JP2005534752A - カンピロバクターグリカンおよびグリコペプチド - Google Patents

Abstract

カンピロバクターの複数の株および種が、共通のグリカン部分（これは複数の表面に暴露された糖タンパク質に存在する）を共有することが見つけられた。このグリカンは次の式：ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−［Ｇｌｃ−β１，３］ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，３−Ｂａｃ（ここでＢａｃは、２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコピラノースを有する。このグリカン及びその免疫学的に活性なフラグメントは、ヒトおよび動物におけるカンピロバクター感染に対する、ワクチンとしての用途を有する。また、これらの化合物と特異的に結合する抗体を提供し得る。係る抗体およびワクチンを使用して、家畜におけるカンピロバクター感染を阻止または中和し、それによって本病原体がヒト食物連鎖に侵入することを阻止し得る。前記グリカンは、１以上のアミノ酸と連結して、グリコペプチドを形成し得る。また、サンプルを、高分解能マジック角スピニング 核磁気共鳴（ＨＲ−ＭＡＳ−ＮＭＲ）分光学に供試することからなる、完全な糖タンパク質（ｉｎｔａｃｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）のグリカン構造を決定するための方法。

Description

本発明は、生物学的に活性な糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）および糖タンパク質のグリカン部分（ｇｙｌｃａｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、同様にカンピロバクター細菌（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ）との戦い（ｃｏｍｂａｔｉｎｇ）に有用なワクチン、抗体、および抗体フラグメントの分野に関する。

発明の背景

カンピロバクターは、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）を含む家畜生産品（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）における重大な食品媒介病原体（ｆｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ）である。従って、ヒトにおける、その有害な影響と戦うための戦略を提供することが望まれる。これらの病原体を家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）から排除することを、ヒトにおける感染の発生率を減少させ、影響される農場動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）における病気（ｄｉｓｅａｓｅ）を減少させる手段として利用することができる。グリコシル化タンパク質および特にこれらの化合物の特定のグリカン部分は、免疫戦略（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）に対する生きた標的（ｖｉａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ）を提示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）し、これにより家畜中のこれらの生物体の存在を減少させる又は排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ）する。このことは、動物生産物（ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を摂食すること（ｅａｔｉｎｇ）又は操作すること（ｈａｎｄｌｉｎｇ）からヒトが汚染するリスク並びに家畜の肥料（ｍａｎｕｒｅ）からの細菌の糞便発散（ｆｅｃａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）による汚染のリスクを減少させるために実施される。また、糖タンパク質及びそれらのフラグメント（例えば、グリカン部分）は、ワクチンおよび抗体調製（カンピロバクター感染を標的とする）のための基礎（ａ ｂａｓｉｓ）を提供し得る。
タンパク質糖鎖形成（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を研究するための、一般的な適用を有している研究道具を提供することも望ましい。タンパク質の糖鎖形成は、真核生物に固有の（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）現象であると考えられたが、しかし古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）および真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）のドメイン（１， ２）の双方に広く存在していることが現在明かとなっている。
Ｎ−および０−型両方のグリコシド結合（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ）は、原核生物の多様なグループにおいて同定されており、古細菌において明らかなＮ連結型糖（Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｓｕｇａｒｓ）が優勢（ｐｒｅｐｏｎｄｅｒａｎｃｅ）である。しかし、これまで真正細菌において同定された糖タンパク質においてはＯ型の結合単位（ｌｉｎｋａｇｅ ｕｎｉｔｓ）が優位（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ）である（１，２）。加えて、細菌性のＮ−および０−結合は、真核生物性の糖タンパク質において観察されたものよりも、広い範囲の糖を形成する。
本発明者らは、次のことを発見した。それは即ち、特定のグリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）およびグリカン部分が、複数の株のカンピロバクター菌に対するワクチンおよび抗体に対する効果的な基礎を形成することである。このことは、複数の株および種を横断する不変（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）（又はほとんど不変の）の形態において、これらの細菌の表面にそれらが遍在性に存在することによる。また、このグリカンは、カンピロバクターの複数の表面糖タンパク質のコンポーネントとして存在し、それゆえに免疫的な標的としての、その価値が増強される。
最近、特定の遺伝子座位が、腸内の病原体カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）において同定された（これは複数のタンパク質の糖鎖形成に関与していると思われる）。このことにより、グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）において、広範囲に広がったタンパク質糖鎖形成に関する経路の最初の証拠が提供された（３）。ｐｇｌ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎに対する）と称される本座位内の遺伝子の突然変異誘発（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、複数のタンパク質における免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の欠損（ｌｏｓｓ）が生じた。これらのタンパク質のグリカン部分（ｇｌｙｃａｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が、実験的に感染させたヒトのボランティアから採取した抗血清により認識されたことも示された（３）。ｐｇｌ突然変異によるグリカン部分の除去により、減少した接着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）および浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）をインビトロで並びにマウスコロニー形成（ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の欠損をインビボで生じ（４）、このことはタンパク質糖鎖形成が、この生物体のビルレンス特性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）に影響することを示唆している。
本発明者等は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株（ＮＣＴＣ １１１６８）のタンパク質の翻訳後修飾を同定し、特性を調査した。この株に関する、全ゲノム配列はＰａｒｋｈｉｌｌ等により記載された（６）。
２Ｄゲル上で複数のスポットを生じるタンパク質のなかに、ＰＥＢ３（またはＣｊ０２８９ｃ）が存在し、これはＣ．ｊｅｊｕｎｉの主要な抗原性タンパク質（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、Ｐｅｉ等により最初に記載された（７）。
１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製および分析した際に、２つのバンド（−１５００Ｄａの質量差）が現れ、その双方は標準的なＰＥＢ３（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ＰＥＢ３）に対応するＮ末端配列を有していた。我々のＰＥＢ３における観察と同時（Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）にＬｉｎｔｏｎら（８）は、２つの推定上の糖タンパク質をＣ．ｊｅｊｕｎｉからＧａｌＮＡｃ特異的なレクチン（ダイズ凝集素）を使用して同定した。そのうちの一方はＰＥＢ３であり、他方は推定上のペリプラスムタンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ） Ｃｊ１６７０ｃであった（彼らはＣｇｐＡと命名した）。また、前記著者は、いくつかの他の推定上の糖タンパク質を観察したが（前記レクチンと結合する彼らの能力に基づいて）、これらは同定されなかった。さらにまた、前記レクチンへのタンパク質結合は、ｐｇｌ座位中の遺伝子の突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によっても影響された。加えて、我々は遺伝子ｐｇｌＢの突然変異を示した。これのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅのＮ連結型オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＳＴＴ３サブユニットに対する相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、糖タンパク質生合成に役割を有すること（３， ９）、同定された糖タンパク質の糖鎖形成に特異的に影響することを示唆している。
そのうえ、炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）は、生命の全てのドメイン（ｄｏｍａｉｎｓ）において様々な機能と結び付けられる。一般的には、細菌株と関連する種との間の、抗原性表面グリカン（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃａｎｓ）における糖タンパク質及びそれらのグリカン部分の変動（ｖａｒｉａｎｃｅ）は高い水準で存在するが、このことは常に事実であるわけではない。また、このような例外により、細菌を排除するための抗体またはワクチンに基づく戦略に適切な優れた候補者が提示される。特に、係る炭水化物の１つは、カンピロバクター糖タンパク質のグリカン部分（ｇｌｙｃａｎ ｍｏｉｅｔｙ）である。重要な食品媒介病原体 カンピロバクター ジェジュニのグリコム（ｇｌｙｃｏｍｅ）を特徴付けるための我々の最近の努力は、全ての表面グリカン構造、即ち、リポオリゴ糖（ＬＯＳ；ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、莢膜多糖類（ＣＰＳ；ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、Ｎ連結型グリカン、および０連結型グリカンの解明へと向けられた（５，１２−１５）。

本発明者らは、次の事項を示した。その事項とは、本明細書において記載される七糖類（ｈｅｐｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）が、少なくとも数種のカンピロバクター種および多数の株（ヒトおよび獣医学上の病原体として重要な種を含む）に共通であること、複数の糖タンパク質（Ｃｊ ｎｏｓ． ０１１４，０２００ｃ，０２８９ｃ，０３６７ｃおよび他のものを含む）のコンポーネントであることである。このグリカン部分は強い免疫原性がある。そのようなものとして、このグリカン（および関連するフラグメントおよびグリコペプチド）は、カンピロバクターの複数の株および種に対する能動免疫のためのワクチンとして及びヒトにおける又は家畜におけるカンピロバクターのターゲッティングに適切な抗体または抗体フラグメントに関する基礎（ｂａｓｉｓ）としての使用に関する良好な候補である。
本明細書中で使用される「家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）」は、哺乳動物および家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）を含む。

発明の概要

本発明の課題は、単離された状態或いはオリゴペプチド、アミノ酸および／または免疫原性の抱合体（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と連結された状態の何れかで存在し得る、グリカン（ｇｌｙｃａｎ）を提供することである。
１つの側面に基づいて、本発明は、式Ｉの七糖類を含む化合物を提供する： ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−［Ｇｌｃ−β１，３］ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，３−Ｂａｃであって、Ｂａｃは、２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコピラノース（２， ４−ｄｉａｃｅｔａｍｉｄｏ−２， ４， ６−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）である。また、式Ｉは、上記の化合物の免疫学的に活性なフラグメントを含む。「免疫学的に活性な（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」は、係るフラグメントがカンピロバクターに対するワクチンの活性なコンポーネントを含み得ること、或いは係る化合物に特異的に結合する及び同一物が投与された生物体においてカンピロバクターを中和する、抗体または抗体フラグメントを提供し得ることを意味する。これらのグリカンは、単離した形態で提供し得る又は新規のグリコペプチドを形成するために、オリゴペプチドまたはアミノ酸と連結し得る。前記アミノ酸は、Ｎ−連結型のグリコペプチドを形成するための、アスパラギンを具備してもよい。これらのグリカンまたはグリコペプチドは、グラム陰性菌から由来する又は単離および精製されたものであってもよい。この糖タンパク質グリカン部分（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｍｏｉｅｔｙ）は、治療上の調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）および方法（以下に記載される）の基礎（ｂａｓｉｓ）を提供できる。
さらに別の側面に基づいて、本発明は、細菌性の糖タンパク質のグリカン部分を検出する方法を提供する、該方法は、前記サンプルを高分解能マジック角スピニング核磁気共鳴（ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲ）分光学に供試することを含む。この方法により、グリカン部分（その供給元を直接的に形成する）の検出を、前記タンパク質を精製する必要を伴うことなく可能にする。
更なる側面に基づいて、本発明は、式Ｉの七糖類および生理学的に許容される担体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）を含む、薬学的組成物を提供する。好ましくは、前記薬学的組成物は、前記グリカンもしくはグリコペプチド又はそのフラグメントに結合する、免疫原性の抱合体および／または免疫賦活薬（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）を更に含んでいてもよい。係る薬学的組成物は、カンピロバクター病原体により生じる病気に対して、ヒトまたは動物を免疫するためのワクチンとして有用である。係る病気は、例えば、胃腸の感染症（ｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、Ｇｕｉｌｌａｉｎ Ｂａｒｒｅ ＧＢＳおよびミラーフィッシャー症候群（Ｍｉｌｌｅｒ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および菌血症（ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ）である。係るワクチンは、１以上の注射を介して又は別の医学的に許容される方法により、投与されてもよい。
別の側面に基づいて、本発明は、式Ｉのグリカン部分に相互作用し且つ特異的に結合する、抗体または抗原結合性の抗体フラグメントを提供する。係る抗体またはフラグメントは、動物またはヒトのレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に投与された場合、１以上のカンピロバクター種を中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）するだろう。係る抗体は、多様な既知の方法により取得することができる；この方法には、上記の七糖類またはグリコペプチドで事前に（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ）免疫した動物の血清から単離すること、或いは係る化合物に対する、マウスのモノクローナル抗体を調製することが含まれる。別の手段は、組換えＤＮＡ技術を介するものであり；例えば、係る抗体または抗体フラグメントを、ラクダから以前に単離されたドメイン抗体（「ｄＡｂ」）遺伝子のライブラリーセット（ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｔ）をクローニングすることにより取得し、そして次にバクテリオファージ ライブラリー中で発現させ、パニングし、そして次にバクテリオファージ中で、七糖類、グリコペプチド又はそのフラグメントに対して親和性を有する配列ｄＡｂｓ（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄＡｂｓ）を発現させることである。好適なラクダ（ｃａｍｅｌｉｄ）は、Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｍｕｓ、Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ、Ｌａｍａ ｐＰａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ ｇｇＧｌａｍａおよびＬａｍａ ｖＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙから選択される；別の方法は、単一鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ） Ｖｉｃｕｇｎａのバクテリオファージ ライブラリーをスクリーニングすることを伴う（ｉｎｖｏｌｖｅ）であろう。また、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメント、および生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。係る薬学的組成物を、動物またはヒトにおける治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として使用できる。
適切な抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント（ラクダ種は、軽鎖を含有しない独特な型の抗体を産生することが注目され、従来の用語（例えば、「Ｆａｂ」）は修正されるだろう）を含み、これには上記の技術により又は他の伝統的な技術により単離状態に調製され（ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）且つ抗体全体（ａ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に直接的に由来しない、フラグメントが含まれる。
更に別の側面に基づいて、本発明は、カンピロバクター細菌の存在を家畜において減少させる方法を提供する。前記方法は、家畜に、式Ｉのグリカン部分と相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔｓ）及び結合する（ｂｉｎｄｓ）、抗体または抗原結合性抗体フラグメントを投与することを含む。

