CN1323221A - 采用N－丙烯酰化多糖生产用作疫苗的免疫原性β－丙酰胺基－联多糖蛋白缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了新的免疫原性的β－丙酰胺基－联多糖－和N－丙酰胺基－联寡糖－蛋白缀合物以及生产该缀合物的方法。所述缀合过程简单、快速、可重复并且适用于各种从细菌种属、酵母、癌细胞衍化的或化学合成的多糖或寡糖。也描述了应用β－丙酰胺基－联多糖－和β－丙酰胺基－联寡糖－蛋白缀合物抵抗感染或癌症的疫苗和免疫方法。

Description

采用N-丙烯酰化多糖生产用作疫苗的免疫原性 β-丙酰胺基-联多糖蛋白缀合物
发明领域
本发明涉及免疫原性β-丙酰胺基-联(propionamido-1inked)多糖蛋白缀合物以及由细菌、酵母或癌细胞生产所述缀合物的方法。所述缀合物可用作疫苗。
发明背景
革兰氏阳性菌如链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、利斯特氏菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)和梭菌属(Clostridium)细菌以及由革兰氏阴性菌如嗜血菌属(Haemophilus)、志贺氏菌属(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)细菌和某些类型的大肠杆菌(Escherichia coli)引起的细菌感染在整个全球的发病率非常高。这一现象结合细菌对抗生素的抗药性的不断升高，说明需要开发细菌疫苗。例如，链球菌是一大类不同类型的革兰氏阳性菌，已根据其细胞壁多糖的抗原性和结构将链球菌分成几个组(26，27)。其中两组与人类的严重感染有关。A组链球菌引起各种感染性疾病，包括“链球菌咽喉”、风湿热、链球菌性脓庖病和脓毒症。B组链球菌是美国及发展中国家重要的产期致病菌(37)。
革兰氏阴性菌也是重要的致病因素。在近期开发以及应用直接抗b型流感嗜血菌(Hib)的多糖蛋白疫苗之前，Hib细菌感染是造成多数婴幼儿精神发育迟缓的原因。脑膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)和大肠杆菌(E.coli)K1感染引起新生儿脑膜炎。已将革兰氏阴性菌-大肠杆菌的菌株与严重疾病包括由于食用被大肠杆菌腐坏的肉类而导致的死亡联系在一起。
当所述多糖与另一种免疫原性分子如多肽或蛋白质结合时，将其用于诱生对各种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌应答的抗体。多糖或寡糖与多肽的结合可将对多糖或寡糖的免疫应答从典型的T细胞非依赖性转换成T细胞依赖性的应答。
先有技术公开了多糖与蛋白质的直接结合和间接结合以形成缀合物(总结于参考文献(11)和美国专利第5,306,492号中)。缀合方法包括将多糖结合到蛋白载体上的重氮结合(diazo coupling)、硫醚键、酰胺化作用、还原性胺化作用和硫代氨基甲酰基结合。
Geyer等描述了通过还原性胺化作用和衍生糖利用偶氮基结合的连接作用使某些肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的荚膜多糖片段缀合到硝基苯基-乙胺接头上(Med.Microbiol.Immunol,165：171-288(1979))。
McIntire描述了通过与卤酰卤(haloacyl halid)反应将大肠杆菌(Escherichia coli)的减毒性脂多糖共价结合于蛋白质抗原上(美国专利第4,057,685号)。
Jennings等描述了通过还原性胺化作用产生多糖-蛋白缀合物(美国专利第4,356,170号)。
Anderson描述了免疫原性的缀合物的制备，该缀合物含有从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或流感嗜血菌(H.influenzae)的荚膜聚合物中衍生的免疫原性荚膜多糖片段的还原性胺化产物和作为蛋白载体的细菌毒素或类毒素，所述胺化产物含有通过诸如用高碘酸盐氧化裂解或水解糖苷键制备的还原性末端(美国专利第4,673,574、4,761,283和4,808,700号)。
Hillman等描述了多糖-蛋白缀合物的制备，其制备方法是用溴化氰活化b型流感嗜血菌(H.influenzae)的多糖，用间隔分子6-氨基己酸衍生化所述活化多糖以及用水溶性碳化二亚胺缀合脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的主要外膜蛋白以通过6-氨基己酸间隔分子与所述多糖的复杂多样的连接形成与所述蛋白质的酰胺型连接(美国专利第4,459,286号)。
Gordon描述了水溶性多糖-白喉类毒素的共价缀合物，其中用溴化氰活化纯净b型流感嗜血菌的多糖并立即与已用ADH间隔分子衍化的白喉类毒素混合(美国专利第4,965,338号)。
Tsay等描述了通过4-12个碳原子部分将革兰氏阴性细菌的去毒多糖与同一种革兰氏阴性细菌的去毒蛋白质共价结合(美国专利第4,663,160号)。
Gordon描述了致病性细菌如B型流感嗜血菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌和大肠杆菌的多糖分子与T细胞依赖性抗原如白喉类毒素和破伤风类毒素之间的缀合物(美国专利第4,619,828号)。
Porro等描述了具有三价免疫原性活性的糖蛋白缀合物疫苗，它含有革兰氏阳性细菌的荚膜多糖的抗原决定簇以及CRM197、或破伤风类毒素或百日咳毒素(美国专利第4,711,779号)。
Porro描述了寡糖-载体蛋白缀合物，其制备方法是使具有末端还原基团的寡糖与二氨基甲烷在吡啶硼烷存在下的反应使得产生还原性胺化作用，使所述胺化寡糖产物与具有两个官能基团的分子反应，然后将该活化的寡糖产物与蛋白载体反应(美国专利第5,306,492号)。
Kuo等描述了含有从b型流感嗜血菌的荚膜多糖衍化而来的氧化多聚核糖基-核糖醇-磷酸多糖片段的还原性胺化产物和b型流感嗜血菌的外膜蛋白的多糖-蛋白缀合物(美国专利第5,192,540号)。
欧洲专利公开第EP 0747063 A2号描述了含有多唾液酸衍化物和连接到载体分子的异双功能(heterobifunctional)连接分子的修饰荚膜多糖。使用所述连接物可使1个多糖最多N-烷基化约5个唾液酸残基。然后用丙酸酐(proprionic anhydride)或醋酸酐酰化其余氨基基团。
因此需要更有效、产率更高而且更简单的获得纯化免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法，以大规模生产免疫原性多糖-蛋白缀合物疫苗。
发明概述
本发明为一种免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-和β-丙酰胺基-联寡糖-蛋白缀合物。
本发明目的之一是提供一种制备免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的方法，该方法比目前使用的方法更好。本发明的另一目的是提供得自免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的药用组合物、疫苗和其它免疫学试剂。
所提供的制备免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法包括通过碱法或酶法水解使多糖或寡糖的脱-N-乙酰化，随后经过对所述N-去乙酰基多糖进行N-丙烯酰化作用(acryloylation)。所述N-丙烯酰化的多糖与载体蛋白直接偶联形成免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物。
