CN102978185A - 包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物。本发明提供了合成包含氨基氧基基团的寡糖的方法。本发明进一步提供了包含氨基氧基基团的寡糖、将包含氨基氧基基团的寡糖与糖蛋白偶联的方法以及寡糖-蛋白质轭合物。还提供了通过施用寡糖-蛋白质轭合物治疗哺乳动物的溶酶体贮积症的方法。

Description

包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物
本申请是申请日为2008年1月18日，申请号为200880007680.2（国际申请号为PCT/US2008/051429），名称为“包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2007年1月18日提交的美国临时申请No.60/885,471的权益，将其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
一般而言，本发明涉及从包含反应基团的寡糖合成包含氨基氧基基团的寡糖的方法。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及包含氨基氧基基团的寡糖。本发明还涉及将包含氨基氧基基团的寡糖与蛋白质(包括糖蛋白，例如溶酶体酶)轭合的方法，并且涉及寡糖-蛋白质轭合物(包括寡糖-糖蛋白轭合物)的组合物。本发明的另一个实施方案涉及使用这类寡糖-溶酶体酶轭合物治疗溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder)的方法。
背景技术
溶酶体贮积症(LSD)是一类少见的代谢病症，其包括超过40种涉及溶酶体水解酶活性缺乏的遗传疾病。LSD的标志性特征是溶酶体代谢物的异常蓄积，这导致形成大量膨胀的溶酶体。
LSD可通过施用患者所缺少的酶的活性形式来治疗，该过程称为酶替代疗法(ERT)。所施用的含有末端甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate，M6P)的替代酶被靶细胞通过细胞表面相关的非阳离子依赖性M6P受体(CI-MPR)介导的胞吞作用来摄取，并且定向于溶酶体。
一般而言，未充分磷酸化的替代酶不被细胞表面上的M6P受体纳入，并且因此不能被定向于它们在其中起作用的溶酶体。因此，低程度的甘露糖磷酸化能对替代酶的疗效具有明显的和有害的影响。
因此，已开发了增加替代酶的M6P含量的方法。例如，美国专利No.7,001,994描述了将包含M6P的寡糖与糖蛋白偶联的方法。首先，用高碘酸盐或半乳糖氧化酶氧化糖蛋白的寡糖以导致羰基基团的形成，然后将其与在还原端用羰基反应基团(例如，肼、酰肼、氨基氧基、氨基硫脲、氨基脲或胺基团)官能化的寡糖化学轭合，以产生寡糖-糖蛋白轭合物。
溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)与双M6P寡糖的轭合物通过上述方法制备，并且发现其在庞皮(Pompe)病的鼠模型中比重组人GAA更加有效地还原骨骼肌和心肌糖原，所述庞皮病是一种由GAA的代谢缺陷引起的常染色体隐性肌肉疾病，并且以溶酶体糖原的蓄积为特征。
氨基氧基基团是对上述轭合反应特别有用的羰基反应基团，这是因为所形成的轭合物包含较稳定的肟键合。因此，需要制备氨基氧基官能化的寡糖的方法。
发明内容
本发明提供了制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法。这些方法一般适用于大范围的被保护的和未保护的寡糖，例如支链和无支链的以及磷酸化和未磷酸化的寡糖。在某些实施方案中，该寡糖可以是二糖、三糖、四糖、五糖、多聚己糖、七聚糖(heptasaccharide)或更大的糖。在某些实施方案中，寡糖可包含至少一个M6P残基。在一些实施方案中，寡糖可包含至少1、2、3、4、5、6或7个末端M6P残基。
本发明提供了从包含反应基团的寡糖制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法。该方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖；
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物；和
(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应，从而制得包含氨基氧基基团的寡糖。
第一反应基团和第二反应基团可选自例如肼、酰肼、氨基硫脲、氨基脲、胺、羧基、活化酯、酰卤、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯和磺酰卤基团。
在一些实施方案中，氨基氧基化合物选自式II的化合物：
Figure BDA00002429414600031
式II
其中Y是第二反应基团，Z选自烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基，且P选自氨基保护基(例如，氨基甲酸酯保护基)。例如，在一些实施方案中，Y可以是羧基、活化酯、酰卤(例如，酰氟或酰氯)、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯或磺酰卤(例如，磺酰氯或磺酰溴)。在另一些实施方案中，Y可以是例如肼、酰肼、氨基硫脲、氨基脲或胺基团。
在某些实施方案中，式II的氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600032
式III
其中Y是第二反应基团，n选自1至10的整数，且P选自氨基保护基。
在某些实施方案中，氨基氧基化合物包含氨基保护基，且所述方法进一步包括步骤(d)，将包含氨基氧基基团的寡糖去保护。
本发明进一步提供了包含(1)氨基氧基基团和(2)甘露糖-6-磷酸的寡糖。在一些实施方案中，该寡糖通过上述方法制备。例如，在一些实施方案中，本发明提供了式IV的包含氨基氧基基团的寡糖：
Figure BDA00002429414600041
式IV
其中m和p独立地选自1至10的整数。
在另一个实施方案中，本发明提供了式V的寡糖：
Figure BDA00002429414600042
式V。
在另一个实施方案中，本发明提供了将寡糖与蛋白质偶联的方法。在一个实施方案中，该方法包括：
(a)提供包含氨基氧基基团的寡糖；
(b)提供具有至少一个羰基基团的蛋白质；和
(c)使寡糖的氨基氧基基团与蛋白质的至少一个羰基基团反应，从而将寡糖与蛋白质偶联。
在另一些实施方案中，本发明进一步提供了寡糖-蛋白质轭合物，其包含(1)蛋白质、(2)寡糖和(3)连接蛋白质和寡糖的肟基团。例如，在一些实施方案中，本发明提供了通过上文所公开的方法制备的寡糖-蛋白质轭合物。在某些实施方案中，该寡糖-蛋白质轭合物是寡糖-糖蛋白轭合物。在某些实施方案中，该寡糖-糖蛋白轭合物是包含至少一个M6P的寡糖和溶酶体酶例如溶酶体水解酶的轭合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的寡糖-蛋白质轭合物的药物组合物。
本发明的另一个实施方案提供了治疗溶酶体贮积症、例如表1中所公开的那些溶酶体贮积症的方法。在一些实施方案中，该方法包括给哺乳动物施用本发明的寡糖-糖蛋白轭合物，其中寡糖包含至少一个M6P，且糖蛋白是溶酶体水解酶。本公开物进一步提供了本发明的轭合物用于治疗需要其的受治疗者的溶酶体贮积症的用途，以及本发明的轭合物在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。
本发明还涉及如下方面：
1.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖；
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
2.如项1所述的方法，其中所述第一反应基团和第二反应基团选自肼、酰肼、氨基脲、氨基硫脲、胺、羧基、酯、酰卤、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯和磺酰卤基团。
3.如项2所述的方法，其中所述第一反应基团是酰肼基团。
4.如项2所述的方法，其中所述第一反应基团是羧基基团。
5.如项1所述的方法，其中所述氨基氧基化合物选自式II的化合物：
式II
其中Y是所述第二反应基团，Z选自烷基、链烯基、炔基、杂芳基、芳基和杂环基，且P选自氨基保护基。
6.如项5所述的方法，其中P选自氨基甲酸酯保护基。
7.如项6所述的方法，其中P是叔丁氧羰基。
8.如项5所述的方法，其中Y选自：
Figure BDA00002429414600071
其中X选自卤素、叠氮化物、酰氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
9.如项8所述的方法，其中Y是
Figure BDA00002429414600081
10.如项9所述的方法，其中X选自芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
11.如项10所述的方法，其中X是
Figure BDA00002429414600082
12.如项5所述的方法，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600083
式III
