PT2121713E - Oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi e seus conjugados - Google Patents

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aminooxy
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lysosomal
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Seng H Cheng
Yunxiang Zhu
Canwen Jiang
Luis Z Avila
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Description

DESCRIÇÃO
"OLIGOSSACÁRIDOS COMPREENDENDO UM GRUPO AMINOOXI E SEUS CONJUGADOS" A divulgação refere-se, geralmente, a métodos para a síntese de oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi de oligossacáridos compreendendo um grupo reactivo. Noutra forma de realização, a invenção refere-se ainda a oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi. A revelação refere-se também a métodos de conjugação de oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi a proteínas, incluindo as glicoproteínas (tal como, e. g., enzimas lisossomais) e a composições de conjugados de oligossacárido-proteína, incluindo conjugados de oligossacárido-glicoproteína. Outra forma de realização da invenção refere-se a métodos de tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomal utilizando tais conjugados de oligossacárido-enzima lisossomal.
Os distúrbios de armazenamento lisossomal (LSD) são uma classe de distúrbios metabólicos raros, compreendendo mais de quarenta doenças genéticas envolvendo uma deficiência na atividade de hidrolases lisossomais. Uma marca característica dos LSD é a acumulação anormal de metabolitos lisossomais, o que leva à formação de um grande número de lisossomas distendidos.
Os LSD podem ser tratados por administração da versão activa da enzima deficiente no doente, um processo denominado terapia de substituição de enzimas (ERT). A enzima de substituição administrada ligando um grupo manose-6-fosfato (M6P) terminal, é 1 captada pelas células alvo através endocitose mediada pelo receptor M6P (CI-MPR) da superfície celular, associado a catião independente, e direccionada para o lisossoma.
No geral, as enzimas de substituição pouco fosforiladas não são internalizadas pelo receptor M6P na superfície das células e, portanto, não pode ser direccionado para o lisossoma onde eles funcionam. Consequentemente, um baixo grau de fosforilação de manose pode ter um efeito significativo e prejudicial sobre a eficácia terapêutica da enzima de substituição.
Foram portanto desenvolvidos métodos para aumentar o teor de M6P das enzimas de substituição. A Patente U.S. N° 7001994, por exemplo, descreve um método para a ligação de oligossacáridos compreendendo M6P com glicoproteínas. Os oligossacáridos das glicoproteínas são oxidados primeiro com periodato ou galactose oxidase, para resultar na formação de grupos carbonilo, que são depois, quimicamente conjugados com um oligossacárido funcionalizado na extremidade redutora com um grupo carbonilo reactivo (tais como, e. g., uma hidrazina, hidrazida, aminooxi, tiosemicarbazida, semicarbazida ou grupo amina), para se obter um conjugado de oligossacárido-glicoproteína.
Um conjugado do ácido α-glucosidase da enzima lisossomal (GAA) com um oligossacárido bis-M6P, foi preparado pelo método descrito acima, e verificou-se ser mais eficaz na redução do esqueleto e do glicogénio do músculo cardíaco do que a GAA humana recombinante num modelo de doença de Pompe em murinos, uma doença muscular autossómica recessiva, resultante de uma deficiência metabólica de GAA e caracterizada pela acumulação de glicogénio lisossomal. 2 0 documento US 20050169941 divulga um conjugado compreendendo um reagente aminooxi homofuncional ou heterofuncional e uma entidade escolhida de polissacáridos, oligossacáridos, hidratos de carbono e moléculas contendo hidratos de carbono, contendo, pelo menos, um grupo carbonilo, para formar um polissacárido, oligossacárido, hidrato de carbono ou molécula contendo hidrato de carbono funcionalizada via, pelo menos, uma ligação oxima. O documento US 20020137125 revela derivados oligossacáridos de manopiranosilo altamente fosforilados, contendo manose-6-fosfato (M6P) ou outros oligossacáridos ligando outras hexoses terminais. O documento US 20050048047 refere-se à administração intratecal (IT) da enzima recombinante para tratar distúrbios de armazenamento lisossomal.
Os grupos aminooxi são grupos carbonilo reactivos particularmente úteis para as reacções de conjugação descritas acima, uma vez que os conjugados resultantes compreendem uma ligação oxima relativamente estável. Deste modo, existe uma necessidade de métodos para a preparação de oligossacáridos funcionalizados aminooxi.
Consequentemente, a presente invenção proporciona um conjugado de oligossacárido-enzima lisossomal compreendendo (1) uma enzima lisossomal, (2) um oligossacárido, e (3) um grupo oxima ligando a enzima lisossomal e o oligossacárido, em que o oligossacárido é um oligossacárido de Fórmula VI: 3
Fórmula VI A invenção proporciona também um método para preparar o conjugado por ligação de um oligossacárido a uma enzima lisossomal, compreendendo: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma enzima lisossomal com, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com, pelo menos, um grupo carbonilo da enzima lisossomal, 4 ligando assim o oligossacárido à enzima lisossomal, em que o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi é
A invenção proporciona também um método para preparar o conjugado por ligação de um oligossacárido a uma enzima lisossomal, compreendendo: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma enzima lisossomal com, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com, pelo menos, um grupo carbonilo da enzima lisossomal, ligando assim o oligossacárido à enzima lisossomal, em que o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi é 5 ^QjPO ηοΛ
OH A presente divulgação proporciona assim, métodos para a preparação de oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi. Estes métodos são, geralmente, aplicáveis a uma ampla gama de oligossacáridos protegidos e desprotegidos, tais como, e. g. , oligossacáridos ramificados e não ramificados e fosforilados e não fosforilados. Em determinadas formas de realização, os oligossacáridos podem ser um dissacárido, trissacárido, tetrassacárido, pentassacárido, hexassacárido, heptassacárido, ou maior. 0 oligossacárido pode, em determinadas formas de realização, compreender, pelo menos, um resíduo de M6P. Em algumas formas de realização, o oligossacárido pode compreender, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 resíduos M6P terminais. A divulgação proporciona oligossacárido compreendendo um método um grupo de preparação de aminooxi de um um 6 oligossacárido compreendendo um grupo reactivo. 0 método compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reactivo; (b) proporcionar um composto aminooxi compreendendo um grupo aminooxi e um segundo grupo reactivo, e (b) fazer reagir o primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, preparando, assim, o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi. 0 primeiro e segundo grupo reactivo podem ser seleccionados a partir, e. g., hidrazina, hidrazida, tiosemicarbazida, semicarbazida, amina, carboxilo, éster activado, halogeneto de acilo, azida de acilo, halogeneto de alquilo, anidrido, isotiocianato, isocianato e grupos halogeneto de sulfonilo.
Em algumas formas de realização, o composto aminooxi é seleccionado de compostos de Fórmula II: V.
P
Fórmula II em que Y é o segundo grupo reactivo, Z é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo e heterociclilo e P é seleccionado de grupos de protecção amino (tal como, e. g., grupos de protecção carbamato) . Por exemplo, em algumas formas de realização, Y pode ser um carboxilo, éster activado, 7 halogeneto de acilo (tal como, e. g., um fluoreto de acilo ou cloreto de acilo), azida de acilo, halogeneto de alquilo, anidrido, isotiocianato, isocianato ou halogeneto de sulfonilo (tal como, e. g., um cloreto de sulfonilo ou brometo de sulfonilo) . Noutras formas de realização, Y pode ser, e. g., uma hidrazina, hidrazida, tiosemicarbazida, semicarbazida ou grupo amina.
Em determinadas formas de realização, o composto aminooxi de Fórmula II é seleccionado de compostos de Fórmula III:
Fórmula III em que Y é o segundo grupo reactivo, n é seleccionado de números inteiros que variam de 1 a 10, e P é seleccionado dos grupos de protecção amino.
Em determinadas formas de realização, o composto aminooxi compreende um grupo de protecção amino e o método compreende ainda um passo (d), desprotegendo o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi. A divulgação proporciona ainda um oligossacárido compreendendo (1) um grupo aminooxi e (2) manose-6-fosfato. Em algumas formas de realização, esse oligossacárido é preparado pelos métodos descritos acima. Por exemplo, em algumas formas de realização, a invenção proporciona um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi de Fórmula IV:
em que m e p sao independentemente seleccionados de números inteiros que variam de 1 a 10.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um oligossacárido de Fórmula V:
Fórmula V 9
Noutra forma de realização, a divulgação proporciona métodos de ligação de um oligossacárido a uma proteína. Numa forma de realização, o método compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma proteína possuindo, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com, pelo menos, um grupo carbonilo da proteína, ligando assim o oligossacárido à proteína.