按照本发明通过水解连接多糖和其它细胞成分的碱不稳定键或通过酶性水解，可从细菌、酵母或哺乳动物细胞上清液或直接从细菌、酵母或哺乳动物细胞提取荚膜多糖和细胞表面多糖。通过水解从所述多糖去除的一定比例的N-乙酰基由N-丙烯酰基代替，它再直接与蛋白偶联形成本发明的缀合物。
一方面，本发明提供了在多个位点直接与蛋白偶联的寡糖和多糖。
另一方面，本发明是一种免疫哺乳动物对抗细菌或酵母感染或抗肿瘤的方法，其包括给予所述哺乳动物有效量的本发明的疫苗来预防致病微生物感染或癌症。
再一方面，本发明是一种使用β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物在哺乳动物体内激发产生抗体的方法，该方法保护所述哺乳动物免于感染或疾病。
本发明的另一方面是应答用β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的免疫接种时产生的免疫球蛋白和分离的抗体。这种免疫球蛋白和分离抗体可用作治疗药物和诊断试剂。
附图简述
图1.图示制备免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的方法。
发明详述
本发明是一种可用作抗细菌感染、酵母感染的免疫原和疫苗以及癌症治疗药物的新型多糖-蛋白缀合物和寡糖-蛋白缀合物。用于形成免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的多糖或寡糖得自多糖或寡糖的来源，该来源包括但不限于革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母、癌细胞或癌组织等，其中在它们逃逸宿主防御机制时所述多糖或寡糖对所述细胞起毒性因子作用。通过在蛋白上Michael-型加成亲核位点使N-丙烯酰化多糖与蛋白直接偶联形成本发明的所述多糖-蛋白缀合物。
利用碱或酶水解连接所述多糖或寡糖与所述细胞成分的键可从多种来源包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母、癌细胞或它们的重组形式获得多糖或寡糖。通过将所述生物体或细胞或者含有所述生物体或细胞碎片的溶液与碱或酶接触，可以从所述生物体或细胞提取多糖或寡糖。在通过多种方法的碱或酶水解后，可回收多糖或寡糖。按照本发明使用的革兰氏阳性细菌和其重组菌株的非限制性实例有链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、肠球菌属(Enterococci)、杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、利斯特氏菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)和梭菌属(Clostridium)细菌。具体地说，更优选使用链球菌属细菌，最优选使用Ia、Ib、II、III、IV、V和VIII型B组链球菌。用于本发明的革兰氏阴性细菌和其重组菌株的非限制性实例包括流感嗜血菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。具体地说，更优选使用b型流感嗜血菌、B、C、Y和W135型脑膜炎奈瑟氏球菌、大肠杆菌K1及大肠杆菌K92。用于本发明的酵母的实例包括但不限于新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。用于本发明的癌细胞或癌组织的实例包括但不限于小细胞肺癌、成神经细胞瘤、乳腺癌、结肠癌等。
通过本领域已知的方法按照本发明能使用多种条件在水性或有机溶剂中水解多糖或寡糖。可通过反应条件控制水解所述碳水化合物的N-乙酰键的程度。在一个实施方案中，水解去除至少约50％的N-乙酰基，优选去除约50％-100％，更优选去除约90％或以上的天然N-乙酰基。在一个具体实施方案中，用水解试剂处理从所述多糖水解约95％或以上的N-乙酰基。
适合碱提取的荚膜多糖为缺乏任何不能被取代的碱不稳定取代基(如决定免疫原性的O-乙酰基)的多糖。适合碱提取的其它荚膜多糖是缺乏磷酸二酯键的多糖和缺乏4-连接的铀酸残基的多糖。
在碱水解的一个优选实施方案中，从B组链球菌(GBS)提取所述荚膜多糖(CPS)。在一个最优选的实施方案中，从Ia、Ib、II、III、V和VIII型GBS提取所述CPS。
在另一碱水解的优选实施例中，从肺炎链球菌(S.pneumoniae)提取所述CPS。在更优选的碱水解实施例中，从III、IV和XIV型肺炎链球菌提取所述CPS。
在另一碱水解的优选实施方案中，从奈瑟氏球菌属或埃希氏菌属提细菌取所述CPS。在一个更优选的碱提取的实施方案中，从B、C、Y或W135型脑膜炎奈瑟氏球菌、大肠杆菌K1或大肠杆菌K92提取所述CPS。
适合酶法去乙酰基的多糖是那些缺乏任何决定免疫原性的酶不稳定性取代基的多糖，其中所述取代基不能被免疫原性部分替代或取代，这些多糖包括但不限于GBS等。A.N-丙烯酰化多糖的制备1.多糖的去乙酰基作用a).原材料
采用本领域已知的标准方法，使用碱水解或酶法水解从浓缩的细菌、酵母、哺乳动物细胞或这些细胞的重组形式或者从匀浆细胞的上清液或条件培养基中可以获得多糖或寡糖。通过本领域已知的标准方法可以分离和纯化所述多糖或寡糖。市售的分离及纯化的多糖或寡糖也用作原料。
分离多糖的方法依赖于具体使用的多糖。通常的方法是使用离子型去污剂与带电多糖络合。沉淀并分离所述络合物。然后将所述络合物溶于高离子强度的溶液如氯化钙中，再用乙醇沉淀所述多糖。
所获得的用于本发明的分离并纯化的多糖和寡糖优选含有少于1％核酸及蛋白质杂质以用于人类。由于存在无机盐，纯化后常常观测到碳水化合物的纯度为80-100％。b).碱法水解
能用碱处理所述纯化的多糖或寡糖来去除所述N-乙酰基。按照本发明可以使用的碱的非限制性实例为NaOH、KOH、LiOH、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3、KCN、Et3N、NH3、H2N2H2、NaH、NaOMe、NaOEt或KOtBu。诸如NaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMe或KOtBu的碱在0.5N-5.0N的范围使用最有效。诸如NaHCO3、Na2CO3、K2CO3和KCN的碱能可以其能溶解的最高浓度使用。只要存在实现水解的诸如水或乙醇的试剂，可使用中至高(50-100％)浓度的有机碱，诸如Et3N。诸如NH3或H2N2H2的碱几乎能以任何浓度包括100％的浓度使用。溶剂如水、醇类(优选C1-C4醇)、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或这些溶剂的混合物和其它有机溶剂也可使用。最优选含水的碱溶液。
从所述多糖或寡糖去除N-乙酰基的最有效的pH范围是大约9-14，最佳pH是12左右。随后用本领域已知的标准方法通过使用膜或透析的超纯化从剩下的试剂中纯化所述N-去乙酰化多糖。c).酶法水解
可使用N-脱乙酰基酶从多糖或寡糖中酶法去除N-乙酰基。在一个实施方案中，在参考文献47、48和49中描述了可用于从多糖或寡糖中去除N-乙酰基的N-脱乙酰基酶。在酶法水解中，在合适的pH和温度条件下将所述多糖或寡糖和脱乙酰基酶与合适的酶缓冲系统混合并使其反应足够时间以去除N-乙酰基。在一个实施方案中，于37℃下将多糖和脱乙酰基酶与合适的酶缓冲系统(例如，50mMMES、10nM MnCl2，pH6.3)混合60分钟以形成N-脱乙酰基的多糖。使用合适的终止溶液(例如1M一氯乙酸、0.5M NaOH、2M NaCl)或通过使用合适的缓冲溶液稀释终止该反应。2.多糖的N-丙烯酰化作用
所述多糖或寡糖的碱或酶法水解导致从所述多糖或寡糖的唾液酸和氨基糖残基去除N-乙酰基。在水解以后，通过使用多种丙烯酰化剂将所述多糖或寡糖N-丙烯酰化至需要程度。
