PT85828B - Profcesso de producao de uma linha de ceculas de mamifero, recombinante, linha de celulas assim obtida e processo de preparacao de um gene - Google Patents

Description

Processo de produção de uma linha de células de mamífero, recombinante, linha de células assim obtida e processo de preparação de um gene para que SMITHKLINE BECKMAN COHPORATION pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO

Processo de produção de uma linha de células de mamífero recombinante que compreende a co-transfecção de uma célula com um gene com interesse e um proto-oncogene. ϋ presente invento refere-se ainda à linha de células de mamífero recombinante assim obtida e ao processo de preparação de um produto de gene.

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-2MEMÚRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se a um proces lulas eucarióticas e linhas celulares transfectantes produzidas através delas.

Antecedentes do Invento

As células de mamíferos são os hospedeiros de eleição para a produção de muitos produtos de genes através de processos de ADN recombinante. Existem diversas técnicas para introduzir um gene com interesse em células de mamíferos. Estas incluem, duma maneira geral, co-transfecção do gene com interesse com um marcador de selecção. Tipicamente, o marcador de selecção é um gene que dá resistência a uma certa droga ou capacidade para utilizar um certo nutriente. As técnicas para produzir células possuindo várias cópias de um gene com interesse integrado no ADN cromossómico da célula hospedeira incluem amplificação por selecção da pressão. Por exemplo:

Axel e col., U.3. 4.399.216, revela a amplificação de células de ovário de hamster chinês (CHO) sensíveis ao metotrexato (MTX) por co-transfecção com um gene para a di-hidrofolato redutase (DHFR).

Wahl e col., PCT WO82-158, revelam um processo semelhante envolvendo um gene para resistência para N-(fosfonoacetil)-L-as partato (PALA), o gene CAD.

Tais técnicas de amplificação requerem passagens seriadas em concentrações cada vez maiores do agente selectivo num processo que pode necessitar meses para obter um elevado número de cópias. A selecção da pressão tem de ser mantida, geralmente, para assegurar a estabilidade da linha celular.

A amplificação de proto-oncogenes tem siao associada com transformação. Os oncogenes são genes que funcionam no processo de transformação de uma célula normal para um estado maligno.

Os proto-oncogenes são genes celulares normais que se tornam on cogénicos aquando de mutação ou expressão aberrante.

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Varmus, Ann. Rev. Genetics 13:553 (19θ4), revê oncogenes celulares. Na página 5θ7, Varmus revê factos estruturais de on cogenes amplificados, incluindo que os domínios amplificados po dem ser 100 a 1000 kb ou mais, sugerindo que os genes adjacentes podem ser co-amplifiçados.

DeFeo et al., Proc. Natl. Acad. 3ci. USA 78:3328 (19θ1), e Chang e col., Nature 297:479( 19&2), relatam que linhas celulares fibroblásticas de roedores estabelecidas, tal como NIH 313, podem ser transformadas por crescimento com baixa eficácia atra vês da introdução de genes ras de mamífero normais.

Pulciani e col., Molec. Cell. Biol. 5:2036 (1985), relatam que a amplificação do proto-oncogene H-ras está associado com a transformação maligna de células NIH 313·

Sumário do Invento

Este invento reside na elaboração de uma técnica para transfectar células e para seleccionar múltiplas cópias de trans fectantes, num só processo de transfecção e selecção. Mais especificamente, o invento é um processo para produzir uma linha celular de mamífero recombinante possuindo cópias múltiplas de um gene cora interesse 0 qual compreende: (1) co-introduzir numa célula de mamífero, que pode ser transformada por uma expres são aumentada de um proto-oncogene, o gene com interesse e o proto-oncogene e (2) seleccionar transfectantes que são transformados e que exprimem o gene com interesse.

Noutra concretização específica, o invento é representado por uma célula de mamífero recombinante preparada pelo processo deste invento.

