CN103305578B

CN103305578B - 鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法

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Publication number: CN103305578B
Application number: CN201310216798.9A
Authority: CN
Inventors: 陈锦权; 方婷; 彭会娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2013-06-03
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2033-06-03
Also published as: CN103305578A

Abstract

本发明涉及一种鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，具体方法如下：对鲍鱼结缔组织用NaOH溶液进行预处理，洗至中性，以酸酶相结合的方式制备鲍鱼内脏结缔组织粗提液；对所制备的鲍鱼内脏结缔组织粗提液进行热预处理，以特定蛋白酶制备多肽，经纯化、干燥制得鲍鱼内脏结缔组织降压物质。本发明所涉及的鲍鱼内脏结缔组织降压物质富含疏水性氨基酸、脯氨酸等，体外表现为较强的ACE抑制率，体内具有良好的降压效果，可用于降压辅助剂及氨基酸补充剂的制备。

Description

鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法

技术领域

本发明涉及一种鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法。

背景技术

高血压是引发心脑血管类疾病如心肌梗塞、脑中风、心力衰竭及冠心病的重要危险因子。我国是个高血压大国，据《中国心血管病报告2011》我国高血压患者已近2亿，然而血压的长期增高对心脑血管类疾病产生的不良影响，已极大地影响了高血压患者的健康，近十几年来，患病人数以320万/年的速度新增。随着生活水平的不断提高与社会节奏的不断加快，高血压患者正呈现年轻化趋势，因此，高血压的预防及治疗已成为当今社会的一个重要课题。引发高血压的原因有很多,其中体内血管紧张素转换酶的调节作用被认为是最主要的原因之一。由于降血压药的长期服用将产生各种副作用，人们逐步倾向于高血压的预防与食疗保健,因此，食源性血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)已成为高血压研究领域的一个热点。国内外相关研究表明许多天然蛋白水解肽对ACE具有抑制的作用,从而，可以起到降血压的作用。

ACE抑制肽是一类可以抑制ACE活性的多肽类物质，与ACE的亲和度高于血管紧张素I或舒缓激肽，是一种对ACE活性区域竞争性的抑制剂；同时，此肽类物质一旦与ACE结合，便不会轻易从ACE结合区域释放，从而在一定程度上阻碍了ACE催化血管紧张素I生成具有升压作用的血管紧张素Ⅱ以及阻碍了舒缓激肽降解为失活片段的两个生化过程，最终达到降低血压的目的。Cushman等依据竞争性抑制剂和ACE活性区域的结合位点提出了模型假说，后来越来越多研究人员以该模型来解释ACE抑制肽的体内降压机制，并认为ACE抑制活性肽具有以下3个明显的结构特点:①N末端氨基酸一般为：Arg、Tyr、Gly、Val、Ala、Ile和Leu；②C末端氨基酸一般为Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu；③N末端氨基酸性质表现不明显,而C末端氨基酸的性质比较明显,主要为疏水性氨基酸,而且C末端氨基酸对ACE抑制肽活性的影响最大。因此，有必要选用C末端疏水性氨基酸、芳香族氨基酸及脯氨酸含量均较高的材料为制备降压物质的原料。相关研究表明，鲍鱼内脏富含蛋白、活性多糖、纤维素酶等活性物质，胶原是鲍鱼内脏结缔组织中含量最丰富的一种蛋白。然而，鲍鱼的食用及深加工，多以腹足为主，占总重30～40%的脏器大部分被丢弃，极少部分用于加工成动物饲料，资源利用率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，它包含以下步骤：

（1）鲍鱼内脏结缔组织的预处理：将鲍鱼内脏结缔组织置于NaOH溶液中浸泡，浸泡完后将鲍鱼内脏结缔组织洗至中性，即得产品A；

（2）鲍鱼内脏结缔组织粗提液的制备：鲍鱼内脏结缔组织粗提液的制备：以胃蛋白酶与冰醋酸相结合的酶解方式处理产品A，即得产品B；

（3）鲍鱼内脏结缔组织粗提液的预处理：将产品B置于85～100℃的条件下，进行热预处理5～15min，即得产品C；

（4）鲍鱼内脏结缔组织粗提液的再次酶解：以中性蛋白酶再次酶解产品C，灭酶，离心，去除沉淀，取上清液，即得产品D。

进一步地，本发明制备降压物质的方法还包括：

（5）鲍鱼内脏结缔组织降压物质D的纯化：以截留分子量为3～10KD的超滤膜对产品D进行超滤处理后，取透过超滤膜的液体，流经由阴阳离子交换树脂所构成的混床进行脱盐。

