CN103421801B

CN103421801B - 一种调控稻类结实率的基因及其应用

Info

Publication number: CN103421801B
Application number: CN201210161089.0A
Authority: CN
Inventors: 李来庚; 桂金山
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2032-05-22
Also published as: CN103421801A

Abstract

本发明涉及一种调控稻类结实率的基因及其应用。具体地，经过对大量水稻种子缺陷突变体的筛选，发明人首次发现，植物特异的Remorin蛋白及其编码基因OsREM6.6参与了种子结实率的调控，调控该蛋白和基因的表达能获得具有不同结实率的水稻，该蛋白和基因的表达存在组织特异性：始终在韧皮部伴胞细胞中特异表达；Remorin蛋白特异并稳固的定位于细胞膜上。

Description

一种调控稻类结实率的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和育种领域，具体地，本发明涉及一种调控稻类结实率的基因及其应用。

背景技术

粮食问题是一个世界范围内的问题，随着人口的迅速增加和可用耕地面积的日益减少，尽快提高粮食产量已成为各国的重要战略措施。水稻（Oryzasativa）是亚洲人群的主要粮食品种和经济作物，水稻产量的提高对解决粮食问题具有重要意义。如何更大限度的增加粮食的产量成为植物科学研究的重要课题。对优良基因利用生物技术手段快速获得优质高产高抗的新型水稻材料也备受关注。

水稻的产量主要由三个因素决定：粒重，每穗粒数和穗数。这些性状大都是数量性状，而控制这些性状的基因主要是数量性状位点。因此鉴定并了解这些基因的功能对育种和解释产量形成机制都有重要的意义。作为水稻产量构成三大要素之一的水稻穗粒数可进一步分解为颖花数和结实率。到目前为止，有关特异调控水稻结实率的基因还鲜见报道。

目前本领域水稻结实率相关基因的克隆和研究至今还没有获得突破。因此本领域迫切需要开展相关基因的定位和功能研究，以便应用于作物高产分子育种。

发明内容

本发明的目的就是提供一种调控稻类结实率的OsREM6.6基因及其应用。

本发明的另一目的是提供OsREM6.6基因编码蛋白在质膜靶向和启动子定位中的功能和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种一种分离的Remorin多肽或其编码基因的用途，所述多肽或其编码基因用于调节水稻的结实率，和/或粒重，和/或产量；

优选地，所述的Remorin多肽任选自下组：(i)具有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有调节水稻结实率，和/或粒重，和/或产量功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，具有调节水稻结实率，和/或粒重，和/或产量的多肽；

更优选地，所述的Remorin多肽的编码基因任选自下组：

(A)编码如SEQIDNO.:2所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；(D)在SEQIDNO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种提高水稻结实率，和/或粒重，和/或产量的方法，包括步骤：降低水稻中Remorin多肽或其编码基因的表达或活性；

较佳地，所述方法包括步骤：(a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择已转入反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列的植物细胞或组织或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：(a)含有如SEQIDNO.:18所示序列的多核苷酸（较佳地含有如SEQIDNO:17所示序列的多核苷酸）；(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:18所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且具有水稻韧皮部特异启动功能的多核苷酸；(c)如SEQIDNO.:18所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有水稻韧皮部伴胞细胞特异启动功能的多核苷酸；

优选地，所述的多核苷酸是如SEQIDNO.:17或18所示序列的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了第三方面所述的多核苷酸的用途，它被用做启动子元件，且所述的启动子元件具有在水稻韧皮部中特异性启动表达的功能。

在本发明的第五方面，提供了一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的第三方面所述的多核苷酸；

较佳地，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。

在本发明的第六方面，提供了一种表达盒，所述的表达盒从5’至3’依次具有下述元件：第三方面所述的多核苷酸、基因ORF序列、和终止子。

在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有第三方面所述的多核苷酸、或第五方面所述的表达盒。

在本发明的第八方面，提供了第三方面所述的多核苷酸、或第五方面所述表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在水稻韧皮部特异启动的表达。

在本发明的第九方面，提供了一种在水稻韧皮部特异性表达外源基因的方法，包括步骤：(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因，以及与该外源基因可操作地连接的第三方面所述的多核苷酸；(b)将步骤(a)中的构建物导入农杆菌；(c)将植物细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使步骤(a)中的构建物转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(d)选择已转入步骤(a)中的构建物的植物细胞或组织或器官；(e)将步骤(d)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

在本发明的第十方面，提供了一种分离的Remorin多肽片段或其编码基因，所述的Remorin多肽片段任选自下组：(i)含有SEQIDNO.:10所示氨基酸序列的多肽，且与SEQIDNO.：2所示序列不同；(ii)由SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的；

较佳地，所述的Remorin多肽片段的氨基酸序列为：SEQIDNO.：4、SEQIDNO.：6、SEQIDNO.：8、或SEQIDNO.：10；

优选地，所述的Remorin多肽片段的编码基因任选自下组：

(A)序列如SEQIDNO.:9所示的多核苷酸；(B)编码如(i)中所述多肽的多核苷酸；(C)核苷酸序列与SEQIDNO.:9所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；(D)在SEQIDNO.:9所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；

更优选地，所述的Remorin多肽片段的编码基因的核苷酸序列为：SEQIDNO.：3、SEQIDNO.：5、SEQIDNO.：8、或SEQIDNO.：9。

在本发明的第十一方面，提供了第十方面所述的分离的Remorin多肽片段或其编码基因的用途，它们被用于调节目的蛋白的细胞膜靶向，和/或与目的蛋白构建融合蛋白引导目的蛋白定位于质膜。

