BR112020012553A2 - glicanos de superfície de clostridium perfringens e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

Um composto glicano imunogênico tem uma estrutura de unidade de repetição poli-B-1,4-ManNAc modificada variavelmente com fosfoetanolamina ligada à posição 6 e fosfoglicerol ligado à posição 6.

Description

cromossômica; ausência de gene putativo PGro transferase cpe2237 cpe2237 Mutante complementado na Este estudo complementado posição trans

Isolados de campo de Clostridium perfringens

CP1 isolado de galinha John Prescott

CP2 isolado de galinha John Prescott

CP3 isolado de galinha John Prescott

CP148 Galinhas com NE, Quebec John Prescott

CP149 Galinhas com NE, Quebec John Prescott

CP150 Galinhas com NE, Quebec John Prescott

Chalmers et al. isolado 6 (CP10) Galinhas com NE; ST02 (2008)

Chalmers et al. isolado 9 (CP11) Galinhas com NE; ST04 (2008)

Chalmers et al. isolado 10 (CP12) Galinhas com NE; ST03 (2008)

Chalmers et al. isolado 14 (CP13) Galinhas com NE; ST05 (2008)

Chalmers et al. isolado 15 (CP14) Galinhas com NE; ST06 (2008)

Chalmers et al. isolado 19 (CP15) Galinhas com NE; ST08 (2008)

Chalmers et al. isolado 20 (CP16) Galinhas com NE; ST09 (2008)

Chalmers et al. isolado 23 (CP17) Galinhas com NE; ST10 (2008)

Chalmers et al. isolado 28 (CP18) Galinhas com NE; ST13 (2008)

Chalmers et al. isolado 30 (CP19) Galinhas com NE; ST14 (2008)

Chalmers et al. isolado 32 (CP20) Galinhas com NE; ST15 (2008)

Chalmers et al. isolado 42 (CP21) Galinhas com NE; ST16 (2008)

Chalmers et al. isolado 57 (CP22) Galinhas com NE; ST22 (2008)

Chalmers et al. isolado 18 (CP23) Galinhas com NE; ST08 (2008)

Chalmers et al. isolado 22 (CP24) galinha, saudável; ST01 (2008)

Chalmers et al. isolado 26 (CP25) galinha, saudável; ST11 (2008)

Chalmers et al. isolado 27 (CP26) galinha, saudável; ST12 (2008)

Chalmers et al. isolado 34 (CP27) galinha, saudável; ST10 (2008) Chalmers et al. isolado 60 (CP28) galinha, saudável; ST06 (2008) Chalmers et al. isolado 16 (CP29) galinha, saudável; ST07 (2008) Chalmers et al. isolado 45 (CP30) galinha, saudável; ST17 (2008) Chalmers et al. isolado 46 (CP31) galinha, saudável; ST19 (2008) Chalmers et al. isolado 47 (CP32) galinha, saudável; ST18 (2008) Chalmers et al. isolado 54 (CP33) galinha, saudável; ST20 (2008) Gohari et al. JP55 NE em equinos (2016) Gastroenterite hemorrágica Gohari et al. JP838 canina (2016) Clostridium symbiosum Tipo de cepa ATCC ATCC 14940

[059] Lisados de células inteiras de C. perfringens, HN13, JGS4143 e SM101 foram gerados para eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS- PAGE) e análises Western immunoblot, como segue: cepas foram esfregadas de suprimentos a -80°C em placas de PGY agar (com antibióticos, conforme apropriado) e cultivadas durante a noite. Para cada cepa, uma única colônia foi usada para inocular 10 mL de caldo de PGY, deixada crescer por 6 h, colhida por centrifugação (13.000 × g, 10 min), lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ressuspensa em PBS para OD600nm = 2.0. As células de 1 mL foram colhidas por centrifugação como acima, ressuspensas em 100 μl de PBS e incubadas com 2 mg mL-1 de lisozima a 37°C por 1 h. Cada amostra foi combinada com 67 μl de tampão de amostra 4x SDS-PAGE (LaemmLi (1970)), aquecida a 95°C por 10 minutos, deixada esfriar e depois analisada por SDS- PAGE de acordo com o método de LaemmLi (LaemmLi (1970) ) ou incubadas com 0,5 mg mL-1 de proteinase K a 55°C por 1 h antes da análise por SDS-PAGE. Após eletroforese, as amostras foram transferidas eletroforeticamente para membrana de nitrocelulose 0,2 μm (Bio-Rad Laboratories Canada, Mississauga, ON) e submetidas à análise Western immunoblot (Burnette (1981)) usando anti- soro policlonal de coelho aumentado contra células inteiras de C. perfringens HN13 (Dr. SG Melville, Virginia Tech) como primário anticorpo (diluição 1: 1000), e IgG IRDye 680RD de anti-coelho de cabra (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) como anticorpo secundário (1: 15.000) e visualizado em um sistema de imagem infravermelha LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences).

[060] A Figura 1 mostra um Western immunoblot de lisados de células inteiras das cepas de C. perfringens HN13, JGS4143 e SM101 usando anti-soro de coelho que foi aumentado contra células inteiras de C. perfringens HN13.

[061] A reatividade em todas as cepas foi semelhante, com um grande "esfregaço" de antígeno e algumas bandas de alto peso molecular presentes, independentemente do tratamento com lisozima. O tratamento da proteinase K resultou na perda das poucas bandas de alto peso molecular, mas a grande reatividade do "esfregaço" não foi afetada, indicando que o antígeno responsável não é baseado em proteínas, sugerindo que o antígeno é uma molécula polissacarídica, glicolipídica ou lipídica.

