CN103370075A - 长效il-1受体拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及IL-1受体拮抗剂化合物、组合物及其用途以及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及治疗肽,具体来讲是延长的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)及其制备方法、组合物及其在医药中的用途。
背景
IL-1由机体对炎症刺激的反应产生,并介导炎症反应。已知不适当地调节通过IL-1受体的信号传导可引起严重病况,包括但不限于类风湿性关节炎和糖尿病。
阿那白滞素(商品名Kineret)是人IL-1Ra的重组非糖基化类似物,在市场出售用于治疗类风湿性关节炎。尽管阿那白滞素具有益处,其仍具有重要的局限性。首先,阿那白滞素是注射给药,患者在注射部位经历疼痛、炎症和红斑,导致一部分的新患者中断治疗。其次,阿那白滞素在血浆中具有相对短的终末半寿期(4-6小时),因此通常需要每天注射1次(100 mg)。
已显示IL-1水平的提高损伤和破坏产生胰岛素的细胞。在2型糖尿病患者中胰岛IL-1β mRNA水平上调,提高的循环葡萄糖水平似乎促成上调。最近的研究显示用阿那白滞素拮抗IL-1在2型糖尿病的治疗中具有可能的治疗潜能;该治疗改善糖血和β细胞分泌功能和减少全身炎症标记物。脂肪细胞功能研究已支持IL-1能够削弱胰岛素信号传导。
因此,期望提供具有延长血浆半寿期的IL-1Ra。延长血浆半寿期可带来临床益处,比如更好地自始至终覆盖24小时,可允许更低频率地给药从而还减轻注射部位反应。
概述
在一些实施方案中,本发明涉及包含酰化基团的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物。
在一些实施方案中,本发明涉及包含本文限定的IL-1Ra化合物和一种或多种赋形剂的组合物。
在一些实施方案中,本发明涉及用于医药的本文限定的IL-1Ra化合物。
在一些实施方案中,本发明涉及包含选自构建体号2、构建体号3、构建体号4、构建体号5、构建体号6、构建体号7和构建体号8的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中,本发明涉及包含本文限定的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中,本发明涉及包含本文限定的核苷酸序列或本文限定的载体的宿主细胞。在一些实施方案中,本发明涉及由本文限定的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中,本发明涉及用于制备IL-1Ra化合物的方法,所述方法包括在低于25℃的温度(比如在18℃)重组表达核苷酸序列(比如本文限定的核苷酸序列)的步骤。
附图简述
图1显示核苷酸优化IL-1Ra及其变体的重组表达的SDS-PAGE分析;U:非诱导的,S:可溶性蛋白级分,P:不溶性蛋白级分。图1A显示构建体号1在37℃在三个独立克隆中的表达。图1B显示构建体号4-8在37℃的表达。图1C显示构建体号4-7在37℃与18℃的表达,其中构建体号4和5在37℃发酵3小时,而构建体号6和7在18℃发酵过夜。图1D显示构建体号2和3在800 mL振荡烧瓶培养物中的表达,培养物由0.4
mM IPTG诱导并在18℃培养过夜,I:诱导的,M:标记物(14, 20, 30, 45, 66, 97 kDa)。
详述
本发明涉及长效白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物。在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含酰化基团。
在一些实施方案中,本发明的IL-1Ra化合物具有改善的血浆半寿期,如在i.v.给予大鼠或迷你猪后根据本文所述测定(I)或测定(II)所确定的。
令人惊奇地是,本发明人发现尽管在阿那白滞素中存在9个Lys残基,但是只有少数Lys残基,比如1或2个Lys残基,被本文所用的酰化化学靶向,见例如实施例1和2。这使得能够制备具有更少副产物的单组分Lys-酰化阿那白滞素。
在一些实施方案中,本发明的核苷酸优化构建体,比如构建体号1-8,提供更高收率的可溶性IL-1Ra化合物。
在一些实施方案中,核苷酸优化构建体(比如构建体号1-8)在低温(比如小于25℃,小于20℃或18℃)表达提供更高收率的可溶性IL-1Ra化合物。
IL-1Ra
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含人IL-1Ra或其类似物。术语“人IL-1Ra”、“hIL-1Ra”或“hIL-1Ra同种型1”在本文可互换使用,指MEICRGLRSH
LITLLLFLFH SETICRPSGR KSSKMQAFRI WDVNQKTFYL RNNQLVAGYL QGPNVNLEEK IDVVPIEPHA
LFLGIHGGKM CLSCVKSGDE TRLQLEAVNI TDLSENRKQD KRFAFIRSDS GPTTSFESAA CPGWFLCTAM
EADQPVSLTN MPDEGVMVTK FYFQEDE或指UNIPROT登记号P18510-1。在一些实施方案中,hIL-1Ra的N-端序列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETIC缺失。在一些实施方案中,hIL-1Ra的N-端序列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETI缺失。在一些实施方案中,hIL-1Ra包含N-端Met。在一些实施方案中,hIL-1Ra包含在25位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)的Met。除非另外说明,在本文提到的IL-1Ra化合物位置都是相对于hIL-1Ra同种型1而言。