在本发明的第十二方面，提供了一种对目的蛋白进行细胞膜靶向和定位的方法，包括步骤：(1)获得编码融合蛋白的核苷酸序列，所述的融合蛋白为第十方面所述的Remorin多肽片段和所述的目的蛋白构成的融合蛋白；(2)将步骤(1)获得的核苷酸序列导入靶细胞，并在靶细胞中表达所述的融合蛋白，获得目的蛋白在细胞膜定位的宿主细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示突变体的鉴定及突变基因OsREM6.6表达分析，其中，图1A显示，用Tail-PCR法鉴定，T-DNA插入在水稻四号染色体BACOSJNBa0058K23上Os04g52920基因ATG上游462bp处；图1B显示，RT-PCR分析OsREM6.6在各个组织中的表达，LB：叶片，C：茎秆，R：根，LS：叶鞘，DG：发育中的种子；图1C显示通过基因组DNAPCR验证T-DNA插入位置，WT：野生型，M：突变体；图1D显示了OsREM6.6在野生型和突变体叶片中的表达；图1E显示组成型过表达OsREM6.6转基因植株(ROX)叶片中OsREM6.6的表达；图1F显示反义抑制OsREM6.6转基因植株(RKD)叶片中OsREM6.6的表达；图1G显示启动子GUS活性相对定量分析结果，OsREMP₁₇₀₀-GUS：ATG上游1700bp的DNA片段驱动GUS报告基因表达，OsREMP₄₆₀-GUS：ATG上游460bp的DNA片段驱动GUS报告基因表达，Fl：孕穗期小花，Pe：花梗，In：最上节间。

图2显示在种子成熟期，对野生型（WT）和突变体（M）的各项形态指标进行统计分析，突变体的结实率显著降低，其中，图2A显示野生型和突变体种子成熟期穗部表型，Bar=3cm；图2B显示野生型和突变体各取10个独立的株系对种子结实率(Seedsettingrate)、千粒重(1000-grainweight)、颖花数(Spikeletnumber)、种子长度(Grainlenght)、种子宽度(Grainwidth)、种子厚度(Grainthickness)、分蘖数(Tillernumber)、株高(Plantheight)和节间长度(Internodelenght)分别进行统计的结果。

图3显示，不同发育时期，野生型(WT)、OsREM6.6过表达(ROX)和OsREM6.6反义下调表达(RKD)植株的表型分析，过表达OsREM6.6能显著降低结实率和株高，其中，图3A显示分蘖期WT,ROX,RKD植株形态，Bar=10cm；图3B显示灌浆期WT、ROX、RKD植株形态；图3C显示成熟期WT、ROX、RKD穗部表型，Bar=3cm；图3D显示WT、ROX和RKD种子结实率(Seedsettingrate)、千粒重(1000-grainweight)、颖花数(Spikeletnumber)、种子长度(Grainlenght)、种子宽度(Grainwidth)、种子厚度(Grainthickness)、分蘖数(Tillernumber)、株高(Plantheight)和节间长度(Internodelenght)的统计分析结果。

图4显示分别在花药发育第6、8、12期，野生型和突变体花药进行切片及甲苯胺蓝染色结果，其中，图4A-图4C显示不同发育时期野生型植株花药切片；图4D-图4F显示不同发育时期突变体植株花药切片，Bar=50μm。

图5显示OsREM6.6的启动子驱动GUS报告基因转化水稻后，对OsREM6.6在各组织器官中的表达做GUS染色，结果为水稻OsREM6.6在各组织器官中的表达模式，(图5A)根；(图5B)根的成熟区横切；(图5C)幼茎茎间横切；(图5D)成熟茎茎间横切；(图5E)源叶叶片；(图5F)源叶叶片横切；(图5G)抽穗期的花；(图5H)抽穗期花的中部横切；(图5I)15DAF的种子；(图5J)穗轴横切；(图5K)不同孕穗时间的花；这些结果显示，OsREM6.6启动子驱动GUS报告基因在维管组织的韧皮部特异染色。(图5A,图5C,图5D,图5E,图5G-图5K)中Bars=500μm；(图5B,图5F)中Bars=50μm。

图6显示稳定转化OsREM6.6启动子GUS的T1种子，在不同萌发时期的的GUS染色，检测水稻OsREM6.6在种子萌发过程中的表达模式，图6A显示从胚根起始到胚根生长到5mm完整种子的GUS染色；图6B显示从萌发起始到胚根生长到5mm沿种子背部的维管束纵切的GUS染色，Bars=1mm。

图7显示水稻OsREM6.6伴胞细胞特异表达，其中，图7A茎秆第一节间横切；图7B显示茎秆第二节间横切；图7C显示茎秆第三节间横切；图7D显示茎秆第三节间纵切；图7E为图7D中茎秆第三节间纵切的放大图；图7F为野生型植株幼茎茎间的免疫原位，右下角插入小图为阴性对照；Bars=50μm。

图8显示突变体中T-DNA的插入不改变OsREM6.6的组织定位，其中，图8A显示野生型幼茎茎间的免疫原位；图8B显示OsREM6.6突变体幼茎茎间的免疫原位；图8C显示OsREM6.6启动子全长RemP₁₇₀₀-GUS植株第三节间GUS染色；图8D显示OsREM6.6启动子片段RemP₄₆₀-GUS植株第三节间GUS染色；图8A-图8D中Bars=50μm。

图9显示，采用烟草瞬时表达系统，在叶片表皮细胞中观察OsREM6.6蛋白的亚细胞定位结果；水稻GFP-OsREM6.6(A,C,D,F,G,I),质膜膜筏Marker蛋白mCherry-SlREM1.2(B,C)和胼胝质特异染料ABF(E,F)的亚细胞定位。(A-C)GFP-OsREM6.6与mCherry-SlREM1.2共表达，其中(A)GFP-OsREM6.6与(B)mCherry-SlREM1.2以及(C)二者的合成图片；(D-F)GFP-OsREM6.6与ABF染色的共定位，其中(D)GFP-OsREM6.6，(E)ABF染色以及(G)二者的合成图片；(G-I)GFP-OsREM6.6质壁分离后的荧光观察图片。