[062] Assim, parece que C. perfringens provavelmente produz uma molécula antigênica não proteica que domina a resposta imune. Exemplo 2

[063] A Figura 2 representa um Western immunoblot de anti-C. perfringens de lisados de células inteiras com e sem tratamento com proteinase K a partir de HN13, quatro diferentes mutantes transposon de glicosiltransferase e o mutante cpe2071 glicosiltransferase complementado com o gene cpe2071 transmitido por plasmídeo (preparado como descrito no Exemplo 1). Lisados de células inteiras de quatro mutantes de glicosiltransferase (isolados de uma biblioteca de transposons de C. perfringens HN13 descrita anteriormente (Liu et al. (2013)) foram analisados por m e lisados de um mutante com o gene cpe2071 interrompido (cepa HLL8) não contém o antígeno resistente à proteinase K observada no tipo selvagem de cepa. A complementação desse mutante com uma cópia do gene cpe2071 transmitida por plasmídeo resultou na restauração do antígeno resistente à proteinase K, confirmando que a perda desse antígeno no mutante cpe2071 se deu por uma interrupção do gene cpe2071. Dado que o cpe2071 codifica um polissacarídeo e o antígeno é resistente à proteinase K, o antígeno é um polissacarídeo ou um glicolipídeo contendo polissacarídeo.

[064] Assim, de acordo com este exemplo, parece que o antígeno de superfície imunodominante de C. perfringens é provavelmente um polissacarídeo ou glicolipídeo com um componente polissacarídeo. Exemplo 3

[065] As células C. perfringens HN13 e JGS4143 fixadas em formalina foram preparadas da seguinte forma para injeção intramuscular (IM) em galinhas. As células foram cultivadas durante a noite em placas de agar PGY como descrito no Exemplo 1. As células de uma placa foram colhidas e ressuspensas em 10 mL de PBS, sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em 10 mL de PBS contendo formalina a 1% (v/v) e incubadas a 4°C por 2 horas. As células foram lavadas 4 vezes em 2 mL de PBS para remover a formalina e ressuspensas em PBS formando um OD600nm de 1.0. A suspensão de células foi misturada 1: 1 com o adjuvante completo de Freund (FCA, injeção primária) ou o adjuvante incompleto de Freund (FIA, injeção de reforço). Injeções primárias (150 L  2, IMno músculo peitoral) foram administradas aos frangos aos 7 dias de idade, seguidas de injeções de reforço (150 L  2, IM no músculo peitoral) aos 21 dias de idade. As galinhas foram abatidas no dia 35 e exsanguinadas. Deixou-se coagular o sangue à temperatura ambiente durante a noite, e no dia seguinte as amostras foram centrifugadas a 13 000 x g e o soro foi aspirado por pipeta e armazenado a 4°C.

[066] Um total de 32 isolados de campo de C. perfringens foi obtido pelo Dr. John Prescott (Universidade de Guelph, Guelph, ON, Canadá), consistindo em quantidades de galinhas saudáveis e com NE, cobrindo uma gama de tipos de sequência por tipagem por sequências multi-locus (ST), bem como duas cepas de isoladas de infecções não relacionadas a galinhas (NE em eqüino e gastroenterite hemorrágica canina) (Tabela 1).

[067] Lisados de células inteiras de C. perfringens para eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e análises Western immunoblot foram preparados por ebulição de células em tampão SDS-PAGE, tratando com proteinase K e fervendo em tampão SDS-PAGE (como descrito no Exemplo 1), depois separados por SDS-PAGE e analisados por Western immunoblot usando antisoros anti-C perfringens de coelho (que foi aumentado contra C. perfringens HN13), bem como os antisoros anti-C perfringens de galinha, aumentados criados contra C. perfringens HN13 e JGS4143 (descrito acima). Para remover sinais indesejáveis de antígenos que não sejam o glicano de interesse, os anti-

soros de coelho e galinha aumentados contra C. perfringens HN13 foram adsorvidos contra células inteiras do mutante C. perfringens HN13 cpe2071 (cepa HLL8), que não torna o glicano de interesse. O anti-soro de galinha aumentado contra C. perfringens JGS4143 foi utilizado sem qualquer etapa de adsorção, uma vez que nenhum mutante glicano-minus estava disponível nesse contexto. A adsorção foi realizada da seguinte maneira: C. perfringens HN13 cpe2071 foi cultivado como descrito para lisados de células inteiras, lavado com PBS e ajustado para OD600nm = 1.0 in PBS, alíquotas de 4 x 1 mL foram sedimentadas por centrifugação como descrito acima. A primeira alíquota foi ressuspensa em 100 μl de antisoro anti-C perfringens HN13 de coelho ou galinha, deixada incubar em temperatura ambiente por 1 hora, sedimentada por centrifugação, e o sobrenadante foi decantado. Este processo foi repetido sequencialmente para cada uma das 3 alíquotas de células restantes usando o sobrenadante da rodada anterior para ressuspender as células. Este anti-soro adsorvido foi usado como anticorpo primário e IgG IRDye 680RD de anti-coelho de cabra foi usado como anticorpo secundário, como descrito no Exemplo 1.