係る抗体は、十分な量で投与される場合、動物の系（ａｎｉｍａｌ’ｓ ｓｙｓｔｅｍ）からの全て又は実質的に全ての病原性のカンピロバクター生物体を中和し或いは細菌によるコロニー形成を阻止（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）し、それによって前記動物を、動物生産物を摂食すること若しくは取り扱うこと又は動物廃棄物からの汚染を介することの何れかで感染したヒト（ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎｓ）から防御する。投与は、家畜（好ましくは、家禽）に、抗体または抗原結合性フラグメントを含有する、飼料または水を給餌すること（ｆｅｅｄｉｎｇ）からなるものであってもよい。病原体を排除すること又はそれらの家畜における存在を減少させることは、前記病原体がヒト（該ヒトは、これらの病原体によって生じる病気から結果的に防御される）に到達することを阻止する方法（ａ ｗａｙ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）を構成する。従って、本発明は、ヒトにおけるカンピロバクター病原体により生じるカンピロバクター感染を阻止する方法を提供し、該方法は、前記病原体を家畜から除去することを含む（前記家畜に上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを配送することにより）。
前記抗体または抗体フラグメントは、動物飼料または水の何れかに添加し得る、或いは動物飼料植物（ａｎ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄ ｐｌａｎｔ）の遺伝的な修飾（これにより係る植物に前記抗体または抗体フラグメントを発現させる）の結果として存在するものであってもよい。
なお別の側面に基づいて、本発明は、ヒトまたは動物におけるカンピロバクター病原体により生じる病気を治療する方法を提供し、該方法は、上記で定義した抗体又はその抗原結合性フラグメントを前記ヒトへ投与することを含む。前記抗体又はその抗原結合性フラグメントを、カンピロバクター病原体により生じる病気に関して、動物またはヒトを治療するための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の調製において使用できる。
別の側面に基づいて、本発明は、カンピロバクター病原体の地下水汚染（ｇｒｏｕｎｄ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を阻止する方法を提供する。この汚染は、家畜による前記細菌の糞便発散（ｆｅｃａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）、引き続く水源（ｗａｔｅｒ ｓｕｐｐｌｙ）への糞便物質（ｆｅｃａｌ ｍａｔｔｅｒ）の侵入（ｅｎｔｒｙ）の結果として生じる。前記方法は、病原体の存在を家畜から排除すること又は減少させることを具備する（前記家畜に上記で規定した抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することによる）。
また、このことにより前記病原体がヒトに到達すること（ｒｅａｃｈｉｎｇ ｈｕｍａｎｓ）を阻止する方法が構成され、その結果、彼らはこれらの病原体により生じる病気から防御される。
また、本発明の抗体および抗体フラグメントを診断上の道具として使用して、ヒトおよび動物における及び環境から採取された（ｄｒａｗｎ）サンプル（例えば、水または肥料のサンプル）における、カンピロバクターの存在を検出できる。

発明の詳細記載

実施例は、本発明によるグリカン部分の単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）および同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を記載する。
一般的な実験手順
細菌株およびプラスミド：
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８を、ミュラーヒントン寒天（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ａｇａｒ）上で微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）の条件（１０％Ｃ０_２、５％０_２、８５％Ｎ_２）下で３７℃で規定どおり成長させた。大腸菌ＤＨ１０Ｂ（インビトロゲン）をクローニング実験に関する宿主株として使用した。そしてクローンをＬｕｒｉａ Ｓ−ｇａｌ寒天（シグマ）またはＭＨ寒天で３７℃で成長させた。適切な場合、抗生物質を次の最終濃度まで添加した、即ち： カナマイシン３０μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１５０μｇ／ｍＬである。
プラスミドｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ（ストラタジーン）をクローニングベクターとして使用した。
糖タンパク質抽出物の調製
一晩成長させた２つのプレートからの細胞を、１０ｍＬミュラーヒントンブロスに再懸濁した、そして１リッターのＭＨ培養培地（ＭＨ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）への接種に使用した。培養物を、微好気性条件下で３７℃、２４ｈ、１５０ｒｐｍで振盪させて成長させた。１２リッターの培養培地からの細菌細胞（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を、遠心分離（１０，０００ｘｇ）を１５ｍｉｎ処理して収穫し、そして即座に−７５℃で凍結した。凍結した細胞ペレットを、氷上で０．２ＭグリシンＨＣｌ緩衝剤 ｐＨ２．２（１３）中で融解し、そして１５ｍｉｎ抽出した（穏やかに撹拌して）。抽出物を、遠心分離（１０，０００ｘｇ）を１５ｍｉｎすることにより清澄（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ）し、純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム、ミリポア社）に対して透析し、そして凍結乾燥した。
ＰＥＢ３の精製および分析：
ＰＥＢ３タンパク質を、グリシン抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーすることにより、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）に精製した（以前に記載の通り（７））。ファルマシアＭｏｎｏＳ ＨＲ ５／５カラムを、ＡＫＴＡエクスプローラーＬＣシステム（アマシャムバイオサイエンス）に使用した。カラム溶出液を、ＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）に関してモニターした。そしてフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を、Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩスラブゲル（バイオラドラボラトリーズ）中でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（２１）により試験した。個々のタンパク質のＮ末端シークエンシングを、ＳＤＳゲルからプロブロット（ＰｒｏＢｌｏｔ^ＴＭ）ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステム社）への転写に引き続き、モデル４９１ プロサイズ（Ｐｒｏｃｉｓｅ）タンパク質配列決定システム（アプライドバイオシステム社）で実施した（ＬｅＧｅｎｄｒｅ等の記載の通り）（２２）。
選択したフラクションのタンパク質分子量プロフィールを、エレクトロスプレーイオン化質量分析により決定した（アプライドバイオシステム／サイエックス Ｑスターハイブリッド四重極 飛行時間型質量分析計を用いて）。
前記フラクションを、最初に頻繁に透析して塩を除去し、３０％メタノール、０．２％ギ酸に対して調製した。溶液を１μＬ／ｍｉｎの流速で流し、そしてスペクトルをｍ／ｚ ６００＞２０００の範囲で取得した。

トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の分析：
選択したフラクションを、修飾型トリプシン（プロメガ）を５０ｍＭアンモニウムバイカルボネート中で一晩３７℃で消化し、Ｑ−ＴＯＦ２ハイブリッド四重極 飛行時間型質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）と連結したキャピラリーＨＰＬＣシステム（ＣａｐＬＣ、ウォーターズ）を用いた、キャピラリーＬＣタンデム型質量分析により分析した。約２５０ｎｇの各消化物を、０．３ｘ１５０ｍｍのＰｅｐＭａｐＣ１８キャピラリーＬＣカラム（Ｄｉｏｎｅｘ／ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ）に注入し、そして勾配溶離（５−９０％アセトニトリル、０．２％ギ酸を４５分間で）により分離した。質量分析計をセットして、自動ＭＳ／ＭＳ獲得モードで実行した。そしてスペクトルを二重（ｄｏｕｂｌｙ）、三重（ｔｒｉｐｌｙ）、および四重（ｑｕａｄｒｕｐｌｙ）に荷電したイオンに関して獲得した。
トリプシン消化物（ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ）のラージスケール分離を、４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）上で実施した。グリコペプチドを含有しているフラクションを、次に一定の流速（１μＬ／ｍｉｎ）でＱ−ＴＯＦ２質量分析計のマイクロエレクトロスプレー界面へと注入した。グリコペプチドのフラグメンテーション（ＭＳ／ＭＳ分析の前の）を、フロントエンド衝突誘発解離（ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により達成した（開口部電位を通常値４０Ｖから１００Ｖに増加させた）。この様式で産生された単一に荷電したフラグメント イオンに対するＭＳ／ＭＳ衝突オフセットは、２０−２５Ｖであった（参照のラボ フレーム（ｌａｂ ｆｒａｍｅ））。Ｒａｄｅｍａｋｅｒ等（２３）の方法によるβ脱離実験（β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）に関して、グリコペプチド含有フラクションの約半分を蒸留して乾燥させて、そして２５％水性アンモニウム水酸化物（２５％ ａｑｕｅｏｕｓ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）に溶解した。前記溶液を、室温で一晩静置し、蒸留して乾燥させ（二回目の）、そして水中で再溶解させた。
前記溶液を、次にインフュージョンＭＳ（ｉｎｆｕｓｉｏｎ−ＭＳ）で試験した（上記の通り）。
全糖タンパク質の精製および分析：
グリシン抽出物からの糖タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによりＳＢＡレクチン／アガロース（シグマアルドリッチ社）上で分離した。凍結乾燥したグリシン抽出物を、ＰＢＳ（１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５）中に再溶解し、そしてＳＢＡ／アガロースカラム（事前にＰＢＳで平衡化させた）を通過させた。前記カラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、結合した糖タンパク質を０．１Ｍ ＧａｌＮＡｃ（ＰＢＳ中）で溶出した。糖タンパク質含有フラクション（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を、プール（ｐｏｏｌｅｄ）し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に対して透析し、凍結乾燥した。
糖タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１２．５％の均質なポリアクリルアミドゲル上で分離した（２１）。２Ｄ−ＰＡＧＥを、ｐＨ３−１０、ｐＨ４−７（バイオラドラボラトリーズ）またはｐＨ６−１１（アマシャムバイオサイエンス）の何れかの固定化された直線状ｐＨグラジエントを含有する、プレキャストＩＥＦストリップを用いて実施した。タンパク質を、製造者の使用説明書にしたがってサンプル緩衝剤中に溶解し、そして等電点フォーカシング（プレキャストＩＥＦストリップ上で）と、引き続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ（均質な１２．５％スラブゲル上、２０ｘ２０ｃｍ、二次元目に関して）とにより分離した。
ゲルを、バイオセーフ（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ）コロイドＧ−２５０クーマシーブルー染色（バイオラドラボラトリーズ）または銀染色で染色した（２３）。引き続くレクチンのプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）に関して、前記ゲルを、ＰＶＤＦ膜上に５０Ｖで１時間、１０ｍＭ ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ１１、１０％メタノール含有）中で電気ブロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）した。前記膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で洗浄し、そしてトリスで緩衝した（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ）生理食塩水（１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリスｐＨ７．５）に０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するもの及び２％ブロッキング緩衝剤（ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ）で、２時間室温でブロックした。
ブロッキング（ｂｌｏｃｋａｇｅ）後、転写物（ｂｌｏｔｓ）を、ＳＢＡ−アルカリホスファターゼ抱合体（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を１０μｇ／ｍＬの濃度で上記ブロッキング溶液中に含有するもので、１時間室温で、更にインキュベートした。転写物を、トリス生理食塩水に０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもので３回洗浄し、そしてニトロブルーテトラゾリウム クロライド（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル リン酸（ＢＣＩＰ）を０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ トリスｐＨ９．５（５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加）中に有する溶液を用いて発色させた。
２Ｄ−ゲルスポットのＭＳ分析：
タンパク質スポットを、切除し、１：１比率の３０ｍＭフェリシアン化カリウムおよび１００ｍＭチオ硫酸ナトリウム（２４）で脱染色した。ゲルスポット（ｇｅｌ ｓｐｏｔｓ）を、脱イオン水で頻繁に洗浄し、アセトニトリルで収縮させ、５０ｍＭアンモニウムバイカルボネート（プロメガ修飾型トリプシン（１０ｎｇ／ｕＬ）を含有する）で再膨潤（ｒｅ−ｓｗｏｌｌｅｎ）させた。そして十分な５０ｍＭアンモニウムバイカルボネートをゲル片に添加してカバーした（典型的には３０ｕＬ）。
チュウブを密封し、一晩３７℃でインキュベーションした。消化液を除去し、ゲル片を５０μＬの５％酢酸で抽出し、次に５０μＬの５％酢酸（５０％水性メタノール中の）で抽出した。抽出液を、消化液と共にプールし、約１０μＬに濃縮した。
強いタンパク質スポットからのペプチド抽出物を、ＭＡＬＤＩ−ＬＲ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用いた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した。
約０．５μＬのＭＡＬＤＩマトリックス溶液剤（１０ｍｇ／ｍＬ α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸を５０％アセトニトリル、０．２％ＴＦＡ中に含有する）を、ターゲットプレート上に沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）させ、乾燥させた。ペプチド抽出物を、Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐｓ^ＴＭ（ミリポア）を用いて脱塩し、そしてマトリックススポット上に直接沈着させた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルの獲得を自動的に実行した。スペクトルを、ペプチド標準（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を用いて外部的に較正（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）し、トリプシン自己消化ペプチドを用いて内部的に較正した。データベース探索を、バッチモードでＭａｓｃｏｔ Ｄａｅｍｏｎｓ ^ＴＭ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８ゲノム配列データベースを対象に実行した。
微かな（ｆａｉｎｔｅｒ）タンパク質スポットからの抽出物を、Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計を用いたｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。全サンプルを、０．３ｘ５ｍｍ Ｃ１８ミクロプレカラムカートリッジ（Ｄｉｏｎｅｘ／ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ）に注入した。ペプチドは、サンプル溶液が洗浄され廃棄される間に保持された。トラップを７５μｍ ｘ １５０ｍｍ Ｃ１８Ｎａｎｏシリーズカラム（Ｄｉｏｎｅｘ／ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ）上に配置した。そしてペプチドをＣａｐＬＣポンプ（１５〜７５％アセトニトリル、０．２％ギ酸を３０分間、約３００ｎＬ／ｍｉｎ流速）により供給されるグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で分離した。質量分析計をセットして、自動化モードでＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した（上記のとおり）。
データベース探索を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析に関する記載にしたがって実行した。
グリコペプチド調製：
凍結乾燥したトータルの糖タンパク質（５ｍｇ）を、２５０μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有）に溶解し、そしてプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）で消化した（以前に記載の通り）（３１）。消化物を、微量遠心（１０，０００ｘｇ、１５ｍｉｎ）し、上清をＢｉｏＧｅｌ Ｐ４、２００メッシュ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカラム（１ｘ１２０ｃｍ）にアプライした。カラムを水中で実施し、カラム溶出液を屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）によりモニターした。フラクションを、ＥＳＩＭＳおよび前駆物質イオン走査質量分析（ｍ／ｚ ２０４でのＨｅｘＮＡｃオキソニウムイオンの前駆物質）をＡＰＩ３０００ 三重四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ）上で実施することにより選抜（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）した。ＨｅｘＮＡｃ イオンサイン（ｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を提示するフラクションを、プールし、凍結乾燥した。グリコペプチドを、ＢｉｏＧｅｌ Ｐ２ファイングレードの１ｘ１２０ｃｍカラム上で更に精製した（フラクションは上記のとおりモニターされ、選抜される）。
ＮＭＲ分光学：
全スペクトルを、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ分光計（標準のＶａｒｉａｎソフトウェアを用いて）を用いて取得した。グラジエント ４ｍｍ間接検出 高分解能マジック角スピニング（Ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ４ ｍｍ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ） ｎａｎｏ−ＮＭＲプローブ（Ｖａｒｉａｎ）に、広帯域（ｂｒｏａｄｂａｎｄ）のデカップリングコイル（ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｉｌ）を備えたものを使用した。サンプルを、駆動（ｄｒｉｖｅ）およびベアリング（ｂｅａｒｉｎｇ） ガスとしての乾燥窒素と共に、３ＫＨｚでスピンさせた。スピン比率（ｓｐｉｎ ｒａｔｅ）は、コンピュータ制御されなかったが、セット値の１０Ｈｚ内で一定に保持された。
サンプル（４０μＬのＤ_２０溶液中）を、より鋭いピークを産生させるために、２５℃で及び３５℃で記録した。ｐＨは、小さい容量のため分からなかった。重水素化したＥＤＴＡ（ＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．）を添加して、金属イオンをキレートし、バシロサミン（ｂａｃｉｌｌｏｓａｍｉｎｅ）およびアミノ酸に対する鋭いピークを提供した。グリコペプチド単離物（Ｐ４カラムからの）が、いくつかのアミノ酸および糖 不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）を含有していたにもかかわらず、スペクトルは、１５ｍＭの重水素化型ＥＤＴＡ（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ＥＤＴＡ）の存在下において、グリコペプチドの完全な共鳴帰属（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ）を許容する十分な質のものであった。多くのＮＭＲ構造研究は、このサンプルで継続した（更なる精製による、分離されたグリコペプチドのバルクを失うリスクのため）。導き出された構造（Ｔｈｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、グリコペプチドにおける付加的なＮＭＲ実験により確認された；このグリコペプチドは、Ｐ２カラムを用いて精製され、凍結乾燥され、そして４０μＬのＤ_２Ｏ（１ｍＭ 重水素化型ＥＤＴＡを有する）に溶解されたものであった。実験は、ＨＤＯシグナルの抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を４．７８ｐｐｍ（２５℃）および４．６７ｐｐｍ（３５℃）で行い実施された。２次元実験（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）の取得（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）および処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を、以前に記載されたとおり実施した（３２）。^１Ｈ リファレンスを、外部のアセトンにより２．２３ｐｐｍでセットした。^１３Ｃ リファレンスを、外部のアセトンのメチル共鳴で３１．０７ｐｐｍにセットした。^１Ｈおよび^１３Ｃ 化学シフト（表１における）を、プロトン スペクトルから及びＣ−Ｈクロスピークから（ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルにおける）測定した。１Ｄ ＴＯＣＳＹ実験（３０−１５１ｍｓの多様なスピン−ロック時間）および１Ｄ ＮＯＥＳＹ（４００−８００ｍｓの混合時間）を、以前に記載されたとおり実施した（２５，２６）。選択的な実験を、１Ｄ ＥＸＰ〔選択されたスピン（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｉｎｓ）、選択励起バンド幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｂａｎｄｗｉｄｔｈ）、混合時間（ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅ）、ここでＥＸＰはＴＯＣＳＹまたはＮＯＥＳＹ〕として記載した。
ＲＦおよび磁場均質性（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ｆｉｅｌｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓ）の双方の存在下において、マジック角スピニング（ＭＡＳ；ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）を液体状態サンプルに対して使用することは、ＴＯＣＳＹ実験において混合シークエンス（ｍｉｘｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の性能に有意に影響することが示されており、これにより性能が劣化され得る（２７，２８）。断熱性（ＷＵＲＳＴ）混合シークエンスは、係る効果を排除できる（２７，２９）。標準の２Ｄ ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ ＴＯＣＳＹシークエンスを、ＭＬＥＶ−１７またはＤＩＰＳＩ−２混合シークエンスが断熱性（ａｄｉａｂａｔｉｃ）ＷＵＲＳＴ−２パルスで置換されるように修飾した。断熱性（ＷＵＲＳＴ−２）混合は、Ｔｐ＝１／ＭＡＳスピン比率の単一の断熱性反転パルス長（ａｄｉａｂａｔｉｃ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｕｌｓｅ ｌｅｎｇｔｈ）、８の変調深度（ａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｐｔｈ）、および２の断熱度（ａｄｉａｂｉｃｉｔｙ）を有していた。典型的には、ＷＵＲＳＴ−２パルスに関して、スイープ帯域幅（ｓｗｅｅｐ ｂａｎｄｗｉｄｔｈ）は、２４ｋＨｚ、Ｔｐ＝０．３３３ｍｓ（３０００＋／−１０ＨｚのＭＡＳスピン比率で）、Ｂ１（ｍａｘ）＝８．５１ｋＨｚ、Ｂ１（ＲＭＳ）＝４．７７ｋＨｚであった。
ＧＣ−ＭＳ分析：
Ｐ２産物のＧｌｃおよびＧａｌＮＡｃコンポーネントの鏡像異性配置（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ）は、ガス液体クロマトグラフィー質量分析においてｂｕｔ−２−イル グリコシド（ｂｕｔ−２−ｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）のキャラクタリゼーションにより割り当てられた（２１）。誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を、ヒューレットパッカード クロマトグラフに３０ｍ ＤＢ−１７キャピラリーカラム（１８０℃から２６０℃を３．５℃／ｍｉｎ）を備えた装置を用いて分析した。また、電子衝撃モード（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｍｐａｃｔ ｍｏｄｅ）におけるスペクトルを、バリアンサターン（Ｖａｒｉａｎ Ｓａｔｕｒｎ）ＩＩ質量分析計で取得（ｏｂｔａｉｎｅｄ）した。
ｐｇｌＢ突然変異体の構築およびキャラクタリゼーション：
ｐｇｌＢ突然変異体の構築に関して、遺伝子Ｃｊ１１２１ｃからＣｊ１１２６ｃを、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８から、次のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した： 即ち、Ｃｊ１１２１ｃＦ（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＡＡＧＡＴＡＡＧＣ−３’）およびＣｊ１１２６ｃＲ（５’− ＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ−３’）である。ＰＣＲ産物を、Ｐｆｕポリメラーゼで削り（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）、そしてｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ（ストラタジーン）へと製造者の使用説明書にしたがって連結した。ライゲーション混合物を、電気穿孔法を適用可能な（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＤＨ１０Ｂへと電気穿孔して導入し、そしてＬＢ Ｓ−ｇａｌ寒天（シグマ−アルドリッチ）にアンピシリンを含有させた培地で選択した。ｐＩＬＬ６００からのブラントエンド化したカナマイシン抵抗性カセット（３７）を、ｐｇｌＢのフィルインしたＸｂａｌ制限酵素部位に挿入して、ｐＥＡｐ２６を作出した。前記カセットの方向性を、ｃｋａｎＢプライマー（５’−ＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＡＴＴＡＧ−３’）でシークエンシングすることにより決定した。ＤＮＡを、ターミネーター化学およびＡｍｐｌｉＴａｑサイクル シークエンシング キット（アプライドバイオシステム）を用いて配列決定し、アプライドバイオシステム３７３ＤＮＡシーケンサーで分析した。突然変異したプラスミドＤＮＡを、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８への電気穿孔に使用した（３２）。また、カナマイシン耐性の形質転換体をＰＣＲにより特性を調査して、入った（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）プラスミドＤＮＡが二重の交差イベントにより統合されたことを確認した。
タンパク質を、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）を用いて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ細胞全体から抽出し（１０）、そして水に対し透析した。サンプルを、１１ｃｍ ｐＨ３−１０のＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＩＰＧ ｓｔｒｉｐｓ（バイオラドラボラトリーズ）およびプレキャスト１２ｘ８ｃｍ ８−１６％グラジエント・クライテリオン・スラブゲル（ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｓｌａｂ ｇｅｌｓ、バイオラドラボラトリーズ）を用いた２Ｄ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルを、コロイド性クーマシーブルーで染色し、写真をとり、次に水中で洗浄することにより部分的に脱染色した。タンパク質を、１ｈ、２０７ｍＡでＰＶＤＦ膜上に転写した（トランス−ブロットＳＤセミドライ転写セル（バイオラド）を用いた）。ブロッキングを一晩した後、膜を１：５００希釈のＨＳ：２セロタイピング血清（ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ｓｅｒｕｍ）で、続いて１：５０００希釈のヤギ抗ウサギ抗血清（シグマ−アルドリッチ）でプローブし、そしてＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ）で発色させた。
カンピロバクター細胞からのグリカンの検出のための実験手順
細菌株および成長条件：
カンピロバクター ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８（ＨＳ：２）は、ヒト腸炎の症例から分離された（４６）、そしてＰａｒｋｈｉｌｌ等（６）により後に配列決定された。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎｓ）：ＨＳ：１（ＡＴＣＣ ４３４２９）、ＨＳ：２（ＡＴＣＣ ４３４３０）、ＨＳ：３（ＡＴＣＣ ４３４３１）、ＨＳ：４（ＡＴＣＣ ４３４３２）、ＨＳ：１０（ＡＴＣＣ ４３４３８）、ＨＳ：１９（ＡＴＣＣ ４３４４６）、ＨＳ：３６（ＡＴＣＣ ４３４５６）およびＨＳ：４１（ＡＴＣＣ ４３４６０）は、ＡＴＣＣから取得された；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：２３は、Ｐｅｇｇｙ Ｇｏｄｓｃｈａｌｋ博士（エラスムス大学医療センター、ロッテルダム）から入手された；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４は、ヘルスカナダ（Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ）から入手された；並びにＣ．ｃｏｌｉ ＨＳ：３０（ＮＣＴＣ １２５３２）は、ＮＣＴＣから入手された。全カンピロバクター株を、ミュラーヒントン寒天（ディフコ）上で微好気性条件下（３７℃）でルーチン的に成長させた。
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８突然変異体を、ミュラーヒントン寒天に３０μｇ／ｍＬカナマイシンを有する培地で成長させた。
部位特異的突然変異体の構築およびキャラクタリゼーション：
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８ ｋｐｓＭ（１２）およびｐｇｌＢ（１３）突然変異体の構築は、既に記載されている。

ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲのための細胞の調製：
１つの寒天プレートから一晩成長させたＣ．ｊｅｊｕｎｉ（〜１０^１０細胞）を、収穫し、そして１ｍＬの１０ｍＭカリウム緩衝生理食塩水（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７）（１０％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を含有しているＤ_２０で作出された）中に懸濁した。前記懸濁液を１ｈ、室温でインキュベーションして、前記細菌を殺傷した。前記細胞を、遠心分離（７５００ ｘ ｇ、２ｍｉｎ）により沈殿させ、そして１０ｍＭカリウム緩衝生理食塩水（Ｄ_２０中）で１回洗浄した。前記ペレットを、２０μＬのＤ_２０を添加することにより再懸濁させた。次に４０μＬの前記懸濁液を分析のためにローター（ｒｏｔｏｒ）に挿入した。
ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲ分光学：
ＨＲ−ＭＡＳ実験を、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ分光計にＶａｒｉａｎ ｎａｎｏ−ＮＭＲプローブを備えた装置を用いて、以前に記載されたとおりに実施した（１２，１３）。４０μＬサンプルからのスペクトルを、３ＫＨｚでスピンさせ、そして外界温度（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（２１℃）で記録した。実験を、ＨＯＤシグナル（４．８ｐｐｍで）の抑制により実行した。
細菌細胞のプロトン スペクトルを、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）パルス シークエンス［９０−（τ−１８０−τ）_ｎ−ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ］（３４）で獲得して、脂質および固体様物質（ｓｏｌｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）から生じる広幅なライン（ｂｒｏａｄ ｌｉｎｅｓ）を除去した。ＣＰＭＧパルス（ｎ＊２τ）の全体の継続時間は、１０ｍｓにτセットから（１／ＭＡＳスピン比率）を伴っていた。１次元の選択的なＴＯＣＳＹ実験（３０−１５０ｍｓの多様なスピン−ロック時間を有する）および選択的なＮＯＥＳＹ（１００−４００ｍｓの混合時間を有する）を、以前に記載されたとおり実施した（２５，３５）。ＭＡＳ条件下での使用のために、ＴＯＣＳＹシークエンスを、ＤＩＰＳＩ−２混合シークエンスが断熱性（ａｄｉａｂａｔｉｃ）ＷＵＲＳＴ−２パルスで置換されるように修飾した（１３）。選択的な実験を、ＥＸＰ〔選択されたスピン（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｉｎｓ）、選択励起バンド幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｂａｎｄｗｉｄｔｈ）、混合時間（ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅ）〕として記載した（ここでＥＸＰはＴＯＣＳＹまたはＮＯＥＳＹである）。典型的には、細菌細胞のプロトン スペクトルは、２５６から１０２４トランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ）（１５ｍｉｎから１時間）を用いて、取得できるであろう。細菌細胞においてマイナーなコンポーネントとして存在するＮ連結型グリカン共鳴においての選択的実験（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）に関して、各ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹに関する前記時間は１から８時間まで変化していた。