图10显示采用烟草叶片原生质体(A,B,E,F,I,J,M,N,Q,R)和烟草叶片注射(C,D,G,H,K,L,O,P,S,T,U,V,W,X)瞬时表达系统，观察OsREM6.6蛋白不同截短区段的亚细胞定位，(图10A-图10D)GFP-OsREM₅₃₁、(图10E-图10H)GFP-OsREM₄₁₄、(图10I-图10L)GFP-OsREM₁₁₈、(图10M-图10P)GFP-OsREM₇₁、(Q-T)GFP-OsREM₄₇、(图10U,图10V)GFP-OsREM₂₈、和(图10W,图10X)GFP-OsREM₁₉。

图11显示用水稻OsREM6.6(A,C,D,F,G,I),高尔基体Marker蛋白G-rk(B,C,E,F)和依赖于高尔基体分泌途径的胞间连丝蛋白AtPDLP1a(H,I)，分别融合35S启动子驱动的绿色荧光蛋白，在烟草叶片表皮细胞中瞬时表达，并用BFA处理(D-I)观察蛋白的亚细胞定位变化，显示水稻Remorin蛋白的质膜定位不依赖于高尔基体分泌途径。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，在对大量的水稻种子缺陷突变体的筛选中，首次意外发现，植物特异基因OsREM6.6编码Remorin蛋白，所述的Remorin蛋白参与种子结实率的调控，调控该基因的表达能获得具有不同结实率的水稻；该基因的表达存在组织特异性，始终在韧皮部伴胞细胞中特异表达；Remorin蛋白特异并稳固的定位于细胞膜上。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明基因”、“OsREM6.6基因”、“本发明调节结实率，和/或粒重，和/或产量的基因”可以互换使用，都是指来源于水稻的OsREM6.6基因及其变体。本发明的OsREM6.6基因典型的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。

如本文所用，术语“本发明多肽”、“Remorin多肽”、“本发明的调节结实率，和/或粒重，和/或产量的多肽”可以互换使用，都是指来源于水稻的Remorin多肽及其变体。本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQIDNO.:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调节水稻的结实率、粒重、产量等性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQIDNO.:l中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQIDNO.:l的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQIDNO.:l的同源性较低，也能基本编码出如SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列。另外，“在SEQIDNO.:l中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQIDNO.:l所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQIDNO.:1所示)具有一定同源性(保守性)的Remorin基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。

本发明涉及一种调节水稻结实率的Remorin多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。本发明的多肽能够有效维调节结实率，粒重、产量等性状。

本发明还包括与本发明的SEQIDNO.:2所示序列具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“调节水稻结实率、粒重和/或产量”。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQIDNO.:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了用于抑制Remorin蛋白表达的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要抑制目的基因时，将抑制目的基因的核苷酸序列连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将所述序列与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，外源序列，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。

包括外源序列的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和外援序列(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和外源序列的载体片段整合到植物的染色体上。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明还提供了一种提高水稻结实率、粒重和/或产量的方法，包括步骤：降低水稻中Remorin多肽或其编码基因的表达或活性。在本发明的一个优选例中，所述方法包括步骤：(a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述表达载体含有抑制Remorin多肽表达的编码序列；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使抑制Remorin多肽表达的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择已转入抑制Remorin多肽表达的编码序列的植物细胞、或组织、或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞、或组织、或器官再生为植株。本发明还提供了一种改造水稻的方法，包括步骤：降低水稻中Remorin多肽的表达水平或活性。

本发明还提供了一种分离的Remorin多肽片段或其编码基因，所述的Remorin多肽片段任选自下组：(i)具有SEQIDNO.:10所示氨基酸序列的多肽（且与SEQIDNO.:10不同）；(ii)将如SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQIDNO.:10所示氨基酸序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多肽。

优选地，所述的Remorin多肽的编码基因任选自下组：(A)编码如SEQIDNO.:10所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.:9所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列与SEQIDNO.:9所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；(D)在SEQIDNO.:9所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供了所述分离的Remorin多肽片段或其编码基因的用途，它们被用于细胞膜靶向，和/或调节目的蛋白的质膜定位。

如本文所用，术语“本发明启动子”、“水稻韧皮部伴胞细胞特异表达的启动子”、“水稻韧皮部伴胞细胞特异启动的启动子”可互换使用，指来源于水稻等OsREM6.6基因的启动子元件，本发明的一种典型的启动子元件序列如SEQIDNO.:18或17所示。

如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

本发明提供了一种水稻韧皮部伴胞细胞特异启动的启动子，所述启动子来源于水稻的OsREM6.6基因。一种优选的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.:17或18所示。

本发明的启动子能够高效、专一地在水稻韧皮部伴胞细胞中表达。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

本发明还包括与本发明的优选启动子序列(SEQIDNO.:18)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动水稻韧皮部伴胞细胞表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于水稻的OsREM6.6基因，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻同属于一科或属的植物)的、与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。所述的“水稻韧皮部伴胞细胞特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在水稻韧皮部伴胞细胞中表达。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，可以为RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。

所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。

所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTBpins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。

本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下列元件：启动子、基因ORF序列、和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQIDNO.:18所示或与SEQIDNO.:18所示序列的同源性≥95%，较佳地≥98%，更佳地≥99%。

本发明还提供了一种包括本发明的启动子和/或基因表达盒的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。

本发明的主要优点：

(1)本发明发现植物特异的Remorin蛋白及其编码基因OsREM6.6参与了种子结实率的调控，调控该蛋白和基因的表达能获得具有不同结实率的水稻

(2)Remorin蛋白及其编码基因OsREM6.6的表达存在组织特异性，始终在韧皮部伴胞细胞中特异表达；Remorin蛋白特异并稳固的定位于细胞膜上。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料和方法

1.OsREM6.6基因表达分析

水稻不同发育时期、不同组织的总RNA用Trizol试剂提取(Invitrogen)。对总RNA样本用RNase-freeDNaseI进行处理，以去除其中残留的基因组DNA。利用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit（TAKARA），并以2μg经DNase消化的总RNA为模板，采用OligodT引物合成第一链cDNA。以合成的cDNA为模板对OsREM6.6进行半定量RT-PCR分析，并以水稻肌动蛋白基因(OsACT1,Os03g0718100)作为内参基因。

