BamHI和NotI酶切位点间得到的载体。

具体构建方法如下：将pUC57-DD质粒用BamHI和NcoI双酶切，得到332bp的DD核酸片段；将332bp的DD核酸片段与经过同样酶切的pEGFP质粒（Clontech公司）3332bp的骨架连接，使得DD编码序列与EGFP编码序列同框融合，形成pDD-EGFP；然后使用BamHI和NotI双酶切pDD-EGFP，得到1056bp的DD-EGFP融合基因片段，再将1056bp的DD-EGFP融合基因片段与经过同样酶切的pCB302载体（记载在如下文献中Xiang,C.,et al.(1999).A minibinary vector series for plant transformation.Plant Mol.Bio.40,711-717，公众可从中国科学院微生物研究所获得）6179bp的骨架连接，得到重组载体pCB302-DD-EGFP。

（2）pCB302-EGFP-DD（DD的N端融合EGFP）

pCB302-EGFP-DD为将序列表中序列4所示的EGFP-DD插入pCB302质粒的BamHI和NotI酶切位点间得到的载体。

具体构建方法如下：以pEGFP质粒为模板，以EGFP-BamHI-for和EGFP-SpeI-rev（表1）为引物，扩增774bp EGFP片段，使得EGFP片段上游具有BamHI位点，下游去除终止密码子并添加SpeI位点；然后将742bp EGFP片段与经过同样酶切的2955bp的pSK载体（Agilent，货号#212205）骨架连接，得到pSK-EGFP；再以pUC57-DD质粒为模板，用DD-SpeI-for和DD-NotI-rev为引物扩增，得到346bp的DD片段，使得DD片段上游具有SpeI位点，下游具有NotI位点；346bp的DD片段经过SpeI和NotI酶切后得到的334bp酶切产物与经过同样酶切后的pSK-EGFP载体3684bp的骨架连接，形成pSK-EGFP-DD，使得EGFP与DD编码序列形成同框融合；再用BamHI和NotI双酶切pSK-EGFP-DD，得到1076bp的EGFP-DD融合基因片段与经过同样酶切的pCB302质粒6179bp的骨架连接，得到重组载体pCB302-EGFP-DD。

2）对照重组载体pCB302-DDK-EGFP（DDK的C端融合EGFP）

pCB302-DDK-EGFP的构建方法如下：为将序列表中序列5所示的DDK-EGFP插入pCB302的BamHI和NotI酶切位点间得到的载体。

具体构建方法如下：以pUC57-DD为模板，以DD-BamHI-for和DDK-NcoI-rev为引物进行扩增，得到336bp的DDK片段，该片段依次包括BamHI位点、DD编码序列、赖氨酸密码子、NcoI位点；然后用BamHI和NcoI双酶切335bp的DDK片段，得到酶切产物与经过同样酶切的pEGFP质粒3332bp的骨架连接，使得DDK和EGFP编码序列同框融合，形成pDDK-EGFP；再用BamHI和NotI双酶切pDDK-EGFP，得到1059bp的DDK-EGFP融合基因片段，将该片段与经过同样酶切的pCB302质粒6179bp骨架连接，形得到重组载体pCB302-DDK-EGFP。

3）重组载体pCB302-UbRDDK-EGFP的构建（UbRDDK的C端融合EGFP，中间融合位点为NcoI）

以EGFP为报告蛋白质，检测UbRDDK的C端融合导致的背景积累，构建载体pCB302-UbRDDK-EGFP。

pCB302-UbRDDK-EGFP为将序列表中序列1所示的UbRDDK-EGFP插入pCB302的BamHI和NotI酶切位点间得到的载体。

具体构建方法：以pUC57-DD为模板（或者也可以以序列1为模板），用RDDK-BS-for（表1）和DDK-NcoI-rev扩增，得到358bp的RDDK，得到的RDDK依次包括BamHI位点、SacII位点、UbC端部分序列、精氨酸密码子、DD编码序列、赖氨酸密码子和NcoI位点；再用BamHI和NcoI双酶切358bp的RDDK，得到346bp的酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切的pEGFP质粒3332bp的骨架连接，形成pBSUBRDDK-EGFP；将用BamHI和SacII双酶切pUC57-Ub质粒，得到227bp的Ub片段，该片段上游为BamHI位点，下游为SacII位点；将227bp的Ub片段BamHI和SacII酶切后与经过同样酶切得到的pBSUBRDDK-EGFP载体3667bp的骨架连接，使得Ub、RDDK、EGFP三段编码序列形成同框融合，形成pUbRDDK-EGFP；最后用BamHI和NotI双酶切pUbRDDK-EGFP，得到1286bp的UbRDDK-EGFP融合基因片段，将UbRDDK-EGFP融合基因片段连接至经过同样酶切的pCB302质粒6179bp的骨架上，形成重组载体pCB302-UbRDDK-EGFP。