进一步地，本发明还包括产品干燥：将步骤4获得的滤液经浓缩、干燥；或将经过步骤5脱盐后的滤液经过浓缩、干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂。

进一步地，所述的阴阳离子交换树脂是将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂按1：3的重量比混合而得；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。

进一步地，所述的脱盐后浓缩、干燥方法具体为：温度控制在60℃以下蒸发浓缩或温度控制在0℃以下冷冻浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥脱除水分后得到鲍鱼内脏降压物质粉剂。

进一步地，所述的NaOH溶液浸泡鲍鱼内脏结缔组织的具体条件为：NaOH溶液的浓度为0.05～0.15mol/l、浸泡时间为5～7h、浸泡温度0～4℃。

进一步地，所述的胃蛋白酶加酶量以产品A干重计为200～280u/g；冰醋酸浓度为0.05～0.5mol/l；酶解温度为4～25℃；酶解时间为24～48h。24～48h

进一步地，所述的鲍鱼内脏结缔组织粗提液的再次酶解具体为：所述的中性蛋白酶加酶量以产品C干重计为10000～14000u/g；酶解温度为45～55℃；pH值为6.5～7.5；酶解时间为5～7h；所述灭酶方式为水浴灭酶，灭酶温度为85～100℃；灭酶时间为5～15min。

较之现有技术而言，本发明以鲍鱼内脏结缔组织为原料，经胃蛋白酶特异性水解C-末端的同时作用芳香族氨基酸所组成的肽键，进而可制备C-末端富含疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的鲍鱼内脏结缔组织降压物质；此外，降压物质中脯氨酸的含量约占总氨基酸的10％～12％；这可为ACE抑制活性肽的制备提供保障。本发明充分利用鲍鱼的食用及深加工中无法食用的脏器来制备降压物质，合理并提高了鲍鱼的有效使用率。

附图说明

图1：SHR各实验组大鼠增重情况。

图2：WKY各实验组大鼠增重情况

图3：一次给药实验中SHR自身血压值下降趋势

图4：长期给药实验中SHR血压值变化趋势

图5：实施例4所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质自动分析结果

具体实施方式

本发明提供一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法，主要步骤包括：

鲍鱼内脏结缔组织→于0～4℃，0.05～0.15mol/l的NaOH溶液中浸泡5～7h→洗至中性→胃蛋白酶与冰醋酸相结合进行酶解→鲍鱼内脏胶原粗提液→85～100℃热预处理5～15min→中性蛋白酶再次酶解5～7h→85～100℃水浴灭酶5～15min→离心，去除沉淀→收集上清液→3～10KD分子膜超滤→取透过超滤膜的液体→流经阴阳离子交换树脂混床→浓缩→干燥。

实施例1

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（1）取已洗净的鲍鱼内脏结缔组织1.0kg，以NaOH溶液（C_NaOH=0.05mol/l），0℃下浸泡7h，洗至中性，即得产品A。

（2）于25℃，胃蛋白酶按280u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰醋酸=0.05mol/l）相结合酶解A48h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为18.35%。

（3）将产品B于85℃的条件下，进行热预处理15min，即得产品C。

（4）于45℃、pH值7.5的条件下，中性蛋白酶按14000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C7h后，85℃水浴灭酶15min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以3KD分子膜超滤产品D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为46.57%。

实施例2

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（1）取已洗净的鲍鱼内脏结缔组织1.0kg，以NaOH溶液（C_NaOH=0.15mol/l），4℃下浸泡5h，洗至中性，即得产品A。

（2）于4℃，胃蛋白酶按200u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰 _醋酸=0.5mol/l）相结合酶解产品A24h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为22.28%。

（3）将产品B于100℃的条件下，进行热预处理5min，即得产品C。

（4）于55℃、pH值6.5的条件下，AS.1398中性蛋白酶按10000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C5h后，100℃水浴灭酶5min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以10KD分子膜超滤产品D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为54.63%。

实施例3

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（1）取已洗净的鲍鱼内脏结缔组织1.0kg，以NaOH溶液（C_NaOH=0.1mol/l），2℃下浸泡6h，洗至中性，即得产品A。

（2）于20℃，胃蛋白酶按240u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰醋酸=0.25mol/l）相结合酶解产品A36h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为20.05%。