2.GUS活性分析

为了研究OsREM6.6基因的组织表达情况，克隆OsREM6.6基因ATG上游1.7kb和0.46kb的片段，并将其亚克隆到pCAMBIA1301(CAMBIA)。验证后转入市售的农杆菌EHA105菌株，并转入水稻中花11中。对转基因阳性材料进行GUS活性分析，组织首先用丙酮处理（约10min，4℃），用100mMNaPO4buffer(pH7.0)洗掉组织中残留的丙酮，用GUS显色液于37℃保温适当的时间，用75%的乙醇终止反应和脱掉叶绿体的颜色。

3.GUS活性定量分析

4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide(4-MUG)能被β-glucuronidase(GUS)酶切产生4-methylumbelliferone(4-MU)，而4-MU的荧光强度可以在特定的波长下度量。因此，植物组织GUS的活性可以以4-MUG为底物，在365nm激发光和455nm发射光下检测4-MU的荧光值，准确度量GUS的活性。

试剂：

GUS提取缓冲液：10mMEDTA(pH8.0),0.1%SDS,50mMsodiumphosphate(pH7.0),0.1%TritonX-100,10mMβ-mercaptoethanol,25μg/mlPMSF；

4-MUG母液：25mMinGUS提取缓冲液；

GUS反应液：GUS提取缓冲液中含1mM4-MUG；

反应终止液：1M碳酸钠；

试验步骤：

称取200~500mg液氮研磨的样品；加入1mlGUS提取缓冲液，振荡混匀5分钟，12000rpm离心10分钟；转移上清至新离心管，置冰上；取10ul上清液加入到130μlGUS反应液中，37℃保温10分钟；反应结束后，取10μl加入到190μl的反应终止液中，混匀；用酶标仪在365nm激发光和455nm发射光下检测4-MU的荧光值。

4.免疫原位

丙酮微波炉法组织固定

用锋利的双面刀片将水稻节间切成~2mm长的小块，迅速投入4℃预冷丙酮的样品瓶中，抽真空15min，换冰预冷丙酮，抽真空15min，换新鲜丙酮4℃过夜；换新鲜丙酮，抽真空15min，静置10min。然后用微波炉保温37℃，15分钟（分3次，每次5min，先将2L水升温至37℃，然后用小烧杯盛水并将样品瓶放入小烧杯中），重复2次；丙酮/二甲苯（1∶1），微波炉保温60℃，1min,15sec。（微波前将水温调至60℃）；纯二甲苯，微波炉保温60℃，1min,15sec；换二甲苯∶石蜡（1∶1），微波炉保温60℃10min（3min时拿出来测下温度，轻摇小瓶保证混匀）；纯石蜡，微波炉保温60℃，10min；纯石蜡，微波炉保温70℃，30min。重复4次；包埋，4℃保存。

免疫原位

丙酮微波炉法固定好的材料，切10μm横切片；二甲苯脱蜡2次，每次15min；二甲苯/乙醇（1∶1）2min；无水乙醇2次，每次1~2分钟；95%、90%、80%、60%、30%，分别依次1~2分钟；PBS缓冲液（0.13MNaCl，7mMNa2HPO4·12H2O，3mMNaH2PO4·2H2OpH7.0）漂洗2次；封闭液处理(PBS，0.5%NormalGoatSerum，1%BSA)，1.5小时；一抗在封闭液中（1∶500）杂交，1小时或者4℃过夜；PBS缓冲液漂洗10分钟，3次；二抗-AP杂交（1∶5000），2小时；PBS缓冲液漂洗10分钟，3次；碱性磷酸酶缓冲液(100mMTrispH9.5,50mMMgCl2,100mMNaCl,0.1%Tween-20,5mMlevamisole)漂洗2次，每次5分钟；BCIP/NBT溶于碱性磷酸酶缓冲液，室温显色5min-10min；脱水，30%、60%、80%、90%、95%、100%乙醇和100%二甲苯依次分别3秒钟，中性树脂封片；

5.亚细胞定位

5.1亚细胞定位载体构建

在OsREM6.6的CDS全长核苷酸序列(1596bp的核苷酸序列见SEQIDNO.：1，531个氨基酸序列见SEQIDNO.：2)引入XbaI和BglII酶切位点，并连接到市售的T-载体上，进行酶切和测序验证。

以市售的pA7-GFP为骨架，将OsREM1596bp的全长序列(SEQIDNO.：1)插入到酶切位点XbaI和BamHI之间，并与GFP序列融合，构建成pA7-GFP-OsREM531。

同理，将各种截短长度的OsREM6.6片段分别以融合的形式构建到pA7-GFP的C-端(XbaI和BamHI之间)，其中，

OsREM6.6截短片段(1242bp核苷酸序列见SEQIDNO.：3，414个氨基酸序列见SEQIDNO.：4)引入XbaI和BglII，构建pA7-GFP-OsREM414；

OsREM截短片段(354bp核苷酸序列见SEQIDNO.：5，118个氨基酸序列见SEQIDNO.：6)引入XbaI和BamHI，构建pA7-GFP-OsREM118；

OsREM截短片段(213bp核苷酸序列见SEQIDNO.：7，71个氨基酸序列见SEQIDNO.：8)引入XbaI和BamHI，构建pA7-GFP-OsREM71；

OsREM截短片段(141bp核苷酸序列见SEQIDNO.：9，47个氨基酸序列见SEQIDNO.：10)引入XbaI和BamHI，构建pA7-GFP-OsREM47。

对上述构建好的质粒分别进行酶切和测序验证。

利用pA7-GFP和pCAMBIA1300（pCAMBIA1300购自CAMBIA公司），构建pCAMBIA1300-GFP，将pA7-GFP载体HindIII和EcoRI之间的片段插入到pCAMBIA1300多克隆位点HindIII和EcoRI之间，构建成pCAMBIA1300-GFP载体。