2、转基因拟南芥的获得

1）、重组菌的获得

将重组载体pCB302-DD-EGFP、pCB302-EGFP-DD、pCB302-DDK-EGFP和pCB302-UbRDDK-EGFP分别转入根癌农杆菌GV3101::pMP90（Koncz,C.and Schell,J.(1986)The promoterofTL-DNA gene5controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried bya novel type of Agrobacterium binary vector.Mol.Gen.Genet.204,383–396；公众可从中国科学院微生物研究所获得；）；分别得到重组菌GV3101::pMP90/pCB302-DD-EGFP、GV3101::pMP90/pCB302-EGFP-DD、GV3101::pMP90/pCB302-DDK-EGFP和GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-EGFP。

提取各菌株的质粒，测序验证正确。

2）、转基因拟南芥的获得

将重组菌GV3101::pMP90/pCB302-DD-EGFP、GV3101::pMP90/pCB302-EGFP-DD、GV3101::pMP90/pCB302-DDK-EGFP和GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-EGFP分别采用农杆菌介导的花序浸泡法（Clough,S.J.,and Bent,A.F.(1998).Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plantjournal:for cell and molecular biology16:735-743.）转入野生型拟南芥Columbia-0（ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center））的花序中，得到T1代转DD-EGFP拟南芥、T1代转EGFP-DD拟南芥、T1代转DDK-EGFP拟南芥和T1代转UbRDDK-EGFP拟南芥。

将上述T1代转基因植株均分别收种、播种，获得T2代转基因植株。

3、UbRDDK多肽降低目的蛋白EGFP在植物体内的积累水平

1）Western Blot检测

将上述获得的T2代转DD-EGFP拟南芥、T2代转EGFP-DD拟南芥、T2代转DDK-EGFP拟南芥和T2代转UbRDDK-EGFP拟南芥的叶片样品于液氮中用研钵磨成粉末，用如下缓冲液进行蛋白提取：pH7.5的50mM Tris/HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、0.5%SDS、5%甘油、2.5mMDTT、Complete蛋白酶抑制剂（Roche）；得到各样本的蛋白。以野生型拟南芥Columbia-0（WT）为对照。每一种转基因植物的每个株系采用10个单株混合，实验重复三次。

将上述各样品的蛋白经SDS-PAGE分离后经半干法转印至PVDF膜，使用鼠源GFP抗体（Roche,1:2500）检测GFP，使用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠第二抗体（Sigma，1:20000），使用Pro-light HRP发光液显色（Tiangen）。

2）RT-PCR检测

将上述获得的T2代转DD-EGFP拟南芥、T2代转EGFP-DD拟南芥、T2代转DDK-EGFP拟南芥和T2代转UbRDDK-EGFP拟南芥的叶片于液氮中用研钵磨成粉末，使用TRNzol试剂(Tiangen)提取植物总RNA，用M-MLV reverse transcriptase RNaseH minus（Takara）进行反转录合成cDNA。以野生型拟南芥Columbia-0为对照。每一种转基因植物的每个株系采用10个单株混合，实验重复三次以上述各样品的cDNA为模板，用EGFP-60-for和EGFP-718-for为引物，进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应条件如下：94度变性3分钟；94度变性30秒，60度退火30秒，72度延伸60秒，循环30次；72度延伸5分钟。

内参为ACT7，内参引物为ACT7-for和ACT7-rev。

上述WB和RT-PCR的结果如图1（图中的数字为转基因植物的不同株系）所示，（A）为DD-EGFP和EGFP-DD两种融合方式在转基因拟南芥植物中的背景蛋白积累比较，其中上图为拟南芥总蛋白GFP抗体蛋白质免疫印迹；下图为用EGFP基因特异性引物进行反转录PCR检测mRNA表达量；（B）DDK-EGFP和UbRDDK-EGFP两种融合方式在转基因拟南芥植物中的背景蛋白积累比较,其中上图为拟南芥总蛋白GFP抗体蛋白质免疫印迹；下图为用DDK-EGFP基因特异性引物DD-83-for和EGFP-718-rev进行反转录PCR检测mRNA表达量；