（3）将产品B于90℃的条件下，进行热预处理10min，即得产品C。

（4）于50℃、pH值7.0的条件下，中性蛋白酶按11000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C6h后，95℃水浴灭酶8min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以5KD分子膜超滤D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为51.72%。

实施例4

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（1）取已洗净的鲍鱼内脏结缔组织1.0kg，以NaOH溶液（C_NaOH=0.1mol/l），4℃下浸泡6h，洗至中性，即得产品A。

（2）于15℃，胃蛋白酶按240u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰醋酸=0.5mol/l）相结合酶解产品A48h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为23.26%。

（4）于50℃、pH值7.0的条件下，中性蛋白酶按12000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C6h后，85℃水浴灭酶15min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以3KD分子膜超滤产品D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为65.39%。

实施例5

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（2）于10℃，胃蛋白酶按240u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰醋酸=0.5mol/l）相结合酶解产品A48h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为23.26%。

（4）于53℃、pH值7.5的条件下，中性蛋白酶按14000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C7h后，100℃水浴灭酶5min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以8KD分子膜超滤产品D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为56.85%。

实施例6

一种鲍鱼内脏降压物质的制备方法如下：

（2）于4℃，胃蛋白酶按240u/g（以产品A干重计）加入，与冰醋酸（C_冰 _醋酸=0.5mol/l）相结合酶解产品A48h，即得产品B，此条件下鲍鱼内脏结缔组织的胶原提取率为23.26%。

（3）将产品B于100℃的条件下，进行热预处理15min，即得产品C。

（4）于55℃、pH值7.0的条件下，中性蛋白酶按12000u/g（以产品C干重计）加入，再次酶解产品C6.5h后，100℃水浴灭酶5min，离心，去除沉淀，收集上清液，即得产品D。

（5）以3KD分子膜超滤产品D后，取透过超滤膜的液体，流经由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂按1：3的重量比混合所构成的混床进行脱盐，45℃蒸发浓缩，冷冻干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂，此条件下体外ACE抑制率为60.55%。

对实施例1～6所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质先进行体外ACE抑制率的测定，再筛选体外ACE抑制率最高的进行动物试验，验证其在体内的降压效果。

体外ACE抑制率的测定

水解液ACE体外抑制率的测定参照Cushman的测定方法，并加以改进。

（1）试剂的配制：

硼酸-硼砂缓冲液（0.1mol/l，pH为8.3，含0.3mol/lNaCl）的配制：称取12.3680g硼酸，加热溶解后用去离子水定容至1L备用，并记为A液。称取19.0716g硼砂（Na₂B₄O₇.10H₂O）,加热溶解后用去离子水定容至1L备用，并记为B液。量取A液325ml与B液175ml，混合并用HCl或者NaOH调节pH至8.3后加入17.5320gNaCl，并定容至1L即可；

ACE溶液：取0.1UACE溶于1ml硼酸-硼砂缓冲液（0.1mol/l，pH为8.3，含0.3mol/lNaCl），分装后-20℃保藏；

HHL溶液：取0.0086gHHL溶于4ml硼酸-硼砂缓冲液（0.1mol/l，pH为8.3，含0.3mol/lNaCl），即配成5mmol/l的HHL溶液，分装后-20℃保藏；

1mol/lHCl溶液：取45ml浓盐酸，用蒸馏水定容至500ml的容量瓶中，并转入磨口试剂瓶中；

（2）样品溶液的配制：取各酶解上清液，用大孔吸附树脂静态脱盐处理后乙醇解吸并冻干成品，取各成品1mg溶于1ml硼酸-硼砂缓冲液（0.1mol/l，pH为8.3，含0.3mol/lNaCl）。

（3）其具体操作方法如表1所示：

表1ACE体外抑制率测定方法

Tab.1The assay for ACE inhibitory activity in vitro

其ACE体外抑制率如计算式（1）所示：

式中：

OD_对照组—反应中不加抑制剂（即不加样品溶液），ACE与HHL完全反应的OD值；

OD_样品组—反应中加入抑制剂（即样品溶液）的OD值；

OD_空白组—ACE与HHL空白反应的OD值。

其中实施例1～6所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质，在体外均表现较强的体外ACE抑制率，其中以实施例4所制备的体外ACE抑制率最高，为65.39%；并通过对实施例4所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质进行氨基酸自动分析，分析结果如附件1所示，其结果表明，鲍鱼内脏结缔组织降压物质氨基酸含量丰富，氨基酸总量占干基的71.77%，种类较为齐全，共检出17种氨基酸；其甘氨酸含量最高，为15.79％，脯氨酸含量为8.93%；同时，含有两种芳香族类氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸，其含量分别为2.00%、1.88%；含有8种疏水性氨基酸，其含量占总氨基酸含量的36.60%。据Cheung等人提出的降压肽模型假说，多肽疏水性氨基酸的含量、芳香族氨基酸的含量、及脯氨酸的含量均与其酶解物ACE抑制活性密切相关。

