CN104693294A - 水稻温敏叶色突变基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻温敏叶色突变基因及其应用。具体地，本发明提供了一种水稻的温敏叶色基因OsTCD5。当OsTCD5基因发生突变时，可导致水稻具有温敏叶色性状。本发明还提供了OsTCD5基因的应用，尤其是作为选择标记的应用。本发明的温敏叶色基因OsTCD5特别适用于农作物(如水稻)的品种改良等领域。

Description

水稻温敏叶色突变基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种水稻温敏叶色突变基因及其应用。
背景技术
在植物基因工程中，需要用到筛选标记以方便筛选转化子，随着转基因植物的商品化，其安全性问题也逐渐引起了人们的高度重视，其中主要涉及筛选标记的安全性。目前，植物基因工程中使用的筛选标记主要是编码抗生素抗性或除草剂抗性蛋白的基因，但这些基因存在安全性方面的问题。为了提高转基因植物的安全性，人们开始寻找生物安全的筛选标记。使用生物安全标记基因不必担心由于“基因逃逸”而产生的应用生素失效，产生“超级杂草”，破坏生态平衡等问题，从而避免了由于使用抗生素或抗除草剂标记基因而引起的争议。
安全标记基因主要包括化合物解毒酶基因和糖类代谢酶基因两类。近几年，随着对生物代谢机理研究的不断深入，人们发现许多代谢过程中的关键酶基因可用作转基因植物的筛选标记，且由于它源于生物体内固有的代谢途径，属于绿色筛选标记。
水稻叶色突变体具有稳定，易于识别等优点，已被广泛应用于形态标记、品种改良等多个领域。而温敏感叶绿素缺失突变体是一类比较特殊的叶色突变体，在限制温度以下，突变体往往表现出突变表型(如白化、斑叶等)，改变温度到适宜温度时，叶片的表型可以恢复至绿色，与野生型植株表型一致。而温敏感叶色突变体在一些植物中有报道，如拟南芥、烟草、日本柳杉等。然而，这些温敏叶色相关基因大多不适合作为筛选标记。
同时，叶绿素合成是一个复杂的生物化学反应，被子植物中一共包含16步反应，在拟南芥和水稻中相关基因已经被克隆。温敏感叶绿素缺失突变体的特殊性和复杂性就在于受环境温度的影响而出现不同的表型，这一特征跟许多全生育期叶绿素缺失的突变体差异很大。植物体内存在一种或多种感知温度的转录因子，被环境温度激活后催化相应的基因表达，从而使植物适应环境温度。温敏叶绿素缺失突变体可能是一些在一定温度下表达的基因突变导致叶绿素合成通路中断，从而产生突变表型；当温度改变时，这些基因的作用被其他途径所取代，植物就恢复正常的表型。
到目前为止，人们虽然已经报道和克隆了一些受温度调控的基因，但是受调控的机制依然没有阐明。
本领域迫切需要开发一种安全的、操作简便的、可广泛用于转基因植物简便筛选和良性育种等领域的温敏叶色性状相关基因工程选择标记。
发明内容
本发明的目的就是提供一种优异、安全、操作性强且用法便捷的基因工程选择标记。
在本发明的第一方面，提供了一种TCD5多肽或其编码基因的用途，所述多肽或其编码基因用于调节或提供植物的温敏叶色性状，或被用作转基因植物的选择标记。
在另一优选例中，所述的选择标记的标记性状为温敏叶色变异。
在另一优选例中，所述的温敏叶色变异指在低温(低于25℃，较佳地≤20℃，如15-20℃)，叶片或叶片的一部分(如叶尖)表现为白色；在高温条件下(高于28℃，较佳地≥30℃，如30-35℃)时，叶片表现为绿色。
在另一优选例中，所述的TCD5多肽或其编码基因来自水稻。
在另一优选例中，所述的TCD5多肽选自下组：
优选地，所述的TCD5多肽任选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有提供温敏叶色的功能、由(i)衍生的多肽；或
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，具有提供温敏叶色的功能的多肽；
较佳地，所述的TCD5多肽的编码基因选自下组：
(A)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；
(B)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；
(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；
(D)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的TCD5多肽是无单加氧酶活性的突变型蛋白。
在另一优选例中，所述的突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中，所述的TCD5多肽的编码基因编码无单加氧酶活性的突变型TCD5蛋白。
在另一优选例中，所述突变型TCD5多肽的编码基因是序列如SEQ ID NO.:3所示。
在本发明的第二方面，提供了一种调节植物温敏叶色的方法，包括步骤：降低所述植物中TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
在本发明的一个优选例中，所述植物为水稻。
在本发明的一个优选例中，所述方法包括敲除TCD5基因、或使TCD5蛋白失活，从而降低TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
