CN111491662A - 产气荚膜梭菌表面聚糖及其应用 - Google Patents

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Abstract

免疫原性聚糖化合物，其具有用6‑连接的磷酸乙醇胺和6‑连接的磷酸甘油可变修饰的聚‑β‑1,4‑ManNAc重复单元结构。

Description

产气荚膜梭菌表面聚糖及其应用
技术领域
本申请涉及产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)表面聚糖及其在由产气荚膜梭菌引起的感染的疫苗及诊断和治疗中的用途。
背景技术
产气荚膜梭菌是一种产生毒素的革兰氏阳性厌氧细菌，其为人类食源性疾病的最常见原因之一(Grass et al.(2013))，并且还在许多牲畜物种中导致肠道疾病(Songer(1996)；Uzal et al.(2010))。产气荚膜梭菌是禽类坏死性肠炎(NE)的主要原因(Al-Sheikhly et al.(1977a)；Timbermont et al.(2010))，其对家禽业构成了重大问题。该疾病导致急性感染发作后24小时内迅速死亡，在大多数情况下排斥治疗(Caly et al.(2015)，并且亚临床感染与肠粘膜的慢性损伤有关，从而导致体重增加减少和饲料效率降低(Elwinger et al.(1998)；Hofacre et al.(2003)；Hofshagen et al.(1992)；Kaldhusdal et al.(2001))。据估计NE在全球范围内总共导致家禽业每年20亿美元的损失(Van der Sluis(2000))。此外，欧洲禁止对牲畜预防性使用抗生素(欧盟，第1831/2003号法规(EC))已导致欧洲国家NE暴发增加(Van Immerseel.et al.(2004))，其已经导致了重度感染产气荚膜梭菌的动物群与健康的动物群相比利润损失了33％(Lovland et al.(2001))。这些损失凸显了代替抗生素治疗的替代预防策略的必要性。
尽管在牲畜环境中产气荚膜梭菌很重要，并且荚膜多糖(CPS)被鉴定为Hobbs分型方案的主要抗原决定簇(Hughes et al.(1976))，但关于鉴定并表征该生物体表面上存在的碳水化合物结构的研究开展甚少。仅对来自产气荚膜梭菌Hobbs 5、9和10的CPS结构进行了详细检查，从而在1977年确定了Hobbs 9CPS的组合物为1:1.6:1.1比例的葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和半乳糖胺(GalN)(Cherniak et al.(1977))，并且分别在1997年和1998年通过NMR波谱法解析了Hobbs 5和Hobbs 10CPS的完整结构(Kalelkar et al.(1997)；和Shenget al.(1997))。
除CPS结构外，许多革兰氏阳性细菌还会产生细胞壁磷壁酸(WTA)和脂磷壁酸(LTA)，但很少进行产气荚膜梭菌中这些或其他碳水化合物结构的存在和潜在的重要性的检查。Richter et al(2013)指出产气荚膜梭菌SM101基因组中存在LTA合酶基因(ltaS)的三种同源物，并证明产气荚膜梭菌SM101对LTA合成的小分子抑制剂非常敏感，表明了LTA在产气荚膜梭菌中的存在和重要性，然而尚未证明存在LTA也未在该细菌中对其进行结构表征，直到最近，Vinogradov et al.(2017)报告产气荚膜梭菌ATCC 13124产生具有β-ManNAc6PEtN-(1→4)-[β-ManNAc6PEtN-(1→4)]-β-ManNAc-(1→4)-β-Ma nNAc6PEtN[3-Ribf]-(1→4)-β-ManN-(1→4)-β-Glc-(1→1)-Gro的重复结构的LTA。
没有已知的针对产气荚膜梭菌的基于多糖的疫苗。迄今为止的疫苗接种策略都集中在蛋白质抗原的使用上，如由产气荚膜梭菌产生的毒素的解毒形式(类毒素)和产气荚膜梭菌表面和分泌的蛋白质，其产生不同程度的保护(Mot et al.(2014))。由于产气荚膜梭菌菌株产生的多于一种毒素会引起牲畜疾病，包括鸡中的NE，因此有效的蛋白质疫苗策略可能需要包含多于一种类毒素的多价疫苗。
可商购的用于家禽的产气荚膜梭菌疫苗(
Figure BDA0002539312950000021
(Merck Animal Health,Whitehouse Station,NJ)和梭菌类毒素自身疫苗(Vacci-VetTM,Saint-Hyacinthe,QC,加拿大)基于α-毒素类毒素，但此后证明NetB毒素在鸡的产气荚膜梭菌病理学中起着更为关键的作用。此外，最近的NE疫苗研究发现，只有组合使用α毒素和NetB来源的抗原时，才能观察到明显的保护水平(Jiang et al.(2015))。开发NE疫苗的主要考虑因素之一是，由于鸡的市场价值低，其生产起来必须便宜，并且对于用于家禽而言，需要多种抗原而不是单一抗原的疫苗策略可能会被证明成本过高。
仍然需要从产气荚膜梭菌中鉴定出一种保守的免疫原性靶分子，其引起广泛的交叉反应性免疫反应，以用作针对鸡NE、其他牲畜疾病和由产气荚膜梭菌引起的人类食物中毒的安全且有效的疫苗中的主要抗原。
提供这些背景信息的目的是使申请人所相信的已知信息与本发明可能相关。并非必然旨在承认也不应解释为，任何上述信息构成了针对本发明的现有技术。
发明内容
本发明基于识别保守的产气荚膜梭菌抗原，其包含具有用6-连接的磷酸乙醇胺和6-连接的磷酸甘油可变修饰的聚-β-1,4-ManNAc重复单元结构的多糖。概括地，本发明包括免疫原性聚糖化合物，其包含用至少一个6-连接的磷酸甘油修饰的聚-β-1,4-ManNAc重复单元结构。
在一个方面，本发明可以包括免疫原性产气荚膜梭菌特异性表面聚糖，其包含分离的、合成的和/或纯化的形式的式I的化合物、其脂质连接的或游离的或类似物或修饰形式：
Figure BDA0002539312950000031
其中n≥1，Glc代表葡萄糖，ManNAc代表N-乙酰甘露糖胺(2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-甘露糖)、ManN代表甘露糖胺(2-氨基-2-脱氧-D-吡喃甘露糖)、Gro代表甘油，并且其中R1、R2、R3和R4中的每个包含任意取代基或修饰，只要R1-R4中的至少一个是磷酸甘油(–PGro)；R5包含任意修饰，如–OH；并且R6包含-H或–Ac。在一种实施方式中，重复结构的末端拷贝中的一个R5可以包含糖，如Ribf(呋喃核糖)。