鲍鱼内脏结缔组织降压物质体内降压效果的验证

以实施例4所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质短期、长期灌胃给药于SHR、WKY大鼠，验证所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质的体内降血压功效。

1、试验方法

（1）研究对象

自发性高血压大鼠（SHR）：体重220g，9周龄，SPF级雄性大鼠25只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；

京都wistar大鼠(WKY)：体重220g，9周龄，SPF级雄性大鼠20只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

（2）饲养条件

SHR与WKY均饲养于实验动物中心屏障环境内，其环境温度为21-25℃，相对湿度50%-70%，压差7-10Pa，每天光照12h，均用标准饲料饲喂，大鼠自由进食和饮水。

（3）实验动物分组

购买的SHR与WKY大鼠于实验动物中心屏障环境内的检验检疫室适应1周后，将25只SHR随机分成5组，20只WKY随机分成4组，其具体的实验安排如表2所示。

表2动物实验设计表

Tab.2The design table of animal experiment

（4）给药样品的配制

鲍鱼内脏结缔组织降压物质的配制：根据实验给药剂量的设计，准确称取各剂量组的鲍鱼内脏结缔组织降压物质，以0.9％的生理盐水充分溶解并定容至一定体积，置于4℃的冰箱中保存。

卡托普利溶液的配制：根据实验给药剂量的设计，准确称取所需的卡托普利，以0.9％的生理盐水充分溶解并定容至一定体积，置于4℃的冰箱中保存。

（5）大鼠血压的测定

将大鼠装入鼠笼，36℃下预热，使大鼠尾部动脉充分扩张，待监视器上出现正常的脉搏波形并稳定后进行测定，每只老鼠重复测定多次，记录收缩压，并进行统计分析。

（6）短期降血压效果研究

以灌胃给药的方式进行初次给药，观察各个实验组在初次灌胃后0～6h的血压变化情况。

（7）长期降血压效果研究

以灌胃给药的方式进行多次给药，给药时间15～30d，每3d测定大鼠的血压值，观察各个实验组在多次灌胃后的血压、体重变化情况。

2、结果与分析

2.1鲍鱼内脏结缔组织降压物质对SHR大鼠体重的影响

在长期灌胃给药期间，同时观察了各实验组大鼠体重的变化情况，灌胃30天内SHR各实验组大鼠体重的变化情况如表3与图1所示。

表3SHR实验组大鼠增重情况（单位：g）

Tab.3The rats weight gain of each SHR group(unit:g)

注：*表示与SHR药物组相比，p＜0.05，差异显著

从图1可看出，SHR各实验组大鼠的体重均随着灌胃时间的延长而增长，由表3可知，灌胃30天后SHR空白组大鼠增重SHR低剂量组大鼠增重SHR中剂量组大鼠增重SHR高剂量组大鼠增重SHR药物组大鼠增重经数据统计分析得出，在灌胃第21天、第24天、第27天，SHR中剂量组大鼠较SHR药物组大鼠增重差异显著（P＜0.05），但与SHR空白组大鼠相比，其增重差异并不显著（P＞0.05），且灌胃30天后SHR各实验组间大鼠增重无显著性差异，即可说明鲍鱼内脏结缔组织降压物质对SHR大鼠的摄食量无显著性影响，对SHR大鼠正常生长无妨碍。

2.2鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY大鼠体重的影响

在长期灌胃给药期间，同时观察了各实验组大鼠体重的变化情况，30天内WKY各实验组大鼠体重的变化情况如表4与图2所示。

表4WKY实验组大鼠增重情况（单位：g）

Tab.4The rats weight gain of each WKY group(unit:g)