在一些实施方案中,hIL-1Ra的N-端序列MEICRGLRSH LITLLLFLFH S缺失,所述hIL-1Ra包含N-端序列MALADLYEEG GGGGGEGEDN ADSK (hIL-1Ra同种型2 UNIPROT登记号P18510-2)。
在一些实施方案中,hIL-1Ra的N-端序列MEICRGLRSH LITLLLFLFH S缺失,所述hIL-1Ra包含N-端序列MAL (hIL-1Ra同种型3 UNIPROT登记号P18510-3)。
在一些实施方案中,hIL-1Ra的N-端序列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETICRPSGR KSSK缺失(hIL-1Ra同种型4 UNIPROT登记号P18510-4)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含阿那白滞素或其类似物。如用于本文的“阿那白滞素”指[Met25]hIL-1Ra(25-177)或MRPSGRKSSK
MQAFRIWDVN QKTFYLRNNQ LVAGYLQGPN VNLEEKIDVV PIEPHALFLG IHGGKMCLSC VKSGDETRLQ
LEAVNITDLS ENRKQDKRFA FIRSDSGPTT SFESAACPGW FLCTAMEADQ PVSLTNMPDE GVMVTKFYFQ
EDE,其中Cys70和Cys117可经由二硫键连接。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含一处或多处糖基化。
在本文提到肽时使用的术语“类似物”指修饰肽,其中该肽的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代和/或其中该肽的一个或多个氨基酸残基已从该肽缺失和/或该肽的一个或多个氨基酸残基已被加入该肽中。这样的氨基酸残基取代可发生在该肽的任何位置,如在31、34、118和/或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)。这样的氨基酸残基添加或缺失可发生在该肽的N-端和/或在该肽的C-端。用简单的系统描述类似物,例如[Met25]hIL-1Ra(25-177)表示hIL-1Ra同种型1类似物,其中在hIL-1Ra同种型1的1-24位的氨基酸序列“MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETI”已缺失,天然存在的在25位的Cys已被Met取代。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物在N-端位置和/或在Lys残基酰化。
在人IL-1Ra中的9个Lys残基没有一个与人IL-1R1受体元件有密切接触,因此所有这些都可以是在预期不丧失对受体亲和力的情况下可能的酰化靶标。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含一个或多个Lys-残基被取代成Arg。在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含取代K31R、K34R、K118R和/或K121R (相对于hIL-1Ra同种型1的位置)。
酰化基团
本发明的IL-1Ra化合物包含酰化基团。
在一些实施方案中,本发明化合物的酰基包含脂肪酸或脂肪二酸。
在一些实施方案中,本发明化合物的酰基包含脂肪酸或脂肪二酸和任选接头。
在一些实施方案中,本发明化合物的酰基包含脂肪酸或脂肪二酸和接头。
在一些实施方案中,本发明酰基的脂肪酸或脂肪二酸包含14、16、18、20或22个氨基酸。
在一些实施方案中,本发明酰基的脂肪酸或脂肪二酸包含16、18或20个氨基酸。
在一些实施方案中,本发明酰基的脂肪酸或脂肪二酸包含16、18或22个氨基酸。
在一些实施方案中,酰化基团是脂肪酸取代基。“脂肪酸取代基”在本文理解为在氨基酸位置比如赖氨酸或N-端氨基酸(任选经由接头)与母体IL-1Ra连接的由脂肪酸或脂肪二酸组成的侧链。
在一些实施方案中,与母体IL-Ra连接的“脂肪酸取代基”具有通式:
Acy-Ln-* (式I),
其中n是0或1至10范围内的整数;Acy是包含约14至约22个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸;L是氨基酸残基或亚烷基二醇部分,其中(*)表示与IL-1Ra连接的位点。
在一些实施方案中,本发明脂肪酸取代基的脂肪酸或脂肪二酸包含14、16、18、20或22个氨基酸。
在一些实施方案中,本发明脂肪酸取代基的脂肪酸或脂肪二酸包含16、18或20个氨基酸。
在一些实施方案中,本发明脂肪酸取代基的脂肪酸或脂肪二酸包含16、18或22个氨基酸。
在一些实施方案中,酰化基团包含选自十六烷二酰基、十八烷二酰基、二十烷二酰基和二十二烷二酰基的羧酸衍生物。
在一些实施方案中,本发明的化合物包含式(I)的脂肪酸取代基,其中Acy选自十六烷二酰基、十八烷二酰基、二十烷二酰基和二十二烷二酰基。
在一些实施方案中,酰化基团包含γ-L-谷氨酸。
在本发明一些实施方案中,式(I)的AA1是接头。
在本发明一些实施方案中,式(I)的AA1是选自D-γGlu、L-γGlu的接头,从中已脱除氢原子和/或羟基。
在本发明一些实施方案中,本发明的接头选自从中已脱除氢原子和/或羟基的D-γGlu、L-γGlu。
在一些实施方案中,酰化基团包含一个或多个连续的[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基,比如[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在本发明一些实施方案中,本发明的脂肪酸取代基是十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸。
