CN101955512A - 血管紧张素ⅰ转换酶活性抑制寡肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是以新鲜猪血为原料，通过提取珠蛋白粉末并对珠蛋白粉末酶解以及对珠蛋白可溶蛋白酶解液进一步分离、纯化得到其氨基酸序列为Thr Lys ThrTyr Phe Pro His Phe的寡肽，实验证明是有效的血管紧张素I转换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于制备降低高血压的药品及保健品中。

Description

血管紧张素Ⅰ转换酶活性抑制寡肽、制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及一种血管紧张素I转换酶(ACE)抑制剂，尤其是一种以新鲜猪血为原料，无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽、制备方法及其应用。

背景技术：

高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。血管紧张素I转换酶在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用，它可以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na⁺、K⁺的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高，如果抑制了血管紧张素I转换酶的活性，就可以起到降压的作用。

现有的作为治疗高血压的合成物卡普托利就是血管紧张素I转换酶的抑制剂，但由于它是由化学药品合成，因此有很多副作用。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种以新鲜猪血为原料，无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽、制备方法及其应用。

本发明的技术解决方案是：一种血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽，其特征是氨基酸序列为Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe。

一种上述血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.在新鲜猪血中加入体积为新鲜猪血0.3％0.3％的柠檬酸钠溶液，离心去血清，所得血红细胞与水等体积混合溶血，所得的血红蛋白溶液经酸性丙酮重复处理并干燥后，得到灰白色的珠蛋白粉末；

b.将珠蛋白粉末进行酶解并经过超滤膜过滤制得珠蛋白可溶蛋白酶解液；

c.将珠蛋白可溶蛋白酶解液经凝胶柱进行层析分离及RP-HPLC纯化分离。

所述b步骤是称取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值为2.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌后，再加入pH值为2.0的磷酸缓冲液调节珠蛋白浓度为3％，按酶与底物质量比为1％加入木瓜蛋白酶后在37℃的恒温水浴中反应12h后再在沸水中恒温10min，3000×g离心10min取上清液，经MW 3000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为珠蛋白可溶蛋白酶解液。

所述c步骤是取珠蛋白可溶蛋白酶解液经Sephadex G25柱进行层析分离，流动相为纯水，温度为室温，检测波长为280nm，按时间收集具有血管紧张素I转换酶抑制活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil C₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度：

0～60min A液  100％～50％线性降低；B液0％～50％线性升高；

60～80min A液 0％；B液100％。

上述的血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽在制备降低高血压产品中的应用。

本发明是以新鲜猪血为原料，通过提取珠蛋白粉末并对珠蛋白粉末酶解以及对珠蛋白可溶蛋白酶解液进一步分离、纯化得到其氨基酸序列为Thr Lys ThrTyr Phe Pro His Phe的寡肽，实验证明是有效的血管紧张素I转换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于制备降低高血压的药品及保健品中。

附图说明：

图1是本发明实施例中用Sephadex G25柱进行层析分离，检测波长为为280nm的谱图。

图2是本发明实施例在HPLC上纯化谱图

图3是应用本发明实施例降血压的效果示意图。

具体实施方式：

a.在新鲜猪血中加入体积为新鲜猪血0.3％的柠檬酸钠溶液，离心去血清，所得血红细胞与水等体积混合溶血，所得的血红蛋白溶液经酸性丙酮重复处理并干燥后，得到灰白色的珠蛋白粉末；

b.称取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值为2.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌后，再加入pH值为2.0的磷酸缓冲液调节珠蛋白浓度为3％，按酶与底物质量比为1％加入木瓜蛋白酶后在37℃的恒温水浴中反应12h后再在沸水中恒温10min，3000×g离心10min取上清液，经MW 3000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为珠蛋白可溶蛋白酶解液。

c.取珠蛋白可溶蛋白酶解液经Sephadex G25柱进行层析分离，流动相为纯水，温度为室温，检测波长为280nm，按时间收集具有血管紧张素I转换酶抑制活性的组分，谱图如图1所示，即收集谱图中的I、II、III、IV、V部分；将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil C₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集，如图2所示获得具有较高ACE抑制活性的吸收峰A；