其中Y是所述第二反应基团，n选自1至10的整数，且P选自氨基保护基。
13.如项12所述的方法，其中n是1。
14.如项12所述的方法，其中Y是羧基、酯、酰卤、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯或磺酰卤基团。
15.如项14所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600084
16.如项12所述的方法，其中Y是肼、酰肼、氨基脲、氨基硫脲或胺基团。
17.如项16所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600085
18.如项1所述的方法，其中所述寡糖是
Figure BDA00002429414600091
19.如项1所述的方法，其中所述寡糖是
Figure BDA00002429414600092
20.如项1所述的方法，其中所述氨基氧基化合物包含氨基保护基，所述方法进一步包括(d)将所述包含氨基氧基基团的寡糖去保护。
21.用项1的方法制备的包含氨基氧基基团的寡糖。
22.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述寡糖是
Figure BDA00002429414600101
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600102
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是所述第二反应基团；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
23.如项22所述的方法，其中Y是
Figure BDA00002429414600103
且其中X选自羟基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
24.如项23所述的方法，其中X是
Figure BDA00002429414600111
25.如项24所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600112
26.如项25所述的方法，其中步骤(c)包括使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团在偶联试剂和/或催化剂存在下反应。
27.如项26所述的方法，其中所述催化剂是
Figure BDA00002429414600113
28.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述寡糖是
Figure BDA00002429414600114
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600121
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是所述第二反应基团；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
29.如项28所述的方法，其中Y是肼、酰肼、氨基氧基、氨基硫脲、氨基脲或胺基团。
30.如项29所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600122
31.如项30所述的方法，其中步骤(c)包括使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团在偶联试剂和/或催化剂存在下反应。
32.如项31所述的方法，其中所述偶联试剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，所述催化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
33.一种将寡糖与蛋白质偶联的方法，其包括：
(a)提供包含氨基氧基基团的寡糖；
(b)提供具有至少一个羰基基团的蛋白质；和
(c)使所述寡糖的氨基氧基基团与所述蛋白质的至少一个羰基基团反应，
从而将所述寡糖与所述蛋白质偶联，其中所述包含氨基氧基基团的寡糖是：
34.如项33所述的方法，其中所述蛋白质是糖蛋白。
35.如项34所述的方法，其中所述糖蛋白是溶酶体酶。
36.如项35所述的方法，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、酸性鞘磷脂酶或α-L-艾杜糖苷酸酶。
37.如项36所述的方法，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶。
38.如项33所述的方法，其中所述包含氨基氧基基团的寡糖是
Figure BDA00002429414600141
39.如项33所述的方法，其中所述包含氨基氧基基团的寡糖是
Figure BDA00002429414600142
40.用项33的方法制备的寡糖-蛋白质轭合物。
41.式IV的寡糖：
Figure BDA00002429414600151
式IV
其中m和p独立地选自1至10的整数。
42.如项41所述的寡糖，其中m是3。
43.如项41所述的寡糖，其中p是1。
44.如项41所述的寡糖，其中m是3且p是1。
45.式V的寡糖：
Figure BDA00002429414600161
式V。
46.寡糖-蛋白质轭合物，其包含(1)蛋白质，(2)寡糖，和(3)连接所述蛋白质和所述寡糖的肟基团，其中所述寡糖是式VI的寡糖：
Figure BDA00002429414600162
式VI。
47.如项46所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述蛋白质是糖蛋白。
48.如项47所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述糖蛋白是溶酶体酶。
49.如项48所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、酸性鞘磷脂酶或α-L-艾杜糖苷酸酶。
50.如项49所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶。
51.一种药物组合物，其包含项48的寡糖-糖蛋白轭合物和赋形剂。
52.一种治疗溶酶体贮积症的方法，其包括给哺乳动物施用项48的寡糖-糖蛋白轭合物，其中所述蛋白质是溶酶体酶。
53.如项52所述的方法，其进一步包括在用所述寡糖-糖蛋白轭合物治疗之前、之后或期间给哺乳动物施用甲氨蝶呤。
54.项48的轭合物用于治疗需要其的受治疗者的溶酶体贮积症的用途。
55.项48的轭合物在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。
附图说明
图1是描述本发明的方法的一个示例性实施方案的反应流程图。具有第一反应基团(酰肼基团)的寡糖1在催化剂3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮存在下与氨基氧基化合物2反应，产生寡糖3。然后用50%三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM)除去寡糖3的叔丁氧羰基(t-Boc)氨基保护基，产生寡糖4。
图2描述了图1中所述的合成流程图中的中间体的一系列凝胶色谱图。图2A是起始寡糖1的Dionex分析色谱图。图2B是寡糖3的Dionex分析色谱图。图2C是寡糖4的Dionex分析色谱图。
图3A是寡糖1的质谱图(计算分子量=1250；钠盐的计算分子量=1338)。图3B是寡糖4的质谱图(计算分子量=1323；钠盐的计算分子量=1411)。
图4是描述本发明的方法的一个示例性实施方案的反应流程图。具有第一反应基团(羧基基团)的寡糖5在偶联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下与氨基氧基化合物6反应，产生含有氨基氧基的寡糖3。然后用50%TFA/DCM除去寡糖3的Boc氨基保护基，产生寡糖4。
发明详述
I.包含氨基氧基基团的寡糖的制备
A.包含反应基团的寡糖
本发明的方法适用于大范围的包含反应基团的寡糖。本文所用的寡糖指二糖、三糖、四糖、五糖、多聚己糖、七聚糖或更大的寡糖(例如，包含2-50、2-10、8-25或8-50个糖单元的寡糖)。因此，在不同的实施方案中，寡糖可以是例如二糖、三糖、四糖、五糖、多聚己糖、七聚糖或更大的寡糖。寡糖可以是单-、二-、三-、四-或五-天线(antennary)结构。寡糖可包含0、1、2、3、4个或更多个分支点。
在一些实施方案中，也称为第一反应基团的寡糖上的反应基团可以是例如肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、氨基硫脲基团或胺基团。在一些实施方案中，第一反应基团可以是例如羧基、酯(例如，活化酯)、酰卤(例如，酰氟或酰氯)、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯或磺酰卤(例如，磺酰氯或磺酰溴)基团。