在一些实施方案中,酰化基团是十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸。
在本发明一些实施方案中,本发明的脂肪酸取代基是十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在一些实施方案中,酰化基团是十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在本发明一些实施方案中,本发明的脂肪酸取代基是十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在一些实施方案中,酰化基团是二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在本发明一些实施方案中,本发明的脂肪酸取代基是二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在一些实施方案中,酰化基团是二十二烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在本发明一些实施方案中,本发明的脂肪酸取代基是二十二烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
在一些实施方案中,酰化基团经由IL-1Ra的N-端氨基或Lys氨基酸残基与IL-1Ra连接。在一些实施方案中,酰化基团经由IL-1Ra化合物的Lys氨基酸残基的ε氨基与IL-1Ra连接。
在一些实施方案中,酰化基团经由31、34、118和/或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)与IL-1Ra连接。在一些实施方案中,酰化基团经由118和/或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)与IL-1Ra连接。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸单酰化。如本文在IL-1Ra化合物的上下文中使用的术语“单酰化”指在所述IL-1Ra化合物上单个的酰化。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含在31、34、118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化。
可按照WO2005/012347、WO2009/115469或WO2006/084842的描述制备酰化基团。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物包含在K118或K121位具有N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸的hIL-1Ra同种型1 (化合物A)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物是在K118位具有N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸的hIL-1Ra同种型1 (化合物B)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物是在K118位具有N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基]的hIL-1Ra同种型1 (化合物B)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物是在K31或K34位具有N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基]的hIL-1Ra同种型1 (化合物C)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物是在K118或K121位具有N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基]的hIL-1Ra同种型1 (化合物D)。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物选自
N-ε118-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物A1),
N-ε121-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物A2),或其混合物。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物选自
N-ε118-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物B),
N-ε31-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物C1),
N-ε34-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物C2),或其混合物。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物选自N-ε118-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物D1),N-ε121-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物D2),或其混合物。
