JP2016514096A - ポンぺ病の処置のための方法および組成物 - Google Patents

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ダスティン ディー． アームストロング，
ダスティン ディー． アームストロング，
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バレリオン セラピューティクス， エルエルシー
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Abstract

成熟酸性α−グルコシダーゼ（ｍａｔｕｒｅ ａｃｉｄ−ａｌｐｈａ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）（ＧＡＡ）ポリペプチドと内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを本明細書において提供する。本出願の例示的内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）により細胞膜を透過してＤＮＡと結合することが可能である３Ｅ１０抗体である。ポンペ病を処置するための、細胞内の酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を増加させるための、および細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を減少させるための方法および前記キメラポリペプチドの使用をさらに提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１３年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７６７，０１６号および２０１４年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９２６，８７４号の優先権の利益を主張する。上記出願の各々の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、前記配列表はその全体が参照により本明細書に援用されている。２０１４年２月２０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーの名は１０６１９９−０００７−ＷＯ１．ｔｘｔであり、サイズは８０，７６７バイトである。
糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩまたはポンペ病）は、リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠乏を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。この障害に罹患している患者は、グリコーゲンのリソソーム貯蔵をグルコースに変換することができず、その結果、最初はリソソームにグリコーゲンが蓄積することになり、そして後に細胞の細胞質および自己貪食小胞にグリコーゲンが蓄積することになる。最終的には、毒性レベルのグリコーゲンの集積が細胞を損傷させ、適正な機能を損なわせる。特に、筋肉細胞機能不全はポンペ病の顕著な特徴であり、乳児期発症型の当該疾患での肥大性心筋症、衰弱、骨格筋機能不全および早期乳児死亡から、若年および成人発症型の当該疾患での骨格筋機能の進行性衰退および呼吸筋機能不全にわたる症状を伴う。
酵素補充療法（ＥＲＴ）でのポンペ病の処置は、一部の患者では筋肉機能の部分的回復および生存期間の延長をもたらした。しかし、１１０ｋＤａ前駆体ＧＡＡタンパク質の送達に基づく以前の治療は、リソソームへのタンパク質送達しか達成しなかった。専らリソソームへのタンパク質の送達は、細胞質または他のリソソーム外空間へのグリコーゲン集積のクリアランスには効果がないと判明した。加えて、リソソームへのタンパク質の送達に基づくアプローチは、リソソーム中のマンノース−６−リン酸受容体による取り込みに依存しており、高い投薬量を要するようである。
ポンペ病の患者における細胞質グリコーゲン集積を排除するための方法および組成物が当該技術分野において必要とされており、ポンペ病を処置するための代替療法も必要とされている。かかる方法および組成物は、ポンペ病の処置、特に、顕著な細胞質グリコーゲン蓄積を有するほどに疾患が重篤である、および／または進行している患者におけるポンペ病の処置を改善することになる。本開示は、かかる方法および組成物を提供する。ある一定の実施形態において、本明細書において提供する方法および組成物は、少なくとも細胞質の、グリコーゲン集積を減少させる。ある一定の実施形態において、前記方法および組成物は、リソソームおよび自己貪食小胞へのグリコーゲン集積も減少させる。同様に、本明細書に提供した前記方法および組成物は、ポンペ病の有害症状を改善するために、例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼのうちの１つ以上のレベルを低下させるために（例えば、１つ以上のかかる酵素の異常に上昇したレベル、例えば血清中レベル、を低下させるために）使用することができる。
第一の態様において、本開示は、（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞への送達を促進する内在化モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）とを含むキメラポリペプチドを提供する。言い換えると、本開示は、２つの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）、すなわち、成熟ＧＡＡポリペプチドを含む部分（成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド；成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ部分）および細胞への送達を促進する内在化モイエティを含む部分、を有するキメラポリペプチドを提供する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、細胞の細胞質への輸送を促進する。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、かつ約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、詳細には、シグナルペプチダーゼおよびプロテアーゼ１による配列番号１のアミノ酸１−５６の切断により内因的に生成される１１０キロダルトンの前駆体ポリペプチドを含まない。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドのシグナル配列を含まない（例えば、配列番号１または２について描写されているシグナル配列を参照されたい）。言い換えると、前記キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡ部分および内在化モイエティ部分（ｍｏｉｅｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）を含むが、配列番号１のアミノ酸１−５６を含まない（例えば、前記ＧＡＡ部分は、ＧＡＡポリペプチドを含むが、配列番号１のアミノ酸１−５６を含まない）。前記キメラポリペプチドは、リンカーモイエティおよび／またはタグなどの追加の部分をさらに含んでもよいが、一定の実施形態では、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチド（例えば、Ｍｏｒｅｌａｎｄら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６７８０において定義されているようなＧＡＡ前駆体）および／または配列番号１もしくは２に記載の完全長ＧＡＡポリペプチドを含まない。
ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０ｋＤａまたは約７６ｋＤａの分子量を有する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、おおよそ、配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０６−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２８８−７８２から選択されるアミノ酸配列を含む。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、おおよそ以下の残基：配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０６−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２８８−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る。他の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基は、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、配列番号１または２に記載の残基８１６−８８１のいずれかであるように変動する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、上述のもののいずれかを含む。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドのＧＡＡポリペプチド部分は、成熟ＧＡＡの上述の例のいずれかから成る。前記キメラポリペプチドは、追加のアミノ酸配列を含むが、ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチド部分と連続する追加のＧＡＡアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡを含み、追加のＮおよびまたはＣ末端連続ＧＡＡポリペプチド配列、例えば、本明細書に記載される、より長い活性ＧＡＡポリペプチドも含む（例えば、前記ＧＡＡ部分は、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含む）。本明細書において用いる場合、「ＧＡＡポリペプチド」は、成熟ＧＡＡに対応する部分を含むが、ＧＡＡポリペプチド（例えば、ネイティブＧＡＡポリペプチド）中に天然に存在する追加のＮおよび／またはＣ末端部分も含むことがある、ポリペプチドを指す。ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドおよび方法において使用するためのＧＡＡポリペプチドは、配列番号１の残基１−５６を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、１１０キロダルトンの、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドに対応しない。
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、酸性α−グルコシダーゼ活性を有する。
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ翻訳産物を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ翻訳産物を含まない）。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−５６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−５６、好ましくは１−５７、に対応する部分を欠き、この領域は、そのキメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠くＧＡＡポリペプチドを含み、前記全リンカー領域（配列番号３１）は、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する（例えば、前記キメラポリペプチドは、前記全リンカー領域の一部を含むことはあるが、前記全リンカー領域のすべてを含まない）。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する部分を欠き、この領域は、そのキメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸６１−９５２を含む。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する部分を欠き、この領域は、そのキメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸６７−９５２を含む。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する部分を欠き、この領域は、そのキメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２３の配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７０−９５２を含む。本開示は、これらの特徴のいずれか１つ以上の組み合わせを企図している。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１１もしくは１２に記載の、または１つ以上のエピトープタグが不存在の状態の（例えば、Ｈｉｓおよび／またはＭｙｃエピトープタグが不存在の状態などの）これらの配列識別名のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドおよび／または前記成熟ＧＡＡは、グリコシル化される。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドおよび／または成熟ＧＡＡは、グリコシル化されない。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡは、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞、例えば骨格筋または心筋細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する（例えば、かかる細胞の細胞質への送達を促進する）。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ニューロンまたは肝細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する（例えば、かかる細胞の細胞質への送達を促進する）。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、Ｍ６Ｐ残基で修飾されたＮ結合型オリゴ糖鎖を含む。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＫＦＥＲＱ様配列（配列番号３３）を含む。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、生産または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含む。例示的ポリペプチド部分としては、エピトープタグ、例えば、ＨＡおよびｍｙｃタグ、ならびに免疫グロブリンのＦｃ領域、またはＨＳＡのすべてもしくは一部分も挙げられる。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体または抗原結合断片を含む。ある一定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体または断片である。ある一定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、ヒトのものであるか、ヒト化されたものである。他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、マウスのものである。例示的抗原結合断片としては、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂなどが挙げられる。さらなる例示的抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。適する内在化モイエティに言及する場合、それらは、キメラポリペプチドの環境の中にあるとき、好ましくは抗原／標的結合特性および細胞透過特性を保持する。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片を内在化モイエティとして含む。ある一定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそれらのヒト化変異体を含む。抗体または抗原結合断片のいずれの記載についても、本開示は、その抗体または抗原結合断片が、重鎖および軽鎖、例えば、重鎖可変ドメインを含む重鎖と、軽鎖可変ドメインを含む軽鎖とを含み得ることを企図している。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはカバット体系に準拠する。
一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する。
言い換えると、ある一定の実施形態において、前記抗体は、カバットにより決定された上述のとおりの３Ｅ１０抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖と、カバットにより決定された上述のとおりの３Ｅ１０抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤ２およびＶＬ ＣＤ３を含む軽鎖とを含むか、またはその抗原結合断片である。ある一定の実施形態において、前記抗体は、ＩＧＭＴ体系により決定された上述のとおりの３Ｅ１０抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖と、ＩＧＭＴ体系により決定された上述のとおりの３Ｅ１０抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤ２およびＶＬ ＣＤ３を含む軽鎖とを含むか、またはその抗原結合断片である。
ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖領域が、ある一定の実施形態では、リンカーによって接続されていることがあることは理解される（例えば、ｓｃＦｖの環境におけるものなど−配列番号１１および１２を参照されたい）。上述のまたは下記の内在化モイエティと成熟ＧＡＡ部分の任意の組み合わせを有するキメラポリペプチドを企図している。さらに、上述のまたは下記の内在化モイエティと本明細書に記載するＧＡＡ部分（例えば、ＧＡＡポリペプチド）の任意の組み合わせを有するキメラポリペプチドが企図される。いずれのかかるキメラポリペプチドも、本明細書に記載する本開示の任意の方法での使用に適している。
一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体または抗原結合断片（例えば、抗体断片）である。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体断片、特にｓｃＦｖである。他の実施形態において、前記抗体断片はＦａｂである。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端は、Ｆａｂの重鎖定常領域部分のＣ末端に融合している。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端は、Ｆａｂの重鎖定常領域部分のＣ末端にリンカーによって融合している。一部の実施形態において、前記リンカーは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、抗体である。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端は、前記抗体の重鎖Ｆｃ部分のＣ末端に融合している。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端は、前記抗体の重鎖Ｆｃ部分のＣ末端にリンカーによって融合している。一部の実施形態において、前記リンカーは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ホーミングペプチドを含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＥＮＴ２トランスポーターによって細胞膜を通過する。例として、３Ｅ１０抗体またはその抗原結合断片は、ＥＮＴ２によって細胞膜を通過する。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。例えば、３Ｅ１０および本明細書に記載する特定の３Ｅ１０変異体は、ＤＮＡと結合することが分かっている（例えば、それらの標的−すなわち抗原は、ＤＮＡである）。これらおよび他のＤＮＡ結合抗体は、典型的には単一抗原と特異的に反応しないが、それらは、比較的強い親和性でＤＮＡと結合する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。前述については、例えば、標準プロトコルに従ってＳＰＲまたはＱＣＭを用いて、ＫＤを決定してよい。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、前記内在化モイエティへの成熟ＧＡＡポリペプチドの化学的結合体、例えば、ＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含む化学的結合体である。言い換えると、前記成熟ＧＡＡ部分および前記内在化モイエティ部分は、化学的結合体化によって直接または間接的に相互接続されている。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、前記成熟ＧＡＡポリペプチドと前記内在化モイエティとを含む組換え共翻訳融合タンパク質である。前記キメラポリペプチドが融合タンパク質である場合、前記成熟ＧＡＡタンパク質と前記内在化モイエティ部分は、直接相互接続されていることもあり、または間接的に相互接続されていることもある。ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを組換え生産して、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに組換え結合体化させる。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、原核細胞または真核細胞、例えば酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞において生産される。ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドは、原核細胞、例えば細菌細胞において生産される。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体または抗体断片である。前記内在化モイエティが抗体または抗体断片である場合、前記ＧＡＡポリペプチドは、その抗体または抗体断片の任意の部分への融合体として生産されることがある。例えば、前記内在化モイエティが完全長抗体またはＦａｂである場合、前記ＧＡＡポリペプチドは、例えばその抗体またはＦａｂの重鎖のＣ末端に、組換え融合（または化学的に結合体化）されることがある。
化学的に結合体化されるにせよ、遺伝子結合体化されるにせよ、ある一定の実施形態において、その結合体は、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに、直接または間接的に、結合体化または連結させるリンカーを含む。ある一定の実施形態において、前記結合体はリンカーを含まず、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、前記内在化モイエティに直接結合体化または連結されている。リンカーが前記成熟ＧＡＡと前記内在化モイエティを連結させるかどうかにかかわらず、前記内在化モイエティの部分は、リンカーによって連結されることがある（例えば、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結させるリンカーを有する）。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、合計０、１または２個のリンカーを有する。他の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、２個より多くのリンカーを有する。いずれのリンカーも切断可能であってよい。本開示のキメラポリペプチドは、ＧＡＡ部分（例えば、ＧＡＡポリペプチド）および内在化モイエティ部分を含む。本開示は、任意のＧＡＡ部分（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド）および内在化モイエティ部分を上に記載したように連結させることができることを企図している。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、前記成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸に、または成熟ＧＡＡポリペプチドを含むより長いＧＡＡポリペプチドに、直接または間接的に、結合体化または連結されている。言い換えると、前記成熟ＧＡＡ部分と前記内在化部分が連続しているのか、または１つ以上のアミノ酸残基によって隔てられているのかにかかわらず、本開示は、前記成熟ＧＡＡ部分が前記内在化モイエティ部分のＮ末端側に位置する実施形態、および前記成熟ＧＡＡ部分が前記内在化モイエティ部分のＣ末端側に位置する実施形態を企図している。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの内部アミノ酸に結合体化または連結されている。
関連態様において、本開示は、本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを含む組成物を提供する。かかる組成物において使用するためのキメラポリペプチドは、上述の特徴の任意の組み合わせを有してよい。１つの実施形態において、本開示は、（ａ）（ｉ）約７６ｋＤａの分子量を有する成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む、第一のキメラポリペプチド；および（ｂ）（ｉ）約７０ｋＤａの分子量を有する成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む第二のキメラポリペプチドを含む組成物であって、前記第一のキメラポリペプチドおよび前記第二のキメラポリペプチド各々が、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記第一のキメラポリペプチドも、前記第二のキメラポリペプチドも、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、組成物を提供する。上記は、適する組成物の単なる例である。前記第一および第二のキメラポリペプチドについての内在化モイエティは、同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
ある一定の実施形態において、２つ以上のキメラポリペプチドの前記組成物は、約１１０ｋＤａの分子量を有する前駆体ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む。約１１０ｋＤａのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない本開示の１つ以上のキメラポリペプチドが、約１１０ｋＤａの分子量を有する前駆体ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドと併用される組成物も、企図される。
関連実施形態において、本開示は、（ａ）（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドおよび（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティを含み、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、かつ約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まないキメラポリペプチドと、（ｂ）約１１０ｋＤａの分子量を有する前駆体ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドとを含む組成物を提供する。上記は、適する組成物の単なる例である。
別の態様において、本開示は、本開示のキメラポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。例えば、本開示は、内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、成熟ＧＡＡポリペプチド（またはＧＡＡポリペプチド部分）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を有するとともに内在化モイエティの内在化活性を有するキメラポリペプチドをコードし、かつ約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードしない、または配列番号１の残基１−５６に対応する部分を含むポリペプチドをコードしない、核酸構築物を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、本開示の核酸構築物のいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、本開示は、本開示のベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記ベクターを含み、発現することが可能である。一部の実施形態において、本開示は、キメラポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現を起こさせる適切な条件下で本開示の宿主細胞のいずれかを培養するステップを含む方法を提供する。本開示は、キメラポリペプチドが単一ポリペプチド鎖を含む実施形態、ならびにキメラポリペプチドが１本より多くのポリペプチド鎖を含む実施形態も企図している。キメラポリペプチドが、会合している１本より多くのポリペプチド鎖をその活性ポリペプチド中に含む場合、本開示は、両方のポリペプチド鎖が同じベクターの中に存在し、同じベクターから発現される方法および組成物、ならびに各鎖が、同じ宿主細胞において共発現されることもある異なるベクターの中に存在し、前記異なるベクターから発現される方法および組成物も企図している。
別の態様において、本開示は、上述の態様および実施形態の任意の組み合わせを有する任意のキメラポリペプチドを含む、本開示のキメラポリペプチドのいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物を提供する。ある一定の実施形態において、前記組成物は、滅菌組成物である。ある一定の実施形態において、前記組成物は、実質的に発熱物質不含である。
別の態様において、本開示は、様々なインビトロおよびインビボ法を提供する。１つの態様において、本開示は、ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、有効量の本開示のキメラポリペプチドまたは組成物のいずれか１つ以上を前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本開示は、ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む有効量のキメラポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、そして前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、細胞の酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を増加させる方法であって、前記細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、そして前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、筋肉細胞の細胞質のグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への送達を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、そして前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、筋肉細胞の細胞質およびリソソームのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、そして前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、筋肉細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞のグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し、そして前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
以下の例示的実施形態は、本開示の上述の方法のいずれにも適用可能である。さらに本開示は、これらの特徴の互いの組み合わせ、ならびに上で詳述した本開示の態様および実施形態および本明細書全体を通して詳述する本開示の態様および実施形態との組み合わせも企図している。例えば、本明細書に記載するキメラポリペプチドのいずれか、例えば、本明細書に記載の成熟ＧＡＡポリペプチド（例えば、ＧＡＡポリペプチド）を含むＧＡＡポリペプチド部分と、本明細書に記載の内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドを、本開示の任意のインビボまたはインビトロ法において使用してよい。
ある一定の実施形態において、前記方法は、成熟ＧＡＡポリペプチドが約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、キメラポリペプチドの使用を含む。ある一定の実施形態において、前記方法は、成熟ＧＡＡポリペプチドが約７０キロダルトンまたは約７６ｋＤａの分子量を有する、キメラポリペプチドの使用を含む。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０ｋＤａまたは約７６ｋＤａの分子量を有する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０６−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２８８−７８２から選択されるアミノ酸配列を含む。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、残基：配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０６−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２８８−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る。他の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基は、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、配列番号１または２に記載の残基８１６−８８１のいずれかであるように変動する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
一部の実施形態において、前記方法は、酸性α−グルコシダーゼ活性を有するキメラポリペプチドの使用を含む。本開示は、本明細書に記載のＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含むキメラポリペプチド、および任意のかかるキメラポリペプチドを使用する方法を企図している。一部の実施形態において、前記方法は、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡポリペプチドを含まないキメラポリペプチドの使用を含む。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−５６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−５６、好ましくは１−５７に対応する部分を欠き、この領域は、前記キメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠くＧＡＡポリペプチドを含み、前記全リンカー領域は、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８（すなわち、配列番号３１）に対応する。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する部分を欠き、この領域は、前記キメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドにおいて使用するためのＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸６１−９５２を含む。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する部分を欠き、この領域は、前記キメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドにおいて使用するためのＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸６７−９５２を含む。一部の実施形態では、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する部分を欠き、この領域は、前記キメラポリペプチド中に存在しない）。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドは、配列番号２３の配列を含む。一部の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドにおいて使用するためのＧＡＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７０−９５２を含む。
ある一定の実施形態において、本開示は、配列番号２１、２２または２３に記載のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチド、およびかかるキメラポリペプチドを使用する方法を企図している。言い換えると、かかるキメラポリペプチドのＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２１、２２または２３に記載のアミノ酸配列を含む（またはそれから成る）。本開示のキメラポリペプチドにおいて使用するための変異体、例えば、配列番号２１、２２または２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の変異体も企図している。
ある一定の実施形態において、前記方法は、配列番号１１もしくは１２に記載のアミノ酸配列または１つ以上のエピトープタグが不存在の状態のこれらの配列識別名のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る、キメラポリペプチドの使用を含む。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドおよび／または前記成熟ＧＡＡは、グリコシル化される。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドおよび／または前記成熟ＧＡＡは、グリコシル化されない。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡは、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡは、ＫＦＥＲＱ様モチーフ（配列番号３３）を含む。
上述のもののいずれかについてのある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞、例えば、例えば骨格筋または心筋細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する（例えば、少なくとも筋肉細胞の細胞質への、送達を促進する）。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、肝細胞またはニューロンへの前記キメラポリペプチドの送達を促進する（例えば、少なくとも肝細胞またはニューロンの細胞質への、送達を促進する）。内在化モイエティを、筋肉細胞への送達を促進すると記載するとき、送達が専ら筋肉細胞へのものであることを含意しないことに留意すべきである。それが含意するのは、１つ以上の他の細胞タイプに対して筋肉細胞への送達が多少強化されること、および細胞への通過が全ての細胞タイプにわたって遍在的なものではないことだけである。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、Ｍ６Ｐ残基で修飾されたＮ結合型オリゴ糖鎖を含む。
ある一定の実施形態において、前記方法は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、生産または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含むキメラポリペプチドの使用を含む。例示的ポリペプチド部分としては、エピトープタグ、例えばＨＡおよびｍｙｃタグ、ならびに免疫グロブリンのＦｃ領域、またはＨＳＡのすべてもしくは一部分も挙げられる。
ある一定の実施形態において、前記方法は、抗体または抗原結合断片を含む内在化モイエティを含むキメラポリペプチドの使用を含む。ある一定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体または断片である。ある一定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、ヒトのものであるか、ヒト化されたものである。他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、マウスのものである。例示的抗原結合断片としては、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂなどが挙げられる。さらなる例示的抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。適する内在化モイエティに言及する場合、それらは、キメラポリペプチドの環境の中にあるとき、好ましくは抗原結合特性および細胞透過特性を保持する。一部の実施形態において、前記抗原または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂである。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、Ｆａｂの重鎖セグメントのＣ末端に融合している。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、Ｆａｂの重鎖セグメントのＣ末端にリンカーによって融合している。一部の実施形態において、前記リンカーは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、抗体である。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、前記抗体の重鎖部分のＣ末端に融合している。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、前記抗体の重鎖部分のＣ末端にリンカーによって融合している。一部の実施形態において、前記リンカーは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