実施例１ ＰＥＢ３の精製およびキャラクタリゼーション
ＰＥＢ３タンパク質（Ｃｊ０２８９ｃ）は、グリシン抽出物の２Ｄゲル中に、ペプチドマスフィンガープリント法により、ｐＨ９−１０の範囲内に集束しているスポットの群のコンポーネントとして、同定された（結果示さず）。ＰＥＢ３は、前記抽出物から陽イオン交換クロマトグラフィーで精製され、そして同じカラム上で再分画されて（より浅い塩化ナトリウムの勾配を用いて）、結果的に前記ＰＥＢ３は３つのフラクションに出現した（図１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、２つのバンドが示された。前記バンドのＮ末端配列は、前記バンドをＰＶＤＦ膜へと転写した後に決定された。１０サイクルのシークエンシングにより、低質量の種（ｌｏｗｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）がＰＥＢ３と同定された。一方で、高質量（より豊富なコンポーネント）もＰＥＢ３であって、ＰＥＢ３にＰＥＢ４（Ｃｊ０５９６）に対応する若干の配列（ａ ｍｉｎｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するものであった。
マススペクトルおよびフラクション＃３１に関する再構築された分子量プロファイルを、図２ａ）およびｂ）に示す。３つのピークが、再構築された分子量プロファイルにおいて観察された。２５，４５４ Ｄａおよび２８，３７６ Ｄａでのピークは、それぞれＰＥＢ３（２５，４５３ Ｄａ、Ｃｊ０２８９ｃ）およびＰＥＢ４（２８，３７７ Ｄａ、Ｃｊ０５９６）の推定上の分子量と良く一致した（シグナルペプチドなし）。質量２６，８６１ Ｄａのタンパク質を同定するため、ＣａｐＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を本フラクションのトリプシン消化物に関して実行した。同定されたペプチドの１つを除いた全てを、ＰＥＢ３またはＰＥＢ４に帰属させることが可能であった（Ｎ末端配列データと一致して）。未同定のイオンのＭＳ／ＭＳ分析（図３ａ）により、それがグリコペプチドであることが明瞭に同定された。ＨｅｘＮＡｃ（２０３Ｄａ）の連続的な欠損（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｌｏｓｓｅｓ）を構成するフラグメンテーションシリーズ（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）および単一のＨｅｘ（１６２Ｄａ）が、本スペクトルにおいて観察できる。トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、^６８ ＤＦＮＶＳＫ ^７３と同定された（ＰＥＢ３より）。このグリコペプチドのオリゴ糖部分の残基質量（ｒｅｓｉｄｕｅ ｍａｓｓ）は１４０６Ｄａであり、これはＰＥＢ３の分子量および未知のタンパク質ピーク（図２ｂにおいて観察される）における差とよく対応している。従って、約５０％のＰＥＢ３タンパク質（このフラクション中の）は、単一のオリゴ糖（５ＨｅｘＮＡｃｓ、１Ｈｅｘおよび２２８Ｄａの残基質量を有する異常な糖から構成される）で修飾されたと思われる。そのうえ、ＭＳ／ＭＳスペクトルは、オリゴ糖が２２８Ｄａの糖部分（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）を介して前記ペプチドに連結していることを指摘した。
実施例２ グリコペプチド結合（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）のキャラクタリゼーション
ＰＥＢ３トリプシンペプチド（これに前記オリゴ糖が付着している）は、Ｎ−および０−結合（即ち、ＡｓｎおよびＳｅｒ）の両方に対する部位を含有している。従って、この結合の素性（ｎａｔｕｒｅ）を決定するための更なる実験を実行することが必要であった。以前、我々はβ脱離（β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を使用して、０−連結型の炭水化物を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ８１−１７６のフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）から除去した（５）。しかしながら、この手順は、この事例において前記オリゴ糖の除去に失敗した。このことは、前記オリゴ糖がＮ連結型であるとの我々の最初の指摘であった。このことは、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）グリコペプチドのフロントエンド衝突誘起解離により産生された、単一的にプロトン化したフラグメント イオン（ｍ／ｚ ９３７．０での）のＭＳ／ＭＳ分析により確認された（図３ｂ）。このイオンは、トリプシンペプチド プラス 異常な（ｕｎｕｓｕａｌ）２２８Ｄａ糖のみから構成されている。特定のイオンがｍ／ｚ ６０５．１で観察された。これはｂ_３フラグメント イオン プラス ２２８Ｄａ糖部分にのみ帰属できた。フラグメント イオンは観察されず、炭水化物がセリン残基に連結していることが示唆された。この証拠の全ては、前記オリゴ糖が前記ペプチドにＡｓｎ７０で連結していることを強く示唆している。
興味深いことに、このペプチドは、真核生物のＮ−結合コンセンサス シークオン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｏｎ） Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒを含有している。
実施例３ 糖タンパク質の単離および同定
推定上の糖タンパク質を、ＳＢＡアフィニティークロマトグラフィーで、４０ｇ湿重量の細胞のグリシン抽出物から精製した。推定上の糖タンパク質の収量（ｙｉｅｌｄ）は、ＵＶ吸光度（２８０ｎｍでの）により推定されたとおり５ｍｇであった。
ＧａｌＮＡｃ溶出物を、１Ｄおよび２Ｄ−ＰＡＧＥに供試し（図４）、この様式で精製されたタンパク質がレクチン結合特性（非特異的な結合特性ではなく）を有していることを確立した。また、ウエスタンブロット法（ＳＢＡ／アルカリホスファターゼ抱合体での）を実施した。約１３のタンパク質種を、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて視覚化した。しかし、この数は、前記産物が２Ｄ−ＰＡＧＥにより分析された場合、実質的に増加した。個々のバンド（１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの）およびスポット（２Ｄ−ＰＡＧＥからの）中のタンパク質を、マスフィンガープリント法およびデータベース検索により同定した（表Ｉ）。同定されたタンパク質のなかには、以前Ｌｉｎｔｏｎ等により同定された、ＰＥＢ３（Ｃｊ０８２９ｃ）およびＣｇｐＡ（Ｃｊ１６７０ｃ）が認められた（８）。Ｃｊ１６７０ｃおよび他のタンパク質により同一のｐｌｓで提示されたスポットの、垂直方向のパターンは、様々な程度の糖鎖形成を指摘しているようである。というのもそれらの予想されたアミノ酸配列（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８（６）の全体のゲノム配列に由来する）の調査（ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）が、複数の潜在的なＮ−連結した糖鎖形成部位（シークオンＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含有する）の存在を明らかにしているからである（表Ｉ）。事実、Ｃｊ１６７０ｃを含有しているインゲル消化物の抽出物のＭＳ／ＭＳ分析は、６つのＮ−連結部位のうち３つが、様々な程度に占有されることを指摘した（３つのＣｊ１６７０ｃグリコペプチドはｃａｐＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出された、即ち： ^７ＴＤＱＮＩＴＬＶＡＰＰＥＦＱＫＥＥＶＫ^２５、^７７ＶＬＤＶＳＶＴＩＰＥＫＮＳＳＫ^９１および^９２ＱＥＳＮＳＴＡＮＶＥＩＰＬＱＶＡＫ^１０８である。また、単一のグリコペプチドが、Ｃｊ０１１４（^７１ＬＳＱＶＥＥＮＮＱＮＩＥＮＮＦＴＳＥＩＱＫ^９１）に関して及びＣｊ０２００ｃ（^１ＤＳＬＫＬＥＧＴＩＡＱＩＹＤＮＮＫ^１７）に関しても観察された。さらにまた、全てのそれらのグリコペプチドのグリカンコンポーネントの質量および組成は、ＰＥＢ３に関して観察されたものと同一であると思われる。
しかしながら、２Ｄ−ＰＡＧＥから同定された特定のタンパク質、特にＣｊ０１４７ｃ、Ｃｊ０１６９、Ｃｊ０３３２ｃ、Ｃｊ０３３４、Ｃｊ０６３８ｃ、Ｃｊ１１８１ｃおよびＣｊ１５３４ｃは、任意のこれらの特定のシークオンス（ｓｅｑｕｏｎｓ）を、彼らのアミノ酸配列中に含有していない。これらのタンパク質の何れもが、非共有結合性にＳＢＡ結合タンパク質と相互作用するか又は非特異的に前記カラムに結合する。この結論は、これらのタンパク質スポットがＳＢＡ／アルカリホスファターゼ抱合体と反応しない（２Ｄ ＰＡＧＥおよび電気ブロッティング後）との失敗により支持される（表Ｉ）。
実施例４ グリコペプチドの調製
混合した糖タンパク質サンプルを、２ラウンドのプロナーゼ消化に供試した、そして産物をゲル濾過（ＢｉｏＧｅｌ Ｐ４）で分離した（図５ａ）。炭水化物含有フラクションを、質量分析により決定した、ＮＭＲ試験後（以下を参照）、前記サンプルをＢｉｏＧｅｌ Ｐ２上で再精製した（図５ｂ）。最終的な精製サンプルは、単一のＡｓｎに連結したオリゴ糖から主に構成されていた。グリカンコンポーネント（ｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）において如何なる変化の証拠も存在していなかった。グリコペプチドの収量は、約２００μｇであると推定された。
実施例５ 単離された七糖類の調製
実施例４（式Ｉ）において同定された七糖類部分（ｈｅｐｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｏｉｅｔｙ）は、既知の方法で単離することにより取得し得る。例えば、アミノ酸部分（Ａｓｎ）を、実施例４において調製されたオリゴペプチドから、当該技術分野において周知の酵素的または化学的な加水分解により切断し得る。本発明者等は上記の工程を実施しなかったが、係る工程を実施して前記七糖類を単離し得ることが明らかであろうことが注目される。また、前記七糖類は、前記糖タンパク質から直接取得できる（グリコペプチドを経由することなく）。また、この切断は、酵素的または化学的な加水分解により実施できる。例えば、Ｐａｔｅｌ等（４１）は、係る切断に関してヒドララジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）の使用を教示している。
実施例６ ＮＭＲ分光学
精選された方法（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）を使用したので、不純物のあるＰ４サンプルで作業可能であった。糖部分の完全な共鳴帰属（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を、更なる精製に際するグリコペプチドの損失の恐れがあるため、このサンプルで実施した。Ｐ２カラムを用いた第二の精製後、２５％のグリコペプチドが損失した（Ｐ４およびＰ２精製サンプルに関するＳ／Ｎ比の測定により判断された）。ＨＭＱＣ実験を、Ｐ２精製サンプルで再試験して、Ｐ４精製サンプルを用いて取得した帰属を確認した。質量分析の結果、前記グリコペプチドは、５ＨｅｘＮＡｃ残基、Ｈｅｘ残基、および未知の糖（質量２２８Ｄａを有する）から構成されていた。ＨｅｘＮＡｃおよびＨｅｘ残基の絶対配置（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、化学分析によりＤであると決定された。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲデータの分析により、アルファベット順にラベルされた８アノマープロトン（８ ａｎｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｏｎｓ）の存在が指摘された（図６）。アノマー共鳴に関する一連の１Ｄ ＴＯＣＳＹを、プロトンの帰属（ｐｒｏｔｏｎ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ）に関して実施した（図７）。異なる混合時間（ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅｓ）を使用して、各残基内のスピンを帰属させた。ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣを使用して、次に^１３Ｃ共鳴を帰属させた。ＮＭＲ帰属を表ＩＩに示す。１Ｄ ＮＯＥＳＹ実験（図７）を使用して、示されるシークエンスを取得した（図６）。
残基ｇは、β−Ｄ−Ｇｌｃｐと帰属された。１４４ｍｓの混合時間によるｇ１の１Ｄ ＴＯＣＳＹ（図７ａ）に関して、Ｈ６およびＨ６’共鳴までの全てのスピンを検出した（β−グルコピラノースの典型的な、大きいＪ_{Ｈ， Ｈ}カップリングの表示）。また、共鳴ｇ１はｆ２とオーバーラップし、これによりｆ１からｆ４共鳴の検出を可能にする。残基ｇは末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）であった（Ｃ２からＣ６に関する^１３Ｃおよび^１Ｈ化学シフトの、β−Ｄ−グルコピラノースのものに対する類似する結果から）（３６）。
５つの残基（ａ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）は、α−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃと同定された。Ｊ_{１， ２}の３．６＋／−０．２Ｈｚ（強いＨ１−Ｈ２ ＮＯＥ（図７））、およびＪ_{Ｈ， Ｈ}カップリングパターン（Ｈ４に対する小さいカップリングを含む（図７））の値により、それらのユニットがα−Ｄ−ガラクトピラノシル配置を有することが示された。ｅ１およびｆ１のアノマー共鳴は狭いバンド幅（１０Ｈｚ）で選択的に励起されうるが、ｅ１およびｆ１の連続的な励起（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）に関するスペクトルは図７ｂに示される。
また、共鳴ｆ２からｆ４は、ｇ１ｆ２の１Ｄ ＴＯＣＳＹに対して検出された（図７ａ）。５１ｐｐｍに近いＣ２に関する化学シフトは、アセトアミド基の表示（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）であった。（Ｃ２，Ｈ４）ＨＭＢＣ相関を使用して、５つのＧａｌＮＡｃ残基のＣ２共鳴を帰属させた。１Ｄ ＴＯＣＳＹ−ＮＯＥＳＹ（Ｈ１，Ｈ４）を使用して、ＮＯＥ（Ｈ４およびＨ５の間の）を検出し、Ｈ５共鳴を帰属させた（２５）。１Ｄ−ＴＯＣＳＹ実験（Ｈ５共鳴において）を、次に使用してＨ６ｓ共鳴を検出した（示さず）。Ｐ２精製サンプルの統合（図６ｂ）は７ＮＡｃ基を指摘した、それらのうち５つは５つのＧａｌＮＡｃ残基に相当している。
ＧａｌＮＡｃユニットの^１３Ｃ化学シフトとα−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃのものとの比較により、残基ａ、ｃ、ｅ、ｆがＯ−４で連結していることが指摘された（Ｃ４に関する低磁場シフトによる）（３７）。残基ｆが分岐点（Ｏ−３で）を有していたことが、Ｃ３に関する低磁場変化（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ ｓｈｉｆｔ）により樹立された。残基ｄは末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）であった（Ｃ２からＣ６に関する^１３Ｃ化学シフトの、α−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃのものに対する類似する結果から）（３７）。
残基ｂは、β−Ｄ−バシロサミン（２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース）に帰属された。残基ｂおよびｃに関して、アノマー共鳴（ａｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ）が部分的にオーバーラップした。ｂ１およびｃ１共鳴（１４４ｍｓの混合時間を有する）の１Ｄ ＴＯＣＳＹに関して（図７ｅ）、広い共鳴がＣＨ_３共鳴（ｂ６）まで１．１４ｐｐｍで同定できた。１．１４ｐｐｍでのｂ６（６６ｍｓの混合時間を有する）の１Ｄ ＴＯＣＳＹに関して（図７ｄ）、ｂ４までのピークが観察された。
異なる混合時間（３０ｍｓから１４４ｍｓまでの）を有する、一連の１Ｄ ＴＯＣＳＹを実施して、ピークを帰属させた。残基ｂに関して、広いピークは、カップリング定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）を提供しない。しかしながら、ｂ１の１Ｄ ＴＯＣＳＹ（１４４ｍｓの混合時間を有する）に関して、Ｈ６までの共鳴が観察できた（β−Ｇｌｃｐ（残基ｇ）のＨ１に対する１Ｄ ＴＯＣＳＹと類似する）。それ故、このような効率的な伝達は、β−グルコピラノシル配置に典型的な、大きいカップリング定数の表示であった。ｂ１−ｂ３およびｂ１−ｂ５ ＮＯＥｓ（図７ｋにおいて観察された）も、典型的なβアノマーの配置であった。Ｃ２およびＣ４に関する化学シフト（５５および５８ｐｐｍでの）は、アセトアミド基の表示であった（前記構造における７ＮＡｃ基の存在と一致する）（図６ａ）。化学シフト（Ｃ１に関して、７９ｐｐｍおよびＨ１ ５．１ｐｐｍ）は、β−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに関して発見されたものに類似する、Ｎ−連結型アノマーを表示した（２０）。残基ｂの化学シフトと２，４−ジアミノ−２，４，６−トリデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（他の構造において発見された）の化学シフトとの比較により、ＢａｃがＯ−３（唯一可能なグリコシド化部位）で連結したことが指摘された（３８−４０）。
残基ｂの絶対配置が、ＮＯＥｓによって取得された（バシロサミンを含有している別の構造に関して以前記載されたように）（３８）。１．１４ｐｐｍでのＣＨ_３共鳴（ｂ６）および１．９５ｐｐｍでのＮＡｃの間で観察された強いＮＯＥは、ＣＨ_３基（Ｃ６での）のＮＡＣ−ＣＨ_３基（Ｃ４での）に対する密接な近接性によるものであった。ＮＡｃ共鳴（１．９５ｐｐｍでの）は他のＮＡＣ共鳴から分離されていたので、それを選択的に励起できた。強いＮＯＥが、このＮＡｃ共鳴と残基ａのα−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ Ｈ１共鳴との間で観察された。これは（１−３）ｂ結合による（以下に示されるとおり）。残基ｂがＤ−配置（残基ｂのＣ４でのＮＡｃ基が、残基ａのアノマープロトンの近くに近接（３Å）する）を有する場合のみ、このＮＯＥが発生し得る。残基ｂがＬ−配置を有する場合、このＮＯＥは可能ではない（Ｈ１ａ／４ｂ−ＮＡｃプロトン間 距離が５Åよりも大きいので）。