在另一优选例中，所述的降低是通过敲除所述植物中的TCD5基因实现的。
在另一优选例中，所述的降低是通过向所述植物中转入干扰野生型TCD5基因表达的抑制剂实现的。
在另一优选例中，所述的抑制剂包括miRNA或表达miRNA的载体。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有反义表达TCD5多肽编码基因的多核苷酸序列；
(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使反义表达TCD5多肽编码基因的多核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(c)选择已转入反义表达TCD5多肽编码基因的多核苷酸序列的植物细胞或组织或器官；
(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。
在本发明的一个优选例中，所述方法包括：
(i)提供一植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞的染色体不含编码具有单加氧酶活性的TCD5编码基因；
(ii)将编码突变型TCD5多肽的编码基因，导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。
在另一优选例中，所述的突变型TCD5多肽是无单加氧酶活性的。
在本发明的第三方面，提供了一种TCD5基因或其TCD5多肽在筛选调节水稻的温敏叶色性状的促进剂或拮抗剂中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种筛选调节温敏叶色性状的促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在测试组中，在待测物质存在下，培养水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞或水稻中TCD5多肽的表达量和/或活性，其中表达量记为E1，活性大小记为A1；
并且，在对照组中，在与测试组相同的但无待测物质存在的条件下，培养相同类型的水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞或水稻中TCD5多肽的表达量和/或活性，其中表达量记为E0，活性大小记为A0；
(b)比较测试组和对照组中TCD5多肽的表达量和/或活性，
其中，如果E1显著高于E0和/或A1显著高于A0，则提示所述待测物质是抑制温敏叶色性状的抑制剂；
如果E1显著小于E0和/或A1显著小于A0，则提示所述待测物质是促进温敏叶色性状的促进剂。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指E1/E0≥2；或A1/A0≥2。
在另一优选例中，所述的“显著低于”指E1/E0≥0.5；或A1/A0≥0.5。
在本发明的第五方面，提供了一种挑选转入外源基因的转基因植物的方法，包括步骤：
(1)提供一转基因构建物，所述构建物包括待转入的外源基因以及标记基因，其中所述的标记基因编码无单加氧酶活性的突变型TCD5蛋白；
(2)将所述的转基因构建物导入一植物细胞，并获得转基因的所述植物细胞；
(3)培养步骤(2)获得的植物细胞，从而获得转基因的植物；
(4)观察所述转基因植物的温敏叶色性状，挑选出具有温敏叶色性状的植株，作为转入外源基因的转基因植物；和
(5)任选地，测定步骤(4)中所述转基因植物中所述外源基因的表达情况。
在另一优选例中，所述的植物细胞为水稻细胞。
在另一优选例中，所述的植物细胞的染色体不含编码具有单加氧酶活性的TCD5编码基因。
在本发明的第六方面，提供了一种突变型TCD5多肽，所述的突变型TCD5不具有单加氧酶活性；较佳地，所述的突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列编码本发明第六方面所述的突变型TCD5多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第七方面所述的多核苷酸序列。
在本发明的第九方面，提供了一种细胞，所述的细胞含有本发明第八方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的本发明第七方面所述的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的细胞包括农杆菌细胞、植物细胞。较佳地，所述植物细胞为水稻细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1显示了嘉花1号(左)和突变体mr40(右)在不同温度下的叶色比较。其中，左图为将两者于低温20℃中培养的情况；中图为将两者于高温30℃培养的情况；右图为将两者于中间温度24℃培养的情况。
图2显示了野生型(即嘉花1号，图2A-2C)和突变体(即mr40，图2D-2F)在20℃生长时的叶绿体电镜观察结果。
图3显示了野生型(即嘉花1号，图2A-2C)和突变体(即mr40，图2D-2F)在32℃生长时的叶绿体电镜观察结果。
图4显示了OsTCD5基因的图位克隆示意图。
图5显示了突变体中LOC_Os05g34040cDNA序列与野生型序列比对分析。其中，RT3为突变体中LOC_Os05g34040cDNA序列，34040.1和34040.2为数据库中的cDNA序列。