ある一定の実施形態において、前記方法は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である抗体または抗原結合断片を含むキメラポリペプチドの使用を含む。ある一定の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを、またはそれらのヒト化変異体を含む。抗体または抗原結合断片のいずれの記載についても、本開示は、その抗体または抗原結合断片が、重鎖および軽鎖、例えば、重鎖可変ドメインを含む重鎖と、軽鎖可変ドメインを含む軽鎖とを含み得ることを企図している。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはカバットに準拠する。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する。
ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖領域が、ある一定の実施形態では、リンカーによって接続されていることがあることは理解される（例えば、ｓｃＦｖの環境におけるもの−配列番号１１および１２を参照されたい）。上述のまたは下記の内在化モイエティと成熟ＧＡＡ部分の任意の組み合わせを有するキメラポリペプチドが企図される。ある一定の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体、断片または変異体は、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および／または
配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはカバットに準拠する。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ホーミングペプチドを含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。
ある一定の実施形態において、処置を必要とする被験体は、１つ以上の以前の酵素補充療法に対して不応性であったポンペ病を有する被験体である。
ある一定の実施形態において、処置を必要とする被験体は、乳児ポンペ病のヒト患者である。ある一定の実施形態において、処置を必要とする被験体は、若年発症または成人発症ポンペ病のヒト患者である。ある一定の実施形態において、処置を必要とする被験体は、ヒト患者である。
ある一定の実施形態において、投与されたキメラポリペプチドは、細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食小胞のうちの１つ以上に輸送される。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドの投与は、細胞質グリコーゲン蓄積を低減させる。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドの投与は、リソソームグリコーゲン蓄積を低減させる。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドの投与は、自己貪食空胞グリコーゲン蓄積を低減させる。
ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、ポンペ病であると診断されたか、またはポンペ病を有すると予想される被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、１つ以上の以前の酵素補充療法に対して不応性であった疾患を有する被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する患者である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病であると診断された被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病であると診断された被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である。ある一定の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、病的細胞質グリコーゲン蓄積がまだ起こっていないポンペ病の被験体である。かかる場合、本開示のキメラポリペプチド（例えば、細胞質に送達することができるポリペプチド）の投与を用いて、病的細胞質グリコーゲン蓄積の発生を予防する。
ある一定の実施形態において、前記方法は、前記キメラポリペプチドの全身投与を含む。ある一定の実施形態において、前記方法は、前記キメラポリペプチドの静脈内投与を含む。
本開示は、任意の上述の態様および実施形態のすべての組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」で述べる任意の実施形態との組み合わせも企図している。例えば、成熟ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを有するキメラポリペプチドおよび組成物を含めて、任意の前記キメラポリペプチドおよび組成物を、本明細書に記載する任意の方法で使用することができる。さらに、本開示は、ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドが、成熟ＧＡＡを含む上に、追加の連続ＧＡＡ配列（例えば、前記ＧＡＡ部分は、成熟ＧＡＡ以上の大きさだが、配列番号１に記載の完全アミノ酸配列を含まない、および好ましくは配列番号１または２の残基１−５６または１−５７に対応する部分を含まないＧＡＡポリペプチドを含む）も含み得ることを企図している。
図１は、生成された２つの異なる融合構築物を模式的に描写している図である。図１Ａは、完全長ＧＡＡタンパク質およびその様々な領域、ならびにマウス重鎖および軽鎖を模式的に描写している図である。アミノ酸残基１−２８は、シグナル配列（「ＳｉｇＳｅｑ」）領域に対応し、アミノ酸２９−５６は、プレプロ領域に対応し、およびアミノ酸５７−７８は、全リンカー領域に対応する。配列番号１の中で残基１−５６を強調表示する。なぜなら、Ｍｏｒｅｌａｎｄらによると、これは、シグナルペプチダーゼおよびプロテアーゼによって切断されて約１１０キロダルトンの前駆体ＧＡＡポリペプチドを生じさせるＧＡＡ翻訳産物の部分であるからである。図１Ｂは、マウス３Ｅ１０ Ｆａｂ−ＧＡＡ融合構築物を模式的に描写している図であり、その一方で図１Ｃは、マウス３Ｅ１０ ｍＡｂ−ＧＡＡ融合構築物を模式的に描写している図である。
グリコーゲンは、人体の細胞へのグルコースの容易な貯蔵をもたらす複雑な多糖類である。グリコーゲンは、主として、肝臓（ここで、グリコーゲンが加水分解され、血流に放出されてグルコースを他の細胞に供給する）および筋肉（ここで、グリコーゲン加水分解の結果として得られたグルコースが筋肉細胞にエネルギーを供給する）において見出される。リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、グリコーゲン加水分解を媒介する酵素の１つである。
グリコーゲン加水分解の乱れ（典型的にはこのプロセスと関連づけられる遺伝子の遺伝子突然変異に起因する）は、糖原病につながり得る。多くの場合、その疾患症状の重症度は、その突然変異の程度と直接相関する。消耗性糖原病は、糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩまたはポンペ病）、すなわち、リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠乏を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。ＧＡＡの３００を超える変異体が公知であり、疾病表現型は、主として、残留酵素活性の量に依存する（Ｓｃｈｏｓｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ（ＧＳＤＩＩ）／Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５（４）：５６９−５７８、２００８）。ポンペ病の最重症の型は、初期診断が０〜７か月齢の間に起こる乳児発症型である。乳児発症ポンペ病は、肥大性心筋症および重度の全身衰弱を特徴とし、典型的には１歳までに死亡が生ずる。遅発性ポンペ病（若年および成人発症）のほうが、残留ＧＡＡ活性が存在するので、重症度が低い。症状は１歳を過ぎてまたは成人期に現れ、主として骨格筋および呼吸筋の機能不全が起こる（Ｃａｓｅ ａｎｄ Ｋｉｓｈｎａｎｉ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ８（５）：３１８−３２７、２００６）。若年および成人発症ポンペ病のほうが重症度が低いが、筋肉機能不全は、徐々に強まる顕著な身体障害をもたらす。場合によっては、患者は車椅子および／または人工呼吸器に依存するようになる。
すべてのポンペ病型において、ＧＡＡの機能不全は、リソソーム内のグリコーゲンの加水分解を損なわせ、毒性レベルのグリコーゲン蓄積を生じさせる（Ｇｅｅｌら、Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、９２：２９９−３０７、２００７）。最初に、罹患細胞内のリソソームのサイズおよび数が増加する。その後、それらのリソソームが破裂し、グリコーゲンを細胞質に漏出させる。筋線維の場合、グリコーゲン加水分解の欠如を伴う高いグリコーゲンレベルは、局所欠乏および自己貪食応答増加をもたらすことがある。しかし、自己貪食小胞は、リソソームと適正に融合することができない。加えて、細胞が水を取り込んで高いグリコーゲン濃度を中和し、その結果、細胞が膨張することになる。比較的短期間にわたって、グリコーゲンはリソソームばかりでなく細胞質にも蓄積する。
内因性ヒトＧＡＡは、長さ約２８ｋｂの遺伝子によってコードされた９５２アミノ酸タンパク質である。ヒトでは、３つの転写変異体が公知である（ＮＰ０００１４３．２をコードするＮＭ＿０００１５２．３；ＮＰ＿００１０７３２７１．１をコードするＮＭ＿００１０７９８０３．１；およびＮＰ＿００１０７３２７２．１をコードするＮＭ＿００１０７９８０４．１）。しかし、３つの転写変異体すべてが、実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。内因的に、ＧＡＡ遺伝子は、シグナル配列を含む９５２または９５７アミノ酸ポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、小胞体およびゴルジ体内でグリコシル化され、その結果、１１０ｋＤａの見かけの分子質量を有するグリコシル化前駆体となる。その未成熟前駆体上に７つの潜在的グリコシル化部位があり、それらは、配列番号１または２の残基１４０、２３３、３９０、４７０、６５２、８８２および９２５に位置する。前記未成熟前駆体は、マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）およびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）非依存経路によってリソソームに標的化される。その１１０ｋＤａ前駆体タンパク質は切断されて、約９５ｋＤａの分子量を有するエンドソーム中間形態のＧＡＡを産生する。その後のＮ末端およびＣ末端タンパク質分解的切断により、リソソーム内で、約７６ｋＤａおよび約７０ｋＤａの分子量を有する成熟、活性形態のＧＡＡが生じる（Ｍｏｒｅｌａｎｄら、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０（８）：６７８０−６７９１、２００５：これは、その全体が参照により援用されている）。切断部位の不均一性のため、代替開始残基および／または終了残基が、成熟ＧＡＡポリペプチド、例えば本請求項記載の開示における使用のための成熟ＧＡＡポリペプチドの、ＮおよびＣ末端境界を規定することもある。例えば、約７６ｋＤａの成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端残基は、ある一定の実施形態では、配列番号１または２の残基１２２（Ｍｅｔ）または１２３（Ｇｌｙ）に対応することがあり、その一方で約７０ｋＤａの成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端残基は、ある一定の実施形態では、配列番号１または２の残基２０４（Ａｌａ）、２０６（Ｓｅｒ）または２８８（Ｇｌｙ）のいずれかに対応することがある。前述のＮ末端残基のいずれかを有するポリペプチドは、例えば、配列番号１または２の残基８１６から８８１までのいずれかに対応するＣ末端残基を有することもあり、配列番号１または２の残基７８２であることもある。加えて、前記Ｃ末端残基は、両端の残基を含めて、残基７８２から８１６までのいずれか、または残基７８２から８８１までのいずれかであってよい。前記成熟ＧＡＡポリペプチドの分子量は、約７６ｋＤａもしくは約７０ｋＤａであってもよく、または上述の代替開始および／または終了ＮおよびＣ末端残基（例えば、代替切断に起因して産生される部分に対応するもの）に従って変動してもよい。
ＦＤＡは、ＣＨＯ細胞において生産された、ＧＡＡの１１０ｋＤａ前駆形態の組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）類似体である、アルグルコシダーゼアルファ（マイオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれるＧＡＡの１バージョンを認可した。マイオザイムは、エンドサイトーシス／リソソーム経路に標的化されると考えられており、リソソーム内でその効果を発揮すると考えられる。マイオザイムは、細胞質のグリコーゲン蓄積は処置しないようである（Ｓｃｈｏｓｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ（ＧＳＤＩＩ）／Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５（４）：５６９−５７８、２００８）。上で述べたように、この療法は、リソソームを標的にすると考えられており、未成熟前駆形態のタンパク質の送達に基づく。しかし、この前駆形態のタンパク質は、７６ｋＤａ成熟形態のＧＡＡより活性が低い（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７（１１）：１８１５−１８２４、１９９８）。したがって、ある一定の態様では、（ｉ）成熟形態のＧＡＡをキメラポリペプチドとして送達すること、（ｉｉ）成熟形態より長いが１１０ｋＤａ前駆形態より短いＧＡＡポリペプチドをキメラポリペプチドとして送達すること、および／または（ｉｉｉ）任意のサイズの活性を有するＧＡＡポリペプチドを、細胞へのおよびさらには適切な細胞内区画へのポリペプチドの送達を助長するための内在化モイエティに接続されたキメラポリペプチドとして送達することのいずれかが有益であり得る。理論により拘束されないが、たとえ本開示のポリペプチドが前駆体ＧＡＡポリペプチドと実質的に同じ活性を有しても、細胞質への送達を促進する内在化モイエティによって場合により助長される適正な細胞位置への送達は、細胞に送達される有効なＧＡＡ活性を増加させることになる。ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド（成熟ＧＡＡを含むＧＡＡ部分）と細胞への送達を助長する内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドを提供する。言い換えると、本開示は、ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを企図している。
１つの態様において、本開示は、罹患細胞、例えば骨格筋細胞への成熟ＧＡＡ分子の細胞質送達のための組成物および方法を提供する。ポンペ患者は、リソソームばかりでなく細胞質および自己貪食小胞のグリコーゲン集積を示す。リソソームまたはエンドサイトーシス小胞に標的化されるＧＡＡは、細胞質グリコーゲンを加水分解しないことがある。疾患が進行してしまった後に処置を始める患者（場合によっては、これは、ＧＡＡ機能不全になって６カ月後に処置を始める患者であることもある）については、リソソーム標的化形態のＧＡＡが細胞からグリコーゲンを有効に排除するには遅すぎることがある。対照的に、細胞質標的化成熟ＧＡＡは、細胞質からグリコーゲンを排除することができる。成熟ＧＡＡは未成熟ＧＡＡより活性であるばかりでなく、成熟ＧＡＡは、中性ｐＨでも活性のままであり、リソソームの酸性環境に比べて約４０％活性を中性ｐＨで示す（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１（１４）、２００２）。実際には、成熟ＧＡＡの活性は、酸性ｐＨでのその活性に比べて中性ｐＨでは低減されるが、この低減された活性でさえ−リソソームの内因性酸性環境下で評定したときでさえ−未成熟ＧＡＡのものより大きい。加えて、細胞質に送達される成熟ＧＡＡは、細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させることができるばかりでなく、かかるＧＡＡは、自己貪食小胞およびリソソームにも組み込まれることがある。理論により拘束されないが、最終的にリソソームと融合する自己貪食小胞は、リソソームへの細胞質ＧＡＡの送達を促進するのにも役立つメカニズムの１つであり得る。したがって、細胞質に送達される本開示のキメラポリペプチドは、少なくとも、細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させるのに有用であり、リソソームおよび自己貪食小胞へのグリコーゲン蓄積を減少させるのにも役立ち得る。
ある一定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを提供する。本開示のいずれのかかるキメラポリペプチドも、本明細書に記載する内在化モイエティ部分のいずれかと会合している本明細書に記載するＧＡＡポリペプチドのいずれかを含むことができ、これらのキメラポリペプチドを本開示の任意の方法で使用することができる。
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドを含み、ＧＡＡポリペプチドからの何らかの追加の連続アミノ酸配列も含有してよい（しかし、１１０ｋＤ前駆体ポリペプチド、または前記ＧＡＡ前駆体ポリペプチドのシグナル配列を含まない）。他の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むが、その成熟ＧＡＡポリペプチド以外にＧＡＡポリペプチドからの追加の連続アミノ酸配列を含まない。したがって、本開示は、ＧＡＡ部分が成熟ＧＡＡポリペプチドを含むまたはそれから成るキメラポリペプチドを企図している。７０〜７６ｋＤの分子量を有する例示的成熟ＧＡＡポリペプチドを本明細書に記載する。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、前記前駆体ＧＡＡポリペプチドのシグナル配列を含まない。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１または２の残基１−５６に対応する部分を含まない。
ある一定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを提供する。本開示のいずれのかかるキメラポリペプチドも、本明細書に記載する内在化モイエティ部分のいずれかと会合している本明細書に記載するＧＡＡポリペプチドのいずれかを含むことができ、これらのキメラポリペプチドを本開示の任意の方法で使用することができる。
ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２１を含み）、したがって、前記キメラポリペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列を有する成熟ＧＡＡを含む。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは−配列番号２１以外の−ヒトＧＡＡからの追加の連続アミノ酸配列を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、配列番号１の残基１−５６を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、配列番号１の残基１−６０を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２を含み）、したがって、前記キメラポリペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列を有する成熟ＧＡＡを含む。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは−配列番号２２以外の−ヒトＧＡＡからの追加の連続アミノ酸配列を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、配列番号１の残基１−６６を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み（例えば、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２３を含み）、したがって、前記キメラポリペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列を有する成熟ＧＡＡを含む。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは−配列番号２３以外の−ヒトＧＡＡからの追加の連続アミノ酸配列を含まない。ある一定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、配列番号１の残基１−６９を含まない。
したがって、ある一定の態様において、本開示は、ポンペ病に伴う症状を処置するために使用され得る成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを提供する。
ある一定の実施形態において、本開示は、（ｉ）成熟ＧＡＡポリペプチドと、（ｉｉ）細胞への、例えば細胞の細胞質への、送達を促進する内在化モイエティとを含む、キメラポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞、例えば骨格筋細胞への、前記キメラポリペプチドの標的送達に役立つ。
Ｉ．ＧＡＡポリペプチド
成熟ＧＡＡポリペプチドが、低ｐＨ（すなわち、リソソームまたは自己貪食空胞のｐＨ）条件においてであろうと、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）条件においてであろうと、完全長前駆体ＧＡＡと比較して向上されたグリコーゲンクリアランスを有することは立証されている（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、７（１１）：１８１５−２４）。加えて、成熟ＧＡＡは、より低いｐＨで最適な活性を有するリソソームタンパク質でありながら、成熟ＧＡＡは、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）で約４０％活性を保持する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔｏｕａｕｘら、２００２、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１１（１４）：１６３７−４５）。したがって、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドは、細胞質送達に適しており、それ故、ポンペ病の未対処問題点、すなわち細胞質グリコーゲン蓄積、に対処するのに適している。しかし、キメラポリペプチドのＧＡＡ部分が成熟ＨＡＡを含むのか、またはそれから成るのかにかかわらず、本開示の内在化モイエティと会合しているＧＡＡポリペプチドの提供は、細胞への送達およびある一定の実施形態では細胞質への送達を助長する。
本明細書において用いる場合、成熟ＧＡＡポリペプチドは、当該タンパク質の変異体、および特に、成熟、活性形態（活性約７６ｋＤａもしくは約７０ｋＤａ形態または代替開始残基および／もしくは終了残基を有する類似の形態、総称して「成熟ＧＡＡ」）を含む。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因的にプロセッシングされたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約７０ｋＤａから約７６ｋＤａの見かけの分子量を有する未成熟ＧＡＡタンパク質の部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の代替開始残基および／または終了残基を有する類似のポリペプチドも指す。一部の実施形態において、ＧＡＡポリペプチドは、シグナル配列（配列番号１もしくは２のアミノ酸１−２７、または配列番号１−５６のアミノ酸１−５６によって示される配列）を欠く。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２を有するポリペプチドが挙げられる。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因性成熟タンパク質と同じまたは実質的に同じ方法でグリコシル化される、およびそれ故、予測分子量と同じまたは同様である分子量を有する、ポリペプチドを含む。この用語は、グリコシル化されていないまたは過剰グリコシル化されているので同じ一次アミノ酸配列を含むにもかかわらず見かけの分子量が異なるポリペプチドも含む。成熟ＧＡＡポリペプチドのいずれのかかる変異体またはアイソフォーム、機能性断片または変異体、融合タンパク質および修飾形も、ネイティブ成熟ＧＡＡタンパク質と実質的配列同一性のアミノ酸配列の少なくとも一部分を有し、酵素活性を保持する。ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドの機能性断片、変異体または融合タンパク質は、配列番号３および４の一方または両方に記載の成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２；または配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２のうちの１つ以上に対応する成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、非ヒト種、例えば、マウス、ラット、イヌ、ゼブラフィッシュ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、サルまたは類人猿からのＧＡＡポリペプチドである。一部の実施形態において、前記ＧＡＡタンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する、完全長形態ではないが、成熟形態のウシＧＡＡタンパク質を含む。
ここでの、および本明細書中の他の箇所での、配列同一性は、候補配列を比較する対応配列の残基と同一である候補配列中の残基であって、配列全体について最大同一性パーセントを達成するために必要な場合には配列をアラインし、ギャップを導入した後の、そして一切の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない、残基の百分率を指す。ＮまたはＣ末端伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させるとみなさないものとする。
配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算のための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知であり、容易に利用できる。配列解析ソフトウェアを使用して配列同一性を測定してもよい。例えば、デフォルトパラメータに設定された、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムなどの、ＥｘＰａｓｙバイオインフォマティクスリソースポータルを通して利用できるアラインメントおよび解析ツール。ペアワイズまたはグローバルアラインメントに基づく適切な配列アラインメントおよび比較を容易に選択することができる。配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適しているアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。ある一定の実施形態では、特定のプログラムの今の最新のデフォルト設定を配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算に使用する。
ある一定の特定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチド、例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含む。前記成熟ＧＡＡは、約７６ｋＤａまたは約７０ｋＤａである内因性形態のヒトＧＡＡの活性と同様または実質的に等価である活性を有する。例えば、同じまたは同様の条件下で比較を行って、１１０ｋＤａ前駆形態より、前記成熟ＧＡＡ（例えば、酸性または中性ｐＨ条件下で内因性ヒト未成熟前駆体ＧＡＡと比較した、本明細書に開示する成熟ＧＡＡ−キメラポリペプチド）は、７〜１０倍、グリコーゲン加水分解についての活性が高いことがある。前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡの７６ｋＤａまたは７０ｋＤａ形態であってもよく、または代替開始残基および／または終了残基を使用する類似の形態であってもよい。Ｍｏｒｅｌａｎｄら（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０（８）：６７８０−６７９１、２００５）に述べられているように、ＧＡＡのプロセッシングされた形態について用いられる命名法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるような見かけの分子質量に基づく。一部の実施形態において、成熟ＧＡＡは、通常は小胞体内でグリコシル化されるＮ末端部位を欠くことがある。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号３または配列番号４を含む。さらなる例示的成熟ＧＡＡポリペプチドは、おおよそ：配列番号１もしくは２の残基１２２−７８２；配列番号１もしくは２の残基１２３−７８２、例えば配列番号３に示すもの；配列番号１もしくは２の残基２０４−７８２；配列番号１もしくは２の残基２０６−７８２；配列番号４に示すような配列番号１もしくは２の残基２８８−７８２に対応するアミノ酸配列を含むこと、またはそれから成ることがある。成熟ＧＡＡポリペプチドは、上に記載したＮ末端およびまたはＣ末端残基も有することもある。
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、完全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、成熟ＧＡＡポリペプチドと、完全長ＧＡＡポリペプチドの少なくとも一部分とを含む。言い換えると、ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む完全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列を含む成熟ＧＡＡポリペプチド配列、および配列番号１−２のアミノ酸１−１２１に対応するアミノ酸の少なくとも一部分、および／または配列番号１のアミノ酸７８３−９５２に対応するアミノ酸の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む完全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む成熟ＧＡＡポリペプチド配列、および配列番号１のアミノ酸７８３−９５２に対応するアミノ酸の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む完全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む成熟ＧＡＡポリペプチド配列、および配列番号２のアミノ酸７８３−９５７に対応するアミノ酸の少なくとも一部分を含む。これらは、ＧＡＡポリペプチドの例である。
ある一定の実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質のＧＡＡポリペプチド部分（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含む部分；例えば、ＧＡＡポリペプチド）は、成熟形態のＧＡＡを含むが、配列番号１に記載のＧＡＡ翻訳産物を含まない。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−２７または１−５６に対応する連続アミノ酸配列を含まない。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、前記全リンカー領域は、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８（すなわち、配列番号３１）に対応する。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６０、１−６１、１−６２、１−６３、１−６４、１−６５、１−６６、１−６７、１−６８、１−６９、１−７０、１−７１、１−７２、１−７３、１−７４、１−７５、１−８０、１−８５、１−９０、１−９５、１−１００、１−１０５、１−１１０、１−１１５、１−１２０または１−１２１に対応する連続アミノ酸配列を含まない。特定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分を含む）。他の実施形態において、前記ＧＡＡ部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含む）。一部の実施形態において、前記ＧＡＡ部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分を含む）。
他の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。グリコシル化されている成熟ＧＡＡポリペプチドについて、そのグリコシル化パターンは、天然に存在するヒトＧＡＡのものと同じであってもよく、または異なってもよい。最終成熟ＧＡＡ構築物において前駆体ＧＡＡタンパク質上のグリコシル化部位の１つ以上が除去されていてもよい。
成熟ＧＡＡは、ウシ精巣、ラット肝臓、ブタ肝臓、ヒト肝臓、ウサギ筋肉、ヒト心臓、ヒト尿、およびヒト胎盤などの組織から単離されている。組換え技術を用いて、例えば、完全長ヒトＧＡＡを発現するベクターまたは成熟ＧＡＡを発現するベクターでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトすることによって、成熟ＧＡＡを生産してもよい。その後、Ｍｏｒｅｌａｎｄら（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０（８）：６７８０−６７９１、２００５）によって記載されているように、一連の限外濾過、ダイアフィルトレーション、洗浄および溶離ステップを用いて、組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）または成熟ＧＡＡをＣＨＯ馴化培地から精製する。成熟ＧＡＡ画分を当該技術分野において公知の方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーおよびＳＤＳｐａｇｅに従って分離してもよい。
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡ、または断片もしくは変異体は、ヒト成熟ＧＡＡである。
ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え生産されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて、断片または変異体を化学合成することができる。断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、例えば、グリコーゲンを加水分解する、および／またはポンペ病の症状を処置するそれらの能力を試験することにより、ネイティブＧＡＡタンパク質として機能することができる断片または変異体を同定することができる。
ある一定の実施形態において、本開示は、治療もしくは予防有効度または安定性（例えば、エクスビボ保存可能期間、およびインビボでのタンパク質分解に対する耐性）を向上させることなどを目的として成熟ＧＡＡポリペプチドの構造を修飾することも企図している。かかる修飾成熟ＧＡＡポリペプチドは、天然に存在するＧＡＡポリペプチドの機能的等価物とみなされる。修飾ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によって生産することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、またはアミノ酸の構造的関連性のあるアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子のＧＡＡ生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないことを、例えば予想することは、理に適っている。保存的置換は、それらの側鎖において関連性のあるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。
本開示は、成熟ＧＡＡポリペプチドのコンビナトリアル突然変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｔａｎｔｓ）のセットの生成、ならびにトランケーション突然変異体の生成もさらに企図しており、機能性変異体配列の同定に特に有用である。天然に存在するＧＡＡポリペプチドに比べて選択的効力（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｃｙ）を有するコンビナトリアル誘導変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）を生成することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＧＡＡポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じさせることができる。例えば、ＧＡＡ機能の破壊または別様の不活性化をもたらすタンパク質分解または他の細胞プロセスに対して、変性タンパク質をより安定にまたはより不安定にさせることができる。かかる変異体を利用して、それらの半減期を調節することにより成熟ＧＡＡポリペプチドレベルを変えることができる。可能性のある成熟ＧＡＡ変異体配列のライブラリーを、例えば縮重オリゴヌクレオチド配列から、生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、その後、合成遺伝子を発現のために適切な遺伝子にライゲートすることができる。縮重遺伝子セットの目的は、可能性のあるポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列すべてを１つの混合物で提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ．２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化に活用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。
あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用してコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、成熟ＧＡＡポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いるスクリーニング（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）によって、リンカースキャニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）によって、飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）によって、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）によって、または化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）によって、ライブラリーから単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、トランケート（生物活性）形態の成熟ＧＡＡの魅力的な同定方法である。
点突然変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が当該技術分野において公知である。かかる技術は、一般に、成熟ＧＡＡポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応させることができるであろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられている技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングするステップ、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させるステップ、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを典型的に含む。下で説明する実例となるアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された多数の縮重配列をスクリーニングするために必要に応じて高スループット解析に適用できる。
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、ペプチドおよびペプチドミメティックを含むことがある。本明細書において用いる場合、用語「ペプチドミメティック」は、天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含有する化学修飾ペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチドミメティックは、被験体に投与されたとき、向上された安定性をはじめとするペプチドに対する様々な利点を提供する。ペプチドミメティックを同定するための方法は当該技術分野において周知であり、可能性のあるペプチドミメティックのライブラリーを収録しているデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、結晶構造が判っている３００，０００を超える化合物のコレクションを収録している（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ、３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造を入手できない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成することができる。もう１つのデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を収録しており、このデータベースを検索して、成熟ＧＡＡポリペプチドについての可能性のあるペプチドミメティックを同定することもできる。