再以pCAMBIA1300-GFP为骨架，将1596bp的REM的全长序列(核苷酸序列见SEQIDNO.：1)插入到酶切位点XbaI和BamHI之间，与GFP序列融合，构建成pCAMBIA1300-GFP-OsREM531。

同理，构建各截短的载体：

REM截短片段(1242bp核苷酸序列见SEQIDNO.：3，414个氨基酸序列见SEQIDNO.：4)引入XbaI和BglII，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM414；

REM截短片段(354bp核苷酸序列见SEQIDNO.：5，118个氨基酸序列见SEQIDNO.：6)引入XbaI和BamHI，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM118；

REM截短片段(213bp核苷酸序列见SEQIDNO.：7，71个氨基酸序列见SEQIDNO.：8)引入XbaI和BamHI，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM71；

REM截短片段(141bp核苷酸序列见SEQIDNO.：9，47个氨基酸序列见SEQIDNO.：10)引入XbaI和BamHI，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM47；

REM截短片段(84bp核苷酸序列见SEQIDNO.：11，28个氨基酸序列见SEQIDNO.：12)引入XbaI和BamHI，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM28；

REM截短片段(57bp核苷酸序列见SEQIDNO.：13，19个氨基酸序列见SEQIDNO.：14)引入XbaI和BamHI，构建pCAMBIA1300-GFP-OsREM19。

以pCAMBIA1300-GFP为骨架，将SlREM1.2(602bp，核苷酸序列见SEQIDNO.：15)和AtPDLP1(912bp，核苷酸序列见SEQIDNO.：16)的全长序列插入到酶切位点XbaI和BamHI之间，与GFP序列融合，构建成pCAMBIA1300-GFP-SlREM1.2和pCAMBIA1300-GFP-AtPDLP1。

5.2烟草叶片原生质体观察蛋白的亚细胞定位

原生质体的分离

现配10ml酶解液用0.45μm滤膜过滤，置于六孔细胞培养板；选取健康平展的烟草叶片，切成1-2mm宽的条带，浸入酶解液；室温抽真空30min，在22-25℃酶解约3h；用40-100μm的筛网过滤包含原生质体的酶解液；100g离心1.5min，重悬于10mlW5溶液，计数；冰上放置30min；100g离心1min，用MMg溶液重悬。

5.3PEG介导原生质体的转化

准备60μl质粒（约1μg/μl）；加入100μl原生质体（约1×105个原生质体），轻轻混匀；加入160μl的PEG溶液，轻轻混匀，23℃孵育约15min；加入800μlW5溶液，混匀，100g离心1.5min；重悬于1mlW5溶液；23℃暗培养过夜。

5.4烟草叶片观察蛋白的亚细胞定位

挑取鉴定好的农杆菌GV3101单克隆于5mlLB培养基（加入适当的抗生素）中28℃，220rpm摇晃20h；按1%转接菌液至新培养基中，28℃，220rpm摇晃16-20h；测菌液OD₆₀₀值，5000rpm5min沉淀菌液，用注射液[10mMMgCl2+10mMMes(pH=5.7)+20umAS(乙酰丁香酮)]将沉淀稀释至OD600=1重悬，在室温下静置3h（活化需要）；用1ml注射器注射烟草平展叶片的下表面，使注射液在叶片内部漫延至硬币大小；培养2~3天；用激光扫描共聚焦显微镜观察。

5.5烟草叶片质壁分离处理

用30%(w/v)的蔗糖溶液渗透烟草叶片,处理约5~10分钟，观察。

5.6苯胺蓝荧光染色

苯胺蓝荧光染料ABF能特异的与胼胝质结合，用0.1mg/ml的ABF渗透烟草叶片，在405nm激化光和发射光460~500nm下，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

5.7烟草叶片BFA处理

烟草叶片瞬时表达蛋白，农杆菌注射培养约40小时后，用50μg/ml的BFA渗透注射过的区域，再培养12小时，激光扫描共聚焦显微镜观察。

6.正反义表达载体的构建

正义过表达载体的构建：在OsREM6.6的全长序列(1596bp,531aa)引入SacI和XbaI酶切位点，并连接到T-载体上，分别进行酶切和测序验证。以市售的pHB载体为骨架，将OsREM的全长序列(1596bp)插入到酶切位点SacI和XbaI之间，构建成2×35S:OsREM6.6OX。

反义强表达载体的构建：在OsREM6.6的全长序列(1596bp,531aa)引入XbaI和SacI酶切位点，并连接到T-载体上，分别进行酶切和测序验证。以pHB载体为骨架，将OsREM的全长序列反向插入到酶切位点SacI和XbaI之间，构建成2×35S:OsREM6.6AS。