Estas e outras concretizações são consideradas outros aspectos do mesmo invento que está completamente revelado abaixo.

Descrição Detalhada do Invento presente invento proporciona um meio de transfectar uma célula de mamífero com um gene com interesse e seleccionar rapidamente transfectantes possuindo múltiplas cópias integradas do gene com interesse. Através uo processo do invento, células

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recombinantes possuindo até 5^0 ou mais cópias do gene com interesse, podem ser produzidas numa questão de dias. Por comparação, a transfecção através de técnicas convencionais envolven do co-transfecção com um marcador de selecção, por exemplo, a resistência a DHFR ou a G418 ou a higromicina, resulta geralmente na integração inicial de não mais do que algumas cópias de um gene com interesse, por exemplo, 1 a 10. A amplificação para um número de cópias de gene comparáveis através de técnicas de amplificação com selecção de pressão, por exemplo, a técnica DHFR/MTX, pode necessitar vários meses para ser conseguida.

Além disso, o presente invento não requer necessariamente selec ção de pressão, embora não esteja evidentemente excluída a utilização de selecção de pressão como um complemento para este processo do invento.

Diversos proto-oncogenes conhecidos que funcionam como on cogenes aquando de expressão aumentada, podem ser usados neste invento. Estes incluem genes normais mos, sis, abl, myb, src e myc. São também conhecidas células que podem ser transformadas por cultura através ae transfecção com estes genes ou por expressão anormal, i.e., elevada, dos produtos de gene. Tais células são inibidas por contacto antes da transfecção num número elevado de cópias, e são transformadas após transfecção num ele vado número de cópias. A transformação é manifestada por uma alteração fenotípica observável, causada pela expressão do produto oncogene , tal como uma alteração no crescimento, na morfologia, ou nas propriedades bioquímicas, por exemplo, por imor talização, através da formação de focos em monocamadas, através de crescimento em ágar brando, crescimento em soro reduzido, ou através de tumorogenicidade in vivo.

proto-oncogene preferido é um gene ras normal. A família do gene ras inclui os genes H-ras, K-ras e IT-ras. Todos estes codificam para uma proteína transformante, p21, de 21 a 24 kilodaltons. Todos existem como proto-oncogenes, ou como genes normais, o que dá o fenotipo transformado aquando da expressão aumentada ou aquando da mutação. E especialmente preferido o gene H-ras normal.

Para co-transfecção com um gene H-ras normal, i.e. um óó Ó45

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proto-oncogene H-ras, é preferida uma linha celular de fibroblas to de ratazana inibida por contacto, especialmente a linha celular NIH 3T3· Outras linhas celulares úteis incluem a linha celular de rím normal de ratazana (NRK) (ATCC 1571), a linha ce lular de fibroblasto embrionário de ratazana 52 (REF-52) (McGlu re e col. Cold Spring Harbor Conferences on Cell Proliferation 9:345-364 (1932)) e outras linhas celulares inibidas por contacto.

gene com interesse pode ser qualquer sequência codifica dora operativamente ligada a funções reguladoras necessárias ou desejáveis para a transcrição e tradução da sequência codificadora. As funções reguladoras incluem, por exemplo, funções necessárias para ligação de ARN polimerase, iniciação de transcri ção, ligação e tradução do ribossoma, bem como outras funções tais como poliadenilação e sequências transcricionais aumentadoras. 0 promotor pode ser regulável de forma.que, por exemplo, a expressão não é induzida até apos a transfecçao e selecção dos clones transformados. 0 gene com interesse pode ser, por exemplo, um que codifica uma hormona, uma linfoquina ou outros agentes farmaceuticamente activos tais como soro ou proteína tissulares, por exemplo, activador do plasminogénio tissular e uroquinase.