在一个实施方案中，所述方法包括加入丙烯酰化试剂以N-丙烯酰化N-脱乙酰基的多糖或寡糖。丙烯酰化试剂的实例包括但不限于丙烯酰氯、丙烯酰酐、丙烯酸和脱水剂如DCC、CH2CHCOCN等，以约1M的浓度过量使用。在N-脱乙酰基多糖的N-丙烯酰化方法中，在反应期间将所述pH调节并维持在约9-11，优选pH约为10。反应期间的温度为约2℃-8℃，优选约4℃。所述反应进行约1小时时间。所得N-丙烯酰化多糖或N-丙烯酰化寡糖至少丙烯酰化约95％或以上。B.  β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的制备
当与另一种免疫原性分子如多肽或蛋白缀合时，本发明的所述多糖或寡糖可用于在个体中对多种革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌、酵母和癌症激发产生抗体应答。所述多糖或寡糖与所述多肽的缀合对所述多糖或寡糖的通常是T细胞非依赖性免疫应答转化为T细胞依赖性免疫应答。因此，优选所述多肽的大小是一种足以引起所述应答从T细胞非依赖型转化为T细胞依赖型的多肽大小。为了提供第二免疫原的目的，使用较小的多肽可能是有效的。所述蛋白质载体的大小通常是约50,000-500,000M.W.。
优选的载体蛋白包括但不限于破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素亚单位B、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B组链球菌的C-β蛋白、B组链球菌的C-β蛋白、B组链球菌的非-IgA结合的C-β蛋白、铜绿假单胞菌类毒素、百日咳类毒素、含有赖氨酸或半胱氨酸残基的合成蛋白等。所述载体蛋白可以是天然蛋白、化学修饰的蛋白、去毒蛋白或重组蛋白。就所述蛋白成分而言，按照本发明制备的缀合物分子可以是单体、二聚体、三聚体和更高的交联分子。
本发明提供了生产缀合物分子的能力，在该缀合物分子中所述蛋白是通过在所述多糖或寡糖上的一个或多个位点与所述多糖或寡糖连接。所述多糖或寡糖的大小可以有很大不同。一种或多种多糖或寡糖可以与一种或多种蛋白交联。本发明的缀合物优选为点阵结构。连接点是在所述蛋白的赖氨酸或半胱氨酸残基与所述多糖或寡糖的N-丙烯酰基之间。
在一种形成免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法中，首先用碱或酶水解处理在构成其重复单元的糖残基中含有游离氨基或N-酰基(如N-乙酰基)的分离的多糖(糖胺聚糖)，以去除其部分或全部N-酰基。然后用N-丙烯酰化试剂将所述游离氨基进行N-酰化以形成上述N-丙烯酰化多糖。然后在最佳pH、温度和时间条件下使所述N-丙烯酰化的多糖直接与蛋白质偶联，从而形成免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物。
在一个实施方案中，在pH9.0以上下进行该缀合方法，对于蛋白质赖氨酸残基的ε-游离氨基基团的最佳反应性优选pH约9.0-10.0。在另一个实施方案中，在所述蛋白半胱氨酸残基的巯基(SH)基团的最佳反应性的约7.0的中性pH下进行该缀合方法。可根据特定载体蛋白的反应基团数目选择进行缀合方法的pH。例如，使用包含更多反应性赖氨酸残基(与半胱氨酸残基数相比)的蛋白的方法优选在碱性pH下进行。使用包含更多反应性半胱氨酸残基(与赖氨酸残基数相比)的蛋白的缀合方法优选在约中性pH下进行。
所述缀合反应可在缓冲试剂中进行，该缓冲试剂包括但不限于碳酸盐/碳酸氢盐、硼酸盐缓冲剂、磷酸盐等。所述缀合反应的温度至少约为25℃，优选约37℃，反应持续优选约24小时。如Romanowska等(46)所述，关键反应涉及蛋白上的亲核性半胱氨酸巯基基团或赖氨酸ε-NH2基团与N-丙烯酰化糖残基的1，4-缀合加成(迈克尔型加成)，所述N-丙烯酰化糖残基存在于图1所示的所述多糖的重复单元内。所得β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物的多糖与蛋白比率约0.1-0.6。
适于与蛋白上的半胱氨酸和/或赖氨酸残基直接缀合的具有N-酰基的所述多糖的糖基残基包括但不限于葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、岩藻糖胺、唾液酸等。所述多糖可得自天然来源如细菌、酵母或癌细胞，或得自合成来源。合成来源包括化学合成、酶法合成以及化学酶合成。所述合成可以是全程合成或是修饰天然碳水化合物的。天然分离的碳水化合物能通过改变碳水化合物残基上的官能团或通过加减碳水化合物残基来修饰。
用于制备本发明所述β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物和β-丙酰胺基-联寡糖-蛋白缀合物的所述多糖或寡糖可以改变大小以与载体蛋白缀合。作为本文定义，用于本发明的寡糖包含至少10个糖残基，优选10到约50个糖残基。作为本文定义，多糖糖残基50个以上，并且最高可为约600个或更多的残基。在某些情况下，需要大的构建物来增强免疫原性。本发明方法适用于非常大的多糖，因为许多反应位点能被引入单个多糖中。本发明超越先有技术的另一优势是不改变所述多糖或寡糖的带电官能团，该基团常常与决定免疫性的表位相互作用/或构成决定免疫性的表位部分。C.疫苗
本发明也涉及疫苗制备。按照本发明，可将上述分离的β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物用作抗原以产生对所述多糖或寡糖反应的抗体，并因此对所述多糖或寡糖从其分离的生物体或细胞反应。本发明疫苗可以是除了β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物进一步包含其它成分的复合疫苗或多成分疫苗，包括但不限于白喉-破伤风-百日咳(DTP)、破伤风-白喉(Td)、DTaP、DTaP-Hib疫苗、DTaP-IPV-Hib疫苗等以及其复合物，从而提供用于免疫抗多种引起疾病的生物体或引起疾病的细胞的多功能疫苗。
本发明疫苗可提供主动或被动免疫。提供主动免疫的疫苗包含与至少一种抗原肽缀合的分离并纯化的N-丙烯酰化多糖或寡糖。D.药用组合物
本发明组合物可包含至少一种多糖-蛋白缀合物和药学上可接受的载体如盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。在另一实施方案中，所述药用组合物包含另一种免疫原性部分如肽，或含有由本发明的一种CPS产生的抗体的组合物。所述组合物也可含有佐剂以增强接受者的免疫应答。该佐剂可以是铝基佐剂如明矾或长链烷基佐剂如硬脂酰酪氨酸(参见1990年9月17日申请的美国序号583,372；欧洲专利EP 0 549 617 B1；Moloney等，美国专利号4,258,029)、胞壁酰二肽(MDP)或其衍生物、单磷酰脂质A(MPL)、皂甙(Quil-A)等。还参见Jennings等，美国专利号5,683,699和Paoletti等，J.Infectious Diseases1997；175：1237-9。所述药用组合物可进一步包含一种或多种附加的免疫原，包括但不限于白喉-破伤风-百日咳(DTP)、破伤风-白喉(Td)、DTaP、DTaP-Hib、DTaP-IPV-Hib等以及其复合物。这些药用组合物作为疫苗特别有效。
对于引起被动免疫，所述药用组合物可以含有多克隆抗体、或单克隆抗体、它们的衍生物或其片段以及它们的重组形式。抗体、片段或衍生物的量将是按标准临床技术确定的治疗学上或预防学上的有效量。
通过本领域中已知的有效方法可将本发明的药用制剂引入个体。给予途径包括但不限于皮内、腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内、口服和鼻内给予。