Noutras formas de realização, a divulgação proporciona ainda um conjugado de oligossacárido-proteína compreendendo (1) uma proteína, (2) um oligossacárido e (3) um grupo oxima ligando a proteína e o oligossacárido. Por exemplo, em algumas formas de realização, a divulgação proporciona um conjugado de oligossacárido-proteína preparado pelos métodos divulgados acima. Em determinadas formas de realização, o conjugado de oligossacárido-proteína é um conjugado de oligossacárido-glicoproteína. Em determinadas formas de realização, o conjugado de oligossacárido-glicoproteína é o conjugado de um oligossacárido compreendendo, pelo menos, um de M6P e uma enzima lisossomal, tal como, e. g., uma hidrolase lisossomal. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um conjugado de oligossacárido-proteína da invenção. 10
Outra forma de realização da divulgação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal, tal como, e. g. , aqueles descritos na Tabela 1. Em algumas formas de realização, os métodos compreendem a administração a um mamífero de um conjugado de oligossacárido-glicoproteína da invenção, em que o oligossacárido compreende, pelo menos, um M6P e a glicoproteína é uma hidrolase lisossomal. A invenção proporciona ainda um conjugado da invenção para utilização no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal num indivíduo com essa necessidade, e na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um esquema reaccional que mostra uma forma de realização ilustrativa dos métodos da divulgação. 0 oligossacárido 1, que tem um primeiro grupo reactivo (um grupo hidrazida) é feito reagir com o composto aminooxi 2 em presença do catalisador 3-hidroxi-l,2,3-benzotriazin-4 (3H)-ona (DHBt-OH) para proporcionar o oligossacárido 3. 0 grupo de protecção amino terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) do oligosacárido 3 é então removido com ácido trifluoroacético a 50%/diclorometano (TFA/DCM), para se obter o oligossacárido 4. A Figura 2 representa uma série de cromatografia de gel de intermediários no esquema sintético descrito na Figura 1. A Figura 2A é uma cromatografia de fase analítica Dionex do oligossacárido 1 de partida. A Figura 2B é uma cromatograf ia de fase analítica Dionex do oligossacárido 3. A Figura 2C é uma cromatografia de fase analítica Dionex do oligossacárido 4. 11 A Figura 3A é um espectro de massa do oligossacárido 1 (massa molecular calculada = 1250, peso molecular calculado de sal de sódio = 1338) . A Figura 3B é um espectro de massa do oligossacárido 4 (massa molecular calculada = 1323, peso molecular calculado de sal de sódio = 1,411). A Figura 4 é um esquema reaccional que mostra uma forma de realização ilustrativa dos métodos da divulgação. 0 oligossacárido 5, tendo um primeiro grupo reactivo (um grupo carboxilo), é feito reagir com o composto aminooxi 6 em presença do agente de ligação l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e o catalisador de N-hidroxissucinimida (NHS), para proporcionar o oligossacárido 3 contendo o aminooxi. O grupo de protecção amino Boc do oligosacárido 3 é depois removido com TFA a 50%/DCM, para proporcionar o oligossacárido 4. I. Preparação de um Oligossacárido Compreendendo um Grupo Aminooxi A. Oligossacárido compreendendo um grupo reactivo
Os métodos da divulgação são aplicáveis a uma ampla gama de oligossacáridos compreendendo um grupo reactivo. Como aqui utilizado, um oligossacárido refere-se a um dissacárido, trissacárido, tetrassacárido, pentassacárido, hexassacárido, heptassacárido ou oligosacárido maior (tal como, e. g., um oligossacárido compreendendo 2-50, 2-10, 8-25 ou 8-50 unidades de sacárido). Consequentemente, em várias formas de realização, um oligossacárido pode ser, e. g., um dissacárido, trissacárido, tetrassacárido, um pentassacárido, um hexassacárido, um 12 heptassacárido ou um oligossacárido maior. Um oligossacárido pode ser mono-, bi-, tri-, tetra- ou penta-antenal em estrutura. Um oligossacárido pode compreender 0, 1, 2, 3, 4 ou mais pontos de ramificação. O grupo reactivo no oligossacárido, também referido como um primeiro grupo reactivo, pode ser, em algumas formas de realização, e. g., um grupo hidrazina, grupo hidrazida, grupo semicarbazida, tiosemicarbazida ou grupo amina. Em algumas formas de realização, o primeiro grupo reactivo pode ser, e. g., um grupo carboxilo, éster (tal como, e. g., um éster activado), halogeneto de acilo (tal como, e. g., fluoreto de acilo ou cloreto de acilo) , azida de acilo, halogeneto de alquilo, anidrido , isotiocianato, isocianato ou halogeneto de sulfonilo (tal como, e. g., cloreto de sulfonilo ou brometo de sulfonilo). O primeiro grupo reactivo pode estar ligado à extremidade redutora do oligossacárido ou pode estar localizado em qualquer parte do oligossacárido. O primeiro grupo reactivo pode, em determinadas formas de realização, estar ligado através de um ou mais elementos de ligação ao oligossacárido. Um ligante como aqui utilizado, pode ser escolhido a partir de, e. g., uma combinação de um grupo alquilo opcionalmente substituído, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, aciloxilo, alcoxilo, ariloxilo e grupos heterocicliloxilo. Um ligante pode ser interrompido ou terminado por um ou mais heteroátomos tais como, e. g., azoto, enxofre e oxigénio. Por exemplo, um ligante, em algumas formas de realização, pode compreender um ou mais grupos éter, éster ou amida.
Qualquer grupo químico do ligante (tais como, e. g., alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, 13 aciloxilo, alcoxilo, ariloxilo e heterocicliloxilo) pode ser substituído ou não substituído, a menos que indicado de outra forma. Os substituintes podem ser seleccionados de, e. g. , acilo, acilamino, aciloxilo, alcenilo, alcoxilo, alquilo, alcinilo, amido, amino, arilo, ariloxilo, azido, carbamoilo, carbo-alcoxilo, carboxilo, ciano, cicloalquilo, formilo, guanidino, halo, heteroarilo, heterociclilo, hidroxilo, iminoamino, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinilo, sulfonamino, sulfonato, sulfonilo, tio, tioacilamino, tioureído e ureído. Os substituintes podem, eles próprios, ser substituídos ou não substituídos e podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais heteroátomos tais como, e. g., azoto, enxofre e oxigénio.
Em determinadas formas de realização, um oligossacárido pode compreender, pelo menos, um grupo de protecção. 0 termo "grupo de protecção" refere-se a qualquer substituinte que pode ser utilizado para impedir que um grupo funcional (tais como, e. g., um grupo amina, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo, um grupo de hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida ou um grupo tio-semicarbazida) numa molécula, de sofrer uma reacção química, enquanto que a mudança química ocorre em outras posições da molécula. Um grupo de protecção pode ser removido sob as condições químicas adequadas. São conhecidos vários grupos de protecção pelos especialistas na técnica, e os exemplos de grupos de protecção, os métodos para a sua adição e métodos para a sua remoção podem ser encontrados em, e. g., Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley and Sons: Nova Iorque, 1999 e Kocienski, Protecting Groups, 3° ed., Georg Thieme Verlag: Estugarda, Alemanha, 2005, cujas divulgações estão aqui incorporadas por referência. Em determinadas formas de realização, o oligossacárido pode compreender, pelo menos, um grupo de protecção seleccionado de 14 grupos de protecção hidroxilo, grupos de protecção carboxilo e grupos de protecção de amino. Noutras formas de realização, um oligossacárido pode ser "desprotegido" e pode não compreender quaisquer grupos de protecção.
Um oligossacárido pode ser isolado a partir de uma fonte natural ou pode ser preparado por síntese química ou enzimática. Um oligossacárido isolado a partir de uma fonte natural pode ser homogéneo ou pode ser uma mistura heterogénea de oligossacáridos relacionados. Em algumas formas de realização, um oligossacárido pode ser preparado por modificação química ou enzimática a partir de um oligossacárido isolado de uma fonte natural ("semi-síntese"). Em algumas formas de realização, o oligossacárido pode ser um oligossacárido sintético com a estrutura química de um oligossacárido que ocorre naturalmente.
Em algumas formas de realização, um oligossacárido pode compreender um monossacárido que é reconhecido por um receptor particular. 0 monossacárido reconhecido por um receptor particular, pode ser escolhido de, e. g., galactose, GalNAc, manose, M6P, glucose, GIcNAc, ácido siálico ou resíduo de ácido siálico sulfatado. Um oligossacárido pode, em certas formas de realização, compreender, pelo menos, um resíduo de M6P, tal como, e. g. , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de M6P. O monossacárido reconhecido por um receptor particular pode ser, em algumas formas de realização, um monossacárido penúltimo ou um monossacárido terminal. Em algumas formas de realização, o monossacárido reconhecido por um receptor particular, pode ser uma galactose terminal, manose, M6P, glucose, GIcNAc ou resíduo de ácido siálico. Um oligossacárido pode, em algumas formas de 15 realização, conter, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 resíduos de M6P terminal.
Em determinadas formas de realização, o oligossacárido compreendendo um grupo reactivo pode ser um hexassacárido contendo M6P de Fórmula Ia: «o#®
Fórmula Ia 0 oligossacárido de Fórmula Ia pode ser descrito como butiril-hidrazina-4-ilo 6-0-f osf ono-a-D-manopiranosil - (l->2 ) -a-D-manopiranosi 1 — (1—>6) — oí—D—manopiranosil - (1—>6) — [6—0—fosfono-oí—D— manopiranosil- (1-+2) -α-D-manopiranosil - (l->3) -β-D-manopir ano sido .