可以看出，EGFP与DD、DDK或UbRDDK的融合蛋白基因均可检测到mRNA转录，说明融合蛋白基因转入拟南芥中，且转录成功（图1A下图和1B下图）；但是WB检测发现作为融合标签的DD与EGFP融合不能够使DD-EGFP融合蛋白或EGFP-DD融合蛋白完全降解，植物体内还仍有40KD的DD-EGFP或EGFP-DD融合蛋白积累（图1A上图），而DDK融合EGFP也仍不能够使DDK-EGFP融合蛋白完全降解，植物体内还有40KD的DDK-EGFP的积累（图1B上图）；而采用UbRDDK作为N端标签与EGFP融合，可以使UbRDDK-EGFP融合蛋白完全降解，植物体内没有40KD的UBRDDK-EGFP的积累（Ub在翻译后迅速被剪切，形成UBRDDK-EGFP）（图1B上图），即使mRNA有很高的转录量，也仍没有目的蛋白UBRDDK-EGFP的积累。

以上结果说明，构建的UbRDDK多肽相较原来的DD多肽大幅降低了植物体内融合的目的蛋白的背景积累，降低目的蛋白在植物体内的稳定性。

将上述的T2代转DD-EGFP拟南芥和T2代转UbRDDK-EGFP拟南芥收种、播种，直到得到T3代转DD-EGFP拟南芥和T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥。

4、Shield1调控UbRDDK-EGFP融合蛋白在植物体内的积累

1）、Shield1处理

拟南芥按照如下生长条件培养：8h光照、16h黑暗交替的短日照条件，温度22℃。植物种植于4：1：1混合的营养土，蛭石，珍珠岩的混合物中。无菌苗生长于含有10克/升蔗糖的1/2MS培养基上。

Shield1溶液：将不同量的Shield1（Clontech，货号632189，MW748.91，(C₄₂H₅₆N₂O₁₀)，其化学式如下式1所示）溶于0.01%（体积百分含量）Silwet L-77(GE healthcare,货号SL77080596)中，得到Shield1溶液，使Shield1溶液的终浓度分别为0、10、100、100、1000、3000nM。

Shield1处理（喷雾处理）：使用喷雾器将Shield1溶液均匀喷洒至T3代转DD-EGFP拟南芥和T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥的叶片上，使得所有叶片均被Shield1溶液均匀浸润，得到T3代转DD-EGFP拟南芥（喷雾处理）和T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥（喷雾处理）。

2）、检测

为了研究Shield1处理的动力学过程，将用100nM Shield1溶液按照上述1）的方法处理T3代转DD-EGFP拟南芥和用3000nM Shield1溶液按照上述1）的方法处理T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥在不同时间段取样，经Western blot检测融合蛋白的积累情况，方法同上述3的1）。

处理后的T3代转DD-EGFP拟南芥结果如图2B，对于T3代转DD-EGFP拟南芥，Shield1处理后30分钟，即可观察到DD-EGFP的显著积累，积累水平在12-24小时达到峰值，然后逐渐下降。采用3000nM Shield1溶液按照上述1）的方法处理T3代转DD-EGFP拟南芥的结果与上述无显著差异，也在Shield1处理后24小时以后开始下降。因而后继实验的时间点均采用Shield1处理后24小时。

处理后的T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥结果如图3B，Shield1处理后30分钟，同样可观察到UBRDDK-EGFP的显著积累，但是积累水平在2-4小时达到峰值，然后逐渐下降。因而后继实验的时间点均采用Shield1处理后4小时。

T3代转DD-EGFP拟南芥（喷雾处理）用不同浓度的Shield1溶液喷雾处理后24小时、T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥（喷雾处理）用不同浓度的Shield1溶液喷雾处理后4小时后进行如下检测：

（1）Western Blot检测

方法同上述3的1）；以野生型拟南芥样品（Col-0）为对照。

（2）明场与共聚焦显微术

样本为T3代转DD-EGFP拟南芥（喷雾处理）、T3代转UbRDDK-EGFP拟南芥（喷雾处理）的叶片。以野生型拟南芥样品（Col-0）为对照。

激光共聚焦图像由Leica TCS SP5Ⅱ拍摄。EGFP绿色荧光由488nm激发光激发，515/530nm波长处收集发射荧光。使用Image J软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行荧光强度测量。