[068] A Figura 3 representa o Western immunoblot de lisados de células inteiras de campo de C. perfringens anteriores vs JGS4143 e HN13 (controles +ve) e o mutante HN13 cpe2071 (controle -ve) usando os antisoros anti-C perfringens HN13 de coelho e galinha, bem como os antisoros anti-C perfringens JGS4143 não adsorvidos. Para os anti-soros de coelho e galinha aumentados contra C. perfringens HN13, todas as cepas apresentaram reatividade semelhante a HN13 e JGS4143, indicando que essas cepas produzem um glicano semelhante ou intimamente relacionado em comparação com C. perfringens HN13. Observe que a reatividade consistente com o glicano de interesse foi observada no campo utilizado de galinhas com NE e galinhas saudáveis, bem como de um equino com NE (JP55) e uma gastroenterite hemorrágica canina (JP838) isolada, indicando que o glicano de interesse está presente no disponibilidade de C. perfringens, independentemente da espécie hospedeira ou do estado de doença dos animais hospedeiros. Por outro lado, o anti-soro de galinha aumentado contra C. perfringens JGS4143 foi reativo com os controles de lisado HN13 e JGS4143, mas apenas 5 dos campos apresentaram reatividade, com 3 (20, 21 e 149) mostrando reatividade moderada e mais 2 campos selecionados (10 e 11) apenas com reatividade fraca.

[069] Assim, parece que o antígeno polissacarídeo de superfície de C. perfringens HN13 é um exemplo específico de um glicano em conformidade com a Fórmula I na (Figura 12) e é amplamente conservado ou possui um ou mais epítopos que provocam uma resposta imune amplamente reativa-cruzada, enquanto o antígeno polissacarídeo de superfície de C. perfringens JGS4143 (Figura 12) é muito menos reativo cruzado em isolados de campo exemplificativos de C. perfringens. Exemplo 4

[070] Os lisados de células tratadas com proteinase K de Clostridium cocleatum, Clostridium perfringens e Clostridium symbiosum foram preparados da mesma maneira que a descrita para lisados de células de C. perfringens no Exemplo 1. Os lisados não-C. perfringens, juntamente com os lisados JGS4143 e HN13 como controles positivos e o lisado mutante HN13 cpe2071 como controle negativo, foram separados por SDS-PAGE e analisados por Western immunoblot usando antisoro anti-C.perfringens de coelho adsorvido contra células inteiras do mutante C. perfringens HN13 cpe2071, como descrito no Exemplo 3.

[071] A Figura 4 representa o Western immunoblot de lisados de células inteiras de cepas representativas de C. cocleatum, C. perfringens e C.

symbiosum vs JGS4143 e HN13 (controles +ve) e o mutante HN13 cpe2071 (controle -ve) usando anti-soro C. anti perfringens de coelho adsorvido contra células inteiras do mutante HN13 cpe2071. Nenhum dos lisados não-C. perfringens exibiram reatividade consistente com o glicano de interesse, indicando que o antígeno conservado de C. perfringens não está presente nessas cepas de Clostridium relacionadas.

[072] Assim, de acordo com este exemplo, parece que o antígeno conservado de C. perfringens provavelmente não está presente em outras espécies de Clostridium. Exemplo 5

[073] Para testes de proteção passiva, pintos de legorne foram submetidos à provocação de resposta no 1 dia de idade a C. perfringens na presença e ausência de antisoro anti-C. perfringens de galinha da seguinte forma. Para preparar as soluções de gavagem oral, a cepa C. perfringens JGS4143 de galinhas com NE foi esfregada no ágar PGY no dia anterior à gavagem (dia 0) e cultivada durante a noite como descrito acima. No dia da gavagem (dia 1), as células foram colhidas em PBS, sedimentadas por centrifugação a 13,000  g for 30 minutos, e lavadas duas vezes com PBS. O sedimento de células lavadas foi ressuspenso em ~3,7  109 células por mL em PBS, e separadamente uma diluição de 1/10 de antisoro anti-C. perfringens HN13 de galinha altamente reativo foi preparada em PBS. A suspensão de células de C. perfringens JGS4143 foi então misturada 9: 1 com PBS ou com o antisoro anti-C.perfringens de galinha diluído imediatamente antes da gavagem, conforme apropriado. No total, 9 aves submetidas à gavagem por via oral com 300 μl da mistura de C. perfringens/PBS sem anti-soro (1 x109 células), 9 aves foram submetidas à gavagem por via oral com 300 μl da mistura de C. perfringens/PBS contendo anti-soro (1 x 109 células) e 5 aves foram submetidas à gavagem por via oral com PBS isoladamente como controle, e a mortalidade das aves foi monitorada por 7 dias.

[074] A Figura 5 representa a porcentagem de sobrevivência de aves nos grupos de gavagem oral apenas com C. perfringens JGS4143 e co-gavagem com JGS4143 com uma diluição de 1: 100 de anti-soro C. perfringens. Sete dias após a gavagem, 100% das aves submetidas à gavagem oral apenas com PBS sobreviveram (não mostrado), apenas 22% de sobrevivência (2 de 9 aves) foi observada no grupo submetido à gavagem com C. perfringens isoladamente e uma taxa de sobrevivência de 89% ( 8 de 9 aves) foi observada no grupo submetido à co-gavagem com C. perfringens e 1: 100 de antisoro anti-C. perfringens. Exemplo 6