A transfecçao é efectuada através de técnicas padrão. Ver, por exemplo, Wigler e col., Proc. ITatl. Acad. Sei. U3A 76: :1373 (1979) e Copeland e col., Cell 17:993 (1979). Estas técnicas incluem, por exemplo, precipitação por fosfato de cálcio, picnocitose induzida por DEAE-dextrano, electroporação e transfecção virai. As células são transfectadas com um gene ras nor mal e com um gene com interesse. As duas funções podem ser ligadas, i.e., transportadas na mesma molécula de ADN, ou podem estar não ligadas, i.e., em moléculas de ADN diferentes. Pode- se obter uma melhor eficiência quando ambos o gene com interesse e o proto-oncogene são transportados na mesma molécula de ADN.

Após a transfecçao e selecção das células transformadas, as células transformadas são clonadas através de técnicas padrão. As células transformadas estáveis são então selecciona66 645

3KB CASE 14365 das para serem analisadas. Os clones que exprimem elevados níveis do gene com interesse são seleccionados para nova cultura. Tais células são cultivadas e o proauto com interesse é recolhi do e isolado de acordo com técnicas padrão.

Ao efectuar o processo do invento, as células transformadas podem ser seleccionadas na transformação em que se prevê a mutação do gene normal para um oncogene, activo ou mutante. Tal facto, que ocorrerá a uma baixa frequência, no máximo, será prontamente identificada por falha das células transformadas em exprimir grandes quantidades do gene com interesse em relação a outras células transformadas ou através de análise genética ou bioquímica.

A modificação do processo ao invento pode ser feita para melhorar a eficiência ou para talhar uma linha celular que sirva um objectivo em particular. Por exemplo, o proto-oncogene pode ser colocado sob o controlo de um promotor regulável. Des ta forma, as células transformadas seleccionadas sob expressão óptima do proto-oncogene, pode ser revertida para um fenotipo normal desligando o promotor após a transfecção e selecção.

Em casos de transfecção com marcadores de selecção necessitando selecção de pressão, as sequências de ADN transfectadas podem ficar fixas no genoma com pouco rearranjo após mais de 100 duplicaçafes da população, sob selecção de pressão. Na ausên cia de selecção de pressão, as células nas quais as sequências transfectadas estão perdidas ou rearranjadas, acumulam-se a velocidades variáveis. Noutra mouificação deste invento, a co- introdução de um segundo marcador seleccionável, tal como resistência a 0418, proporciona uma alternativa parcial para a identificação de condições selectivas para o proto-oncogene aas células transformadas. Esta abordagem simplifica também o isolamento clonal das células transformadas pelo crescimento, eliminando as células normais removidas a partir da monocamada com focos. Porque este segundo marcador está só fisicamente-não funcionalmente-associado com as cópias múltiplas do proto-oncogene, ele não pode dar protecção contra perda específica do pro to-oncogene. Contudo, esta abordagem, pode manter uma população de células transfectadas mais homogénea. Embora a transfor

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mação por crescimento seja seleccionável pela formação de focos, não identificamos ainda as condições de manutenção que seleccionarão contra células não-transformadas que aparecem na cultura. Chiang e col., In Vitro Cell Devei. Biol. 21:707 (1985), define condições isentas de soro favorecendo 0 crescimento de células ΝΊΗ3Γ3 transformadas pelo gene ras T24, i.e., o oncogene mutante, em relação às próprias células TTIH3T3· Estas condições podem também ser aplicáveis a células transformadas por sobre-expressão do gene ras normal. Contudo, estas condições podem não ser selectivas contra células NIH 3T3 em cultura mista com as cé lulas transformadas com ras porque produtos segregados pelas cé lulas transformadas podem suportar o crescimento das células normais.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são ilustrativos, e não limitan tes do invento. As endonucleases de restrição e outras enzimas usadas na manipulação genética, foram obtidas a partir de fontes comerciais e foram usadas substancialmente de acordo com as instruções do fabricante. Excepto quando indicado em contrário, os processos foram efectuados substancialmente como descrito por Maniatis e col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Todas as temperaturas estão em °C.