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことがある。例示的翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、スモイル化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖のもしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾された成熟ＧＡＡポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートを含有することがある。成熟ＧＡＡポリペプチドの官能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響をその生物学的活性について、例えば、ポンペ病を処置するその能力について試験してもよい。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、および／または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含むことがある。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
本開示の１つの特定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、非タンパク質様ポリマーで修飾されていることがある。１つの特定の実施形態において、前記ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号明細書に示されているように、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、このポリマーは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３巻、１３８−１６１頁）。
用語「生物学的活性」、「生物活性」または「機能性の」は、野生型ＧＡＡタンパク質に随伴する機能、例えば、グリコーゲン、例えばリソソームグリコーゲンのα−１，４−およびα−１，６−グリコシド結合の加水分解を行う成熟ＧＡＡタンパク質の能力を意味する。用語「生物学的活性」、「生物活性」および「機能性の」を本明細書では交換可能に用いている。ある一定の実施形態において、および本明細書に記載するように、生物学的活性を有する成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、グリコーゲンを加水分解する能力がある。他の実施形態において、生物学的活性を有する成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、リソソームおよび／または細胞質グリコーゲンの濃度を低下させる能力がある。さらに他の実施形態において、成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、ポンペ病に伴う症状を処置する能力がある。本明細書において用いる場合、「断片」は、本明細書に記載するような「生物活性」を示す生物活性断片（機能性断片とも呼ばれる）または生物活性変異体を含むと解される。すなわち、成熟ＧＡＡの生物活性断片または変異体は、測定および試験することができる生物活性を示す。例えば、生物活性断片／機能性断片または変異体は、ネイティブ（すなわち、野生型、または正常な）ＧＡＡタンパク質と同じまたは実質的に同じ生物活性を呈示し、かかる生物活性は、例えばインビトロまたはインビボでグリコーゲンを加水分解する、その断片または変異体の能力によって評定することができる。本明細書において用いる場合、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。ある一定の実施形態において、「実質的に同じ」は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、ネイティブＧＡＡポリペプチドに随伴するＧＡＡ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を好ましくは保持することになる。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、そのネイティブタンパク質の半減期に比べて向上された半減期（ｔ１／２）を有する。好ましくは、成熟ＧＡＡ断片または変異体の半減期は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、ネイティブＧＡＡタンパク質の半減期に比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはさらには１０００％向上される。一部の実施形態では、前記タンパク質半減期をインビトロで、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中で判定する。他の実施形態において、前記タンパク質半減期は、インビボ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。加えて、断片または変異体を当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて化学合成することができる。前記断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、ネイティブＧＡＡタンパク質と同程度にまたは実質的に同様に機能することができる断片または変異体を同定することができる。
細胞におけるＧＡＡ生物活性を増加させる方法に関して、本開示は、任意の上述の態様および実施形態のすべての組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」で述べる任意の実施形態との組み合わせも企図している。キメラポリペプチドの投与または細胞とキメラポリペプチドの接触に基づく前記方法をインビトロで（例えば、細胞または培養で）行うことができ、またはインビボで（例えば、患者または動物モデルで）行うことができる。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビトロ法である。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビボ法である。
一部の態様において、本開示は、本明細書に記載の任意の上述のキメラポリペプチドの生産方法も提供する。さらに、本開示は、上述の方法および組成物の任意の数の組み合わせを企図している。
ある一定の態様において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、１つ以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であることもある。かかる融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス、例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂を使用する。融合ドメインは「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常、特異的抗体が利用可能である短鎖ペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知エピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。例示的Ｈｉｓタグは、配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）を有し、例示的ｃ−ｍｙｃタグは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）を有する。任意のかかるタグまたは融合体を前記キメラポリペプチドの成熟ＧＡＡ部分に追加してもよく、または前記キメラポリペプチドの内在化モイエティ部分に追加してもよく、または両方であってもよい。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、そのキメラポリペプチドのＮ末端に（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内に）「ＡＧＩＨ」部分（配列番号１９）を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するかまたは不存在の状態で提供してもよい。さらなる実施形態において、前記キメラポリペプチドは、そのポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、そのキメラポリペプチドのＮ末端に（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内に）「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２０）部分を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するかまたは不存在の状態で提供してもよい。
場合によっては、前記融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それによってそれらから組換えタンパク質を遊離させるプロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ切断部位を有する。その後、遊離されたタンパク質を後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、それらのポリペプチドを安定化することが可能である１つ以上の修飾を含むことがある。例えば、かかる修飾は、前記ポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、前記ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、または前記ポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。
一部の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であることもある。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５つのドメインを含む。これらのドメインは、次のように順次名づけられる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。前記重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラス間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同であり、かつＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同である。本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域の、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域の、またはその一部分の、カルボキシル末端部分を意味すると解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含むことがある。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、かつ好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。１つの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。免疫グロブリンの他のクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を用いてもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号明細書において詳細に論じられている。特定の結果を達成するための、ある一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該技術分野における技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくはヒンジドメインの少なくとも一部分、および好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのうちのいずれかにおける相同ドメインの少なくとも一部分を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本開示の実施の際に有用であり得ると考えられる。一例は、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減されたＦｃ変異体を生じさせるようなアミノ酸置換の上方ＣＨ２領域への導入であろう（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。通常の当業者は、周知の分子生物学技術を用いてかかる構築物を調製することができる。
上述のいずれかについてのある一定の実施形態において、前記キメラタンパク質のＧＡＡ部分は、ＧＡＡの成熟形態、例えば、７６ｋＤａ断片、７０ｋＤａ断片、代替開始部位および／もしくは終止部位を使用する類似の形態、またはそれらの機能性断片のうちの１つを含む。ある一定の実施形態において、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片は、インビトロまたはインビボで評価して、グリコーゲンを加水分解する能力を保持する。さらに、ある一定の実施形態において、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片を含むキメラポリペプチドは、グリコーゲンを加水分解することができる。例示的生物活性断片は、完全長成熟ＧＡＡポリペプチドの連続した少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７５、または少なくとも３００のアミノ酸残基を含む。
ある一定の実施形態において、本明細書に記載するキメラタンパク質のＧＡＡポリペプチド部分は、成熟形態のＧＡＡを含むが、配列番号１に記載のＧＡＡポリペプチドを含まない。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、前記全リンカー領域は、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８（すなわち、配列番号３１）に対応する。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６０、１−６１、１−６２、１−６３、１−６４、１−６５、１−６６、１−６７、１−６８、１−６９、１−７０、１−７１、１−７２、１−７３、１−７４、１−７５、１−８０、１−８５、１−９０、１−９５、１−１００、１−１０５、１−１１０、１−１１５、１−１２０または１−１２１に対応する連続アミノ酸配列を含まない。特定の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分を含む）。他の実施形態において、前記ＧＡＡ部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分を含む）。一部の実施形態において、前記ＧＡＡ部分は、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、前記キメラポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分を含む）。
ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡ部分が任意の上述の成熟ＧＡＡポリペプチドまたは機能性断片の変異体である、キメラタンパク質を企図している。例示的変異体は、ネイティブＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し、かかる変異体は、インビトロまたはインビボで評価してグリコーゲンを加水分解するネイティブＧＡＡの能力を保持する。本開示は、ＧＡＡ部分が、本明細書に記載する成熟ＧＡＡポリペプチド、形態または変異体のいずれかを本明細書に記載する任意の内在化モイエティとの組み合わせで含む、キメラタンパク質およびかかるタンパク質の使用を企図している。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドを配列番号３および４に記載する。さらに、ある一定の実施形態において、任意の上述のキメラポリペプチドの成熟ＧＡＡ部分は、ある一定の実施形態では、融合タンパク質である。ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含み、場合により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含む任意のかかるキメラポリペプチドを、本開示の任意の方法で使用してよい。
ＩＩ．内在化モイエティ
本明細書において用いる場合、用語「内在化モイエティ」は、標的組織または細胞タイプと相互作用して付着分子の細胞への送達を果たす（すなわち、所望の細胞を透過する；細胞膜を横断して輸送する；細胞膜を横断して少なくとも細胞質に送達する）ことが可能なモイエティを指す。好ましくは、この開示は、例えば筋肉細胞および肝臓細胞への送達を促進する内在化モイエティに関する。限られた交差反応性を有する内在化モイエティが一般に好ましい。ある一定の実施形態において、この開示は、筋肉細胞を、必ずしも専ら筋肉細胞のみにではないが、選択的に標的化および透過する内在化モイエティに関する。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、限られた交差反応性を有し、それ故、特定の細胞または組織タイプを優先的に標的化する。しかし、本開示の内在化モイエティが専ら特定の細胞タイプのみを標的化するわけでないことは理解されるはずである。むしろ、内在化モイエティは、他の細胞タイプより優先的に１つ以上の特定の細胞タイプへの送達を促進し、それ故、遍在的ではない送達をもたらす。ある一定の実施形態において、適する内在化モイエティとしては、例えば、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられる。他の内在化モイエティとしては、例えば、ホーミングペプチド、融合タンパク質、受容体、リガンド、アプタマー、ペプチドミメティック、および特異的結合ペアの任意のメンバーが挙げられる。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ２トランスポーターによる細胞膜通過を媒介する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドが細胞膜を有効かつ効率的に通過するのに役立つ。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞（例えば、骨格筋および心筋）への送達を促進する。他の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞以外の細胞、例えば、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞への送達を促進する。上述のいずれについても、ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの細胞質への送達を促進する。
ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの細胞質への送達を促進する。理論に拘束されないが、キメラポリペプチドのＧＡＡポリペプチド部分が成熟ＧＡＡを含むのか、それから成るのかにかかわらず、これは、細胞質への、ならびに場合によりリソソームおよび／または自己貪食小胞への送達を助長する。
ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ＫＤは、現行標準法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いて測定することができる。例として、３Ｅ１０抗体または抗体断片（配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む抗体または抗体断片を含む）が１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することは公知である。
一部の実施形態において、内在化モイエティは、成熟ＧＡＡポリペプチドを筋肉細胞に標的化し、筋肉細胞の細胞質への前記ポリペプチドの細胞膜を横断しての通過を媒介する。
本明細書において用いる場合、用語「内在化モイエティ」は、標的組織または細胞タイプと相互作用することが可能なモイエティを指す。好ましくは、この開示は、例えば筋肉細胞および肝臓細胞への送達を促進する内在化モイエティに関する。限られた交差反応性を有する内在化モイエティが一般に好ましい。しかし、本開示の内在化モイエティが専ら特定の細胞タイプのみを標的化するわけでないことは理解されるはずである。むしろ、内在化モイエティは、他の細胞タイプより優先的に１つ以上の特定の細胞タイプへの送達を促進し、それ故、遍在的ではない送達をもたらす。ある一定の実施形態において、適する内在化モイエティとしては、例えば、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられ；および他の内在化モイエティとしては、例えば、ホーミングペプチド、融合タンパク質、受容体、リガンド、アプタマー、ペプチドミメティック、および特異的結合ペアの任意のメンバーが挙げられる。一部の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドが細胞膜を有効かつ効率的に通過するのに役立つ。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞（例えば、骨格筋または心筋）への送達を促進する。他の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞以外の細胞、例えば、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞への送達を促進する。
（ａ）抗体
ある一定の態様において、内在化モイエティは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体をはじめとする抗体を含むことがある。理論により拘束されないが、かかる抗体は、標的組織の抗原に結合し、かくして対象キメラポリペプチドの標的組織（例えば、筋肉）への送達を媒介し得る。一部の実施形態において、内在化モイエティは、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ヒト抗体および抗体断片、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、抗体断片、それらの誘導体または類似体；Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ヒト抗体および抗体断片、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、多価内在化モイエティ；単一特異性または二重特異性抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、典型的に共有結合で連結されたまたは別様に安定化された（すなわち、ロイシンジッパーもしくはヘリックス安定化された）ｓｃＦｖ断片であるダイアボディー、トリボディーまたはテトラボディーを限定ではないが含む、多価内在化モイエティ；所望の標的分子と自然に相互作用する受容体分子を含むことがある。一部の実施形態において、前記抗体またはそれらの変異体は、キメラのものであってよく、例えば、それらは、マウス３Ｅ１０抗体からの可変重鎖または軽鎖領域を含むことがあるが、別の種（例えば、ヒト）の抗体からの定常領域を含むこともある。一部の実施形態において、抗体またはそれらの変異体は、いくつかの異なる抗体サブクラス定常ドメインのハイブリッド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の任意の組み合わせ）である定常領域を含むこともある。
ある一定の実施形態では、抗体またはその変異体を、被験体に投与するとき、免疫原性を低くするように修飾することがある。例えば、被験体がヒトである場合、前記抗体は、例えばＪｏｎｅｓ，Ｐ．ら、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２−５２５またはＴｅｍｐｅｓｔら、（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２６６−２７３に記載されているような、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域（単数または複数）がヒトモノクローナル抗体に移植された「ヒト化された」ものであってもよい。抗体に言及するときの用語ヒト化およびヒト化されたは、当該技術分野において十分理解されている。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体配列の、または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、同じ標的、例えばＤＮＡ）と結合する抗体の、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する任意のペプチドまたは抗体様タンパク質である。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を使用してヒト化またはヒト抗体を発現させてもよい。かかるヒト化は、部分的であってもよく、または完全であってもよい。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、モノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片を含む。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０であってもよく、または細胞透過活性を保持するその変異体であってもよく、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片であってもよい。加えて、前記抗体またはその抗原結合断片は、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）に結合する抗体であってもよく、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有する抗体であってもよく、またはその抗原結合断片であってもよい。これらは、ＥＮＴ２を標的化する作用物質の例である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ＫＤは、製造業者の説明書および現行作業方法に従って、ＳＰＲまたはＱＣＭを用いて測定することができる。
ある一定の実施形態において、前記抗原結合断片は、ＦｖまたはそのｓｃＦｖ断片である。モノクローナル抗体３Ｅ１０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９で永久寄託されているハイブリドーマ３Ｅ１０によって生産することができ、米国特許第７，１８９，３９６号明細書に開示されている。加えて、またはあるいは、前記３Ｅ１０抗体は、その３Ｅ１０抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることによって生産することができる。用語「３Ｅ１０抗体」または「モノクローナル抗体３Ｅ１０」は、当該抗体を生産するために用いる方法にかかわらず、当該抗体を指すために用いている。同様に、３Ｅ１０の変異体または抗原結合断片に言及するとき、かかる用語は、当該抗体が生産される様式に関係なく用いている。この点で、３Ｅ１０は、一般にハイブリドーマによって生産されず、組換え生産される。したがって、本出願に関連して、３Ｅ１０抗体は、ハイブリドーマの配列を有する抗体、または配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（これは、本明細書に記載のＡＴＣＣに寄託されている３Ｅ１０抗体のものに比べて１つのアミノ酸置換を有する）と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体を指すことになる。
前記内在化モイエティは、ｍＡｂ ３Ｅ１０の変異体、例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０と同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、適便な結合体化部位など）も含むことがある。かかる変異体は、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および／または定常領域（単数または複数）に導入されている変異体を含む。かかる変異体は、３Ｅ１０または３Ｅ１０変異体のヒト化バージョンを含む。一部の実施形態において、前記軽鎖または重鎖は、Ｎ末端またはＣ末端が修飾されていることがある。同様に、変異体についての上述の説明は、抗原結合断片にもあてはまる。これらのいずれの抗体、変異体または断片も、宿主細胞でのヌクレオチド配列（単数または複数）の発現によって組換えにより作製され得る。
モノクローナル抗体３Ｅ１０は、細胞を透過して、タンパク質および核酸を標的組織の細胞質または核空間に送達することが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９９８ Ｏｃｔ；１１（５）：５３９−４６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｚａｃｋ ＤＪら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ Ｓｅｐ １；１５７（５）：２０８２−８）。さらに、３Ｅ１０のＶＨおよびＶｋ配列は、ヒト抗体と高相同性であり、それぞれのヒト化度（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）ｚ−スコアは０．９４３および−０．８８０である。したがって、Ｆｖ３Ｅ１０は、多くの他の認可されているヒト化抗体より誘導する抗抗体反応が小さいと予想される（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ＫＲら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７ ３６９、８５２−８６２）。３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ断片は、原モノクローナル抗体の細胞透過能すべてを有し、タンパク質、例えばカタラーゼ、ジストロフィン、ＨＳＰ７０およびｐ５３は、Ｆｖ３Ｅ１０との結合体化後にそれらの活性を保持する（Ｈａｎｓｅｎ ＪＥら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００６ Ｍａｙ ９；１０８８（１）：１８７−９６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００３ Ｊｕｎ １０；１９５（２）：２１１−９；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．２００５ Ｆｅｂ；１３（２）：８１−７；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｊｕｎ １；１６４（１１）：６０２０−６；Ｈａｎｓｅｎ ＪＥら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｊｕｌ ２０；２８２（２９）：２０７９０−３）。３Ｅ１０は、すべての哺乳動物に存在する抗体足場；マウス可変重鎖および可変κ軽鎖に基づき構築される。３Ｅ１０は、特に骨格筋および癌細胞に多く含まれているＥＮＴ２ヌクレオチドトランスポーターによって細胞に入り、またインビボ研究により３Ｅ１０は非毒性であることが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００１ Ｊａｎ ２６；２８０（３）：９５１−９）。
前記内在化モイエティは、ｍＡｂ ３Ｅ１０の突然変異体、例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０と同じまたは実質的に同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、改善された結合親和性など）も含むことがある。かかる突然変異体は、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および／または定常領域（単数または複数）に導入される変異体を含む。ｍＡｂ ３Ｅ１０の非常に多くの変異体が、例えば、米国特許第７，１８９，３９６号明細書および国際公開第２００８／０９１９１１号パンフレットにおいて特性評価されており、前記特許文献の教示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび／または配列番号１０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体または抗原結合断片、あるいはそれらのヒト化変異体を含む。もちろん、かかる内在化モイエティは、ＥＮＴ２によって細胞を通過し、および／または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）と結合する。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗原結合断片、例えば、配列番号９および１０を含む３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（または別の抗原結合断片）を含み、そのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、およびそのＶＬのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。前記変異体３Ｅ１０またはその断片は、内在化モイエティの機能を保持する。内在化モイエティがｓｃＦｖであるとき、典型的に、ＶＨおよびＶＬドメインは、リンカー、例えばｇｌｙ／ｓｅｒリンカーによって接続されている。ＶＨドメインは、ＶＬドメインに対してＮ末端であり得るか、またはその反対であり得る。
一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、配列番号９と同一であるＶＨドメインのアミノ酸配列と、配列番号１０と同一であるＶＬドメインのアミノ酸配列とを含む３Ｅ１０抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲを、当該技術分野において利用可能な任意のＣＤＲ同定スキームを用いて決定してよい。例えば、一部の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のカバット定義に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７およびＣｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ．３４２：８７７−８８３に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、ＬｅＦｒａｎｃら、２００３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５−７７に記載のｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．、２００１、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３０９：６５７−６７０に準拠して定義される。一部の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋｕｎｉｋら、２０１２、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８において論じられているＣＤＲ同定スキームのいずれかに準拠して定義される。当該技術分野において公知のＣＤＲ同定スキームのいずれかに準拠するＣＤＲの同定を目的として３Ｅ１０抗体の残基に番号付けするために、３Ｅ１０抗体を当該抗体の配列の相同性領域において、選ばれたＣＤＲ同定スキームについての当該技術分野において公知の「基準」番号付き配列とアラインしてもよい。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に用いられるような、番号付け体系への「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。加えて、任意の所与の部位番号におけるある一定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子多様性のため抗体鎖ごとに変わることがある。
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、カバットＣＤＲ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号１３−１８に記載のＣＤＲ）の少なくとも１、２、３、４または５つを含む。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号２４−２９に記載のＣＤＲ）の少なくとも１、２、３、４または５つを含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、カバットＣＤＲ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、配列番号１３−１８を含む）。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、これらを配列番号２４−２９として記載する）。上述のいずれについても、ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、同じ標的、例えばＤＮＡ）と結合する抗体であり、および／または内在化モイエティは、抗原への結合について３Ｅ１０と競合する。例示的内在化モイエティは、細胞を標的化し、ＥＮＴ２によって細胞を通過する。
本開示は、３Ｅ１０または３Ｅ１０断片もしくは変異体の細胞透過能力を利用して、成熟ＧＡＡ、および成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドのインビボでの送達またはインビトロで細胞への、例えば細胞の細胞質への送達を促進する。３Ｅ１０ならびに３Ｅ１０変異体および断片は、骨格筋および心筋をはじめとする筋肉細胞ならびに横隔膜への送達を有効に促進するそれらの実証された能力のため、この送達に特によく適している。したがって、ある一定の実施形態において、３Ｅ１０ならびに３Ｅ１０変異体および断片（または同じエピトープと結合する、および／もしくはＥＮＴ２によって細胞を通過する、抗体もしくは抗体断片）は、ポンペ病を有するまたはポンペ病を繰り返す症状を有する被験体、例えばヒト患者またはモデル生物、の細胞への有効な送達の促進に有用である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティが３Ｅ１０に関係付けられるキメラポリペプチドは、細胞の細胞質への成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドの送達を助長するのに適している。
下でさらに説明するように、組換え３Ｅ１０または３Ｅ１０様変異体または断片を成熟ＧＡＡポリペプチドに、例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチドに結合体化、結合または別様に連結させることができる。キメラポリペプチドの作製に関連して、成熟ＧＡＡへの化学的結合体化、ならびにキメラポリペプチドの融合タンパク質としての作製も利用可能であり、当該技術分野において公知である。
抗体またはその断片（例えば、ＶＨ−リンカー−ＶＬもしくはＶＬ−リンカー−ＶＨによってコードされた一本鎖Ｆｖ断片、またはＦａｂ）の調製は、当該技術分野において周知である。特に、ｍＡｂ ３Ｅ１０抗体断片の組換え生産方法は、国際公開第２００８／０９１９１１号に記載されている。さらに、抗体またはＦａｂのｓｃＦｖ断片の生成方法は、当該技術分野において周知である。抗体または抗体断片を組換え生産する場合、リンカーを使用することがある。例えば、柔軟なタンパク質領域における典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。１つの例示的リンカーを配列番号５または６に提供する。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列の基準（例えば、柔軟性で最小の疎水性または荷電性）を満たすと予想される。もう１つの例示的リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎ（この式中のｎは、１〜１０の整数、例えば２、３または４である）（配列番号３４）のものである。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。
例えばｓｃＦｖの部分を相互接続するリンカーに加えて、本開示は、例えば、キメラポリペプチドの抗体部分に成熟ＧＡＡ部分を相互接続するための追加のリンカーの使用を企図している。
モノクローナル抗体を産生するための任意の数の周知の方法によって抗体の調製を遂行してもよい。これらの方法は、典型的に、動物、典型的にはマウスを所望の免疫原（例えば、所望の標的分子またはその断片）で免疫するステップを含む。マウスを免疫し、好ましくは所望の免疫原（単数または複数）で１回以上追加免疫したら、周知の方法に従ってモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマを調製し、スクリーニングしてよい（例えば、モノクローナル抗体生産の総括（この部分は参照により本明細書に援用されている）については、Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、ｐｐ．１３１−１３９、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．（１９９７）を参照されたい）。過去数十年の間に、抗体生産は極めて堅固なものになってきた。抗体認識法とファージディスプレイ技術を併用するインビトロ法は、極めて特異的な結合能を有する抗体の増幅および選択を可能にする。例えば、参照により本明細書に援用されているＨｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら、「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１１：４４５−４４９を参照されたい。これらの方法は、典型的に、旧来のモノクローナル抗体調製方法によるハイブリドーマの調製よりはるかに扱いやすい。１つの実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて、所望の標的分子に対して特異的な内在化モイエティを産生することがある。選択された免疫原に対する免疫応答を動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギまたは他の動物）において惹起し、その応答を追加刺激して免疫原特異的Ｂ細胞集団を増やす。メッセンジャーＲＮＡをそれらのＢ細胞から、または場合によりモノクローナルもしくはポリクローナルハイブリドーマ集団から単離する。ポリ−Ａプライマーを使用するか、または典型的には所望のＶＨおよびＶＬ鎖に隣接した配列に特異的な、マウス免疫グロブリン特異的プライマー（単数もしくは複数）を使用して、公知の方法によりｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る。ＶＨおよびＶＬ特異的プライマーセットを典型的に使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望のＶＨおよびＶＬ鎖を増幅し、リンカーによって隔てて互いにライゲートする。ＶＨおよびＶＬ特異的プライマーセットは、例えばカリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．から、市販されている。（ｓｃＦｖ断片をコードする）組み立てられたＶＨ−リンカー−ＶＬ産物をＰＣＲによって選択し、増幅する。制限部位を含むプライマーを用いるＰＣＲによってそのＶＨ−リンカー−ＶＬ産物の末端に制限部位を導入し、ファージディスプレイに適する発現ベクター（典型的にはプラスミド）にそのｓｃＦｖ断片を挿入する。Ｆａｂ’断片などの他の断片をファージ粒子上での表面発現のためにファージディスプレイベクターにクローニングしてもよい。前記ファージは、ラムダなどの任意のファージであってよいが、典型的には糸状ファージ、例えば、ｆｄおよびＭ１３、典型的にはＭ１３である。