在一些实施方式中，式I的聚糖包含化合物，其中R1-R4中的至少一个是PGro，并且R1-R4中的至少一个、两个或三个是磷酸乙醇胺或OH。
在一些实施方式中，聚糖具有分离的、合成的和/或纯化的形式的式II的结构、其脂质连接的或游离的或类似物或修饰形式：
Figure BDA0002539312950000041
在一些实施方式中，式I或II的化合物或者其免疫原性类似物或修饰形式可以例如与脂质连接或与单个氨基酸、寡肽、肽或蛋白质缀合。
在另一方面，本发明可以包括产生抗体或抗血清的方法，包括以下步骤：提供带有包含全部或部分式I或II的聚糖的抗原性表面结构的化合物，用该化合物接种动物以刺激对该化合物的免疫反应，从所述动物中抽取血清，并任选地纯化所述血清以获得特异性地与聚糖结合的抗体或抗血清。抗体或抗血清可用于诊断目的以检测动物或人体内产气荚膜梭菌的存在，或者可用于被动免疫方法以治疗实际或潜在的产气荚膜梭菌感染。
本发明的化合物可以用于针对产气荚膜梭菌的有或没有佐剂的疫苗制剂，该疫苗制剂可以给药至家禽，如鸡或其他牲畜。该化合物还可以用于哺乳动物如人的疫苗制剂中，因为产气荚膜梭菌也是食用受污染的食物(诸如牛肉或禽肉)而导致的人食物中毒的主要原因。本发明的化合物还可用于糖缀合物疫苗和诊断应用中。
在另一个方面，本发明可以包括包含抗原性化合物的疫苗，该抗原性化合物包含全部或部分的式I或II的聚糖或其类似物或修饰形式，其任选地与单个氨基酸、寡肽、肽、蛋白质或脂质连接，或者荷载在减毒的产气荚膜梭菌细胞上或在经改造以异源表达该抗原性化合物的细菌上表达。
在其他方面，本发明可包括在人或动物中使用包含全部或部分式I或II的化合物或其免疫原性类似物或修饰形式的组合物来治疗或预防由产气荚膜梭菌生物体引起的感染的方法。通过按如上所述给药所述疫苗，根据本发明的疫苗可用于提高动物的生产力和健康。本文所述的疫苗、抗体和抗血清也可以在包括人在内的受试者中用于预防、治疗和诊断。
附图说明
在说明书中所示的附图中，相似的元素可以被分配相似的参考标记。附图不一定按比例绘制，而是重点放在本发明的原理上。另外，所示的每个实施方式仅仅是利用本发明的基本概念的许多可能布置中的一个。
图1是Western免疫印迹，其示出了产气荚膜梭菌表面上的免疫显性抗原是蛋白酶K抵抗性的。
图2是Western免疫印迹，其示出了产气荚膜梭菌的免疫显性表面抗原是多糖或糖脂。
图3显示了Western免疫印迹，其示出了兔和鸡中常见的表面多糖是免疫显性的，并且对来自产气荚膜梭菌HN13的表面多糖的免疫反应与所有测试的野外分离株交叉反应，而抗血清针对来自产气荚膜梭菌JGS4143的表面多糖(仅与少量野外分离株发生交叉反应，并且在针对产气荚膜梭菌HN13 cpe2237突变体(推定的磷酸甘油-负突变体，分离株#3)的全细胞吸附后，鸡抗HN13抗血清与野外分离株的交叉反应急剧减少。
图4是Western免疫印迹，其示出了在其他梭菌物种中不存在免疫显性表面抗原。
图5显示了经口灌服PBS、于PBS中的1×109个产气荚膜梭菌JGS4143细胞，或以1：100抗产气荚膜梭菌血清：PBS与1×109个产气荚膜梭菌JGS4143细胞一起灌服的莱霍恩小鸡(leghorn chicks)的存活百分比。
图6显示了评估针对产气荚膜梭菌HN13的全细胞培育的鸡抗血清相比幼鸡血清的保护潜力的调理吞噬测定中产气荚膜梭菌JGS4143细胞的存活百分比。
图7是Western免疫印迹，其示出了提取和分离自菌株HN13和鸡NE菌株JGS4143的产气荚膜梭菌免疫显性抗原。
图8显示了来自产气荚膜梭菌HN13的脱酰基的保守免疫显性抗原的NMR波谱学数据，证实了存在式II的具有用磷酸乙醇胺和磷酸甘油修饰的四糖重复单元结构的多糖。
图9显示了来自产气荚膜梭菌HN13的脱酰基的和脱磷酸的保守免疫显性抗原的A)高分子量和B)低分子量形式的NMR波谱学数据，证实了式II的四糖重复的还原端处的末端二糖-甘油。
图10显示了来自产气荚膜梭菌JGS4143的脱脂的保守免疫显性抗原的NMR波谱学数据，证实了存在这样的多糖，其由用磷酸乙醇胺修饰的聚ManNAc重复单元结构组成，在非还原端处由用PEtN修饰的三糖封端且在还原端处由式III的二糖-甘油封端。
图11显示了Western免疫印迹，其证明了推定缺少磷酸甘油的产气荚膜梭菌HN13cpe2237突变体针对/对鸡抗HN13抗血清的免疫反应性明显降低，并且为该突变体补充cpe2237基因的反式拷贝可将突变体的反应性恢复至野生型水平，如对该突变体的三种不同的分离株所示的。
图12显示了式I中描述的产气荚膜梭菌广泛交叉反应性常见表面多糖抗原的多糖区域的新颖的重复单元结构，以及来自产气荚膜梭菌HN13的广泛交叉反应性表面多糖(式II)的多糖区域的新颖的重复单元结构。
图13显示了来自JGS4143的多糖抗原(式III)的多糖区域，其可被抗HN13(式II)抗血清识别，但不引发广泛交叉反应性的免疫反应。
具体实施方式
本文未明确定义的任何术语或表达应具有本领域技术人员所理解的其普遍接受的定义。
如本文所用，“聚糖”是由通过糖苷键连接的多个单糖组成的多糖或寡糖化合物，或者是糖缀合物如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的多糖或寡糖部分。
如本文所用，“抗原”是促使抗体产生并可以引起免疫反应的物质。术语“抗原”和“免疫原”在本文可互换使用，尽管从严格意义上说，免疫原是引起免疫系统应答的物质，而抗原则定义为与特定抗体结合的物质。抗原或其片段可以是与特定抗体接触的分子(即表位)。当使用糖蛋白或其片段免疫宿主动物时，糖蛋白的许多区域都可以诱导抗体的产生(即引发免疫反应)，这些抗体特异性地与抗原(糖蛋白上的给定区域或三维结构)结合。
如本文所用，“修饰”是取代基或取代基的变化。“取代基”是取代化学结构中的氢原子的原子或原子团。
本发明涉及具有用至少一个6-连接的磷酸甘油修饰的聚-β-1,4-ManNAc重复单元结构的免疫原性聚糖。因此，在一些实施方式中，本发明可以包括化合物，其包含式I的聚糖化合物，或其免疫原性部分，或其免疫原性类似物或修饰形式：
Figure BDA0002539312950000071
其中n≥1，Glc代表葡萄糖，ManNAc代表N-乙酰甘露糖胺(2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-甘露糖)，ManN代表甘露糖胺(2-氨基-2-脱氧-D-吡喃甘露糖)，Gro代表甘油，并且其中R1、R2、R3、R4中的每个包含任意修饰，如OH、磷酸乙醇胺(PEtN)或磷酸甘油(PGro)，只要R1-R4中的至少一个是–PGro；R5包含任意修饰，如–OH；并且R6包含-H或–Ac。在一种实施方式中，重复结构的末端拷贝中的一个R5可以包含糖，如Ribf(呋喃核糖)。