功能特征
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物具有至少1.5倍,比如至少2倍或至少3倍于阿那白滞素半寿期的体内血浆半寿期。在一些实施方案中,IL-1Ra化合物具有至少5倍,比如至少10倍于阿那白滞素半寿期的体内血浆半寿期。除非另外指定,用于本文的“体内血浆半寿期”指根据本文所述测定(I)或测定(II)确定的体内血浆半寿期。
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物保护免于IL-1β-活性,如通过本文所述测定(III)所确定的。
制备方法
在一些实施方案中,IL-1Ra化合物可通过如描述于实施例5的重组表达制备。在较低温度比如18℃诱导重组表达,提供更高收率的重组IL-1Ra。在较低温度比如18℃诱导重组表达,提供可溶性重组IL-1Ra。因此,在一些实施方案中,本发明涉及制备IL-1Ra化合物的方法,所述方法包括在低于25℃的温度(比如在18℃)重组表达核苷酸序列(比如在权利要求11限定的核苷酸序列)的步骤。
在一些实施方案中,本发明涉及包含选自构建体号2、构建体号3、构建体号4、构建体号5、构建体号6、构建体号7和构建体号8的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中,本发明涉及包含本发明核苷酸序列的载体。
在一些实施方案中,本发明涉及包含本发明核苷酸序列或载体的宿主细胞。
在一些实施方案中,本发明涉及由本发明核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明涉及制备IL-1Ra化合物的方法,包括以下步骤:
a)
核苷酸序列优化,
b)
制备表达质粒,
c)
转化入宿主细胞内,
d)
培养含有表达质粒的表达宿主细胞,和
e)
后续捕获和纯化重组IL-1Ra化合物。
药用组合物
在一些实施方案中,本发明涉及包含IL-1Ra化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方案中,组合物包含一种或多种IL-1Ra化合物,比如两种IL-1Ra化合物。
药物适应证
本发明的化合物可用于医药。在一些实施方案中,本发明涉及用于治疗糖尿病、类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎(SJIA)、心血管疾病、痛风、炎性肠病(IBD)、红斑狼疮(SLE)、阿尔茨海默病、多发性硬化、IL1受体拮抗剂缺乏(DIRA)或Muckle-Wells综合征的IL-1Ra化合物。
在一些实施方案中,本发明涉及用于治疗糖尿病、类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎(SJIA)、心血管疾病、痛风、炎性肠病(IBD)、红斑狼疮(SLE)、阿尔茨海默病、多发性硬化、IL1受体拮抗剂缺乏(DIRA)或Muckle-Wells综合征或其它病况的方法,其中通过给予本发明的化合物,通过给予本发明化合物,控制IL-1信号传导具有临床益处。
定义
如用于本文的术语“人IL-1Ra类似物”指修饰的人IL-1Ra,其中IL-1Ra的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已从IL-1Ra缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已被添加和/或插入到IL-1Ra内。
在一些实施方案中,IL-1Ra类似物与IL-1Ra相比包含小于10个氨基酸修饰(取代、缺失、添加(包括插入)及其任何组合),或者与IL-1Ra相比包含小于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。
在本文,术语“氨基酸残基”是氨基酸,从其上已正式地脱除羧基的羟基和/或从其上已正式地脱除氨基的氢原子。
如用于本文的术语“IL-1Ra衍生物”指化学上修饰的母体IL-1Ra或其类似物,其中一种或多种修饰采用连接酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等的形式。
本发明的“An IL-1Ra”在本文应理解为人IL-1Ra或来自另一物种比如猪或牛胰岛素的IL-1Ra。
如用于本文的术语“IL-1Ra肽”指肽,它是人IL-1Ra或其具有胰岛素活性的类似物或衍生物。
如用于本文的术语“母体IL-1Ra”意指在本发明的任何修饰还未应用其上前的IL-1Ra。
给药方式
在本文,术语“酰化IL-1Ra”覆盖一个或多个脂肪酸取代基任选经由接头与IL-Ra肽连接的IL-1Ra修饰。
一方面,用于本发明组合物的胰岛素肽是N-端修饰的,并且在不是胰岛素N-端位置的位置上被脂肪酸取代基取代,其中脂肪酸取代基由任选经由接头与胰岛素连接的脂肪酸或二脂肪酸组成。接头可以是脂肪酸或脂肪二酸和与胰岛素连接的点之间的任何合适部分,该部分也可称为连接部分、间隔体等。
术语“治疗”意欲包括预防涉及的疾病、病症或病况和将其减至最小两者(即“治疗”指预防性和治疗性给予IL-1Ra衍生物或包含IL-1Ra衍生物的组合物两者,除非另外指示或通过上下文明确反驳)。
给药途径可以是将本发明化合物有效地转运至体内所需的或合适位置的任何途径,比如胃肠外,例如皮下、肌内或静脉内。备选地,可以口服、经肺、经直肠、经皮、口腔含化、舌下或经鼻给予本发明的化合物。
关于胃肠外给药,与已知胰岛素的配制类似地配制本发明的化合物。此外,关于胃肠外给药,与已知胰岛素的给药类似地给予本发明的化合物,医师熟悉这种程序。
在本文,术语“脂肪酸”覆盖具有至少两个碳原子且饱和或不饱和的直链或支链脂族羧酸。脂肪酸的非限制性实例是肉豆蔻酸、软脂酸和硬脂酸。
