CN118126156A - 一种多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种编码上述的多肽的DNA分子。本发明还提供了一种重组载体，其含有上述的DNA分子。本发明还提供了上述的多肽在制备治疗心肌纤维化的药物中的用途。本发明与现有的治疗心肌纤维化的多肽相比，该多肽是通过运动后的生理情况下大量分泌的，因此该多肽对生物体无明显不良反应，在正常生物体和疾病早期的生物体中，可通过增加运动量来减轻心肌纤维化，在中后期，可通过体外给予该多肽来减轻心肌纤维化，尤其是在运动受限的情况下。因此，本发明能够抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，减轻心肌纤维化。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽及其用途。
背景技术
心力衰竭（简称心衰）是各种心脏疾病的终末阶段，不仅严重影响患者生活质量，而且会出现恶性心律失常，甚至猝死。随着全球人口的老龄化加剧，心衰患者的总数在持续上升，已成为全球范围内严重的公共卫生问题。目前心衰的临床治疗主要包括药物治疗、介入治疗及心脏移植等，但这些手段均存在不同程度的局限性，使得慢性心衰患者的5年死亡率仍高达50%左右。因此，寻找更为安全有效的心衰防治策略具有重大意义。
心肌纤维化在许多心脏病理生理条件下导致收缩和舒张功能障碍，已有的研究发现，①ghrelin通过调节Act A/FS失衡抑制心肌纤维化，减轻左心室重构，最终改善心功能；②基质蛋白肽p1159通过膜受体整合素α4激活RhoA通路，从而增加心脏成纤维细胞的迁移，通过调节纤维化瘢痕的沉积、排列和灌注来减少心肌梗死后不良左室重构；③apelin-13通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激，改善了angⅡ诱导的心功能障碍，心脏血流动力学受损，减轻了心脏成纤维细胞纤维化等。
长期规律的运动对心血管系统的有益效应已成为业界的共识。近年来，随着相关临床研究的开展，运动对心衰的良好防治效果受到越来越多的关注。研究显示，规律且适度的运动能够减轻心肌纤维化，降低心脏僵硬度，改善心肌舒张和收缩功能，不仅有效降低心衰风险，还可降低心衰患者全因死亡率和住院率，并显著改善患者预后。目前，越来越多的研究发现运动作为一种安全的生理性刺激对心衰具有良好的防治效果。
已发现，运动可刺激肌肉释放多种物质，包括蛋白及多肽类物质，是其作用的重要媒介。研究表明，多肽在人体生理学和临床诊断治疗方面发挥着重要的作用，现已经成为生物药物研发和临床研究的热门方向之一。多肽以其毒副作用低、免疫原性低、安全性高、特异性强以及生产耗能低等优点是药物开发的理想对象。目前，多肽类药物已在多个疾病领域得到了广泛应用，收获了良好的疗效。因此，我们从多肽层次对运动进行了解读及探索，并从中发现了对心肌纤维化有抑制作用的多肽，目前尚未见运动相关多肽类药物被报道对心肌纤维化过程具有优秀治疗效果的案例。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种多肽及其用途，所述的这种多肽及其用途要解决现有技术中的药物对于治疗心肌纤维化的效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体为：
MPFSRTEDGKIYQRAFGGHSLKFGKGRQAHRCCCVADRTGHSILHTLYGRVRLPPVHLRQDT。
本发明还提供了一种编码上述的多肽的DNA分子。
本发明还提供了一种重组载体，其含有上述的DNA分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述的重组载体。
本发明还提供了一种表达系统，所述表达系统含有上述的重组载体，或基因组中整合有外源的上述的DNA分子。
本发明还提供了上述的多肽在制备治疗心肌纤维化的药物中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，其有效成分为上述的多肽。
进一步的，所述的组合物还含有药用辅料。
进一步的，所述的组合物的剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。
本发明与现有的治疗心肌纤维化的多肽相比，该多肽是通过运动后的生理情况下大量分泌的，因此该多肽对生物体无明显不良反应，在正常生物体和疾病早期的生物体中，可通过增加运动量来减轻心肌纤维化，在中后期，可通过体外给予该多肽来减轻心肌纤维化，尤其是在运动受限的情况下。因此，本发明能够抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，减轻心肌纤维化。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明与现有的治疗心肌纤维化的药物等相比，该多肽的副作用少，免疫原性低，生产耗能低，并且多肽能够涵盖多种危险因素的病人，能够更好的管理和治疗病人。
附图说明
图1显示了EICMP1在脊椎动物中的同源性。
图2显示了EICMP1抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化；A.细胞增殖水平；B.肌成纤维细胞相关标志物的mRNA表达水平；C.肌成纤维细胞相关标志物的蛋白表达水平；D.SRF和Calcineurin的蛋白表达水平。
图3显示了EICMP1拮抗高血压所致小鼠心肌纤维化；A.小鼠的心重比；B.小鼠心脏的H&E染色；C.小鼠心脏的Masson染色。
具体实施方式
实施例1 多肽的筛选
我们构建了耐力运动小鼠模型（以低强度、长时间的训练形式为特征的耐力运动，如：慢跑，游泳等，被认为是改善心脏功能的主要运动方式），以8周龄C57BL/6雄性小鼠为研究对象，构建耐力运动模型，先以10米/分钟的速度每天跑步5分钟进行2天的适应性运动训练，而后小鼠每天从10米/分钟的初始速度开始进行跑步运动训练，每20分钟速度增加1米/分钟，直至力竭，运动训练14天。
本发明以正常饲养的未运动小鼠作为对照组。
