CN105111279A - Ace抑制肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ACE抑制肽及其应用。所述的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CA或CH。本发明的二肽CA或CH对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发现，二肽CA在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。
Description
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及ACE抑制肽及其应用。
背景技术：
高血压是全球最常见的慢性病,是导致心血管病和肾脏病等发生以及死亡的最主要危害因素。人体的血压调节主要是受到血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，RAS)和激肽系统(kallikreinkininsystem，KKS)控制，而血管紧张素转化酶(Angiotensinconvertingenzyme，ACE)在这两个系统中起着关键作用。ACE是一种羧基二肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中，主要以膜结合胞外酶的形式存在于血管上皮细胞。在RAS系统中，ACE能够使没有生理活性的血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)转化为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)。在KKS系统中，ACE可将血管舒缓激肽降解为失活片段，导致血管收缩，引起血压升高。目前高血压的药物治疗主要是对ACE进行抑制，阿利吉仑、卡托普利、依那普利、阿拉普利和赖诺普利都是广泛应用的抗高血压药物。然而，这些药物会引发诸如咳嗽、过敏、味觉紊乱和皮疹等副作用，因此，寻找安全可靠、毒副作用小的ACE抑制剂成为抗高血压药物研究的热点。
近年来，相关研究表明一些从动物、植物以及乳制品中分离得到的天然生物活性肽具有抑制ACE活性、降低血压的作用。相比传统降压药物这些天然活性肽具有特异性高、毒副作用小、疗效好、可用药剂量更大等优点。在这其中二肽和三肽可以在小肽转运蛋白(peptidetransporter)的帮助下被肠粘膜完整的吸收，因此，这些二肽和三肽对ACE的抑制作用以及降压效果也较为明显。目前尚未有研究对二肽的氨基酸构成以及其ACE抑制活性进行系统的分析研究。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供对ACE(血管紧张素转化酶)的活性具有持续稳定的抑制作用，具有良好降血压效果的ACE抑制肽。
本发明的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CA(Cys-Ala，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示)或CH(Cys-His，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供上述ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用。
一种ACE抑制药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。
本发明的第三个目的是提供上述ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。
一种降血压药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。
本发明的二肽CA或CH对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发现，二肽CA在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。
附图说明：
图1是二肽CA和CH的ACE抑制活性；
图2是CA灌胃后2小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以“平均值±标准误”形式表示。*p<0.05,**p<0.01表示给药前后血压发生显著变化；
图3是CA灌胃后4小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以“平均值±标准误”形式表示。*p<0.05,**p<0.01表示给药前后血压发生显著变化；
图4是灌胃后2小时SHR大鼠SBP随CA剂量增加呈线性下降趋势。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.实验部分
1.1实验材料和仪器
实验材料：35种合成二肽(由吉尔生化上海有限公司合成)、卡托普利(Captoril)、呋喃丙烯酰三肽(FAPhe-Gly-Gly，FAPGG)、ACE、原发性高血压大鼠(SpontaneouslyHypertensiveRats，SHR)、生理盐水
仪器设备：酶标仪、移液器、大小鼠无创血压仪，注射器，灌胃针，SPF实验室
1.2实验方法：
1.2.1ACE抑制率的测定
二肽的ACE抑制率使用可见分光光度法进行测定。具体方法是利用FAPGG作为ACE作用的底物，FAPGG最大吸收峰在340nm附近，用ACE将FAPGG水解成FAP和GG可使340nm附近处吸光度降低，降低的速率与ACE活性成正比。通过测定FAPGG在340nm附近处吸光度下降速度可计算出ACE的活性，进而根据添加抑制剂前后ACE酶活的变化间接反映不同ACE抑制剂的抑制活性。本实验将二肽样本用超纯水溶解后配置20mg/mL原液，然后稀释成20μg/mL浓度的样品作为实验组，以0.002μg/mL的卡托普利溶液为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。实验于37℃下，以340nm为主波长，405nm为参比波长，检测吸光度值的变化，连续检测1小时。根据公式：计算样品的抑制率。其中E为样品孔的ACE酶活(U/L)，计算公式为Ss为样品孔ACE动力学曲线直线段的斜率，Sp为未加抑制剂孔的ACE动力学曲线直线段的斜率，Sb为空白孔ACE动力学曲线直线段的斜率。
1.2.2大鼠降压实验