シークエンスは、１Ｄ ＮＯＥＳＹ実験により決定された（図７）。強いｃ１−ｆ４ ＮＯＥ並びにより小さいｃ１−ｆ６およびｃ１−ｆ６’ ＮＯＥｓにより、ｃ（１−４）ｆ結合が確認された。強いｄ１−ｃ４ ＮＯＥ及びより小さいｄ１−ｃ６’により、ｄ（１−４）ｃシークエンスが指摘された。ｅ１−ａ４、ｆ１−ｅ４およびｇ１−ｆ３により、ｅ（１−４）ａ、ｆ（１−４）ｅおよびｇ（１−３）ｆ結合が確認された。ａ１−ｂ３ ＮＯＥ（図７ｌ）により、ａ−ｂシークエンス（ａ−ｂ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が確認された。前記構造を図６ａに示す。前記シークエンスは、結合炭素（ｔｈｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｃａｒｂｏｎｓ）に対して観察された、グリコシド化（ｇｌｙｃｏｓｉｄａｔｉｏｎ）シフトと一致する（上記を参照）。
実施例７ ｐｇｌＢ突然変異体のキャラクタリゼーション
ｐｇｌＢ突然変異体を、カセット突然変異誘発により構築した（図８）。
突然変異体細胞のグリシン抽出物により、タンパク質の免疫反応性における劇的な変化が実証された（２Ｄ−ＰＡＧＥと共にＨＳ：２セロタイピング血清でウエスタンブロット法を行うことによって）（図８ｂ、ｅ）。２Ｄゲル上の移動度および／または免疫反応性において変化を示した、タンパク質のいくつかを、マスフィンガープリント分析により同定した（表Ｉ）。タンパク質同定はＳＢＡレクチンアフィニティークロマトグラフィーにより同定されたものと一致し、このことによりＧａｌＮＡｃレクチンと反応性のタンパク質が、Ｐｇｌ経路によりグリコシル化されることに関する更なる証拠が提供される。ＳＢＡ反応性タンパク質の完全なセットは、本実験では観察されなかった。というのも前記実験は、全グリシン抽出物（ｗｈｏｌｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ）で且つ異なるｐＨ範囲で実施されたからである（即ち、図４および８は直接的に比較できない）。加えて、ＰＥＢ３は、ｐｇｌＢ突然変異体からイオン交換クロマトグラフィーで精製された（上記のとおり）。そして、質量分析法による分析により、タンパク質が前記グリカンを完全に欠損していることが示された（図２ｃ、ｄ）。
ｐｇｌＢ突然変異が糖タンパク質の糖鎖形成にのみ影響することを示すため、分析を前記突然変異体のリポオリゴ糖および莢膜多糖類に関して実施した。プロテイナーゼＫ消化物のデオキシコレートＰＡＧＥ（Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ−ＰＡＧＥ）および質量分析により、突然変異体ＬＯＳコア（ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ＬＯＳ ｃｏｒｅ）の質量が野生型のものと同一であったことが示された（結果示さず）。加えて、同一の莢膜の反復（ｃａｐｓｕｌａｒ ｒｅｐｅａｔｓ）は、野生型および同質遺伝子的な突然変異体（ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔ）の細胞の抽出物のデオキシコレートＰＡＧＥ上で可視であった。カプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）が不変（ｕｎａｌｔｅｒｅｄ）であったことを更に実証するために、我々は前記ポリ多糖をＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲにより試験した。
前記突然変異体のスペクトルは、野生型のものと比較して不変（ｕｎｃｈａｎｇｅｄ）であった（結果示さず）。
実施例８ 細胞全体におけるＮ連結型グリカンのＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲによる検出
完全な（ｉｎｔａｃｔ）カンピロバクター細胞のＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルにおいて（図９）、共通の^１Ｈ共鳴のセットが検出された。我々は、以前にＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８のＮ連結型グリカンの構造を、ＭＳおよびｎａｎｏ−ＮＭＲ技術を用いて、七糖類であると決定した（１３）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８、ＮＣＴＣ１１１６８ ｋｐｓＭ−、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１９およびＣ．ｃｏｌｉ ＨＳ：３０のＨＲ−ＭＡＳスペクトルにおいて観察できるように、精製されたＮ連結型グリカンのものと一致したアノマー共鳴が観察され、このことは本グリカンが全てに共通であったことを示唆している（図９）。ＮＣＴＣ１１１６８のスペクトルにおいて（図９ｂ）、Ｎ連結型グリカンに対応する共鳴は、ＣＰＳからの共鳴およびオーバーラップしたアノマー共鳴のいくつかと比較して、より低い強度であった。しかしながら、莢膜の共鳴がＮＣＴＣ１１１６８ ｋｐｓＭ突然変異体において排除される場合、それらは明瞭に区別できるだろう（図９ｃ）。共通のグリカン共鳴のＮ連結型グリカンに対する帰属（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、ＮＣＴＣ１１１６８ ｐｇｌＢ突然変異体（ここではタンパク質糖鎖形成が消失している）のスペクトルを試験することにより更に確認できた（３， １３）。予想どおり、Ｎ連結型グリカンの共鳴は、この突然変異体のＮＭＲスペクトルにおいて観察できなかった（図９ｆ）。
推定上の共通グリカン（ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｇｌｙｃａｎ）の同一性を、選択的なＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験を用いて更に確認した（図１０）。実験をＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１９細胞を用いて実施した（というのもＮ連結型グリカンのアノマー共鳴が明瞭に観察できたからである）。標準の選択的なＮＯＥＳＹ実験（ＨＳ：１９におけるａ１共鳴の選択的な照射で開始される）により、４．２１ｐｐｍでの共鳴との相関が確認された（図１０ａ）。この共鳴は、精製したグリコペプチドのａ１共鳴に関するＮＯＥＳＹスペクトルにおいて観察されたａ２共鳴と同じ化学シフトを有している（図１０ｂ）。
ＨＳ：１９と精製されたＮ連結型グリカンとの間の、他のアノマー共鳴に関するＮＯＥパターンの比較により、２セットの実験間の類似する一致が明瞭に示された（図１０ｃ−ｆ）。ＮＯＥ実験により、イントラおよびインター残基相関（ｉｎｔｒａ− ａｎｄ ｉｎｔｅｒ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）の双方が明らかにされた。この一致は、共通グリカンのシークエンスが、以前に報告された精製されたＮ連結型グリカンのものと同一であることを示唆している（１３）。選択的なＴＯＣＳＹ実験（ｇ１およびｆ２オーバーラップ共鳴を４．５ｐｐｍで照射する）により、ｇ２およびｆ３共鳴に対応する交差ピーク（ｃｒｏｓｓ ｐｅａｋｓ）が生じた（図１０ｇ）。それらの多重線形状（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ ｓｈａｐｅ）および化学シフトは、精製されたＮ連結型グリカンに関する、対応する実験において観察されたものと一致していた（図１０ｈ）。観察された他の共鳴は、より強いＣＰＳ共鳴の部分的な励起によるものであった。従って、細菌細胞で実施した選択照射実験により、共通のＮ連結型グリカンのインサイチューでの同一性が確認された。
多様なカンピロバクター種のＨＲ−ＭＡＳプロトンＮＭＲスペクトルにおけるＮ連結型グリカンの検出を、図１１に示す。Ｎ連結型グリカンの構造を、前記スペクトルの上部に示す。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８における精製されたＮ連結型グリカンのスペクトル（ａからｇとラベルされたアノマー共鳴を示し、垂直方向の点線で示した共通の共鳴を有している）を、比較のために示す。細胞全体（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ）の１０ｍｓ ＣＰＭＧフィルターを用いたＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルが示される；該細胞は、Ｃ．ｃｏｌｉ ＨＳ：３０（ＮＣＴＣ １２５３２、ブリュッセルのブタから単離された）、Ｃ．ｃｏｌｉ ４２３（アルバータのニワトリから単離された）およびＣ． ｆｅｔｕｓ ｓｓｐ． ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ Ｂｉｏｔｙｐｅ Ａ（ＮＣＴＣ １０３５４、雌ウシの膣粘液から分離された）である。ＨＯＤ共鳴（４．８ｐｐｍでの）は、飽和され（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）、デジタル方式でフィルターされた。
図１２は、高分解能マジック角スピニングＮＭＲ（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ ＮＭＲ）を塩化コバルトの有り無しで実施して、Ｎ連結型Ｐｇｌグリカンの表面暴露を実証した図である。各々におけるトップスペクトル（ｔｏｐ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、ＣｏＣｌ_２が添加されたサンプルからのものである。それらは、同じく処理された。トップスペクトルの信号雑音比（Ｓ／Ｎ）が、各々のボトムスペクトルのものよりも非常に低いことに注目すべきである。前記スペクトルはＴ２フィルターで効率的に取得されるので、それゆえＣｏＣｌ_２で広げられたラインは弱く出現する。ｋｓｐＭ突然変異体に関して、３．１５ｐｐｍに近いピークが非常に異なる相対強度を３ｐｐｍに近いピーク（ｓ）に対して呈したことに注目すべきである。３．１５ｐｐｍに近いピークに関する絶対的なＳ／Ｎ（ＣｏＣｌ_２の有り／無し）はほぼ同じであるが、一方で３ｐｐｍでのピークに対する絶対的なＳ／Ｎは非常に異なっている。
このことは次のこと、即ち、３．１５ｐｐｍでのピークは、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）である可能性が高く、ＣｏＣｌ_２に対して有効（ａｖａｉｌａｂｌｅ）ではないことを指摘している。このように、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）の残基は、強度が有意に減少している。
ＨＳ：１９の場合において、同じ観察が３．１５ｐｐｍ 対 ３ｐｐｍのピークに関してなされる。更に、〜２．７および〜２．８５ｐｐｍでのアスパラギン酸ピーク（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ＪＢＣ， ２００３を参照されたい）は、ＣｏＣｌ_２の存在下で消失する。このことにより外部表面または中間部（ｍｅｄｉｕｍ）に暴露される残基が広げられた（ｂｒｏａｄｅｎｅｄ）ことが確認される。Ｎ−連結型Ｐｇｌグリカン共鳴（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ＪＢＣ， ２００３および図９を参照されたい）は、ＣｏＣｌ_２の存在下で基本的に消失するので、このことはそれらも細胞表面に存在することを指摘している。
抗体およびワクチンの調製および投与
本発明によるグリカン部分に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）は、従来の方法で生産し得る。例えば、マウスモノクローナル抗体は、式Ｉ（フラグメントを含む）のグリカン（随意にオリゴペプチドまたはアミノ酸または免疫原性の抱合体に連結された）に対して産生し得る。別の戦略は、ラクダのリンパ球に由来し且つｄＡｂ抗体フラグメントを発現する能力を有する、クローン化された遺伝子の既存ライブラリー（ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）を、パン（ｐａｎ）して、選択した抗原に対して免疫原性活性を有しているフラグメントを発現する能力を有する遺伝子を同定および単離することである。このように単離された遺伝子（ｓ）は、バクテリオファージライブラリー（この遺伝子を含有するように修飾された）において発現されてもよい。係る抗原は、上記の七糖類または係る七糖類のフラグメント（随意に上記のとおりアミノ酸、オリゴペプチドまたは他の抱合体と連結される）を含んでいてもよい。この方法は、米国特許番号５，７５９，８０８（Ｃａｓｔｅｒｍａｎらに対する）に記載される。なお更なる戦略は、前記遺伝子を、選択された抗体またはフラグメントを発現させるために、適切な植物のゲノムに導入することである；これにより次に家畜の食物源として機能し得る。係る植物は、抗体または抗体フラグメントを発現するだろう、そして家畜により消費される際に、抗体またはフラグメントの適切な用量を動物に配送するだろう。
本発明のグリカンに特異的に結合する抗体またはフラグメントを産生するための様々な方法が存在することが理解される。係る抗体フラグメントを、完全抗体（ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と独立して（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ）調製または産生し得る。
また、抗体は、係る抗体を動物（上記の実施例において同定された抗原の適切な量を投与された）の血清から単離する伝統的な手段により調製し得る。
例えば、係る方法は、米国特許５，７５９，８０８（Ｃａｓｔｅｒｍａｎ等に対する）に記載されている。この参照文献は、独特のタイプの抗体（軽鎖を含有しない）を産生するために、ラクダ種の使用を記載している。
上記のような抗体またはフラグメントは、適切な担体と共にヒトまたは家畜に、受動免疫の形態で投与し得る。
家畜（例えば、家禽）に投与する場合、好適なアプローチは、抗体またはフラグメントを飼料（ｆｅｅｄ）または飲料水（ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ）と共に供給することである（濃縮物中に混合すること又は植物産物（抗体または抗体フラグメントを発現するために修飾された）を供給することのいずれであれ）。別々に提供される場合、抗体またはフラグメントを、適切な担体と共に濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）として、使用前に飼料または飲料に混合するために供給し得る。
家畜に投与される係る抗体またはフラグメントは家畜に存在するカンピロバクターと戦い、このようにして家畜を、動物生産物を食し且つ取り扱うヒトに伝播性の病原体の伝播から防御（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）し、同様に地下水を動物の排泄物から保護する。
また、これらの抗体およびフラグメントを使用して、ヒトまたは動物におけるカンピロバクター細菌の存在を、従来の手段により診断し得る。同様に、それらをアッセイのコンポーネントとして使用して、サンプル（例えば、水、土壌または肥料）におけるカンピロバクターの存在を決定し得る。
七糖類またはフラグメント（任意にアミノ酸、オリゴペプチドまたは他の適切な抱合体と連結された）を、ワクチンとして投与するための、適切なアジュバンドおよび免疫賦活薬（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）と組み合わせてもよい。このような目的に対して、１以上の適切な用量が、従来の様式で投与される。