第一反应基团可连接于寡糖的还原端，或可位于寡糖的任何位置。在某些实施方案中，第一反应基团可通过一个或多个连接体(linker)连接于寡糖。本文所用的连接体可选自例如任选取代的烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰氧基、烷氧基、芳氧基和杂环基氧基的组合。连接体可被一个或多个杂原子例如氮、硫和氧中断或终止。例如，在一些实施方案中，连接体可包含一个或多个醚、酯或酰胺基团。
除非另有说明，否则连接体的任何化学基团(例如，烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰氧基、烷氧基、芳氧基和杂环基氧基)可以是取代的或未取代的。取代基可选自例如酰基、酰基氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳氧基、叠氮基、氨基甲酰基、烷氧羰基(carboalkoxy)、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、硝基、氧代、膦酰氨基(phosphonamino)、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酸酯、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基和脲基。取代基自身可以是取代的或未取代的，并且可以被一个或多个杂原子例如氮、硫和氧中断或终止。
在某些实施方案中，寡糖可包含至少一个保护基。术语“保护基”指可用于防止分子上的官能团(例如，胺基团、羧基基团、羟基基团、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团或氨基硫脲基团)发生化学反应、但分子的其它位置发生化学变化的任何取代基。保护基能在合适的化学条件下被除去。本领域技术人员已知大量的保护基，保护基的实例、添加它们的方法以及除去它们的方法可参见例如Greene等人,Protective Groups in OrganicSynthesis,第3版,John Wiley and Sons:纽约,1999和Kocienski,Protecting Groups,第3版,Georg Thieme Verlag:Stuttgard,德国,2005，将其公开内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，寡糖可包含至少一个选自羟基保护基、羧基保护基和氨基保护基的保护基。在另一些实施方案中，寡糖可以是“未保护的”，并且可以不包含任何保护基。
寡糖可从天然来源分离得到或者可通过化学合成或酶促合成来制备。从天然来源分离的寡糖可以是同质的或者可以是相关寡糖的异质混合物。在一些实施方案中，寡糖可通过化学或酶促修饰从天然来源分离的寡糖来制备(“半合成”)。在一些实施方案中，寡糖可以是具有天然存在的寡糖的化学结构的合成寡糖。
在一些实施方案中，寡糖可包含被特定受体识别的单糖。被特定受体识别的单糖可选自例如半乳糖、GaINAc、甘露糖、M6P、葡萄糖、GIcNAc、唾液酸或硫酸化唾液酸残基。在某些实施方案中，寡糖可包含至少一个M6P残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个M6P残基。
在一些实施方案中，被特定受体识别的单糖可以是次末端单糖或末端单糖。在一些实施方案中，被特定受体识别的单糖可以是末端半乳糖、甘露糖、M6P、葡萄糖、GIcNAc或唾液酸残基。在一些实施方案中，寡糖可含有至少1、2、3、4、5、6、7个末端M6P残基。
在某些实施方案中，包含反应基团的寡糖可以是式Ia的含有M6P的多聚己糖：
式Ia
式Ia的寡糖可描述为丁酰肼-4-基6-O-膦酰基-α-D-吡喃甘露糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基-(1→6)-α-D-吡喃甘露糖基-(1→6)-[6-O-膦酰基-α-D-吡喃甘露糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基-(1→3)]-β-D-吡喃甘露糖苷。
在某些实施方案中，包含反应基团的寡糖可以是式Ib的含有M6P的多聚己糖：
Figure BDA00002429414600211
式Ib
B.氨基氧基化合物
本文所用的氨基氧基化合物可以是包含氨基氧基基团和第二反应基团的任何化合物，其中第二反应基团可与寡糖上的第一反应基团反应以形成共价键。例如，在一些实施方案中，第二反应基团可以是羧基、酯(例如，活化酯)、酰卤(例如，酰氟或酰氯)、酰叠氮、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯或磺酰卤(例如，磺酰氯或磺酰溴)基团。在另一些实施方案中，第二反应基团可以是例如肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、氨基硫脲基团或胺基团。
在某些实施方案中，氨基氧基化合物的氨基氧基基团的氮被氨基保护基保护。本领域技术人员已知大量氨基保护基，氨基保护基的实例、添加它们的方法和除去它们的方法可参见Greene等人,Protective Groups inOrganic Synthesis,第3版,John Wiley and Sons:纽约,1999的第494-653页；Kocienski，Protecting Groups,第3版,Georg Thieme Verlag:Stuttgard,德国,2005的第8章；Bodanszky,Principles of Peptide Synthesis,SpringerVerlag:纽约,1993；Lloyd-Williams等人,Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins,CRC Press:Boca Raton,FL,1997；以及Stewart等人,Solid Phase Peptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical Co.:Rockford,IL,1984，将其发明通过引用并入本文。
在一些实施方案中，氨基氧基化合物选自式II的化合物：
Figure BDA00002429414600221
式II
其中Y是第二反应基团，Z选自烷基、链烯基、炔基、杂芳基、芳基和杂环基，且P选自氨基保护基。
除非另有说明，否则本文所用的氨基氧基化合物上的任何化学基团(例如，烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰氧基、烷氧基、芳氧基和杂环基氧基)可以是取代的或未取代的，并且可以被一个或多个化学基团中断。取代基和中断化学基团可选自例如酰基、酰基氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳氧基、叠氮基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酸酯、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基和脲基。取代基自身可以是取代的或未取代的，并且可以被一个或多个杂原子例如氮、硫和氧中断或终止。
在某些实施方案中，Y可选自例如：
其中X选自卤素、叠氮化物(azide)、酰氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
在某些实施方案中，氨基氧基化合物是活化酯。本文所用的活化酯是在温和条件下反应形成酰胺键的酯。一般而言，活化酯是较具酸性的醇的酯。在某些实施方案中，式II的氨基氧基化合物是式的活化酯，且X选自烷氧基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。例如，X可选自：
Figure BDA00002429414600251
在另一些实施方案中，Y选自例如酰肼、肼、氨基硫脲、氨基脲和胺基团。
在一些实施方案中，Z可包含例如羰基、醚、酯或酰胺基团。在一些实施方案中，Z可以是例如被一个或多个杂原子中断的烷基，如寡聚乙二醇(oligoethyleneglycol)。例如，Z可以是单乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇或更大的寡聚乙二醇。
在一些实施方案中，Z可以是例如被氧代取代的并且被一个或多个杂原子中断的烷基，如寡肽。例如，寡肽可包含1、2、3、4、5、6个或更多个组成氨基酸。氨基酸可以是例如α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸和ω-氨基酸。氨基酸可以在任何手性原子处具有R或S手性。氨基酸可选自例如丙氨酸、β-丙氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、1-氨基环戊烷甲酸、6-氨基己酸、2-氨基庚二酸、7-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、氨基甲基吡咯甲酸、8-氨基-3,6-二氧杂-辛酸、氨基哌啶甲酸、3-氨基-丙酸、氨基丝氨酸、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、氮杂环丁烷甲酸、苯并噻唑基丙氨酸、丁基甘氨酸、肉碱、4-氯苯基丙氨酸、瓜氨酸、环己基丙氨酸、环己基抑胃酶氨酸(cyclohexylstatine)、半胱氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、二羟基苯基丙氨酸、二甲基噻唑烷甲酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、高丝氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、六氢异烟酸、亮氨酸、赖氨酸、亚甲基并脯氨酸(methanoproline)、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、对氨基苯甲酸、青霉胺、苯基丙氨酸、苯基甘氨酸、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、抑胃酶氨酸、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、别异亮氨酸、别苏氨酸、2,6-二氨基-4-己酸、2,6-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、dicarboxidine、高精氨酸、高瓜氨酸、高半胱氨酸、高胱氨酸、高苯基丙氨酸、高脯氨酸和4-肼基苯甲酸。