ある一定の実施形態では、抗体または抗体断片を宿主細胞において組換えにより作製する。言い換えると、抗体の配列が（例えば、上で説明した方法を用いて）判ったら、標準的な技術を用いてその抗体を組換えにより作製することができる。
ある一定の実施形態では、前記内在化モイエティを、プロテアーゼによる切断に対してより耐性にするように修飾することがある。例えば、（Ｌ）立体配置の天然に存在するアミノ酸の１つ以上をＤ−アミノ酸で置換することによって、ポリペプチドを含む内在化モイエティの安定性を増加させてもよい。様々な実施形態において、内在化モイエティのアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％または１００％は、Ｄ立体配置のものであってよい。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への切り換えは、消化管内で見いだされる多くの遍在ペプチダーゼの消化能を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む内在化モイエティの向上した安定性を、旧来のペプチド結合の修飾の導入によって実現してもよい。例えば、ポリペプチド主鎖内へのシクロ環の導入は、胃または他の消化器官内および血清中のポリペプチドを消化することが公知の多くのタンパク質分解酵素の影響を回避するために向上した安定性をもたらすことがある。さらに他の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸間に１つ以上の右旋性アミノ酸（例えば、右旋性フェニルアラニンまたは右旋性トリプトファン）を挿入することによって内在化モイエティの向上した安定性を実現することもある。例示的実施形態において、かかる修飾は、所望の標的分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼすことなく、内在化モイエティのプロテアーゼ耐性を増加させる。
（ｂ）ホーミングペプチド
ある一定の態様において、内在化モイエティは、対象キメラ成熟ＧＡＡポリペプチドを標的組織（例えば、筋肉）に選択的に指向させるホーミングペプチドを含むことがある。例えば、ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むホーミングペプチドによって、キメラポリペプチドの筋肉への送達を媒介することができる。さらなる例示的ホーミングペプチドは、国際公開第９８／５３８０４号に開示されている。標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて同定することができる。ホーミングペプチドのさらなる例としては、核局在化配列Ｔａｔ４８−６０を含むＨＩＶ転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）；ショウジョウバエアンテナペディア転写因子ホメオドメイン（例えば、Ａｎｔｐ４３−５８ホメオドメイン第３ヘリックスを含むペネトラチン）；ホモ−アルギニンペプチド（例えば、虚血ラット心のＡｒｇ７ペプチド−ＰＫＣ−εアゴニスト保護（「Ａｒｇ７」を配列番号３６として開示する））；α−ヘリックスペプチド；カチオン性ペプチド（「超正」電荷を持つタンパク質）が挙げられる。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ２を標的化する。他の実施形態において、ホーミングペプチドは、筋肉細胞を標的化する。ホーミングペプチドにより標的化される筋肉細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞が挙げられるだろう。他の実施形態において、ホーミングペプチドは、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞を標的化する。
ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。
加えて、標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて同定することができる。同定されたら、ある一定の実施形態では、特定の標的組織に対して選択的であるホーミングペプチドを使用することができる。
例示的方法は、インビボファージディスプレイ法である。具体的には、ランダムペプチド配列をファージの表面タンパク質との融合タンパク質として発現させ、このランダムペプチドライブラリーを全身循環に注入する。宿主マウスへの注入後、標的組織または器官を回収してファージを単離し、増やし、前記注射手順をさらに２回繰り返す。注射されたウイルスは、組織にランダムに結合する機会または非標的組織に特異的に結合する機会があるので、各注射ラウンドは、デフォルトで陰性選択を含む。非標的組織に特異的に結合するウイルス配列は、選択プロセスによって直ぐに削除されることになり、その一方で非特異的結合ファージの数は、各選択ラウンドに伴って減少する。多くの研究室が脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、腸、子宮、副腎、網膜、筋肉、前立腺または腫瘍の血管系に対して選択的であるホーミングペプチドを同定した。例えば、Ｓａｍｏｙｌｏｖａら、１９９９、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、２２：４６０；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：３６４；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：２６５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３０：１１８９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｍｏｌｅ．Ｐｓｙｃｈ．、１：４２１、４２３；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２：４３０；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１１５９３を参照されたい。米国特許第５，６２２，６９９号、同第６，０６８，８２９号、同第６，１７４，６８７号、同第６，１８０，０８４号、同第６，２３２，２８７号、同第６，２９６，８３２号、同第６，３０３，５７３号、同第６，３０６，３６５号明細書も参照されたい。任意の上記組織を標的化するホーミングペプチドをその組織に成熟ＧＡＡタンパク質を標的化するために使用してよい。
（ｃ）リソソームおよび自己貪食小胞へのさらなる標的化
リソソームへのタンパク質の従来の標的化方法は、Ｍ６Ｐ残基とゴルジ体または後期エンドソームなどの構造の内面のＭ６ＰＲ分子との相互作用によってそれらの輸送をリソソームに指向させる、Ｍ６Ｐ残基でのタンパク質の修飾である。リソソームへの内因性ＧＡＡの輸送は、Ｍ６ＰとＭ６ＰＲの相互作用に依存する。他のリソソーム酵素の重度の欠乏が顕在化するＩ細胞病の患者であっても正常なＧＡＡ活性によって証明されるように、ＧＡＡのＭ６Ｐ非依存性の輸送形態もある（Ｗｉｓｓｅｌａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８（３）：２２２３−２２３１、１９９３）。ＧＡＡのＭ６Ｐ非依存性輸送のさらなる証拠は、筋肉特異的Ｍ６ＰＲノックアウトマウス標的化の際にリソソームＧＡＡの分解がないことを示す研究（Ｗｙｌｉｅら、２００３、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１６２（１）：３２１−２８）によって証明される。ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチド（例えば、成熟ＧＡＡと内在化モイエティとを含むポリペプチド）は、Ｍ６ＰＲによる、またはＭ６ＰＲ非依存性の経路での、リソソームへのさらなる標的化を助長するような修飾をさらに含むことがある。かかる標的化モイエティを、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、そして３Ｅ１０もしくは成熟ＧＡＡへの結合体化によって、付加させてもよい。他の実施形態において、キメラポリペプチドのＧＡＡ部分は、Ｍ６Ｐ輸送を助長するための内因性配列のすべてまたは一部を含む。
一部の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、細胞の自己貪食プロセスによってリソソームに輸送される。自己貪食は、リソソーム機構による不必要なまたは機能不全の細胞成分の細胞分解を伴う異化メカニズムである。このプロセス中に標的細胞質成分は、細胞の他の部分からオートファゴソームと呼ばれる小胞内へと単離され、前記オートファゴソームは、その後、リソソームと融合され、分解または再循環される。自己貪食小胞へのタンパク質の取り込みは、細胞の標的領域周囲の膜の形成、およびその後のその小胞とリソソームの融合によって媒介される。細胞小器官およびタンパク質が自己貪食空胞と呼ばれる小胞の中の細胞内に捕捉されるマクロオートファジーを含む、いくつかの自己貪食メカニズムが公知である。リソソームと融合すると、自己貪食空胞の内容物は、酸性リソソームヒドロラーゼによって分解される。ミクロオートファジーでは、リソソームが細胞質を直接飲み込み、シャペロン媒介自己貪食では、コンセンサスペプチド配列を有するタンパク質にｈｓｃ７０含有シャペロン−コシャペロン複合体が結合し、その複合体がリソソームタンパク質によって認識され、リソソーム膜を越えて転位される。自己貪食空胞は、成熟ＧＡＡなどの酵素の活性の助けになるリソソーム環境（低ｐＨ）を有する。
自己貪食は哺乳動物の筋肉細胞で天然に起こる（Ｍａｓｉｅｒｏら、２００９、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１０（６）：５０７−１５）。自己貪食性分解がポンペ病の際に増進されることも実証されている（Ｍａｌｉｃｄａｎら、２００８、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１８：５２１−２９；Ｆｕｋｕｄａら、２００６、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１４（６）：８３１−３９；Ｔａｋｉｋｉｔａら、２００９、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ、５（５）：７２９−３１；Ｒａｂｅｎら、２００８、１７（２４）：３８９７−３９０８）。さらに、ポンペ病の際に存在する自己貪食空胞はグリコーゲンを含有する（Ｍａｌｉｃｄａｎら、２００８、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１８：５２１−２９）。自己貪食空胞は細胞質からタンパク質を取り込むので、本開示のキメラポリペプチドはグリコーゲン含有自己貪食小胞によって取り込まれると予想され、そこで本キメラポリペプチドは、それらの空胞内に存在するグリコーゲンを自由に分解することになる。したがって、一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、いずれの自己貪食空胞特異的標的化モチーフも付加せずに自己貪食空胞によって取り込まれることが可能である。
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、自己貪食小胞へのさらなる標的化を助長するための修飾をさらに含むことがある。１つの公知シャペロン標的化モチーフは、ＫＦＥＲＱ様モチーフ（配列番号３３）である。したがって、このモチーフを本明細書に記載のキメラポリペプチドに付加させて、それらのポリペプチドを自己貪食の標的にすることができる。例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、そして３Ｅ１０もしくは成熟ＧＡＡへの結合体化によって、かかる標的化モイエティを付加させてもよい。
Ｍ６Ｐ残基またはシャペロン標的化モチーフを成熟ＧＡＡポリペプチドに付加させてもよい。本開示の成熟ＧＡＡポリペプチドは、例えば、別々に投与されるか併用で投与される、ＧＡＡの７６ｋＤａ形態、またはＧＡＡの７０ｋＤａ形態、または代替開始部位および／もしくは終了部位を使用する類似の形態を含むことがある。ＧＡＡの７０ｋＤａおよび８６ｋＤａ形態の組み合わせ、または本明細書に記載のＧＡＡの類似の形態については、内在化モチーフを前記成熟ＧＡＡポリペプチドのいずれかに付加させてもよいし、または両方に付加させてもよい。
ＩＩＩ．キメラポリペプチド
本開示のキメラポリペプチドは、様々な手法で作製することができる。前記キメラポリペプチドは、本明細書に開示する任意の内在化モイエティ部分および成熟ＧＡＡポリペプチド部分（例えば、本明細書に記載の成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド）を含んでよい。本明細書において用いる場合、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチド部分（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、成熟ＧＡＡを含むが、ＧＡＡ前駆体の内因性プロセッシングによってインビボで産生された成熟ＧＡＡより長い、ＧＡＡポリペプチドを含む）などの、（ｉ）ＧＡＡポリペプチド部分と（ｉｉ）内在化モイエティ部分とを含む本開示のキメラポリペプチド。加えて、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドを本明細書に開示する任意の方法または組成物において使用してよい。一部の実施形態において、内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）は、本明細書に開示する成熟ＧＡＡポリペプチド、断片または変異体のいずれか１つに直接または間接的に連結されている。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ｉ）約１１０ｋＤａの未成熟ＧＡＡポリペプチドおよび／またはｉｉ）シグナル配列、すなわち、配列番号１もしくは２のアミノ酸残基１−２７を有する未成熟ＧＡＡを含まない。言い換えると、本開示は、キメラポリペプチドであって、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドと連続する配列をはじめとするＧＡＡポリペプチドからの追加のポリペプチド配列も含むことがある（例えば、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、成熟ＧＡＡポリペプチド配列を含むＧＡＡポリペプチドを含む）キメラポリペプチドを企図している。例えば、一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、配列番号２１−２３のいずれかのアミノ酸配列を含むＧＡＡポリペプチドを含む（例えば、配列番号２１−２３は、成熟ＧＡＡを含むがＧＡＡポリペプチドの追加の連続アミノ酸も含むＧＡＡポリペプチドの例である）。本開示は、キメラポリペプチドが、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むが、その成熟ＧＡＡポリペプチド部分と連続する追加のＧＡＡポリペプチド配列を含まない実施形態も企図している。最後に、本開示は、キメラポリペプチドが成熟ＧＡＡポリペプチドに加えて追加のＧＡＡポリペプチド部分を含まない実施形態を企図している。
ある一定の実施形態では、より長いＧＡＡポリペプチド（例えば、配列番号２１−２４のいずれかのアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチド）を含むキメラポリペプチドが、被験体内の標的細胞によってそのキメラポリペプチドが取り込まれる前に、完全長ＧＡＡポリペプチド中に存在するいずれかの切断部位において被験体のプロテアーゼによって偶発的に切断される（例えば、配列番号１のアミノ酸５６−５７、７７−７８、１１３−１１４、１２１−１２２、２００−２０１、２０３−２０４、７８１−７８２、または７９１−７９２に対応するいずれかのアミノ酸間の切断）尤度を低下させるために、本明細書に記載する内在化モイエティのいずれかと成熟ＧＡＡポリペプチド（例えば、配列番号３または４のアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチド）を結合体化させることが望ましいことがある。
ある一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドのＣ末端を、内在化モイエティ（例えば、抗体、抗体断片またはホーミングペプチド）のＮ末端に直接または間接的に連結させることができる。あるいは、内在化モイエティ（例えば、抗体、抗体断片またはホーミングペプチド）のＣ末端を成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に直接または間接的に連結させることができる。例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０の抗体重鎖または軽鎖いずれかのアミノまたはカルボキシ末端に成熟ＧＡＡポリペプチドを配置するようにキメラポリペプチドを設計することができる。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、内在化モイエティのＣ末端に融合した配列番号２２または２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、Ｆａｂ内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号２２または２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、完全長抗体内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号２２または２３のアミノ酸配列を含む。
ある一定の実施形態において、可能性のある構成は、付着成熟ＧＡＡポリペプチドの機能的完全性を維持するために必要に応じて抗体の重鎖および軽鎖配列（例えば、ｍＡＢ ３Ｅ１０）のトランケート部分の使用を含む。さらになお、前記内在化モイエティを成熟ＧＡＡまたはその変異体の露出された内部（非末端）残基に連結させることができる。さらなる実施形態では、成熟ＧＡＡ−内在化モイエティ構成の任意の組み合わせを用いることができ、それによって、１：１より大きい成熟ＧＡＡ：内在化モイエティ比（例えば、２成熟ＧＡＡ分子対１内在化モイエティ）が得られる。
前記成熟ＧＡＡポリペプチドおよび前記内在化モイエティを互いに直接連結させてもよい。あるいは、前記成熟ＧＡＡポリペプチドおよび前記内在化モイエティを、各ドメインが適正にその二次および三次構造に確実にフォールディングするのに十分な距離だけ離隔するリンカー配列を介して、互いに連結させてもよい。好ましいリンカー配列は、（１）柔軟な伸長された高次構造をとるべきであり、（２）成熟ＧＡＡポリペプチドまたは内在化モイエティの機能性ドメインと相互作用することができる規則二次構造を発生させる傾向を示してはならず、そして（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進することができる最小の疎水性または荷電性を有するべきである。柔軟なタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列についての上記基準を満たすと予想される。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。特定の実施形態では、約２０アミノ酸のリンカー配列長を使用して、機能性タンパク質ドメインの適する離隔をもたらすことができるが、より長いまたはより短いリンカー配列を使用してもよい。成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティを離隔するリンカー配列の長さは、長さ５から５００アミノ酸、またはさらに好ましくは長さ５から１００アミノ酸であることができる。好ましくは、前記リンカー配列は、長さ約５〜３０アミノ酸である。好ましい実施形態において、前記リンカー配列は、約５から約２０アミノ酸であり、有利には約１０から約２０アミノ酸である。他の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドを内在化モイエティに連結させるリンカーは、抗体の定常ドメイン（例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０の定常ドメイン、または別の抗体のＦｃ領域のすべてもしくは一部分）であることができる。ある一定の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。ある一定の実施形態において、前記リンカー配列は、配列番号３０のリンカー配列を含む。
他の実施形態では、前記成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片を前記内在化モイエティに直接結合体化または連結させることがある。例えば、組換え結合体化キメラポリペプチドを、前記成熟ＧＡＡ部分と前記内在化モイエティ部分とのインフレーム融合体として生産することができる。ある一定の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーであってよい。上述の実施形態のいずれにおいても、前記内在化モイエティを前記成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に、例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に（直接またはリンカーを介して）結合体化させてよい。他の実施形態では、前記内在化モイエティを前記成熟ＧＡＡポリペプチドの内部アミノ酸に（直接または間接的に）結合体化させてもよい。前記構築物の２つの部分が互いに結合体化／連結されることに留意されたい。別段の指定がない限り、成熟ＧＡＡ部分の内在化モイエティへの結合体化としてのキメラポリペプチドの記載は、内在化モイエティの成熟ＧＡＡ部分への結合体化と同義で用いている。さらに、別段の指定がない限り、結合体化および／または連結は、化学的結合体化または遺伝子結合体化いずれかを指す。
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、周知の架橋試薬または架橋プロトコルを用いて生成することができる。例えば、当業者に公知であり、成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティ（例えば、抗体）を架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、前記架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。タンパク質を結合体化させるより特異的なカップリング方法が、ヘテロ二官能性架橋剤によって設計できるようになり、それによりホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させることができる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野において公知であり、それらとしては、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤を、より大きい水溶性を一般に有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。加えて、連結する鎖内にジスルフィドブリッジを有する架橋剤をアルキル誘導体としてその代りに合成して、インビボリンカー切断量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性および光反応性架橋剤をはじめとする多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本開示における使用のために有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説については、参照により本明細書に援用されているＭｅａｎｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２を参照されたい。
上に含めたヘテロ二官能性架橋剤の１つの特に有用なクラスは、第一級アミン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性類似体Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。アルカリｐＨでの第一級アミン（リジンε基）は、プロトン化されず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに対する求核攻撃によって反応する。この反応は、アミド結合の形成、そしてＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの副生成物としての遊離をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用なもう１つの反応性基は、チオール反応性基である。一般的なチオール反応性基としては、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、弱酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）条件下で数分で遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理ｐＨで−−ＳＨ基と反応する。これら両方の反応性基は、安定したチオエーテル結合の形成をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の第三の構成要素は、スペーサーアームまたはブリッジである。ブリッジは、２つの反応性末端を接続する構造である。ブリッジの最も明白な特質は、立体障害に対するその効果である。場合によっては、長いブリッジほど、２つの複雑な生体分子を連結させるために必要な距離に容易に架かることができる。
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、複数のリンカーを含む。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、そのキメラポリペプチドは、ＧＡＡを内在化モイエティに結合体化させる第一のリンカーと、ＶＨドメイン（例えば、配列番号９）をＶＬドメイン（例えば、配列番号１０）に結合体化させるｓｃＦｖ内の第二のリンカーを含むことがある。
ヘテロ二官能性試薬を使用するタンパク質結合体の調製は、アミン反応とスルフヒドリル反応を含む二工程プロセスである。第一の工程、アミン反応のために選択されるタンパク質は、第一級アミンを含有すべきである。これは、リジンεアミンまたは殆どのタンパク質のＮ末端に見いだされる第一級αアミンであることができる。前記タンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含有してはならない。結合体化される両方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含有する場合、例えばＮ−エチルマレイミドを使用してすべてのスルフヒドリルをブロックするように一方のタンパク質を修飾することができる（参照により本明細書に援用されているＰａｒｔｉｓら（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を使用して、特定のタンパク質中のスルフヒドリルの量を計算することができる（例えば、参照により本明細書に援用されているＥｌｌｍａｎら（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３およびＲｉｄｄｌｅｓら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５を参照されたい）。
ある一定の特定の実施形態では、ユニバーサル担体系を使用して本開示のキメラポリペプチドを生産することができる。例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドを一般的な担体、例えば、プロテインＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ｈｅｘ−ヒスチジンなどに結合体化させることができる。その場合、その結合体化された担体は、内在化モイエティとして作用する抗体と複合体を形成することになる。免疫グロブリンと結合する役割を担う担体分子の小部分を担体として使用することもできよう。
ある一定の実施形態では、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編集）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を用いることにより、本開示のキメラポリペプチドを生産することができる。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。成熟ＧＡＡの内在化モイエティへの化学的結合体化のための上述のいずれの架橋方法においても、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを使用することができる。切断は、内在化モイエティと成熟ＧＡＡポリペプチドの分離を可能にする。例えば、キメラポリペプチドが細胞を透過した後に、切断可能リンカーの切断によって成熟ＧＡＡの内在化モイエティから分離することが可能になる。
ある一定の実施形態において、ＧＡＡポリペプチド部分（例えば、成熟ＧＡＡポリペプチド配列を含むＧＡＡポリペプチド）と内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドを、前記ＧＡＡポリペプチドと前記内在化モイエティとを含有する融合タンパク質として生成することができる。ある一定の実施形態では、１本の連続ポリペプチド鎖として発現される、成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）とを含有する融合タンパク質として、本開示のキメラポリペプチドを生成することができる。ある一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含む融合タンパク質であって、前記ＧＡＡポリペプチド部分が、成熟ＧＡＡポリペプチドを含み、かつＧＡＡポリペプチドからの追加のポリペプチド配列（前記成熟ＧＡＡポリペプチドと連続する配列を含む）も含む融合タンパク質として、キメラポリペプチドを生成する。かかる融合タンパク質を調製する場合、成熟ＧＡＡポリペプチドおよび内在化モイエティをコードし、場合により、前記成熟ＧＡＡポリペプチドと前記内在化モイエティに架かるようなペプチドリンカー配列もコードする核酸を含む、融合遺伝子を構築する。翻訳産物が所望の融合タンパク質である、融合遺伝子を生じさせるための組換えＤＮＡ技術の使用は、当該技術分野において周知である。遺伝子のコード配列とその調節領域の両方を設計しなおして、タンパク質産物の機能特性、作製されるタンパク質の量、またはそのタンパク質が生産される細胞タイプを変えることができる。遺伝子のコード配列を−−例えば、その一部を異なる遺伝子のコード配列に融合させることによって−−大幅に変更して、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を生産することができる。融合タンパク質の生産方法の例は、参照により本明細書に援用されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５号パンフレット、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８に記載されている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。あるいは、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別の方法では、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｍ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。融合遺伝子によってコードされたキメラポリペプチドを、当該技術分野において周知であるような様々な発現系を使用して組換え生産してもよい（下記も参照されたい）。
組換え結合体化キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドが内在化モイエティのＮ末端またはＣ末端に結合体化されている実施形態を含む。成熟ＧＡＡポリペプチドがＦｖ３Ｅ１０の可変（ｖａｒｉａｎｔ）軽鎖および重鎖に結合体化されている例示的キメラポリペプチドを配列番号１１および１２に示す。ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、Ｎ末端に（Ｎ末端に、またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内に）、配列番号１９または２０に記載のアミノ酸配列をさらに含む。
組換え結合体化キメラポリペプチドは、内在化モイエティがＧＡＡポリペプチドのＮ末端側にある実施形態、および内在化モイエティがＧＡＡポリペプチド部分のＣ末端側にある実施形態を含む。
融合タンパク質を組換えにより作製する方法は当該技術分野において周知であることに特に言及しておく。本明細書に記載のいずれのキメラタンパク質も容易に組換えによって作製することができる。これは、１つ以上のタグおよび／または１つ以上のリンカーを有するタンパク質を含む。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、そのキメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチド部分へ内在化モイエティを相互接続する（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）第一のリンカー、およびＶＨドメインを結合体化させるｓｃＦｖ中の第二のリンカーを含むことがある。さらに、ある一定の実施形態において、キメラポリペプチドは、そのキメラポリペプチドのＮ末端に（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内に）「ＡＧＩＨ」部分（配列番号１９）を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するかまたは不存在の状態で提供することがある。さらなる実施形態において、前記キメラポリペプチドは、そのポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。一部の実施形態において、キメラポリペプチドは、そのポリペプチドのＮ末端に（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内に）「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２０）部分を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するまたは不存在の状態で提供することがある。
一部の実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号明細書に記載されているように、キメラポリペプチドに架かる連結領域内の候補Ｔ細胞エピトープを同定し、その連結領域内のアミノ酸を変えることによって、キメラポリペプチドの免疫原性を低減させることがある。
本開示によるキメラポリペプチドは、非常に多くの目的に用いることができる。本明細書に記載する任意のキメラポリペプチドを本明細書に記載する任意の方法で使用することができること、およびそのような適する組み合わせを具体的に企図していることに、特に言及しておく。
本明細書に記載するキメラポリペプチドを使用して、成熟ＧＡＡポリペプチドを細胞に、特に筋肉細胞に送達することができる。ある一定の実施形態において、キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡを肝臓細胞に送達する。したがって、前記キメラポリペプチドを使用して、成熟ＧＡＡの細胞へのインビトロまたはインビボ輸送を助長することができる。細胞への輸送を助長することによって、前記キメラポリペプチドは送達効率を改善し、かくして成熟ＧＡＡポリペプチドでのインビトロまたはインビボ作用を助長する。さらに、輸送効率を上昇させることにより、前記キメラポリペプチドは、インビトロまたはインビボ実験に必要な成熟ＧＡＡの量を減少させるのに役立つこともある。さらに、細胞質への送達を助長することにより、本開示のキメラポリペプチドおよび方法は、例えばポンペ病の際のグリコーゲンの細胞質蓄積に伴う問題に対処することができる。
前記キメラポリペプチドを使用して、培養細胞における成熟ＧＡＡの機能を研究することができ、成熟ＧＡＡの輸送を研究することもできる。前記キメラポリペプチドを使用して、細胞質とリソソーム間の輸送などの、細胞中の成熟ＧＡＡについての結合パートナーを同定することができる。前記キメラポリペプチドをスクリーンに使用して、細胞中の成熟ＧＡＡ活性の修飾因子（例えば、小有機分子またはポリペプチド修飾因子）を同定することができる。前記キメラポリペプチドを使用して、ヒトにおけるまたは動物モデルにおけるポンペ病の症状の処置または緩和を助けることができる。前述は、対象キメラポリペプチドについての使用の単なる例である。
前記ＧＡＡポリペプチド、内在化モイエティおよびリンカーの任意の特徴を兼備するキメラポリペプチドを含めて、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、本開示の任意の方法で使用してよい。
ＩＶ．ＧＡＡ関連核酸および発現
ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡポリペプチド（その機能性断片、変異体および融合体を含む）を生産するために、例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチドを生産するために、核酸を使用する。ある一定の特定の実施形態において、前記核酸は、本開示の組換えキメラタンパク質を作製するための内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）をコードするＤＮＡをさらに含むことがある。ある一定の実施形態において、その核酸構築物は、約１１０ｋＤａのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードしない。ある一定の実施形態において、その核酸構築物は、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドをコードするが、（ｉ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号１もしくは２の残基１−２７および／もしくは１−５６に対応する部分を含むＧＡＡポリペプチドをコードしない。これらの核酸すべてを総称して成熟ＧＡＡ核酸と呼ぶ。なぜならそれらは成熟ＧＡＡポリペプチドおよび、場合により、ＧＡＡポリペプチドの追加の連続部分を含むポリペプチドをコードするからである。
前記核酸は、一本鎖または二本鎖、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡ（例えば、成熟ＧＡＡヌクレオチド配列）をコードするＧＡＡヌクレオチド配列の領域（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ０００１４３．２をコードするＮＭ＿０００１５２．３；ＮＰ＿００１０７３２７１．１をコードするＮＭ＿００１０７９８０３．１；およびＮＰ＿００１０７３２７２．１をコードするＮＭ＿００１０７９８０４．１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離されたまたは組換え核酸配列に関する。ＧＡＡについての前記ヌクレオチド配列は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。さらなる実施形態において、前記ＧＡＡ核酸配列は、単離されている場合があり、組換え型である場合があり、および／または異種ヌクレオチド配列と融合している場合があり、またはＤＮＡライブラリー中のものである場合がある。
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡ核酸は、上述のネイティブＧＡＡヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００１５２．３；ＮＭ＿００１０７９８０３．１；およびＮＭ＿００１０７９８０４．１）またはそれらの相補配列のいずれかに高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることは、通常の当業者には容易に理解されるであろう。例えば、約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃で２．０ｘＳＳＣの洗浄を行うことができよう。例えば、洗浄工程での塩濃度を５０℃で約２．０ｘＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程の温度を室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または他の変数を変化させつつ温度もしくは塩濃度を一定に保ってもよい。１つの実施形態において、本開示は、室温で６ｘＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供し、ハイブリダイズ後、室温で２ｘＳＳＣで洗浄する。
遺伝コードの縮重のためにネイティブ成熟ＧＡＡ核酸とは異なっている単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が複数のトリプレットによって表される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことがある。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％またはそれ未満）のこれらの変異が、天然対立遺伝子変異のため所与の種の個体間に存在することがあることは、当業者には理解されるであろう。任意のおよびすべてのかかるヌクレオチド変異および結果として生ずるアミノ酸多型が本開示の範囲内である。
ある一定の実施形態では、前記組換え成熟ＧＡＡ核酸を発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることがある。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に用いられる宿主細胞に適切であるだろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適する調節配列が当該技術分野において様々な宿主細胞について公知である。典型的に、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターを本開示は企図している。前記プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターの要素を兼備するハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は、染色体に挿入されることもある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なることになる。ある一定の態様において、本開示は、成熟ＧＡＡポリペプチドをコードし、かつ少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野において認知されており、そしてコードされたポリペプチドの発現を命じるために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素を含む。例示的調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）の選択、および／または発現させることを所望するタンパク質タイプなどの因子に依存し得ることは、理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。