[075] Para ensaios de opsonofagocitose, células de C. perfringens JGS4143 foram incubadas com sangue de galinha heparinizado e soro de galinha naive ou anti-soro anti-C. perfringens HN13 de acordo com o método descrito anteriormente por Goyette-Desjardins et al (2016) com modificações, conforme a seguir. Para preparar as células bacterianas para este ensaio, a cepa C. perfringens JGS4143 de Galinhas com NE foi esfregada no ágar PGY no dia anterior ao abate de uma galinha de 5 semanas de idade (dia 34) como fonte de sangue fresco de galinha e cultivada durante a noite como descrito acima. No dia da coleta de sangue e seleção (dia 35), as células foram colhidas em PBS, sedimentadas por centrifugação a 13,000g por 30 minutos, e lavadas duas vezes com PBS. O sedimento de células lavadas foi ressuspenso em ~2,9105 células por mL em meio RPMI 1640, suplementado com soro de galinha inativado pelo calor a 5%, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM e mercaptoetanol 50 µM and, e sangue de uma única galinha abatida foi coletado em um tubo revestido com heparina para evitar a coagulação. O sangue heparinizado foi diluído 1/3 no RPMI 1640 suplementado listado acima. O sangue diluído (50 µL) foi combinado com 40 µL de soro de galinha naive ou antisoro C.perfringens HN13 de galinha em um microtubo, seguido pela adição de 10 µL da suspensão de C. perfringens JGS4143, resultando em um MOI aproximado de 0,015 com base em 2,9-103 células bacterianas na reação e em um conteúdo calculado de leucócitos 1,9105 leucócitos com base nos valores da literatura de leucócitos no sangue de frangos de corte (Orawan e Aengwanich (2007). Os topos dos tubos foram perfurados usando uma agulha estéril de calibre 25 e depois colocados em uma incubadora de CO2 a 5% a 37°C por 2 hs, depois cada reação foi combinada com glicerol estéril a 80% e incubada a -80°C até ficar pronta para plaqueamento. Para enumerar as células em cada reação, as amostras foram descongeladas em gelo e semeadas em alíquotas de 100 µL de diluições em série de 10 vezes em ágar PGY e incubadas em condições anaeróbicas por 18 hs. Os valores percentuais de morte bacteriana foram calculados usando a seguinte fórmula:% de bactérias mortas = [(nº de células na reação sérica de galinha naive – nº de células recuperadas na reação de interesse)/(nº de células na reação sérica de galinha naive)]  100.

[076] A Figura 6 representa a porcentagem de mortes bacteriana observadas nas reações do ensaio de opsonofagocitose contendo antisoro anti- C perfringens HN13 de galinha, com uma % média de morte bacteriana observada de C. perfringens JGS4143 de 29,5% com este soro. Exemplo 7

[077] Para testes NMR, as cepas de Clostridium foram cultivadas em caldo PGY a 37° C com agitação a 50 rpm em um fermentador BioFlo 115 (Eppendorf, Mississauga. ON) que foi fornecido com N2 a uma taxa de fluxo de 1 L/min. Os meios foram pré-aquecidos e condicionados com N2 por 1 h antes da inoculação com uma cultura de caldo de 40 mL durante a noite. Quando apropriado, os meios foram suplementados com 30 µg de mL-1 eritromicina (Em).

[078] O polissacarídeo de C. perfringens foi extraído e purificado a partir de culturas de fermentador de 10 L de C. perfringens HN13 e JGS4143 da seguinte maneira: as culturas foram inoculadas com uma cultura de 40 mL de O/N e deixadas crescer 6 h (~ OD 2.0 ) antes da colheita por centrifugação (13,000 × g, 30 min). As células foram lavadas uma vez com PBS, ressuspensas em 400 mL de água MilliQ e fervidas por 30 minutos sob agitação em uma placa quente. A mistura foi resfriada, as células foram sedimentadas por centrifugação (como acima), o sobrenadante foi removido e o sedimento foi submetido a extração com fenol: água quente de acordo com o método de Westphal e Jann (1965) com modificações. O sedimento foi ressuspenso em 200 mL de solução salina (NaCl 125 mM) e combinado com 200 mL de fenol liquefeito pré-aquecido em banho-maria a 70°C, e a mistura foi incubada sob agitação por 1 h. A mistura foi resfriada em gelo, centrifugada (13,000 × g for 30 min) para separar as fases aquosa e fenol, e a fase fenol foi dialisada contra água da torneira durante 5 dias e depois liofilizada. A amostra liofilizada foi ressuspensa em 100 mL de água MilliQ, submetida a centrifugação a 13,000 × g por 30 minutos, e depois colocada em uma ultracentrífuga por 16 hs. Após a remoção do sobrenadante, o sedimento transparente foi ressuspenso novamente em água MilliQ e re-sedimentado por ultracentrifugação (como acima) para remover vestígios residuais do sobrenadante, ressuspenso em 20 mL de MilliQ e liofilizado. Os compostos isolados utilizados para NMR foram comparados com as moléculas antigênicas resistentes à proteinase K, como observado em Western immunoblot.

[079] A Figura 7 representa um Western immunoblot dos antígenos purificados em comparação com os lisados de células inteiras digeridas com proteinase K de HN13 e JGS4143 (controles + ve) e o mutante HN13 cpe2071 (controle -ve) usando anti-soro de coelho aumentado contra C. perfringens HN13. Análise da composição de glicosil dos polissacarídeos de superfície C. perfringens HN13 e JGS4143 purificados

[080] A composição do glicolipídeos isolados dessas duas cepas (como descrito acima) foi determinada por cromatografia gasosa combinada/espectrometria de massa (GC-MS) de derivados de per-O- trimetilsilila dos monossacarídeos glicosídeos de metila produzidos por metanólise ácida das amostras descritas por Santander et al. (2013). Resumidamente, os glicolipídeos HN13 e JGS4143 liofilizados foram aquecidos com HCl metanólico em um tubo de ensaio de vidro com tampa de rosca vedada por 18 horas a 80°C. Após o resfriamento e a remoção do solvente sob um fluxo de nitrogênio, as amostras foram tratadas com uma mistura de metanol, piridina e anidrido acético por 30 minutos. Os solventes foram evaporados e as amostras foram derivatizadas com Tri-Sil® (Pierce) a 80°C por 30 minutos. A análise GC/MS dos metilglicosídeos TMS foi realizada em um GC Agilent 7890A, em interface com um MSD 5975C, usando uma coluna capilar sílica fundida Supelco Equity-1 (30 m x 0,25 mm ID).