参考文献

本明細書中で使用される略語は：
Ｂａｃ， バシロサミン， ２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコピラノース；
ｃａｐＬＣ−ＭＳ／ＭＳ， キャピラリー液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）；
ＣＥ， キャピラリー電気泳動法；
ＣＰＭＧ， Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ；
ＣＰＳ， 莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）；
ＣＯＳＹ， 相関分光法（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）；
ＤＩＰＳ−２， スカラー結合（ｓｃａｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）の存在下におけるデカップリング；
ＥＳＩ−ＭＳ， エレクトロスプレーイオン化 質量分析；
ＧＢＳ， ギラン−バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；
ＨＭＢＣ， 異核間の複数の結合にわたる相関（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）；
ＨＭＱＣ， 異核間の複数の量子にわたる相関（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）；
ＨＲ−ＭＡＳ， 高解像度マジック角スピニング（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）；
ＬＯＳ， リポオリゴ糖（ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）；
ＬＰＳ， リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）；
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ， マトリックス支援レーザー脱離 飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）；
ＭＡＳ， マジック角スピニング（ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）；
ＭＬＥＶ−１７， Ｍａｌｃｏｌｍ Ｌｅｖｉｔｔ’ｓカップリングサイクル；
ＭＳ−質量分析
ＭＳ／ＭＳ−タンデム型質量分析
ＮＯＥＳＹ， 核オーバーハウザー効果分光法；
ＰＶＤＦ， ポリビニリデン ジフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）；
ＳＢＡ， ダイズ凝集素（ｓｏｙｂｅａｎ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）；
ＴＯＣＳＹ， 全相関分光法（ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）；並びに
ＷＵＲＳＴ−２， 広帯域（ｗｉｄｅｂａｎｄ）， 均一割合（ｕｎｉｆｏｒｍ ｒａｔｅ）， およびスムース トランケーション（ｓｍｏｏｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）。
表Ｉ

^ａ Ｓ， Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒシークオンス；Ｔ， Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒシークオンス。
^ｂ ２ＤゲルのウエスタンブロットにおけるＳＢＡとの反応性。
^ｃ ２Ｄゲルでの変化したスポット位置および／または免疫反応性を有するタンパク質（ｐｇｌＢ突然変異体における）。Ｃｊ１０１８ｃ＆Ｃｊ１６４３は、ＳＢＡクロマトグラフィーで単離されなかった。
^ｄ ＣａｐＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察されたグリコペプチド。

^ｅ１−Ｄゲルから同定された。
表ＩＩ
Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ Ａｓｎ結合型 グリコペプチドの化学シフト（ｐｐｍ）。
６００ＭＨｚ（^１Ｈ） Ｄ_２０中、３５℃ ＨＯＤ ４．６７ｐｐｍで測定した。ｄ_Ｈ ２．２３ｐｐｍおよびｄｃ ３１．０７ｐｐｐｍでの外部アセトンメチル共鳴。ｄｃにおけるエラーは±０．２ｐｐｍ、またｄ_Ｈに関して±０．０２ｐｐｍ。ｄ_Ｈ２．０７、２．０５、２．０４、２．０３、２．０２、２．０２および１．９５ｐｐｍでの７つのＮＡｃ共鳴。２３．１−２３．４ｐｐｍでのＮＡｃ−ＣＨ_３ ｄｃ。１７５−１７６ｐｐｍでのＮＡｃ−ＣＯ ｄｃ。