在一些实施方式中，聚糖包含式II的化合物，或其类似物或修饰形式：
Figure BDA0002539312950000081
其中n≥1。
据信，在产气荚膜梭菌分离株中，式I的化合物的一个或多个抗原表位基本上是保守的，如通过相比于不符合式I的来自产气荚膜梭菌JGS4143的表面聚糖的一个或多个抗原表位(式III–图12)，针对符合式I的产气荚膜梭菌HN13的表面多糖(式II–图12)培育的抗血清的交叉反应性所例示的(表1；图3子图A和B；图12)。式III的聚糖可被针对HN 13的抗血清识别，但引发与产气荚膜梭菌分离株交叉反应性较差的免疫反应(表1，图3子图C；图12)。
式I或II的免疫原性化合物、类似物或修饰形式任选地与脂质、单个氨基酸、寡肽、肽或蛋白质连接或链接。单个氨基酸可以包括天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸。
式I或II的保守结构，或其免疫原性类似物和修饰形式，包含本文确定的引发识别广泛范围的产气荚膜梭菌菌株的交叉反应性免疫反应，并且基于抗体针对式I或II以保护小鸡免于产气荚膜梭菌介导的死亡的能力而可能具有保护性的所必需的所有特征。如本文所用，“类似物”或“化合物的修饰形式”是基本上类似于另一种化合物的化合物，其中至少一种组分不同，但是其与另一种化合物的功能等同。在这种情况下，类似物或修饰形式将引发免疫反应，该免疫反应在合适的条件下与式I的化合物发生交叉反应，如在以下实施例中所述的那些中的任意条件下。例如，式Ⅲ的聚糖不是式Ⅰ或Ⅱ的类似物或修饰形式，其引发与产气荚膜梭菌分离株交叉反应性较差的免疫反应。例如，作为式I或II的聚糖的类似物或修饰形式的化合物会引起与下表1中鉴定的野外分离株中的至少50％，或优选至少75％，且更优选至少90％反应的免疫反应。
本文所述或要求保护的任意化合物可以是与生物分子化学缀合的，和/或在减毒的天然宿主或异源宿主中作为N-聚糖、O-聚糖表达，在脂质上、在细菌表面上或在外膜囊泡(OMV)上。可以通过N-OTase或O-OTase与聚糖、生物合成基因和受体肽共表达介导转移至肽，该转移可以利用纯化的组分体内或体外发生。如果与脂质缀合，则脂质可以从细菌、古菌或真核生物来源分离和纯化或者可以化学合成。可以通过磷酸酯、焦磷酸酯连接子或通过糖苷键介导聚糖化合物与脂质的连接。
例如，可以通过共价键或离子相互作用直接地或使用连接子将载体分子与免疫原性聚糖连接。可以通过化学交联，例如硫醇连接来实现连接。可以通过例如聚糖与肽中的苏氨酸残基的O-连接将载体蛋白或肽与聚糖连接。用于将聚糖连接至载体分子的方法以及制备糖缀合物疫苗的方法在本领域中是熟知的。在一些实施方式中，通过将重组合成的聚糖与载体蛋白缀合来制备缀合的聚糖抗原。
在另一方面，本发明可以包括疫苗和用于产生疫苗的方法，其中该方法包括提供一种或多种式I或II的聚糖并配制在疫苗组合物中。聚糖可以连接到脂质、单个氨基酸(如天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸)、寡肽、肽或蛋白质，和/或荷载在减毒的产气荚膜梭菌细胞中，或在经改造以异源表达聚糖的细菌上表达。减毒的天然宿主可以包括灭活的细胞或经改造以删除一种或多种毒素或其他毒力因子的细胞(Thompson et al.2006)。
疫苗是可被给药至受试者以诱导体液免疫反应(包括引发可溶性抗体反应)和/或细胞介导的免疫反应(包括引发细胞毒性T-淋巴细胞(“CTL”)反应)的制剂。本文提供的疫苗包括免疫原性聚糖，并可有效诱导针对聚糖抗原的免疫反应。如上文所述，聚糖可以是纯化的形式，或与生物分子缀合，或通过宿主细胞表达和展示。结果，本文所述的疫苗旨在诱导针对产气荚膜梭菌的免疫反应，并提供针对产气荚膜梭菌感染的保护。因此，可将疫苗给药至需要保护以免受产气荚膜梭菌感染的任何动物，诸如但不限于牲畜，如牛、绵羊或家禽(火鸡、鹅、鸭或鸡)、犬科动物或猫科动物物种，或人。
疫苗还可以包含佐剂。如本文所用的术语“佐剂”是指任何化合物，其在与抗原一起注射时，非特异性地增强对该抗原的免疫反应。示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、Gerbu佐剂(GMDP；C.C.Biotech Corp.)、RIBI禽佐剂(MPL；RIBI ImmunochemicalResearch,Inc.)、钾明矾、磷酸铝、氢氧化铝、QS21(Cambridge Biotech)、Titer Max佐剂(CytRx)、胱氨酸磷酸酯鸟嘌呤(CpG)和Quil A佐剂。可以具有佐剂特性的其他化合物包括粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精，调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂，以及着色剂。
可以使用药学上可接受的稀释剂配制疫苗。示例性的“稀释剂”包括水、生理盐水溶液、人血清白蛋白、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂如苯甲醇、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺-四乙酸、缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。示例性的“载体”包括液体载体(如水、盐水、培养基、盐水、水性葡萄糖和乙二醇)和固体载体(如以淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖和右旋糖酐为例的碳水化合物，以抗坏血酸和谷胱甘肽为例的抗氧化剂，以及水解的蛋白质。
疫苗可以包含赋形剂。术语“赋形剂”在本文中是指形成用于递送抗原的媒介物的任何惰性物质(例如阿拉伯树胶、糖浆、羊毛脂、淀粉等)。术语赋形剂包括在足够的液体存在下能向组合物赋予制备丸剂或片剂所需的粘合质量的物质。
疫苗可被冻干或为水性形式，例如溶液或悬浮液。这种类型的液体制剂可以使组合物直接从其包装形式进行给药，而无需在水性介质中进行重构，并因此非常适合注射。组合物可以在小瓶中提供，或者其可以在填充就绪的注射器中提供。注射器可以配备有针头或没有针头。注射器将包括单剂量的组合物，而小瓶可以包括单剂量或多剂量(例如2次剂量)。
当疫苗需要重构时，提供了试剂盒，其可以包含两个小瓶，或可以包含一个填充就绪的注射器和一个小瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重构小瓶的内容物。