[081] A análise da composição de glicosil mostrou que o polissacarídeo HN13 contém glicerol (Gro), glicose (Glc), traços de N-acetilmanosamina (ManNAc) e ácidos graxos: C20, C18, C16 e C14. O polissacarídeo JG4143 contém ribose (costela), glicose (Glc), traços de N-acetilmanosamina (ManNAc) e ácidos graxos: C20, C18 e C16. Como mostrado e descrito abaixo, o principal resíduo glicosil no glicolipídeo é o ManNAc, no entanto, não é amplamente observado usando esse método, devido à maioria desses resíduos serem substituídos por fosfoetanolamina ou fosfoglicerol (veja abaixo).

[082] Para preparar amostras para espectroscopia de NMR, todos os glicolipídeos purificados foram desacilados da seguinte forma: as amostras liofilizadas foram dissolvidas em NH4OH concentrado, incubadas a 80°C por 1 h, deixadas esfriar e liofilizadas. O material liofilizado foi dissolvido em água destilada e fraccionado em uma coluna BioGel P6 usando água desionizada como eluente. As frações foram coletadas com base na resposta de um detector de índice de refração, liofilizadas e depois lavadas 3 vezes com diclorometano para remover completamente os ácidos graxos livres das amostras.

[083] Para todas os testes de NMR as amostras liofilizadas foram dissolvidas em 0,2 mL de D2O e transferidas para um tubo de NMR OD de 3 mm. Os espectros de prótons 1D foram adquiridos a 25°C com supressão padrão de sinal de solvente “Presat” em um espectrômetro Varian 600 MHz equipado com sonda de frio de 3 mm (Varian, Inova Palo Alto, CA). Todos os espectros foram adquiridos com sequências de pulsos Varian padrão. As aquisições de NMR foram processadas usando o software MNova (Mestrelab Research, Espanha). Os espectros foram referenciados em relação ao sinal DSS (H=0 ppm; C=0 ppm). Espectroscopia de NMR do carboidrato de superfície a partir de C. perfringens HN13:

[084] O polissacarídeo HN13 delipidado foi analisado por espectroscopia de NMR 1D/2D; análises de prótons, HSQC, COSY, TOCSY e NOESY. Isso permitiu a atribuição dos deslocamentos químicos de prótons e carbono de cada resíduo e também a determinação de suas ligações, sequência e posições de substituição dos substituintes PEtN e PGro. As atribuições de deslocamentos químicos são apresentadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 deslocamentos químicos 1H e 13C NMR do polissacarídeo HN13 registrado em D2O a 30 C Resíduo H-1/C- H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C- 1 6 -4)-β- 4,87 4,61 3,94 3,80 3,61 4,12 ManNAc6PEtN-(1- 101,1 54,0 71,7 77,9 74,9 65,4

A -4)-β- 4,89 4,58 3,94 3,80 3,61 4,12 ManNAc6PGro-(1- 101,1 54,1 71,7 77,9 74,9 65,4

B PEtN 4,11 3,23 - - - - 63,3 41,4 PGro 3,86; 3,94 3,60; - - - 3,91 71,7 3,66 67,6 63,4

[085] A Figura 8 representa os espectros de 1H RMN, NOESY (200ms) e gHSQC (D2O, 30°C) do polissacarídeo desacilado de Clostridium perfringens HN13.

[086] O espectro de NMR de 1H (Figura 8, acima) continha dois sinais anoméricos em δ 4,87 (resíduo A) e δ 4,84 (resíduo B) na proporção 3: 1, que eram devidos a resíduos β-ManpNAc, conforme indicado por seus respectivos deslocamentos químicos H-2 no campo inferior, δ 4,61 e δ 4,58, e deslocamentos químicos de C-2 em δ 54,0 e 54,1 (Figura 3, meio e fundo). O sinal de campo alto em δ 2,06 foi atribuído aos grupos NAc ligados ao C-2 de cada resíduo de ManNAc. As fortes correlações intraresiduais de NOE (Figura 3,

meio) entre H-1 e H-3 e entre H-1 e H-5 confirmam a configuração β desses resíduos. Todos os resíduos ManNAc foram conectados por ligações (1 → 4) e foram substituídos em O-6 por PEtN (resíduo A) ou PGro (resíduo B). A substituição 4- e 6- dos resíduos A e B, respectivamente, foi suportada pelos deslocamentos químicos de 13C (Figura 8, parte inferior; Tabela 2): A C-4 δ 77,9, A C-6 δ 65,4, B C- 4 5 77,9, B C-6 5 65,4. O fato de um resíduo terminal não ter sido observado indica que o polissacarídeo possui um alto peso molecular.

[087] Para obter mais informações sobre a estrutura, o polissacarídeo HN13 foi desfosforilado pela dissolvição da amostra delipidada liofilizada em 48% HF e pela incubação a 4° C por 48 hs, seguida de evaporação da amostra em gelo e liofilizado mais uma vez. A mistura do produto gerado foi submetida a cromatografia de exclusão por tamanho por coluna Bio-Gel P6 e foram obtidas duas frações, denotadas F1 e F2. A análise de NMR 1D/2D permitiu atribuições de prótons e carbono dos resíduos em F1 e F2, bem como a ligação e sequência desses resíduos (Figura 9; Tabela 3) Tabela 3 1 13 deslocamentos químicos H e C NMR do polissacarídeo HN13 desfosforilado (Fração F1-F2), registrados em D2O em 25 C Resíduo H-1/C-1 H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C- 6 -4)-β-ManNAc-(1- 4,84 4,57 3,93 3,73 3,49 3,76; C* 100,6 54,0 71,6 77,3 76,3 3,88 61,1 T-β-ManNAc-(1- 4,85 4,55 3,82 3,51 3,43 3,80; D 100,6 54,4 73,0 67,8 77,7 3,92

61,5 -4)-ManN-(1- 5,03 3,91 4,11 3,79 3,57 3,76; E 97,6 55,2 69,4 76,6 75,9 3,89 61,1 -4)-β-Glc-(1- 4,48 3,36 3,68 3,76 3,59 3,73; F 103,5 74,1 74,9 79,1 75,6 3,89 61,1 Gro 3,76; 3,93 3,60; 3,92 71,9 3,67 72,0 63,5 *Fração, F1, continha apenas esses deslocamentos químicos.