Em determinadas formas de realização, o oligossacárido compreendendo um grupo reactivo pode ser um hexassacárido contendo M6P de Fórmula Ib: 16
Β. Composto Aminooxi
Como aqui utilizado, um composto aminooxi pode ser qualquer composto compreendendo um grupo aminooxi e um segundo grupo reactivo, em que o segundo grupo reactivo pode reagir com um primeiro grupo reactivo num oligossacárido, de modo a formar uma ligação covalente. Por exemplo, em algumas formas de realização, o segundo grupo reactivo pode ser um grupo carboxilo, éster (tal como, e. g. , um éster activado) , halogeneto de acilo (tal como, e. g. , um fluoreto de acilo ou cloreto de acilo), azida de acilo, anidrido, isotiocianato, isocianato ou halogeneto de sulfonilo (tal como, e. g., um cloreto de sulfonilo ou o brometo de sulfonilo). Noutras formas de realização, o segundo grupo reactivo pode ser, e. g., um grupo de hidrazina, um grupo hidrazida, grupo de semicarbazida, tiosemicarbazida ou grupo amina. 17
Em determinadas formas de realizaçao, o azoto do grupo aminooxi do composto aminooxi é protegido com um grupo de protecção amino. São conhecidos pelos especialistas na técnica vários grupos de protecção amino, e exemplos de grupos de protecção amino, métodos para a sua adição e métodos para a sua remoção podem ser encontrados nas páginas 494-653 de Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley and Sons: Nova Iorque, 1999, Capitulo 8 de Kocienski, Protecting Groups, 3a ed, Georg Thieme Verlag: Estugarda, Alemanha, 2005; Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag: Nova Iorque, 1993; Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press: Boca Raton, FL, 1997, e Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co. : Rockford, IL, 1984, as invenções dos quais são aqui incorporadas por referência.
Em algumas formas de realização, o composto aminooxi é seleccionado de compostos de Fórmula II:
Z N
H
Formula II em que Y é o segundo grupo reactivo, Z é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, heteroarilo, arilo e heterociclilo, e P é seleccionado de grupos de protecção amino.
Tal como aqui utilizado, qualquer grupo quimico no composto aminooxi (tais como, e. g., alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, aciloxilo, alcoxilo, ariloxilo e heterocicliloxilo), pode ser substituído ou não substituído, e 18 pode ser interrompido por um ou mais grupos químicos, a menos que indicado de outra forma. Os substituintes e grupos químicos de interrupção podem ser seleccionados de, e. g., acilo, acilamino, aciloxilo, alcenilo, alcoxilo, alquilo, alcinilo, amido, amino, arilo, ariloxilo, azido, carbamoílo, carboalcoxilo, carboxilo, ciano, cicloalquilo, formilo, guanidino, halo, heteroarilo, heterociclilo, hidroxilo, iminoamino, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinilo, sulfonamino, sulfonato, sulfonilo, tio, tioacilamino, tioureído e ureido. Os substituintes podem, eles próprios, ser substituídos ou não substituídos, e podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais heteroátomos tais como, e. g., azoto, enxofre e oxigénio.
Em determinadas formas de realização, Y pode ser seleccionado a partir de, por exemplo: 19
em que X é seleccionado de halogénio, azida, aciloxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo e heterocicliloxilo.
Em determinadas formas de realização, o composto aminooxi é um éster activado. Como aqui utilizado, um éster activado é um éster que reage para formar uma ligação amida sob condições moderadas. No geral, um éster activado é um éster de um álcool 20 relativamente ácidico. Em determinadas formas de realizaçao, o composto de aminooxi de Fórmula II é um éster activado de 0
fórmula heteroariloxilo seleccionado a e X é seleccionado e heterocicliloxilo. partir de: de Por alcoxilo, arilox exemplo, X pode ilo, ser u. fa) λ / -o-/ w (t>) fc) Y o / \ 1
% (©) 21 s; e. V / \ ÍO / s. J r* ) 1 í# 0 |-OCF2CF3 (h) ^—sch2ch3 (i) Ç ' y o—tf s v @ Ϊ V § i \ j l e
J (H)
I
% I m .
Noutras formas de realização, Y é seleccionado de, e. g. , hidrazida, hidrazina, tiosemicarbazida, semicarbazida e grupos amina.
Em algumas formas de realização, Z pode compreender, por exemplo, um grupo carbonilo, éter, éster ou um grupo amida. Em algumas formas de realização, Z pode ser, por exemplo, alquilo 22 interrompido por um ou mais heteroátomos, tal como um oligoetilenoglicol. Por exemplo, Z pode ser monoetilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, tetraetilenoglicol ou um oligoetilenoglicol maior.
Em algumas formas de realização, Z pode ser, por exemplo, alquilo substituído com oxo e interrompido por um ou mais heteroátomos, tal como um oligopéptido. Por exemplo, o oligopéptido pode compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais componentes aminoácidos. Os aminoácidos podem ser, por exemplo, α-aminoácidos, β-aminoácidos, γ-aminoácidos, δ-aminoácidos e ω-aminoácidos. Um aminoácido pode ter quiralidade R ou S em qualquer átomo quiral. Um aminoácido pode ser seleccionado de, e. g., alanina, β-alanina, ácido α-aminoadípico, ácido 2-aminobutanóico, ácido 4-aminobutanóico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 6-amino-hexanóico, ácido 2-amino-heptanodióico, ácido 7-amino-heptanóico , ácido 2-aminoisobutírico, ácido aminometilpirrole carboxílico, ácido 8-amino-3,6-dioxa-octanóico, ácido aminopiperidinocarboxílico, ácido 3-amino-propiónico, aminoserina, ácido aminotetra-hidropiran-4-carboxílico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido carboxílico de azetidina, benzotiazolilalanina, butilglicina, carnitina, 4-clorofenilalanina, citrulina, ciclo-hexilalanina, ciclo-hexilstatina, cisteína, ácido 2,4-diaminobutanóico, ácido 2,3-diaminopropiónico, di-hidroxifenilalanina, ácido dimetiltiazolidinacarboxílico, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, homoserina, hidroxiprolina, isoleucina, ácido isonipecótico, leucina, lisina, metanoprolina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, ácido p-aminobenzóico, penicilamina, fenilalanina, fenilglicina, piperidinilalanina, piperidinilglicina, prolina, pirrolidinilalanina, sarcosina, selenocisteína, serina, 23 estatina, tetra-hidropiranglicina, tienilalanina, treonina, triptofano, tirosina, valina, alo-isoleucina, alo-treonina, ácido 2,6-diamino-4-hexanóico, ácido 2,6-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, dicarboxidina, homoarginina, homocitrulina, homocisteina, homocistina, homofenilalanina, homoprolina e ácido 4-hidrazinobenzóico. P pode ser seleccionado de grupos de protecção amina conhecidos pelos especialistas na técnica. Em algumas formas de realização, P pode ser um grupo de protecção carbamato, tais como, e. g. , um grupo de protecção (9-fluorenilmetil)carbamato (Fmoc), (terc-butiloxi)carbamato (t-Boc), (tricloroetil)carbamato (Troe) ou alilearbamato (Alloc). Noutras formas de realização, P pode ser um grupo de protecção não carbamato, tal como, e. g., um grupo de protecção amida, tal como ftalimida ou um grupo de protecção trifluoroacetamida.
Em algumas formas de realização, o composto aminooxi de Fórmula II é seleccionado de compostos da Fórmula III:
y>T0nn'P
Fórmula III em que Y e P sao conforme divulgado acima e n é seleccionado de números inteiros que variam de 1 a 10.
Em determinadas formas de realização, n pode ser seleccionado de números inteiros compreendidos entre os seguintes intervalos: 1-4, 2-6, 2-8, 3-6, e 4-10. Em formas de realização ilustrativas, n é 1. 24
Numa forma d© uealizaçao ίlustratίvã, o composto aminooxi © éster tetrafluorofenilo do ácido t-Boc-aminooxiacético, a estrutura do qual é apresentada abaixo.
F I J .¾
Numa outra forma de realização ilustrativa, o composto aminooxi tem a estrutura representada abaixo. "N»-'
H
θ' N
C. Métodos de Preparação de um Oligossacárido Compreendendo um grupo Aminooxi
Noutra forma de realização, a divulgação proporciona um método de preparação de um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi a partir de um oligossacárido compreendendo um grupo reactivo. 0 método compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reactivo; (b) proporcionar um composto aminooxi compreendendo um segundo grupo reactivo; e (c) fazer reagir o primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, 25 preparando assim o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi. 0 oligossacárido compreendendo um primeiro composto reactivo pode ser, e. g., qualquer oligossacárido compreendendo um grupo reactivo, tal como descrito supra. Em formas de realização ilustrativas, o oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reactivo é um oligossacárido de fórmula Ia ou um oligossacárido de fórmula Ib. 0 composto aminooxi compreendendo um segundo grupo reactivo pode ser qualquer composto compreendendo um grupo aminooxi reactivo, tal como descrito supra.