疫苗可以经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径；或经粘膜给药至口腔/消化道、呼吸道(例如鼻内给药)、泌尿生殖道来给药，并且配制成经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径；或经粘膜给药至口腔/消化道、呼吸道(例如鼻内给药)、泌尿生殖道通过注射给药。尽管可以将疫苗作为单剂量给药，但是其组分也可以在同一时间或不同时间一起共同给药。除了单一给药途径外，还可以使用2种不同的给药途径。
本申请的另一方面提供了用于免疫动物受试者的方法，包括向受试者给药免疫学有效量的疫苗以产生免疫反应的步骤。在一种实施方式中，免疫反应包括产生杀菌抗体产物。
在其他实施方式中，提供了用于被动免疫的组合物和方法，包括对本文所述的任一聚糖特异性的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性地与聚糖结合。如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原或表位结合的任意免疫球蛋白或完整分子以及其片段。此类抗体包括但不限于完整抗体的多克隆的、单克隆的、嵌合的、人源化的、单链、Fab、Fab'、F(ab′)2、F(ab)′片段和/或F(v)部分及以上的变体。该术语涵盖所有同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。如本文所用，术语“抗体片段”是指功能上等同的抗体片段或部分，即指保留了亲本抗体的抗原结合能力(例如，特异性、亲和力和/或选择性)的抗体的完整序列的不完整或分离的部分。如本领域熟知的，抗体制剂可以包含单克隆或多克隆抗体。
术语“对…特异性”或“特异性地结合”可互换使用，以指抗体与其相应抗原之间的相互作用。相互作用取决于结合分子(即抗原或表位)所识别的特定结构的化合物的存在。为了使结合为特异性的，它应涉及抗体结合目标表位(一个或多个)而不结合背景抗原，即与其他抗原(如其他蛋白质或聚糖结构、宿主细胞蛋白质等)仅有少量的交叉反应性。还可以根据它们对抗原的结合亲和力来描述或指定本公开的抗体或抗原结合片段、其变体或衍生物。可以使用本领域已知的方法通过实验确定抗体对抗原的亲和力。
在另一方面，本发明可以包括用于检测样品或受试者中产气荚膜梭菌的存在的诊断方法。在一些实施方式中，检测受试者中产气荚膜梭菌的存在的方法包括从受试者获得生物样品并分析样品中是否存在本文所述的聚糖，其中其聚糖在样品中的存在表明在受试者中存在产气荚膜梭菌。在一些实施方式中，测定包括免疫测定。
为了更好地理解本文所述的发明，阐述了以下实施例。应该理解，这些实施例仅用于说明目的。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
将梭菌菌株在37℃于厌氧条件下，在补充有5％氢气、5％CO2、90％N2)的WhitleyDG250厌氧工作站(Don Whitley Scientific,Frederick,MD)中培养，并在无搅动的PGY肉汤(3％月示蛋白胨#3、2％葡萄糖、1％酵母提取物、0.1％硫代乙醇酸钠)中或在PGY琼脂(包含1.5％琼脂的PGY肉汤)上繁殖。表1列出了产气荚膜梭菌菌株及其分离株和衍生物。
表1.产气荚膜梭菌菌株。
Figure BDA0002539312950000131
Figure BDA0002539312950000141
产生了产气荚膜梭菌HN13、JGS4143和SM101的全细胞裂解物以用于按如下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析：将菌株从-80℃储备物划线到PGY琼脂板(视情况具有抗生素)上，并生长过夜。对于每个菌株，使用单个菌落接种10mlPGY肉汤，使其生长6h，通过离心(13 000×g，10min)收获，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并重悬于PBS中，至OD600nm＝2.0。通过如上所述的离心收获来自1ml的细胞，重悬于100μl PBS中，并与2mg ml-1溶菌酶一起在37℃下温育1h。将每个样品与67μl的4x SDS-PAGE样品缓冲液(Laemmli(1970))合并，加热至95℃持续10min，使其冷却，然后根据Laemmli的方法(Laemmli(1970))通过SDS-PAGE进行分析或在SDS-PAGE分析之前于55℃下与0.5mg ml-1蛋白酶K一起温育1h。电泳后，将样品通过电泳转移到0.2μm硝酸纤维素膜(Bio-RadLaboratories加拿大，Mississauga，ON)上，并使用针对产气荚膜梭菌HN13的全细胞培育的多克隆兔抗血清(Dr.S.G.Melville,Virginia Tech)作为一抗(1：1000稀释)和IRDye680RD山羊抗兔IgG(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)作为二抗(1：15,000)进行Western免疫印迹分析(Burnette(1981))，并在LI-COR Odyssey红外成像系统(LI-CORBiosciences)上可视化。
图1显示了使用针对产气荚膜梭菌HN13的全细胞培育的兔抗血清的产气荚膜梭菌HN13、JGS4143和SM101菌株的全细胞裂解物的Western免疫印迹。
所有菌株的反应性都相似，其中不论溶菌酶处理如何，都存在大的抗原“涂片(smear)”和一些高分子量条带。蛋白酶K的处理导致少数高分子量条带的丢失，但大的“涂片”反应性并未受到影响，表明负责的抗原不是基于蛋白质的，这表明抗原是多糖、糖脂或脂质分子。
因此，看来产气荚膜梭菌很可能产生了主导免疫反应的非蛋白质抗原分子。
实施例2
图2示出了有和无蛋白酶K处理的来自HN13、四种不同的糖基转移酶转座子突变体和补充有质粒荷载的cpe2071基因的cpe2071糖基转移酶突变体(按实施例1中所述制备)的全细胞裂解物的抗产气荚膜梭菌Western免疫印迹。通过Western免疫印迹法分析了四种糖基转移酶突变体(自先前描述的产气荚膜梭菌HN13转座子文库(Liu et al.(2013)中分离)的全细胞裂解物，并且来自cpe2071基因被破坏的突变体(菌株HLL8)的裂解物不包含在野生型菌株中观察到的蛋白酶K抵抗性抗原。给该突变体补充质粒荷载的cpe2071基因拷贝导致了蛋白酶K抵抗性抗原的恢复，证实了cpe2071突变体中该抗原的丢失是由于cpe2071基因的破坏引起的。鉴于cpe2071编码多糖并且该抗原是蛋白质K抵抗性的，因而该抗原是多糖或含有多糖的糖脂。