本发明组合物可含有本领域技术人员已知的适用于疫苗的标准载体、缓冲剂或防腐剂，包括但不限于任何合适的药学上可接受的载体，如生理盐水或其它可注射的液体。也可含有疫苗常规添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨醇和增强免疫原性应答的佐剂如磷酸铝、氢氧化铝或硫酸铝以及硬脂酰酪氨酸。按照本发明生产的疫苗也可作为多价疫苗的成分，该多价疫苗可激发产生抗多种传染原的免疫应答。
以足以激发产生作为免疫原性反应的一部分的抗体的量给予本发明的疫苗。所述疫苗可以胃肠外使用以产生IgG和IgM抗体，或者将其给予粘膜以在组织表面产生IgA抗体。可根据接受所述疫苗的个体的体型大小、重量或年龄调节剂量。可通过检测抗体滴度或杀菌活性监测个体的所述抗体应答，并且如果需要可加强免疫以增强所述免疫应答。通常，用于婴幼儿的单剂量为每剂量约10μg的缀合物疫苗或者为大约0.5μg-20μg/公斤。成人一次剂量为约0.5μg-20μg/公斤的所述缀合物疫苗。对于所述CPS-蛋白缀合物疫苗，常规剂量为每剂量的每种CPS各约25μg。即，抗B组链球菌疫苗可以含有九个血清型的每一CPS型各25μg。E.抗体
直接抗所述多糖的抗体可以通过本领域已熟知的任何技术生产。根据一种方法，可通过将分离的免疫原性β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物给予宿主动物来产生所述抗体。所述宿主动物可以是但不限于大鼠、小鼠、兔、非人类的灵长类动物或人。优选所述宿主为人。在一个实施方案中，通过使用本领域已知的佐剂可以增强免疫应答。
通过本领域已熟知的任何一种技术也可制备直接抗所述多糖的单克隆抗体。按照一种方法，使用杂交瘤细胞系培养物(Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497)。直接抗所述多糖的单克隆抗体可以是通过本领域已熟知的任何技术制备的人单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。根据一种方法，可以产生具有与人类恒定区结合的非人类(如小鼠)抗原-结合域的嵌合单克隆抗体。(Takeda等(1985)Nature 314：452)。按照Queen等，美国专利号5,585,089和美国专利号5,530,101的方法能够生产人源化抗体。通过本领域已知的方法可以构建单链抗体(美国专利号4,946,778；Davis，G.T.等1991Biotechnology 9：165-169；Pluckthun，A.1990 Nature 347：497-498)。通过本领域已知方法(WO 89/07142)可以修饰所述抗体的恒定区的结构域。
通过本领域已熟知的任何技术可以纯化直接抗所述多糖或寡糖的抗体，所述技术包括但不限于免疫吸附或免疫亲和层析、或其它层析法(如HPLC)。抗体也可作为免疫球蛋白部分从血清、血浆或细胞培养基纯化。
本发明的抗体分子可以是完整的免疫球蛋白分子、大体上完整的免疫球蛋白分子或含有抗原结合位点的免疫球蛋白分子部分诸如Fab片段。所述抗体分子可以是任何类型，包括IgG、IgM和IgA。
通过本领域已熟知的任何技术可以生产直接抗所述CPS的抗体片段。(Campbell(1985)生物化学和分子生物学实验室技术，第13卷，Burdon等(编辑)，Elsevier Science出版社，Amsterdam)。
所述抗体或其抗原结合片段可作为治疗剂使用以提供被动保护来对抗由Gram(+)、Gram(-)菌或酵母引起的疾病。所述抗体或其抗原结合片段也可作为标准免疫测定中的诊断试剂以检测和/或鉴定细菌、酵母或癌细胞。所述抗体可以试剂盒形式单独或与标准试剂一起提供用于免疫测定。
在本发明的另一实施方案中，可将本发明的直接抗所述多糖或寡糖的抗体作为治疗或预防用途的药用制剂使用以便将一个宿主个.体的被动免疫转移给另一个体(即，增强个体的对革兰氏阴性或革兰氏阳性菌或酵母的免疫应答或者在无免疫应答的或免疫耗竭的个体包括AIDS患者中提供免疫应答)。抗体的被动转移在本领域是已知的并且可通过任何已知方法完成。按照一种方法，本发明的直接抗其缀合物的抗体在具有免疫能力的宿主(“供体”)动物中生成、从所述宿主动物中获取并输注到接受的个体。例如，可采用人类供体生产对本发明的所述多糖-蛋白缀合物反应的抗体。然后将所述抗体以治疗学或预防学上的有效量给予需要治疗的人类受者，从而使所述接受者具有对细菌的抵抗力，由所述多糖成分激发产生的抗体结合细菌。(参见Grossman，M.和Cohen，S.N.，“基础和临床免疫学”，第7版，(Stites，D.P.和Terr，A.T.编辑，Appleton & Lange 1991)58章“免疫”。)
在某些情况下，本发明使用的所述多糖可以诱导与其它病原体交叉反应的抗体，因此具有抗这些其它细菌感染的保护能力。F.诊断试剂盒
在另一实施方案中，可以诊断试剂盒提供本发明的所述CPS或其衍生物或其片段以指示直接抗细菌、酵母或癌细胞的抗体的存在。存在这类抗体表明以前曾暴露于所述病原体，并预测对感染有抵抗力的个体。所述诊断试剂盒可包含至少一种本发明的所述CPS或其衍生物或其片段(单独或与蛋白缀合)和合适的试剂，当所述修饰的CPS或衍生物或片段与含有直接抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母或癌细胞或癌组织的抗体的样本混合时，所述试剂用于检测抗体反应。抗体反应可通过本领域中描述的任何方法鉴定，包括但不限于ELISA检测。这样的了解是重要的并能避免不必要的免疫接种。
或者，所述诊断试剂盒可进一步包含固体载体或磁珠或塑料基质和至少一种本发明的所述CPS或其衍生物或其片段。
在某些情况下，优选标记所述CPS或衍生物或片段。标记物是本领域中已知的。例如，标记物包括但不限于放射性、化学发光、生物发光、发光或其它方便分析的鉴定“标记”。可将体液或组织样本(如血液、血清、唾液)收集和纯化并加样于所述诊断试剂盒。所述CPS、衍生物或片段可以是纯化的或非纯化的，可由分子混合物组成。
固体基质是本领域已知的，并可使用包括但不限于试管、珠、微粒、浸-棒(dip-sticks)、平板等形状的聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或任何固体可塑性物质。其它基质包括但不限于膜、96孔微量滴定板、试管和Eppendorf管。通常这种基质含有配体结合剂能够附着于其上的任何表面或者其自身提供配体附着位点的表面。
本文涉及的所有公开出版物、专利和文章通过引用特别结合到本文中。给出以下实施例以说明本发明，但绝不能解释为用其限制本发明的范围。本领域技术人员将认识到可对其作许多修改和替代而没有偏离本发明的精神和权限范围。
实施例1
β-丙酰胺基-联多糖-蛋白载体缀合物的制备
下述非限制性实施例描述了一系列与临床相关的抗肺炎链球菌(14型)、III型和II型B组链球菌(GBS)以及大肠杆菌K1的多糖-蛋白缀合物疫苗的制备。用于本实施例的所有上述多糖是在一个或多个糖基残基中含有N-乙酰基基团糖胺聚糖，所述糖基残基是其结构重复单位组分。
A.  14型肺炎球菌多糖的解聚作用
为增加所述多糖的溶解性，首先通过声处理将其部分解聚。将200mg的14型肺炎球菌多糖(批号2020510，美国典型培养物保藏中心)溶于20ml的PBS中并用Branson Sonifier Model 450在0℃进行声处理。透析所得多糖并冻干，然后通过用磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡的superdex 200柱子筛分。合并峰部分，然后用截留分子量(MWCO)为3,500的Spectra/PorMembrane对去离子(d.i.)水透析。冻干后获得157.5mg的固体产物。用具有miniDAWN的SEC-MALLS(WyattTechnology Corp.，Santa Barbara，CA)测定所述声处理的多糖的平均分子量约为50,000。