注：*表示与WKY空白组相比，p＜0.05，差异显著；▼表示与WKY药物组相比，p＜0.05。

从图2可看出，WKY各实验组大鼠的体重均随着灌胃时间的延长而增长，由表4可知，灌胃30天后WKY空白组大鼠增重WKY中剂量组大鼠增重WKY高剂量组大鼠增重WKY药物组大鼠增重经数据统计分析得出，在灌胃第3天，WKY高剂量组大鼠较WKY空白组大鼠和WKY药物组大鼠增重差异显著（P＜0.05），但在之后的长期给药期间，其增重差异并不显著（P＞0.05），WKY高剂量组增重并不表现连续性差异显著；灌胃30天后WKY各实验组间大鼠增重无显著性差异，即可说明鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY大鼠的摄食量无显著性影响，对WKY大鼠正常生长无妨碍。

2.3鲍鱼内脏结缔组织降压物质短期降血压效果研究

（1）对SHR大鼠短期降血压效果研究

按表1设计的剂量，以灌胃给药的方式进行一次性给药于SHR各实验组大鼠，分别于灌胃1h、3.25h、5.5h后测量SHR各实验组大鼠的血压值，以收缩压（systolic blood pressure，SBP）为指标，评价鲍鱼内脏结缔组织降压物质对SHR大鼠血压的影响，其实验结果如表5与图3所示。其中，下文大鼠血压值均指大鼠SBP值。

表5一次给药实验中SHR收缩压值变化结果（单位：mmHg）

Tab.5The variation of SHR systolic blood pressure value with a single administration(unit:mmHg)

注：与SHR空白组相比，*表示差异显著（0.01＜P＜0.05）,**表示差异极显著（P＜0.01）；

与SHR药物组相比，▼表示差异显著（0.01＜P＜0.05）,▼▼表示差异极显著（P＜0.01）；

同一行中上标相同字母代表差异不显著(P＞0.05)，标不同字母代表差异显著(P＜0.05)。

由表5及图3可知，SHR各实验组大鼠的基础血压差异均不显著；与SHR空白组血压相比，SHR低剂量组、SHR中剂量组、SHR高剂量组及SHR药物组在一次性灌胃给药后，其血压值都有显著性降低；与给药前SHR各血压相比，SHR中剂量组、SHR高剂量组及SHR药物组在一次性灌胃给药后，其血压值均显著性地降低。其中，SHR低剂量组在灌胃3h后，血压出现明显地下降，在灌胃第3.25h后，其血压下降14.79mmHg，较SHR空白组差异显著（P＜0.05），灌胃5h后血压开始回升，到5.5h时血压回升到与给药前SHR低剂量组血压无显著性差异（P＞0.05）；SHR中剂量组在灌胃1h后，血压下降13.13mmHg，到灌胃3.25h时血压下降16.43mmHg，均与给药前SHR中剂量组血压及SHR空白组血压差异显著（P＜0.05），4h后血压开始回升，5.5h时血压回升到与初始血压无显著性差异（P＞0.05）；SHR高剂量组血压在灌胃1h后，血压下降14.68mmHg，与SHR空白组血压相比，差异极显著（P＜0.01），灌胃3.25h时，血压为与初始血压相比，差异显著（P＜0.05），与SHR低剂量组、SHR中剂量组及SHR药物组相比，4h后血压回升较平缓，灌胃5.5h时血压回升到与初始血压相比，差异仍显著（P＜0.05），从中可知，SHR大鼠短期血压的下降值与鲍鱼内脏结缔组织降压物质剂量呈现一定程度的依赖关系；SHR药物组血压下降的幅度最大，在3.25h血压下降至其下降幅度高达33.2%，4h后血压值有所回升，但仍处于一个较低的水平，灌胃5.5h血压回升至虽仍与初始血压及SHR空白组血压差异显著（P＜0.05），但其血压回升较快，回升幅度高达23.9%。

与SHR药物组血压相比，灌胃1h后，SHR低剂量组、SHR中剂量组、SHR高剂量组的血压值差异均不显著（P＞0.05），SHR空白组血压值差异显著（P＜0.05）；灌胃3.25h，SHR低剂量组、SHR中剂量组、SHR高剂量组及SHR空白组的血压值差异显著（P＜0.01）；到灌胃5.5h时，SHR空白组、SHR低剂量组及SHR中剂量组的血压值差异显著（P＜0.01），SHR高剂量组血压值差异不显著（P＞0.05）。