图6显示了T1代OsTCD5互补转基因水稻植株低温表型。其中，从左到右依次为：突变体mr40，嘉花1号，转基因T1代mr40-OsTCD5-1以及mr40-OsTCD5-2。每个品系两株植株。
图7显示了T1代RNAi-OsTCD5转基因水稻植株低温环境表型。其中，从左到右依次为：突变体mr40，日本晴，T1代转基因日本晴-RNAi-OsTCD5-1，日本晴-RNAi-OsTCD5-2，日本晴-RNAi-OsTCD5-3。每个品系三株植株。
图8显示了嘉花1号与mr40突变体在大田环境下的农艺性状统计。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，首次利用图位克隆技术克隆了一种温敏叶色相关基因，该基因是水稻OsTCD5(thermo-sensitive chlorophyll deficient5)基因。实验证明，该基因是一种与温敏叶色性状非常相关的基因。当该单基因突变，就可出乎意料地导致水稻具有温敏叶色性状。该基因突变体水稻在低温条件下，叶片呈白色；24℃左右培养时，叶片为白绿相间；高温条件下，叶色恢复正常；且株高、穗数、穗长和千粒重等农艺性状均与野生型无差异。本发明人从而对该基因作了相应的分离、克隆、转基因、杂交和RNA干扰等相应实验，并在此基础上完成了本发明。
由于本发明的OsTCD5与温敏叶色性状密切相关，可在普通环境温度范围内(15-30℃)通过温度进行调控，并可方便地通过肉眼观测，因此特别适合作为转基因的选择标记，特别适用于农作物(如水稻)的品种改良。
TCD5多肽和编码基因
如本文所用，术语“本发明基因”、“TCD5基因”、“本发明的温敏叶色基因”、可以互换使用，都是指温敏感叶绿素缺失5基因(thermo-sensitivechlorophyll deficient5)。一种代表性的TCD5基因是来源于水稻的TCD5基因及其变体。
本发明的水稻TCD5基因包括(但并不限于)：野生型TCD5核苷酸序列，如SEQID NO.:1所示；以及突变型TCD5基因，如SEQ ID NO.:3所示。
如本文所用，术语“OsTCD5基因”、“水稻TCD5基因”可以互换使用，都是指来源于水稻的TCD5基因及其变体。
如本文所用，术语“本发明多肽”、“本发明蛋白”、“TCD5多肽”、“本发明的温敏叶色相关蛋白”可以互换使用，都是指来源于水稻等植物的、具有调节温敏叶色性状功能的TCD5多肽及其变体。在本发明中，TCD5多肽包括野生型和突变型，并且可以具有或不具有单加氧酶活性。一种特别优选的TCD5多肽是单加氧酶活性降低或丧失的突变型蛋白。
一种优选的来自水稻的TCD5多肽包括(但并不限于)：野生型的、具有单加氧酶功能的TCD5多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示；突变型的、不具有单加氧酶功能的TCD5多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:1或3)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调节水稻的结实率、粒重、产量等性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
在本发明中，SEQ ID NO.:l或3中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:l或3的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:l或3的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:l或3中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:l或3所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO.:3所示)具有一定同源性(保守性)的TCD5基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。
本发明涉及一种调节水稻温敏叶色的TCD5多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2或4所示。本发明的多肽能够有效维调节结实率，粒重、产量等性状。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:2或4所示序列具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指调节植物(如水稻)的温敏叶色的性状。
本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
表1
本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
表达载体和宿主细胞