[088] A Figura 9 representa os espectros de 1H NMR (D2O, 25°C) das frações F1 e F2 da cromatografia Bio-Gel P6 do polissacarídeo HN13 desfosforilado. Estes dados mostram que a cadeia principal do polissacarídeo desfosforilado, F1, contém apenas cadeias lineares de resíduos ManNAc (C) - 4-ligada. Todos os grupos PEtN ou PGro foram removidos pelo tratamento de IC. A análise por NMR 1D/2D da fração de baixo peso molecular (F2) mostrou que o polissacarídeo HN13 possui um componente →4)--ManN-(1→4)--Glc- (1→1)-Gro e na sua extremidade redutora seguida por resíduos de ManNAc - 4-ligada. A análise MALDI-TOF-MS, juntamente com os dados de NMR acima, confirmou que a fração F2 continha o componente trissacarídeo acima seguido de alongamento sucessivo com resíduos de ManNAc ligada a β-4 (Tabela 4). Tabela 4. Massas observadas e composições propostas para íons gerados pelo modo de íons positivos na fração Bio-Gel P6 F2.

Estrutura proposta Observada (m/z) ManNAc3ManNGlcGro 1047,5 [M+Na]+ ManNAc4ManNGlcGro 1250,6 [M+Na]+ ManNAc5ManNGlcGro 1453,7 [M+Na]+ ManNAc6ManNGlcGro 1656,8 [M+Na]+ ManNAc7ManNGlcGro 1859,8 [M+Na]+

[089] Combinados, esses dados indicam que o polissacarídeo HN13 é composto por um polímero de repetição de resíduos de ManNac modificado com PGro ou PEtN em uma proporção de 1: 3 ligada a ManN-Glc-Gro na extremidade redutora (Figura 12), com uma estrutura da Fórmula II (mostrada acima). Espectroscopia de NMR do carboidrato de superfície de C. perfringens JGS4143:

[090] A análise de NMR 1D e 2D (como descrito para o polissacarídeo HN13) permitiu a atribuição completa dos prótons e carbonos para esses resíduos (Figura 10; Tabela 5).

[091] A Figura10 representa os espectros de 1H NMR, NOESY (200 ms) e gHSQC (D2O, 60°C). O espectro de 1H NMR do polissacarídeo JGS4143 mostrou a presença de sistemas de spin pertencentes a: →4)--ManpNAcPEtN-(1→ (resíduo A); →4)--ManpNAc-(1→ (resíduo C); →4)--Glcp-(1→ (resíduo F); →3,4)--ManpNAcPEtN-(1→ (resíduo G); T--Ribf-(1→ (resíduo H); T-- ManpNAcPEtN-(1→ (resíduo J). Tabela 5 Deslocamentos químicos 1H e 13 C NMR do polissacarídeo JGS4143, registrados D2O a 60°C

Resíduo H-1/C-1 H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C-6 -4)-β- 4,87 4,61 3,94 3,82 3,62 4,12 ManNAc6PEtN-(1- 101,1 54,0 71,7 77,9 74,9 65,2

A -4)-β-ManNAc-(1- 4,84 4,57 3,93 3,73 3,55 3,75; C 100,7 54,0 71,6 77,9 76,1 3,87 61,2 -4)-β-Glc-(1- 4,49 3,35 3,68 3,73 3,59 3,75; F 103,4 73,9 74,8 77,8 76,1 3,87 61,2 -3,4)-β- 4,87 4,72 4,00 4,04 3.,63 4,12 ManNAc6PEtN-(1- 100,8 54,0 78,6 74,.1 75,0 65,2

G T-α-Ribf-(1- 5,29 4,10 4,00 4,02 3,66; H 104,6 72,8 70,5 86,2 3,71 62,6 T-β-ManNAc6PEtN- 4,90 4,59 3,85 3,59 3,58 4,12 (1- 101,1 54,3 72,8 67,4 76,2 65,2

J Gro 3,75; 3,94 3,55; 3,93 71,7 3,64 71,7 63,5 PEtN 4,11 3,20 63,4 41,4

[092] Esses dados, diferentemente dos do polissacarídeo HN13,

permitiram a identificação de um resíduo ManNAc terminal, bem como a extremidade redutora componente -4)--Glcp-(1→1)-Gro. A comparação desses dados de NMR com os do polissacarídeo HN13 (descrito acima) mostrou que a molécula era um oligossacarídeo com uma cadeia principal de ManNAc ligada a β-4 que foi amplamente substituído por PEtN, como foi o caso do polissacarídeo HN13, mas diferiu significativamente do polissacarídeo HN13, na medida em que era desprovido de PGro e continha -Ribf substituído em O-3 de um dos resíduos de ManNAc.

[093] Estes dados indicam que o polissacarídeo JGS4143 é composto por um polímero de repetição de resíduos de ManNac modificado com PEtN e ligado a ManN-Glc-Gro na extremidade redutora, semelhante ao polissacarídeo de HN13, mas desprovido das modificações de PGro observadas no polissacarídeo HN13 e com um resíduo -Ribf em O-3 no resíduo ManNAc proximal ao resíduo terminal ManNAcPEtN (Figura 12), com uma estrutura de Fórmula III.