一部の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、前記核酸構築物は、成熟ＧＡＡ生物活性を有するキメラポリペプチドをコードする。ある一定の実施形態において、前記核酸構築物は、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことがある。
本開示は、本開示の成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。前記宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドを細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において発現させてもよい。他の適する宿主細胞は、当業者に公知である。
本開示は、さらに、本開示の成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を起こさせるような適切な条件下で培養することができる。そのポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物からそのポリペプチドを分泌させ、単離してもよい。あるいは、そのポリペプチドを細胞質にまたは膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は、当該技術分野において周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および前記ポリペプチド（例えば、ＧＡＡポリペプチド）の特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製をはじめとする、当該技術分野において公知のタンパク質精製技術を用いて、前記ポリペプチドを細胞培養培地、宿主細胞または両方から単離することができる。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、その精製を助長するドメインを含有する融合タンパク質である。
組換え成熟ＧＡＡ核酸は、クローン遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳動物）または両方のいずれかにおける発現に適するベクターにライゲートすることによって生産することができる。組換えポリペプチドの生産のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適するベクターとしては、次のタイプのプラスミドが挙げられる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるそのベクターの増殖を助長するための原核性配列と、真核細胞において発現される１つ以上の真核性転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターが、真核細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部をｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾して、原核細胞および真核細胞両方における複製および薬剤耐性選択を助長する。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バー・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞両方のための他の適する発現系、ならびに一般組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）第１６および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいこともある。かかるバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。
融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。あるいは、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｍ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
本開示は、キメラタンパク質を組換え生産する方法、例えば上に記載したものを企図している。タンパク質の例えば酵母または哺乳動物細胞における発現のための適するベクターおよび宿主細胞は、容易に選択され得る。宿主細胞は、キメラポリペプチドをコードするベクターを安定的に発現することもあり、または一過的に発現することもある。細胞培養培地から容易に単離することができるキメラポリペプチドを発現させるのに適する条件下で、かかる宿主細胞を培養してよい。
本開示のキメラポリペプチド（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分とを含むポリペプチド）を単一ポリペプチド鎖として発現させてもよいし、または１本より多くのポリペプチド鎖として発現させてもよい。単一ポリペプチド鎖の例は、ｓｃＦｖである内在化モイエティにＧＡＡ部分がインフレームで融合する場合である。ある一定の実施形態において、この単一ポリペプチド鎖は、単一ベクターから融合タンパク質として発現される。
１本より多くのポリペプチド鎖の例は、内在化モイエティが抗体またはＦａｂである場合である。ある一定の実施形態では、前記抗体またはＦａｂの重鎖および軽鎖を、単一ベクターを発現する宿主細胞において発現させてもよいし、または２つのベクター（重鎖を発現するものおよび軽鎖を発現するもの）を発現する宿主細胞において発現させてもよい。いずれの場合も、例えば重鎖のＣ末端への、インフレーム融合体としてＧＡＡポリペプチドを発現させてよく、それによりＧＡＡポリペプチドは内在化モイエティに付けられるが、内在化モイエティの抗原結合領域からはある程度の距離に付けられる。
上で述べたように、キメラポリペプチドをはじめとするポリペプチドを組換え発現させる方法は当該技術分野において周知である。特定のアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチド、例えばヒトＧＡＡポリペプチド、を発現するヌクレオチド配列を入手でき、使用することができる。さらに、配列番号９および１０に記載のＶＨおよびＶＬを含む３Ｅ１０抗体、ｓｃＦｖまたはＦａｂを発現するものなどの、内在化モイエティ部分を発現するヌクレオチド配列を公的に入手でき、適する重鎖および軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と組み合わせることができる。本開示は、本開示のキメラポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を含むベクター（単一ベクターまたはベクターセット）、かかるベクターを含む宿主細胞、およびかかる宿主細胞を培養して本開示のキメラポリペプチドを発現させる方法を企図している。
Ｖ．処置方法および他の使用方法
本明細書に記載するいずれの方法についても、本開示は、本出願を通して記載する任意のキメラポリペプチドおよび／または組成物の使用を企図している。加えて、本明細書に記載するいずれの方法についても、本開示は、１つの方法の任意のステップ（単数もしくは複数）と別の方法からの任意のステップ（単数もしくは複数）の組み合わせを企図している。
例えば、ＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含む本開示のキメラポリペプチドを本開示の任意の方法で使用することができる。
ある一定の実施形態において、ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡタンパク質の成熟、活性形態（例えば７０ｋＤａ形態もしくは成熟７６ｋＤａ形態）のうちの１つ、またはそれら２つの組み合わせを含むことがある。できる限り多くの細胞小器官および細胞領域／区画を標的化するために、成熟ＧＡＡポリペプチドをＧＡＡの未成熟１１０ｋＤａ形態と併用で投与してもよい。加えて、ＧＡＡの免疫寛容化（ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ）断片、例えばＧＡＡの小断片、および／または免疫抑制化合物の投与と併用で、および／または投与後に、成熟ＧＡＡポリペプチドを投与してもよい。一部の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチド、ならびにＧＡＡポリペプチドからの追加のポリペプチド配列、例えば、前記成熟ポリペプチドと連続する配列も含む。
ある一定の実施形態において、本開示は、培養細胞（インビトロまたはエクスビボ）、および被験体の細胞をはじめとする細胞に、キメラポリペプチドを送達する方法を提供する。培養細胞、例えば健常細胞または疾病モデルからの細胞、への送達には、非常の多く使い道がある。これらの使用には、ＧＡＡ基質もしくは結合パートナーを同定するための使用、（例えば、細胞質、リソソームおよび／または自己貪食小胞への）局在化および／または輸送を評価するための使用、様々な条件（例えば、ｐＨ）下での酵素活性を評価するための使用、グリコーゲン蓄積を評定するための使用などが含まれる。ある一定の実施形態では、健常または疾病状況でのＧＡＡ活性、局在化および輸送を理解するために本開示のキメラポリペプチドを試薬として使用することができる。
被験体への、例えば被験体の細胞への送達には非常に多くの使い道がある。例示的な治療的使用を下で説明する。さらに、診断または研究目的でキメラポリペプチドを使用してもよい。例えば、本開示のキメラポリペプチドを検出可能に標識し、被験体、例えば疾患の動物モデルまたは患者に投与し、そして被験体の組織内のそのキメラポリペプチド（例えば、筋肉および／または肝臓への局在化）を撮像するために使用してもよい。加えて、例示的使用としては、被験体の細胞への、例えば疾患（例えばポンペ病）の動物モデルへの送達が挙げられる。例として、健常または罹病動物におけるＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するために本開示のキメラポリペプチドを試薬として使用して動物に送達してもよい。
ある一定の実施形態において、本開示は、ＧＡＡの機能不全およびポンペ病に伴う状態を処置する方法を提供する。かかる状態としては、罹患細胞、例えば心筋細胞および骨格筋細胞のリソソーム、細胞質および／または自己貪食小胞へのグリコーゲンの異常蓄積；細胞飢餓；微小管構造の崩壊；リソソーム数および／またはサイズの増加、リソソームの破裂；自己貪食成分を含む細胞破壊片の蓄積；ミトコンドリア構造の破壊；細胞膨張；運動ニューロン疾患；筋衰弱；進行性筋肉減少；骨格筋、呼吸筋および／または心筋損傷；ならびに早期死亡が挙げられるが、それらに限定されない。ポンペ病の一部の症状は、患者が長期間、例えば６カ月以上にわたって機能性ＧＡＡなしにまたは減少したＧＡＡレベルで生きてしまうまで顕在化しない。これらの場合、患者の細胞のリソソームのみならず細胞質および自己貪食空胞にもグリコーゲンが蓄積するための追加の時間があり、その結果、上で説明したような細胞および細胞小器官機能の破壊が誘発されてしまう。疾患がこのステージに進行すると、ＧＡＡをリソソームに標的化する旧来の酵素補充療法は、もはや有効でないことがあり、またはその状態を処置するには不十分であることがある。したがって、一部の実施形態において、本開示の成熟ＧＡＡポリペプチドの投与は、成熟ＧＡＡを含むポリペプチドを罹患細胞の細胞質に標的化し、細胞質および／または自己貪食空胞へのグリコーゲンの蓄積に伴う症状を処置する。
ある一定の実施形態において、これらの方法は、治療有効量の上記のキメラポリペプチド（例えば、（ｉ）ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ部分と（ｉｉ）内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチド）の個体への投与を含む。これらの方法は、動物およびより詳細にはヒトの治療的および予防的処置を特に目的とする。ポンペ病のための方法については、本開示は、任意の上述の態様および実施形態の組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」に記載の任意の実施形態との組み合わせすべてを企図している。
本開示は、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ２）経路により細胞にキメラポリペプチドまたは核酸構築物を送達する方法であって、細胞をキメラポリペプチドまたは核酸構築物と接触させるステップを含む方法を提供する。ある一定の実施形態において、前記方法は、細胞とキメラポリペプチドを接触させるステップを含み、このキメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片と、ＥＮＴ２経路による細胞膜を横断する輸送を媒介し、その結果、そのキメラポリペプチドを細胞へ送達する内在化モイエティとを含む。ある一定の実施形態において、前記細胞は筋肉細胞である。本請求項記載の方法を用いて標的化される筋肉細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞を含み得る。他の実施形態では、前記キメラポリペプチドを肝臓に送達する。
本開示は、筋肉細胞以外の細胞への出入りを可能にする経路によってキメラポリペプチドまたは核酸構築物を細胞に送達する方法を提供する。本願に記載の方法を用いて標的化され得る他の細胞タイプとしては、例えば、肝臓細胞、ニューロン、上皮細胞、子宮細胞および腎臓細胞が挙げられる。
ＧＡＡ機能不全およびポンペ病に伴う状態は多岐にわたる。ポンペ病は、罹患組織の重度の機能不全につながる、多くの組織、しかし主として骨格筋および心筋、へのグリコーゲンの大量蓄積を特徴とする。疾患症状は、進行性である。早期発症型の前記疾患は、乳児において緊張低下と全身性筋衰弱の組み合わせ、例えば、ヘッドラグまたは「フロッピーベビー」外観として臨床的に顕在化する。心肥大がすべての乳児患者の推定９２〜９５％に現れ、心不全が起こることも多い。横隔膜の衰弱に起因する呼吸不全は一般的であり、乳児が摂食困難を呈することもある。処置をしないと、通常、乳児は生まれて２年以内に死亡する。
若年および成人発症型の前記疾患の場合、症状としては、筋骨格機能不全、例えば、筋衰弱、歩行異常、筋肉痛、頻繁な転倒、咀嚼困難；横隔膜および他の呼吸筋の衰弱に起因する呼吸器系合併症；心臓の異常、例えば不整脈；ならびに胃腸の問題、例えば嚥下または摂食困難が挙げられる。患者は、呼吸器系合併症が進行して人工呼吸器に依存することになることもあり、または運動機能が低下して車椅子に依存することになることもある。
用語「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味するために本明細書では用いている。状態または疾患を「処置すること」は、その状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒ならびに改善することを指し、および組成物の投与であって、その組成物を受けていない被験体と比較して、それを必要とする被験体の医学的状態の症状の頻度を低減させるか、または前記医学的症状の発症を遅延させる組成物の投与を含む。本明細書において用いる場合の「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置を包含し、（ａ）その疾患もしくは状態の素因を有するかもしれないが、まだ症状を経験し始めていない被験体においてその疾患もしくは状態の症状の発症を予防すること；（ｂ）その疾患もしくは状態を抑制すること（例えば、その発現を阻止すること）；または（ｃ）その疾患もしくは状態を寛解すること（例えば、その疾患もしくは状態の退行を生じさせること、１つ以上の症状の改善をもたらすこと）を含む。例えば、ポンペ病の「処置」は、この疾患の完全回復もしくは治癒、またはポンペ病に帰する症状および／もしくは有害作用の任意の範囲の改善を包含する。単なる例証だが、ポンペ病の「処置」は、ＧＡＡの機能不全に伴う次の作用のいずれか（またはそれらの組み合わせ）の改善を含む：ＧＡＡ活性減少（例えば、処置はＧＡＡ活性を増加させる）、細胞へのグリコーゲン蓄積（例えば、処置はグリコーゲン蓄積を減少させる）、クレアチンキナーゼレベル増加、尿中グルコース四糖類の上昇、心臓の大きさの縮小、肥大性心筋症、呼吸器系合併症、人工呼吸器への依存、筋肉機能不全および／または衰弱、運動機能喪失、車椅子または他の形の移動介助への依存、まっすぐ座るための首または腹部支持具への依存、筋線維の超微細構造の損傷、筋緊張および機能の喪失。これらの症状のいずれの改善も、当該技術分野において公知の標準的方法および技術に従って容易に評定することができる。上に挙げていない他の症状も、ポンペ病の処置の有効性を判定するためにモニターしてよい。本開示の方法によって処置される被験体の集団は、望ましくない状態または疾患に罹患している被験体、ならびにその状態または疾患を発現するリスクがある被験体も含む。ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡキメラポリペプチドの投与には次のいずれか１つ以上の効果があり得る：細胞の細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる、筋肉細胞の細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる、肝臓細胞の細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる、ニューロンの細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる、細胞のリソソームへのグリコーゲンの蓄積を減少させる、筋肉細胞のリソソームへのグリコーゲンの蓄積を減少させる、肝臓細胞のリソソームへのグリコーゲンの蓄積を減少させる、ニューロンのリソソームへのグリコーゲンの蓄積を減少させる、細胞の自己貪食空胞へのグリコーゲンの蓄積を減少させる、筋肉細胞の自己貪食空胞へのグリコーゲンの蓄積を減少させる、肝臓細胞の細胞質への自己貪食空胞の蓄積を減少させる、ニューロンの自己貪食空胞へのグリコーゲンの蓄積を減少させる、上昇したアラニントランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を減少させる、上昇したアスパラギン酸トランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を減少させる、上昇したアルカリホスファターゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を減少させる、および／または上昇したクレアチンホスホキナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を減少させる。上に記載したまたは本明細書に記載する任意のＧＡＡキメラポリペプチドを本明細書に記載する任意の方法で使用してよいことに留意すべきである。
ある一定の実施形態において、処置を必要とする被験体は、乳児型のポンペ病を有する被験体である。他の実施形態において、処置を必要とする被験体は、若年発症型のポンペ病を有する被験体である。
用語「治療有効用量」は、投与される目的である所望の効果を生じさせる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存することになり、当業者は公知の技術を用いてそれを突き止めることができよう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
ある一定の実施形態では、本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを一緒に（同時に）投与することができ、または異なる時点で（逐次的に）投与することができる。加えて、本開示のキメラポリペプチドを単独で投与することができ、またはポンペ病を処置するための１つ以上の追加の化合物または療法と併用で投与することができる。例えば、１つ以上のキメラポリペプチドを１つ以上の他の治療化合物とともに併用投与することができる。一部の実施形態では、前記１つ以上のキメラポリペプチドをアルグルコシダーゼアルファ（マイオザイム、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともに併用投与することができる。併用投与が指示される場合、その併用療法は、同時投与または交互投与を包含し得る。加えて、前記併用は、急性投与または慢性投与を包含し得る。場合により、本開示のキメラポリペプチドと追加の化合物がポンペ病の処置に相加的または相乗的に作用する。併用療法で使用することになる追加の化合物としては、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。併用療法の性質に依存して、本開示のキメラポリペプチドの投与を、他の療法が投与されている間、および／またはその後、続けてよい。前記キメラポリペプチドの投与を単回用量で行ってもよいし、または複数回用量で行ってもよい。ある場合には、前記キメラポリペプチドの投与を他の療法の少なくとも数日前に開始するが、他の場合には、投与を、他の療法の投与直前にまたは他の療法の投与と同時に開始する。
１つのタイプの併用療法は、筋肉合成および／または脂肪低減を促進する分子を使用する。筋肉組織を構築するために、および脂肪浸潤を低減させるために、分子、例えば、ＩＧＦ−１、成長ホルモン、ステロイド、β−２アゴニスト（例えば、クレンブテロール）およびミオスタチン阻害剤を患者に投与してもよい。これらの分子は、ＥＮＴ２レベルも上昇させ得る。したがって、前記分子は、成熟ＧＡＡポリペプチドでの処置を始める前に投与してもよいし、成熟ＧＡＡポリペプチドでの処置と処置の間に投与してもよいし、または成熟ＧＡＡポリペプチドでの処置後に投与してもよい。
併用療法のもう１つの例では、１つ以上の追加の処置法と組み合わせた治療レジメンの一部として本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを使用することができる。例として、かかる他の処置法としては、食事療法、作業療法、物理療法、人工呼吸器支持療法、マッサージ、鍼療法、指圧療法、移動補助、介助動物などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載するキメラポリペプチドを他の療法と併用することができるが、ある一定の実施形態では、キメラポリペプチドを単独形態の治療として提供することに留意されたい。単独で投与するのか、または他の薬物療法もしくは治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）と併用で投与するのかにかかわらず、前記キメラポリペプチドの投薬量、投与頻度、投与経路、および投与のタイミングは、患者の状態および必要に基づいて医師により決定される。
本開示のキメラポリペプチドには、インビボおよびインビトロ使用を含めて、非常に多くの使い道がある。インビボ使用は、治療的使用のみならず、例えば上述の動物モデルのいずれかにおける診断的および研究的使用も含む。例として、健常または罹病動物におけるＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するために本開示のキメラポリペプチドを研究試薬として使用して動物に送達してもよい。
例えば、健常およびＧＡＡ欠乏培養細胞をはじめとする培養細胞においてＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、ならびに酵素活性を評価するために、キメラポリペプチドをインビトロで使用してもよい。本開示は、本開示のキメラポリペプチドが、培養細胞をはじめとする細胞の細胞質、リソソームおよび／または自己貪食小胞にＧＡＡを送達するために使用され得ることを企図している。
ＶＩ．遺伝子療法
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて、成熟ＧＡＡのポリペプチドおよび／または成熟ＧＡＡを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入することができる。ある一定の実施形態において、本明細書に記載する方法で使用するためのキメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドを含むが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドと連続する配列を含めて、ＧＡＡポリペプチドからの追加のポリペプチド配列も含む。かかる方法を用いて、本開示のポリペプチド（例えば成熟ＧＡＡ（その変異体を含む）；およびキメラポリペプチドを含む）をコードする核酸を細胞にインビトロで投与することができる。本開示は、本開示のキメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドのいずれかをコードする核酸を送達するために遺伝子導入法を用いることがあることを企図している。一部の実施形態では、成熟ＧＡＡをコードする核酸をインビボまたはエクスビボ遺伝子療法用途のために投与する。他の実施形態では、健常もしくは罹病細胞および組織への送達後に、キメラポリペプチドもしくはＧＡＡポリペプチドの活性を研究するために、または細胞ベースのモデルもしくは動物モデルにおいてポンペ病を研究するために、例えば、細胞輸送、酵素活性およびタンパク質間相互作用を評価するために、遺伝子送達技術を用いる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。かかる方法は、当該技術分野において周知である。
本開示の改変ポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増進ＤＮＡ取り込みが挙げられる。リポフェクション法およびリポフェクション試薬は当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞へのもの（エクスビボ投与）または標的組織へのもの（インビボ投与）である場合がある。免疫脂質複合体などの標的化リポソームをはじめとする脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である。
成熟ＧＡＡまたはその変異体をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特異的細胞に標的化するため、およびウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターを直接患者に（インビボ）投与することができ、またはウイルスベクターを使用して細胞をインビトロで処置することができ、修飾された細胞を患者に（エクスビボ）投与する。本開示のポリペプチドの送達のための従来のウイルスベースの系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純疱疹ウイルスベクターを挙げることができよう。ウイルスベクターは、標的細胞および組織内への遺伝子導入の現在最も効率的かつ用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。加えて、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織で観察されている。
外来エンベロープタンパク質を組み込むことによってレトロウイルスの親和性を変更し、それによって標的細胞の潜在的標的集団を増やすことができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するまたは感染させることができ、かつ典型的に高ウイルス力価を生じさせることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまたはそれ未満の外来配列に対するパッケージング容量を有するシス作用性長鎖末端反復配列から成る。前記最小シス作用性ＬＴＲは、これらのベクターの複製およびパッケージングに十分なものであり、したがって、これらのベクターは、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永久導入遺伝子発現をもたらすために使用される。広範に用いられているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬ Ｖ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬ Ｖ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＷ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくものおよびこれらの組み合わせが挙げられ、これらのすべてが当該技術分野において周知である。
本開示のポリペプチドの一過性発現が好ましい応用例では、アデノウイルスベースの系を典型的に使用する。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプにおいて非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い発現力価およびレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、標的核酸を細胞に形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために使用される。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）をはじめとする多数の出版物に記載されている。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の極めて重要な特徴である。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ３遺伝子を置換するように改変することができ；その後、その複製デフェクターベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｏｒ ｖｅｃｔｏｒ）を、欠失した遺伝機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖させる。Ａｄベクターは、非分裂性分化細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉系組織において見いだされるものを含めて、複数の組織タイプにインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持容量を有する。
パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージする４２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージするプロデューサー細胞系統によって産生される。前記ベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みのために必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、タンパク質を発現するための発現カセットによって置換される。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系統によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要とされるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列しか典型的には有さない。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐ、をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系統にパッケージされる。この細胞系統もまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため有意な量ではパッケージされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、アデノウイルスの方がＡＡＶより敏感である熱処理によって低減させることができる。
多くの遺伝子療法応用例では、遺伝子療法ベクターを特定の組織タイプに対して高い特異度で送達することが望ましい。ウイルスベクターは、典型的に、ウイルスの外面にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより所与の細胞タイプに対して特異性を有するように修飾される。目的の細胞タイプ上に存在することが公知の受容体に対して親和性を有するリガンドが選択される。この原理を、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスと受容体を発現する標的細胞の他のペアに拡大することができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように糸状ファージを改変することができる。上の説明は主としてウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに当てはめることができる。かかるベクターを、筋肉細胞などの特定の標的細胞による取り込みに有利であると考えられる特定の取り込み配列を含有するように改変することができる。
遺伝子療法ベクターを、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターをエクスビボで細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能供血者造血幹細胞に送達し、その後、通常はベクターを組み込まれた細胞を選択した後、それらの細胞を患者に再び内植することができる。
診断、研究のための、または遺伝子療法のための（例えば、トランスフェクト細胞の宿主生物への再注入による）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。例えば、細胞を被験体生物から単離し、例えば成熟ＧＡＡまたはその変異体をコードする核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、そして被験体生物（例えば患者）に再び注入して戻す。エクスビボトランスフェクションに適する様々な細胞タイプが当業者に周知である。
ある一定の実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボ手順において幹細胞を使用する。幹細胞を使用する利点は、それらを他の細胞タイプにインビトロで分化させることができること、またはそれらが骨髄に外植されることになる哺乳動物（例えば、細胞のドナー）にそれらを導入することができることである。公知の方法を用いて遺伝子導入および分化のために幹細胞を単離する。
治療用核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）をインビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される任意の経路による。かかる核酸の適する投与方法を利用でき、前記方法は当業者に周知であり、および１つより多くの経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路が別の経路より即時的かつ有効な反応をもたらすことができることがしばしばある。
薬学的に許容され得る担体は、一部は、投与される特定の組成物によって、ならびにその組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決まる。したがって、本明細書に記載するように、本開示の医薬組成物の多種多様な適する製剤がある。
ＶＩＩ．投与方法
様々な送達系が公知であり、本開示のキメラポリペプチドを投与するためにそれらを使用することができる。任意のかかる方法を用いて、本明細書に記載する任意のキメラポリペプチドを投与してよい。導入方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、心筋内、静脈内、皮下、肺、鼻腔内、眼内、硬膜外および経口経路を含むがこれらに限定されない、経腸的または非経口的なものであり得る。前記キメラポリペプチドを任意の適便な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）による吸収によって投与してよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身性または局所性であることができる。
ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを静脈内投与する。
ある一定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、処置を必要とするエリア（例えば筋肉）に局所的に投与することが望ましいこともある；これは、例えば、限定としてではないが、外科手術中の局所注入によって、カテーテルによって、またはインプラントによって達成することができ、前記インプラントは、膜、例えばサイラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、繊維または市販の代用皮膚を含む、多孔質、無孔またはゲル状材料のものである。
別の実施形態において、かかる局所投与は、心臓のすべてまたは一部分への局所のものであり得る。例えば、心膜内または心筋内投与によって投与することができる。同様に、心臓の様々な領域への薬剤の送達を意図したカテーテル、ワイヤなどを使用して、心臓組織への投与を達成することができる。
別の実施形態では、局所投与を肝臓に向けたものである。肝臓内のグリコーゲン貯蔵およびグリコーゲン分解は、体内の多くの他の組織のグリコーゲンの利用能に影響を及ぼす。例えば、静脈カテーテルを肝門脈に配置してキメラポリペプチドを肝臓に直接送達してもよい。加えて、キメラポリペプチドの内在化モイエティが他の細胞タイプより肝臓細胞に対して低い親和性を示す一部の実施形態では、肝門脈による送達によって適正な濃度の成熟ＧＡＡが確実に肝臓細胞に到達する。
本開示がキメラポリペプチドを同時にまたは異なる時点で、１つ以上の投与経路によって投与する方法を企図していることに留意されたい。例えば、本開示は、キメラポリペプチドを全身に、例えば静脈内注入によって、肝門脈経由の局所投与と併用で投与するレジメンを企図している。
他の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを小胞で、特にリポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。さらに別の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを制御放出系で送達することができる。別の実施形態では、ポンプを使用することもある（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、上掲を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。ある一定の特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを静脈内送達することができる。
ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを静脈内注入によって投与する。ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも３０分間にわたって注入する。他の実施形態では、前記キメラポリペプチドを少なくとも６０、９０または１２０分間にわたって注入する。注入期間にかかわらず、本開示は、各注入が、キメラポリペプチドを規則的なスケジュール（例えば、週１回、月１回など）に従って投与する総合的な処置計画の一部であることを企図している。
上述は、本明細書に記載するキメラポリペプチド、組成物および方法のいずれにも当てはまる。本開示は、かかるキメラポリペプチド、組成物および方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、この節に記載する様々な医薬組成物および投与経路について記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
ＶＩＩＩ．医薬組成物
ある一定の実施形態では、本開示の対象キメラポリペプチドを、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化する。１つ以上のキメラポリペプチドを単独でまたは医薬製剤（組成物）の成分として投与することができる。本明細書に記載するいずれのキメラポリペプチドも本明細書に記載するように製剤化してよい。ある一定の実施形態において、前記組成物は、本開示の２つ以上のキメラポリペプチド、例えば、約７０ｋＤａの成熟ＧＡＡを含むキメラポリペプチド、および約７６ｋＤａの成熟ＧＡＡを含むキメラポリペプチドを含む。ヒトまたは獣医学での使用のための任意の適便な方法で投与するために前記キメラポリペプチドを製剤化してよい。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も前記組成物中に存在することができる。
対象キメラポリペプチドの製剤は、例えば、経口、鼻、局所、非経口、直腸および／または膣内投与に適しているものを含む。前記製剤を単位剤形で適便に提供してよく、および薬学技術分野において周知の任意の方法によって調製してよい。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、処置される宿主、および特定の投与方式に依存して変わることになる。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物の量であろう。
ある一定の実施形態において、これらの製剤または組成物を調製する方法は、別のタイプの治療剤および担体、ならびに場合により１つ以上の補助成分を併せる工程を含む。一般に、液体担体、または微粉固体担体、または両方を用いて製剤を調製し、その後、必要に応じて生成物を成形する。
経口投与用の製剤を、各々が所定量の対象キメラポリペプチド治療剤を活性成分として含有する、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（香味基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香剤（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムを使用）として、および／またはマウスウォッシュなどとして投与してよい。懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含有することがある。
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣丸、粉末、顆粒など）の場合、本開示の１つ以上のキメラポリペプチド治療剤を、１つ以上の薬学的に許容され得る担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または次のもののいずれかと混合してもよい：（１）フィラーまたは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、医薬組成物は、緩衝剤も含むことがある。同様のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して軟充填カプセルおよび硬充填カプセル中の充填物として利用してもよい。経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、前記液体剤形は、当該技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｙｌ）アルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有することがある。不活性希釈剤に加えて、前記経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤も含むことができる。