因此，根据本实施例，看来产气荚膜梭菌的免疫显性表面抗原很可能是多糖或具有多糖组分的糖脂。
实施例3
按如下方法制备福尔马林固定的产气荚膜梭菌HN13和JGS4143细胞，以用于肌内(IM)注射至鸡中。如实施例1所述的，使细胞在PGY琼脂平板上生长过夜。收获来自每种的一个平板的细胞，并重悬于10ml PBS中，通过离心沉淀，重悬于含1％(v/v)福尔马林的10mlPBS中，并在4℃下温育2h。将细胞在2ml PBS中洗涤4次以除去福尔马林，然后重悬于PBS中至OD600nm为1.0。将细胞悬液与弗氏完全佐剂(FCA，初次注射)或弗氏不完全佐剂(FIA，增强注射)以1：1混合。在7日龄时对肉鸡给予初次注射(150μl×2，IM，于胸肌中)，然后在21日龄时进行增强注射(150μl×2，IM，于胸肌中)。在第35天将鸡宰杀并放血。让血液在室温下凝结过夜，并在第二天将样品在13 000×g下离心，并通过移液管吸出血清，并在4℃下保存。
从John Prescott博士(圭尔夫大学(University of Guelph)，圭尔夫，ON，加拿大)获得了总共32种产气荚膜梭菌的野外分离株，其由涵盖多位点序列分型序列类型(ST)范围的健康鸡和NE鸡的分离株，以及从非鸡感染(马NE和犬出血性肠胃炎)中分离的两株菌株组成(表1)。
通过以下方法制备了用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析的产气荚膜梭菌的全细胞裂解物：在SDS-PAGE缓冲液中煮沸细胞，用蛋白酶K处理，并在SDS-PAGE缓冲液(如实施例1所述)中煮沸，然后通过SDS-PAGE分离，并通过使用兔抗产气荚膜梭菌抗血清(其是针对产气荚膜梭菌HN13培育的)以及针对产气荚膜梭菌HN13和JGS4143(如上文所述)培育的鸡抗产气荚膜梭菌抗血清的Western免疫印迹进行分析。为了从目标聚糖以外的抗原中去除不需要的信号，针对不制造目标聚糖的产气荚膜梭菌HN13cpe2071突变体(菌株HLL8)的全细胞，吸附针对产气荚膜梭菌HN13培育的兔和鸡抗血清。针对产气荚膜梭菌JGS4143培育的鸡抗血清无需任何吸附步骤即可使用，因为在该背景下没有可利用的减聚糖突变体。按以下方式进行吸附：按对于全细胞裂解物所述的生长产气荚膜梭菌HN13 cpe2071，用PBS洗涤并在PBS中调节至OD600nm＝1.0，按如上所述通过离心沉淀4×1-ml等分试样。将第一个等分试样重悬于100μl的兔或鸡抗产气荚膜梭菌HN13抗血清中，使其在室温下温育1h，通过离心沉淀，并倾倒上清液。使用来自上一轮的上清液，依次对剩余的3个细胞等分试样中的每个重复该过程以重悬细胞。如实施例1中所述的，将该吸附的抗血清用作一抗，并将IRDye 680RD山羊抗兔IgG用作二抗。
图3示出了使用吸附的兔和鸡抗产气荚膜梭菌HN13抗血清以及未吸附的抗产气荚膜梭菌JGS4143抗血清的来自产气荚膜梭菌野外分离株相比JGS4143和HN13(+ve对照)和HN13 cpe2071突变体(-ve对照)的全细胞裂解物的Western免疫印迹。对于针对产气荚膜梭菌HN13培育的兔和鸡抗血清，所有菌株均显示出与HN13和JGS4143相似的反应性，表明与产气荚膜梭菌HN13相比，这些菌株产生相似或密切相关的聚糖。注意到在来自NE和健康鸡以及来自马NE(JP55)和犬出血性肠胃炎(JP838)分离株的野外分离株中观察到与目标聚糖一致的反应性，表明不论宿主物种或宿主动物的疾病状态如何，产气荚膜梭菌的分离株上都存在目标聚糖。相反，针对产气荚膜梭菌JGS4143培育的鸡抗血清与HN13和JGS4143裂解物对照均具有反应性，但只有5种野外分离株表现出反应性，其中3种分离株(20、21和149)显示中等反应性，且另外2种野外分离株(10和11)仅具有微弱的反应性。
因此，看来来自产气荚膜梭菌HN13的表面多糖抗原是符合本文中的式I的聚糖的具体实例(图12)，并且是广泛保守的，或者具有引起广泛交叉反应性免疫反应的一个或多个表位，而来自产气荚膜梭菌JGS4143的表面多糖抗原(图12)在产气荚膜梭菌的示例性野外分离株中的交叉反应性要少得多。
实施例4
以与实施例1中对产气荚膜梭菌细胞裂解物所述相同的方式制备了蛋白酶K处理的耳蜗形梭菌、产气荚膜梭菌和共生梭菌的细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离非产气荚膜梭菌裂解物，连同JGS4143和HN13裂解物作为阳性对照以及HN13 cpe2071突变体裂解物作为阴性对照，并通过使用针对如实施例3中所述的产气荚膜梭菌HN13 cpe2071突变体的全细胞吸附的兔抗产气荚膜梭菌抗血清的Western免疫印迹进行分析。
图4示出了使用针对HN13 cpe2071突变体的全细胞吸附的抗产气荚膜梭菌兔抗血清的来自耳蜗形梭菌、产气荚膜梭菌和共生梭菌的代表性菌株相比JGS4143和HN13(+ve对照)和HN13 cpe2071突变体(-ve对照)的全细胞裂解物的Western免疫印迹。没有一种非产气荚膜梭菌裂解物显示出与目标聚糖一致的反应性，表明这些相关的梭菌菌株中不存在保守的产气荚膜梭菌抗原。
因此，根据本实施例，看来在其他梭菌物种中可能不存在保守的产气荚膜梭菌抗原。
实施例5
对于被动保护实验，按如下在存在和不存在鸡抗产气荚膜梭菌抗血清的情况下，在1日龄时用产气荚膜梭菌攻击莱霍恩小鸡。为了制备经口灌服溶液，在灌服前一天(第0天)将鸡NE菌株产气荚膜梭菌JGS4143在PGY琼脂上划线，并按上文所述生长过夜。在灌服当天(第1天)，将细胞收获于PBS中，通过以13,000×g离心30min沉淀，并用PBS洗涤两次。将洗涤后的细胞团在PBS中重悬至～3.7×109个细胞/ml，并分别制备于PBS中的以1/10稀释的高交叉反应性鸡抗产气荚膜梭菌HN13抗血清。然后，根据情况，在灌服之前立即将产气荚膜梭菌JGS4143细胞悬液与PBS或稀释的鸡抗产气荚膜梭菌抗血清以9：1混合。总共给9只禽类经口灌服300μl的无抗血清的产气荚膜梭菌/PBS混合物(1×109个细胞)，给9只禽类经口灌服300μl的含有抗血清的产气荚膜梭菌/PBS混合物(1×109个细胞)，并给5只禽类经口灌服仅PBS作为对照，并在7天内监测禽类死亡率。
图5示出了经口灌服仅产气荚膜梭菌JGS4143，以及一起灌服JGS4143和1：100稀释的抗产气荚膜梭菌抗血清的组中禽类的存活百分比。灌服后7天，经口灌服仅PBS的禽类100％存活(未示出)，在灌服仅产气荚膜梭菌的组中观察到仅22％存活(9只禽类中2只)，且在一起灌服产气荚膜梭菌和1：100抗产气荚膜梭菌抗血清的组中观察到89％存活率(9只禽类中8只)。
实施例6