在本文,术语“脂肪二酸”覆盖具有至少两个碳原子且饱和或不饱和的直链或支链脂族二羧酸。脂肪二酸的非限制性实例是己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
如用于本文的术语“约”指在所述数值附近的合理范围,比如加或减10%。
实施例
中间体的合成
酰化基团,如N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基琥珀酰亚胺酯、N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯和N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯,可按照WO2005/012347、WO2009/115469或WO2010/029159的描述制备。
实施例1:在K118或K121位具有N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸的[Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物A):
用N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基琥珀酰亚胺酯(化1)衍生[Met25]hIL-1Ra(25-177)。
化1:
将Kineret (660 μL, 5.8 nmol阿那白滞素, 市售购自Amgen)用5 % NaHCO3, pH 8 (1340 μL)稀释,混合物的pH是7。使N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基琥珀酰亚胺酯(4.8
mg, 5.8 nmol)溶于DMF (300 μL)中,并加至蛋白质溶液。15分钟后LCMS分析显示形成产物如下:1963
Da [M+9H]9+, 1359 Da [M+13]13+, 1262Da [M+14H]14+。将酰化蛋白质在Source 30Q阴离子交换柱(20 mM Tris pH 8.0, 经过20柱体积从50至200 mM NaCl)上纯化,并贮存于4℃。
令人惊奇地是,阴离子交换层析纯化产物是在K118或K121单酰化的[Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物A)。蛋白水解性Asp-N降解后接着MALDI-TOF
MS或LCMS分析显示产物是N-ε118-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物A1)和N-ε121-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物A2)的混合物。
实施例2:在K118位(化合物B)或者在K31或K34位(化合物C)具有N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的[Met25]hIL-1Ra(25-177):
用N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯(化2)衍生[Met25]hIL-1Ra(25-177)
化2:
将Kineret (660 μL, 5.8 nmol阿那白滞素, 市售购自Amgen)用5 % NaHCO3, pH 8 (1340 μL)稀释,混合物的pH是7。使N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯(4.8 mg, 5.8 nmol)溶于DMF (300 μL)中,并加至蛋白质溶液。15分钟后LCMS分析显示形成产物如下:1998 Da [M+9H]9+, 1799 Da [M+10H]10+, 1635
Da [M+11H]11+, 1499 Da [M+12H]12+, 1383 Da [M+13]13+。将酰化蛋白质在Source 30Q阴离子交换柱(20 mM Tris pH 8.0, 经过20柱体积从50至200 mM NaCl)上纯化,并贮存于4℃。
令人惊奇地是,通过阴离子交换层析分离产生主要酰化产物(化合物B),通过Asp-N降解和LCMS显示其在[Met25]hIL-1Ra
(25-177)的K118位酰化(>80%产物在该层析池中),和次要酰化产物(化合物C),其在[Met25]hIL-1Ra(25-177)的K31或K34位单酰化。产物是N-ε118-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物B)、N-ε31-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基]
[Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物C1)和N-ε34-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物C2)的混合物。
实施例3:在K118或K121位具有N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基的[Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物D):
用N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯(化3)衍生[Met25]hIL-1Ra (25-177)。
化3:
将Kineret (1.32 mL, 11.6 nmol阿那白滞素, 市售购自Amgen)用0.1 M NaHCO3, pH 8 (6.65 mL)稀释,混合物的pH是7.4。使N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基琥珀酰亚胺酯(10.0 mg, 11.6 nmol)溶于DMF (1.5 mL)中,并加至蛋白质溶液。15分钟后LCMS分析显示形成酰化产物,[M+12 H]+ = 1501.2 Da,计算值1501.0 Da,将其通过关于化合物A-C描述的方法纯化。