7.部分相关序列

OsREM6.6CDS序列如下：

atggagtatgaaaggattcacaaggttcaggctggtgcactttctccgacaaagctaagg60

atgaagcttctgggaactcacaatcgtgtgagggtcatcagcaacagctcatcacggaca120

tcaccttcgaagaacactgaaccatcgcaagcacagaacagactattagtttgtgatgtt180

cttgaagaagtttcaggcagctctgatggatccaaatgctcctcagcaatcaacaaaact240

gaagctttagagaaggatccaccattggacatcaacaaggttgaggacatgaccaaaagt300

tcagttcagcaacctgcatcaagcaactcaagcatgatacatccagttcgaaccatagaa360

gaagagagtaatgactgtgatagtggtattgacaatgctagtaccagtagtttcgagttc420

catggaggagagaaaacagcagcgcagaatccaacatcaggatatttctcgagacagact480

tcctccaagtggaatgatgctgagaaatggattgttaataagcaaaatgttcaacaaaat540

atctctaagggcgcaccacagaaccagagtgcacagcagatgaattcagctgcaggcagg600

ggttttattgtgcccaaaatttcaaaccgaaacataattcctcgccccatgcagaacatg660

aaaagaccgagtccagcttcttccgcttctcgaagcatattagagaggttatcttttggt720

tcacatcaaccaaagttggttaggcatgcagatgtctgtacagttaataatgctggtgtc780

acctcagagtatcaaacaaaggcaaccgataacagttcatcaattgaaataaggccctac840

aaagatcccaaagctattcctgcagttcattcggtgtccgtgagagatgtgggcacagaa900

atgactcccataccgagtcaggatccttcaaggacaggaactccacttggatcaatgaca960

ccaactcgtagcccaaattgctctataccatcaactcctgtaggaggacggtcaacagca1020

tcaccaggagatgacaacacagatgatggaccatatttcaacagaaaaggtggcacaaat1080

gaaatatcagacgatgaaatgagattgaagacaaggaaagaaattgccgccctgggtata1140

caactaggaaagatgaacattgctacatgggctagcaaagaggagctagaactagtctct1200

gcatccccaagcattgctgatttggagcggatgaagaaagaatatgcagctcgtgcagca1260

gcatatgaagaagcagaaaattttaagcatacagcaagattcaagaaggaagagttgaag1320

attgaagcatgggagagccttcaaaaagcaaaaatagaatctgaaatgaagagaatagag1380

gaacatgcagagaaattgcgaagcgaagccatggcgaagatggctgaaaagctagaaatg1440

acacggcgtttagctgaagagaaacgagcctcagccaatgcaaggatgaaccaacaagca1500

gcaaaggcggttcacaaggctgagctgattcgccagacaggacgagttccagggtcatgt1560

atcctatgctgcagtggttgcttctgtcaacactag1596

SEQIDNO.：1

OsREM6.6基因编码的蛋白质（Remorin蛋白）序列

MEYERIHKVQAGALSPTKLRMKLLGTHNRVRVISNSSSRTSPSKNTEPSQAQNRLLVCDV60

LEEVSGSSDGSKCSSAINKTEALEKDPPLDINKVEDMTKSSVQQPASSNSSMIHPVRTIE120

EESNDCDSGIDNASTSSFEFHGGEKTAAQNPTSGYFSRQTSSKWNDAEKWIVNKQNVQQN180

ISKGAPQNQSAQQMNSAAGRGFIVPKISNRNIIPRPMQNMKRPSPASSASRSILERLSFG240

SHQPKLVRHADVCTVNNAGVTSEYQTKATDNSSSIEIRPYKDPKAIPAVHSVSVRDVGTE300

MTPIPSQDPSRTGTPLGSMTPTRSPNCSIPSTPVGGRSTASPGDDNTDDGPYFNRKGGTN360

EISDDEMRLKTRKEIAALGIQLGKMNIATWASKEELELVSASPSIADLERMKKEYAARAA420

AYEEAENFKHTARFKKEELKIEAWESLQKAKIESEMKRIEEHAEKLRSEAMAKMAEKLEM480

TRRLAEEKRASANARMNQQAAKAVHKAELIRQTGRVPGSCILCCSGCFCQH531

SEQIDNO.：2

1.7kb启动子序列

ggctggaacaaacaagacaactactgccaaaaatcttgacaactaaactaactttgaccc60

ttttttttcttttcaggagccttgttcatggtattttcttagggggattcatagtatatt120

gaacacaagtaaattgtaagatcaatcatcagtgcatttgaccaatcacctatgaatgat180

ggaccatcaccgtgtgtgttttttcacttctccgtgtaaccccccccccccccacgtcag240

cgggtaatagttgtacaagtcttttttttctgctaatatatcgacctgcatggcttttac300

gtgtttaaaaaaatgatggaccataaacatgatgtgtggcacatcaaactgttttgtaag360

tactcatgctgatgctggccagctccttggccataaaaattggaccacacaggttttaag420

gctaccagcaaagatgatgaagctcataaatggaccataagagcgcagcacaccaaatcg480

aaaccaattcaatgagctatacagttgtgcagttgtgcacctgtactccagagcccaagc540

tccaatcgctcacatgtccaaattttgctccaagtacacggcgaatccaaatgtatgaac600

cttggcaaggtcagagaatcaaaagtgagagcagcaatgacagcaataaccaactagtac660

tagagtacgtacgattgtacgaagtaatatgaacgcatggtcaaattttgcaaacggtga720

gaagcaggaaggtgacaaaagtatatattcataccggtgacgacatcttacatcttagcc780

caacctcgtgacactgggatttgggatagggcgacgttgggtgagtgcatgatgacacga840

gatgggccggtgaaaaggccaagagattggagcaataaataaaatctttgcagggacact900

gatgagtcactgacgcagaaagatgtggcggtgcagtagcagccgtcccccatctctgag960

aggagagtgtgagctgctagtgaagagtggtgggtctgaatgcttggatagggttccagt1020

ccagccttgggacctctgtttgaccacccccagtttatacaaccaaaaggggagtggtag1080

cattagtttggagctttggagtttggggtgtttagggggcacacatctcgagaaatagct1140

aggtttattttactgttgtgtttactatactgcctgtcgtaaaagggaactttgtgtaat1200

aaaagggtcatgtgatttaacaaagagagatctgtaaagactaaaaaagaggatgggact1260

ctttttctgtctagaacaaaaggtcgtcatggtatgttggtgcaagccctatttgtgact1320