对于调理吞噬测定，根据经过如下修改的由Goyette-Desjardins et al(2016)先前描述的方法，将产气荚膜梭菌JGS4143细胞与肝素化的鸡血和幼鸡血清或抗产气荚膜梭菌HN13抗血清一起温育。为了准备用于该测定的细菌细胞，在宰杀5周龄肉鸡(第34天)作为新鲜鸡血来源前一天，将鸡NE菌株产气荚膜梭菌JGS4143在PGY琼脂上划线，并按上文所述生长过夜。在宰杀和采血的当天(第35天)，将细胞收集在PBS中，通过以13,000×g离心30min沉淀，然后用PBS洗涤两次。将洗涤后的细胞团重悬于补充有5％热灭活的鸡血清、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中至～2.9×105个细胞/ml，并将来自单只宰杀的鸡的血液收集在涂有肝素的试管中以防止凝结。将肝素化的血液以1/3稀释于上文列出的补充的RPMI 1640中。将稀释的血液(50μl)与40μl的幼鸡血清或鸡抗产气荚膜梭菌HN13抗血清在微管中合并，然后加入10μl的产气荚膜梭菌JGS4143悬液，产生基于反应中的2.9×103个细菌细胞的约0.015的MOI，以及基于肉鸡血液中白细胞的文献值(Orawan和Aengwanich(2007))计算的1.9×105个白细胞的白细胞含量。使用无菌的25-规格(gauge)针头刺穿管的顶部，并然后将其置于37℃下的5％CO2温育器中2h，其后将每个反应与80％无菌甘油混合，并于-80℃下温育直至准备涂板。为了计算每个反应中的细胞，将样品在冰上融化，并将100μl等份的10倍系列稀释液涂在PGY琼脂上，并在厌氧条件下温育18h。使用下式计算细菌杀灭百分比值：％细菌杀灭＝[(幼鸡血清反应中的细胞#-目标反应中回收的细胞#)/(幼鸡血清反应中的细胞#)]×100。
图6示出了在含有鸡抗产气荚膜梭菌HN13抗血清的调理吞噬测定反应中观察到的细菌杀灭百分比，用该血清观察到的产气荚膜梭菌JGS4143的％细菌杀灭中值为29.5％。
实施例7
对于NMR实验，在以1L/min流速供给N2的BioFlo 115发酵罐(Eppendorf,Mississauga.ON)中，在以50rpm的搅拌下于37℃在PGY肉汤中生长梭菌菌株。在用40-ml过夜肉汤培养液接种之前，将培养基预热并用N2调节1h。在适当的情况下，向培养基中补充30μg ml-1的红霉素(Em)。
按如下从产气荚膜梭菌HN13和JGS4143的10-L发酵罐培养物中提取并纯化来自产气荚膜梭菌的多糖：用40ml O/N培养物接种培养物，并使其生长6h(～OD 2.0)，然后通过离心(13,000×g，30min)进行收获。将细胞用PBS洗涤一次，重悬于400ml MilliQ水中，并在加热板上于搅拌下煮沸30min。将混合物冷却，通过离心(如上所述)沉淀细胞，除去上清液，并根据经修改的Westphal和Jann(1965)的方法对沉淀物进行酚：热水提取。将沉淀重悬于200ml盐水(125mM NaCl)中，并与在70℃水浴中预热的200ml液体酚合并，并在搅拌下将混合物温育1h。将混合物在冰上冷却，离心(13,000×g，30min)以分离水相和酚相，并将酚相对自来水透析5天，然后冻干。将冻干的样品重悬于100ml MilliQ水中，以13,000×g离心30min，并然后置于超速离心机中16h。除去上清液后，将澄清的沉淀再次重悬于MilliQ水中，并通过超速离心(如上所述)重新沉淀，以去除残留的上清液痕迹，重悬于20ml MilliQ中并冻干。将用于NMR的分离的化合物与如在Western免疫印迹中所观察到的蛋白酶K抵抗性抗原分子进行比较。
图7示出了使用针对产气荚膜梭菌HN13培育的兔抗血清的纯化的抗原相比蛋白酶K消化的HN13和JGS4143(+ve对照)和HN13 cpe2071突变体(-ve对照)的全细胞裂解物的Western免疫印迹。
来自产气荚膜梭菌HN13和JGS4143的纯化的表面多糖的糖基组成分析
按Santander et al.(2013)所述的，通过由样品的酸甲醇分解产生的单糖甲基糖苷的过O-三甲基硅烷基衍生物的组合气相色谱法/质谱法(GC-MS)测定了分离自这两种菌株(如上文所述)的糖脂的组成。简言之，将冻干的HN13和JGS4143糖脂与HCl的甲醇溶液一起在密封的螺盖玻璃测试管中于80℃下加热18h。在氮气流下冷却并除去溶剂后，将样品用甲醇、吡啶和乙酸酐的混合物处理30min。蒸发溶剂，并用
Figure BDA0002539312950000211
(Pierce)将样品在80℃下衍生化30min。使用Supelco Equity-1熔融二氧化硅毛细管柱(30m x 0.25mm ID)，在与5975C MSD连接的Agilent 7890A GC上对TMS甲基糖苷进行GC/MS分析。
糖基组成分析表明，HN13多糖包含甘油(Gro)、葡萄糖(Glc)、痕量的N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和脂肪酸：C20、C18、C16和C14。JG4143多糖包含核糖(Rib)、葡萄糖(Glc)、痕量的N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和脂肪酸：C20、C18和C16。如下所示和所述的，糖脂中的主要糖基残基是ManNAc，然而，由于这些残基中的大多数都被磷酸乙醇胺或磷酸甘油取代(见下文)，因此使用该方法在很大程度上不能观察到它们。
为了制备用于NMR波谱学的样品，按如下方法将所有纯化的糖脂脱酰基：将冻干的样品溶解在浓NH4OH中，在80℃下温育1h，使其冷却，并冻干。将冻干的物质溶解在蒸馏水中，并使用去离子水作为洗脱剂在BioGel P6柱上进行分馏。基于来自折射率检测器的响应收集级分，冻干，并然后用二氯甲烷洗涤3次以从样品中完全除去游离脂肪酸。
对于所有NMR实验，将冻干的样品溶解在0.2ml D2O中，然后转移到3mm OD NMR管中。在配备了3mm冷探头(Varian,Inova Palo Alto,CA)的Varian 600MHz光谱仪上，在标准“Presat”溶剂信号抑制下于25℃下获取1D质子谱图。所有光谱都是用标准的Varian脉冲序列获得的。使用MNova软件(Mestrelab Research，西班牙)处理NMR获得物。相对于DSS信号参考光谱(δH＝0ppm；δC＝0ppm)。
来自产气荚膜梭菌HN13的表面糖类的NMR波谱学：
通过1D/2D NMR波谱学；质子、HSQC、COSY、TOCSY和NOESY分析来分析脱脂的HN13多糖。这允许分配每个残基的质子和碳化学位移，还可以确定其连接、序列以及PEtN和PGro取代基的取代位置。化学位移分配在下表2中给出。
表2.
