CN102755352A - 一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法，属于提取鲍鱼脏器中抗氧化物质提取的技术领域。所用提取方法包括以下步骤：将鲍鱼脏器打浆，浸提、去重金属、浓缩、醇沉、精馏、浓缩、干燥后得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。本发明所涉及的鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、脂类等，具有良好的抗氧化活性，可用于制备氨基酸补充营养品和抗氧化的各种制剂。

Description

一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法

技术领域

   本发明涉及一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取技术领域。

背景技术

自从Denham Harman提出机体衰老的自由基理论以来，人体的疲劳、衰老以及许多疾病都与体内氧化产生的自由基有关的观点越来越为人们所认同，抗氧化剂的研究也逐渐受到人们的关注。市场销售的抗氧化剂大多数为合成抗氧化剂，如叔丁基羟基茴香醚（BHA）、二叔丁基羟基甲苯（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ），虽然它们的抗氧化能力不容小觑，但是本身具有毒副作用，会给机体带来负面影响，在人体中潜伏多种危害，这样的抗氧化剂不能满足公众对健康理念的追求，因此，寻找和开发安全、无毒且具有一定的保健功能的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。一些天然抗氧化剂具有过氧化氢分解促进剂和重金属清道夫的作用，可降低自氧化速率，减少脂肪过氧化氢的含量，抑制自由基的生成，不仅具有较强的抗氧化作用，而且具有很高的安全性，在食品和药品行业具有巨大的开发前景。

 目前，未见对鲍鱼醇溶性抗氧化物质提取及其抗氧化活性分析的报道。海产类提取物时常含有一定量的重金属，考虑到食品安全的需要，通常采用离子交换树脂或电渗析技术的方法脱除重金属，进行纯化。采用电渗析技术去除重金属，仅需使用少量电能，无需强酸强碱，进而杜绝了环境污染，并且节约人力物力。

发明内容

本发明提供了一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法，旨在提高鲍鱼产业加工附加值，提供更详尽的基础理论依据。该提取方法简单，提取容易，提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化剂，具有开发潜力。

本发明提取该物质的技术方案是：它包括以下步骤：                                               将鲍鱼脏器打浆；

浸提；除去重金属；

浓缩、醇沉；⑤精馏、浓缩、干燥。

具体的：

将鲍鱼脏器打浆：往鲍鱼脏器中加入其重量的1-5倍的水，打浆得到预处理液A；

浸提：将预处理液A离心或过滤，取上清液B；

去重金属：将上清液B进行电渗析处理或过离子交换树脂，得到去重金属后的溶液C；

浓缩、醇沉：将溶液C浓缩成可溶性固形物含量为3%-10%的浓缩液，加入浓缩液体积2-4倍的乙醇，室温下静置8-12h，离心分离，去除沉淀，得上清液D；

⑤精馏、浓缩、干燥：将上清液D精馏，去除乙醇后，再经浓缩、干燥得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。

更为具体的，步骤具体的为：在0-30℃下，将去除结缔组织并冲洗干净的新鲜鲍鱼脏器，按照鲍鱼脏器：水重量比=1:1-5加入蒸馏水，打浆、过20-40目筛、搅匀，制备成预处理液A。步骤

中，电渗析处理的条件为每膜对的膜堆电压为0.6-1.0V，所述电渗析处理后得到的溶液C为电渗析后的淡相。所述的离子交换树脂是将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂按1：3的重量比混合而得；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，产品型号：001×7，732；所述的阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，产品型号：201×7，717。

与现有技术相比，本发明的突出优点是：

1、利用电渗析技术去除重金属，简单、高效、减少环境污染，提高产品质量。

2、本发明中鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取是一种温和的提取方法，确保其营养成分不损失、不破坏，该醇溶性物质含水量极少，复水性好，无有机溶剂残留。

3、本发明所述的鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质是由蛋白质、糖类、脂类、水分等组成，并检测出17种氨基酸，其中必需氨基酸7种，具有较高的抗氧化活性，可以制成抗氧化制剂；资源丰富、提取方法简单、成本低廉，具有开发潜力。

具体实施方式

 本发明的鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法主要分为：

将鲍鱼脏器打浆；

浸提取上清液；

除去重金属；浓缩、醇沉；⑤精馏、浓缩、干燥得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。

具体步骤如下：

将鲍鱼脏器打浆；浸提；

去重金属；

浓缩、醇沉；⑤精馏、浓缩、干燥得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。

将鲍鱼脏器打浆：在0-30℃下，将去除结缔组织并冲洗干净的新鲜鲍鱼脏器，按照鲍鱼脏器重量比1:1-5加入蒸馏水，打浆、过20-40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液A。