从中可得知，喂给的鲍鱼内脏结缔组织降压物质与卡托普利能显著性地降低SHR的血压，但在灌胃1h时，两者对SHR的血压并无显著性影响（P＞0.05）；灌胃3.25h，喂卡托普利组的SHR血压值下降最明显，两者对SHR的血压有显著性的影响（P＜0.01）；到灌胃5.5h时，喂600mg/kg/d的鲍鱼内脏结缔组织降压物质组与喂卡托普利组的SHR血压值无显著性差异（P＞0.05）。

综上所知，在一次给药期间，鲍鱼内脏结缔组织降压物质及卡托普利能有效降低SHR的血压值，其中，鲍鱼内脏结缔组织降压物质的降压效应与其剂量有着密切的关联。

（2）对WKY大鼠短期降血压效果研究

按表1设计的剂量，以灌胃给药的方式进行一次性给药于WKY各实验组大鼠，作为SHR实验对照组，分别于灌胃1h、3.25h、5.5h后测量WKY各实验组大鼠的血压值，以收缩压（systolic blood pressure，SBP）为指标，评价鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY正常大鼠血压的影响，其实验结果如表6所示。

表6一次给药实验中WKY收缩压变化结果（单位：mmHg）

Tab.6The variation of WKY systolic blood pressure value with a single administration(unit:mmHg)

由表6可知，WKY各实验组大鼠随灌胃时间的延长血压值保持平稳，与初始血压及WKY空白组血压均无显著性差异（P＞0.05），实验结果表明，在一次灌胃给药实验中，鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY(正常大鼠)的血压无显著性影响，其中，卡托普利对WKY的血压也无显著性差异。

2.4鲍鱼内脏结缔组织降压物质长期降血压效果研究

（1）对SHR大鼠长期降血压效果研究

按表1设计的剂量，以灌胃给药的方式进行长期给药于SHR各实验组大鼠，每三天测量SHR各实验组大鼠的血压值，以收缩压（systolic blood pressure，SBP）为指标，评价鲍鱼内脏结缔组织降压物质对SHR大鼠血压的影响，灌胃30d内实验结果如表7所示。

表7长期给药实验中SHR血压值变化结果(单位：mmHg）

Tab.7The variation of SHR blood pressure value with long-term administration(unit:mmHg)

在SHR各实验组大鼠的基础血压差异不显著的基础上（由表5可知），由表7可知，与SHR空白组血压相比，SHR低剂量组只在灌胃第15d与第21d血压值有显著性的下降（P＜0.05）；SHR中剂量组除在灌胃第6d与第12d血压值下降不显著（P＞0.05），其余时间血压值均有显著性地下降（P＜0.05）；SHR高剂量组与SHR药物组在灌胃第3d后，血压均有显著下降（P＜0.01）。其中，低剂量组血压在灌胃初期，血压下降不显著，随着灌胃时间的延长，血压呈现逐渐下降的趋势，到灌胃第15d时，血压下降了8.90mmHg，其下降幅度达到最大，之后，血压下降幅度开始逐步缩小，到灌胃第30d时，血压值为与空白组血压值差异不显著（P＞0.05）；中剂量组血压值在灌胃第3d就开始出现显著性地下降，到灌胃第6天时，其血压值为此时血压下降差异不显著（P＞0.05），随着灌胃时间的延长，其血压下降差异又开始出现显著性差异（P＜0.05），灌胃第12d时，血压下降差异不显著（P＞0.05），到灌胃第27d时，血压下降了15.5mmHg，其下降幅度达到最大，到灌胃第30d时，血压值为与空白组血压值差异极显著（P＜0.01）；高剂量组血压值在30d的灌胃时间里，血压下降均有极显著性的差异（P＜0.01），到灌胃第18d时，血压下降了22.17mmHg，下降幅度达最大，到第30d时，血压值为与空白组血压值差异极显著（P＜0.01）；在长期给药期间，药物组血压下降差异极显著（P＜0.01），到灌胃第30d时，血压值为与空白组相比，其血压下降了25.79mmHg，下降幅度达最大，差异极显著（P＜0.01）。

与SHR药物组血压值相比，低剂量组血压值只在灌胃第15d时差异不显著（P＞0.05）；中剂量组血压值随着灌胃在灌胃第6d、18d、21d、27d及30d时差异显著（P＜0.05）；高剂量组血压值在灌胃第6d及30d时差异显著（P＜0.05）。