纯化产物是单酰化的[Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物D)。蛋白水解性Asp-N降解后接着MALDI-TOF
MS或LCMS分析显示化合物D是以下两种主要产物的混合物:
N-ε118-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物D1)
和
N-ε121-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酸-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra (25-177) (化合物D2)。
生物学测定
测定
(I)
:在大鼠中确定的血浆半寿期
以下测定可用于评价在大鼠中的药代动力学。在稀疏抽样研究设计中通过静脉内(IV)给药给予大鼠。对重约250
g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic)每只动物IV给予溶于Gibco
DPBS w/o Ca和Mg (GIBCO目录号14190)中的1-10 μg测试物。动物随意进食进水,且在进入研究之前适应至少1周。在不麻醉的情况下在给药后例如5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时从舌下静脉(舌)采血(650 µl)。每只大鼠采样4次,并在末次采样后处死大鼠。将血液收集在装有EDTA的管中。将样品保存在冰上并离心(5分钟,
4℃, 8000 rpm)。将每个时间点的2×150 μL血浆样品转移入微量管(micronic)内并在-20℃保存直至分析。如下文所描述通过测定(A)分析血浆样品。
测定
(II)
:在猪中确定的血浆半寿期
以下测定可用于评价在猪中的药代动力学。通过静脉内(IV)给药给予猪。经由插在耳静脉中的venflon
IV给予重约15-30 kg的雄性Göttingen迷你猪(Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, 丹麦)。从颈静脉采血。使测试物溶于Gibco DPBS w/o Ca和Mg (GIBCO目录号14190)中,剂量是每只动物0.2
mg。在例如下列时间点采集血样:给药前,给药后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、192小时、216小时、240小时、264小时和288小时。将血样(0.8 mL)收集入装有EDTA缓冲液的试管内用于稳定,并在离心之前在冰上保存最多20分钟。分离血浆的离心程序可以是:4℃和约2500 g 10分钟。收集血浆,并立即转移(2×200
μL)至微量管(Micronic tube)内,在-20℃贮存直至测定。如下文描述通过测定(A)分析血浆样品。
测定
(A)
:血浆样品的定量测定
血浆样品的定量测定:用市售获得的人白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)的ELISA试剂盒(来自R&D
Systems的Quantikine试剂盒)进行血浆中的IL-1Ra化合物的测量。ELISA是夹心免疫测定,基于一种单克隆抗体和一种多克隆抗体。在除了以下情况外的所有情况下都遵循来自R&D Systems的测定程序:1)试剂盒标准品用作对照,2)在对应于样品(大鼠或迷你猪)的物种血浆中制备每种IL-1Ra化合物的标准品,和3)在物种血浆中稀释样品。简言之,方案是:将对IL-1Ra特异性的单克隆抗体预包被在微量板上。在血浆中制备每种IL-1Ra化合物的标准品,将试剂盒标准品和样品移液入各孔内,且存在的任何IL-1Ra被固定的抗体结合。在洗掉任何未结合的物质以后,将对IL-1Ra特异性的酶联多克隆抗体加至各孔内。在洗涤以除去任何未结合的抗体-酶试剂以后,将底物溶液加至各孔,显色与在初始步骤中结合的IL-1Ra量成比例。停止显色,测量颜色的强度。
非房室分析(NCA):用WinNonlin
(Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)通过非房室药代动力学分析(NCA)来分析血浆浓度-时间曲线。用每只动物各自的血浆浓度-时间曲线进行NCA。
测定
(III)
:
NO-
产生
INS-1细胞从大鼠胰岛素瘤得到,并广泛用于β-细胞的研究。INS-1细胞表达IL-1受体且该受体被IL-1β活化导致iNOS表达增加,并接着导致一氧化氮(NO)释放。NO非常不稳定,并迅速分解为更稳定的副产物硝酸盐和亚硝酸盐。培养基中的亚硝酸盐水平可以容易地用Griess方法测量,从而间接测量NO的产生。在本实验中,将INS-1细胞接种在96孔板中,并在37℃孵育。第二天,将150
pg/ml IL-1β和增加浓度的IL-1受体拮抗剂化合物加至细胞,并将板在37℃孵育48小时。在孵育后用Griess方法分析培养基的NO。
实施例4:IL-1Ra化合物的血浆半寿期
用测定(I)和测定(II)确定阿那白滞素和化合物A、B和C的血浆半寿期。对大鼠的剂量是1 μg (阿那白滞素)、5 μg (化合物B和C)或者10 μg (化合物A)。对迷你猪的剂量是200
μg阿那白滞素、化合物A、B或C。结果显示于表1。
表1. 阿那白滞素和酰化阿那白滞素化合物的血浆半寿期
结果显示,酰化将大鼠血浆半寿期从67分钟改善至长达222分钟(化合物C)和将大鼠血浆半寿期从80分钟改善至长达840分钟(化合物B)。
实施例5:自IL-1Ra化合物的NO-产生
根据测定(III)确定IL-1Ra化合物的NO-产生。进行一式四份测量。结果显示于表2。
表
2.