浸提取上清液：将上述步骤的预处理液A 离心或过滤分离，去除沉淀物，得上清液B；

除去重金属：将上清液B进行电渗析处理，以除去重金属，通过每膜对的膜堆电压为0.6-1.0V；或者将上清液B过离子交换树脂除重金属；去重金属处理后所得到溶液C；

浓缩、醇沉：将步骤

中所得的溶液C浓缩至可溶性固形物含量3%-10%，加入浓缩液体积2-4倍的乙醇，室温下静置8-12h，离心分离，去除沉淀，得含有乙醇的上清液D；

⑤精馏、浓缩、干燥：将含有乙醇的上清液D精馏，除去乙醇后，再经浓缩、干燥得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。

实施例 1

在20℃下，取10kg洗净、去结缔组织的鲍鱼脏器，加入20kg的蒸馏水、打浆、过40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液，离心分离，去沉淀，取上清液。采用40个膜对的膜堆，通过电压24V,对上清液进行电渗析处理，取淡相。将淡相处理液浓缩到可溶性固形物含量至5%，得浓缩液，按浓缩液体积的2.5倍加入纯度95%酒精，经11h静置醇沉，取上清液进行精馏回收乙醇后，再经浓缩、冷冻干燥得鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质68g。样品经检测，重金属含量为7.0ppm，比对比例降低三分之二。

实施例2

在30℃下，取10kg洗净、去结缔组织的鲍鱼脏器，加入30kg的蒸馏水、打浆、过40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液，离心分离，去沉淀，取上清液。采用40个膜对的膜堆，通过电压32V,进行电渗析处理，取淡相。将淡相处理液浓缩到可溶性固形物含量至7%，得浓缩液，按浓缩液体积的3倍加入纯度95%乙醇，经10h静置醇沉，取上清液进行精馏回收乙醇后，再经浓缩、冷冻干燥得鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质72g。样品经检测，重金属含量为5.0ppm，比对比例降低四分之三。

实施例3

在20℃下，取10kg洗净、去结缔组织的鲍鱼脏器，按加入40kg的蒸馏水、打浆、过40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液，离心分离，去沉淀，取上清液。采用40个膜对的膜堆，通过电压40V,进行电渗析处理，取淡相。将淡相处理液浓缩到可溶性固形物含量至9%，得浓缩液，按浓缩液体积的3.5倍加入纯度95%以上酒精，经9h静置醇沉，取上清液进行精馏回收乙醇后，再经浓缩、冷冻干燥得鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质66g。样品经检测，重金属含量为5.0ppm，比对比例降低四分之三。

实施例4

在10℃下，取10kg洗净、去结缔组织的鲍鱼脏器，加入50kg的蒸馏水、打浆、过40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液，离心分离，去沉淀，取上清液。过混合离子交换树脂（混合离子交换树脂指将强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（产品型号：001×7，732）与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂（产品型号：201×7，717）按1：3的重量比混合装填于混合离子交换柱中，对上清液B中的离子进行交换、脱除。除重金属，过滤，取滤液。将滤液浓缩到可溶性固形物含量至10%，按浓缩液体积的4倍加入纯度95%以上酒精，经8h静置醇沉，取上清液进行精馏回收乙醇后，再经浓缩、喷雾干燥得鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质60g。样品经检测，重金属含量为5.0ppm，比对比例降低四分之三。

对比例

在10℃下，取10kg洗净、去结缔组织的鲍鱼脏器，按料液比1:1加蒸馏水、打浆、过40目筛、搅匀，制备成鲍鱼脏器预处理液，离心，去沉淀，取上清液。将所得上清液浓缩至可溶性固形物含量至3%，得浓缩液，按浓缩液体积的2倍加入纯度95%乙醇，经12h静置醇沉，取上清液进行精馏回收乙醇后，再经浓缩、冷冻干燥得鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质78g。

实施例1-4与对比例鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取结果数据如表1所示：

表1  鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取结果数据表

 

由实施例1-4所制得的鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质复水性好，其主要成分中粗蛋白质、氨基酸、糖类、水分含量分别在 45.23-47.12％、22.81-24.05％、32.53-34.05％、2.98-3.36％。

其中实施例2所制得的该鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质中粗蛋白质、糖类、水分含量分别为47.00％、33.23％、3.02%，通过氨基酸自动自动分析仪检测出除谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸外的17种氨基酸。该鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的氨基酸含量高达23.70％，其中含7种必需氨基酸占总氨基酸含量的37.43%，所含氨基酸中鲜味氨基酸含量高达45.91%，支链氨基酸含量达到20.00%，主要抗氧化性氨基酸含量为30.00%。

鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质体外化学抗氧化活性的测定 

将鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质配制为以下浓度的水溶液：1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL。