ＰＥＢ３の精製および分析。ａ）グリシン抽出物のＭｏｎｏＳカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー。ＰＥＢ３含有フラクションは、Ｎ末端シークエンシングを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド（指摘のとおりプールし、透析し、凍結乾燥した）で行い同定された。ｂ）ＭｏｎｏＳカラム上で０〜０．２Ｍ 塩化ナトリウムのより浅い（ｓｈａｌｌｏｗｅｒ）勾配を用いた、プールした物質の再分画。 挿入図はフラクション３０および３１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；これらはＰＥＢ３含有フラクションであることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドのＮ末端シークエンシングにより同定された。 ＰＥＢ３の陽イオン交換クロマトグラフィー精製からのフラクションのＥＳＩ−ＭＳ分析。ａ）図１のフラクション３１のＥＳＩ−ＭＳ（透析後）、及びこのスペクトルから取得した、再構築された質量プロフィール（ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｐｒｏｆｉｌｅ）。ｂ）２５，４５４および２８，３７６Ｄａでのピークは、それぞれＰＥＢ３およびＰＥＢ４と同定された。更なる分析が、２６，８６１Ｄａでの第三のピークがグリコシル化ＰＥＢ３であることを同定するために必要であった。ｃ）ｐｇｌＢ突然変異体から同様に精製されたＰＥＢ３のＥＳＩ−ＭＳ、および再構築された質量プロフィール、ｄ）ＰＥＢ３のグリコシル化した形態の欠損を示している。 ＰＥＢ３トリプシングリコペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）のＭＳ／ＭＳ分析。ａ）ｍ／ｚ １０５７．９の二重にプロトン化したグリコペプチドイオンの産物イオン スペクトル。 オリゴ糖残基の連続的な欠損（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｌｏｓｓ）に由来するフラグメント イオンが、前記スペクトル中に示されている。ペプチド配列は、挿入図中に示される。ｂ）ｍ／ｚ ９３７．４でのグリコペプチドフラグメント イオンの二世代目の産物イオン（Ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ）のスペクトル。前記グリコペプチドは、それが質量分析計に進入した際に、フロントエンド衝突誘導解離（ｆｒｏｎｔ ｅｎｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（開口部電位＝１００Ｖ）によりフラグメンテーションされた。ｍ／ｚ ６０５．３でのｂ_３＋２２８フラグメント イオンの観察により、前記オリゴ糖がＮ−連結型であることが確認された。 ＳＢＡアフィニティークロマトグラフィー産物の２Ｄゲル。 タンパク質を２Ｄ−ＰＡＧＥ上で２つのｐＨ範囲、ａ）ｐＨ４−７およびｂ）ｐＨ６−１１に分離し、そして銀染色した。スポットの正体（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）（Ｃｊナンバリングにより示される）は、それらのトリプシン消化物の質量分析により決定された。同定されたタンパク質の完全なリストを、表Ｉに示す。 ＳＢＡアフィニティークロマトグラフィー産物のプロナーゼ消化物からのグリコペプチドの精製。ａ）プロナーゼ消化物のＢｉｏＧｅｌ Ｐ４ ２００メッシュ上でのサイズ排除クロマトグラフィー。ｂ）ＢｉｏＧｅｌ Ｐ２ファイングレード上でのＰ４からのプールした物質の再分画。両方のフラクションにおいて、糖タンパク質含有フラクション（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ− ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）がＭＳにより同定され、そしてプールされた（バーで指摘される）。ｃ）上記Ｂからのフラクション１０のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。ｍ／ｚ ７７０．５での二重にプロトン化したイオン（ＭＨ_２ ^２＋）は、Ａｓｎに連結した七糖類に対応する。いくつかの大きなイオンも観察され、それは第二のアミノ酸残基（ａ ｓｅｃｏｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）の付加によるものである。主要なグリカン含有イオン（ｇｌｙｃａｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｏｎｓ）のアミノ酸組成（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）は、前記スペクトル上に示される。 グリコペプチドの構造および^１Ｈスペクトル。ａ）前記グリコペプチドの推論上の構造（Ｄｅｄｕｃｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）。ｂ）Ｐ２カラム上での最終的な精製後のスペクトル（Ｄ_２０、３５℃、１ｍＭ重水素化型ＥＤＴＡ）。領域４．４から５．４ｐｐｍにおける、アノマー糖共鳴（ａｎｏｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ）がラベルされる。 前記グリコペプチドでの１Ｄ選択的なＮＭＲ実験（１Ｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＮＭＲ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）。ａ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ｇ１ｆ２， １５Ｈｚ， １４４ｍｓ）、ｂ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ｅ１ｆ１， ２５Ｈｚ， １４４ｍｓ）、ｃ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ｄ１， ２０Ｈｚ， １４４ｍｓ）ｍ、ｄ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ｂ６，５０Ｈｚ， ６６ｍｓ） ここで＊はペプチド共鳴、ｅ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ｂ１ｃ１， ４０Ｈｚ， １５１ｍｓ）、ｆ） １Ｄ ＴＯＣＳＹ（ａ１， ２５Ｈｚ， １４４ｍｓ）、ｇ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ｇ１ｆ２， １５Ｈｚ， ４００ｍｓ）、ｈ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ｆ１， １０Ｈｚ， ４００ｍｓ）、ｉ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ｅ１， １０Ｈｚ， ４００ｍｓ）、ｊ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ｄ１， ２０Ｈｚ， ４００ｍｓ）、ｋ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ｂ１ｃ１， ４０Ｈｚ， ４００ｍｓ）、Ｉ） １Ｄ ＮＯＥＳＹ（ａ１， ４０Ｈｚ， ４００ｍｓ）。 ｐｇｌ座位およびｐｇｌＢ突然変異体のキャラクタリゼーション。ａ）Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８の一般的なタンパク質糖鎖形成座位（ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｌｏｃｕｓ）の遺伝子模式図（Ｇｅｎｅ ｓｃｈｅｍａｔｉｃ）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．のｐｇｌ座位における遺伝子に相同な遺伝子は、灰色の矢印で示される。前記座位の下に示されるｐｇｌＢにおける突然変異は、ｐＥＡｐ２６を用いて構築された。ｂ）からｅ） Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの野生型および同質遺伝子的なｐｇｌＢ突然変異体の二次元ゲル分析。ｂ）およびｄ） ２Ｄゲルのコロイド性のクーマシー染色（それぞれ野生型および突然変異体の免疫ブロットの前）。ｃ）およびｅ） それぞれ野生型および突然変異体のＨＳ：２セロタイピング血清による、タンパク質の免疫検出。矢印は、ゲル移動（ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および／または免疫反応性の何れかにおいて差異を示したタンパク質を指摘している；これらはマスフィンガープリント法による同定のために摘出された。スポットの正体は、それらのＣｊナンバリングにより示される。分子量タンパク質マーカー（ｋＤａ）の質量は、左に示される。 多様なカンピロバクター株のＨＲ−ＭＡＳプロトンＮＭＲスペクトルにおけるＮ連結型グリカンの検出。Ｎ連結型グリカンの構造を、前記スペクトルの上部に示す。ａ）Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８における精製されたＮ連結型グリカンのスペクトルは、ａからｇとラベルされたアノマー共鳴を示している。ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲスペクトラを１０ｍｓのＣＰＭＧフィルターを用いて、次の細胞全体で測定した、ｂ） Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８、ｃ） Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８ ｋｐｓＭ−、ｄ） Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１９血清株、ｅ） Ｃ．ｃｏｌｉ ＨＳ：３０血清株、およびｆ） Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８ ｐｇｌＢ−。ｂ）からｅ）における共通の共鳴〔ａ）におけるものと比較した〕は、垂直方向の点線で示される。ＨＯＤ共鳴（４．８ｐｐｍでの）は、飽和され（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）、デジタル方式でフィルターされた。 Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１９細胞および精製されたＮ連結型グリカンの選択的なＮＭＲ実験の比較。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１９のＨＲ−ＭＡＳスペクトル（ａ）， ｃ）， ｅ）， ｇ） ）および精製されたＮ連結型グリカンのＮＭＲスペクトル（ｂ）， ｄ）， ｆ）， ｈ） ）。ａ）ＮＯＥＳＹ［ａ１， ９０Ｈｚ， ２５０ｍｓ］。ｂ）ＮＯＥＳＹ［ａ１， ４０Ｈｚ， ４００ｍｓ］。ｃ）ＮＯＥＳＹ［ｂ１ｃ１， ６０Ｈｚ， ２５０ｍｓ］。ｄ）ＮＯＥＳＹ［ｂ１ｃ１， ４０Ｈｚ， ４００ｍｓ］。ｅ） ＮＯＥＳＹ［ｄ１ｅ１ｆ１， ９０Ｈｚ， ２５０ｍｓ］。ｆ）ＮＯＥＳＹ［ｄ１， ２０Ｈｚ， ４００ｍｓ］およびＮＯＥＳＹ［ｅ１ｆ１， ２５Ｈｚ， ４００ｍｓ］の合計。ｇ）ＴＯＣＳＹ［ｇ１ｆ２， ７２Ｈｚ， ４７ｍｓ］。ｈ）ＴＯＣＳＹ［ｇ１ｆ２， １５Ｈｚ， ３３ｍｓ］。 Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８における精製されたＮ連結型グリカンのスペクトルが比較のために示される（ａからｇでラベルしたアノマー共鳴を示し、垂直方向の点線で示される共通の共鳴を有している）。 Ｎ−結合型Ｐｇｌグリカンの表面暴露を実証するための、高分解能マジック角スピニングＮＭＲ（塩化コバルトの有無で）。

Claims (32)

1. 式 ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−［Ｇｌｃ−β１，３］ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，３−Ｂａｃ，の七糖類を含む化合物であって、
   前記Ｂａｃは、２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコピラノース又はその免疫学的に活性なフラグメントである化合物。
2. アミノ酸またはオリゴペプチドと連結された、請求項１記載の化合物。
3. 前記アミノ酸がアスパラギンである、請求項２記載の化合物。
4. カンピロバクター細菌から単離および精製された糖タンパク質に由来する、請求項１、２または３の何れか１項に記載の化合物。
5. 請求項４記載の化合物であって、前記細菌が、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｆｅｔｕｓ ｓｓｐ． Ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓから選択される化合物。
6. 細菌の糖タンパク質のグリカン部分を検出する方法であって、前記サンプルを高分解能マジック角スピニング 核磁気共鳴（ＨＲ−ＭＡＳ−ＮＭＲ）分光学に供試することを含む方法。
7. 請求項１〜５の何れかに記載の化合物および生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
8. 請求項７記載の薬学的組成物であって、免疫原性の抱合体を更に含む薬学的組成物。
9. 請求項７または８記載の薬学的組成物であって、免疫賦活薬を更に含む薬学的組成物。
10. 請求項７から９の何れか１項に記載の薬学的組成物の、動物またはヒトにおけるワクチンとしての使用。
11. 式 ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−［Ｇｌｃ−β１，３］ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，４−ＧａｌＮＡｃ−ａ１，３−Ｂａｃ，のグリカンを含む化合物と特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合性フラグメントであって、
    前記Ｂａｃは、２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコピラノース又はその免疫学的に活性なフラグメントである、抗体または抗体の抗原結合性フラグメント。
12. 請求項１から６５の何れかに記載の化合物と特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合性フラグメント。
13. 請求項１から６５の何れか１項に記載の化合物と特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、ラクダから単離した遺伝子に由来する抗体または抗体の抗原結合性フラグメント。
14. 請求項１３記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記ラクダが、Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｍｕｓ、Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ、Ｌａｍａ ｐＰａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ ｇｇＧｌａｍａおよびＬａｍａ ｖＶｉｃｕｇｎａから選択される、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
15. 請求項１１から１４の何れか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント、および生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
16. 請求項１５記載の薬学的組成物の、ヒトまたは動物における治療薬としての使用。
17. カンピロバクター病原体の存在を家畜から減少させる方法であって、前記家畜に請求項１１から１５の何れか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含む方法。
18. 請求項１７記載の方法であって、前記投与が、前記家畜に前記抗体または抗原結合性フラグメントと混合した飼料を給餌することからなる方法。
19. 請求項１７または１８記載の方法であって、前記家畜が家禽である方法。
20. ヒトにおけるカンピロバクター病原体により生じるカンピロバクター感染を阻止する方法であって、前記病原体を家畜から請求項１７記載の方法により除去することを含む方法。
21. ヒトまたは動物におけるカンピロバクター病原体により生じる病気を治療する方法であって、請求項１１から１４の何れか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含む方法。
22. カンピロバクター病原体による地下水汚染を阻止する方法であって、前記病原体の存在を家畜から、請求項１７記載の方法により減少させることを含む方法。
23. 家畜のための動物飼料または飲料（ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄ ｏｒ ｄｒｉｎｋ）であって、請求項１１から１４の何れか１項に記載した、抗体または抗原結合性フラグメントを含む動物飼料または飲料。
24. 前記抗体またはフラグメントを含む添加物（ａｄｄｉｔｉｖｅ）を含む、請求項２３記載の飼料または飲料。
25. 請求項２３記載の飼料であって、修飾されて前記抗体またはフラグメントを発現するゲノムを含有している植物を含む飼料。
26. 請求項１１から１４の何れかに記載の抗体または抗体フラグメントを発現する能力を有する遺伝子を含有している植物ゲノム。
27. 請求項２６記載のゲノムを含有している植物細胞。
28. 請求項２７記載の細胞を含有している植物。
29. 前記遺伝子が、ラクダ遺伝子（ｃａｍｅｌｉｄ ｇｅｎｅｓ）のライブラリーを、請求項１から５に記載の化合物を含むプローブで、前記抗体フラグメントを発現する能力を有するラクダ遺伝子に関してパニングすることと、および前記遺伝子を植物ゲノムに導入することとにより取得される、請求項２６記載の植物ゲノム。
30. カンピロバクターの存在を動物またはヒトにおいて検出するための診断用キットであって、請求項１１〜１４の何れかに記載の抗体または抗体フラグメントを含む診断用キット（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ）。
31. カンピロバクターの存在をサンプルにおいて検出するための診断用キットであって、請求項１１〜１４の何れかに記載の抗体または抗体フラグメントを含む診断用キット（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ）。
32. 前記サンプルが水、土壌、および肥料から選択される、請求項３１記載のキット。

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