自
IL-1Ra
化合物的
NO-
产生
测定
(IV)
:在小鼠中对炎症标记物释放的急性抑制作用
在用hIL-1 (1 ng/g, R&D Systems; 皮下注射体积10 ml/kg)在时间0小时处理之前,对6至7周龄C57bl/雌性小鼠(所有各组n
= 6)腹膜内给予:阿那白滞素(10或100 mg/kg; 注射体积5 ml/kg),在时间-½小时;或化合物C
(10、30或100 mg/kg; 注射体积5 ml/kg),在时间-1小时。在时间2小时将所有小鼠用异氟烷麻醉,并从腹主动脉收集血液。用xMAP多重测定(Luminex)测量炎症标记物IL-6和MCP-1的血浆水平。结果显示于表3。
表
3.
在小鼠中对炎症标记物释放的急性抑制作用
制备方法
实施例6:IL-1Ra或其变体在大肠杆菌中的重组表达和编码DNA序列的构建
为了改善重组IL-1Ra表达系统,将编码IL-1Ra和重组IL-1Ra变体的DNA进行核苷酸优化。核苷酸优化的IL-1Ra和IL-1Ra-变体显示于表3。
将编码IL-1Ra的DNA片段从核苷酸优化的编码IL-1Ra或IL-1Ra-变体的DNA片段进行NdeI+BamHI分离,并亚克隆在NdeI+BamHI限制的pET11a中。
关于表达,将IL-1Ra_pET11a构建体转化入BL21(DE3)内,通过添加0.4 mM IPTG诱导表达,并在37℃继续3小时或在18℃继续过夜。预期的分子量为约17 kDa。在37℃,可溶性重组IL-1Ra-变体的表达是罕见的,但是,在18℃诱导过夜后观察到明显更大的可溶性IL-1Ra-级分。
通过SDS-PAGE分析表达,结果显示于图1。图1A显示构建体号1在37℃在3个独立克隆中的表达。图1B显示构建体号4-8在37℃的表达。图1C显示构建体号4-7在37℃与18℃的表达,其中构建体号4和5在37℃发酵3小时,而构建体号6和7在18℃发酵过夜。图1D显示构建体号2和3在800 mL振荡烧瓶培养物中的表达,培养物由0.4
mM IPTG诱导并在18℃培养过夜,I;
诱导的, M: 标记物(14,
20, 30, 45, 66, 97 kDa)。
用构建体号1在5 mL分批培养物中的产量是120-160 mg/升可溶性重组IL-1Ra。
发现核苷酸优化的编码DNA序列在大肠杆菌中提供最佳的重组IL1RA表达水平。具体来讲,不仅表达水平大量地增加,可溶性蛋白质的产量也增加。此外,发现对于一些在较低温度比如18℃诱导的构建体表达,提供更高收率的重组IL-1Ra并维持重组IL-1Ra可溶。
表3. IL-1Ra (构建体号1)和IL-1Ra-变体(构建体号2-8)氨基酸序列和编码DNA序列的构建体的概述。构建体号1-8的核苷酸序列长度是473个核苷酸。
虽然本文已说明和描述本发明的某些特征,但本领域技术人员将想到许多修改、替代、改变和等同物。因此,应理解附属权利要求旨在覆盖所有此类修改和改变,如同落在本发明真正的主题范围内。
以下是本发明范围内进一步包含的方面的非限制性列表:
1. 一种包含酰化基团的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物。
2. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团经由31、34、118和/或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)与IL-1Ra连接。
3. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra化合物包含:i)在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基单酰化,或者ii)在31、34、118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化,或者iii)在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化。
4. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团选自N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基、N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基、N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基和N-二十二烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
5. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra是人IL-1Ra或其类似物。
6. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团经由所述IL-1Ra的Lys氨基酸残基的ε氨基与IL-1Ra连接。
7. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra包含取代K31R、K34R、K118R和/或K121R (相对于hIL-1Ra同种型1的位置)。
8. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra化合物选自N-ε118-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物A1),N-ε121-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物A2),化合物 A1和A2的混合物,N-ε118-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物B),N-ε31-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物C1),N-ε34-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物C2),N-ε118-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物D1),N-ε118-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物D2),化合物C1和C2的混合物,化合物B、C1和C2的混合物,或者化合物D1和D2的混合物。