本发明还提供了用于抑制TCD5蛋白表达的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要抑制目的基因时，将抑制目的基因的核苷酸序列连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将所述序列与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5'到3'方向)：启动子，外源序列，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。
包括外源序列的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
基因重组和选择标记
作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和外源序列(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和外源序列的载体片段整合到植物的染色体上。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还提供了一种调节或提供水稻温敏叶色性状的方法，包括步骤：降低水稻中TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。在本发明的一个优选例中，所述方法包括步骤：(a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述表达载体含有抑制TCD5多肽表达的编码序列；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使抑制TCD5多肽表达的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择已转入抑制TCD5多肽表达的编码序列的植物细胞、或组织、或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞、或组织、或器官再生为植株。
本发明还提供了一种改造水稻的方法，包括步骤：降低水稻中TCD5多肽的表达水平或活性。
本发明还提供了所述分离的TCD5多肽片段或其编码基因的用途，它们被用于制作温敏叶色突变体，还可以作为安全的基因工程中的选择标记，并可以应用于植物株系去杂保纯、培育或筛选转基因植物等。
应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于水稻的TCD5基因，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻同属于一科或属的植物)的、与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。
如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，可以为RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。
所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。
所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。
本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5'-3'依次具有下列元件：启动子、基因ORF序列、和终止子。
本发明还提供了一种包括本发明的基因表达盒的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5'到3'方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。
本发明的主要优点包括：
(1)提供了一种新颖的温敏叶色相关基因。
(2)本发明的温敏叶色相关基因特别适合作为一种优异、安全、操作性强且用法便捷的基因工程选择标记。本发明的选择标记与温敏叶色性状密切相关，可在普通环境温度范围内(15-30℃)通过温度进行调控，并可方便地通过肉眼观测。
(3)本发明的温敏叶色相关基因在遗传工程和作物遗传学方面有着广泛的应用前景，并可大大简化和缩短植株筛选和良种繁育等工作的步骤和研究周期。
(4)本发明的温敏叶色相关基因特别适用于农作物(如水稻)的品种改良。
(5)本发明的温敏叶色相关基因可作为优良的选择标记，用于基因工程中转基因植物的阳性筛选和杂交稻制种过程中不育系的去杂保纯。
(6)本发明的温敏叶色相关基因可以在水稻苗期评价杂交种子和不育系的纯度，实现阳性植株的简便筛选和简化良种繁育。
(7)可利用OsTCD5基因培育温度敏感的叶色变异体等观赏植物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 温敏叶色突变体的制备
本发明利用经60Co γ辐射诱变的水稻嘉花1号突变体库，筛选到一个水稻温敏叶色突变体。
该突变体在低温条件下（20℃）培养时，叶片为白色，并且在5叶期左右因营养耗尽死亡；在24℃条件下叶尖为白色，靠近基部的叶片呈绿色。而在高温条件下（30℃）培养时，该突变体的叶色恢复正常，其它农艺性状也均与野生型相比无差异，亦即如图8所示，株高、穗数、穗长和千粒重等农艺性状均与野生型无差异。
实施例2 温敏叶色突变基因位点的确定
1.实验材料：