从图4可知，随着灌胃时间的延长，SHR的鼠龄也随之增长，各实验组的SBP均随着时间的延长而升高，其结果与文献报道相吻合；但与空白组血压相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组及药物组的血压均有一定程度地下降，其中，药物组的血压降幅最大。

综上所知，在长期灌胃给药期间，以600mg/kg/d和400mg/kg/d为剂量的鲍鱼内脏结缔组织降压物质及以10mg/kg/d为剂量的卡托普利能有效降低SHR的血压，其中，鲍鱼内脏结缔组织降压物质对SHR的降压效果与其剂量密切相关，具有一定剂量-效应的关系。

（2）对WKY大鼠长期降血压效果研究

按表1设计的剂量，以灌胃给药的方式进行长期给药于WKY各实验组大鼠，每三天测量WKY各实验组大鼠的血压值，以收缩压（systolic blood pressure，SBP）为指标，评价鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY大鼠血压的影响，灌胃30d内实验结果如表8所示。

表8长期给药实验中WKY血压值变化结果（单位：mmHg）

Tab.8The variation of WKY blood pressure value with long-term administration(unit:mmHg)

由表8可知，WKY各实验组大鼠随灌胃时间的延长血压值保持平稳，与初始血压及WKY空白组血压均无显著性差异（P＞0.05），实验结果表明，在长期灌胃给药实验中，鲍鱼内脏结缔组织降压物质对WKY(正常大鼠)的血压无显著性影响（P＞0.05），其中，卡托普利对WKY的血压也无显著性差异。

由一次给药与长期给药实验的结果可知，以600mg/kg/d和400mg/kg/d为剂量的鲍鱼内脏结缔组织降压物质及以10mg/kg/d为剂量的卡托普利能有效降低SHR的血压，但对正常大鼠的血压无显著性影响。

图5是实施例4所制备的鲍鱼内脏结缔组织降压物质所含成份的自动分析结果。

Claims

1.一种鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：该方法包含以下步骤：

(1)鲍鱼内脏结缔组织的预处理：将鲍鱼内脏结缔组织置于NaOH溶液中浸泡，浸泡完后将鲍鱼内脏结缔组织洗至中性，即得产品A；

(2)鲍鱼内脏结缔组织粗提液的制备：以胃蛋白酶与冰醋酸相结合的酶解方式处理产品A，即得产品B；

(3)鲍鱼内脏结缔组织粗提液的预处理：将产品B置于85～100℃的条件下，进行热预处理5～15min，即得产品C；

(4)鲍鱼内脏结缔组织粗提液的再次酶解：以中性蛋白酶再次酶解产品C，灭酶，离心，去除沉淀，取上清液，即得产品D；

其中，步骤(2)中所述的胃蛋白酶与冰醋酸相结合的酶解方式具体为：所述的胃蛋白酶加酶量以产品A干重计为200～280u/g；冰醋酸浓度为0.05～0.5mol/l；酶解温度为4～25℃；酶解时间为24～48h；

所述的NaOH溶液浸泡鲍鱼内脏结缔组织的具体条件为：NaOH溶液的浓度为0.05～0.15mol/l、浸泡时间为5～7h、浸泡温度0～4℃；

所述的中性蛋白酶加酶量以产品C干重计为10000～14000u/g；酶解温度为45～55℃；pH值为6.5～7.5；酶解时间为5～7h；灭酶温度为85～100℃；灭酶时间为5～15min。

2.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：在步骤4后还包括如下步骤：

产品干燥：将步骤4获得的上清液经浓缩、干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂。

3.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：在步骤4之后还包括如下步骤：

(5)鲍鱼内脏结缔组织降压物质D的纯化：以截留分子量为3～10KD的超滤膜对产品D进行超滤处理后，取透过超滤膜的液体，流经由阴阳离子交换树脂所构成的混床进行脱盐。

4.根据权利要求3所述的鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：在步骤5后还包括如下步骤：

(6)产品干燥：将经过步骤5脱盐后的滤液经过浓缩、干燥，即得鲍鱼内脏结缔组织降压物质粉剂。

5.根据权利要求4所述的鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：所述的脱盐后浓缩、干燥方法具体为：温度控制在60℃以下蒸发浓缩或温度控制在0℃以下冷冻浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥脱除水分后得到鲍鱼内脏降压物质粉剂。

6.根据权利要求3所述的鲍鱼内脏结缔组织制备降压物质的方法，其特征在于：所述的阴阳离子交换树脂是将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂按1：3的重量比混合而得；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。