（1）    铁氰化钾还原法测定鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的还原能力

试管中依次加入待测样品1.0 mL， pH=6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL 1%的铁氰化钾2.5 mL，混匀，50℃水浴反应20 min，急速冷却，立即加入2.5 mL 10%的TCA终止反应，3000 rpm离心10 min。取上清液2.5 mL于试管中，依次加入蒸馏水2.5 mL， 0.1%的FeCl₃ 0.5 mL，混匀，静置10 min，然后在700 nm处测定吸光度A，蒸馏水作空白调零。以1.0 mL蒸馏水代替样品，其他反应条件相同作为空白管。样品所测的吸光值越高，则还原能力越强。

（2）    邻苯三酚自氧化法测定鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质清除O₂ ^-的能力

表2  邻苯三酚自氧化法测定清除O₂ ^-能力的步骤及加量表

O₂ ^-·清除率的计算公式：

O₂ ^-·清除率（%）=（A₀–A₁）/A₀*100%  

A₀——空白管的吸光值；

A₁——样品管的吸光值。

（3）    邻二氮菲-Fe²⁺-H₂O₂法测定鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质清除·OH的能力

表3 邻二氮菲-Fe²⁺-H₂O₂法测定清除·OH能力的加量表

·OH清除率的计算公式：

·OH清除率（%）=（A₂–A₁）/（A₀–A₁）*100    

A₀——未损伤管的吸光值；

A₁——损伤管的吸光值；

A₂——样品管的吸光值。

研究表明鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质具有较强的体外抗氧化活性，其对超氧自由基、羟自由基的清除能力及还原能力都随其浓度的增加而增强，在一定范围内呈量效关系。鲍鱼醇溶性物质对O₂ ^-·、·OH的IC₅₀值分别是10.6 mg/mL、11.9 mg/mL，其回归方程分别为y=0.040x+0.074，R²=0.984和y=0.041x+0.012， R²=0.973。具体结果如表4。

表4  鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质抗氧化活性的测定

鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质细胞模型抗氧化活性的测定

实验以人肝癌细胞株（HepG2细胞）为材料，采用H₂O₂建立氧化损伤细胞模型。实验分组：正常组（只加培养液），模型组(加培养液和100 μmol/L的H₂O₂)，Vc1-5组（加含Vc分别为10、30、50、80、100 μg/mL的培养液和100 μmol/L的H₂O₂），鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质1-5组（加含鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质分别为10、30、50、80、100 μg/mL的培养液和100 μmol/L的H₂O₂），每组设5个平行孔。

（1）MTT比色法检测鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质作用于H₂O₂诱导损伤的HepG2细胞存活率 

（2）用试剂盒测定H₂O₂诱导损伤的HepG2细胞的SOD活力及MDA含量

测定步骤按南京建成生物工程研究所提供的SOD、MDA试剂盒说明书进行操作。

细胞模型评价法试验结果如表5、6、7所示。其结果表明，鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质能使H₂O₂诱导损伤的HepG2细胞的存活率和SOD活性提高，MDA含量降低，能抑制细胞过氧化损伤，对损伤的细胞有保护作用，具有较强的抗氧化活性。与正常组相比，H₂O₂损伤模型组的细胞存活率、SOD活性极显著降低（P<0.01），MDA值极显著升高（P<0.01）；鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质和Vc各个实验组的细胞存活率、SOD活力均随浓度的增大而升高，MDA含量随着浓度的增大而降低。相对于模型组，给予80、100 μg/mL鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的HepG2细胞的存活率极显著增强（P<0.01），SOD活性显著增强（P<0.05），MDA含量极显著下降（P<0.01）；当鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的浓度达到100 μg/mL，细胞的存活率、SOD活性、MDA含量均接近或高于正常对照组相应指标的水平。

表5 MTT法检测鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质、Vc作用于H₂O₂诱导损伤的HepG2细胞存活率

注：与正常对照组比较，^★P<0.05，^★★P<0.01；与模型组比较，_＃P<0.05，_＃＃P<0.01。

 

表6 鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质和Vc作用于H2O2诱导损伤的HepG2细胞的SOD活力

注：与正常对照组比较，^★P<0.05，^★★P<0.01；与模型组比较，_＃P<0.05，_＃＃P<0.01。

 

表7 鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质和Vc作用于H₂O₂诱导损伤的HepG2细胞的MDA含量

注：同正常对照组比较，^★P<0.05，^★★P<0.01；同模型组相比，_＃＃P<0.01。

 

鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质体内动物抗氧化活性的测定

按照《保健食品检验与评价技术规范》中，抗氧化功能检验方法要求采用8-12月龄老年小鼠进行试验或通过给予成年小鼠D-半乳糖诱导老化形成试验。本实验采用的是通过给予成年小鼠D-半乳糖诱导老化形成试验。