B.  14型肺炎球菌多糖的去-N-乙酰化
将100mg筛分的14型肺炎球菌多糖溶于10ml的NaOH(2N)中，然后向该反应混合物中加入10mg的NaBH4。将该混合物在100℃下加热1小时，然后冷却至室温。将该N-去乙酰化的组分用截留分子量(MWCO)为3,500的Spectra/PorMembrane对去离子(d.i.)水透析并冻干，获得84mg的白色固体。用H1-NMR在500MHz处测定分析所述N-去乙酰化的多糖，发现其含有少于5％残余N-乙酰基。
C.  N-去乙酰化的14型肺炎球菌多糖的N-丙烯酰化
将84mg的N-去乙酰化的14型肺炎球菌多糖溶于4.2ml的去离子水中。在冰浴中用2N的NaOH将该溶液的pH调节至10。然后加入420μl的1∶1(v/v)的丙烯酰氯∶二噁烷并用2N的NaOH调节pH至11。在pH11时使其再反应1小时以确保完全水解因为O-酰化作用形成的酯。透析溶液并冻干，获得42mg的干粉。在用H1-NMR在500MHz处测定分析后发现该多糖有超过95％的N-丙烯酰化。
D.  N-丙烯酰化的14型肺炎球菌多糖与破伤风类毒素单体的缀合
将22mg的N-丙烯酰化的14型肺炎球菌多糖溶于1.1ml的碳酸钠/重碳酸钠缓冲液(pH9.5)中。向该反应混合物中加入22mg的破伤风类毒素单体。将该反应混合物在37℃孵育过夜。用配有superose12柱子装备的Biologic system(Bio-Rad)测定分析缀合进程。用280nm处的紫外吸光度监测，以柱空隙体积洗脱的峰进行性升高说明多糖与破伤风类毒素的缀合。缀合完成后，用0.1N的HCl中和该溶液至pH7，然后对PBS透析。将该缀合物通过1.6×60cm的Superdex 200PG柱(Pharmacia)过柱纯化并用含有0.01％硫汞撒的PBS洗脱。合并相当于空隙体积峰的部分。用Dubois等(51)的硫酸苯酯法和Bradford(9)的Coomassie法评估所述缀合物中的碳水化合物和蛋白含量。
将同样方法用于II型、III型GBS以及大肠杆菌K1和脑膜炎球菌C型多糖。这些多糖各自的反应条件列于下表。
表1
E.  II型和III型GBS多糖的去-N-乙酰化
  PS大小(kD) 多糖(mg) NaOH  NaBH4 温度 反应时间 产量
GBSII     250  63mg  6ml  12mg  110℃  6小时 63mg
GBSIII     110  50mg  5ml  10mg  110℃  6小时 55mg
*用SEC-MALLS测定
表2
II型和III型GBS多糖的N-丙烯酰化
 多糖量(mg)   去离子水     1∶1(v/v)丙烯酰氯∶二噁烷 产物
 GBSII     60     3ml     300μl  60mg
 GBSIII     55     2.75ml     275μl  55mg
表3II型和III型GBS多糖与破伤风类毒素单体的缀合
多糖量(mg) 破伤风类毒素(mg) 碳酸钠/重碳酸钠缓冲液(pH9.5) 温度 孵育时间
GBSII  10     10     0.5ml  37℃ 过夜
GBSIII  10.52     9.52     0.5ml  37℃ 过夜
F.  K1多糖的去-N-乙酰化
将300mg的K1多糖溶于15ml 2.0N NaOH溶液(其中加有150mg的氢硼化钠)中。将该溶液在110℃下加热6小时，冷却至室温并用20倍体积的去离子水稀释。用去离子水通过Amicon YM3膜的渗滤后，冻干该溶液得到255mg的N-去乙酰化的K1多糖产物。用H1-NMR在500MHz处测定证实完全N-去乙酰化。
G.  K1多糖的N-丙烯酰化
向在冰浴中冷却的含有250mg的去-N-乙酰化的K1多糖的10ml去离子水溶液中滴加丙烯酰氯(Aldrich，Milwaukee，WI)溶液，所述丙烯酰氯溶液通过将1ml丙烯酰氯与1ml二噁烷混合制得。通过加入2N的氢氧化钠溶液将该溶液的pH维持在7.0到10.5之间。完成滴加后，所述pH升至13并在室温下维持在12.9到13.1之间1小时。滴加1N HCl调节该溶液的pH至9.5。将该溶液用去离子水通过搅拌池(stircell)中的Amicon YM3膜的渗滤。将所述残留物冻干至干燥，并将该物质(N-丙烯酰基K1多糖)保存于-20℃冰箱的干燥器中。H1-NMR在500MHz处指示在反应期间发生了完全的N-丙烯酰化。
H.  β-丙酰胺基-联K1-rPorB缀合物(K1-rPorBI)
将0.3ml含有8.4mg的N-丙烯酰K1多糖和4.0mg的重组脑膜炎奈瑟氏球菌PorB的0.2M硼酸盐、0.05％ZwittergenTM3，14(Boehringmannhein)溶液(pH9.5)在37℃孵育3天。通过Superdex 200制备级柱的尺寸排阻层析纯化该缀合物，并用含0.01％硫汞撒的PBS洗脱。合并位于或接近于柱子的空隙体积处洗脱的在uv-280nm活性信号的部分并保存于冰箱中。分别通过间苯二酚和考马斯蛋白分析法测定分析该缀合物中的唾液酸和蛋白含量。
I.  硫醇化rPorB的制备
向1ml rPorB膜孔蛋白浓度为10mg/ml的溶液(含有0.25M的氯化钠和0.05％zwittergent 3-14的0.25M HEPES缓冲液pH，8.5)中加入0.2ml的0.05M的N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]丙酸盐溶液。充分混匀该溶液并将其在室温下放置1小时。向该溶液中加入0.06ml溶于相同缓冲液中的1M二硫苏糖醇溶液。再次充分混匀该溶液并将其在室温下放置2小时。用1.3ml含有0.25M氯化钠和0.05％zwittergent 3-14的pH为7.0的0.25M HEPES缓冲液稀释该溶液并将其上样到用相同缓冲液预先平衡的Pharmacia PD-10脱盐柱上。用相同缓冲液洗脱该柱，收集洗出液并用Amicon Centricon 30浓缩器以5,000RPM浓缩1小时。收集所述残余物并测定蛋白浓度。
H.  N-丙烯酰化的K1-S-rPorB缀合物(K1-S-PorB)的制备
向上述的浓度为25mg/ml的0.17ml的硫醇化rPorB溶液中加入9mg的N-丙烯酰化的K1多糖。充分混匀该溶液并将其在37℃烘箱中孵育18小时。将该溶液通过Supedex 200柱(Pharmacia)纯化，以PBS作洗脱液。合并于或接近于柱子的空隙体积处洗脱的uv-280nm活性部分。分析显示该缀合物含有25μg/ml的多糖和188μg/ml的蛋白。I.  N-丙烯酰化的GCMP-S-rPorB缀合物(GCMP-S-rPorB)的制备
同样，用与上述N-丙烯酰化的K1-S-rPorB缀合物的制备方法相似的方法制备N-丙烯酰化GCMP-S-rPorB，发现该缀合物含有43μg/ml的多糖和200μg/ml的蛋白。
表4
上述缀合物的分析数据
  蛋白浓度μg/ml    多糖浓度μg/ml 缀合物中的多糖百分比
    Pn14-TT(3)     547     293(1)     35
    GBSII-TT(3)     377     160(2)     30
    GBSIII-TT(3)     365     115(2)     24
    K1-rPorBI(3)     147     17(2)     10
    K1-rPorBII(4)     406     41(2)     9
    K1-S-rPorB(3)     188     25(2)     12