于30℃下在D2O中记录的HN13多糖的1H和13C NMR化学位移
Figure BDA0002539312950000221
图8示出了来自产气荚膜梭菌HN13的脱酰基的多糖的1H NMR、NOESY(200ms)和gHSQC谱图(D2O,30℃)。
1H NMR谱图(图8，上图)包含在δ4.87(残基A)和δ4.84(残基B)处的3：1比率的两个异头物信号，其均归因于β-ManpNAc残基，如通过其各自的低场H-2化学位移δ4.61和δ4.58，以及δ54.0和54.1处的C-2化学位移所示的(图3，中图和下图)。δ2.06处的高场信号被分配给与每个ManNAc残基的C-2接合的NAc基团。H-1和H-3之间以及H-1和H-5之间的强的残基内NOE相关性(图3，中图)证实了这些残基的β-构型。所有ManNAc残基均通过(1→4)连接而连接，并在O-6处被PEtN(残基A)或PGro(残基B)取代。残基A和B的4-取代和6-取代分别通过其13C化学位移支持(图8，下图；表2)：A C-4δ77.9，A C-6δ65.4，B C-4δ77.9，B C-6δ65.4。没有观察到末端残基的事实表明，该多糖具有高分子量。
为了获得更多有关结构的信息，通过将冻干的脱脂化样品溶解于48％HF中，并在4℃下温育48h，然后将样品在冰上蒸发并再次冻干，来对HN13多糖进行脱磷酸化。通过Bio-Gel P6柱对产生的产物混合物进行尺寸排阻色谱分析，并得到了两个级分，表示为F1和F2。1D/2D NMR分析允许对F1和F2中的残基，以及这些残基的连接和顺序进行质子和碳分配(图9；表3)
表3.
于25℃下在D2O中记录的脱磷酸化的HN13多糖(级分F1-F2)的1H和13C NMR化学位移
Figure BDA0002539312950000231
Figure BDA0002539312950000241
*级分，F1，仅包含这些化学位移。
图9示出了来自脱磷酸化的HN13多糖的Bio-Gel P6色谱的F1和F2级分的1H NMR谱图(D2O,25℃)。这些数据表明，脱磷酸化的多糖F1的主链仅包含β-4连接的ManNAc(C)残基的线性链。所有PEtN或PGro基团已通过HF处理去除。低分子级分(F2)的1D/2D NMR分析表明，HN13多糖在其还原端具有→4)-β-ManN-(1→4)-β-Glc-(1→1)-Gro成分，随后是β-4连接的ManNAc残基。MALDI-TOF-MS分析以及上述NMR数据证实，级分F2包含上述三糖组分，随后是β-4连接的ManNAc残基的连续延长(表4)。
表4.
对于在Bio-Gel P6级分F2上通过阳离子模式产生的离子观察到的质量和所提出的组成。
Figure BDA0002539312950000242
总之，这些数据表明，HN13多糖由以1:3的比率被PGro或PEtN修饰的、在还原端与ManN-Glc-Gro连接(图12)的、具有式II的结构(如上所示)的ManNac残基的重复聚合物组成。
来自产气荚膜梭菌JGS4143的表面糖类的NMR波谱学：
1D和2D NMR分析(如对于HN13多糖所述的)允许对这些残基进行完全的质子和碳分配(图10；表5)。
图10示出了1H NMR,NOESY(200ms)和gHSQC谱图(D2O，60℃)。JGS4143多糖的1H NMR波谱显示存在属于以下的自旋体系：→4)-β-ManpNAcPEtN-(1→(残基A)；→4)-β-ManpNAc-(1→(残基C)；→4)-β-Glcp-(1→(残基F)；→3,4)-β-ManpNAcPEtN-(1→(残基G)；T-α-Ribf-(1→(残基H)；T-β-ManpNAcPEtN-(1→(残基J)。
表5.
于60℃下在D2O中记录的JGS4143多糖的1H和13C NMR化学位移
Figure BDA0002539312950000251
不同于HN13多糖的那些数据，这些数据允许识别末端ManNAc残基以及还原端-4)-β-Glcp-(1→1)-Gro组分。这些NMR数据与HN13多糖的那些数据(如上所述)的比较显示该分子是具有β-4连接的ManNAc主链的寡糖，其大部分被PEtN取代，这与HN13多糖的情况一样，但与HN13多糖的明显不同之处在于它不含PGro，并且含有在ManNAc残基之一的O-3处取代的α-Ribf。
这些数据表明，JGS4143多糖由用PEtN修饰并在还原端处与ManN-Glc-Gro连接的ManNac残基的重复聚合物组成，这类似于HN13的多糖，但缺少在HN13多糖中观察到的PGro修饰，且在末端ManNAcPEtN残基的近端的ManNAc残基上的O-3处(图12)具有具有式III的结构的另外的分支α-Ribf残基。
总之，这些数据表明，产气荚膜梭菌菌株产生常见类型的表面多糖，并且来自产气荚膜梭菌HN13的表面多糖是具有长多糖链的糖脂，该长多糖链具有以1:3比率用PGro或PEtN修饰的包含与目前为止测试的所有产气荚膜梭菌菌株共有的一个或多个表位的1,4-连接的ManNAc的重复单元结构。与之相比，产气荚膜梭菌JGS4143产生类似分级的相关的糖脂，并且其多糖主链也是用PEtN修饰的1,4-连接的ManNAc残基的聚合物，但与HN13聚糖的不同之处主要在于缺少PGro修饰且聚合物长度较短。
HN13聚糖引发与测试的所有产气荚膜梭菌野外分离株具有广泛交叉反应性的免疫反应(在兔和鸡中)的能力，与非交叉反应性JGS聚糖(引发鸡中的仅与测试的～16％的野外分离株发生交叉反应的免疫反应)形成对比，结合两种聚糖的已解决的结构的结构特征，表明与HN13的广泛交叉反应性免疫反应至少取决于至少一种PGro修饰的存在，以及可能地在JGS4143中观察到的戊糖(α-Ribf)的缺失。
实施例8
对于缺少磷酸甘油部分的产气荚膜梭菌HN13突变体的产生，通过搜寻产气荚膜梭菌菌株13(taxid:195102)的基因组中注释为潜在地在LTA生物合成或磷酸甘油转移中起作用的基因，然后进行编码基因产物的保守结构域分析(使用NCBI CD-搜索特征[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi])，预测跨膜螺旋和膜定向(经由TMHMM服务器[http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/])，鉴定推定的磷酸甘油转移酶基因。然后将这些结果针对已知的磷酸甘油或磷酸乙醇胺转移酶(来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的LtaS[c2w5tA]、来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的Lpt3[NMB2010]和Ltp6[NMA0408]、来自大肠杆菌(E.coli)的EptB[NC_000913.3]和来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)Rd的Lpt6[HI0275])所获得的结果进行比较，结果鉴定出具有共同特征的四个基因。在针对候选物cep2237的基因产物的蛋白质同源性/类似物Y识别引擎V2.0(Phyre2；http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)中，命中率最高的是参与脂磷壁酸生物合成的磷酸甘油转移酶LtaS。根据Nariya et al(2011)的方法对cpe2237进行染色体缺失，并且对全细胞裂解物的Western免疫印迹分析(如实施例4中所述)揭示出，cpe2237的丧失对应于与鸡抗HN13抗血清的反应性降低，但与鸡抗JGS4143血清的反应性增强。对野生型和突变型裂解物的负染色(根据Castellanos-Serra和Hardy(2006)的方法)证实，这些结果并不是由于野生型和突变型之间产生的免疫原性糖脂数量不同，并且为突变型补充cpe2237基因的顺式拷贝(使用pKRAH1)恢复了针对两种抗血清的反应性至野生型水平。