昆明种小鼠72只（全部为雄性，体重20士2 g），每天光照12 h，环境温度25℃，相对湿度50-60%，自由取水和饮食，每天更换饲料、垫料和饮水。小鼠适应环境喂养7 d后，随机分为以下6组，每组12只。除正常对照组外其他5组利用D-半乳糖诱导衰老模型，各组自由取水和饮食，给药（即灌以胃鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质、VC，和注射D-半乳糖）周期42 d，每次皮下注射D-半乳糖0.2 mL ，4 h后进行灌胃鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质、阳性药物D-半乳糖，每次均灌胃0.2 mL。

正常对照组（给药：等体积生理盐水；造模：等体积生理盐水）；

模型组（给药：等体积生理盐水；造模：颈背部皮下注射200 mg·kg^-1·d^-1的D-半乳糖）；

阳性对照组（给药：10 mg·kg^-1·d^-1VC；造模：颈背部皮下注射200 mg·kg^-1·d^-1的D-半乳糖）

低剂量组（给药：200 mg·kg^-1·d^-1鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质；造模：颈背部皮下注射200 mg·kg^-1·d^-1的D-半乳糖）；

中剂量组（给药：500 mg·kg^-1·d^-1鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质；造模：颈背部皮下注射200 mg·kg^-1·d^-1的D-半乳糖）；

高剂量组（给药：800 mg·kg^-1·d^-1鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质；造模：颈背部皮下注射200 mg·kg^-1·d^-1的D-半乳糖）；停药24 h后，摘眼球取血，解剖，取肝脏器官，保存待测指标。

血清及肝脏匀浆中MDA、SOD、GSH含量的测定均按照南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮蓝、MDA、SOD、GSH测定试剂盒说明书进行操作。

经D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠体内实验证明，灌胃鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质可减轻小鼠的衰老迹象，减轻小鼠的消瘦、无力和竖毛现象，可剂量依赖性地提高衰老小鼠体内抗氧化酶SOD的活力和谷胱甘肽GSH的含量，并有效降低氧化应激造成的脂质过氧化代谢产物MDA的水平，可降低细胞膜脂质过氧化水平，保护机体内氧化-抗氧化平衡状态，具有良好的抗氧化能力。尤其是高剂量组的小鼠均未表现出无力、竖毛的状态，其体重与正常组、Vc组的小鼠接近，其血清及肝脏中的MDA水平、SOD活性、GSH含量与阳性对照组对应指标相接近。表明剂量为800 mg·kg^-1·d^-1的鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质对衰老小鼠的抗氧化能力与10 mg·kg^-1·d^-1 Vc的抗氧化水平相当。具体实验结果如表8所示。

表8 鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质对D-半乳糖诱导的衰老小鼠血清及肝脏中各项指标的影响

注：同正常组比较，^★P<0.05，^★★P<0.01；同模型组相比，_＃P<0.05，_＃＃P<0.01。

Claims (6)

1.一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质的提取方法，其特征在于：所述提取方法包括以下步骤：                                               

将鲍鱼脏器打浆；

浸提；

去重金属；浓缩、醇沉；⑤精馏、浓缩、干燥。

2.如权利要求书1所述的一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取方法，其特征在于：所述提取方法的具体步骤包括：   

将鲍鱼脏器打浆：往鲍鱼脏器中加入其重量的1-5倍的水，打浆得到预处理液A；

浸提：将预处理液A离心或过滤，取上清液B；

去重金属：将上清液B进行电渗析处理或过离子交换树脂，得到去重金属后的溶液C；

浓缩、醇沉：将溶液C浓缩成可溶性固形物含量为3%-10%的浓缩液后，加入浓缩液体积2-4倍的乙醇，室温下静置8-12h，离心分离，去除沉淀，得上清液D；

⑤精馏、浓缩、干燥：将上清液D精馏，去除乙醇后，再经浓缩、干燥得到鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质。

3.如权利要求书1、2所述的一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取方法，其特征在于：步骤

具体的为：在0-30℃下，将已去除结缔组织并冲洗干净后的新鲜鲍鱼脏器，按照鲍鱼脏器：水重量比=1:1-5加入蒸馏水，打浆、过20-40目筛、搅匀，制备成预处理液A。

4.如权利要求书1、2所述的一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取方法，其特征在于：所述电渗析处理的条件为每膜对的膜堆电压为0.6-1.0V，所述电渗析处理后得到的溶液C为电渗析后的淡相。

5.如权利要求书2所述的一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取方法，其特征在于：所述的离子交换树脂是将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂按1：3的重量比混合而得；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，产品型号：001×7，732；所述的阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，产品型号：201×7，717。

6.如权利要求书1所述的一种鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质提取方法，其特征在于：所述鲍鱼脏器醇溶性抗氧化物质可用于氨基酸补充营养品或抗氧化制剂的制备。