购买31周龄的原发性高血压大鼠，饲养一周适应环境后进行分组实验。按照如下剂量：卡托普利(100mg/kg)、生理盐水、CA(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、1mg/kg)将相应药品溶于生理盐水中利用灌胃方式进行给药。利用无创血压仪分别测量大鼠灌胃前、灌胃后2小时、灌胃后4小时后的舒张压(DiastolicBloodPressure，DBP)、收缩压(SystolicBloodPressure，SBP)和平均动脉压(MeanBloodPressure，MBP)，取其平均值作为相应的血压值。
1.2.3统计分析
数据统计采用R进行两样本均值单尾t检验，数值均以均值±标准误表示。
2.结果与讨论
2.135种二肽的ACE抑制率
本研究用可见光分光光度法连续监测35种二肽在一小时内对ACE的抑制活性，结果发现除IL、IV和KD外，其余32种二肽都对ACE有不同程度的抑制(表1)，在这其中CA和CH的ACE的抑制率分别达到了84.38％和70.79％(图1)，显著高于其他二肽。
表135种二肽的ACE的抑制率
| 二肽 | ACE抑制率(％) | 二肽 | ACE抑制率(％) |
| MF | 9.66 | IH | 7.10 |
| MW | 15.83 | KK | 4.39 |
| LW | 14.77 | CA | 84.38 |
| HY | 14.97 | CH | 70.79 |
| KF | 13.34 | KM | 6.00 |
| AP | 12.07 | KN | 4.35 |
| AT | 10.85 | ME | 2.57 |
| CP | 10.20 | IK | 2.96 |
| EA | 10.12 | IL | -7.01 |
| EC | 4.63 | IM | 0.99 |
| ET | 4.65 | IN | 2.24 |
| FM | 1.71 | IQ | 4.49 |
| GK | 5.27 | IS | 6.48 |
| GS | 10.56 | IT | 2.43 |
| HL | 10.79 | IV | -5.17 |
| HM | 9.96 | KD | -5.09 |
| HQ | 8.97 | FH | 10.06 |
| IA | 7.94 |
如图1所示1小时连续检测发现CA和CH对ACE的活性有持续稳定的抑制作用，其抑制效果与0.002μg/mL的卡托普利的作用效果相近。
2.2CA和CHIC50测定
研究对二肽CA和CH的ACE抑制活性进行更加精确的测定，浓度梯度实验结果显示CA的IC50值为23.22μM，CH的IC50值为61.17μM。
2.3CA体内降血压实验
相关研究表明部分ACE抑制剂的ACE抑制活性与实际降血压作用之间存在出入，因此，体外检测所得到的具有高ACE抑制率的二肽是否能在生物体内拥有好的降血压效果还需要进一步的动物实验来验证。在本研究中我们选用CA进行SHR大鼠降血压实验。用CA、生理盐水和卡托普利对SHR大鼠进行灌胃，并分别于给药后2小时、4小时监测大鼠的血压变化。
如图2所示当CA剂量为1mg/kg时，给药后2小时SHR大鼠血压无明显改变；当CA剂量达到10mg/kg时SHR大鼠血压开始呈下降趋势，其中SBP下降16.1±4.73mmHg(p<0.05)，下降较为明显。随着CA剂量不断提高，给药后2小时SHR大鼠血压下降幅度进一步增大，当CA剂量达到100mg/kg时SBP下降49.26±10.42mmHg，DBP下降45.58±9.27mmHg，MBP下降47.01±9.64mmHg，各指标均显著低于给药前(p<0.01)，降压效果与同等浓度的卡托普利持平。
我们在给药后4小时继续检测SHR大鼠血压变化。发现当CA剂量为10mg/kg时给药后4小时降压作用基本消失(图3)。而当CA剂量达到25mg/kg时，其降压效果则要优于给药后2小时。以SBP为例，用25mg/kg的CA灌胃SHR大鼠后4小时的SBP比给药前下降50.86±3.16mmHg(p<0.01)，比给药后2小时下降27.67±11.02mmHg(p＝0.09)；当CA浓度达到50mg/kg和100mg/kg时给药后4小时各血压指标血压也较给药后2小时低。DBP和MBP的变化与SBP一致。
由图2和图3可以看出SBP、DBP、MBP下降幅度随着CA剂量的增加整体呈上升趋势。但我们发现灌胃后2小时以上各指标下降值与CA剂量呈很好的正相关，而在灌胃后4小时以上各指标变化值与CA剂量呈非线性关系。利用pearson相关系数分析CA剂量与血压指标灌胃前后的改变量之间的相关性，得到CA对应的各项指标的相关系数。如表2所示，CA灌胃后2小时的各项血压指标的平均改变量与剂量的相关系数R2>0.8，说明CA急性药效与剂量呈线性正相关，CA急性药效的研究适宜在灌胃后2小时进行采样。图4反映了SHR大鼠给药后2小时SBP下降幅度随CA剂量增加呈线性增长。以上结果同时显示当CA剂量达到25mg/kg后，给药后4小时SHR大鼠血压下降幅度不再随剂量增加发生明显改变，SBP下降水平维持在50mmHg左右。
针对生物活性肽降血压效果的研究曾显示，不同长度的短肽在SHR大鼠体内的有效作用时间不同。二肽和三肽(如：IW、VW、LW、IY及LKP)因为较容易被肠粘膜完整的吸收，其达到最大药效的时间一般在给药后2小时左右，当时间超过2小时后其降压效果就逐步降低。而相对长一些的LKPNM、LVGRPRHQG和卡托普利的最大药效时间则是在给药后4～8小时不等。在本研究中我们发现CA在给药4小时后的降压效果优于给药后2小时。分析其原因可能与CA在体内吸收相较其他二肽更慢，或作用半衰期更长有关。
此外，从植物、动物或奶制品中分离得到的具有高ACE抑制活性的生物肽C端多为色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)，而N端多为脂肪类支链氨基酸如缬氨酸(V)和异亮氨酸(I)。氨基酸的构成与短肽和ACE的亲和能力紧密相关。而在本研究中我们对35种二肽进行了系统的筛选，发现仅有的两个N端为半胱氨酸的二肽CA和CH的ACE抑制活性明显高于其他二肽。提示N端为Cys同样有利于二肽和ACE结合，从而提高短肽的ACE抑制活性。这一发现为进一步的生物活性肽的降压研究提供了新的线索。
Claims (5)
1.ACE抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列为CA或CH。
2.权利要求1所述的ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用。
3.一种ACE抑制药物，其特征在于，含有权利要求1所述的ACE抑制肽作为活性成份。
4.权利要求1所述的ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。
5.一种降血压药物，其特征在于，含有权利要求1所述的ACE抑制肽作为活性成份。
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