A. Vectores: A sequência codificando H-ras humano incluindo sequências 3' não traduzidas de pUC69í7 (Gross e col. , Mol. Cell. Biol. 5:1015 (1985)_? foi inserida num vector de expressão sob o controlo transcricional do promotor precoce SV-40 para preparar um vector identificado por pMERcH-ras. 0 fragmento de pUC69’ era um fragmento de extremidade romba preparado por digestão com Sal I seguida por tratamento com nuclease de feijão mung (tipo soja) e depois digerido com ITdel seguido de enchimen to com ADN polimerase I (Klenov.).

pMERT24 foi preparado trocando a sequência val-12 mutante codificando H-ras pelo fragmento ras normal em pMERcHras. 0 oncogene mutante foi excisaco de pUCó9 (Gross e col., acima)

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-8- ✓ , V por digestão com HindIII e Apal.

pRas-neo e o pT24-neo foram preparados inserindo um fragmento BamHI de 1,5 kb contendo a cassete de resistência à neomicina (neoR) de pSV2neo (Southern e col., J. Molec. App. Genet. 1 : 327 (1982) em pMERcEras e pMERT24, respectivamente, com a mesma orientação transcripcional que os genes ras.

pTPA-25 é um vector possuindo uma sequência codificando o activador de plasminogenio tissular (tPA) numa cassete Sal I entre o promotor precoce SV 40 e os sinais de poliadenilação.

pDSPl.1TPA25BGH é um vector possuindo uma sequência codificando o activador de plasminogenio tissular (tPA) numa casse te Sal I sob controlo do promotor precoce SV 40 e da região de poliadenilação da hormona de crescimento bovino (BGH) inserida em pDSPl (Pfarr e col., ADN 4:461 (1985)). Uma região de poliadenilação da BGH é revelada, por exemplo, por Woychik e col., Biochem, 81:3944 (1984) e por Goodwin e col., EP-A-173, 552.

pRDEBTPA foi preparado substituindo o elemento promotor/ /aumentador SV-40 em pDSPl.1TPA25BGH por um vírus sarcoma Rous (RSV) LTR.

Plasmídeos pRasTPA: 0 pRasTPA-13 foi construído por inserção de uma cassete de transcrição tPA, num local Sal I de pMERcHras. A cassete tPA foi excisada a partir de pDSPl.1TPA25DBGH num fragmento Sal I de 3046 pb e pRas+PA38 foi construída de forma semelhante com uma cassete tPA Sal I com 2957 pb a partir de pRDZBTPA. Nestes vectores ras-TPA, os genes ras e tPA têm a mesma orientação transcricional.

B. Cultura Celular: Células NIH 3T3 foram mantidas em meio essenci al minimo de Dulbecco (DJíEM) (GIBCO, Grand Island, Nova Iorque)com 1,85 g/1 de NaHCO^, 100 unidades/ml de penicilina e estreptomicina e soro-Nu a 10% (Collaborative Research Cambridge, Massachusetts) em COg a 5%. As células NIH 3T3 foram semeadas a partir de lotes congelados e foram levadas até à subconfluência durante cerca de meses e foram depois rejeitadas. As células transformadas pelo gene ras foram seleccionadas e mantidas em a 5%.

C. Transfecçao de ADN: As transformações de ADN foram efectuadas da forma descrita por Wigler e col., acima, ou por Copeland e col., acima. 10 g de ADN precipitado com fosfato de cálcio fo-

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WK*' 4 <3' 't.Γ /

-9ram adicionados a cerca de 10 células HIH 3T3 numa placa de 60 mm. 0 meio foi alterado 5-3 horas depois. Para a selecção de focos, as células foram divididas 1:3 ^era placas de 100 mm em DMEM/soro-Nu a 5% cerca de 24 horas após a transfecção. Para a selecção dos resistentes G 413, as células foram divididas 1:10-40 em DMEM/soro-Nu a 10% contendo 600 jug/ml de G418. Os meios de selecção foram mudados todos os 3-4 dias.