Os termos "primeiro grupo reactivo" e "segundo grupo reactivo", como aqui utilizado, não denotam qualquer sequência experimental particular. I. e., o passo (c) , a reacção do primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, pode ser efectuada por qualquer ordem de adição dos reagentes. Por exemplo, o oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reactivo pode ser adicionado ao composto aminooxi compreendendo o segundo grupo reactivo, ou vice-versa. Noutro exemplo, o oligossacárido e o composto aminooxi podem ser adicionados simultaneamente a um recipiente reaccional. 0 passo (c) pode ocorrer sob quaisquer condições apropriadas (e. g., solvente e temperatura), conhecidos pelos especialistas na técnica. Em determinadas formas de realização, um ou mais reagentes adicionais, tais como, e. g., reagentes de ligação e catalisadores, podem estar presentes durante o passo (c) . Um reagente de ligação, tal como é aqui utilizado, é um reagente 26 que pode ser utilizado para formar uma ligaçao covalente entre o primeiro grupo reactivo e o segundo grupo reactivo.
Em algumas formas de realização, tais como, e. g. , quando o primeiro ou o segundo grupo reactivo é um grupo carboxilo, as condições reaccionais podem compreender um reagente de ligação. Os reagentes de ligação podem ser seleccionados de, e. g., reagentes de ligação de fosfónio tais como, e. g., BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfónio), PyBOP® (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio) e PyBroP® (hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfónio) e a partir de reagentes de ligação aminio (urónio) , tais como, e. g., HBTU (hexaf luorof osf ato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio) , HATU (hexafluorofosfato de 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio), TBTU (tetrafluoroborato de 2-(lH-Benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio). Os reagentes de ligação também pode ser seleccionados de, e. g., reagentes de ligação carbodiimida, tais como, e. g., DIC (1,3-diisopropilcarbodiimida), CDI (1,1'carbonildiimidazole) e EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida). Por exemplo, em algumas formas de realização ilustrativas, o reagente de ligação é EDC. Em certas formas de realização, as condições de reacção compreendem um reagente de ligação e um catalisador.
As condições reaccionais podem, em determinadas formas de realização, compreender um catalisador. 0 catalisador pode ser seleccionado de qualquer catalisador adequado, conhecido pelos especialistas na técnica, tais como, e. g., DHBt-OH(3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona), HOBt (N-hidroxibenzotriazole), DMAP (4-dimetilaminopiridina), NHS (N-hidroxissucinimida), N-hidroxissulfossucinimida, HONB (N-hidroxi-5-norborneno-endo-2,3- 27 dicarboximida) ou um sal de tetrabutilamónio, tal como, e. g., TBAI (iodeto de tetrabutilamónio). Em algumas formas de realização ilustrativas, as condições reaccionais compreendem o catalisador de DHBt-OH ou o catalisador NHS.
Em algumas formas de realização, o passo (c) , a reacção do primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi resulta na formação de uma ligação amida. As condições adequadas para a formação de uma ligação amida são bem conhecidas pelos especialistas na técnica e são descritos em, e. g., Chen et al., eds, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press: Nova Iorque, 2000; Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag: Nova Iorque, 1993; Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Syntesis of Peptids and Proteins, CRC Press:. Boca Raton, FL, 1997; e o Catálogo Novabiochem® (San Diego, CA).
Em determinadas formas de realização, o composto aminooxi compreende um grupo de protecção amino e o método compreende um passo adicional (d) desprotecção do oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi para remover o grupo de protecção amino. A desprotecção pode ocorrer através de quaisquer condições adequadas conhecidas pelos especialistas na técnica, tais como, e. g., os descritos nas páginas 494-653 de Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley and Sons: Nova Iorque, 1999 e Kocienski, Protecting Groups, 3a ed., Georg Thieme Verlag: Estugarda, Alemanha, 2005, as invenções das quais são aqui incorporadas por referência.
Uma forma de realização ilustrativa do método da divulgação proporciona um método de preparação de um oligossacárido 28 contendo M6P, compreendendo um grupo aminooxi. 0 método compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reaccional, em que o oligossacárido é
(b) proporcionar um composto aminooxi compreendendo um segundo grupo reactivo, em que o composto aminooxi é seleccionado de compostos de Fórmula III:
H
Fórmula III em que n é seleccionado de números inteiros que variam de 1 a 10, P é seleccionado de grupos de protecção amino e Y é um segundo grupo reactivo; e 29 (c) fazer reagir o primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, preparando assim o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi.
Em determinadas formas de realizaçao, Y na fórmula III é % em que heteroariloxilo X é seleccionado de hidroxilo, ariloxilo, e heterocicliloxilo. Por exemplo, em / determinadas formas de realização ilustrativas, X é
Nas formas de realização ilustrativas, o composto aminooxi é
Y 6
Em determinadas formas de realização, o primeiro grupo reactivo do oligossacárido pode ser feito reagir com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, na presença de um agente de ligação, tal como, e. g., EDC, e/ou um catalisador, tal como, e. g., DHBt-OH.
Outra forma de realizaçao ilustrativa do método da divulgação compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um primeiro grupo reactivo, em que o oligossacárido é 30
(b) proporcionar um composto aminooxi compreendendo um segundo grupo reactivo, em que o composto aminooxi é seleccionado dos compostos de Fórmula
Fórmula III em que n é seleccionado de números inteiros que variam de 1 a 10, P é seleccionado de grupos de protecção amino, e Y é um segundo grupo reactivo; e (c) fazer reagir o primeiro grupo reactivo do oligossacárido com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, preparando assim o oligossacárido compreendendo um grupo aminoxi. 31
Em determinadas formas de realização, Y na Fórmula III é uma hidrazina, hidrazida, aminooxi, tiosemicarbazida, semicarbazida ou grupo amina. Em certas formas de realização, Y na Fórmula III
Nas formas de realizaçao ilustrativas, o composto aminooxi é
F
Em determinadas formas de realização, o primeiro grupo reactivo do oligossacárido pode ser feito reagir com o segundo grupo reactivo do composto aminooxi, na presença de um agente de ligação, tal como, e. g., EDC, e/ou um catalisador, tal como, e. g., NHS . II. Oligossacáridos Compreendendo um Grupo Aminooxi A presente divulgação também proporciona oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi. Em algumas formas de realização, a divulgação proporciona oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi preparado pelos métodos divulgados acima. 0 oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi pode compreender, por exemplo, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais monossacáridos, incluindo, e. g., pelo menos, uma galactose, GalNAc, manose, M6P, glucose, GIcNAc, ácido siálico, ou resíduo de ácido siálico sulfatado. Tal oligossacárido pode ser mono-, bi-, tri-, tetra- ou penta-antenal em estrutura, e pode conter 0, 1, 2, 3, 4 ou mais pontos de ramificação. 32
Em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona um oligossacárido compreendendo (1) um grupo aminooxi e (2) manose-6-fosfato. 0 oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi pode, em algumas formas de realização, compreender, e. g. , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de M6P. Em algumas formas de realização, o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi pode compreender, pelo menos, 1, 2, 3, 4 ou mais resíduos de M6P penúltimos ou terminais.
Os oligossacáridos que compreendem um grupo de aminooxi são, em determinadas formas de realização da presente invenção, seleccionados de oligossacáridos de Fórmula IV:
Fórmula IV em que m e p são, independentemente, seleccionados de números inteiros que variam de 1 a 10. Por exemplo, em determinadas formas de realização, m e p podem ser seleccionados independentemente de números inteiros seleccionados dos 33 seguintes intervalos: 1-4, 2-6, 2-8, 3-6 e 4-10. Em formas de realização ilustrativas, m é 3 e p é 1.
Noutras formas de realização, o grupo aminooxi está directamente ligado à extremidade redutora do oligossacárido. Por exemplo, em algumas formas de realização da presente invenção, o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi pode ser um oligossacárido de Fórmula V:
,,ΗΟ 6sR
Fórmula V 34 III. Conjugação de um Oligossacárido Compreendendo vim Grupo Aminooxi Com uma Proteína A. Oligossacárido 0 oligossacárido para ser conjugado com uma proteína pode ser seleccionado de qualquer oligossacárido compreendendo um grupo reactivo, como discutido supra, e a partir de qualquer oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi, como discutido supra. Por exemplo, em algumas formas de realização, o oligossacárido a ser conjugado pode ser um oligossacárido de Fórmula Ia, Fórmula Ib, Fórmula IV ou Fórmula V. B. Proteína
Os métodos de conjugação aqui descritos são amplamente aplicáveis a qualquer proteína pura, proteína parcialmente purificada ou seu fragmento, tendo, pelo menos, um grupo carbonilo (em que um grupo carbonilo é uma cetona ou um aldeído), incluindo proteínas isoladas e proteínas produzidas recombinante ou sinteticamente. Os termos "puro", "purificado" e "isolado", referem-se a uma molécula que é substancialmente isenta do seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína pura é substancialmente isenta de material celular e/ou de outras proteínas a partir da célula ou fonte de tecido a partir da qual deriva. 0 termo refere-se a preparações que são, por exemplo, pelo menos, 70% a 80%, 80% a 90%, 90 a 95%, ou, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 % (p/p) puras.