P可选自本领域技术人员已知的氨基保护基。在一些实施方案中，P可以是氨基甲酸酯保护基，例如，(9-芴基甲基)氨基甲酸酯(Fmoc)、(叔丁氧基)氨基甲酸酯(t-Boc)、(三氯乙基)氨基甲酸酯(Troc)或烯丙基氨基甲酸酯(Alloc)保护基。在另一些实施方案中，P可以是非氨基甲酸酯保护基，例如酰胺保护基，如苯邻二甲酰亚胺或三氟乙酰胺保护基。
在一些实施方案中，式II的氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600261
式III
其中Y和P如上文所公开，且n选自1至10的整数。
在某些实施方案中，n可以选自来自以下范围的整数：1-4、2-6、2-8、3-6和4-10。在示例性的实施方案中，n是1。
在一个示例性的实施方案中，氨基氧基化合物是t-Boc-氨基氧基乙酸四氟苯基酯，其结构如下所示。
Figure BDA00002429414600271
在另一个示例性的实施方案中，氨基氧基化合物具有以下所示的结构。
Figure BDA00002429414600272
C.制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法
在另一个实施方案中，本发明提供了从包含反应基团的寡糖制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法。该方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖；
(b)提供包含第二反应基团的氨基氧基化合物；和
(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应，从而制得包含氨基氧基基团的寡糖。
包含第一反应化合物的寡糖可以是例如包含上文所述的反应基团的任何寡糖。在示例性的实施方案中，包含第一反应基团的寡糖是式Ia的寡糖或式Ib的寡糖。包含第二反应基团的氨基氧基化合物可以是包含上文所述的反应基团的任何氨基氧基化合物。
本文所用的术语“第一反应基团”和“第二反应基团”不表示任何特定的实验顺序。即，步骤(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应可通过反应物的任何添加顺序完成。例如，可将包含第一反应基团的寡糖加入到包含第二反应基团的氨基氧基化合物中，或反之亦然。在另一个实例中，可将寡糖和氨基氧基化合物同时加入到反应容器中。
步骤(c)可以在本领域普通技术人员所知的任何合适条件(例如溶剂和温度)下发生。在某些实施方案中，在步骤(c)期间可存在一种或多种另外的试剂，例如偶联试剂和催化剂。本文所用的偶联试剂是可用于在第一反应基团和第二反应基团之间形成共价键的试剂。
在一些实施方案中，例如，当第一反应基团或第二反应基团是羧基时，反应条件可包括偶联试剂。偶联试剂可选自例如
Figure BDA00002429414600281
偶联试剂，例如BOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-)、
Figure BDA00002429414600283
(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-
Figure BDA00002429414600284
)和
Figure BDA00002429414600285
(六氟磷酸三吡咯烷子基溴化
Figure BDA00002429414600286
)，以及选自铵(脲
Figure BDA00002429414600287
)偶联试剂，例如HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲
Figure BDA00002429414600288
)、HATU(六氟磷酸2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲
Figure BDA00002429414600289
)、TBTU(四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲
Figure BDA000024294146002810
)。偶联试剂还可选自例如碳二亚胺偶联试剂，例如DIC(1，3-二异丙基碳二亚胺)、CDI(1，1′羰基二咪唑)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)。例如，在一些示例性实施方案中，偶联试剂是EDC。在某些实施方案中，反应条件既包括偶联试剂，又包括催化剂。
在某些实施方案中，反应条件可包括催化剂。催化剂可选自本领域技术人员已知的任何合适的催化剂，例如DHBt-OH(3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)、HOBt(N-羟基苯并三唑)、DMAP(4-二甲基氨基吡啶)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、HONB(N-羟基-5-降冰片烯-内-2，3-二-甲酰亚胺)或四丁铵盐，例如TBAI(碘化四丁铵)。在一些示例性实施方案中，反应条件包括催化剂DHBt-OH或催化剂NHS。
在一些实施方案中，步骤(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应导致形成酰胺键。适合于形成酰胺键的条件是本领域普通技术人员所公知的，并且描述于例如Chan等人编辑，Fmoc Solid PhasePeptide Synthesis：A Practical Approach，Oxford University Press：纽约，2000；Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag：纽约，1993；Lloyd-Williams等人，Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins，CRC Press：Boca Raton，FL，1997；以及(San Diego，CA)目录。
在某些实施方案中，氨基氧基化合物包含氨基保护基，且所述方法包含进一步的步骤(d)，将包含氨基氧基基团的寡糖去保护以除去氨基保护基。去保护可在本领域技术人员所知的任何合适条件下发生，例如在Greene等人,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wileyand Sons:纽约,1999的第494-653页和Kocienski,Protecting Groups,第3版,Georg Thieme Verlag:Stuttgard,德国,2005中所教导的那些，将其发明通过引用并入本文。
本发明的方法的一个示例性实施方案提供了制备含有M6P的包含氨基氧基基团的寡糖的方法。该方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述的寡糖是：
(b)提供包含第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述的氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600292
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是第二反应基团；和
(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应，从而制得包含氨基氧基基团的寡糖。
在某些实施方案中，式III中的Y是其中X选自羟基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。例如，在某些示例性实施方案中，X是
在示例性实施方案中，氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600303
在某些实施方案中，寡糖的第一反应基团可在偶联剂例如EDC和/或催化剂例如DHBt-OH存在下与氨基氧基化合物的第二反应基团反应。
本发明的方法的另一个示例性实施方案包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述的寡糖是：
Figure BDA00002429414600304