D. Hibridação e Isolamento do Ácido Nucleico: A preparação do plasmídeo e do método ue mancha do ADN e do ADN celular foram efectuaaos como substancialmente descrito ou por Deen e col., J. Virol. 57:422 (1936), ae acordo com Maniatis e col., acima.

ARN celular foi isolado essencialmente como descrito por Ghirg win e col., Biochem. 13:5294 (1979)· As células presas na cultura foram lavadas com PBS e lisadas em tiocianato de guanidina tamponado com citrato, pH 7,0. 0 ARN celular foi então separado dos outros constituintes por centrifugação através de 5^7 M de CsGl durante 20 horas a 42°. Para as manchas de RNA, as ήπιο stras foram submetidas a electroforese em geles de formaldeído e foram transferidas para nitrocelulose. Os filtros foram pré-hibridados em 6 x SSPE (lx = 10 mM de NaH₂P0₄, 1 mM EDTA, 18o mM NaCl, pH 7,4), formamida a 5θ%, 200 pig/ml de ARN de levedura e 5 ^x solução de Denhardt (Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23:614 (1966)). As hibridações foram efectuadas durante 48 horas no mesmo tampão com a adição de capas marcadas coih ²P (10° cpm/ml;l-4 x 10 cpm/pg), preparados por tradução de entalhe. Os filtros foram então lavaaos três vezes durante 10 min em 2xSSPE-O,l% SD3 à temperatura ambiente e três vezes durante 10 min em O,lx;33PE-O,l% 3DS a 55°· Para uma quantificação das manchas de ADN, o ADN do plasmídeo clivado com a enzima de restrição adequada foi incluído em cada mancha. Para algumas manchas de ARN, plasmídeo ou fragmentos de codificação específicos foram submetidos a processe ae mancha por ranhura sobre tiras de nitrocelulose, e hibridaram em paralelo.

E. Preparação da proteína e análise por imunomancha: As células foram raspadas a partir de placas de cultura em fosfato

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tamponado salino (PBS), recolhidas por centrifugação e re-suspensas em TMET (10 mM Tris-HCl, pHÔ, 2 mM MgCl, 1 mM de tetracetato de etilenodiamina (EDTA), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,1 mM ue ditiotreitol (DTT), 1% Triton-X100^R - cerca de 5θ jul/10° células) a 0^o. A amostra foi centrifugada a 10.000 x g durante 1 min, a pelete foi rejeitada e o sobrenadante foi levado para 1% de dodecilssulfato de sódio (SDS). Uma parte desta amostra foi guardada para o ensaio de proteina pelo método (BCA) Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). 0 restante da amostra foi tornado 0,1 M em B-mercaptoetanol (B-ME), aquecido a 95° durante 5 min e armazenado a -20°.

Para a quantificação da proteína ras, 1-10 jug de proteína Triton-solubilizada foram submetidos a 3DS-PAGE e transferidos para nitrocelulose substancialmente como aescrito por Gross e col., Mol. Cell Biol. £:1015 (1985). Após transferência, o fil tro foi passado por água, seco ao ar, re-hidratado em água e bloqueado por incubação durante 30 min em PBS com 0,5% de gelatina (em autoclave) a 37°· Todas as etapas subsequentes foram efectuadas em PBS cora 0,2% de gelatina e 0,25% de Triton-X100 z*\ (PGT) a 37 · 0s filtros foram enxaguados em PGT, incubados com anticorpo específico para ras (40 jug/ml) durante 0,5 hr, lavado 3x durante 5 min em PGT, incubados cora proteina A marcada com (0,2 pCi/ml; 47 mCi/mg) durante 0,5 hr, lavados 4x durante 5 min em PGT, seco e exposto a película de raios-x com um ecrán intensificador a -70°.