本实施例中使用的水稻(Oryza sativa L.)材料为：嘉花1号(购自嘉兴市农科院)，日本晴(购自江苏省农业科学院粮食作物研究所)，嘉花1号的TCD5突变体(来自实施例1)。
2.分析和定位群体：
将嘉花1号叶色突变体与叶色正常品系培矮64s进行杂交。
F1代自交，得到F2群体。
初步定位后，再进一步扩大F2群体到1309株进行精细定位。在分蘖期，每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3.SSR标记定位OsTCD5基因：
采用水稻微量DNA的快速提取方法(该方法参照“李筱婷等一种适于PCR扩增的植物基因组快速提取新方法，2010年，农业生物技术学报”)，从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。
取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA。获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μl DNA样品。
OsTCD5基因的初步定位是利用有多态的引物对40株突变型F2植株进行连锁分析，发现OsTCD5基因和第5号染色体长臂端的SSR引物RM440和RM18692紧密连锁。
进一步扩大F2群体，并根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，新开发区间内的InDel标记，最终将基因定位在Indel3和Indel5之间，物理距离大概为35Kb。精细定位所用引物见表2(SEQ ID NO.:6-17)。
表2 OsTCD5基因精细定位所用引物
4、基因预测和比较分析：
根据精细定位的结果，在35kb范围内根据水稻基因组信息自动注释系统(RiceAutomated Annotation System，数据库网站为：http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有3个候选基因，分别是LOC_Os05g34030，LOC_Os05g34040和LOC_Os05g34050。
对3个基因进行测序，发现突变体中LOC_Os05g34030和LOC_Os05g34050的序列与对照无差异，而LOC_Os05g34040基因的5'端存在1个单碱基G的缺失(图5)，导致翻译的提前终止。
本发明人由此推测得到以下结论：LOC_Os05g34040是突变基因OsTCD5。
实施例3 OsTCD5互补实验
在突变基因的5'UTR上游约2000bp处设计上游引物(加BamHⅠ位点)，在3'UTR下游约1000bp处设计下游引物(加SalⅠ位点)，产物大小约为12.2kb，引物序列如下：
上游：5'-CGGGATCC GCTCAACTGAAAGGTTTACTGT-3'(SEQ ID NO.:18)
下游：5'-ACGCGTCGAC CCGTCTTTGTCAACACTATCAC-3'(SEQ ID NO.:19)
以包含目的基因的BAC克隆OSJNBa0092E07为模板，采用TAKARA公司的高保真酶HS DNA Polymerase进行PCR扩增。PCR产物电泳回收目的片段，与pCAMBIA1301分别进行双酶切反应，酶切5～6h左右回收目的片段，用T4连接酶(NEB,USA)16℃过夜连接。
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃过夜培养，鉴定阳性克隆，并测序验证序列的准确性。将此序列命名为pCAMBIA1301:TCD5。
利用嘉花1号的tcd5突变体种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤继代一次，用作转化的受体。利用基因枪转化方法用含有pCAMBIA1301:TCD5质粒载体轰击处于高渗培养基上的受体愈伤，恢复生长1天后转移至含有40mg/L Hygromycin的筛选培养基上，培养20天后抗性愈伤转移至含有50mg/L Hygromycin预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤再转至分化培养基中光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株在生根壮苗培养基上生长15天后进行炼苗，GUS鉴定和表型变异观察。基因枪转化方法中涉及的培养及配方如下：
诱导及继代培养基：MS+2mg/L 2，4-D。
高渗培养基：MS+2mg/L 2，4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇。
轮筛选培养基：MS+2mg/L 2，4-D+30mg/L潮霉素。
分化培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg/L潮霉素。
生根壮苗培养基：1/2 MS+0.1mg/L NAA。
注:以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar，pH5.8。
实验结果：获得了4株pCAMBIA1301:TCD5阳性转基因植株，待植株结实后，取T1代的种子（选取2个独立株系）与对照嘉花11和tcd5突变体种子一并在低温22度情况下萌发，苗期的表型（图6）表明pCAMBIA1301:TCD5转基因株系的后代均能够恢复亲本tcd5突变体叶片白化的表型，也证明水稻中有功能的OsTCD5基因确实控制低温下叶色的发育。