(b)提供包含第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述的氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure BDA00002429414600311
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是第二反应基团；和
(c)使寡糖的第一反应基团与氨基氧基化合物的第二反应基团反应，从而制得包含氨基氧基基团的寡糖。
在某些实施方案中，式III中的Y是肼、酰肼、氨基氧基、氨基硫脲、氨基脲或胺基团。在某些实施方案中，式III中的Y是
Figure BDA00002429414600312
在示例性实施方案中，氨基氧基化合物是
Figure BDA00002429414600313
在某些实施方案中，寡糖的第一反应基团可在偶联剂例如EDC和/或催化剂例如NHS存在下与氨基氧基化合物的第二反应基团反应。
II.包含氨基氧基基团的寡糖
本发明还提供了包含氨基氧基基团的寡糖。在一些实施方案中，本发明提供了用上文所公开的方法制备的包含氨基氧基基团的寡糖。包含氨基氧基基团的寡糖可包含例如至少2、3、4、5、6个或更多个单糖，其包括例如至少一个半乳糖、GaINAc、甘露糖、M6P、葡萄糖、GIcNAc、唾液酸或硫酸化唾液酸残基。这类寡糖可以是单-、二-、三-、四-或五-天线结构，并且可含有0、1、2、3、4个或更多个分支点。
在一些实施方案中，本发明提供了包含(1)氨基氧基基团和(2)甘露糖-6-磷酸的寡糖。在一些实施方案中，包含氨基氧基基团的寡糖可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个M6P残基。在一些实施方案中，包含氨基氧基基团的寡糖可包含至少1、2、3、4个或更多个末端或次末端M6P残基。
在某些实施方案中，包含氨基氧基基团的寡糖选自式IV的寡糖：
Figure BDA00002429414600321
式IV
其中m和p独立地选自1至10的整数。例如，在某些实施方案中，m和p可独立地选自选于以下范围的整数：1-4、2-6、2-8、3-6和4-10。在示例性的实施方案中，m是3且p是1。
在另一些实施方案中，氨基氧基基团直接键合于寡糖的还原端。例如，在一些实施方案中，包含氨基氧基基团的寡糖可以是式V的寡糖：
Figure BDA00002429414600331
式V。
III.包含氨基氧基基团的寡糖与蛋白质的轭合
A.寡糖
有待与蛋白质轭合的寡糖可选自上文所讨论的包含反应基团的任何寡糖，并且可选自上文所讨论的包含氨基氧基基团的任何寡糖。例如，在一些实施方案中，待轭合的寡糖可以是式Ia、式Ib、式IV或式V的寡糖。
B.蛋白质
本文所述的轭合方法广泛适用于任何纯的蛋白质、特别是纯化的蛋白质，或其片段，其具有至少一个羰基基团(其中羰基基团是酮或醛)，包括分离的蛋白质以及重组或合成制备的蛋白质。术语“纯的”、“纯化的”和“分离的”指基本脱离其自然环境的分子。例如，纯的蛋白质基本不含来自衍生它的细胞或组织来源的细胞物质和/或其它蛋白质。该术语指例如至少70%-80%、80%-90%、90-95%；或至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)纯的制品。
在另一些实施方案中，蛋白质可以是在pH 1-7、例如1-3、2-5、3-6、4-5、5-6或4-6下通过活性测定显示具有最佳活性的酶。例如，该酶可具有处于pH 4-6范围的最佳pH。
在一些实施方案中，蛋白质可以是具有从1至8例如1-3、2-5、3-8、4-5、5-6、4-6、5-8、6-8或7-8的等电点(pI)的酶。可使用例如等电聚焦凝胶电泳测量蛋白质的pI。
在一些实施方案中，通过使用具有扩张的遗传密码的表达系统获得含有羰基基团的蛋白质，如例如Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:56-61(2003)中所述。在这种情况下，羰基基团可位于所翻译的氨基酸侧链上。
在某些实施方案中，具有至少一个羰基基团的蛋白质是具有至少一个寡糖的蛋白质(即糖蛋白)。例如，可通过用本领域技术人员所知的任何方法氧化糖蛋白来获得具有至少一个羰基基团的糖蛋白。在一些实施方案中，例如，具有至少一个羰基基团的糖蛋白可通过用高碘酸盐(例如，高碘酸钠)或用半乳糖氧化酶氧化糖蛋白来获得。在这种情况下，羰基基团可位于蛋白质糖基化位点。
在某些实施方案中，具有至少一个羰基基团的蛋白质是糖蛋白，如治疗性糖蛋白。治疗性糖蛋白可通过与包含甘露糖-6-磷酸的寡糖轭合来靶向于溶酶体。例如，糖蛋白可以是溶酶体酶，包括ERT酶。酶可以是溶酶体水解酶，包括表1中所列的那些。在某些实施方案中，溶酶体水解酶选自例如α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A和酸性鞘磷脂酶。在某些实施方案中，溶酶体水解酶是GAA。
表1：LSD的实例和相应的溶酶体水解酶
Figure BDA00002429414600341
Figure BDA00002429414600351
在某些实施方案中，糖蛋白可以是具有至少1、2、3、4、5个或更多个N-键合的或O-键合的糖基化氨基酸残基的糖蛋白。在另一些实施方案中，蛋白质可具有1、2、3、4、5个或更多个N-键合的或O-键合的糖基化的共有位点，它们中至少一个是糖基化的。
在某些实施方案中，蛋白质可以是受体的配体。例如，在一些实施方案中，蛋白质可以是与识别糖(例如，甘露糖或甘露糖-6-磷酸)的受体结合的糖蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白可与例如脱唾液酸糖蛋白受体、阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体、胰岛素样生长因子II/非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体或巨噬细胞甘露糖受体结合。
在某些实施方案中，蛋白质是一种糖蛋白，该糖蛋白当与包含甘露糖-6-磷酸的寡糖轭合时与相应的未轭合的糖蛋白相比更加有效地被靶细胞纳入(例如，经由CI-MPR-介导的胞吞作用)。例如，在给定的时间段内，轭合的糖蛋白比未轭合的糖蛋白的纳入更有效例如至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%或90%(w/w)。在另一些实施方案中，在给定的时间段内，相对于未轭合的糖蛋白，可纳入至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍(w/w)的轭合的糖蛋白。所述的时间段可以是例如10、30、45分钟或1、2、3、5、6、12、24、48或72小时，或更长。
C.将寡糖与蛋白质偶联的方法
本发明提供了将寡糖与蛋白质(例如，糖蛋白)偶联的方法。在一个实施方案中，该方法包括：
(a)提供包含氨基氧基基团的寡糖；
(b)提供具有至少一个羰基基团的蛋白质；和
(c)使寡糖的氨基氧基基团与蛋白质的至少一个羰基基团反应，从而将寡糖与蛋白质偶联。
在某些实施方案中，该方法进一步包括向偶联的溶酶体酶中加入还原剂。所述还原剂可以是本领域技术人员所知的任何还原剂，例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠(STAB)。
IV.寡糖-蛋白质轭合物
本发明进一步提供了寡糖-蛋白质轭合物，其包含(1)蛋白质，(2)寡糖，和(3)连接蛋白质和寡糖的肟基团。在一些实施方案中，本发明提供了用上文所公开的方法制备的寡糖-蛋白质轭合物。轭合物的寡糖和蛋白质组分可以是例如本文描述的任何寡糖和蛋白质，其中其轭合物包含下文所述的肟基团。(下文所述的肟基团在形式上衍生自氨基氧基基团和醛基团的反应；本发明还涵盖在形式上衍生自氨基氧基基团和酮基团的反应的肟基团。)
Figure BDA00002429414600371
在某些实施方案中，寡糖-蛋白质轭合物是寡糖-糖蛋白轭合物。在某些实施方案中，寡糖-蛋白质轭合物是包含至少一个M6P的寡糖和溶酶体水解酶的轭合物。
V.药物组合物
本公开物提供了本发明的轭合物在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。其还提供了包含本发明的寡糖-蛋白质轭合物的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含含有至少一个M6P的寡糖与溶酶体酶的轭合物。
本发明的药物组合物可包含一种或多种合适的药物赋形剂。标准的药物配制技术和赋形剂对本领域技术人员而言是公知的(参见例如2005Physicians' Desk
Figure BDA00002429414600372
Thomson Healthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Gennado等人编辑,Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。组合物可含有或可不含有防腐剂。在一些实施方案中，包含α-半乳糖苷酶A轭合物的药物组合物可包含一种或多种赋形剂，例如甘露醇、磷酸二氢钠一水合物和/或磷酸氢二钠七水合物。在一些实施方案中，包含α-葡糖苷酶的轭合物的药物组合物可包含一种或多种赋形剂，例如甘露醇、聚山梨酯80、磷酸氢二钠七水合物和磷酸二氢钠一水合物。