据推测，cpe2237基因是磷酸甘油转移酶，并因此该突变体中的免疫原性糖脂缺乏PGro修饰。这导致对应于来自突变体的两种纯化的免疫原性糖脂(如实施例#中所述)的NMR分析(例如1H-13C HSQC和/或TOCSY，1H-31P HSQC)和全细胞的HR-MAS分析(如van Alphen etal(2014)所述)中的PGro的信号丢失。还可以预期，PGro的丢失将导致人内凝集素-1(hItln1)的差异结合，这已被报导能够识别细菌多糖结构上的甘油-磷酸酯基团(Weseneret el(2015))。这通过使用hItln1代替一抗和荧光标记的抗hItln1二抗，或者在全细胞的显微镜检查中使用荧光标记的hItln1，以与实施例3中相同的方式对全细胞裂解物进行Western免疫印迹来进行。PGro的丢失与抗HN13抗血清的反应性降低相关，表明PGro是重要的表位，其有助于对HN13的免疫反应，并支持PGro是通过免疫显性糖脂引发广泛交叉反应性免疫反应中的重要表位的提议。
如此描述了本发明，很明显，其可以以许多方式进行变型。这样的变型不应被认为是背离本发明的精神和范围，并且所有这样的对本领域技术人员显而易见的修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。
解释
说明书中对“一种实施方式”、“实施方式”等的引用指示所描述的实施方式可以包括特定方面、特征、结构或特性，但是并非每个实施方式都必然包括该方面、特征、结构或特性。此外，这样的短语可以但不必指说明书其他部分中提及的相同实施方式。此外，当结合实施方式来描述特定方面、特征、结构或特性时，影响或联系这样的模块、方面、特征、结构或特性与其他实施方式在本领域技术人员的知识范围内，无论是否明确描述。换言之，除非存在明显的或固有的不相容性，或者明确地将其排除在外，否则任何模块、元素或特征都可以与不同实施方式中的任何其他元素或特征组合。
还应注意，可以设计权利要求以排除任何任选的元素。因此，该陈述旨在用作结合权利要求要素的叙述使用排除性术语如“仅仅(solely)”、“仅(only)”等，或者使用“否定”限制的先行基础。术语“优选地”、“优选的”、“优选”、“任选地”、“可以”和类似的术语用于指示所参考的项目、条件或步骤是本发明的任选的(非必需的)特征。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数参考对象。术语“和/或”意指项目中的任意一个、项目的任意组合或与该术语相关联的所有项目。短语“一个或多个”是本领域技术人员容易理解的，尤其是当阅读其使用的上下文时。
术语“约”可以指所指定值的±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，在一些实施方式中，“约50”％可以包括从45％至55％的变化。对于整数范围，术语“约”可以包括大于和/或小于所述范围的每一端的整数的一个或两个整数。除非本文另外指明，否则术语“约”旨在包括在组合物的功能或实施方式方面等同的接近所述范围的值和范围。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所述的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，以及组成范围的各个值，特别是整数值。所述的范围包括该范围内的每个特定值、整数、小数或标识。可以容易地将任何列出的范围鉴定为充分描述和使得能够将同一范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一或十分之一。作为非限制性的实例，可以容易地将本文论述的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。
如本领域技术人员还将理解的，所有语言如“至多”、“至少”、“大于”、“少于”、“多于”、“或更多”等，包括所述的数字，并且这样的术语是指可以随后分解为如上所论述的子范围的范围。以相同的方式，本文所述的所有比率还包括落入较宽比率内的所有子比率。
参考文献
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且通过引用并入本文中，其程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被特异性地且单独地指出通过引用并入本文中一样。
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Claims (16)

1.一种免疫原性聚糖化合物，所述免疫原性聚糖化合物具有用至少一个6-连接的磷酸甘油修饰的聚β-1,4-ManNAc重复单元结构。
2.根据权利要求1所述的聚糖，所述聚糖包含分离的、合成的和/或纯化形式的式I的化合物，任选地其缀合的或免疫原性类似物或修饰形式：
Figure FDA0002539312940000011
其中n≥1；R1、R2、R3和R4中的每个都包含任意修饰，只要其中的至少一个是磷酸甘油(–PGro)；R5包含任意修饰；并且R6包含-H或–Ac。
3.根据权利要求2所述的聚糖，其中R5是–OH和/或所述重复结构的末端拷贝中的R5包含糖，如呋喃核糖。
4.根据权利要求2或3所述的聚糖，其中R1-R4中的至少一个是PGro，并且R1-R4中的至少一个、两个或三个是磷酸乙醇胺。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的聚糖，其中约25％的R1-R4是–PGro。
6.根据权利要求2所述的聚糖，所述聚糖包含式II的化合物或其免疫原性类似物或修饰形式，其中n≥1：
Figure FDA0002539312940000012
7.根据权利要求1-6中任一项所述的聚糖，所述聚糖与脂质、单个氨基酸、寡肽、肽或蛋白质连接。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的聚糖，所述聚糖与生物分子化学缀合，并在天然的或异源的宿主中作为N-聚糖、O-聚糖表达，在脂质上、在细胞表面上或在外膜囊泡(OMVs)上。
9.根据权利要求7所述的聚糖，所述聚糖与脂质连接，其中所述脂质分离和纯化自细菌、古菌或真核生物来源，或为化学合成的。
10.根据权利要求9所述的聚糖，其中所述脂质通过磷酸酯、焦磷酸酯连接子或通过糖苷键而与所述聚糖连接。
11.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求1-10中任一项所述的聚糖，或具有所述聚糖的减毒的产气荚膜梭菌细胞，或经改造以异源表达所述聚糖的细菌，以及药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或佐剂。
12.一种通过给药权利要求11所述的疫苗而治疗或预防由产气荚膜梭菌引起的感染的方法。
13.一种组合物，所述组合物包含与权利要求1-10中任一项所述的聚糖特异性地结合的抗体或其片段，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
14.一种使用权利要求13所述的组合物被动免疫或治疗动物的方法。
15.一种通过使用权利要求13所述的组合物识别样品中的产气荚膜梭菌物种而诊断由产气荚膜梭菌生物体引起的感染的方法。
16.根据权利要求15所述的方法，包括进行免疫测定的步骤。
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