gggtgaatttctactgtagtacttgcaacctgctttgtgtttacccattgatgaataggc1380

aaagcatactactataaatactttctaacaaagggttttggaaagaaaatgcgactggcc1440

agagaaactggcttgtggacgactcatgagtcatgtctaaagaacttacctaaatgacac1500

gacctgacagcgtgctaacagatctctcttcttattagctagtatgccagtccaaatgct1560

ctagtgttcagtgttctcttctccccctcactctctcctgtctcgctcccccctccttcc1620

ccagtccctccatctcactctcacccaccagagtaccagagaagcacagagactcagaga1680

gggagagagagaggaaga1698

SEQIDNO.：17

0.46kb启动子序列

agactaaaaaagaggatgggactctttttctgtctagaacaaaaggtcgtcatggtatgt60

tggtgcaagccctatttgtgactgggtgaatttctactgtagtacttgcaacctgctttg120

tgtttacccattgatgaataggcaaagcatactactataaatactttctaacaaagggtt180

ttggaaagaaaatgcgactggccagagaaactggcttgtggacgactcatgagtcatgtc240

taaagaacttacctaaatgacacgacctgacagcgtgctaacagatctctcttcttatta300

gctagtatgccagtccaaatgctctagtgttcagtgttctcttctccccctcactctctc360

ctgtctcgctcccccctccttccccagtccctccatctcactctcacccaccagagtacc420

agagaagcacagagactcagagagggagagagagaggaaga461

SEQIDNO.：18

实施例1水稻突变体的制备及检测

本实施例通过常用的转基因的实验手段，通过转化携带T-DNA的质粒，插入到水稻的染色体上而产生的。

水稻突变体的性状：水稻突变体主要性状表现在结实率和千粒重这两个性状上。结实率是水稻成熟后统计饱满粒占总粒数（饱满粒数+空粒数）的百分比。千粒重是以克表示的一千粒种子的重量，它是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的内容，也是田间预测产量时的重要依据。

实施例2突变体的检测

通过Tail-PCR查询T-DNA的旁邻序列。

TAIL-PCR技术原理：TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR，该技术通过目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物，用它们分别和随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD）组合，以基因组DNA为模板，进行连续的三轮PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，从而从已知序列扩增旁邻未知序列。该技术广泛应用于插入突变体库的侧翼序列分离。本实施例TAIL-PCR反应体系和程序如下：

Tail-PCR1

ddH2O9.3μl10×Buffer2μlMg2+(2.5mM)2μl

dNTP(2.5mM)1.5μlArbitraryprimer(20μM)2μl

T-DNA1primer(2μM)2μlrTaq(5U/μl)0.2μl

GenomicDNA(50ng/μl)1μl

Total20μl

Tail-PCR2

ddH2O8.3μl10×Buffer2μlMg2+(2.5mM)2μl

dNTP(2.5mM)1.5μlArbitraryprimer(20μM)2μl

T-DNA1primer(2μM)2μlrTaq(5U/μl)0.2μl

Tail-1PCRProduct(dilute×100)2μl

Total20μl

Tail-PCR3

ddH2O25μl10×Buffer5μlMg2+(2.5mM)2.5μl

dNTP(2.5mM)2μlArbitraryprimer(20μM)5μl

T-DNA1primer(2μM)5μlrTaq(5U/μl)0.5μl

Tail-2PCRProduct(dilute×100)5μl

Total50μl

PCR程序如下：

Tail-1PCR程序Step14℃,2分钟Step293℃,1分钟

Step395℃,1分钟Step494℃,0.5分钟Step562℃,1分钟

Step672℃,2.5分钟Step7Gotostep4for4morecycles

Step894℃,0.5分钟Step925℃,3分钟

Step10Rampat0.2degreespersecondto72.0degrees

Step1172℃,2.5分钟Step1294℃,10秒

Step1368℃,1分钟Step1472℃,2.5分钟

Step1594℃,10秒Step1668℃,1分钟

Step1772℃,2.5分钟Step1894℃,10秒

Step1944℃,1分钟Step2072℃,2.5分钟

Step21Gotostep12for14morecycles

Step2272℃,5分钟Step234℃,保温Step24End

Tail-2PCR程序

Step14℃,2分钟Step294℃,10秒Step364℃,1分钟

Step472℃,2.5分钟Step594℃,10秒Step664℃,1分钟

Step772℃,2.5分钟Step894℃,0.5分钟Step944℃,1分钟

Step1072℃,2.5分钟

Step11Gotostep2for11morecycles

Step1272℃,5分钟Step134℃,保温Step14End

Tail-3PCR程序

Step14℃,2分钟Step294℃,10秒Step344℃,1分钟

Step472℃,2.5分钟Step5Gotostep2for19morecycles

Step672℃,5分钟Step74℃,保温Step8End

在第三轮PCR（Tail-PCR3）结束后，将第二轮和第三轮PCR产物，分别跑琼脂糖胶，比较电泳主带的大小，将目的片段切胶、回收、连接、转化和测序。

结果发现一个植物特异的基因OsREM6.6与突变体的性状相关。

通过RT-PCR检测该基因转录水平的表达，图1为突变体的鉴定及突变基因OsREM6.6表达分析结果，在该突变体中，基因OsREM6.6的表达提高。

(A)：Tail-PCR鉴定T-DNA插入在四号染色体BACOSJNBa0058K23上Os04g52920基因ATG上游462bp处；

(B)：RT-PCR分析OsREM6.6在各个组织中的表达，LB：叶片，C：茎秆，R：根，LS：叶鞘，DG：发育中的种子；

(C)：通过基因组DNAPCR验证T-DNA插入位置，WT：野生型，M：突变体；

(D)：OsREM6.6在野生型和突变体叶片中的表达；

(E)：组成型过表达OsREM6.6转基因植株(ROX)叶片中OsREM6.6的表达；

(F)：反义抑制OsREM6.6转基因植株(RKD)叶片中OsREM6.6的表达；

(G)：启动子GUS活性相对定量分析，OsREMP₁₇₀₀-GUS：ATG上游1700bp的DNA片段驱动GUS报告基因表达，OsREMP₄₆₀-GUS：ATG上游460bp的DNA片段驱动GUS报告基因表达，Fl：孕穗期小花，Pe：花梗，In：最上节间。

实施例3OsREM6.6基因对水稻种子结实率和产量的影响

在人工气候室（设定参数为：12小时光周期、光照强度200~250μmol·m^-2·s^-1、温度28±1℃）观察，发现OsREM6.6基因直接调控水稻种子结实率和产量。

在种子成熟期，对野生型（WT）和突变体（M）的各项形态指标进行统计分析，图2显示突变体的结实率显著降低，(A)为野生型和突变体种子成熟期穗部表型；(B)为野生型和突变体各取10个独立的株系对种子结实率(Seedsettingrate)、千粒重(1000-grainweight)、颖花数(Spikeletnumber)、种子长度(Grainlenght)、种子宽度(Grainwidth)、种子厚度(Grainthickness)、分蘖数(Tillernumber)、株高(Plantheight)和节间长度(Internodelenght)分别进行统计，(A)中Bar=3cm。