9. 一种组合物,其包含前述方面中任一项限定的IL-1Ra化合物和一种或多种赋形剂。
10. 前述方面中任一项的IL-1Ra化合物,其用于医药。
11. 一种核苷酸序列,其包含选自构建体号2、构建体号3、构建体号4、构建体号5、构建体号6、构建体号7和构建体号8的序列。
12. 一种载体,其包含方面11限定的核苷酸序列。
13. 一种宿主细胞,其包含方面11限定的核苷酸序列或者方面12限定的载体。
14. 一种氨基酸序列,其由方面11限定的核苷酸序列编码。
15. 一种制备IL-1Ra化合物的方法,所述方法包括在低于25℃的温度比如在18℃重组表达核苷酸序列,比如方面11限定的核苷酸序列的步骤。
Claims (15)
1. 一种IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物,其中所述IL-1Ra是人IL-1Ra或其类似物,并包含酰化基团,其中所述酰化基团包含脂肪酸或脂肪二酸。
2. 权利要求1的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物,其进一步包含接头。
3. 一种包含酰化基团的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)化合物,其中所述酰化基团包含式I的亲脂取代基:
Acy-Ln-*(式I),
其中n是0或1至10范围内的整数;Acy是包含约8至约24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸;L是氨基酸残基或亚烷基二醇部分并且*表示与IL-1Ra连接的位点。
4. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团经由31、34、118和/或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)与IL-1Ra连接。
5. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra化合物包含:i)在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基单酰化,或者ii)在31、34、118或121位(相对于hIL-1Ra同种型1的位置)用N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化,或者iii)在118或121位(相对于hIL-1Ra同种型的位置)用N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基单酰化。
6. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团选自N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基、N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基、N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基和N-二十二烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基。
7. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述酰化基团经由所述IL-1Ra的Lys 氨基酸残基的ε氨基或者N-端氨基残基的氨基与IL-1Ra连接。
8. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra包含取代K31R、K34R、K118R和/或K121R (相对于hIL-1Ra同种型1的位置)。
9. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其中所述IL-1Ra化合物选自N-ε118-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物A1),N-ε121-[N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酸][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物A2),N-ε118-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物B),N-ε31-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物C1),N-ε34-[N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物C2),N-ε118-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177) (化合物D1),N-ε121-[N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基][Met25]hIL-1Ra(25-177)
(化合物D2),化合物A1和A2的混合物,化合物C1和C2的混合物,化合物B、C1、C2的混合物,或者化合物D1和D2的混合物。
10. 一种组合物,其包含前述权利要求中任一项限定的IL-1Ra化合物和一种或多种赋形剂。
11. 前述权利要求中任一项的IL-1Ra化合物,其用于医药。
12. 一种核苷酸序列,其包含选自构建体号2、构建体号3、构建体号4、构建体号5、构建体号6、构建体号7和构建体号8的序列。
13. 一种载体,其包含权利要求11限定的核苷酸序列。
14. 一种宿主细胞,其包含权利要求11限定的核苷酸序列或者权利要求11限定的载体。
15. 一种制备IL-1Ra化合物的方法,所述方法包括在低于25℃的温度比如在18℃重组表达核苷酸序列比如权利要求11限定的核苷酸序列的步骤。
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