ある一定の実施形態において、本開示の方法は、皮膚、または粘膜、例えば子宮頚および膣上の粘膜、いずれかへの局所投与を含む。局所製剤は、皮膚または角質層浸透増進剤として有効であることが公知の広範な薬剤の１つ以上をさらに含むことがある。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドおよびアゾンである。前記製剤を化粧品として許容され得るものにするために追加の薬剤をさらに含むことがある。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、着香剤、保存剤、安定剤および界面活性剤である。当該技術分野において公知のものなどの角質溶解剤も含むことがある。例は、サリチル酸および硫黄である。局所または経皮投与用の剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が挙げられる。対象ポリペプチド治療剤を薬学的に許容され得る担体と、および必要とされ得る保存剤、緩衝剤または噴射剤と無菌条件下で混合してもよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、対象キメラポリペプチド剤に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有することがある。粉末およびスプレーは、対象キメラポリペプチドに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレーは、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを追加で含有することができる。
非経口投与に適する医薬組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、その製剤を所期のレシピエントの血液と等張にさせる溶質、または懸濁化もしくは増粘剤を含有し得る１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末との組み合わせで、１つ以上のキメラポリペプチドを含むこともある。本開示の医薬組成物において用いてもよい、適する水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適する混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含有することがある。微生物の作用の予防を、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実なものにしてもよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましいこともある。加えて、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用医薬剤形の持続性吸収をもたらしてもよい。
注射用デポー形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中の１つ以上のポリペプチド治療剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬物を捕捉することによっても調製される。
好ましい実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、日常的手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化する。必要な場合には、前記組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬も含むことがある。前記組成物を注入によって投与すべき場合、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている輸液ボトルでそれを投薬することができる。前記組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合してもよいように注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
別の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドをヒトへの皮下投与用に製剤化する。
ある一定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを心臓への送達用に、例えば心筋内または心膜内送達用に製剤化する。
ある一定の実施形態では、前記組成物は、肝門脈経由での肝臓への局所投与を意図したものであり、それに応じてそのキメラポリペプチドを製剤化する。
ある一定の実施形態では、特定の製剤が１つより多くの経路による送達という状況での使用に適していることに留意されたい。したがって、例えば、静脈内注入に適する製剤は、肝門脈経由での送達にも適していることがある。しかし、他の実施形態において、製剤は、１つの送達経路という状況での使用に適しているが、第二の送達経路という状況での使用には適していない。
組織関連状態または疾患（例えば、ポンペ病）の処置に有効であろう本開示のキメラポリペプチドの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投薬範囲の特定に役立つようにインビトロアッセイを場合により用いてもよい。製剤に用いる正確な用量は、投与経路およびその状態の重症度にも依存することになり、施術者の判断および各被験体の状況に従ってその正確な用量を決定すべきである。しかし、静脈内投与の適する投薬範囲は、一般に、体重１キログラムにつき約２０〜５０００マイクログラムの活性キメラポリペプチドである。鼻腔内投与の適する投薬範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。インビトロまたは動物モデル試験系から導出された用量−応答曲線から有効用量を推定してもよい。
ある一定の実施形態において、医薬調製物を含めて、本開示の組成物は、非発熱性である。言い換えると、ある一定の実施形態において、前記組成物は、実質的に発熱物質不含である。１つの実施形態において、本開示の製剤は、エンドトキシンおよび／または関連発熱物質が実質的にない発熱物質不含製剤である。エンドドキシンは、微生物内に閉じ込められている毒素であり、微生物が破壊されるか、死滅したときにのみ放出される毒素を含む。発熱物質は、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘起性、熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これら両方の物質は、ヒトに投与されると発熱、低血圧およびショックを惹き起こす場合がある。潜在的有害作用のため、少ないエンドトキシン量であっても静脈内投与される医薬薬物溶液から除去しなければならない。米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静注薬物適用について１回１時間で体重１キログラムにつき５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を比較的多い投薬量でおよび／または長期間にわたって（例えば、患者の全生涯の間など）投与する場合、たとえ少ない有害かつ危険な内毒素量でも危険であり得る。ある一定の特定の実施形態において、前記組成物中のエンドドキシンおよび発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または５ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）である。
上述は、本明細書に記載するキメラポリペプチド、組成物および方法のいずれにも当てはまる。本開示は、かかるキメラポリペプチド、組成物および方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、この節に記載する様々な医薬組成物および投与経路について記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
ＩＸ．動物モデル
ポンペ病は、ブラーマンとショートホーンのウシ、ラップランド犬、ネコ、ヒツジ、およびニホンウズラ系統などの動物においてモデル化された（Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｑｕａｉｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１（４）：８２７−８３３、１９９８）。加えて、マウスモデルがＧＡＡ遺伝子の標的破壊によって開発された（Ｇｅｅｌら、Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、９２：２９９−３０７、２００７に要約されている）。簡単に言うと、ＧＡＡ遺伝子のエクソン１３のノックアウトを有するマウスは、表現型的には正常のままであるが、肝臓、心臓および骨格筋細胞のリソソームへのグリコーゲン蓄積を示す（Ｂｉｊｖｏｅｔら、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７（１）：５３−６２、１９９８）。ＧＡＡ遺伝子のエクソン６がＬｏｘＰ部位に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子によって置換されたマウスが開発され、当該マウスにはいくつかの組織にＧＡＡ機能がなかった。このマウスはまたＣｒｅを生産するマウスと交雑され、得られた子孫は心臓および骨格筋への異常なリソソームグリコーゲン貯蔵を有した（Ｒａｂｅｎら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｃａｕｓｅｓ ａｎ Ｉｌｌｎｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２（３０）：１９０８６−１９０９２、１９９８）。類似のマウスモデルは、ネオマイシンカセットでのエクソン１４の標的置換を有し、前記ネオマイシン−エクソン６マウスに匹敵する（Ｒａｂｅｎら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄ ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：２８３−２９１、２０００）。免疫応答の問題点に対処するために２つのさらなるマウスモデル、すなわち、肝臓ではＧＡＡ機能を維持するが他の組織では疾患表現型を保持するようにエクソン６欠失を標的にした１つのマウスモデル、およびｈＧＡＡの投与時に抗ｈＧＡＡ抗体を生産しないＳＣＩＤマウスでの１つのＧＡＡノックアウトマウスモデル、が開発された（Ｒａｂｅｎら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｎｚｙｍｅ、ａｃｉｄ ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：１７１−１７８、２００３；Ｘｕら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ、ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＧＳＤ−ＩＩ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：１５８９０−１５９８、２００４）。より最近、グリコーゲン生産減少の効果を判定するのに役立つようにＧＡＡの欠失とグリコーゲンシンターゼ１の欠失を対にする二重ＫＯマウスが開発された（Ｘｕら、Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０８：１３８３−１３８８、２０１０）。
したがって、ある一定の実施形態において、本開示は、任意の１つ以上の動物モデル、例えば、本明細書に記載するマウスモデルにおいて、本明細書に開示する成熟ＧＡＡ構築物（例えば、成熟ＧＡＡを含むキメラポリペプチド）を使用して、疾病表現型の改善を調査する方法を企図している。例として、対象キメラポリペプチドで処置した実験動物において様々なパラメータを検査することができ、かかる動物を対照と比較することができる。潜在的有効度を評価するために評定することができる例示的パラメータとしては、寿命の増加；グリコーゲンクリアランスの増加；グリコーゲン蓄積の減少；アラニントランスアミナーゼ血清レベルの低下；アスパラギン酸トランスアミナーゼ血清レベルの低下；アルカリホスファターゼ血清レベルの低下；クレアチンホスホキナーゼ血清レベルの低下；例えばオープンフィールドおよびオープンワイヤーハングパラダイムでの、筋力向上；肝臓、骨格筋、平滑筋および／または心筋のリソソームにおけるＧＡＡ機能の回復が挙げられるが、これらに限定されない。グリコーゲンクリアランスの増加およびグリコーゲン蓄積の減少を、例えば、処置または未処置動物モデルからの生検材料（例えば、筋肉、肝臓またはニューロン）における過ヨウ素酸シッフ染色によって評定してもよい。
さらに、例えば３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡがこれらの表現型のいずれか１つ以上の改善をもたらすことが確証されたら、３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの有効用量、クリアランス率、分布体積および半減期を決定するための完全な薬物動態研究を決定することができる。最終生成物のＰＫ／ＰＤ／ＴＫをより大きい動物、例えばラット、イヌおよび霊長類で検査することができる。
上記モデルは、対象キメラポリペプチドおよび／または製剤の活性および有効性を評定するための適する動物モデル系の例である。これらのモデルは、ＧＡＡ欠乏の症状と相関があり、したがってポンペ病の研究のための適切なモデルとなる。対象キメラポリペプチドおよび／または製剤の活性をこれらのモデルのいずれか１つ以上において評定することができ、その結果を、野生型対照動物および前記キメラポリペプチドでの処置を受けていない動物において観察された結果と比較することができる。同様に、培養細胞、例えば、上述の突然変異体マウスまたは他の動物のいずれかから調製した細胞、ならびに野生型細胞、例えば線維芽細胞を使用して、対象キメラポリペプチドを評価することができる。加えて、無細胞系を使用して、例えば、対象キメラポリペプチドの酵素活性を評定することができる。本明細書に開示するキメラポリペプチドの活性を試験するためのインビトロアッセイの一例は、前記キメラポリペプチドでまたはなしでポンペ細胞を処置し、そしてその後、ある一定期間のインキュベーション後にそれらの細胞をグリコーゲンの存在について、例えば過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染料を使用することによって、染色するアッセイであろう。本明細書に開示するキメラポリペプチドの活性を試験するためのインビトロアッセイのもう１つの例は、基質としての４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドを加水分解する前記キメラポリペプチドの能力を評定する細胞または無細胞アッセイであろう。
本開示のキメラポリペプチドは、インビトロおよびインビボ使用を含めて、非常に多くの使い道がある。インビボ使用は、治療的使用のみならず、例えば上述の動物モデルのいずれかにおける、診断および研究使用も含む。例として、健常または罹病（ｄｉｓｅａｓｅｓ）動物におけるＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するために本開示のキメラポリペプチドを研究試薬として使用して動物に送達してよい。
例えば、健常およびＧＡＡ欠乏培養細胞をはじめとする培養細胞におけるＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用ならびに酵素活性を評価するためにキメラポリペプチドをインビトロで使用してもよい。本開示は、本開示のキメラポリペプチドが、培養細胞をはじめとする細胞の細胞質、リソソームおよび／または自己貪食小胞にＧＡＡを送達するために使用され得ることを企図している。
Ｘ．キット
ある一定の実施形態において、本開示は、本開示の少なくとも１つのキメラポリペプチドを充填した１つ以上の容器を含む医薬パッケージまたはキットも提供する。場合により、医薬またはバイオ製品の製造、使用または販売を監督する政府機関によって命じられた形式での注意書きがかかる容器（単数または複数）に付随することがあり、この注意書きは、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売についての前記機関による承認、（ｂ）使用説明書、または両方を示す。
ある一定の実施形態において、前記キットは、対象キメラポリペプチドの送達を助長するための追加の材料を含む。例えば、前記キットは、カテーテル、チューブ、輸液バッグ、注射器などのうちの１つ以上を含むことがある。ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを凍結乾燥形態でパッケージし、そのキットは、少なくとも２つの容器、すなわち、凍結乾燥されたキメラポリペプチドを含む容器、ならびに適量の水、緩衝剤、または前記凍結乾燥材料の再構成に適する他の液体を含む容器、を含む。
上述は、本明細書に記載するキメラポリペプチド、組成物および方法のいずれにも当てはまる。本開示は、かかるキメラポリペプチド、組成物および方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、この節に記載する様々なキットについて記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
例示
ここでは本開示を一般的に説明しているが、単に本開示のある一定の態様および実施形態の説明のために含めるものであり、本開示を限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することによって、本開示は、より容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示する個々の構築物および実験設計は、適正な機能を検証するための例示的ツールおよび方法の代表である。したがって、開示する特定の構築物および実験計画のいずれも、本開示の範囲内で置換できることは、容易にわかるであろう。
実施例１
３Ｅ１０とヒト成熟ＧＡＡの化学的結合体化（ｍＡｂ３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ）
化学的結合体化
この実施例では、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルおよびトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロ−ヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルという２つの異なるヘテロ二官能性試薬を使用して、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む１０ミリグラム（１０ｍｇ）の例示的３Ｅ１０抗原結合断片（例えば、ＶＨおよびＶＬドメインがリンカーによって相互接続されているｓｃＦｖなど）を、７６ｋＤａもしくは７０ｋＤａ成熟ヒトＧＡＡに、または成熟ヒトＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドに、１／１モル比で直接または間接的に共有結合で結合体化させる。この反応は、３Ｅ１０のリジン残基を修飾してチオールにし、チオール反応性マレイミド基を成熟ＧＡＡに付加させる（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｊｕｎ １；１６４（１１）：６０２０−６）。脱保護後、各修飾タンパク質を互いに反応させて、安定したチオエーテル結合を生じさせる。化学的結合体化を行い、生成物をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画する。それらの画分の組成を還元および非還元環境でネイティブＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評定する。３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ結合体の遊離３Ｅ１０および遊離成熟ＧＡＡに対する最大比を含有する画分をプールし、後の研究での使用に選択する。
同様に、３Ｅ１０の抗原結合部分（例えば、一本鎖Ｆｖ断片）または完全長３Ｅ１０または３Ｅ１０ Ｆａｂが、成熟ＧＡＡポリペプチド、例えば約７０〜７６ｋＤａの分子量を有する成熟ＧＡＡポリペプチド（例えば、ＧＡＡの成熟、活性形態）または代替開始残基および／もしくは終了残基を使用する類似の形態に、または成熟ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチドに結合体化されている結合体を作製する。他の例示的結合体としては、内在化モイエティが完全長３Ｅ１０ ｍＡｂであるか、その変異体であるか、または前述のものの抗原結合断片である、結合体が挙げられる。上述の方法を用いて、ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含む化学的結合体を作製することができ、前述のものは単なる例である。Ｎ末端およびＣ末端結合体（例えば、３Ｅ１０部分が成熟ＧＡＡ部分のＮ末端側にある結合体、および３Ｅ１０部分が成熟ＧＡＡ部分のＣ末端側にある結合体）両方を作製する。さらに、本明細書中で詳述する実験アプローチを用いて、任意のかかるキメラポリペプチドを評価することができ、またはキメラポリペプチド間で活性を比較することができる。
化学的に結合体化された３Ｅ１０と成熟ＧＡＡのインビトロ評定
結合体化Ｆｖ３Ｅ１０−成熟ＧＡＡキメラポリペプチドおよび適する対照ポリペプチドの調製物を表１に要約する。収載されているキメラポリペプチドは、単に説明のためのものであり、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含む本開示の任意のキメラポリペプチドも同様に企図している。対象キメラポリペプチドを、例えば細胞培養物に添加し、タンパク質取り込み度、タンパク質局在化および／またはＧＡＡ酵素活性を判定し、対照と比較する。同様に、ＧＡＡ酵素活性を無細胞系で評定することができる。この実施例では内在化モイエティ部分とＧＡＡ部分を化学的に結合体化させるが、個々の部分各々を（例えば、培養細胞において前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させ、発現されたポリペプチドを精製することによって）組換えにより作製してもよいことに特に言及しておく。
Figure 2016514096
ｉ）３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの酵素活性
ＭｃＶｉｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．、９４（４）：４４８−４５５、２００８）によって記載されたように、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ４．３中での合成基質、ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−α−グルコピラノシド、の３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ触媒加水分解の速度を判定することにより、ＧＡＡ酵素活性を測定する。放出された発色団、ｐ−ニトロフェノール、をアルカリ性ｐＨ（＞１０．２）で、４００ｎｍで、分光光度法により定量する。１成熟ＧＡＡ単位を、３７℃、アッセイ条件下で毎分１μｍｏｌの基質の加水分解をもたらす活性の量と定義する。Ｆｖ３Ｅ１０と成熟ＧＡＡ、Ｆｖ３Ｅ１０のみ、または成熟ＧＡＡのみについて二重反復実験を行う。
ｉｉ）３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの取り込み
３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの取り込みを先ずＣＯＳ−７細胞において評定する。以前の研究は、ＥＮＴ２がＣＯＳ−７細胞膜を横断する３Ｅ１０輸送に関与することを示しており（Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：２０７９０−２０７９３、２００７）、同様の戦略を用いて、膜を横断するキメラ３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの輸送を判定することができる。簡単に言うと、１０％ウシ胎仔血清を伴うＰＢＳ中で精製キメラポリペプチドを調製する。対照緩衝液は、１０％ウシ胎仔血清を伴うＰＢＳである。５０μＬの対照緩衝液または３Ｅ１０−成熟ＧＡＡをＣＯＳ−７細胞に添加し、１時間インキュベートする。緩衝液を吸引し、細胞を洗浄し、冷却１００％エタノールで固定し、３Ｅ１０に対する抗体またはＧＡＡに対する抗体いずれかで染色する。
筋肉細胞もＦｖ３Ｅ１０−成熟ＧＡＡポリペプチドを取り込むことを実証するために、同じ実験を筋肉細胞で行う。マウス心筋細胞ＨＬ−１細胞系統はＥＮＴ２を発現する（Ｎａｙｄｅｎｏｖａら、Ｉｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ＨＬ−１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９４（６）：Ｈ２６８７−２６９２、２００８）。この細胞系統を上記実験においてＣＯＳ−７細胞の代わりに使用することができる。
ＭＥＭ／ＦＢＳ培地を使用してＴ−７５フラスコの中でヒトポンペ線維芽細胞（ＴＲ４１９２）を集密になるまで成長させる。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、９６ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）でプレーティングする。プレートを一晩、３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、Ｆｖ３Ｅ１０と成熟ＧＡＡ、Ｆｖ３Ｅ１０のみ、または成熟ＧＡＡのみの試料（各々を三重反復でアッセイしたもの）を還元血清培地（ＭＥＭ／１％ＦＢＳ）で希釈し、細胞に添加する。３７℃での２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ／１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加して溶解し、−８０℃で凍結させる。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）を使用するタンパク質決定アッセイおよび（ＧＡＡの基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドを使用する）活性分析を、それらの細胞溶解産物に関して行って、細胞による成熟ＧＡＡ取り込み度を判定する（ＭｃＶｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅａｓｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．、９４（４）：４４８−４５５、２００８）。
ｉｉｉ）細胞透過性３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの免疫ブロット検出
追加の試験を行って、野生型マウスまたはＧＡＡ ＫＯマウスのいずれかから単離した筋線維における３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの取り込みを判定する（Ｂｉｊｖｏｅｔら、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７（１）：５３−６２、１９９８）。ＷＴおよびＧＡＡ−ＫＯマウスから屠殺直後に白色腓腹筋（Ｇ）、前脛骨筋（ＴＡ）および長指伸筋（ＥＤＬ）筋肉を除去し、１時間の０．１Ｍリン酸緩衝液中の２％パラホルムアルデヒドでの固定、続いて６分間のメタノール（−２０℃）中での固定のためにシルガードコートディッシュにピンで留める（Ｆｕｋｕｄａら、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ Ｍｉｓ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、１４（６）：８３１−８３９、２００６）。手動で裂くことによって単一線維を得る。
１０から１００μＭの化学的結合体化３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ、Ｆｖ３Ｅ１０と成熟ＧＡＡの未結合体化混合物、Ｆｖ３Ｅ１０のみ、または成熟ＧＡＡのみを、単離された筋線維とともに培養する。３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの添加直前の、ＥＮＴ２トランスフェクト細胞へのニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）、ＥＮＴ２特異的阻害剤（Ｈａｎｓｅｎら、２００７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２（２９）：２０７９０−３）の添加によって、ＥＮＴ２トランスポーターに対する３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの特異性を検証する。８から２４時間後、免疫ブロットおよびグリコーゲンについての過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色のために筋線維を回収する。
筋線維を回収し、５００ｕＬ ＰＢＳに再懸濁させ、溶解し、３Ｅ１０および成熟ＧＡＡの免疫ブロット分析のために上清を回収する。ある一定の実施形態ではエピトープタグ付を利用しないことになり、したがって、３Ｅ１０のみおよびＧＡＡのみの対照に対する３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ処置細胞における（完全長３Ｅ１０＋７６ｋＤａ ＧＡＡまたは完全長３Ｅ１０＋７０ｋＤａ ＧＡＡについての）約１５０〜１５６ｋＤａの一致した抗３Ｅ１０および抗ＧＡＡ免疫反応性バンドの存在は、化学的結合体化３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡの透過成功を構成する。チューブリン検出をローディング対照として用いる。
加えて、処置細胞のカバーガラスを洗浄し、１００％エタノールで固定し、再び水和させ、以前に記載された抗体（Ｆｕｋｕｄａら、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ Ｍｉｓ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、１４（６）：８３１−８３９、２００６）で３Ｅ１０および成熟ＧＡＡを検出する。
それぞれの組織を凍結させ、均質化し、遠心分離して不溶性タンパク質を除去し、上清のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイによって測定する。同量のタンパク質を１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル中で電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写し、ウサギ抗ヒトＧＡＡポリクローナル抗体でプローブする。結合抗ＧＡＡ抗体の検出をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって可視化する。
ｉｖ）組織グリコーゲン含有量
処理した野生型マウスおよびＧＡＡ ＫＯマウスからの筋線維を９５％エタノール中の５％ホルムアルデヒドで５分間、室温で固定する。ＭｃＶｉｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅａｓｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．、９４（４）：４４８−４５５、２００８）に記載されているような高分解能光学顕微鏡法およびコンピュータ支援組織形態計測を用いてグリコーゲン含有量を評価する。簡単に言うと、筋肉組織の代表試料を０．２ｍｏｌ／Ｌ カコジル酸ナトリウム緩衝液中の３％グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州フォートワシントン）で固定し、エポン−アラルダイトに包埋する。１マイクロメートル切片を過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）反応で染色し、リチャードソン溶液で対比染色する。これは、グリコーゲンが完全に保持され、筋細胞細胞質の青色対比染色に対して紫色に見える、質の高い組織保存という結果になる。各スライドガラスからの１つの代表視野をＮｉｋｏｎ ＤＸＭ１２００デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｃ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ、ニューヨーク州メルヴィル）で撮影し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン４．６；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して解析する。画像ごとにグリコーゲン負荷量が全組織面積の百分率として表示されることになる。
実施例２
ｆｖ３Ｅ１０とヒト成熟ＧＡＡの遺伝子構築物（Ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ）
Ｆｖ３Ｅ１０とヒトＧＡＡの２つの成熟形態のうちの１つ（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドなど）との遺伝子融合体（成熟ＧＡＡに例えばＧＳ３リンカーによって融合されたｍＡｂ ３Ｅ１０のｓｃＦｖを含む、ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ）をコードする哺乳動物発現ベクターを産生することになる。本実施例において、本発明者らは、３Ｅ１０のｓｃＦｖを指すために「Ｆｖ３Ｅ１０」を用いていることに留意されたい。これらの遺伝子融合体を組換え結合体または組換え生産結合体とも呼ぶことに留意されたい。他のリンカーを同様に使用してもよい。さらに、３Ｅ１０モイエティと成熟ＧＡＡモイエティが直接融合しているリンカーなしの融合体も使用してよい。同様に、完全長抗体またはＦａｂの一部分への融合体を作製してもよい。化学的結合体と同様に、本開示のキメラポリペプチドのいずれかを含む組換え融合体を企図している。組換え生産キメラポリペプチドは、本開示によるＧＡＡポリペプチド部分（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド）と本開示による内在化モイエティ部分とを含むことがある。
後の試験のために追加の組換え生産結合体を同様に作製することになる。非限定的な例として：（ａ）成熟ＧＡＡ−ＧＳ３−３Ｅ１０、（ｂ）３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ、（ｃ）成熟ＧＡＡ−ＧＳ３−Ｆｖ３Ｅ１０、（ｄ）成熟ＧＡＡ−３Ｅ１０、（ｅ）３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ、（ｆ）成熟ＧＡＡ−Ｆｖ３Ｅ１０。本実施例を通して、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖを指すために略語Ｆｖを用いていることに留意されたい。同様に、ｍＡｂ ３Ｅ１０および３Ｅ１０を交換可能に用いている。同様に、成熟ＧＡＡは、約７６ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子量を有する成熟ＧＡＡタンパク質などの、約７０〜７６ｋＤａの分子量を有する成熟ＧＡＡタンパク質を指す。これらおよび他のキメラポリペプチドを、例えば、本明細書中で詳述するアッセイを用いて、試験することができる。キメラポリペプチドが成熟ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドだが、追加の連続ＧＡＡポリペプチド配列も含む（しかし、全１１０ｋＤ前駆体ポリペプチドを含まない、および／あるいは残基１−５６または配列番号１もしくは２に記載のシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｔ ｆｏｒｔｈ ｉｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ １−５６ ｏｒ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ｏｒ ２）を含まない）さらなるポリペプチドも企図しており、同様に作製および試験することができる。
ヒトＧＡＡのｃＤＮＡの生成およびインビトロ活性の確認
ｉ）ＧＡＡのｃＤＮＡの合成
完全長、前駆形態のヒトＧＡＡをコードする完全長、３．６ｋｂヒトＧＡＡ ｃＤＮＡ（ｈＧＡＡ ｃＤＮＡ）を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚにおいて、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１５２．３で見つけてもよい。このｃＤＮＡ配列および他の転写変異体は、それら全体が本明細書に援用されている。成熟ＧＡＡをコードする領域にほぼ対応するかかるヒトｃＤＮＡ配列の一部分をここでは組換え構築物を産生するために使用する。しかし、完全長ｃＤＮＡを使用できることも企図している。
成熟ＧＡＡ ｃＤＮＡは、適切な発現ベクターへのクローニングを助長する隣接制限部位とともに、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔまたは他の適格な遺伝子配列製造業者によって合成され、シークエンシングされることになる。発現を最大にするために、成熟ＧＡＡ ｃＤＮＡを哺乳動物およびピキア発現についてコドン最適化することになる。万が一、哺乳動物またはピキアが所与のアミノ酸について異なるコドンを選好する場合は、次善の候補を使用して選好を統一することになる。得られたｃＤＮＡをＣＭＶベースの哺乳動物発現カセットにクローニングし、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｅｇａ Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミド精製キットを使用してプラスミドｐＣＭＶ−成熟ＧＡＡの大規模調製を行うことになる。３Ｅ１０−ＧＡＡタンパク質に対する複雑な免疫応答を回避するために、エピトープまたは精製タグを、ある一定の実施形態では、含めない。しかし、かかるタグを含む結合体も作製し、試験する。
ｉｉ）インビトロでの細胞のトランフェクション
トランスフェクト細胞におけるＧＡＡ機能を評定するための戦略は、上で説明されている。市販トランスフェクション試薬を使用して、１０マイクログラムのプラスミドｐＣＭＶ（モック）またはｐＣＭＶ−成熟ＧＡＡを１）ＣＯＳ−７細胞、２）ＨＬ−１細胞、３）野生型マウスからの筋線維、および４）ＧＡＡ ＫＯマウスからの筋線維にトランスフェクトする（表２）。トランスフェクション効率を追跡するために、β−ガラクトシダーゼまたはＧＦＰなどの適するレポーターをコードするプラスミドでの二重反復トランスフェクションを行う。４８時間後、トランスフェクト細胞を遠心分離によってペレット化し、タンパク質および免疫ブロット分析のために５００μＬ ＰＢＳに再懸濁させる。
Figure 2016514096
ｉｉｉ）ＡＡＶ ｃＤＮＡ構築物でのウイルス感染
Ｓｕｎら（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ， Ｈｉｇｈｌｙ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ａｃｉｄ α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、１４（６）：８２２−８３０、２００６）に記載されている方法に従って、上記構築物をアデノウイルスベクタープラスミドにクローニングする。これらの構築物は、細胞中のｃＤＮＡ構築物を試験する手段、および／または遺伝子療法のためにインビボで構築物を使用する手段をもたらす。
簡単に言うと、２９３細胞をＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶパッケージングプラスミドｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８、およびｐＡｄＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）でトランスフェクトする。感染４８時間後に細胞溶解産物を回収し、３回凍結融解し、スクロースクッションペレット化、続いて２工程の塩化セシウム勾配遠心分離工程によって単離する。ハンクス緩衝液を３回交換してＡＡＶストックを透析し、アリコートを−８０℃で保管する。ベクターＤＮＡ含有粒子の数をＤＮａｓｅ Ｉ消化、ＤＮＡ抽出そしてサザンブロット分析によって決定する。すべてのウイルスベクターストックを、ＮＩＨによって発行されたＢｉｏｈａｚａｒｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ２ガイドラインに従って取り扱う。
キメラ成熟ＧＡＡの取り込みを（１）ＣＯＳ−７細胞、（２）ＨＬ−１細胞および（３）ポンペ病患者細胞において、上の実施例１で説明したように分析する。１０％ＦＢＳを含有する培地でＣＯＳ−７細胞、ＨＬ−１細胞、またはＧＳＤ−ＩＩ患者からの線維芽細胞を成長させ、トランスフェクト２９３細胞の培地とともに４０時間インキュベートして、３００ｎｍｏｌ．ｈｒ．ｍＬの活性を有するキメラｈＧＡＡを生産する。培養患者線維芽細胞におけるＧＡＡ活性およびグリコーゲンを、上で説明したように分析する。
ｉｉｉ）トランスフェクトヒトＧＡＡの免疫ブロット検出、およびグリコーゲンのＧＡＡ媒介加水分解のアッセイ。
実施例１で説明したのと同じ手順を利用する。
７６ｋＤａまたは７０ｋＤａ形態のＧＡＡに遺伝子結合体化されたｃＤＮＡ Ｆｖ３Ｅ１０の生成および検証
ｉ）Ｆｖ３Ｅ１０のｃＤＮＡの合成
３Ｅ１０重鎖に連結されたマウスＦｖ３Ｅ１０可変軽鎖（配列番号９〜１０）をコードするｃＤＮＡは、Ｆｖ断片の細胞透過能を向上させるＶＨ ＣＤＲ１の突然変異を有する（Ｚａｃｋら、１９９６、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５７（５）：２０８２−８）。３Ｅ１０ ｃＤＮＡは、成熟形態のＧＡＡ中のアミノ酸配列（配列番号３〜４）に対応するｃＤＮＡコード配列とインフレームで、または成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドとインフレームで、クローニングを助長する制限部位に挟まれている。構築物は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔまたは遺伝子配列の他の適格製造業者によって合成され、シークエンシングされる。発現を最大にするために、３Ｅ１０ ｃＤＮＡを哺乳動物およびピキア発現についてコドン最適化することになる。万が一、哺乳動物またはピキアが所与のアミノ酸について異なるコドンを選好する場合は、次善の候補を使用して選好を統一することになる。得られたｃＤＮＡを哺乳動物発現カセットにクローニングし、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｅｇａ Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミド精製キットを使用してプラスミドｐＣＭＶ−３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの大規模調製を行うことになる。それらの構築物を１）ＣＯＳ−７細胞、２）ＨＬ−１細胞、３）野生型マウスからの筋線維、および４）ＧＡＡ ＫＯマウスからの筋線維において試験することになる。トランスフェクション戦略の概要を表３に示す。