F. Ensaios de Focos; 5 ^x 10^ células ΤΠΗ 3T3 foram adicionadas --— juntamente com 10 , 10 ou 10 células da linha a ser testada em placas de 100 mm, em 10 ml de DMEM/soro-Nu a 10%. Ho dia seguinte, a concentração do soro foi diminuída para 5% θ o meio foi alterado todos os 3-4 dias daí em diante. Foram contados focos nos dias 12 e 18. Para controlar a viabilidade e ligação das diversas linhas celulares, após tripsinização, 2 x 10^ células de cada linha foram adicionadas em duplicado a placas de 10 cm em 10 ml de DMEM/soro-Hu a 10%. As células foram tripsinizadas e contadas no dia seguinte. Os números diferem tanto

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como +/- 15$ da média.

G. Ensaios em Agar Brando; As células foram tripsinizadas, lavadas, re-suspensas em D^El/soro de vitelo a 20% e diluídas pa-

células foram misturados com 0,6 ml de agar a 0,5% em DÃlEM/soro a 10%. Amostras duplicadas de 0,2 ml desta suspensão foram adi cionadas a uma camada de base pré-formada de 0,2 ml de agar a 0,5%-DMEM/soro a 10% numa placa com 24 depósitos. Após 5 minutos à temperatura ambiente as células foram incubaoas a 37° em C0£ a 5% durante 1 semana. As colónias foram separadas por estir pes com 0,2 ml de violeta p-iodonitrotetrazolium a 0,05% em H^O e contadas num sistema de análise de imagem Omnicon. A viabili dade celular foi controlada como no ensaio de focos. A variação no número de células foi de +/- 6% da média.

H. Ensaios tPA: A actividade tPA foi quantificada espectrofotometricamente em relação a um padrão tPA purificado (American Diagnostica, Greenwich, Connecticut) usanuo o substrato 5-2251 (d-val-L-leu-L-lis-p-nitroanilido) CKabi Vitrum, Estocolmo, Suécia).

- Transfecção com H-ras e T24

Células NIH 3T3 foram transfectadas com quantidades variá veis dos vectores ras na forma de super espiral, excento quando indicado em contrário, e foram mantidas em soro-Nu a 5%· As células transformadas apareceram como focos de sobrecrescimento nas monocamadas aos dias 7-12 e foram contadas aos dias 15-20. Os resultados das três experiências estão apresentados no Quadro 1, abaixo. Nestas experiências, os plasmídeos H-ras foram 50-150 vezes menos eficientes na formação de focos que os plasmídeos T24. Os focos apareceram em primeiro lugar aos dias 7-8 cora plasmídeos T24 e aos dias 10-12 cora plasmídeos H-ras. Os focos individuais foram tripsinizados em cilindros de clonação, expandidos em meio contendo soro -NtPa 5% e depois subclonados nos mesmos meios.

Ca focos clonados foram caracterizados em relação ao seu conteúdo em ras ADN, ARN e proteína e em relação à sua capaci66 645

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dade de formação de focos em cultura mista com células NIH 3?3· Até à data, analisamos quatro clones transformadas pelo plasmídeo ras mutante ras p^vSRT24 e quatro clones transformados pel^ plasmídeo H-ras normal pNERcHras. 0 número de cónia e a organização dos mini-genes ras transfectados, foi examinado pela análise em mancha Southern· C número de genes ras potencialmente funcionais foi calculado por clivagem em locais de restrição ligando a unidade de transcrição (BamHI mais EcoRI) e comparado com o plasmídeo relacionado.