    GCMP-S-rPorB(3)     200     43(2)     18
(1)总碳水化合物的Dubois分析
(2)间苯二酚唾液分析
(3)通过N-丙烯酰化多糖与相应载体蛋白的直接偶联制得
(4)通过高碘酸氧化的N-丙烯酰化K1 PS与rPorB的还原胺化作用制备的对照缀合物
实施例2
β-丙酰胺基-联多糖-蛋白载体缀合物的免疫原性和效能所述缀合物在小鼠中的临床前评估
免疫分析：用ELISA测定每种多糖缀合物的血清抗体。通过还原性胺化作用制备用于ELISA分析中的人血清白蛋白(HSA)(Sigma，St Louis，MO)缀合物。向HAS中加入氧化的多糖，然后用NaCNBH3进行还原性胺化作用。通过凝胶过滤层析分离该缀合物，并将其冻干保存于-70℃。用ELISA按下述测定多糖-特异性抗体滴度。用溶于PBS(0.01M磷酸钠，0.15M氯化钠，pH7.5)中的PS-HSA缀合物以每孔0.25μg(100μl/每孔)包被96孔聚苯乙烯平底微量滴定板(NUNC Polysorb)(Nunc，Naperville，IL)，在37℃孵育1小时，随后用PBS-Tween(溶于PBS的0.05％(v/v)Tween 20)洗涤(5次)。在室温下进行随后所有的孵育。将PBS-Tween用于所有需要的洗涤。然后对于IgGELISA用PBS-BSA(溶于PBS的0.5％(w/v)牛血清白蛋白)、或对于IgMELISA中用0.1％(w/v)Carnation脱脂奶粉以每孔0.15ml封闭所述包被板1小时，随后洗涤。在板中以每孔100μl稀释血清2倍，一式二份，并孵育1小时，随后洗涤。以每孔100μl加入抗体缀合物(过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体)(Kirkegaard & Perry Lab，Gaithersburg，MD)并孵育30分钟，随后洗涤。以每孔0.05ml加入1∶1的染料和底物溶液(Kirkegaard & Perry TMB)和过氧化物并孵育10分钟。然后用1M H3PO4以每孔0.05ml终止过氧化物酶反应，并将该板置于Molecular Devices Emax微板读数仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)上读取波长为450nm的读数，以650nm作参考波长。测定几个无血清对照孔的本底吸光度并平均每板的数值。对于每个血清稀释度，减去本底吸光度平均值，然后平均复孔的血清吸光值。将改良的Scatchard作图用于随后的数据分析，其中将吸光度(y轴)对吸光度乘以稀释度的倒数(x轴)(参考)作图。在平衡和过量抗体条件下，获得每种血清稀释系列的直线；根据这条线可推断x轴以测定抗体滴度。为对所有血清标准化提供参考，将板与板间和天与天间的变异减少到最小，将预先测定抗体滴度的阳性对照血清用于每块板。这些分析的结果示于表5、6和7。
调理素吞噬细胞试验(OP)：应用人早幼粒细胞白血病HL-60细胞系(ATCC号CCL 240)的体外调理素吞噬杀伤试验测试小鼠抗血清对链球菌B(GBS)和肺炎球菌缀合物的调理活性。简要地说，将200cfu的III型GBS M781菌株细胞或14型肺炎球菌株与等体积的血清抗体混合并在35℃、5％CO2培养箱中振摇孵育15分钟。将幼兔补体和在90mM的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)存在下培养5天的HL-60细胞(5×105)加入该混合物中并在37℃下振摇孵育1小时。取出一等份用于培养物的定量。通过推断相当于50％存活细菌的抗体稀释度测定滴度。这些试验中14型肺炎球菌缀合物的结果示于表5而III型GBS缀合物的结果示于表6。
血清杀菌试验(SBA)：根据杀伤50％靶细菌的杀菌滴度或稀释度的倒数测定抗体-依赖补体介导的杀菌活性。首先将所有血清中的补体在56℃孵育30分钟。然后用GBSS在无菌的96孔U型底的微量滴定板(Sigma)中对每种血清进行2倍系列稀释，每孔终体积为50μl。用工作浓度的GBM细菌(15血清型菌株，44/76)或C组脑膜炎球菌C11参考菌株按1∶1稀释幼兔血清补体(Pel-Freez，Brown Deer，WI)并将其在含有所述稀释血清的每孔中加入50μl，每孔反应混合物的终体积为100μl。将这种含有50％血清(加热灭活并稀释)、25％兔血清补体和25％细菌(工作浓度)的反应混合物在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中的微量滴定板振摇器(LKB-Wallac；pharmacia Biotech)上快速振摇孵育60分钟。
然后将所有孔中的培养物以30μl/板铺于巧克力琼脂平板上。时间为零的(time zero)细菌样本也同样铺于平板上。象前述一样将所有平板孵育过夜。然后用Imaging Products International(Chantilly，VA)的自动集落计数器计数菌落形成单位(cfu)，每板均取三个读数的平均值。直接从绘制的图上读取50％杀伤的稀释度的倒数或滴度，所述图中x轴代表相当于稀释度的倒数的10的对数而y轴代表存活百分率。这些试验的结果示于表7。
表5：
14型肺炎球菌-破伤风类毒素缀合物的免疫原性
    疫苗/佐剂 ELISA第0天 ELISA第28天 ELISA第38天 ELISA第59天   OP第59天
    对照/盐水 ＜50  2,250  29,000  32,600  3,100
    对照/Alum ＜50  18,200  99,000  265,000  25,000
    Pn14-TT/盐水 ＜50  4,600  89,000  59,200  3,900
    Pn14-TT/Alum ＜50  27,000  185,000  251,000  26,000
    PBS/Alum ＜50  ＜50  ＜50  ＜50  ＜50
对照疫苗是通过还原性胺化作用制备的14型多糖-破伤风类毒素缀合物。Pn14-TT缀合物是N-丙烯酰化14型肺炎球菌多糖和破伤风类毒素之间的直接缀合的产物。
本研究中将6-8周龄的CD1小鼠(Charles River Laboratory)分组(一组10只)，在第0、28和38天皮下注射给予2.0μg多糖缀合物。在第0、28、38天从动物取血并于第59天放血。应用通过还原性胺化作用制备Pn14多糖-HSA缀合物进行ELISA。报告于表5的ELISA滴度代表总IgG。所报告的OP滴度是抗14型肺炎球菌株的滴度。
表6：
III型GBS缀合物的免疫原性
    疫苗/佐剂   ELISA第0天  ELISA第21天     ELISA第42天    ELISA第52天     OP第52天
 缀合物对照/Alum    ＜50    900     1,800     3,000     170
 GBSIII-TT/Alum    ＜50    500     8,500     25,000     3,100
 PBS/Alum    ＜20    ＜20     ＜20     ＜20     ＜20
对照缀合物疫苗是III型GBS-破伤风类毒素缀合物，该缀合物通过高碘酸盐氧化的III型GBS多糖和破伤风类毒素的还原性胺化作用制得。III型GBS-TT缀合物是N-丙烯酰化III型多糖和破伤风类毒素之间的直接缀合的产物。
本研究中将6-8周龄的CD1小鼠(Charles River Laboratory)分组(一组10只)，在第0、21和42天皮下注射给予2μg多糖缀合物。在第0、21、42天从小鼠取血并于第52天放血。应用与人血清白蛋白缀合的III型GBS多糖测定ELISA滴度，示于表6的滴度代表抗III型多糖的总IgG。
表7：大肠杆菌K1缀合物的免疫原性