上述2个实验的结果如图2、表2和图3、表3所示:

图2为不稳定结构域（Destabilizing Domain,DD）赋予拟南芥中绿色荧光蛋白依赖于Shield1的稳定性；A为不同浓度Shield1处理24h的DD-GFP融合蛋白免疫印迹；B为1μMShield1处理后DD-GFP融合蛋白的积累随时间的变化免疫印迹；C为不同浓度Shield1处理24h的DD-GFP转基因植物荧光共聚焦图片；D为不同浓度Shield1处理24h的DD-GFP转基因植物的表皮细胞荧光定量结果；可以看出，加入Shield1可以诱导DD-EGFP融合蛋白的积累，而且积累水平依赖于Shield1浓度和处理时间。然而，DD虽然可以协助Shield1调解融合蛋白DD-EGFP的积累量，但是在不加入Shield1的情况下，还有融合蛋白DD-EGFP的积累，不能完全降解。

表2为不同浓度Shield1处理24h的DD-GFP转基因植物的表皮细胞荧光定量结果

样品	DD-EGFP	DD-EGFP	DD-EGFP	DD-EGFP	Col-0
						Shield1浓度（nM）	0	10	100	1000	1000
荧光强度平均值	14.0	12.3	22.3	54.4	5.5
						荧光强度标准偏差（n=3)	2.9	2.9	6.5	11.0	0.4

图3为拟南芥中UbRDDK-EGFP融合蛋白以依赖于Shield1的方式积累；A为不同浓度Shield1处理4h的UbRDDK-EGFP融合蛋白免疫印迹；B为3μM Shield1处理的UbRDDK-EGFP融合蛋白积累量随时间的变化免疫印迹；C为不同浓度Shield1处理4h的UbRDDK-EGFP转基因植物荧光共聚焦图片；D为不同浓度Shield1处理4h的UBRDDK-EGFP转基因植物的表皮细胞荧光定量结果；可以看出，使用不同浓度的Shield1处理UBRDDK-EGFP转基因植物，在1nM至100nM浓度区间内无法诱导UbRDDK-EGFP的积累，但是1000nM和3000nM的Shield1处理可以有效诱导UbRDDK-EGFP的积累，而且积累水平与Shield1浓度相关（图3A、图3C、图3D）。使用3000nM Shield1处理UbRDDK-EGFP转基因植物，然后分时间段取样，经Western blot分析发现Shield1处理0.5小时即可诱导UbRDDK-EGFP积累，处理后2小时达到高峰（图3B）。

表3为不同浓度Shield1处理24h的DD-GFP转基因植物的表皮细胞荧光定量结果

样品	UBRDDK-EGFP	UBRDDK-EGFP	UBRDDK-EGFP	UBRDDK-EGFP	Col-0
						Shield1浓度（nM）	0	100	1000	3000	1000
荧光强度平均值	5.8	6.4	17.3	39.7	5.5
						荧光强度标准偏差（n=3)	0.8	0.6	4.6	12.7	0.4

上述结果表明，UbRDDK融合大幅度的降低了DD融合的渗漏效应，消除了未诱导时的背景积累。这对于可诱导系统是非常重要的，因为背景积累的蛋白质可能会带来表型，使诱导效果的分析更加复杂。此外，某些目的基因编码的蛋白质对细胞有毒性，渗漏效应会造成毒性蛋白的背景积累，引起转基因植物死亡。

二、UbRDDK多肽调控目的蛋白AvrRpm1在植物体内的积累水平

HA标签和FLAG标签在植物研究中广泛应用，未发现有致细胞死亡效应或引起蛋白其他功能。

人工合成序列6，所示的DNA分子为UbRDDK-HA-AvrRpm1，其中序列表中序列6自5’末端第1-555位核苷酸为UbRDDK，自5’末端第562-651位核苷酸为HA，自5’末端第658-1320位核苷酸为AvrRpm1。UbRDDK-HA-AvrRpm1编码的蛋白为UbRDDK-HA-AvrRpm1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列7，序列7自N末端起第1-185位氨基酸为UbRDDK，自N末端起第188-217位氨基酸为HA，自N末端起第220-439位氨基酸为AvrRpm1。