Figure 2016514096
ｉｉ）細胞のトランスフェクション
３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ遺伝子融合体の発現およびグリコーゲン加水分解を試験するための戦略は、上で説明されている。トランスフェクション手順は、ヒトＧＡＡ ｃＤＮＡのトランスフェクションについて上で説明したものと同じとなる。トランスフェクト細胞をｈＧＡＡの発現およびグリコーゲンの加水分解についてアッセイすることになる。
成熟ＧＡＡに遺伝子結合体化された組換え３Ｅ１０の生産
ｉ）ピキアについてのタンパク質発現ベクターの構築。ピキアのプラスミド構築、トランスフェクション、コロニー選択および培養にはキットおよびマニュアルを製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用する。上で説明したように生成し、検証した遺伝子結合体化３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡのｃＤＮＡを２つの代替プラスミドにクローニングすることになる；細胞内発現のためのＰＩＣＺ、および分泌発現のためのＰＩＣＺａｌｐｈａ。各プラスミドからのタンパク質発現をＡＯＸ１プロモーターによって駆動する。トランスフェクトされたピキアをゼオシンで選択し、コロニーを組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡの発現について試験することになる。高発現物を選択し、精製のために拡大することになる。
ｉｉ）組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡの精製
ｍＡｂ ３Ｅ１０ ＦｖとのｃＤＮＡ融合体を酵母発現ベクターｐＰＩＣＺＡにライゲートし、その後、それをピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３株に電気穿孔する。ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）でコロニーを選択し、抗ｈｉｓ６抗体（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ、カリフォルニア州バレンシア）で同定する。製造業者のプロトコル（ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に従って、緩衝グリセロール／メタノール培地が入っているバッフル付き振盪フラスコの中でＸ−３３細胞を成長させ、０．５％メタノールでタンパク質合成を誘導する。２０，０００ｌｂｓ／ｉｎ２でＦｒｅｎｃｈ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓに２回通すことによって細胞を溶解し、９ＭグアニジンＨＣｌおよび２％ＮＰ４０に可溶化された細胞ペレットから、Ｎｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）での固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって組換えタンパク質を精製する。３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾールおよび２５％グリセロールを含有する５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中で結合タンパク質を溶離する。溶離画分の試料を４〜２０％勾配ＳＤＳＰＡＧＥ（ＮｕＳｅｐ Ｌｔｄ、オーストラリア国フレンチフォレスト）で電気泳動させ、カーゴ特異的マウス抗体、続いてマウスＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗体で顕色されるニトロセルロース膜へのウエスタンブロットによって、組換えタンパク質を同定する。発色性基質、塩化ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩によってアルカリホスファターゼ活性を測定する。ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質を同定する。溶離タンパク質を濃縮し、５％までのウシ胎仔血清で再構成し、３０，０００ＭＷＣＯスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビルリカ）で５％グリセロールを含有するＭｃＣｏｙ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ヴァージニア州ハーンドン）に対して１００倍交換透析する。この実施例ではピキア発現系を説明するが、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物発現系をはじめとする他の発現系でタンパク質を生産してもよい。ＣＨＯ細胞においてタンパク質を発現させるためのベクターおよび方法論（契約製造サービスを含む）は、例えばＬｏｎｚａから得ることができる。
ｉｉｉ）品質評定および製剤
３Ｅ１０および成熟ＧＡＡに対する免疫ブロットを用いて組換えタンパク質のサイズおよび同一性を検証し、その後、銀染色して３Ｅ１０、ＧＡＡおよび３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡの調製物間の相対純度を同定する。組換え材料を緩衝液中でおよび濃度（約０．５ｍｇ／ｍＬ）で製剤化する。
ｉｖ）組換え材料のインビトロ評定
実施例１において詳述したアッセイのいずれか１つ以上を用いて３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡタンパク質の活性を評価する。細胞透過活性および／または酵素活性を適する対照と比較する。さらに、ＧＡＡ欠乏を緩和するために必要な３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡタンパク質の量を、上で説明した方法を用いて決定する。哺乳動物細胞由来およびピキア由来組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡにおけるＧＡＡ活性の量を、例えば、（１）ポンペ病患者および対照患者からの線維芽細胞ならびに（２）野生型およびＧＡＡ ＫＯマウスから単離された筋線維において試験することができる。
実施例３
ＧＡＡ ＫＯマウスにおける筋肉標的化ＧＡＡのインビボ評定
評価のためのＧＡＡマウスモデル
数種のＧＡＡ ＫＯマウスが以前に特性評価されている：ＧＡＡ ＫＯ系統（Ｂｉｊｖｏｅｔら、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７（１）：５３−６２、１９９８）；エクソン６がｌｏｘＰに挟まれたｎｅｏ遺伝子で置換された（６ｎｅｏ／６ｎｅｏ）または欠失された（Δ６／Δ６）系統（Ｒａｂｅｎら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｃａｕｓｅｓ ａｎ Ｉｌｌｎｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２（３０）：１９０８６−１９０９２、１９９８）；エクソン１４が欠失されたマウス系統（Δ１４ｎｅｏ／Δ１４ｎｅｏ）（Ｒａｂｅｎら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄ ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉａｓｅ ｇｅｎｅ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：２８３−２９１、２０００）；肝臓または筋肉に特異的にＧＡＡを復帰させる誘導性ｈＧＡＡと交雑されたＧＡＡ ＫＯ（Ｒａｂｅｎら、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄ ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（ＧＡＡ）ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ＧＡＡ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２０３９−２０４７、２００１）；肝臓におけるＧＡＡの発現がＧＡＡに対する免疫寛容を誘導する誘導性ｈＧＡＡマウス異形等系統と交雑されたＧＡＡ ＫＯ；（Ｒａｂｅｎら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｎｚｙｍｅ，ａｃｉｄ ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：１７１−１７８、２００３）；ＧＡＡ ＫＯマウスにおけるＧＡＡに対する免疫応答を回避するために開発されたＧＡＡ ＫＯ／ＳＣＩＤマウス（Ｘｕら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ，ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＧＳＤ−ＩＩ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：１５８９０−１５９８、２００４）；およびグリコーゲン生産減少の効果を研究する、ＧＡＡおよびグリコーゲンシンターゼ１の二重ＫＯマウス（Ｘｕら、Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０８：１３８３−１３８８、２０１０）。
これらのマウスのうち、６ｎｅｏ／６ｎｅｏおよびΔ１４ｎｅｏ／Δ１４ｎｅｏマウスは、ポンペ病の乳児および成人表現型の特徴を示すが、Δ６／Δ６は、歳を重ねると筋衰弱を示す。すべてのマウスは、心筋および骨格筋への異常なグリコーゲン貯蔵を示す。したがって、これらの動物のすべてが、３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ療法の有効度を試験するために適切なモデルとして役立つ。マウスが高用量の３Ｅ１０−成熟ＧＡＡに対して免疫応答を発生した場合には、免疫寛容マウスモデルの１つを使用する。
成熟ＧＡＡの用量の選択
有害免疫応答を誘導することなく骨格筋へのグリコーゲン蓄積を処置する投薬量を決定するために、１ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの週間用量のｆｖ３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡまたはｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡをＧＡＡ ＫＯマウスに静脈内注射し、その後、グリコーゲン蓄積の変化を評定する。抗３Ｅ１０−ＧＡＡ抗体の発生もモニターする。筋肉形態、筋線維力の変化、および自己貪食空胞の減少の評定も評価する。下の表は、評価することができる例示的キメラポリペプチドを説明するものである。上記のように、本開示のキメラポリペプチドのいずれかは、同様に作製および試験される。
Figure 2016514096
材料および方法
ｉ）化学的または遺伝子結合体化３Ｅ１０−成熟ＧＡＡの注射
Ｆｖ３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡまたはＦｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡを製剤化し、静脈内注射に見合った緩衝液（例えば、滅菌食塩溶液、または５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌの緩衝溶液）で希釈する。各マウスに与える３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡの量は、次のように計算する：用量（ｍｇ／ｋｇ）×マウス体重（ｋｇ）×ストック濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝マウス１匹あたりのストックの体積（ｍＬ）、と１００μＬにするための適量のビヒクル。これらの実験で使用するための例示的Ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡキメラポリペプチドを配列番号１１または１２に記載する。
ｉｉ）抗ＧＡＡ抗体の測定
３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡに対する免疫応答を、Ｒａｂｅｎら（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８０：１５９−１６６、２００３）に記載されているように判定する。簡単に言うと、様々な時点で尾静脈から採血し、９６ウェルプレートを使用してＥＬＩＳＡによって前記酵素に対する抗体の存在についてそれらの血清を試験する。プレートを一晩、４℃で、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのｒｈＧＡＡでコーティングし、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）とともに２時間、３７℃でインキュベートし、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄する。次に、それらのプレートを三重反復で試験血清の系列希釈物（１：１００〜１：１２８００）とともに１時間、３７℃でインキュベートし、入念に洗浄し、１時間、３７℃で、１：１２０００ ヤギ抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、アラバマ州バーミングハム）とともにインキュベートし、再び洗浄し、トリメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で１５分間、室温で顕色させる（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）。１Ｎ ＨＣＬを添加することによって反応を停止させ、プレートをマイクロプレートリーダーで、４５０／６５０ｎｍで読み取ることになる。
ｉｉｉ）組織回収および調製
成熟酵素の最終投薬の４８〜７２時間後に３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ、３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ、または対照未処置マウスの肝臓、心臓、横隔膜および下腿骨格筋から採取組織を得る。ＧＡＡ活性を測定するために組織を均質化し、抽出物にグリコーゲン測定のための準備を施す、および／または組織を固定し、包埋し、染色のために１μｍ切片の薄片にする。筋肉組織の電子顕微鏡検査のために、クランプした筋肉試験片を０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％緩衝グルタルアルデヒドで２〜４時間、４℃で固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で保管し、さらに処理する。
ｉｖ）組織学的評価
過ヨウ素酸シッフ分析のために、標準的方法により、組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、薄片にし、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色する。加えて、瞬間凍結させた筋肉生検試料を用いてＰＡＳ染色および組織化学を行う。連続横断面（７μｍ）を標準的方法によりアルカリＡＴＰａｓｅ（ｐＨ１０．４）またはＮＡＤＨ−ＴＲで染色する。
ｖ）免疫組織化学
Ｒａｂｅｎら（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８０：１５９−１６６、２００３）によって記載されたようにリソソームの増殖を評定するために、リソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰに対する抗体を使用する。加えて、ＭＰＲ抗体を使用して、（アルカリＡＴＰａｓｅまたはＮＡＤＨの染色によって評定して）どの組織化学的筋線維タイプが最も有効にグリコーゲンを排除できるかを判定する。次の一次抗体を使用してよい：（ＦＩＴＣ）結合体化ラット抗マウスＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ−２；１：２０）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）；（ＦＩＴＣ）結合体化ラット抗マウスＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１；１：２０）；およびウサギ抗ウシＣＩ−ＭＰＲ（１：５００）。液体窒素で冷却されたイソペンタン中で瞬間凍結させた、筋肉生検試料の７マイクロメートル切片を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたカバーガラス上に収集し、１０分間、冷アセトンで固定し、その後、１０分間のＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）への浸漬によって再び水和させる。非特異的結合部位を１時間、加湿チャンバ内で、室温で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ウマ血清でブロックし、その後２４時間、４℃で、高湿チャンバ内で一次抗体とともにインキュベートする。ＰＢＳでの数回の洗浄後、切片を抗退色封入試薬混合物（ＰｒｏＬｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）で封入するか、または封入前に（ＣＩ−ＭＰＲについては）フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：２００）二次抗体（Ｃａｌｔａｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）で顕色させる。
ｖｉ）筋肉機能の試験
運動能力の評定：オープンフィールドでの歩行活動を、Ｒａｂｅｎら（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８０：１５９−１６６、２００３）に記載されているように、Ｄｉｇｉｓｃａｎ装置（Ｏｍｎｉｔｅｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）で測定する。全距離、水平方向の活動および垂直方向の活動を光電管ビーム遮断の合計数により１時間セッション中、１０分間隔で測定する。１週間にわたって動物ごとに３回の独立したセッションを行う。屠殺前に一晩、動物を絶食させる。群間比較のためにスチューデントｔ検定を用いることになる。差は、ｐ＜０：０５で有意とみなす。
加えて、すべてのマウスを、Ｓｉｄｍａｎら、Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ６ｎｅｏ／６ｎｅｏ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｉｃｅ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．６７（８）：８０３−８１８、２００８）に記載されているような一連の運動試験に付して筋肉機能を判定する。簡単に言うと、全てのマウスを３カ月齢から１週間に１回評価する。運動協調およびバランスを回転棒装置（ＳｍａｒｔＲｏｄ、Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイオ州コロンバス）で測定する。揺動ロトロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）試験のために、その棒を、２．５秒またはそれ未満の持続時間、後方および前方に、２５ｒｐｍに増加する両方向の全加速で揺動するようにプログラムする。カットオフ時間は、加速試験については６０秒、および揺動試験については５４秒である。測定と測定の間に少なくとも５分の休憩時間がある各バージョンの試験で３回、動物を試験する。棒からの平均落下潜時（またはカットオフ時間）を各動物について記録し、統計解析に使用する。歩行機能の分析は、スチューデントｔ検定（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）で行う。データは、平均±ＳＥＭである。ｐ＜０．０５を統計的有意差とみなす。フットフォールト試験については、四角い穴の開いた金網台の上に各動物を６０秒間配置し、足が穴に滑り落ちる回数を記録する。各動物を２回試験する。平均値を統計解析に用いる。強さは、ワイヤハングテストで測定する。大きい収容ケージの上６０ｃｍに配置したワイヤスクリーンから逆さまにぶらさがる能力をケージに落下するまでの潜時として測定する。直ぐに落下する動物にゼロのスコアを割り当て、落下しなかった動物に６０秒のスコアを割り当てる。カットオフ時間は６０秒である。各動物を２回試験し、平均値を統計解析に用いる。データを平均±ＳＥＭとして表すことになる。２つの群にスチューデントｔ検定を用いる；２群より多い群の比較については、一元配置ＡＮＯＶＡを用い、続いて、事後ボンフェローニ多重比較試験を用いる。
ｖｉｉ）血清酵素レベルの評定
研究期間中、３〜４日ごとに各マウスの尾静脈または静脈洞から血液を採集する。試料をアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよび／またはクレアチンホスホキナーゼレベルについて試験する。これらの酵素の１つ以上についての上昇したレベルの低下は、細胞質グリコーゲン蓄積の病理学的作用の一部についての低減を示す。
ｖｉｉｉ）生存評定
上で説明した実験で屠殺していない処置および未処置罹病および対照マウスを生存研究においてモニターすることになる。具体的には、動物の病状、処置状態および死亡日を記録する。この研究の結果に基づいて生存曲線を作製することになる。
実施例４
ヒトポンペ病患者における３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡおよび３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡの試験
乳児期発症ポンペ病患者および遅発性ポンペ病患者における臨床試験の（Ｓｃｈｏｓｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ（ＧＳＤＩＩ）／Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５（４）：５６９−５７８、２００８によってまとめられた）例に従って、３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡおよび／または３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチド）を患者に、例えば、週１回、４０ｍｇ／ｋｇまでの投薬量で静脈内投与する。患者は、５２週間、週１回、１０ｍｇ／ｋｇを受けてもよく、または１５３週間、週１回もしくは隔週に５〜２０ｍｇ／ｋｇを受けてもよい。患者を治療に対する寛容性について、ならびにグリコーゲンクリアランス、組織形態、運動機能および／または心機能の改善についてモニターする。筋肉生検試料を採取し、高分解能光学顕微鏡法、デジタル組織形態計測、電子顕微鏡法、毛細血管密度、線維型分析および／または共焦点顕微鏡法によって分析する。乳児の左室心筋重量係数（ＬＶＭＩ）をモニターする。処置を受けている乳児および幼児の運動マイルストーン、例えば歩行または直立姿勢での着席を、ポンペ病に罹患していない同年齢の被験体と比較する。呼吸のための人工呼吸器の補助への依存もモニターする。
上述の実験スキームを同様に用いて他のキメラポリペプチドを評価することになる。非限定的な例として、このスキームを用いて、ＧＡＡ部分（またはその断片）と内在化モイエティ部分とを有する化学的結合体および融合タンパク質を評価することになる。さらなる例として、上述の方法を用いて、２つ以上の結合体の混合物、例えば３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ（７０ｋＤａ）と３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ（７６ｋＤａ）の混合物、を含む組成物の使用を評価してもよい。
実施例１〜４において評価のために上に記載した特定のキメラポリペプチドは、本開示のキメラポリペプチドの例である−これらはいずれも、例えば実施例１〜４で説明した方法を用いて、作製および評価することができる。例として、リンカーが存在するまたは不存在の状態の化学的および遺伝子結合体を作製し、試験する。成熟ＧＡＡモイエティが内在化モイエティのＮ末端側に位置する結合体、ならびに成熟ＧＡＡモイエティが内在化モイエティのＣ末端側に位置する結合体を作製し、試験する。任意の範囲の内在化モイエティおよびリンカーモイエティを用いる。
非限定的な例として、次のキメラポリペプチドを作製し、試験する：（ａ）成熟ＧＡＡ−ＧＳ３−３Ｅ１０、（ｂ）３Ｅ１０−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ、（ｃ）成熟ＧＡＡ−ＧＳ３−Ｆｖ３Ｅ１０、（ｄ）成熟ＧＡＡ−３Ｅ１０、（ｅ）３Ｅ１０−成熟ＧＡＡ、（ｆ）成熟ＧＡＡ−Ｆｖ３Ｅ１０、（ｇ）３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ、（ｈ）成熟ＧＡＡ＊３Ｅ１０、（ｉ）内在化モイエティ＊成熟ＧＡＡ、（ｊ）成熟ＧＡＡ＊内在化モイエティ、（ｋ）内在化モイエティ−ＧＳ３−成熟ＧＡＡ、（ｌ）成熟ＧＡＡ−ＧＳ３−内在化モイエティ。本実施例を通して、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖを指すために略語Ｆｖを用いていることに留意されたい。同様に、ｍＡｂ ３Ｅ１０および３Ｅ１０を交換可能に用いている。同様に、成熟ＧＡＡは、約７６ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子量を有する成熟ＧＡＡタンパク質などの、約７０〜７６ｋＤａの分子量を有する成熟ＧＡＡタンパク質を指す。これらおよび他のキメラポリペプチドを、例えば、本明細書中で詳述するアッセイを用いて試験することができる。
さらなる例として、上述の方法を用いて、２つ以上の結合体の混合物、例えば３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ（７０ｋＤａ）と３Ｅ１０＊成熟ＧＡＡ（７６ｋＤａ）の混合物、を含む組成物の使用を評価してもよい。
実施例５
３Ｅ１０ ｍＡｂ−ＧＡＡおよび３Ｅ１０ Ｆａｂ−ＧＡＡ融合構築物の産生および特性評価
本発明者らは、Ｈａｃｋｅｒら、２０１３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．９２：６７に記載されているプロトコルに従って代表キメラポリペプチドを発現させた。具体的には、ＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドを組換えにより作製した。この実施例では、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド（キメラポリペプチドのＧＡＡポリペプチド部分）を、配列番号１０に記載の軽鎖可変ドメインと配列番号９に記載の重鎖可変ドメインとを含む完全長マウスモノクローナル３Ｅ１０抗体（内在化モイエティ部分）に、またはこの３Ｅ１０抗体のＦａｂに融合させた（図１を参照されたい）。具体的には、この実施例では、成熟ＧＡＡを含み、かつ配列番号２２のアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチドのＮ末端を、マウス３Ｅ１０ Ｆａｂ断片のいずれかの重鎖定常領域のＣ末端に、または完全長マウス３Ｅ１０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖定常領域のＣ末端に融合させた。この実施例では、前記内在化モイエティの重鎖は、マウス３Ｅ１０抗体を含み、このマウス３Ｅ１０抗体は、上述のＶＨと、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むマウス重鎖定常ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ４抗体からの定常ドメイン領域とを含む。いずれの場合も、組換え重鎖および上述の３Ｅ１０ ＶＬを含む３Ｅ１０軽鎖を発現するヌクレオチド配列を別々のベクターに挿入し、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に一過的にトランスフェクトさせて、組換えキメラタンパク質を生産した。同様に、前記重および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を単一のベクターから発現させることができた。それらのキメラ構築物を図１に模式的に示す。
この実施例では、リンカー配列を使用して、ＧＡＡポリペプチドをＦａｂまたはｍＡｂ重鎖に融合させ、そのリンカーは、配列番号３０のアミノ酸配列を有した。
Figure 2016514096
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参照による援用
本明細書の中で言及するすべての出版物および特許は、個々の出版物または特許各々が具体的にかつ個々に参照により援用されていると示されているがごとく、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
本開示の特定の実施形態を論じたが、上記明細書は説明的なものであり、制限的なものではない。本明細書および下記請求項の再考により当業者には本開示の多くの変形形態が明らかになるであろう。本開示の全範囲は、本請求項をそれらの全範囲の均等物とともに、および本明細書をかかる変形形態ともに参照することにより決定されるべきものである。

Claims (256)

  1. （ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドであって、
    約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まないキメラポリペプチド。
  2. （ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むＧＡＡポリペプチドと（ｉｉ）１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合する、および／または受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによる細胞膜通過を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドであって、
    配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まないキメラポリペプチド。
  3. 配列番号１または２の残基１−５６に記載のＧＡＡポリペプチドの部分を含まない、請求項１または２に記載のキメラポリペプチド。
  4. 配列番号１または２の残基１−５７に記載のＧＡＡポリペプチドの部分を含まない、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  5. 酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  6. ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも１部分を欠き、該全リンカー領域が配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  7. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項１〜６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  8. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のキメラポリペプチド
  9. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  10. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラポリペプチド
  11. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  12. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２３の配列を含む、請求項１１に記載のキメラポリペプチド。
  13. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  14. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  15. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  16. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号１の残基１２２−７８２または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１〜５または１３〜１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  17. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  18. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  19. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  20. 前記内在化モイエティが、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１〜１９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  21. 自己貪食空胞によって取り込まれることが可能である、請求項１〜２０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  22. 前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進する、請求項１〜２１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  23. 前記内在化モイエティが、肝細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進する、請求項１〜２２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  24. 前記内在化モイエティが、ニューロンへの前記キメラポリペプチドの輸送を促進する、請求項１〜２２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  25. Ｍ６Ｐ残基で修飾されたＮ結合型オリゴ糖鎖を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  26. インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、生産または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  27. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過することができる、および／または１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することができる抗体または抗原結合断片を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  28. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項２７に記載のキメラポリペプチド。
  29. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項２７または２８に記載のキメラポリペプチド。
  30. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは該３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項２７〜２９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  31. 前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項２７〜３０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  32. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２７〜３１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  33. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２７〜３２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  34. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体とを含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  35. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはカバットに準拠する）
    を含む、請求項２７〜３４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  36. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する）
    を含む、請求項２７〜３４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  37. 前記抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項２７〜３６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  38. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂである、請求項２７〜３６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  39. 前記抗体または抗原結合断片が、抗体である、請求項２７〜３６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  40. 前記ＧＡＡポリペプチドのＮ末端が、前記Ｆａｂの重鎖のＣ末端に融合している、請求項３８に記載のキメラポリペプチド。
  41. 前記ＧＡＡポリペプチドのＮ末端が、前記抗体の重鎖のＣ末端に融合している、請求項３９に記載のキメラポリペプチド。
  42. 前記ＧＡＡポリペプチドのＮ末端が、リンカーによって前記Ｆａｂの重鎖のＣ末端に融合している、請求項４０に記載のキメラポリペプチド。
  43. 前記ＧＡＡポリペプチドのＮ末端が、リンカーによって前記抗体の重鎖のＣ末端に融合している、請求項４１に記載のキメラポリペプチド。
  44. 前記リンカーが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラポリペプチド。
  45. 前記内在化モイエティが、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である、請求項１〜４４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  46. 前記内在化モイエティが、５０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合する、請求項１〜４５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  47. 前記内在化モイエティが、ホーミングペプチドを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  48. ＧＡＡポリペプチドの前記内在化モイエティへの化学的結合体である、請求項１〜４７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  49. 前記ＧＡＡポリペプチドと前記内在化モイエティとを含む組換え共翻訳融合タンパク質である、請求項１〜４７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  50. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１〜４９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  51. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項５０に記載のキメラポリペプチド。
  52. 融合タンパク質である、請求項１〜５１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  53. 原核細胞または真核細胞において生産される、請求項５２に記載のキメラポリペプチド。
  54. 前記真核細胞が、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞から選択される、請求項５３に記載のキメラポリペプチド。
  55. 前記ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに直接または間接的に結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項１〜５４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  56. 前記ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに相互接続するリンカーを含まない、請求項１〜５４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  57. 前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項５５に記載のキメラポリペプチド。
  58. 前記内在化モイエティが、前記ＧＡＡポリペプチドのＮ末端側にある、請求項５５〜５７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  59. 前記内在化モイエティが、前記ＧＡＡポリペプチドの内部アミノ酸に結合体化または連結されている、請求項５５〜５７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  60. 請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。
  61. 内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、成熟ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記内在化モイエティの内在化活性を有するキメラポリペプチドをコードし、および約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードしない核酸構築物。
  62. 内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、