Noutras formas de realização, a proteína pode ser uma enzima que tem uma actividade óptima, tal como medido por um ensaio de 35 actividade, a um pH variando de 1-7, tal como, e. g., 1-3, 2-5, 3-6, 4-5, 5-6 ou 4-6. Por exemplo, a enzima pode ter um pH óptimo a um pH variando entre 4-6.
Em algumas formas de realização, a proteína pode ser uma enzima que tem um ponto isoeléctrico (pi), variando de 1 a 8, tais como, e. g. , 1-3, 2-5, 3-8, 4-5, 5-6, 4-6, 5-8, 6-8 ou 7-8. 0 pi de uma proteína pode ser medido utilizando, e. g., electroforese em gel de focagem isoeléctrica.
Em algumas formas de realização, a proteína contendo um grupo carbonilo é obtida através da utilização de um sistema de expressão que tem um código genético expandido, como descrito, e. g., Wang et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:56-61 (2003). Em tal caso, o grupo carbonilo pode estar localizado na cadeia lateral do aminoácido, como traduzido.
Em determinadas formas de realização, a proteína que possui, pelo menos, um grupo carbonilo é uma proteína que possui, pelo menos, um oligossacárido (i. e., uma glicoproteína) . Por exemplo, uma glicoproteína que tem, pelo menos, um grupo carbonilo pode ser obtida por oxidação da glicoproteína através de quaisquer meios conhecidos pelos especialistas na técnica. Em algumas formas de realização, e. g., uma glicoproteína que tem, pelo menos, um grupo carbonilo, pode ser obtida por oxidação dessa glicoproteína com periodato (e. g., periodato de sódio) ou com galactose-oxidase. Em tal caso, o grupo carbonilo pode estar localizado num local de glicosilação de proteínas.
Em determinadas formas de realização, a proteína que possui pelo menos um grupo de carbonilo é uma glicoproteína, tal como uma glicoproteína terapêutica. Uma glicoproteína terapêutica 36 pode ser orientada para o lisossoma pela conjugação com um oligossacárido compreendendo de manose-6-fosfato. Por exemplo, a glicoproteína pode ser uma enzima lisossomal, incluindo uma enzima ERT. A enzima pode ser uma hidrolase lisossomal, incluindo aquelas listadas na Tabela 1. Em certas formas de realização, a hidrolase lisossomal é seleccionada de, e. g., a-glucosidase, α-galactosidase A e a esfingomielinase ácida. Em determinadas formas de realização, a hidrolase lisossomal é GAA.
Tabela 1: Exemplos de LSD e Hidrolases Lisossomais
Correspondentes
Distúrbio De Armazenamento Lisossomal Enzima Defeituosa Fabry α-galactosidase A Farber Ácido ceramidase Fucosidode Ácido α-L-fucosidase Gaucher tipo 1, 2 e 3 Ácido β-glucosidase Gangliosidose GMi Ácido β-glucosidase Hunter (Mucopolissacáridose (MPSII)) Iduronato-2-sulfatase Hunter-Scheie, Hurler, Scheie (MPSI) a-L-Iduronidase Krabbe Galactocerebrosidase a-Manosidose Ácido a-manosidase β-Manosidose Ácido β-manosidase Maroteaux-Lamy (MPS VI) Arilsulfatase B 37 (Continuação)
Distúrbio De Armazenamento Lisossomal Enzima Defeituosa Leucodistrofia metacromática Arilsulfatase A Morquio A (MPS IV) N-Acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase Morquio B (MPS IV) Ácido β-glucosidase Niemann-Pick A e B Esfingomielinase ácida (ASM) Pompe Ácido a-glucosidase (α-glucosidase; GAA) Sandhoff β-Hexosaminidase B Sanfilippo A (MPS III) Heparano IV-sulfatase Sanfilippo B (MPS III) α-iV-Acet ilglucosaminidase Sanfilippo C (MPS III) Acetil-CoA:α-glucosaminida N-acetiltransferase Sanfilippo D (MPS III) N-Acetilglucosamina-6-sulfato sulfatase Schindler-Kanzaki a-iV-acetilgalactosaminidase Sialidose Sialidase Sly (MPS VII) β-Glucuronidase Tay-Sachs β-Hexosaminidase A
Em determinadas formas de realização, a glicoproteína pode ser uma glicoproteína que tem, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácidos glicosilados ligados a N ou ligados a 0. Noutras formas de realização, a proteína pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou mais sítios de consenso para glicosilação ligados a íí ou ligados a 0, pelo menos um dos quais é glicosilado. 38
Em determinadas formas de realização, a proteína pode ser um ligando para um receptor. Por exemplo, em algumas formas de realização a proteína pode ser uma glicoproteína que se liga a um receptor que reconhece um açúcar, tal como, e. g. , manose ou manose-6-fosfato. Em algumas formas de realização, a glicoproteína pode ligar-se ao, e. g. , receptor de asialoglicoproteína, receptor manose-6-fosfato dependente de catião, o factor de crescimento semelhante à insulina II/receptor de manose-6-fosfato independente de catião ou o receptor de manose de macrófagos .
Em determinadas formas de realização, a proteína é uma glicoproteína que, quando conjugada com um oligossacárido compreendendo manose-6-fosfato, é internalizada mais eficientemente por uma célula alvo (e. g., através de endocitose mediada por CI-MPR), do que é a glicoproteína não conjugada correspondente. Por exemplo, a glicoproteína conjugada pode ser internalizada de forma mais eficiente do que a glicoproteína não conjugada em, e. g., pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% (p/p) , durante um determinado período de tempo. Noutras formas de realização, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes (p/p) mais da glicoproteína conjugada, pode ser internalizada, em relação à glicoproteína não conjugada, num determinado período. 0 período de referência pode ser, por exemplo, 10, 30, 45 minutos ou 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24, 48 ou 72 horas, ou mais. 39 C. Métodos de Ligação de um Oligossacárido a uma Proteína A divulgação proporciona métodos de ligação de um oligossacárido a uma proteína, tal como, e. g., uma glicoproteína. Numa forma de realização, o método compreende: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma proteína com, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com o, pelo menos, um grupo carbonilo da proteína, ligando assim o oligossacárido à proteína.
Em determinadas formas de realização, os métodos compreendem ainda a adição de um agente redutor à enzima lisossomal ligada. 0 agente redutor pode ser qualquer agente redutor conhecido pelos especialistas na técnica, tal como, e. g., cianoboro-hidreto de sódio ou triacetoxiboro-hidreto de sódio (STAB). IV. Conjugados de Oligossacárido-Proteína A divulgação proporciona ainda um conjugado de oligossacárido-proteína, compreendendo (1) uma proteína, (2) um oligossacárido e (3) um grupo oxima ligando a proteína e o oligossacárido. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona um conjugado de oligossacárido-proteína preparado pelos métodos descritos acima. Os oligossacáridos e componentes 40 proteicos do conjugado podem ser, por exemplo, qualquer oligossacárido e proteína aqui descritos, em que um seu conjugado compreende um grupo oxima, como descrito abaixo. (0 grupo oxima representado abaixo é formalmente derivado por reacção de um grupo aminooxi e um grupo aldeído; grupos oxima formalmente derivados por reacção de um grupo aminooxi e um grupo cetona são também englobados por esta invenção.)
Em certas formas de realização, o conjugado de oligossacárido-proteína é um conjugado de oligossacárido-glicoproteína. Em determinadas formas de realização, o conjugado de oligossacárido-proteína é o conjugado de um oligossacárido compreendendo, pelo menos, um M6P e uma hidrolase lisossomal. V. Composições Farmacêuticas
Esta divulgação proporciona a utilização de um conjugado da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal. Também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um conjugado de oligossacárido-proteína da invenção. Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas da divulgação compreendem um conjugado de um oligossacárido compreendendo, pelo menos, um M6P e uma enzima lisossomal. 41
As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um ou mais excipientes farmacêuticos adequados. Técnicas de formulação farmacêutica padrão e excipientes são bem conhecidos pelos especialistas na técnica (ver, e. g., 2005 Physicians'
Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004;
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennado. et al. , Eds, Lippincott Williams & Wilkins: Filadélfia, PA, 2000. As composições podem ou não conter conservantes. Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas compreendendo conjugados de α-galactosidase A, podem compreender um ou mais excipientes, tais como, e. g., manitol, fosfato de sódio monobásico mono-hidratado e/ou fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado. Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas compreendendo conjugados de α-glicosidase podem compreender um ou mais excipientes, tais como, e. g., manitol, polissorbato 80, fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado e fosfato de sódio monossódico mono-hidratado. A composição farmacêutica pode compreender qualquer um dos conjugados aqui descritos, como o único composto activo ou em combinação com outro composto, composição ou material biológico. Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender também uma ou mais moléculas pequenas, úteis para o tratamento de um LSD e/ou um efeito secundário associado com a LSD. Em algumas formas de realização, a composição pode compreender miglustat e/ou um ou mais compostos descritos em, e. g., Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244; 2005/0267094. A formulação das composições farmacêuticas pode variar dependendo da via prevista de administração e outros parâmetros (ver, e. g., Rowe et al. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 42 4a ed., APhA Publications, 2003.) Em algumas formas de realização, a composição pode ser um bolo ou pó liofilizado estéril, não-pirogénico, branco ou quase branco, para ser administrado por injecção intravenosa após a reconstituição com Água Estéril para Injeção, USP. A administração de uma composição farmacêutica da invenção não está limitada a qualquer sistema de distribuição específico e pode incluir, sem limitação, parentérica (incluindo subcutânea, intravenosa, intracraniana, intramedular, intra-articular, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal), transdérmica ou oral (por exemplo em cápsulas, suspensões ou comprimidos). A administração a um indivíduo pode ocorrer numa dose única ou em administrações repetidas e, em qualquer de uma variedade de formas de sais fisiologicamente aceitáveis e/ou com um veículo farmacêutico aceitável e/ou aditivos, como parte de uma composição farmacêutica.