造模结束后收集各组小鼠的心脏组织进行多肽组学的检测，我们对测序结果根据Log2(fold change)>1和P<0.05进行生物信息学分析筛选，发现了一个在小鼠运动后心脏组织中表达明显升高的多肽，其编码的氨基酸的多肽在人、小鼠、大鼠等多种脊椎动物中同源性高（图1），显示出进化保守性，提示可能具有重要的生物学功能。该多肽目前未见任何功能和机制报道，我们将其命名为EICMP1（Exercise-induced cardiac micropeptide 1）。
多肽的序列为：
MPFSRTEDGKIYQRAFGGHSLKFGKGRQAHRCCCVADRTGHSILHTLYGRVRLPPVHLRQDT（SEQ IDNO.1）
上述多肽的制备方法采用常规的方法制备，具体如下：
多肽从C端到N端方向合成。
1. 称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g）于150 ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷（DCM）浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3. 向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4. 取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑（HOBT）适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头（醋酸酐 ：DIEA : DCM=1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7. 向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8. 取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
9. 称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中，加入25 ml的DMF将其溶解，然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11. 待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12. 按照步骤9-11依次接上后面的氨基酸。
13. 待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液（三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水=95:2:2:1）将多肽从树脂上切割下来（每克树脂加10ml切割液），并用冰乙醚（切割液：乙醚=1:9）离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽。
14.纯化条件如下：
固定相：C18色谱柱（市售产品）；
流动相的配置：
Pump A：V（tfa）/V(水)=1/1000；
Pump B: V(TFA)/v(乙腈）=1/1000；
流速：10ml/min；
保留时间：20-30min之间。
实施例2 多肽的应用
1. 多肽抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化
为了研究多肽对心肌纤维化的作用，我们分离了原代心脏成纤维细胞，通过CD11b和MEFSK4染色标记细胞，流式细胞仪分选去除CD11b染色的细胞，从而纯化成纤维细胞，采用1µM Ang Ⅱ刺激24h构建体外模型，将细胞分为对照组、EICMP1组、Ang Ⅱ+对照组及AngⅡ+EICMP1组，通过CCK-8检测心脏成纤维细胞在0、24、48、72h的增殖水平，结果显示，AngⅡ激活了成纤维细胞的增殖（图2A）且增加了肌成纤维细胞相关标志物水平（COL1A1，α-SMA），而实施例1的EICMP1多肽显著降低了这些指标（图2B-C）。在Ang Ⅱ刺激后SRF和Calcineurin表达水平显著升高，但多肽的干预抑制了两者的表达（图2D）。
2.EICMP1拮抗高血压所致小鼠心肌纤维化
分别经8周龄C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射带有心脏成纤维细胞特异性启动子Postn的EICMP1腺相关病毒及对照病毒，以1.5mg/kg Ang Ⅱ微型渗透泵颈背部皮下植入的方法进行心肌纤维化模型的造模，将小鼠分为对照组、EICMP1组、Ang Ⅱ+对照组及Ang Ⅱ+EICMP1组，造模4周后，测量小鼠的体重及心脏的重量，计算小鼠的心脏重量与体重之比，结果显示，EICMP1能够降低小鼠的心重比（图3A）；对心脏行组织病理切片染色，H&E染色结果显示，EICMP1干预可减小心脏室壁厚度，增大心腔的大小（图3B）；Masson染色可见EICMP1能够减轻心肌纤维化的水平（图3C）。
Claims (9)
1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的多肽的DNA分子。
3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。
5.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有权利要求3所述的重组载体，或基因组中整合有外源的权利要求2所述的DNA分子。
6.权利要求1所述的多肽在制备治疗心肌纤维化的药物中的用途。
7.一种药物组合物，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物还含有药用辅料。
9.根据权利要求7所述的一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物的剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。
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