洗脱梯度：

0～60min  A液 100％～50％线性降低；B液0％～50％线性升高；

60～80min A液 0％；B液100％。

对所收集的组分用高效毛细管电泳鉴定纯度大于95％，基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-MS)和电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)测定此活性肽的分子量为896.8氨基酸序列为Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe，此肽及肽的类似物的盐类均可以用于制备降低高血压的药物、保健品等。

实验例：

1.静脉注射动物实验

选择20只自发性高血压大白鼠(SHR)为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成2组，每一组10只，将本发明实施例的寡肽每日按大白鼠体重5-20mg/kg剂量进行静脉注射，结果表明，1周后对照组SHR血压持续升高，而治疗组SHR的血压明显下降，SHR的平均收缩压从195mmHg下降到162mmHg说明此肽具有明显的降血压效果。

2.灌胃动物实验

选择20只SHR为实验模型，饲养一周后，将其分组，将本发明实施例的寡肽每日按SHR体重20-200mg/kg剂量Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe进行灌胃投入，结果表明，4周后对照组SHR的血压持续升高，而治疗组SHR的血压明显下降(图3)，平均收缩压从195mmHg下降到160mmHg说明此肽具有明显的降血压效果。

上述寡肽及肽的类似物的盐类可以用通常的方法生产。公认的与酸反应产生的盐类，比如说盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公认的与金属离子形成的盐类，包括钠盐，钾盐，钙盐，铵盐；以及氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。

本发明相关的ACE抑制剂，由各种充填剂所形成的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂等，通过口腔摄取或者是注射液的形式使用。

本发明相关的ACE抑制剂，可经口腔和非经口腔投入使用。非经口腔的投入方法比如皮下和静脉注射，肛肠投入等。注射液的制作可以任意选用生理盐水，葡萄糖，安定剂，防腐剂，悬浮剂，乳化剂等。

本发明相关的ACE抑制剂，可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品。食品的形态可以是清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，奶酪，火腿，点心等。

本发明相关的ACE抑制剂，使用量是没有特别的限制，具体的要根据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素，适当地确定。

序列表

<110>大连水产学院

<120>血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽、制备方法及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>8

<212>蛋白质或肽

<213>新鲜猪血

<220>

<223>misc_feature

<400>1

Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe        8

Claims (5)

1.一种血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽，其特征是氨基酸序列为Thr LysThr Tyr Phe Pro His Phe。

2.一种如权利要求1所述血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.在新鲜猪血中加入体积为新鲜猪血0.3％的柠檬酸钠溶液，离心去血清，所得血红细胞与水等体积混合溶血，所得的血红蛋白溶液经酸性丙酮重复处理并干燥后，得到灰白色的珠蛋白粉末；

b.将珠蛋白粉末进行酶解并经过超滤膜过滤制得珠蛋白可溶蛋白酶解液；

c.将珠蛋白可溶蛋白酶解液经凝胶柱进行层析分离及RP-HPLC纯化分离。

3.根据权利要求2所述血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽的制备方法，其特征在于所述b步骤是称取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值为2.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌后，再加入pH值为2.0的磷酸缓冲液调节珠蛋白浓度为3％，按酶与底物质量比为1％加入木瓜蛋白酶后在37℃的恒温水浴中反应12h后再在沸水中恒温10min，3000×g离心10min取上清液，经MW 3000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为珠蛋白可溶蛋白酶解液。

4.根据权利要求3所述血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽的制备方法，其特征在于所述c步骤是取珠蛋白可溶蛋白酶解液经Sephadex G25柱进行层析分离，流动相为纯水，温度为室温，检测波长为280nm，按时间收集具有血管紧张素I转换酶抑制活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil C₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度：

0～60min  A液    100％～50％线性降低；  B液0％～50％线性升高；

60～80min A液    0％；    B液    100％。

5.一种如权利要求1所述的血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽在制备降低高血压产品中的应用。

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