Os conjugados aqui descritos são administrados em quantidades terapeuticamente eficazes. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a idade do indivíduo, estado e sexo, bem como da gravidade da estado médico do indivíduo. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, se necessário, de acordo com os efeitos observados do tratamento. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro (i. e., culturas celulares) ou in vivo (i. e., modelos experimentais animais), e. g. , para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeut icamente eficaz em 50% da população) . A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico (ou razão terapêutica), e pode ser expressa como a razão de LD50/ED5o. 43
Os conjugados que exibem índices terapêuticos de, pelo menos, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 20 estão aqui descritos. Os conjugados que exibem um grande índice terapêutico são preferidos.
Os dados obtidos a partir de ensaios in vitro e estudos com animais, por exemplo, pode ser utilizado na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos reside, de um modo preferido, dentro de uma gama de concentrações de circulação que incluem o ED5o com baixa, pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer conjugado utilizado na presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentrações plasmática em circulação que inclua o IC5o (i. e., a concentração do conjugado de teste que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas), como determinado em experiências in vitro. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevado desempenho ou por um ensaio de actividade enzimática apropriado. Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorizados por um bioensaio adequado de pontos terminais.
Salvo indicação em contrário, os conjugados da invenção podem ser administrados a uma dose de cerca de 1 pg/kg a 500 mg/kg, dependendo da gravidade dos sintomas e da progressão da doença. Por exemplo, os compostos proteicos podem ser administrados por infusão intravenosa lenta em ambulatório, cada, e. g. , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias, ou por,
e. g., administração semanal, quinzenal, mensal ou bimestral. A 44 dose terapeuticamente eficaz apropriada de um composto é seleccionada por um médico assistente e irá variar, aproximadamente, de 1 pg/kg e 500 mg/kg, de 1 pg/kg a 10 mg/kg, de 1 pg/kg e 1 mg/kg, a partir de 10 pg/kg e 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 100 pg/kg, de 100 pg a 1 mg/kg, e de 500 pg/kg a 5 mg/kg.
Por exemplo, os conjugados de α-galactosidase A podem ser administrados por infusão intravenosa a uma dose de, e. g·, 1,0 mg/kg de peso corporal a cada duas semanas, com uma taxa de infusão, e. g ., inferior ou igual a 10 , 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 mg/hora). Noutro exemplo, os conjugados de a-glucosidase podem ser administrados via intravenosa, a uma dose de, e. g., 20 mg/kg ou 40 mg/kg, de duas em duas semanas, ao longo de cerca de aproximadamente, e. g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 horas. Em algumas formas de realização, a taxa de administração de a-glicosidase pode ser iniciada com, e. g., 1 mg/kg/h e em seguida aumentada, e. g., 2 mg/kg/h a cada 30 minutos, após o estabelecimento da tolerância do doente à taxa de perfusão, até um máximo de, e. g., 7 mg/kg/h. Além disso, os exemplos de dosagens especificas podem ser encontrados em Physicians’ Desk Reference®. VI. Métodos de Tratamento de Distúrbios de Armazenamento Lisossomal A divulgação proporciona métodos de tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomal, tais como, e. g., aqueles divulgados na Tabela 1. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona um conjugado da invenção para utilizar no 45 tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal, num indivíduo com essa necessidade. A divulgação proporciona ainda métodos de proteínas alvo para o lisossoma, pela conjugação com oligossacáridos compreendendo manose-6-fosfato.
Numa forma de realização, o método compreende a administração a um mamífero com um distúrbio de armazenamento lisossomal, um conjugado de oligossacárido-glicoproteína da invenção, numa quantidade terapeuticamente eficaz. 0 conjugado de oligossacárido-glicoproteína pode ser um conjugado de uma enzima lisossomal, tal como um enzima lisossomal listada na Tabela 1, com um oligossacárido compreendendo manose-6-fosfato. Numa forma de realização, o método compreende a administração a um indivíduo com essa necessidade, de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um dos conjugados aqui descritos.
Em determinadas formas de realização, os conjugados da invenção podem ser administrados com uma ou mais de outras terapias. A uma ou mais de outras terapias podem ser administradas concomitantemente com (incluindo a administração concomitante como uma formulação combinada) , antes ou depois da administração dos conjugados da invenção.
Em algumas formas de realização, um doente pode ser tratado (antes, depois ou durante o tratamento com um conjugado da invenção), com um antipirético, anti-histamínico e/ou imunossupressor. Em algumas formas de realização, um doente pode ser tratado com um antipirético, anti-histamínico e/ou imunossupressor, antes do tratamento, com um conjugado de oligossacárido-glicoproteína da invenção, de modo a diminuir ou prevenir reacções associadas à infusão. Por exemplo, os doentes 46 podem ser pré-tratados com um ou mais de acetaminof eno, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, metotrexato, micofenolato de mofetila, esteróides orais ou rapamicina.
Em algumas formas de realização, os doentes podem ser tratados com um ou mais de acetaminofeno, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, metotrexato, micofenolato de mofetila, esteróides orais ou rapamicina, ou cerca de, e. g., t = 0 (o tempo de administração do conjugado da invenção) e/ou t = 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 e 144 horas para, e. g., o primeiro 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais incidências de tratamento com um conjugado da invenção. Por exemplo, em algumas formas de realização, um doente com a doença de Fabry ou doença de Pompe podem ser tratados com metotrexato (e. g., com 0,1, 0,2, 0,3, 0, 4, 0,5, 0,6, 0,7, 0, 8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 , 80 mg/kg de metotrexato, ou mais), ou cerca de, e. g., t = 0, 24 e 48 horas para, e. g- , a primeira 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8 semanas de tratamento com um conjugado da invenção. Em algumas formas de realização, a tolerância imunológica para os conjugados da invenção podem ser induzidos num doente com um distúrbio de armazenamento lisossomal, tal como, e. g., mucopolissacaridose I, por tratamento com a ciclosporina A e azatioprina. Por exemplo, o doente pode ser tratado com ciclosporina A e azatioprina, tal como descrito em Kakkis et al., Proc. Natl. Acad. Sei EUA 101:829-834 (2004) .
Em algumas formas de realização, um doente pode ser tratado (antes, depois ou durante o tratamento com um conjugado da invenção) com, e. g., terapia de pequena molécula e/ou terapia génica, incluindo a terapia de pequena molécula ou terapia génica direccionada para o tratamento de um distúrbio de 47 armazenamento lisossomal. A terapia de pequena molécula pode compreender a administração de um ou mais compostos descritos em, e. g. , Publicação do Pedido de Patente U.S N° 2003/0050299, 2003/0153768, 2005/0222244; e 2005/0267094. A terapia genica pode ser realizada como descrito em, e. g., Patente U.S. N° 5952516, 6066626, 6071890 e 6287857 e Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2003/0087868. A expressão "tratamento", "método terapêutico" e seus cognatos referem-se tanto ao tratamento terapêutico e a medidas profiláticas/preventivas. Assim, pessoas que necessitam de tratamento, pode incluir indivíduos que já tenham um distúrbio de armazenamento lisossomal particular, bem como aqueles em risco para a doença (i. e., aqueles que são susceptíveis a adquirir o distúrbio ou determinados sintomas do distúrbio).
Um método terapêutico resulta na prevenção ou melhoria dos sintomas ou, de outra forma, do resultado biológico desejado, e podem ser avaliadas por meio de sinais clínicos melhorados ou de início tardio da doença, o aumento da actividade da enzima metabolicamente defeituosa e/ou a diminuição dos níveis de substrato acumulado da enzima metabolicamente defeituosa.