人工合成序列10，所示的DNA分子为DD-AvrRpm1，其中序列表中序列10自5’末端第1-324位核苷酸为DD,自5’末端第328-990位核苷酸为AvrRpm1。

1、重组载体的构建

1）中间载体pCB302-UbRDDK-HA

为了方便构建目的基因与UbRDDK序列的融合，构建了pCB302-Ub-RDDK-HA质粒，该质粒在UbRDDK融合序列后含有一段3*HA多肽的融合标签，以方便进行后继的Western blot检测，同时在Ub-RDDK-HA融合序列后存在一个含有BamHI、SpeI、XbaI、Notl四酶切位点的多克隆位点以方便外源片段克隆。

具体构建方法如下：以pUbRDDK-EGFP为模板，以Ub-BglII-for和DDK-HA-rev为引物，得到587bp的Ub-RDDK-HA，消除Ub5’端的BglII位点，并使Ub上游具有BamHI位点，同时片段下游引入HA序列以利于后继的重叠PCR；以序列6所示的DNA分子为模板，以DDK-HA-for和HA-BamHI-rev引物扩增128bp DDK-HA融合片段，使得扩增的片段含有20个核苷酸的DDK序列，同时HA序列下游具有BamHI位点；然后将Ub-RDDK-HA和DDK-HA片段混合（摩尔比例为1:1）作为模板，使用Ub-BglII-for和HA-BamHI-rev进行重叠PCR，得到669bp Ub-RDDK-HA-FL片段，从上游到下游分别含有BglII位点、Ub编码序列、精氨酸密码子、DD编码序列、赖氨酸密码子、3*HA编码序列、BamHI位点；由于BglII和BamHI位点酶切后具有相同的粘性末端，将669bp Ub-RDDK-HA-FL片段用BglII和BamHI双酶切，连接至经BamHI酶切的pCB302质粒6198bp的骨架上，形成pCB302-UbRDDK-HA质粒。

2）pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1

重组载体pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1为将序列表中的序列6所示的DNA分子UbRDDK-HA-AvrRpm1插入pCB302的BamHI和NotI位点间得到的载体。

具体构建方法如下：

以序列6所示的DNA分子模板，用AvrRpm1-BamHI-for和AvrRpm1-NotI-rev扩增687bp的AvrRpm1片段，使用BamHI和NotI双酶切AvrRpm1片段，得到670bp的酶切产物连接至同样酶切中间载体pCB302-Ub-RDDK-HA的6855bp的骨架上，形成Ub-RDDK-HA-AvrRpm1同框融合片段，得到重组载体pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1。

3）对照重组载体pCB302-DD-AvrRpm1

对照重组载体pCB302-DD-AvrRpm1为将序列表中的序列10所示的DNA分子DD-AvrRpm1插入pCB302的BamHI和NotI位点间得到的载体。

以序列6所示的DNA分子为模板，用AvrRpm1-NcoI-for和AvrRpm1-NotI-rev扩增684bp的AvrRpm1片段；将684bp的AvrRpm1片段经NcoI和NotI双酶切，连接到同样酶切的pDD-EGFP质粒2940bp的骨架上，替换EGFP编码片段，使得DD编码序列与AvrRpm1编码序列同框融合，形成pDD-AvrRpm1；然后使用BamHI和NotI双酶切pDD-AvrRpm1，得到998bp的DD-AvrRpm1融合基因片段，将该片段连接至同样酶切的pCB302质粒6179bp的骨架上，形成pCB302-DD-AvrRpm1质粒。

2、转基因拟南芥的获得

1）、重组菌的获得

将重组载体pCB302-DD-AvrRpm1和pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1分别转入根癌农杆菌GV3101::pMP90，分别得到重组菌GV3101::pMP90/pCB302-DD-AvrRpm1和GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1。

提取各菌株的质粒，测序验证正确。

2）、转基因拟南芥的获得

将重组菌GV3101::pMP90/pCB302-DD-AvrRpm1和GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-HA-AvrRpm1采用农杆菌介导的花序浸泡法转入野生型拟南芥的花序中，得到T1代转DD-AvrRpm1拟南芥和T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥。

3、UbRDDK多肽降低目的蛋白AvrRpm1在植物体内的积累水平

将T1代转DD-AvrRpm1拟南芥和T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥进行RT-PCR检测，方法同一的3的2），不同的是引物为AvrRpm1-NcoI-for和AvrRpm1-NotI-rev。