[094] Combinados, esses dados indicam que as cepas de C. perfringens produzem uma classe comum de polissacarídeos de superfície e que o polissacarídeo de superfície de C. perfringens HN13 é um glicolipídeo com uma cadeia longa de polissacarídeos com uma estrutura de unidade de repetição de ManNAc 1-4-ligada modificado com PGro ou PEtN em uma proporção de 1: 3 que contém um ou mais epítopos compartilhados com todas as cepas de C. perfringens testadas até o momento. Em contraste, C. perfringens JGS4143 produz um glicolipídeo relacionado que fraciona de maneira semelhante e cuja cadeia principal polissacarídica também é um polímero de resíduos de ManNAc 1,4-ligada modificados com PEtN, mas difere do glicano HN13 principalmente pela ausência de modificações de PGro e comprimento de polímero mais curto.

[095] A capacidade do glicano HN13 de provocar uma resposta imune (em coelhos e galinhas) que é amplamente reativa a todos os campos testados em C. perfringens, contrastado com o glicano JGS não reativo cruzado (provocando uma resposta imune em galinhas que é reativa apenas com ~ 16% do campo testado), tomada com as características estruturais das estruturas resolvidas para ambos os glicanos, sugere que a resposta imune amplamente reativa ao HN13 depende pelo menos da presença de pelo menos uma modificação de PGro e possivelmente da ausência da pentose (-Ribf) observada no JGS4143. Exemplo 8

[096] Para a geração de um mutante C. perfringens HN13 que não possui a porção fosfoglicerol, os genes putativos de fosfoglicerol transferase foram identificados pesquisando o genoma da cepa 13 de C. perfringens (taxid: 195102) para genes anotados para potencialmente ter um papel na biossíntese de LTA ou transferência de fosfoglicerol, seguida de análise de domínio conservado dos produtos gênicos codificados (usando o recurso de pesquisa de CD do NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi]), previsão de hélices transmembranares e orientação da membrana (via servidor TMHMM [http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/]). Esses resultados foram comparados com os resultados obtidos para transferências de fosfoglicerol ou fosfoetanolamina conhecidas (LtaS de Staphylococcus aureus [c2w5tA], Lpt3 [NMB2010] e Ltp6 [NMA0408] de Neisseria meningitidis, EptB de E. coli [NC_000613.3] e LptS de E. coli [NC_000613.3]. de Haemophilus influenzae Rd [HI0275]), resultando na identificação de quatro genes com características comuns. No programa Protein Homology/analogY Recognition Engine V2.0. (Phyre2; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htmL/page.cgi?id=index) para o produto gênico do cep2237 candidato, o principal impacto foi na fosfoglicerol transferase LtaS envolvida na biossíntese do ácido lipoteicóico. A deleção cromossômica de cpe2237 foi realizada de acordo com o método de Nariya et al (2011), e análises de Western immunoblot de lisados de células inteiras (como descrito no Exemplo 4) revelaram que a perda de cpe2237 correspondia a uma reatividade reduzida com antisoro HN13, mas reatividade aprimorada com soro anti-JGS4143 de galinha. A coloração negativa de lisados de tipo selvagem e mutantes (de acordo com o método de Castellanos-Serra e Hardy (2006)) confirmou que esses resultados não eram devidos a diferenças na quantidade de glicolipídeo imunogênico produzido entre o tipo selvagem e mutante e a complementação do mutante com uma cópia do gene cpe2237 na posição trans (usando pKRAH1) restaurou a reatividade contra os dois anti- soros aos níveis do tipo selvagem.

[097] Postula-se que o gene cpe2237 é a fosfoglicerol transferase e que o glicolipídeo imunogênico nesse mutante, portanto, carece das modificações de PGro. Isso resulta na perda de sinais correspondentes ao PGro nas análises de NMR (por exemplo, 1H-13C HSQC e/ou TOCSY, 1H-31P HSQC) do glicolipídeo imunogênico purificado a partir do mutante (como descrito no Exemplo nº) e da análise HR-MAS de células inteiras (como descrito por van Alphen et al (2014)). Também é antecipado que a perda de PGro resultará em ligação diferencial pela intelectina-1 humana (hItln1), que foi relatada como reconhecendo grupos glicerol-fosfato em estruturas de polissacarídeos bacterianas (Wesener et el (2015)). Isso é feito através da realização de um Western immunoblot em lisados de células inteiras da mesma maneira que no Exemplo 3, usando o hItln1 em vez de um anticorpo primário e um anticorpo secundário anti-hItln1 marcado com fluorescência ou na microscopia de células inteiras usando hItln1 marcado com fluorescência. A perda de PGro correlacionada à reatividade reduzida ao anti-soro anti-HN13 indica que o PGro é um epítopo importante que contribui para a resposta imune ao HN13 e apóia a proposta de que o PGro seja um epítopo importante na obtenção de uma resposta imune amplamente reativa pelo glicolipídeo imunodominante.

[098] Sendo a invenção assim descrita, naturalmente que a mesma pode variar de diversas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como um desvio do espírito e escopo da invenção, e todas as modificações que seriam óbvias para um técnico no assunto devem ser incluídas no escopo das reivindicações a seguir. Interpretação

[099] As referências no relatório a "aquela modalidade", "uma modalidade", etc., indicam que a modalidade descrita pode incluir um aspecto, recurso, estrutura ou característica específica, mas nem toda modalidade inclui necessariamente esse aspecto, característica, estrutura ou recurso. Além disso, essas frases podem, mas não necessariamente, se referir à mesma modalidade mencionada em outras partes do relatório. Além disso, quando um aspecto, recurso, estrutura ou característica em particular é descrito em conexão com uma modalidade, é do conhecimento de um técnico no assunto associar ou conectar esse módulo, aspecto, recurso, estrutura ou característica a outras modalidades, seja de forma descrita explicitamente ou não. Em outras palavras, qualquer módulo, elemento ou recurso pode ser combinado com qualquer outro elemento ou recurso em diferentes modalidades, a menos que haja uma incompatibilidade óbvia ou inerente, ou ela está especificamente excluída.