Os conjugados da presente invenção são úteis para tratar vários distúrbios de armazenamento lisossomal em humanos ou animais. Por exemplo, a administração dos conjugados pode ser utilizada para aumentar a actividade enzimática deficiente num doente, por exemplo, em, pelo menos, 10%. A actividade enzimática aumentada pode ser determinada por, e. g., uma redução dos sintomas clínicos, ou através de um ensaio clínico ou biológico adequado. 48
Os conjugados GAA podem ser administrados para o tratamento da doença de Pompe (também conhecida como deficiência na ácido α-glicosidase, deficiência na maltase ácida, doença de armazenamento de glicogénio tipo II, glicogenose II e deficiência lisossomal da α-glicosidase) . 0 aumento da actividade de GAA pode ser determinado por observação bioquímica (ver, e. g. , Zhu et ai., J. Biol Chem. 279: 50336-50341 (2004)) ou histológica da acumulação de glicogénio lisossomal reduzida em, e. g. , miócitos cardíacos, miócitos esqueléticos ou fibroblastos de pele. A actividade de GAA pode também ser ensaiada em, e. g. , uma amostra de biópsia de músculo, nos fibroblastos da pele em cultura, em linfócitos e em manchas de sangue seco. Os ensaios em mancha de sangue seco são descritos em, e. g. , Umpathysivam et ai., Clin. Chem. 47:1378-1383 (2001) e Li et ai. Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004). O tratamento da doença de Pompe também pode ser avaliado por, e. g., os níveis séricos de creatinina cinase, os ganhos em função motora (e. g., como avaliado pela Alberta Infant Motor Scale), alterações no índice de massa ventricular esquerda, medida pelo ecocardiograma e actividade eléctrica cardíaca, tal como medido por electrocardiograma. A administração de conjugados GAA pode resultar numa redução em um ou mais sintomas da doença de Pompe, como cardiomegalia, cardiomiopatia, sonolência durante o dia, dispneia exercional, défice de crescimento, dificuldades de alimentação, "moleza", anormalidades da marcha, dores de cabeça, hipotonia, organomegalias (e. g., alargamento do coração, língua, fígado), lordose, perda de equilíbrio, dor lombar, dor de cabeça matinal, fraqueza muscular, insuficiência respiratória, escápula alada, escoliose, redução dos reflexos profundos do tendão, apneia do sono, susceptibilidade a infecções respiratórias e vómito. 49
Num outro aspecto, os conjugados de α-galactosidase A com oligossacáridos compreendendo M6P são administrados para o tratamento da doença de Fabry. A doença de Fabry ou doença de Anderson-Fabry, é um distúrbio de armazenamento lisossomal raro ligado ao cromossoma X, marcado por uma deficiência na α-galactosidase A e que resulta na acumulação de globotriaosilceramida (GL3) e outros glicoesfingolipidos neutros nos lisossomas de tecidos viscerais e endoteliais, periteliais e células musculares. A acumulação dos glicoesfingolipidos neutros na vasculatura resulta em estreitamento e dilatação dos vasos sanguíneos e, em último grau, em isquemia e enfarte.
A administração de conjugados de α-galactosidase A pode resultar numa redução de um ou mais dos sintomas clínicos da doença de Fabry, incluindo, e. g.r acroparestesia, angina, angioceratoma, arritmia, ataxia da marcha, ardor e/ou dor de formigamento nas mãos e pés, cataratas, intolerância ao frio, distúrbios da condução, córnea em espiral, doença arterial coronária, demência, depressão, diarreia, câmaras cardíacas dilatadas, tonturas, cardiomegalia, cardiomiopatia, diplopia, disartria, fadiga, febre, com elevada taxa de sedimentação de eritrócitos, problemas de audição, doenças cardíacas, problemas da válvula cardíaca, intolerância ao calor, hemiataxia, hemiparesia, hipoidrose, transpiração prejudicada, enfarte, isquemia, dor nas articulações, doença renal, hipertrofia ventricular esquerda, anormalidades lenticulares, opacidade lenticular, lipidúria, fraqueza muscular, enfarte do miocárdio, náuseas, nistagmo, dor (e. g., dor intensa radiação em todo o corpo), polidipsia, proteinúria, dor pós-prandial, insuficiência renal, anormalidades da retina, zumbido nos ouvidos, dor de estômago, alterações na onda ST-T, acidente vascular cerebral, uremia, doença valvular, vertigens, vómitos e fraqueza. A 50 administração de conjugados de α-galactosidase A, pode resultar num aumento da actividade da α-galactosidase A actividade em, e. g. , plasma, lágrimas, leucócitos, tecidos de biópsias, ou fibroblastos da pele cultivados. A administração de conjugados de α-galactosidase A, pode também resultar numa verificação histológica de uma redução (e. g., de pelo menos 10%) ou a ausência de aumento de glóbulos lipídicos birrefringentes. Também pode resultar numa diminuição de glóbulos lipídicos no sedimento urinário, melhoria da função renal, como medido pelos níveis de creatinina no soro ou na eliminação da creatinina e proteinúria reduzida. A administração de conjugados de α-galactosidase A também pode resultar numa redução nas inclusões de GL3 no endotélio capilar do rim, coração e pele. Os ensaios adicionais para medir a eficácia do tratamento para a doença de Fabry podem ser encontrados em, e. g., MacDermott et al., J. Med. Chem. Genet. 38:750-760 (2001).
Ainda noutro aspecto, os conjugados de esfingomielinase ácida são administrados para o tratamento da doença de Niemann-Pick ou deficiência de esfingomielinase ácida. A administração de conjugados de esfingomielinase ácida pode resultar numa redução em um ou mais sintomas clínicos da doença de Niemann-Pick, incluindo, e. g., os níveis anormais de colesterol, níveis anormais de lípidos, ataxia, anormalidades no sangue, manchas vermelho cereja no olho, infecções pulmonares frequentes, crescimento retardado, hepatoesplenomegalia, baixo número de plaquetas, linfadenopatia, neuropatia periférica, problemas com a função pulmonar, falta de ar, alterações de pigmentação da pele ou xantomas. Em algumas formas de realização, os conjugados podem ser administrados por via intracraniana. 51
Uma forma de realização alternativa refere-se ao tratamento de mucopolissacaridose I (incluindo, e. g. , formas Hurler e Hurler-Scheie de MPS I) com conjugados compreendendo α-L-iduronidase. A administração de conjugados de α-L-iduronidase pode resultar numa redução num ou mais dos sintomas clínicos de MPS I, incluindo, e. g., regurgitação aórtica, estenose da aorta, síndrome do túnel cárpico, rinite crónica, perda de audição condutiva, obstipação, turvação da córnea, atraso no desenvolvimento, diarreia, distensão abdominal, cifose dorsolombar, deformidade gibbus das costas, hepatoesplenomegalia, hidrocefaleia, hérnia inguinal, cifose, atraso mental, regurgitação mitral, estenose mitral, cegueira noturna, glaucoma de ângulo aberto, função fraca da mão, artropatia progressiva e infecções respiratórias recorrentes, insuficiência respiratória, degeneração da retina, escoliose, perda auditiva neurossensorial, dores lombares graves, rinorreia, apneia do sono, compressão da medula espinhal, atrofia tenar, hérnia umbilical e complicações das vias aéreas superiores. 0 anterior e a seguinte descrição são apenas exemplificativas e explanatótias e não são restritivos da invenção, tal como reivindicado.
EXEMPLOS
Os exemplos 1-4 abaixo descrevem a via sintética representada na FIG. 1. Os compostos 1, 2, 3 e 4, como utilizado a seguir, têm as estruturas químicas representadas na FIG. 1. 52
Exemplo 1: Síntese do Oligossacárido 3
Foram dissolvidas 100 mg de oligossacárido 1 (PM = 1250; bisM6P-hidrazida, fornecido por Biomira Inc., Edmonton, Canadá), em 15 mL de DMS0/H20 (50:50, em volume), obtendo-se uma solução de 5,3 pmol/mL. Foram dissolvidas 100 mg de éster tetrafluorofenílico do ácido t-Boc-aminooxiacético 2 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, catálogo N° B3030) em 7,5 mL de DMSO. Foram depois misturados 15 mL da solução de oligossacárido com 7,5 mL da solução de 2 num frasco de vidro, de tal modo a gue a razão molar do composto 2:Composto 1 na solução resultante fosse de 4:1. Foram adicionados 744 pL de DHBt-OH (a partir de um stock de 32,06 mg/mL em DMSO) à mistura reaccional num frasco de vidro, de tal modo que a razão final de composto 2: DHBt-OH fosse de 1:0,5. A mistura foi agitada suavemente à temperatura ambiente (25 °C) , a 100 rpm, de um dia para o outro, durante cerca de 18 horas.
Na manhã seguinte, foram removidos 10 pL da mistura reaccional para análise Dionex, para confirmar a conclusão da reacção. Os resultados, representados na FIG. 2, indicaram 100% de conversão de 1 para 3.
Exemplo 2: Purificação do Oligossacárido 3 Método A. A mistura reaccional foi diluída com um volume igual de H20 e dialisada num tubo de diálise com corte de peso molecular de 1000 Dalton (Spectrapor Inc.), duas vezes contra 4 L de H20 em 4 °C durante, pelo menos, 3 horas cada. As amostras foram, em seguida, liofilizadas. 53 Método B. Uma coluna de cromatografia de permeação em gel Sephadex G-10 com um volume de leito de 225 mL foi empacotada e equilibrada com água desionizada. A mistura reaccional foi carregada na coluna, drenada por gravidade e, em seguida eluida com água desionizada a um caudal de 75 mL por hora. Foram recolhidas frações de 4,5 mL com um colector de fracção. As fracções 10-23, que continham o oligossacárido 3, foram recolhidas, combinadas e liofilizadas. As outras moléculas pequenas, incluindo t-Boc-AOAA, DHBt-OH e DMSO, eluiram nas fracções posteriores e foram descartadas.