结果为T1代转DD-AvrRpm1拟南芥体内有目的融合蛋白DD-AvrRpm1的mRNA水平的表达；T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥体内有目的融合蛋白UbRDDK-HA-AvrRpm1的mRNA水平的表达。

说明转基因成功。

4、Shield1调控UbRDDK-HA-AvrRpm1融合蛋白在植物体内的积累

1）、Shield1处理

Shield1处理（叶片注射）：使用1ml注射器将10ul3μM Shield1溶液分别直接注入T1代转DD-AvrRpm1拟南芥和T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥的叶片背面即可，得到T1代转DD-AvrRpm1拟南芥（叶片注射）和T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥（叶片注射）。

2）、台盼蓝染色

将T1代转DD-AvrRpm1拟南芥（叶片注射）和T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥（叶片注射）在注射24小时后，剪下叶片进行台盼蓝染色(Parker et al.,1996)。染液为乙醇与台盼蓝储液(2.5mg/mL台盼蓝,25%[v/v]乳酸,25%苯酚,25%甘油)1:1混合物。将叶片置于台盼蓝染液中煮5min，染色过夜，之后置于水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脱色至背景清晰为止。以野生型拟南芥（Col-0）为对照。

结果如图4所示，上图显示Shield1注射区域类似超敏反应的细胞死亡，下图显示同一叶片中细胞死亡的台盼蓝染色；可以看出，T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥（叶片注射）中Shield1处理后诱导体内融合蛋白UbRDDK-AvrRpm1累积，从而引发细胞死亡。说明UbRDDK并未影响AvrRpm1蛋白的活性。

3）表型观察

观察未经Shield1处理的74棵T1代转DD-AvrRpm1拟南芥和47棵T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥表型，结果如图5所示，标尺为1厘米，可以看出，T1代转DD-AvrRpm1拟南芥（叶片注射），发现获得的74棵转基因株系中有66棵呈现出极矮小表型，而且幼苗期即死亡，这是由于DD-avrRPM1的渗漏积累所致，此处数据显示DD系统的渗漏率至少高达89%；与之相反的是，T1代转UbRDDK-HA-AvrRpm1拟南芥（叶片注射），其中获得的47棵转基因株系中有33棵呈现出正常表型，表明与DD相比，UbRDDK可以显著地消除融合蛋白UbRDDK-AvrRpm1本底水平的积累。否则UbRDDK-AvrRpm1积累将持续激发超敏反应，引起植物死亡。

UbRDDK多肽相较原来的DD多肽大幅降低了植物体内融合的目的蛋白的背景积累，降低目的蛋白在植物体内的稳定性。

三、UbRDDK多肽调控目的蛋白MYB75在植物体内的积累水平

人工合成序列8，所示的DNA分子为UbRDDK-HA-MYB75，其中序列表中序列8自5’末端第1-555位核苷酸为UbRDDK，自5’末端第562-651位核苷酸为HA，自5’末端第658-1404位核苷酸为MYB75。UbRDDK-HA-MYB75编码的蛋白为UbRDDK-HA-MYB75，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列9。序列9自N末端起第1-185位氨基酸为UbRDDK，自N末端起第188-217位氨基酸为HA，自N末端起第220-467位氨基酸为MYB75。

1、重组载体的构建

pCB302-UbRDDK-HA-MYB75为将序列表中序列8所示的核苷酸插入pCB302的BamHI和NotI酶切位点间得到的重组载体。

具体构建方法如下：以序列8所示的DNA分子为模板，用MYB75-BamHI-NcoI-for和MYB75-NotI-C-rev为引物进行PCR扩增，得到764bp的MYB75片段；再将MYB75片段用BamHI和NotI双酶切，将酶切产物连接至同样酶切的中间载体pCB302-UbRDDK-HA的6855bp骨架上，形成Ub-RDDK-HA-MYB75同框融合片段，得到重组载体pCB302-UbRDDK-HA-MYB75。

2、转基因拟南芥的获得

1）、重组菌的获得

将重组载体pCB302-UbRDDK-HA-MYB75转入根癌农杆菌GV3101::pMP90；得到重组菌GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-HA-MYB75。