    （ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによる細胞膜通過を促進する、および／または１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドをコードし；
    前記キメラポリペプチドが、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡポリペプチドを含まない、核酸構築物。
  63. 前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項６１または６２に記載の核酸構築物。
  64. 前記キメラポリペプチドが、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、該全リンカー領域が、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項６１または６２に記載の核酸構築物。
  65. 請求項６〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
  66. 前記内在化モイエティが、筋肉細胞への送達を促進する、請求項６１〜６５のいずれかに記載の核酸構築物。
  67. 前記内在化モイエティが、肝細胞への送達を促進する、請求項６１〜６６のいずれかに記載の核酸構築物。
  68. 前記内在化モイエティが、ニューロンへの送達を促進する、請求項６１〜６７のいずれかに記載の核酸構築物。
  69. 前記内在化モイエティが、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項６０〜６８のいずれかに記載の核酸構築物。
  70. 前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項６９に記載の核酸構築物。
  71. 前記ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項６１〜７０のいずれかに記載の核酸構築物。
  72. 前記ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、約７０キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項６１〜７１のいずれかに記載の核酸構築物。
  73. 前記ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、約７６キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項６１〜７０のいずれかに記載の核酸構築物。
  74. 前記ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１の残基１２２−７８２または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項６１〜７３のいずれかに記載の核酸構築物。
  75. リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６１〜７４のいずれかに記載の核酸構築物。
  76. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過することができる、および／または１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することができる抗体または抗原結合断片である、請求項６１〜７５のいずれかに記載の核酸構築物。
  77. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項７６に記載の核酸構築物。
  78. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは該３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項７６または７７に記載の核酸構築物。
  79. 前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項７６〜７８のいずれかに記載の核酸構築物。
  80. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項７６〜７９のいずれかに記載の核酸構築物。
  81. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項７６〜８０のいずれかに記載の核酸構築物。
  82. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体とを含む、請求項７６〜８１のいずれかに記載の核酸構築物。
  83. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはカバットに準拠する）
    を含む、請求項７６〜８２のいずれかに記載の核酸構築物。
  84. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する）
    を含む、請求項７６〜８２のいずれかに記載の核酸構築物。
  85. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂである、請求項７６〜８４のいずれかに記載の核酸構築物。
  86. 前記抗体または抗原結合断片が、抗体である、請求項７６〜８４のいずれかに記載の核酸構築物。
  87. 前記内在化モイエティが、ホーミングペプチドである、請求項６１〜８６のいずれかに記載の核酸構築物
  88. 請求項６０〜８７のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
  89. 請求項８８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  90. 請求項８９に記載のベクターを含み、かつ発現することが可能な宿主細胞。
  91. キメラポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの発現を起こさせるのに適した条件下で請求項８９または９０に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
  92. 請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む組成物。
  93. 実質的に発熱物質不含である、請求項９２に記載の組成物。
  94. ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、有効量の請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドを該被験体に投与するステップを含む方法。
  95. ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、有効量の請求項９２または９３に記載の組成物を該被験体に投与するステップを含む方法。
  96. 前記それを必要とする被験体が、１つ以上の以前の酵素補充療法に対して不応性であった疾患を有する被験体である、請求項９４または９５に記載の方法。
  97. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する被験体である、請求項９４〜９６のいずれかに記載の方法。
  98. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項９４〜９７のいずれかに記載の方法。
  99. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項９４〜９８のいずれかに記載の方法。
  101. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項１００に記載の方法。
  102. ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、
    （ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む有効量のキメラポリペプチドを該被験体に投与するステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および
    該キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  103. 細胞の酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を増加させる方法であって、
    該細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  104. 細胞の酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を増加させる方法であって、
    該細胞を（ｉ）成熟ＧＡＡポリペプチドを含む酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによる細胞膜通過を促進する、および／または１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡポリペプチドを含まない、方法。
  105. 前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１０３または１０４に記載の方法。
  106. 前記キメラポリペプチドが、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、該全リンカー領域が、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項１０３〜１０５のいずれかに記載の方法。
  107. 細胞の酸性α−グルコシダーゼ酵素活性を増加させる方法であって、該細胞を請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
  108. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１０２〜１０７のいずれかに記載の方法。
  109. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号１の残基１２２−７８２または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１０２〜１０８のいずれかに記載の方法。
  110. 前記内在化モイエティが、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１０２〜１０９のいずれかに記載の方法。
  111. 前記細胞が、それを必要とする被験体の細胞である、請求項１０３〜１１０のいずれかに記載の方法。
  112. 前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進する、請求項１０２〜１１１のいずれかに記載の方法。
  113. 前記内在化モイエティが、肝細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１０２〜１１２のいずれかに記載の方法。
  114. 前記内在化モイエティが、ニューロンへの前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１０２〜１１３のいずれかに記載の方法。
  115. 前記キメラポリペプチドが、リソソームにも送達される、請求項９４〜１１４のいずれかに記載の方法。
  116. 前記キメラポリペプチドが、細胞質グリコーゲン蓄積を低減させる、請求項９４〜１１５のいずれかに記載の方法。
  117. 前記キメラポリペプチドが、リソソームグリコーゲン蓄積を低減させる、請求項９４〜１１６のいずれかに記載の方法。
  118. 前記キメラポリペプチドが、自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を低減させる、請求項９４〜１１７のいずれかに記載の方法。
  119. 前記キメラポリペプチドが、細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を低減させる、請求項９４〜１１８のいずれかに記載の方法。
  120. 前記ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１１８〜１１９のいずれかに記載の方法。
  121. 前記ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項１１８〜１１９のいずれかに記載の方法。
  122. 前記ＧＡＡポリペプチドが、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する、請求項１１８〜１１９のいずれかに記載の方法。
  123. 前記キメラポリペプチドが、Ｍ６Ｐ残基で修飾されたＮ結合型オリゴ糖鎖を含む、請求項１１８〜１２２のいずれかに記載の方法。
  124. 前記キメラポリペプチドが、ＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、請求項１１８〜１２３のいずれかに記載の方法。
  125. 前記それを必要とする被験体が、１つ以上の以前の酵素補充療法に対して不応性であった疾患を有する被験体である、請求項１１８〜１２４のいずれかに記載の方法。
  126. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する被験体である、請求項１１８〜１２７のいずれかに記載の方法。
  127. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項１１８〜１２６のいずれかに記載の方法。
  128. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項１１８〜１２８のいずれかに記載の方法。
  130. 前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過することができる、および／または１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することができる抗体または抗原結合断片を含む、請求項１１８〜１３０のいずれかに記載の方法。
  132. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記抗体または抗原結合断片が、３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項１３１〜１３２に記載の方法。
  134. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１１８〜１３３のいずれかに記載の方法。
  135. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項１３１〜１３３のいずれかに記載の方法。
  137. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは該３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１３１〜１３７のいずれかに記載の方法。
  139. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１３１〜１３８のいずれかに記載の方法。
  140. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１３１〜１３９のいずれかに記載の方法。
  141. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体とを含む、請求項１３１〜１４０のいずれかに記載の方法。
  142. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはカバットに準拠する）
    を含む、請求項１３１〜１４１のいずれかに記載の方法。
  143. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する）
    を含む、請求項１３１〜１４１のいずれかに記載の方法。
  144. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂである、請求項１３１〜１４３のいずれかに記載の方法。
  145. 前記抗体または抗原結合断片が、抗体である、請求項１３１〜１４３のいずれかに記載の方法。
  146. 前記キメラポリペプチドが、請求項３６〜４６のいずれかに記載のキメラポリペプチドである、請求項１３１〜１４５のいずれかに記載の方法。
  147. 前記キメラポリペプチドが、前記ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに直接または間接的に結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項６５〜１４６のいずれかに記載の方法。
  148. 前記キメラポリペプチドが、リンカーを含まず、前記ＧＡＡポリペプチドが、前記内在化モイエティに直接結合体化または連結されている、請求項１３１〜１４７のいずれかに記載の方法。
  149. 前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項１４７に記載の方法。
  150. 前記キメラポリペプチドが、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化される、請求項１３１〜１４９のいずれかに記載の方法。
  151. 前記キメラポリペプチドが、全身投与される、請求項１３１〜１５０のいずれかに記載の方法。
  152. 前記キメラポリペプチドが、静脈内投与される、請求項１５１に記載の方法。
  153. ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、前記被験体に有効量の請求項１〜９３のいずれかに記載のキメラポリペプチド、核酸構築物または組成物を投与するステップを含む方法。
  154. ポンペ病を処置するための医薬の製造における請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  155. ポンペ病を処置するための請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  156. ポンペ病を処置するための医薬の製造における請求項６０〜９１のいずれかに記載の核酸構築物の使用。
  157. ポンペ病を処置するための請求項６０〜９１のいずれかに記載の核酸構築物の使用。
  158. ポンペ病を処置するための請求項９２または９３に記載の組成物の使用。
  159. 筋肉細胞の細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
    筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および
    該キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  160. 筋肉細胞の細胞質およびリソソームへのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
    筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および
    該キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  161. 筋肉細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
    筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および
    該キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  162. 筋肉細胞の細胞質およびリソソームへのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
    筋肉細胞を（ｉ）酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによる細胞膜通過を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  163. 筋肉細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
    筋肉細胞を（ｉ）酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによる細胞膜通過を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
    該キメラポリペプチドが、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
  164. 前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１６２または１６３に記載の方法。
  165. 前記キメラポリペプチドが、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、該全リンカー領域が、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項１６２または１６３に記載の方法。
  166. 筋肉細胞の細胞質およびリソソームへのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、該細胞を請求項６〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
  167. 筋肉細胞の細胞質、リソソームおよび自己貪食空胞へのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、該細胞を請求項６〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
  168. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１５９〜１６７のいずれかに記載の方法。
  169. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０キロダルトンの分子量を有する、請求項１５９〜１６８のいずれかに記載の方法。
  170. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１５９〜１６９のいずれかに記載の方法。
  171. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号１の残基１２２−７８２、配列番号１の残基１２３−７８２、または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１５９〜１７０のいずれかに記載の方法。
  172. 前記ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１５９〜１７１のいずれかに記載の方法。
  173. 前記ＧＡＡポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項１５９〜１７１のいずれかに記載の方法。
  174. 前記ＧＡＡポリペプチドが、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する、請求項１５９〜１７１のいずれかに記載の方法。
  175. 前記内在化モイエティが、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの輸送を促進する、請求項１５９〜１７４のいずれかに記載の方法。
  176. 前記キメラポリペプチドが、Ｍ６Ｐ残基で修飾されたＮ結合型オリゴ糖鎖を含む、請求項１５９〜１７５のいずれかに記載の方法。
  177. 前記キメラポリペプチドが、ＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、請求項１５９〜１７６のいずれかに記載の方法。
  178. 前記細胞が、ポンペ病の処置を必要とする被験体の細胞であり、該細胞を接触させるステップが、該被験体に前記キメラポリペプチドを投与することを含む、請求項１５９〜１７７のいずれかに記載の方法。
  179. 前記被験体が、１つ以上の以前の酵素補充療法に対して不応性であったポンペ病を有する被験体である、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する被験体である、請求項１７８または１７９に記載の方法。
  181. 前記被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項１７８〜１８０のいずれかに記載の方法。
  182. 前記被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病であると診断された被験体である、請求項１８１に記載の方法。
  183. 前記被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の６カ月より前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項１７８〜１８２のいずれかに記載の方法。
  184. 前記被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始の少なくとも１年前にポンペ病の症状発現が起こった被験体である、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１５９〜１８４のいずれかに記載の方法。
  186. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１８５に記載の方法。
  187. 前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項１８５または１８６に記載の方法。
  188. 前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１５９〜１８７のいずれかに記載の方法。
  189. 前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項１８５〜１８８のいずれかに記載の方法。
  191. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは該３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１８５〜１８８のいずれかに記載の方法。
  193. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８５〜１９２のいずれかに記載の方法。
  194. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８５〜１９３のいずれかに記載の方法。
  195. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体とを含む、請求項１８５〜１９４のいずれかに記載の方法。
  196. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    を含む、請求項１８５〜１９５のいずれかに記載の方法。
  197. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    を含む、請求項１８５〜１９５のいずれかに記載の方法。
  198. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂである、請求項１８５〜１９７のいずれかに記載の方法。
  199. 前記抗体または抗原結合断片が、抗体である、請求項１８５〜１９７のいずれかに記載の方法。
  200. 前記キメラポリペプチドが、請求項３５〜４６のいずれかに記載のキメラポリペプチドである、請求項１８５〜１９７のいずれかに記載の方法。
  201. 前記キメラポリペプチドが、前記ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに直接または間接的に結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項１５９〜２００のいずれかに記載の方法。
  202. 前記キメラポリペプチドが、リンカーを含まず、前記ＧＡＡポリペプチドが、前記内在化モイエティに直接結合体化または連結されている、請求項１５９〜２００のいずれかに記載の方法。
  203. 前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項２０１に記載の方法。
  204. 前記キメラポリペプチドが、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化される、請求項１５９〜２０３のいずれかに記載の方法。
  205. 細胞内の細胞質グリコーゲン蓄積を減少させるための請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  206. 細胞内の細胞質グリコーゲン蓄積を減少させるための医薬の製造における請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  207. 細胞内の細胞質およびリソソームグリコーゲン蓄積を減少させるための請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  208. 細胞内の自己貪食空胞グリコーゲン蓄積を減少させるための請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  209. 細胞内の細胞質およびリソソームグリコーゲン蓄積を減少させるための医薬の製造における請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  210. 細胞内の自己貪食空胞グリコーゲン蓄積を減少させるための医薬の製造における請求項１〜５９のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
  211. （ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞へのキメラポリペプチドの送達を促進する抗体または抗原結合断片とを含むキメラポリペプチドであって、
    約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まないキメラポリペプチド。
  212. （ｉ）酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞へのキメラポリペプチドの送達を促進し、かつ受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過することができる抗体または抗原結合断片とを含むキメラポリペプチドであって、
    配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まないキメラポリペプチド。
  213. 酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項２１１または２１２に記載のキメラポリペプチド。
  214. ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部分を欠き、該全リンカー領域が、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項２１１〜２１３に記載のキメラポリペプチド。
  215. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項２１１または２１２に記載のキメラポリペプチド。
  216. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２１５に記載のキメラポリペプチド。
  217. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項２１１または２１２に記載のキメラポリペプチド。
  218. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項２１７に記載のキメラポリペプチド。
  219. 前記ＧＡＡポリペプチドも、前記キメラポリペプチドも、配列番号１または２のアミノ酸１−６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない、請求項２１１または２１２に記載のキメラポリペプチド。
  220. 前記キメラポリペプチドまたはＧＡＡポリペプチドが、配列番号２３の配列を含む、請求項２１９に記載のキメラポリペプチド。
  221. 前記抗体または抗原結合断片が、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項２１１〜２２０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  222. 前記抗体または抗原結合断片が、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項２１１〜２２１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  223. 前記抗体または抗原結合断片が、肝細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項２１１〜２２２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
  224. 前記抗体または抗原結合断片が、ニューロンへの前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項２１１〜２２３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
  225. 前記ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡを含む、請求項２１１〜２２４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  226. 前記ＧＡＡポリペプチドが、約７０キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡを含む、請求項２１１〜２２５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  227. 前記ＧＡＡポリペプチドが、約７６キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡを含む、請求項２１１〜２２５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  228. 前記ＧＡＡポリペプチドが、配列番号１の残基１２２−７８２、配列番号１の残基１２３−７８２、または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項２２５〜２２７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  229. 前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項２１１〜２２８のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  230. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項２１１〜２２９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  231. 前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは該３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項２３０に記載のキメラポリペプチド。
  232. 前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項２１１〜２３１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  233. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２１１〜２３２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  234. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２１１〜２３３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  235. 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体とを含む、請求項２１１〜２３４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  236. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはカバットに準拠する）
    を含む、請求項２１１〜２３５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  237. 前記抗体または抗原結合断片が、
    配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
    配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （これらのＣＤＲはＩＭＧＴ体系に準拠する）
    を含む、請求項２１１〜２３５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  238. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂである、請求項２１１〜２３７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  239. 前記抗体または抗原結合断片が、抗体である、請求項２１１〜２３７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  240. 前記抗原結合断片が、一本鎖Ｆｖを含む、請求項２１１〜２３７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  241. （ａ）（ｉ）約７６ｋＤａの分子量を有する成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含む、第一のキメラポリペプチド；および
    （ｂ）（ｉ）約７０ｋＤａの分子量を有する成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含む第二のキメラポリペプチド
    を含む組成物であって、
    該第一のキメラポリペプチドおよび該第二のキメラポリペプチド各々が、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および該第一のキメラポリペプチドも、該第二のキメラポリペプチドも、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、、組成物。
  242. 約１１０ｋＤａの分子量を有する前駆体ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、請求項１８２に記載の組成物。
  243. （ａ）（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドおよび（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティを含み、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、キメラポリペプチドと、
    （ｂ）約１１０ｋＤａの分子量を有する前駆体ＧＡＡポリペプチドを含むポリペプチドと
    を含む組成物。
  244. キメラポリペプチドを含む組成物であって、
    該キメラポリペプチドが、（ｉ）酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドおよび（ｉｉ）ＤＮＡに結合し、該キメラポリペプチドの細胞への送達を促進する抗体または抗原結合断片を含み；
    該キメラポリペプチドが、配列番号１に記載の完全長、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、組成物。
  245. 前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有する、請求項２４３または２４４に記載の組成物。
  246. 前記キメラポリペプチドが、ＧＡＡ全リンカー領域の少なくとも一部部分を欠き、該全リンカー領域が、配列番号１または２のアミノ酸５７−７８に対応する、請求項２４３〜２４５のいずれかに記載の組成物。
  247. 前記キメラポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する成熟ＧＡＡポリペプチドを含む、請求項２４３〜２４６のいずれかに記載の組成物。
  248. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０キロダルトンの分子量を有する、請求項２４３〜２４６のいずれかに記載の組成物。
  249. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７６キロダルトンの分子量を有する、請求項２１１〜２４６のいずれかに記載の組成物。
  250. 前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号１の残基１２２−７８２、配列番号１の残基１２３−７８２、または配列番号１の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項２１１〜２４９のいずれかに記載の組成物。
  251. 配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、または１つ以上のエピトープタグ不存在の状態で配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
  252. 配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、または１つ以上のエピトープタグ不存在の状態で配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
  253. 配列番号１９または２０に記載のアミノ酸配列をＮ末端にさらに含む、請求項２５１または２５２に記載のキメラポリペプチド。
  254. ポンペ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、請求項２５１〜２５３のいずれかに記載のキメラポリペプチドを該被験体に投与するステップを含む方法。
  255. 配列番号１の残基１２２−７８２または配列番号１の残基２０４−７８２を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  256. 前記内在化モイエティが、前記ＧＡＡポリペプチドのＣ末端側にある、請求項５５〜５７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
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