[0100] Deve-se notar ainda que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como base antecedente para o uso de terminologia exclusiva, tal como "unicamente", "apenas" e similares, em conexão com a indicação de elementos de reivindicação ou o uso de uma limitação "negativa". Os termos "preferivelmente", "preferido", "preferir", "opcionalmente", "pode" e termos semelhantes são usados para indicar que um item, condição ou etapa a que se refere é um recurso opcional (não obrigatório) da invenção.

[0101] As formas singulares "uma", "um" e "o/a" incluem a referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo "e/ou" significa qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais esse termo está associado. A frase "um ou mais" é facilmente entendida por um técnico no assunto, particularmente quando lida no contexto de seu uso.

[0102] O termo "cerca de" pode se referir a uma variação de ± 5%, ± 10%, ± 20% ou ± 25% do valor especificado. Por exemplo, "cerca de 50" por cento pode, em algumas modalidades, sustentar uma variação de 45 a 55 por cento. Para intervalos inteiros, o termo "cerca de" pode incluir um ou dois números inteiros maiores que e/ou menores que um número inteiro indicado em cada extremidade do intervalo. Salvo indicação em contrário neste documento, o termo "cerca de" destina-se a incluir valores e intervalos próximos ao intervalo indicado que são equivalentes em termos da funcionalidade da composição ou da modalidade

[0103] Como será entendido por um técnico no assunto, para todo e qualquer objetivo, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todos os intervalos aqui descritos também abrangem todo e qualquer subintervalos e combinações possíveis de subintervalos dos mesmos, bem como os valores individuais que compõem o intervalo, principalmente valores inteiros. Um intervalo indicado inclui cada valor, número inteiro, número decimal ou identidade específica dentro do intervalo. Qualquer intervalo listado pode ser facilmente reconhecido como descrevendo suficientemente e permitindo que o mesmo intervalo seja dividido em pelo menos iguais metades, terços, quartos, quintos ou décimos. Como um exemplo não limitativo, cada intervalo discutido aqui pode ser facilmente dividido em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc.

[0104] Como também será entendido por um técnico no assunto, todos os termos tais como "até", "pelo menos", "maior do que", "menor do que", "mais que", "ou mais" e do mesmo modo, incluem o número indicado e esses termos se referem a intervalos que podem ser subsequentemente divididos em subintervalos, conforme discutido acima. Da mesma maneira, todos os índices aqui mencionados também incluem todos os sub-índices dentro do índice mais amplo.

REFERÊNCIAS

[0105] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta Especificação são indicativos do nível de habilidade dos técnicos no assunto a que esta invenção se refere e são incorporados aqui por referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

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Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto glicano imunogênico, caracterizado pelo fato de que apresenta uma estrutura de unidade de repetição poli--1,4-ManNAc modificada com pelo menos um fosfoglicerol ligado à posição 6.

2. Glicano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um composto de Fórmula I na forma isolada, sintetizada e/ou purificada, opcionalmente conjugado, ou um análogo imunogênico ou forma modificada do mesmo: em que n≥1; cada um de R1, R2, R3, e R4 compreende qualquer modificação, desde que pelo menos um deles seja fosfoglicerol (–PGro); R5 compreende qualquer modificação; e R6 compreende -H ou –Ac.

3. Glicano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R5 é –OH e/ou um R5 em uma cópia terminal da estrutura de repetição compreende um açúcar, tal como ribofuranose.

4. Glicano de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1 a R4 é PGro e pelo menos um, dois ou três de R1 a R4 é fosfoetanolamina.

5. Glicano de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que cerca de 25% de R1 a R4 é –PGro.

6. Glicano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende um composto de Fórmula II, ou um análogo imunogênico ou forma modificada do mesmo, em que n≥1:

(II).

7. Glicano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser ligado a um lipídeo, um único aminoácido, um oligopeptídeo, um peptídeo, ou uma proteína.

8. Glicano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser quimicamente conjugado a uma biomolécula e expresso em um hospedeiro natural ou heterólogo como um N-glicano, um O- glicano, em um lipídeo, em uma superfície celular ou em vesículas de membrana externa (OMVs).

9. Glicano de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser ligado a um lipídeo, em que o lipídeo é isolado e purificado de uma fonte bacteriana, arqueana ou eucariótica, ou é quimicamente sintetizado.

10. Glicano de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o lipídeo é ligado ao glicano através de um fosfato, um ligante de pirofosfato ou por uma ligação glicosídica.

11. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o glicano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma célula atenuada de C. perfringens contendo o glicano ou uma bactéria geneticamente modificada para expressar heterologicamente o glicano, e um diluente, carreador, excipiente, ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção causada por C. perfringens.

13. Uso do glicano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma célula atenuada de C. perfringens contendo o glicano ou uma bactéria geneticamente modificada para expressar heterologicamente o glicano, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para tratar ou prevenir uma infecção causada por C. perfringens.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente com um glicano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um diluente, carreador, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser para uso na imunização passiva ou tratamento de um animal.

16. Uso de um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente com um glicano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição para imunizar passivamente ou tratar um animal.

17. Método para diagnosticar uma infecção causada por um organismo C. perfringens, caracterizado pelo fato de ser pelo uso da composição definida na reivindicação 14 para reconhecer espécies de C. perfringens em uma amostra.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de realizar um imunoensaio.

19. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.