Exemplo 3: Desprotecção do Oligossacárido 3 0 grupo t-Boc da amostra liofilizada foi desprotegido em 5 mL de de ácido trifluoroacético (TFA) a 50% em dicolormetano (DCM) num frasco de vidro durante 30 minutos, com agitação suave, a 100 RPM. O TFA/DCM foi em seguida removido por uma corrente de N2, numa capa química.
Exemplo 4: Purificação do Oligossacárido 4 Método A. Após a remoção do TFA/DCM, o resíduo foi dissolvido em 10 mL de tampão de acetato de sódio 0,5 M, pH 5 e transferido para tubo de diálise com um corte de peso molecular de 1000 Dalton. O frasco foi lavado com 4 mL do mesmo tampão, que foram depois transferidos para tubo de diálise. A amostra foi dialisada duas vezes contra 3 L de tampão de acetato de sódio 25 mM, pH 7, durante, pelo menos, 3 horas e, em seguida, transferidas para 4 L de gelo frio de H20 para a diálise de um 54 dia para o outro. A amostra foi recuperada a partir do tubo de diálise e liofilizada. Método B. Após a remoção do TFA/DCM, o resíduo foi dissolvido em 5 mL de tampão de acetato de sódio 0,5 M, pH 7,5, e carregado numa coluna de cromatografia de permeação gel Sephadex G-10, como no Exemplo 2, Método B. A mistura reaccional foi carregada na coluna, drenada por gravidade e, em seguida eluída com água desionizada a um caudal de 75 mL por hora. Foram recolhidas fracções de 4,5 mL com um colector de fracção. As fracções 10-23, que continham o oligossacárido purificado 4, foram recolhidas e liofilizadas. Foi obtido um rendimento de oligossacárido 4 mais elevado, após purificação, através do Método B do que através do Método A. O produto final obtido a partir de qualquer método B foi analisado através de cromatografia Dionex (FIG. 2C) , e a identidade do produto foi confirmada por espectrometria de massa (FIG. 3B) . Algumas impurezas estavam presentes no espectro da FIG. 2C e a FIG. 3B.
Exemplo 5: Ligação do Oligossacárido 4 a GAA
Oxidação de GAA. A GAA humana recombinante liofilizada (rhGAA) foi reconstituída em H20 e dialisada contra 4 L de tampão acetato 100 mM (pH 5,6), 4 vezes, para remover completamente o manitol. Após a diálise, a rhGAA foi oxidada com periodato de sódio 7,5 mM de stock 100 mM em tampão acetato 100 mM. Após 30 minutos a 4 °C, em gelo, foi adicionado glicerol e a amostra foi misturada em gelo durante 10 minutos para decompor o excesso de periodato de sódio. O material oxidado foi então dialisado 55 contra tampão aquoso (e. g., acetato de sódio 100 mM) , de um dia para o outro.
Ligação. Uma solução do oligossacárido 4 em tampão aquoso (e. g., acetato de sódio 100 mM, pH 5,6) foi misturada com GAA oxidada e incubou-se a 37 °C durante 4 horas para proporcionar o conjugado 5 oligossacárido-GAA. A mistura reaccional foi então diafiltrada contra tampão fosfato de sódio 25 mM, pH 6,25, para remover o glicano bisM6P não conjugado e, em seguida, ajustada com tampão de formulação de GAA (tampão de fosfato de sódio 25 mM, pH 6,25, manitol a 2%, Tween-80 a 0,005%).
Exemplo 6: Caracterização do Conjugado GAA
Detecção de M6P. A extensão da conjugação do oligossacárido foi medida por ensaio do conjugado 5 para ligação a uma coluna de receptor M6P à qual as glicoproteinas sem M6P não se ligam. Cinco microgramas de conjugado 5 foram carregadas numa coluna CI-MPR-Sefarose pré-equilibrada (a coluna foi preparada por ligação de CI-MPR isolado, a partir de soro de bovino fetal a Affigel-10), o qual foi, em seguida, lavado com tampão de ligação CI-MPR para fracções 11 x 2 mL e eluido com tampão de ligação CI-MPR contendo M6P 5 mM para fracções 7 x 2 mL. Foram recolhidas um total de 18 fracções e ensaiadas para a actividade enzimática.
Análise de Monossacárido. O conjugado 5 é tratado com ácido trifluoroacético 4 N para hidrolisar os oligossacáridos, seguido por cromatografia de permuta aniónica com pH elevado com detecção amperométrica pulsada (PAD) com um sistema de cromatografia liquida BioLC (Dionex). O teor em monossacárido é 56 extrapolado a partir de uma curva padrao do monossacárido utilizando padrões de monossacáridos pré-misturados (Dionex).
Actividade Específica. A actividade de GAA é medida utilizando um ensaio fluorométrico em microplacas de 96 poços pretas, utilizando o 4-metilumbeliferil-a-D-glucósido como substrato. As diluições do conjugado 5 são adicionadas em triplicado a uma placa de microtitulação. 0 4-metilumbeliferil-a-D-glucósido é adicionado a cada amostra. A placa de 96 poços foi incubada num incubador a 37 °C, durante 30 minutos. A libertação do produto foi detectada fluorimetricamente e comparada com curvas padrão geradas por medição da fluorescência de uma quantidade conhecida de um padrão. A reacção é parada pela adição de 125 pL de tampão glicina-carbonato 1,0 M, pH 10,5 a todos os poços. A actividade específica é definida como nmol de produto libertado/h/mg.
Internalização Pelos Mioblastos Bv L6. As células (ATCC 57 patentes, ou pedidos de patentes incorporadas por referência, contradizem a invenção contida na descrição, a descrição é destinada a substituir e/ou ter precedência sobre qualquer material contraditório.
Todos os números que expressam quantidades de ingredientes, as condições reaccionais, e assim por diante, utilizados na descrição e reivindicações são para ser entendidas como sendo modificados em todos os casos pela expressão "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados na descrição e nas reivindicações anexas são aproximações, que podem variar dependendo das propriedades desejadas pensadas para se obter pela presente invenção. No minimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deverá ser interpretado tendo em vista o número de algarismos significativos e abordagens de arredondamento comuns.
Lisboa, 17 de Junho de 2013 58

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado de oligossacárido-enzima lisossomal, compreendendo (1) uma enzima lisossomal, (2) um oligossacárido e (3) um grupo oxima ligando a enzima lisossomal e o oligossacárido, em que o oligossacárido é um oligossacárido de Fórmula VI:
    Fórmula VI
  2. 2. Conjugado de oligossacárido-proteina da reivindicação 1, em que a enzima lisossomal é a α-glucosidase ácida, α-glucosidase A, esfingomielinase ácida ou α-L-iduronidase.
  3. 3. Conjugado de oligossacárido-proteina da reivindicação 2, em que a enzima lisossomal é α-glucosidase ácida. 1
  4. 4. Composição farmacêutica compreendendo o conjugado de oligossacárido-enzima lisossomal da reivindicação 1 e um excipiente.
  5. 5. Conjugado da reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal num indivíduo com essa necessidade.
  6. 6. Utilização de um conjugado da reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio lisossomal.
  7. 7. Método de preparação de um conjugado da reivindicação 1, por ligação de um oligossacárido a uma enzima lisossomal, compreendendo: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma enzima lisossomal com, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com, pelo menos, um grupo carbonilo da enzima lisossomal, ligando assim o oligossacárido à enzima lisossomal, em que o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi é 2 •20jP0
  8. 8. Método de preparação de um conjugado da reivindicação 1, por ligação de um oligossacárido a uma enzima lisossomal, compreendendo: (a) proporcionar um oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi; (b) proporcionar uma enzima lisossomal com, pelo menos, um grupo carbonilo; e (c) fazer reagir o grupo aminooxi do oligossacárido com, pelo menos, um grupo carbonilo da enzima lisossomal, ligando assim o oligossacárido à enzima lisossomal, em que o oligossacárido compreendendo um grupo aminooxi é 3
  9. 9. Método da reivindicação 7, em que a enzima lisossomal glucosidase ácida, α-glucosidase A, esfingomielinase ou α-L-iduronidase.
  10. 10. Método da reivindicação 9, em que a enzima lisossomal glucosidase ácida.
  11. 11. Oligossacárido de Fórmula IV: é a-ácida é oí- 4
    em que m e p são independentemente seleccionados de números inteiros que variam de 1 a 10.
  12. 12 . Oligossacárido da reivindicação 11,
  13. 13 . Oligossacárido da reivindicação 11,
  14. 14 . Oligossacárido da reivindicação 11,
  15. 15. Oligossacárido de Fórmula V: em que m é em que p é em que m é 3 . 1. 3 e p é 1. 5
    Fórmula V Lisboa, 17 de Junho de 2013 6
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