结果表明，基因OsREM6.6的表达提高的突变体的结实率显著降低。

实施例4过表达OsREM6.6显著降低结实率和株高

农杆菌介导法的转化，调控水稻中OsREM6.6基因的表达，获得具有不同结实率的水稻。

图3显示在不同发育时期，野生型(WT)、OsREM6.6过表达(ROX)和OsREM6.6反义下调表达(RKD)植株的表型分析结果：

(A)为分蘖期WT、ROX、RKD（由左到右）植株形态，Bar=10cm；

(B)为灌浆期WT、ROX、RKD（由左到右）植株形态；

(C)为成熟期WT、ROX、RKD（由左到右）穗部表型，Bar=3cm；

(D)为WT、ROX和RKD种子结实率、千粒重、颖花数、种子长度、种子宽度、种子厚度、分蘖数、株高和节间长度的统计分析结果。

以上结果表明，过表达OsREM6.6显著降低结实率和株高，OsREM6.6反义下调表达(RKD)植株则结实率上升，种粒长、宽、高增加。

实施例5

通过启动子-GUS报告基因系统和OsREM6.6特异抗体的免疫定位分析，发现该基因/蛋白始终在韧皮部伴胞细胞中特异表达。

OsREM6.6的启动子驱动GUS报告基因转化水稻后，对OsREM6.6在各组织器官中的表达做GUS染色，图5显示OsREM6.6在水稻各组织器官中的表达模式：(A)根；(B)根的成熟区横切；(C)幼茎茎间横切；(D)成熟茎茎间横切；(E)源叶叶片；(F)源叶叶片横切；(G)抽穗期的花；(H)抽穗期花的中部横切；(I)15DAF的种子；(J)穗轴横切；(K)不同孕穗时间的花；(A,C,D,E,G-K)中Bars=500μm；(B,F)中Bars=50μm。

以上结果显示，OsREM6.6启动子驱动GUS报告基因在维管组织的韧皮部特异染色。

稳定转化OsREM6.6启动子GUS的T1种子，在不同萌发时期的的GUS染色，图6显示水稻OsREM6.6在种子萌发过程中的表达模式，(A)从胚根起始到胚根生长到5mm完整种子的GUS染色；(B)从萌发起始到胚根生长到5mm沿种子背部的维管束纵切的GUS染色，Bars=1mm。

图7显示水稻OsREM6.6伴胞细胞特异表达，(A)茎秆第一节间横切；(B)茎秆第二节间横切；(C)茎秆第三节间横切；(D)茎秆第三节间纵切；(E)为(D)中茎秆第三节间纵切的放大图；(F)为野生型植株幼茎茎间的免疫原位，右下角插入小图为阴性对照；Bars=50μm。

实施例6

通过PCR获取不同长度的截短启动子片段融合GUS报告基因，利用农杆菌介导转化，对获得的阳性植株进行GUS活性检测，发现适度截短该启动子能调节该启动子的强度但不改变其伴胞特异表达的特性（图8）。

利用OsREM6.6融合GFP(绿色荧光蛋白)构建亚细胞定位载体，农杆菌侵染瞬时转化烟草叶片和PEG介导的原生质体转化均发现，该基因编码的蛋白特异并稳固的定位于细胞膜（图8）。

图8显示突变体中T-DNA的插入不改变OsREM6.6的组织定位，其中，图8A显示野生型幼茎茎间的免疫原位；图8B显示OsREM6.6突变体幼茎茎间的免疫原位；图8C显示OsREM6.6启动子全长RemP₁₇₀₀-GUS植株第三节间GUS染色；图8D显示OsREM6.6启动子片段RemP₄₆₀-GUS植株第三节间GUS染色；Bars=50μm。

实施例7

通过一系列的截短蛋白片段融合GFP构建亚细胞定位载体，利用PEG介导的原生质体转化，发现该蛋白C-末端的47个氨基酸片段负责该蛋白的细胞膜靶向和定位，并且该片段可指导外源蛋白（如,GFP）的质膜定位（图9，图10）。

图10.水稻OsREM6.6质膜定位区段的鉴定，采用烟草叶片原生质体(A,B,E,F,I,J,M,N,Q,R)和烟草叶片注射(C,D,G,H,K,L,O,P,S,T,U,V,W,X)瞬时表达系统，观察OsREM6.6蛋白不同截短区段的亚细胞定位。其中，(A-D)GFP-OsREM531;(E-H)GFP-OsREM414;(I-L)GFP-OsREM118;(M-P)GFP-OsREM71;(Q-T)GFP-OsREM47;(U,V)GFP-OsREM28和(W,X)GFP-OsREM19。

实施例8

利用一种常用的蛋白转运抑制剂BFA（BrefeldinA），阻断蛋白质经由高尔基体途径分泌。OsREM6.6融合GFP对BFA处理不敏感，证实该蛋白的质膜靶向和定位不依赖于高尔基体分泌途径（图11）。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的来源于水稻的Remorin多肽或其编码基因的用途，其特征在于，所述多肽或其编码基因用于调节水稻的结实率，和/或粒重，和/或产量，其中所述的“调节”为降低水稻的结实率，和/或粒重，和/或产量，并且，所述的Remorin多肽为SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽；所述的Remorin多肽的编码基因选自下组：

(A)编码如SEQIDNO.:2所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；

(E)与(A)-(B)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；且所述Remorin多肽或其编码基因的表达上调。

2.一种提高水稻结实率，和/或粒重，和/或产量的方法，其特征在于，包括步骤：降低水稻中源自水稻的Remorin多肽或其编码基因的表达或活性，其中，所述的Remorin多肽为SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽；所述的Remorin多肽的编码基因选自下组：

(A)编码如SEQIDNO.:2所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入反义表达Remorin多肽编码基因的多核苷酸序列的植物细胞或组织或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。