Os clones transformados pelo mini-gene ras mutante continham 2-3 cópias intactas por genomas ecuivalentes 2N de ADN. Em contraste, os clones transformados relo mini-gene ras normal continham 5C”74c> cúrias. Os resultados para todos os clones estão resumidos no Quadro II abaixo. A organização das sequências ras nos clones p”ERcHras foi de novo investigada ror clivagem com enzimas de restrição possuindo nenhum ou um só local no plasmídeo transfectante. Diversos fragmentos grandes foram observados com não-cortantes” indicando que o vector estava integrado no ADN genómico ou transportador. Em digestões com cortadores simples, o fragmento predominante c^-migrou com o vector linearizado. Em conjunto, estes resultados indicam que o rlasmídeo H-ras está integrado em sistemas conjugadas de comprimento indeterminado (tão pouco como duas unidades) em diversos locais em ADN transportador ou genómico. Sistemas conjugaf Zí.

dos de ADN introduzido de forma exógena tem sido observados na produção de ratos transgénicos e sugeriu-se que estas estruturas eram formadas por recombinação homóloga dentro da célula transfectada. Contudo, as sequências ras conjugadas nos nossos transformantes resultam provavelmente da resolução de moléculas multimétricas ou encadeadas nas nossas preparações de plasmídeos porque estas estruturas conjugadas não foram observadas em células transformadas com plasmídeos lineares.

A expressão dos mini-genes ras humanos nestes transformantes foi examinada tanto a nível de ARN como de proteína. Como previsto a partir da unidade de transcrição intacta observada acima, observou-se um ARN de 1,5 kb proeminente através de análise de mancha Northern nos transformantes ras normais.

TT-MQ.

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transcrição semelhante foi detectada a >w nível muito inferior nos clones T24. Não se observada™ transcrições H-ras de rato endógenas, provavelmente devido ao seu baixo nível e devido à homologia reduzida entre a sonda de mini-gene humana e a seqnên cia de H-ras de rato. Os níveis de ÁRN ras humano na mancha Northern fora™ quantificados em relação a quantidades conhecidas do ADN de plasmideo ras (Quadro II) . Os níveis de ARN todas as m.ulti-cópias de transformantes H-ras, são nelativamente elevados; ™as não são sempre proporcionais ao numero da cópia de ADN, particularmente em células co™ um nú^wero mnito elevado de genes. Assi™, pelo menos alguns dos mini-genes não são

Para medir os níveis de proteínas ras, as células fora™ li sadas com 1% triton X-100 e os núcleos fora™ removidos por centrifugação; essencial™ente, todo o p21 estava no sobrenadante. C p21 foi quantificado em relação ao recombinante puro p21 (Gross e col., acima) por análise de imunomancha. 0 nível de p21 variou 2o vezes entre estas linhas celulares e corre lacionon-se bem com o nível de AR ras (Cuadro II). Assi™, a eficiência transdutora do ARN ras é aproximadamente eouivalente em todas estas linhas celulares.

Estamos a caracterizar algumas das propriedades destes clp nes transformados por ras em cultura. De interesse particular são a estabilidade genómica dos transfectantes de multicópias e as condições de crescimento, que pode™ seleccionar a maior parte dos sob reprodutores eficazes de p21 de ent^e os clones transformados por H-ras. Inicialmente, testámos algumas das linhas de células transformadas e™ relação à sua capacidade de reproduzir o fenotipo em foco, cue foi a base para o seu isolamento. Assim, colocara™-se em placa lcá ou 10⁹ células juntamente com 2x10^ células NIH 3T3 e as culturas fora™ mantidas em soro-Nu a 5λ· Como nas transfecções originais, os focos apareceram mais rapidamente no clone T24. Surpreendentemente, os focos diferiam eficientemente de entre os clones. H-ras-2) 1 e T24-6 eram mais ou menos equivalentemente eficientes, enquanto que um segundo clone H-ras, 15—2, produziu um quarto desses focos. A actividade inferior ararente de 15-2 pode resultar do

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tempo mais prolongado para o aparecimento destes focos e da crie da concomitante da mnnocamada ΚΪΗ 3T3 ou da heterogeneidade celular na população de células 15-2. Examinámos subclones de algumas linhas celulares que eram revertantes planos, a baixa frequência que não tinham sequências ras transfectadas. Subclones transformados seleccionados ao acaso, tinham _o mesmr, numero de cópia que os clones parentes. As células transformadas pelo ensaio dos focos crescem em ágar brando. Por exemplo, os clones 2-1 e 6 foram positivos no ensaio com ágar suave e os clones 3T3 θ 5G5 foram negativos.