实施例4 OSTCD5RNAi载体构建及转化
原始干扰载体为pTCK303(中国专利申请03160092.1)。
OSTCD5基因的干扰载体构建如下：以OSTCD5基因的第3外显子为目的片段，设计引物时在5'端加上双酶切位点，序列如下：
F:GGGGTACC ACTAGT GCTGTTAAGAGACTTCTGGATT(KpnI&SpeI)(SEQ ID NO.:20)
R:CGGGATCC GAGCTC ACTACTAAGGCACCAATATCAC(BamHI&SacI)(SEQ ID NO.:5)
以嘉花1号的基因组为模板，扩增目的片段，连入T载体(购自Takara公司)测序，提取测序正确的质粒。将T质粒和pTCK303分别进行SpeI和SacI双酶切，回收目的片段后连接转化，挑选阳性克隆，提取质粒。将T载体质粒和上一步所提质粒分别进行KpnI和BamHI双酶切，回收目的片段后连接转化，挑选到的阳性克隆就是最终的干扰表达载体，命名为pTCK303-TCD5。按上述方法，利用基因枪转化方法用含有pTCK303-TCD5质粒轰击日本晴受体愈伤。对得到的抗性转基因植株进行GUS鉴定和表型变异观察。
实验结果：获得了6株pTCK303-TCD5阳性转基因植株，待植株结实后，取T1代的种子（选取3个独立株系）与对照日本晴和tcd5突变体种子一并在低温22度情况下萌发，苗期的表型（图7）表明pTCK303-TCD5转基因株系后代的叶片在低温下呈现白化的表型，此表型与tcd5突变体叶片白化的表型相同，而亲本日本晴在低温下叶片发育正常，呈绿色。这个结果也证明当水稻日本晴中OsTCD5基因表达受到干扰时，低温下叶色的发育会受到严重影响，表现为白化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)

1.一种TCD5多肽或其编码基因的用途，其特征在于，所述多肽或其编码基因用于调节或提供植物的温敏叶色性状，或被用作转基因植物的选择标记。
2.一种调节植物温敏叶色的方法，其特征在于，包括步骤：降低所述植物中TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括敲除TCD5基因、或使TCD5蛋白失活，从而降低TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)提供一植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞的染色体不含编码具有单加氧酶活性的TCD5编码基因；
(ii)将编码突变型TCD5多肽的编码基因，导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。
6.一种TCD5基因或其TCD5多肽在筛选调节水稻的温敏叶色性状的促进剂或拮抗剂中的应用。
7.一种筛选调节温敏叶色性状的促进剂或拮抗剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)在测试组中，在待测物质存在下，培养水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞或水稻中TCD5多肽的表达量和/或活性，其中表达量记为E1，活性大小记为A1；
并且，在对照组中，在与测试组相同的但无待测物质存在的条件下，培养相同类型的水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞或水稻中TCD5多肽的表达量和/或活性，其中表达量记为E0，活性大小记为A0；
(b)比较测试组和对照组中TCD5多肽的表达量和/或活性，
其中，如果E1显著高于E0和/或A1显著高于A0，则提示所述待测物质是抑制温敏叶色性状的抑制剂；
如果E1显著小于E0和/或A1显著小于A0，则提示所述待测物质是促进温敏叶色性状的促进剂。
8.一种挑选转入外源基因的转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一转基因构建物，所述构建物包括待转入的外源基因以及标记基因，其中所述的标记基因编码无单加氧酶活性的突变型TCD5蛋白；
(2)将所述的转基因构建物导入一植物细胞，并获得转基因的所述植物细胞；
(3)培养步骤(2)获得的植物细胞，从而获得转基因的植物；
(4)观察所述转基因植物的温敏叶色性状，挑选出具有温敏叶色性状的植株，作为转入外源基因的转基因植物；和
(5)任选地，测定步骤(4)中所述转基因植物中所述外源基因的表达情况。
9.一种突变型TCD5多肽，其特征在于，所述的突变型TCD5不具有单加氧酶活性；较佳地，所述的突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
10.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述的多核苷酸序列编码权利要求9所述的突变型TCD5多肽；
一种载体，所述载体含有上述的多核苷酸序列；
一种细胞，所述的细胞含有上述的载体，或其染色体中整合有外源的上述多核苷酸序列。
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