药物组合物可包含本文所述的轭合物中的任何一种作为唯一的活性化合物，或者可包含本文所述的轭合物中的任何一种与另外的化合物、组合物或生物材料的组合。例如，药物组合物还可包含一种或多种用于治疗LSD和/或与LSD相关的副作用的小分子。在一些实施方案中，组合物可包含美格鲁特(miglustat)和/或在例如美国专利申请公开No.2003/0050299、2003/0153768、2005/0222244、2005/0267094中所述的一种或多种化合物。
药物组合物的配制可根据预期的施用途径和其它参数而变化(参见例如Rowe等人.Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版，APhAPublications,2003)。在一些实施方案中，组合物可以是无菌无热源的白色至灰白色的冻干饼或粉末，其在用无菌注射用水USP重构后通过静脉内注射施用。
本发明的药物组合物的施用不限于任何特定的递送系统，可包括但不限于胃肠外(包括皮下、静脉内、颅内、髓内、关节内、肌内、鞘内或腹膜内注射)、透皮或口服(例如以胶囊剂、混悬剂或片剂形式口服)。对个体的施用可以以单剂量或以重复施用进行，可以以各种生理学上可接受的盐形式中的任何一种进行，和/或与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体和/或添加剂一起进行。
本文所述的轭合物以治疗有效量施用。一般而言，治疗有效量可随着受治疗者的年龄、状况和性别以及受治疗者的医学疾患的严重性而变化。剂量可由医生确定，并且必要时可进行调整以满足治疗的观察效果。这类化合物的毒性和疗效可通过体外(即细胞培养物)或体内(即实验动物模型)标准药学方法来确定，例如，测定LD50(导致群体50%死亡的剂量)和ED50(对群体50%有疗效的剂量)的标准药学方法。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数(或治疗比率)，其可表达为LD50/ED50的比值。本文描述了表现出至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10和20的治疗指数的轭合物。优选表现出大的治疗指数的轭合物。
例如，从体外测定和动物研究所获得的数据可用于制定在人类中使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选处于循环浓度的范围内，所述范围包括ED50，具有低毒性、几乎没有毒性或无毒性。剂量可根据所用的剂型和所用的施用途径在这一范围内变化。对于本发明所用的任何轭合物而言，可用体外测定初步评估治疗有效剂量。可用动物模型制定剂量，以实现包含体外实验所确定的IC50(即，实现症状半数最大抑制的供试轭合物的浓度)的循环血浆浓度范围。例如，可通过高效液相色谱或通过合适的酶活性测定来测量血浆中的水平。任何特定剂量的效应可通过合适的终点生物测定来监测。
除非另有说明，否则本发明的轭合物可根据症状的严重性和疾病的进展以约1μg/kg至500mg/kg的剂量施用。例如，蛋白质性质的化合物在门诊患者情况中可通过例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天进行一次缓慢静脉内输注来施用，或者例如每周一次、每两周一次、每个月一次或每两个月一次施用。化合物的合适的治疗有效剂量由治疗临床医生选择，其范围约为从1μg/kg至500mg/kg、从1μg/kg至10mg/kg、从1μg/kg至1mg/kg、从10μg/kg至1mg/kg、从10μg/kg至100μg/kg、从100μg至1mg/kg以及从500μg/kg至5mg/kg。
例如，α-半乳糖苷酶A的轭合物可以以例如每两周1.0mg/kg体重的剂量以例如小于或等于10、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33mg/小时的输注速率通过静脉内输注施用。在另一个实例中，α-葡糖苷酶的轭合物可以以例如每两周20mg/kg或40mg/kg的剂量历经约例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小时静脉内注射施用。在一些实施方案中，α-葡糖苷酶的施用速率可以以例如1mg/kg/hr开始，然后在建立患者对输注速率的耐受性之后，以例如每30分钟2mg/kg/hr增加，直到最大值，例如7mg/kg/hr的最大值。此外，特定剂量的实例可参见Physicians' Desk
Figure BDA00002429414600391
VI.治疗溶酶体贮积症的方法
本发明提供了治疗溶酶体贮积症(例如表1中所公开的那些)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的轭合物用于治疗需要其的受治疗者的溶酶体贮积症的用途。本发明进一步提供了通过与包含甘露糖-6-磷酸的寡糖轭合使蛋白质靶向于溶酶体的方法。
在一个实施方案中，该方法包括给具有溶酶体贮积症的哺乳动物以治疗有效量施用本发明的寡糖-糖蛋白轭合物。该寡糖-糖蛋白轭合物可以是溶酶体酶(如表1中所列出的溶酶体酶)与包含甘露糖-6-磷酸的寡糖的轭合物。在一个实施方案中，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含至少一种本文所述的轭合物的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的轭合物可以与一种或多种其它治疗剂一起施用。所述的一种或多种其它治疗剂可以与本发明的轭合物同时施用(包括以组合制剂的形式同时施用)、在其之前施用或在其之后施用。
在一些实施方案中，患者可以用退热药、抗组胺药和/或免疫抑制剂治疗(在用本发明的轭合物治疗之前、之后或在此期间)。在一些实施方案中，在用本发明的寡糖-糖蛋白轭合物治疗之前，患者可用退热药、抗组胺药和/或免疫抑制剂治疗，以便降低或防止与输注相关的反应。例如，患者可用对乙酰氨基酚、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素A、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯、口服类固醇或雷帕霉素中的一种或多种进行预治疗。
在一些实施方案中，对于例如用本发明的轭合物进行的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次治疗而言，患者可在或约例如t=0(施用本发明的轭合物的时间)和/或t=12、24、36、48、60、72、96、120和144小时用对乙酰氨基酚、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素A、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯、口服类固醇或雷帕霉素中的一种或多种进行治疗。例如，在一些实施方案中，对于用本发明的轭合物进行的例如前1、2、3、4、5、6、7、8周的治疗而言，可在或约例如t=0、24和48小时用甲氨蝶呤(例如用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、25、30、35、40、50、60、70、80mg/kg甲氨蝶呤或更多甲氨蝶呤)治疗患有法布里病或庞皮病的患者。在一些实施方案中，通过用环孢菌素A和硫唑嘌呤治疗在具有溶酶体贮积症(例如I型粘多糖贮积病)的患者中诱导对本发明的轭合物的免疫耐受性。例如，可以如Kakkis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:829-834(2004)中所述的那样用环孢菌素A和硫唑嘌呤对患者进行治疗。
在一些实施方案中，可用例如小分子疗法和/或基因疗法(包括针对治疗溶酶体贮积症的小分子疗法和基因疗法)来治疗(在用本发明的轭合物治疗之前、之后或期间)患者。小分子疗法可包括施用例如美国专利申请公布No.2003/0050299、2003/0153768、2005/0222244和2005/0267094中描述的一种或多种化合物。基因疗法可按照例如美国专利No.5,952,516、6,066,626、6,071,890和6,287,857以及美国专利申请公布No.2003/0087868中所述的那样进行。
术语“治疗”、“治疗方法”以及它们的同性质词指治疗性治疗和预防性/防御性措施。因此，需要治疗的那些受治疗者可包括已经患有特定的溶酶体贮积症的个体以及处于该疾病风险的个体(即，可能最终获得该病症或该病症的某些症状的那些个体)。
治疗方法导致症状的预防或改善或另外的所需的生物学结果，并且可通过临床体征的改善或疾病发作的延迟、代谢缺乏酶活性的提高和/或代谢缺乏酶的蓄积底物水平的降低来评价。
本发明的轭合物用于治疗多种人或动物的溶酶体贮积症。例如，施用本发明的轭合物可用于将患者的缺乏酶活性增加例如至少10%。酶活性的增加可通过例如临床症状的减少或通过合适的临床或生物学测定来确认。