    疫苗/佐剂   ELISA第0天    ELISA第28天  ELISA第42天 ELISA第52天  SBA第52天
第1批K1-rPorBII/Alum对照    ＜50     1,000  39,000  106,000  450
第2批K1-rPorBII/Alum对照    ＜50     450  124,000  250,000  1,000
第1批K1-rPorBI/Alum    ＜50     220  27,000  96,000  810
第2批K1-rPorBI/Alum    ND     ND  24,000  71,000  3,800
第1批K1-S-rPorB/Alum    ND     ND  45,000  114,000  2,600
第2批K1-S-rPorB/Alum    ND     ND  41,000  94,000  1,700
    PBS/Alum    ＜50     ＜50  ＜50  ＜50  ＜50
对照疫苗(K1-rPorBII)是高碘酸盐氧化的N-丙烯酰化K1多糖和破伤风类毒素之间的还原性胺化作用的产物。K1-rPorBI疫苗是N-丙烯酰化K1多糖和破伤风类毒素的直接缀合的产物。K1-S-rPorB是硫醇化膜孔蛋白rPorB和N-丙烯酰化K1多糖的直接缀合产物。
本研究中将Charles River Laboratory的CD1小鼠(6-8周龄)分组(一组10只)，在第0、28和42天进行腹腔免疫。在第0、28、42天从小鼠取血并于第52天放血。应用与人血清白蛋白缀合的N-丙烯酰化K1多糖测定ELISA滴度。示于表7的滴度代表抗修饰的N-丙烯酰化K1多糖的总IgG。抗15血清型B组脑膜炎奈瑟氏球菌H 44/76菌株的血清抗杀活性(SBA)(第52天放血)也示于表7。
表8：GCMP缀合物的免疫原性
    疫苗/佐剂 ELISA，第38天 SBA，第38天
 GCMP-S-rPorB/AlumLot1     44,000     2,100
 GCMP-S-rPorB/AlumLot2     43,000     2,800
    PBS/Alum     ＜50     ＜50
GCMP-S-rPorB是N-丙烯酰化的C组脑膜炎球菌多糖(GCMP)和硫醇化rPorB之间的直接缀合产物。在这些动物试验中将HSD的远系繁殖的Swiss Webster雌性小鼠(6-8周龄)分组(一组10只)，在第0和28天皮下注射每剂量2μg多糖缀合物。在第38天将动物放血至死。应用与人血清白蛋白缀合的GCMP测定对C组多糖的ELISA滴度。应用脑膜炎球菌C11参考菌株获得血清杀菌滴度。
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Claims (58)

1.包含在丙酸部分的β-位与蛋白直接缀合的N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物。
2.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物，其中所述蛋白含有至少一个赖氨酸或半胱氨酸残基。
3.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖是从细菌、酵母、癌细胞衍生获得或化学合成制得。
4.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖衍生自大肠杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌属、链球菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属或假单胞菌属。
5.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖衍生自Ia血清型、Ib血清型、II血清型、III血清型、V血清型、VIII血清型B组链球菌及其组合物。
6.根据权利要求4的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖衍生自B组、C组、Y组、W135组脑膜炎球菌及其组合物。
7.根据权利要求4的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖衍生自大肠杆菌K1、大肠杆菌K92、4型肺炎球菌、14型肺炎球菌、A组链球菌、C组链球菌或其组合物。
8.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B组链球菌的C-β蛋白和B组链球菌的非-IgA-结合的C-β蛋白。
9.根据权利要求8的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述蛋白是重组产生的蛋白。
10.根据权利要求9的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述蛋白是重组的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白。
11.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖包括糖胺聚糖。
12.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖含有至少具有一个游离氨基或N-酰基的结构重复单位的糖残基。
13.根据权利要求12的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述糖残基选自葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、岩藻糖胺和唾液酸。
14.根据权利要求1的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖直接与所述蛋白的赖氨酸残基的ε-游离氨基或半胱氨酸残基的巯基缀合。
15.一种多糖-蛋白缀合物，它包括N-丙酸化14型肺炎链球菌多糖-破伤风类毒素缀合物、N-丙酸化III型B组链球菌多糖-破伤风类毒素缀合物、N-丙酸化II型B组链球菌多糖-破伤风类毒素缀合物、N-丙酸化大肠杆菌K1多糖-蛋白缀合物或N-丙酸化脑膜炎球菌C多糖-破伤风类毒素缀合物的。
16.用一种方法制备的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，所述方法包括：
A)用去-N-乙酰化剂将分离的多糖或寡糖去-N-乙酰化，形成去-N-乙酰化多糖或去-N-乙酰化寡糖，
B)用丙烯酰化试剂将去-N-乙酰化多糖或去-N-乙酰化寡糖N-丙烯酰化，形成N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖，以及
C)将N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖直接与蛋白缀合，形成所述多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物。
17.根据权利要求16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述多糖或寡糖衍生自细菌、酵母、癌细胞或化学合成制得。
18.根据权利要求16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述缀合在pH约为7.0的条件下进行。
19.根据权利要求16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述缀合在pH大于9的条件下进行。