提取各菌株的质粒，测序验证正确。

2）、转基因拟南芥的获得

将重组菌GV3101::pMP90/pCB302-UbRDDK-HA-MYB75采用农杆菌介导的花序浸泡法转入野生型拟南芥的花序中，得到T1代，再播种传代，取T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥进行以下实验。

3、鉴定

对T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥进行RT-PCR检测，方法同一的3的1），不同的是引物为MYB75-BamHI-NcoI-for和MYB75-NotI-C-rev。

结果为T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥目体内有融合蛋白UbRDDK-HA-MYB75的mRNA水平的表达。

说明转基因成功。

4、Shield1调控UbRDDK-HA-MYB75融合蛋白在植物体内的积累

1）、Shield1处理

Shield1水溶液：将Shield1溶于水中，得到Shield1水溶液，使Shield1溶液的终浓度为3μM。

Shield1处理（浸泡处理）：将T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的无菌苗直接浸入Shield1水溶液中处理5天，得到T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥（浸泡处理）。以不用Shield1处理为对照（mock，浸泡于水中）。实验重复三次，每个株系3株。

观察表型，结果如图6A所示，T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的叶片不用Shield1处理对照组（上图）以及3μM Shield1处理组（下图）；可以看出，未经Shield1处理的3株T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥均表现出与野生型类似的表型。而Shield1处理后诱导了3株T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的叶脉的存在紫色花青素沉积，说明Shield1处理UbRDDK-HA-MYB75在拟南芥体内得到积累，且可以促进花青素合成。这表明UbRDDK可以协助Shield1调控拟南芥内源蛋白质功能。

UbRDDK多肽降低植物体内融合的目的蛋白的背景积累，降低目的蛋白在植物体内的稳定性，但在Shield1作用下，植物体内目的蛋白得到表达。

2）、花青素含量测定

将经过3μM Shield1水溶液处理和不用Shield1处理的T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的叶片花青素含量进行测定，测定方法见文献Shan,X.,et al.(2009).Molecular mechanismfor jasmonate-induction of anthocyanin accumulation in Arabidopsis.J.Exp.Bot.60,3849–3860。实验重复三次，结果取平均值±标准差，每个株系9株。

结果如图6B所示，可以看出，不用Shield1处理的9株T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的叶片花青素含量为0.84±0.09；经过3μM Shield1水溶液处理的9株T2代转UbRDDK-HA-MYB75拟南芥的叶片花青素含量为3.14±0.34。

上述结果说明，UbRDDK与目的蛋白融合，可以在Shield1的调控下改变目的蛋白的累积。

Claims (10)

1.一种多肽，是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列2自N末端第1-185位的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列7自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质或序列9自N末端第1-217位的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将(a)或(b)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述多肽的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下(1）-(4）中任一种的DNA分子：

(1）编码区为序列表中序列1自5’末端第1-555位所示的DNA分子；

(2）编码区为序列表中序列6或序列8自5’末端第1-651位所示的DNA分子；

(3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的相关蛋白的DNA分子；

(4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求1所述多肽的融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为权利要求1所述多肽与目的蛋白融合得到的融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：

所述融合为权利要求1所述多肽的C端与所述目的蛋白N端融合；

所述目的蛋白和对应的所述融合蛋白如下1）-3）中任一种：

1）所述目的蛋白为EGFP蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；

2）所述目的蛋白为AvrRpm1蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列7；

3）所述目的蛋白为MYB75蛋白，对应的所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列9。

7.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述DNA分子在调控目的蛋白在生物体内的稳定性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述调控目的蛋白在生物体内的稳定性为降低目的蛋白在生物体内的累积；

所述生物体为植物，所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物。

9.一种控制目的蛋白在植物体内累积量的方法，包括如下步骤：

1）将权利要求1所述多肽和目的蛋白融合，得到融合蛋白；

2）将所述融合蛋白导入目的植物中，得到转基因植物A；

3）用小分子Shield1处理所述转基因植物A，得到转基因植物B；

所述转基因植物B体内目的蛋白的累积量大于所述转基因植物A。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述小分子Shield1处理所述转基因植物A的方法为如下1）或2）或3）：

1）将含有所述小分子Shield1的溶液注射到所述转基因植物A叶片中；

2）所述转基因植物A在含有所述小分子Shield1的水溶液中浸泡；

3）将含有所述小分子Shield1的溶液喷雾到所述转基因植物A叶片表面；所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

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