可施用GAA轭合物来治疗庞皮病(也称为酸性α-葡糖苷酶缺乏、酸性麦芽糖酶缺乏、糖原贮积病II型、糖原病II型和溶酶体α-葡糖苷酶缺乏)。通过生物化学(参见例如Zhu等人,J.Biol.Chem.279:50336-50341(2004))或组织学观察例如心肌细胞、骨骼肌细胞或皮肤成纤维细胞中溶酶体糖原蓄积的减少可确认GAA活性的增加。还可在例如肌肉活检样品、培养的皮肤成纤维细胞、淋巴细胞或干燥血斑点中测定GAA活性。干燥血斑点测定在例如Umpathysivam等人,Clin.Chem.47:1378-1383(2001)以及Li等人,Clin.Chem.50:1785-1796(2004)中有描述。还可通过例如肌酸酐激酶的血清水平、运动功能的增益(例如，通过阿尔伯塔婴幼儿动作评估量表(Alberta Infant Motor Scale)评价)、由超声心动图测量的左心室质量指数的变化以及由心电图测量的心电活动来评价庞皮病的治疗。施用GAA轭合物可导致庞皮病的一种或多种症状减轻，所述症状例如心肥大、心肌病、日间嗜睡(daytime somnoiescence)、劳力性呼吸困难、发育停滞(failure tothrive)、进食困难、“懒散(floppiness)”、步态异常、头痛、张力过低、内脏增大(例如心、舌、肝增大)、脊柱前凸、丧失平衡、下腰痛、早晨头痛、肌无力、呼吸功能不全、肩胛翘起(scapular winging)、脊柱侧凸、深部腱反射减弱、睡眠呼吸暂停、易感呼吸道感染和呕吐。
在另一个方面，施用α-半乳糖苷酶A与包含M6P的寡糖的轭合物来治疗法布里病。法布里病或安德森-法布里(Anderson-Fabry)病是一种少见的伴X染色体的溶酶体贮积症，其特征为α-半乳糖苷酶A缺乏，该病导致神经酰胺己三糖苷(GL3)和其它中性鞘糖脂在内脏组织以及内皮、外周和肌肉细胞的溶酶体中蓄积。中性鞘糖脂在脉管系统中的蓄积导致血管变窄和扩张，并最终导致局部缺血和梗塞。
施用α-半乳糖苷酶A轭合物可导致法布里病的一种或多种临床症状减轻，所述症状包括例如肢端感觉异常、绞痛、血管角质瘤、心率不齐(arrythmia)、步态的共济失调、手和足的灼痛和/或刺痛、白内障、寒冷耐受不良、传导异常、角膜螺层(corneal whorling)、冠状动脉病、痴呆、抑郁、腹泻、心腔扩张、头晕、心肥大、心肌病、复视、构音困难、疲劳、伴有红细胞沉降率升高的发热、听力问题、心脏病、心瓣膜问题、热耐受不良、偏身共济失调、轻偏瘫、少汗、发汗受损、梗塞、局部缺血、关节痛、肾病、左心室肥大、晶状体异常(lenticular abnormalities)、晶状体混浊、脂类尿、肌无力、心肌梗塞、恶心、眼球震颤、疼痛(例如放射状扩散至全身的剧痛)、烦渴、蛋白尿、食后痛、肾衰竭、视网膜异常、耳鸣、胃痛、ST-T波形变化、中风、尿毒症、瓣膜病、眩晕、呕吐和虚弱。施用α-半乳糖苷酶A轭合物可导致在例如血浆、泪液、白细胞、活检组织或培养的皮肤成纤维细胞中的α-半乳糖苷酶A活性增加。施用α-半乳糖苷酶A轭合物还可产生双折射脂质小球增加的减少(例如减少至少10%)或缺失的组织学发现。其还可导致尿沉淀中脂质小球减少、肾功能改善(按照血清肌酸酐水平或肌酸酐清除率测量)和蛋白尿减轻。施用α-半乳糖苷酶A轭合物还可导致肾、心脏和皮肤的毛细血管内皮中GL3内含物减少。用于测量法布里病的治疗功效的另外的测定法可参见例如MacDermott等人,J.Med.Genet.38:750-760(2001)。
在又一个方面，施用酸性鞘磷脂酶的轭合物来治疗尼-皮病或酸性鞘磷脂酶缺乏。施用酸性鞘磷脂酶轭合物可导致尼-皮病的一种或多种临床症状减轻，所述症状包括例如异常的胆固醇水平、异常的脂质水平、共济失调、血液异常、眼的樱桃红斑、频繁的肺部感染、生长迟缓、肝脾大、血小板数量低、淋巴结病、周围神经病、肺功能问题、呼吸浅促、皮肤色素沉着变化或黄色瘤。在一些实施方案中，可颅内施用轭合物。
一个可选的实施方案涉及用包含α-L-艾杜糖苷酸酶的轭合物治疗粘多糖贮积病I型(包括，例如MPS I的胡尔勒综合征和胡-沙综合征形式)。施用α-L-艾杜糖苷酸酶轭合物可导致MPS I的一种或多种临床症状减轻，所述症状包括例如主动脉瓣反流、主动脉瓣狭窄、腕管综合征、慢性鼻炎、传导性耳聋、便秘、角膜混浊、发展迟缓、腹泻、腹胀(distended abdomen)、背腰脊柱后凸(dorsolumbar kyphosis)、背部驼背变形、肝脾大、脑积水、腹股沟疝、脊柱后凸、精神发育迟缓、二尖瓣反流、二尖瓣狭窄、夜盲、开角型青光眼、手功能不良(poor hand function)、进行性关节病、复发性呼吸道感染、呼吸功能不全、视网膜变性、脊柱侧凸、感觉神经性耳聋、严重背痛、鼻溢、睡眠呼吸暂停、脊髓压迫、鱼际萎缩(thenar atrophy)、脐疝和上呼吸道并发症。
以上所述和以下的描述仅仅是举例性的和解释性的，不限制要求保护的发明。
实施例
下面的实施例1-4描述了图1中所示的合成路线。下文所用的化合物1、2、3和4具有图1中所示的化学结构。
实施例1：寡糖3的合成
将100mg寡糖1(MW=1250；双M6P-酰肼，由加拿大Edmonton的Biomira Inc.提供)溶解于15ml DMSO/H2O(50:50体积比)中，得到5.3μmol/ml的溶液。将100mg t-Boc-氨基氧基乙酸四氟苯基酯2(InvitrogenCorp.;Carlsbad,CA;目录#B3030)溶解于7.5ml DMSO中。然后将15ml寡糖溶液与7.5ml 2的溶液在玻璃瓶中混合，导致在所得的溶液中化合物2:化合物1的摩尔比是4:1。向在玻璃瓶中的反应混合物中加入744μlDHBt-OH(来自32.06mg/ml DMSO储备溶液)，导致化合物2:DHBt-OH的最终比例为1:0.5。将该混合物在室温(25℃)下以100RPM温和振荡过夜约18个小时。
次日早晨，取出10μl反应混合物用于Dionex分析，以确定反应完全。结果如图2所示，显示从1到3的转化率为100%。
实施例2：寡糖3的纯化
方法A将反应混合物用等体积的H2O稀释，并在截留分子量为1000道尔顿的透析管(SpectraPor Inc.)中用4L H2O在4℃下透析两次，每次持续至少3小时。然后冻干样品。
方法B填装具有225ml的柱床体积的Sephadex G-10凝胶渗透色谱柱，并用去离子水平衡。将反应混合物装载于柱上，通过重力使之流下，然后用去离子水以每小时75ml的流速洗脱。用级分收集器收集4.5ml级分。级分10-23含有寡糖3，将其收集、合并并冻干。弃去在后面级分中洗脱的其它小分子，包括t-Boc-AOAA、DHBt-OH和DMSO。
实施例3：寡糖3的去保护
在以100RPM温和振荡的情况下，在玻璃瓶中，将冻干样品的t-Boc基团在5ml在二氯甲烷(DCM)中的50%三氟乙酸(TFA)中去保护30分钟。然后在化学通风橱中用氮气流除去TFA/DCM。
实施例4：寡糖4的纯化
方法A除去TFA/DCM后，将残余物溶解于10ml pH 5的0.5M乙酸钠缓冲液中，转移至截留分子量为1000道尔顿的透析管中。将瓶用4ml相同的缓冲液洗涤，然后将该缓冲液转移至透析管中。将样品用3L pH 7的25mM乙酸钠缓冲液透析2次，持续至少3小时，然后转移至4L冰冷的H2O上透析过夜。从透析管中回收样品，冻干。
方法B除去TFA/DCM后，将残余物溶解于5ml pH 7.5的0.5M乙酸钠缓冲液中，装载到与实施例2方法B中相同的Sephadex G-10凝胶渗透色谱柱上。将反应混合物装载于柱上，通过重力使之流下，然后用去离子水以每小时75ml的流速洗脱。用级分收集器收集4.5ml级分。级分10-23含有纯化的寡糖4，将其收集并冻干。用方法B纯化比用方法A纯化获得的寡糖4收率更高。
用Dionex色谱分析任何获自方法B的终产物(图2C)，用质谱鉴别产物(图3B)。在图2C和图3B的图谱中存在一些杂质。
实施例5：寡糖4与GAA的偶联
GAA的氧化将冻干的重组人GAA(rhGAA)在H2O中重构并用4L100mM乙酸盐缓冲液(pH 5.6)透析4次以完全除去甘露醇。透析后，将rhGAA用来自100mM储备溶液的7.5mM高碘酸钠在100mM乙酸盐缓冲液中氧化。4℃下在冰上30分钟后，加入甘油，将样品在冰上混合10分钟以分解过量的高碘酸钠。然后用缓冲水溶液(例如，100mM乙酸钠)透析氧化的物质过夜。
偶联 将寡糖4在缓冲水溶液(例如，100mM乙酸钠，pH 5.6)中的溶液与氧化的GAA混合并在37℃下孵育4小时以生成寡糖-GAA轭合物5。然后将反应混合物用25mM pH 6.25的磷酸钠缓冲液渗滤以除去未轭合的双M6P聚糖，然后用GAA配制缓冲液(25mM磷酸钠缓冲液，pH 6.25，2%甘露醇，0.005%吐温-80)调整。
实施例6：GAA轭合物的定性
M6P的检测通过测定轭合物5对M6P受体柱的结合测量寡糖轭合的程度，缺少M6P的糖蛋白不结合所述M6P受体柱。将5微克轭合物5装载于预先平衡的CI-MPR-Sepharose柱(该柱式通过将从胎牛血清分离出的CI-MPR与Affigel-10偶联来制备的)，然后用CI-MPR结合缓冲液洗涤，得到11×2mL级分，用含有5mM M6P的CI-MPR结合缓冲液洗脱，得到7×2mL级分。收集总计18个级分，并测定其酶活性。
单糖分析用4N三氟乙酸处理轭合物5以水解寡糖，随后在BioLC液相色谱系统(Dionex)上用脉冲电流检测(PAD)进行高pH阴离子交换色谱处理。从用预混单糖标准品得到的单糖标准曲线(Dionex)推算单糖含量。
比活度使用4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷(4-methylumbelliferyl-α-D-glucoside)作为底物通过荧光测定法在黑色96孔微量板上测量GAA活性。一式三份地向微量滴定板中加入轭合物5的稀释液。向每个样品中加入4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷。将96孔板在37℃的孵育箱中孵育30分钟。荧光检测产物的释放，并与通过测量已知量标准品的荧光所产生的标准曲线进行对比。通过向所有孔中加入125μL pH 10.5的1.0M甘氨酸-碳酸盐缓冲液淬灭反应。将比活度定义为nmol释放的产物/hr/mg。