20.根据权利要求16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述缀合用选自磷酸盐、碳酸盐/重碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液的试剂进行。
21.根据权利要求16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述去-N-乙酰化剂是碱或酶而丙烯酰化试剂选自N-丙烯酰氯、丙烯酰酐、丙烯酸和脱水剂。
22.一种药用组合物，它包含根据权利要求1或16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物和药学上可接受的载体。
23.根据权利要求22的药用组合物，它还包含佐剂。
24.根据权利要求23的药用组合物，其中所述佐剂选自明矾或硬脂酰酪氨酸。
25.根据权利要求22的药用组合物，它还包含第二种组分，所述第二种组分选自DTP、DTaP、Td、DTaP-Hib、DTaP-IPV-Hib及其组合物。
26.一种免疫原，它包含根据权利要求1或16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，所述免疫原诱导多糖-特异性或寡糖-特异性免疫应答。
27.根据权利要求26的免疫原，其中所述免疫应答产生多糖-特异性或寡糖-特异性免疫球蛋白。
28.根据权利要求27的免疫原，其中所述免疫球蛋白是IgG、IgM、IgA或其组合物。
29.制备β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物或β-丙酰胺基-联寡糖-蛋白缀合物的方法，包括：
A)用去-N-乙酰化试剂将多糖或寡糖去-N-乙酰化，形成去-N-乙酰化多糖或去-N-乙酰化寡糖，
B)用丙烯酰化试剂将去-N-乙酰化多糖或去-N-乙酰化寡糖N-丙烯酰化，形成β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖，以及
C)将β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖直接与蛋白缀合，形成β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物或β-丙酰胺基-联寡糖-蛋白缀合物。
30.权利要求29的方法，其中所述去-N-乙酰化试剂是碱或酶。
31.权利要求29的方法，其中所述去-N-乙酰化试剂选自NaOH、KOH和KiOH。
32.权利要求29的方法，其中所述丙烯酰化试剂选自丙烯酰氯、丙烯酰酐、丙烯酸和脱水剂。
33.权利要求29的方法，其中所述多糖或寡糖衍生自细菌、酵母、癌细胞或化学合成制得。
34.权利要求29的方法，其中所述多糖或寡糖衍生自大肠杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌属、链球菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属或假单胞菌属。
35.权利要求29的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B组链球菌的C-β蛋白和B组链球菌的非-IgA-结合的C-β蛋白。
36.权利要求35的方法，其中所述蛋白是重组产生的蛋白。
37.一种疫苗，它包含根据权利要求1或16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物，其中所述疫苗提供对导致疾病的有机体或细胞的保护性免疫。
38.根据权利要求37的疫苗，其中所述导致疾病的有机体或细胞选自细菌、酵母和癌细胞。
39.根据权利要求38的疫苗，其中所述细菌是大肠杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌属、链球菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属或假单胞菌属细菌。
40.根据权利要求37的疫苗，它还包含与所述多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物组合的第二种免疫原，所述第二种免疫原选自DTP、DTaP、Td、DTaP，Hib、DTaP-IPV-Hib及其组合物。
41.免疫哺乳动物抵抗引起疾病的有机体或引起疾病的细胞的方法，该方法包括给予所述哺乳动物免疫量的权利要求37的疫苗。
42.免疫哺乳动物抵抗肺炎链球菌的方法，该方法包括给予所述哺乳动物免疫量的权利要求37的疫苗。
43.免疫哺乳动物抵抗B组链球菌的方法，包括给予所述哺乳动物免疫量的权利要求37的疫苗。
44.免疫哺乳动物抵抗B组脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，包括给予所述哺乳动物免疫量的权利要求37的疫苗。
45.免疫哺乳动物抵抗C组脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，包括给予所述哺乳动物免疫量的权利要求37的疫苗。
46.免疫哺乳动物抵抗B型流感嗜血菌的方法，包括给予所述哺乳动物免疫量权利要求37的疫苗。
47.在哺乳动物激发产生针对多糖或寡糖的抗体应答的方法，包括给予有效剂量权利要求1或16的多糖-蛋白缀合物或寡糖-蛋白缀合物。
48.根据权利要求47的方法制备的免疫球蛋白或其抗原-结合片段。
49.根据权利要求48的免疫球蛋白，它选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体及其组合物。
50.根据权利要求49的免疫球蛋白，其中所述抗体是分离的IgG。
51.在对根据权利要求1和16的β-丙酰胺基-联多糖-蛋白缀合物或β-丙酰胺基-联寡糖-蛋白缀合物的应答中诱导产生的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖具有特异性免疫活性，并对由其衍生β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖的天然N-乙酰化多糖具有免疫活性。
52.根据权利要求51的抗体或其抗原结合片段，其中所述天然N-乙酰化多糖是细菌、酵母或癌细胞的成分。
53.根据权利要求52的抗体或其抗原结合片段，其中所述多糖衍生自大肠杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌属、链球菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属或假单胞菌属细菌。
54.根据权利要求51的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是重组产生的抗体。
55.针对引起疾病的有机体或引起疾病的细胞的被动免疫方法，包括给予有效剂量根据权利要求48或51的所述免疫球蛋白或抗体，所述剂量足以抑制或杀伤导致疾病的有机体或导致疾病的细胞。
56.根据权利要求55的被动免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分离的IgG抗体或其抗原结合片段。
57.根据权利要求55的被动免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分离的IgM抗体或其抗原结合片段。
58.根据权利要求55的被动免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分离的IgA抗体或其抗原结合片段。
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