被L6成肌细胞纳入将在生长培养基(DMEM+10%FBS)中的细胞(ATCC CRL-1458)以5.0×105个细胞/孔接种于6孔板，并生长至汇合。将细胞与0-100nM GAA(轭合物5或未轭合的rhGAA)一起在DMEM+1%热灭活的FBS+10mM Hepes pH 6.7中孵育16小时。摄取后，将细胞用含有5mM M6P的PBS洗涤3次，并用0.25%Triton X-100在冰上裂解1小时。将裂解物以18000g离心5分钟，并测试其比活度。参见例如Zhu等人,J.Biol.Chem.279:50336-50341(2004)；Zhu等人,Biochem.J.389:619-628(2005)。
将本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。对于通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书所含的发明矛盾的情况，本说明书意在代替和/或优先于任何此类矛盾的材料。
在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，否则说明书和所附权利要求书中所给出的数字参数是近似值，其可根据试图通过本发明获得的所需性质而变化。至少并不试图限制对权利要求的范围适用等同原则，每个数字参数应参照有效数字的数和常规舍入方法来理解。
如对本领域技术人员将是显而易见的那样，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其进行多种改良和变化。本文所述的具体实施方案仅仅是以举例方式给出，无意于以任何方式限制本发明。应将说明书和实施例仅作为举例理解，本发明的真正的范围和精神由以下的权利要求书给出。

Claims (38)

1.寡糖-蛋白质轭合物，其包含(1)蛋白质，(2)寡糖，和(3)连接所述蛋白质和所述寡糖的肟基团，其中所述寡糖是式IV的寡糖：
Figure FDA00002429414500011
式IV
其中m和p独立地选自1至10的整数。
2.如权利要求1所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中m是3且p是1。
3.如权利要求1或2所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述蛋白质是溶酶体酶。
4.如权利要求3所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、酸性鞘磷脂酶或α-L-艾杜糖苷酸酶。
5.如权利要求4所述的寡糖-蛋白质轭合物，其中所述溶酶体酶是酸性α-葡糖苷酶。
6.一种药物组合物，其包含权利要求5的寡糖-蛋白质轭合物和赋形剂。
7.权利要求5的寡糖-蛋白质轭合物在制备用于治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。
8.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖；
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述氨基氧基化合物选自式II的化合物：
Figure FDA00002429414500021
式II
其中Y是所述第二反应基团，Z选自烷基、链烯基、炔基、杂芳基、芳基和杂环基，且P选自氨基保护基；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一反应基团和第二反应基团选自肼、酰肼、氨基脲、氨基硫脲、胺、羧基、酯、酰卤、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯和磺酰卤基团。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一反应基团是酰肼基团。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述第一反应基团是羧基基团。
12.如权利要求8所述的方法，其中P选自氨基甲酸酯保护基。
13.如权利要求12所述的方法，其中P是叔丁氧羰基。
14.如权利要求8所述的方法，其中Y选自：
其中X选自卤素、叠氮化物、酰氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
15.如权利要求14所述的方法，其中Y是
Figure FDA00002429414500041
16.如权利要求15所述的方法，其中X选自芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
17.如权利要求16所述的方法，其中X是
Figure FDA00002429414500042
18.如权利要求8所述的方法，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure FDA00002429414500043
式III
其中Y是所述第二反应基团，n选自1至10的整数，且P选自氨基保护基。
19.如权利要求18所述的方法，其中n是1。
20.如权利要求18所述的方法，其中Y是羧基、酯、酰卤、酰叠氮、烷基卤、酸酐、异硫氰酸酯、异氰酸酯或磺酰卤基团。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
22.如权利要求18所述的方法，其中Y是肼、酰肼、氨基脲、氨基硫脲或胺基团。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure FDA00002429414500045
24.如权利要求8所述的方法，其中所述寡糖是
25.如权利要求8所述的方法，其中所述寡糖是
Figure FDA00002429414500052
26.如权利要求19所述的方法，其中所述氨基氧基化合物包含氨基保护基，所述方法进一步包括(d)将所述包含氨基氧基基团的寡糖去保护。
27.用权利要求8的方法制备的包含氨基氧基基团的寡糖。
28.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述寡糖是
Figure FDA00002429414500061
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure FDA00002429414500062
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是所述第二反应基团；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
29.如权利要求28所述的方法，其中Y是
Figure FDA00002429414500063
且其中X选自羟基、芳氧基、杂芳氧基和杂环基氧基。
30.如权利要求29所述的方法，其中X是
31.如权利要求30所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure FDA00002429414500072
32.如权利要求31所述的方法，其中步骤(c)包括使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团在偶联试剂和/或催化剂存在下反应。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述催化剂是
34.一种制备包含氨基氧基基团的寡糖的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一反应基团的寡糖，其中所述寡糖是
Figure FDA00002429414500074
(b)提供包含氨基氧基基团和第二反应基团的氨基氧基化合物，其中所述氨基氧基化合物选自式III的化合物：
Figure FDA00002429414500081
式III
其中n选自1至10的整数，P选自氨基保护基，且Y是所述第二反应基团；和
(c)使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团反应，
从而制得所述包含氨基氧基基团的寡糖。
35.如权利要求34所述的方法，其中Y是肼、酰肼、氨基氧基、氨基硫脲、氨基脲或胺基团。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述氨基氧基化合物是
Figure FDA00002429414500082
37.如权利要求36所述的方法，其中步骤(c)包括使所述寡糖的第一反应基团与所述氨基氧基化合物的第二反应基团在偶联试剂和/或催化剂存在下反应。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述偶联试剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，所述催化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
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