Cs elevados níveis de p21 nas células transformadas com H-ras está de acordo com relatórios anteriores de transformação de fibroblastos de roedores por sobre-expressão de genes ras normais. A sobre-expressão de p21 resulta da aquisição de múltiplas cópias de gene. Esta observação, associada com a baixa eficácia de transformação de pTERcHras em relação a pE^r>ri24, in dica que a formação de focos com plasmídeos H-ras identifica transfectantes com elevado poder de cópia raros dentro da população de células transfectadas. Cs resultados iniciais obtidos com os vectores duplamente seleccionáveis ppas-neo e pT24-neo sustentam esta conclusão. ^TTsando estes plasmídeos, comparámos as eficácias relativas de formação de focos e de resistência a G418 nas mesmas experiências de transfecção. Verificámos que estes vectores produzem colónias resistentes a G418 com uma efi cácia aproximadamente igual mas com a excepção de que o p^pas-neo foi cerca de 2C0 vezes menos eficaz que o pT24-neo na formação de focos (Quadro Σ'). Para melhor caracterização, focos ao acaso e colónias resistentes a G418 foram recolhidas de ambos os conjuntos de transfecções e foram expandidas sob resistência a G418. Ambos os focos e os clones resistentes a G418 obtidos com pT24-neo continham um baixo número de unidades de transcrição ras + neo-intactas - 2-7 cópias por genoma equivalente 2N (Quadro III). Além disso, cada um dos clones resistentes a pT24-neo G418 deu focos em cultura mista com células NIH 3T3· Concluímos que a expressão de uma ou de algumas cópias integradas de pT24-neo pode conferir resistência a G418 e produzir f*cos. Em contraste, para linhas celulares derivadas de pRas-neo,

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focos seleccionados ao acaso tinham uma media numérica superior de unidades de transcrição intactas que os clones resistentes a G418. Nestes focos, o número de cópias variou de 2c a 75 por genoma 2N enquanto que nas colónias resistentes a G418, o número de cópias variou de 2 a 55 (este último valor é superior ao dos clones resistentes a pT24-neo G418, provavelmente devido à concentração de ADN 5-50 vezes superior na transfecção pRas-neâ (Quadro III). Nenhum dos oito clones pRas-neo inicialmente se lecclonados por resistência a g418 formaram focos em cultura mista com células NIH 5T5, embora a morfologia da maior parte destes clones difira da das células parentes. Concluímos, por tanto, que os focos H-ras derivam dessa sub-população de células possuindo um elevado número de cópias do gene ras transfectado.

Finalmente, considerámos a possibilidade de que células contendo múltiplas cópias do H-ras são transformadas porque um ou mais destes genes mutaram para uma variante ras transformante. Os argumentos indirectos contra uma tal mutação são a elevada frequência de transformação H-ras em relação às velocidades de mutação previstas e a rigorosa correlação entre elevados níveis de p21 e transformação. Contudo, para abordar» esta possibilidade directamente, transfectaram-se células NIH 5T5 com ADN genómico de diversas linhas celulares transformadas por H-ras e T24-ras. Os ADN de células transformadas por genes T24-^as deram todos focos enquanto oue não se observaram nenhuns com ADN de células transformadas por H-ras (Quadro IV). Corno os transformantes T24- e A5-1 T24-ras têm só uma ou duas cópias de um gene ras transformante intacto, é pouco provável que os transformantes H-ras contenham sequer um só gene ras mutante.

Os resultados descritos demonstram aue os focos H-ras resultam da sobre-expressão da proteína H-ras. Assim, o elevado número de cópias do plasmídeo transfectado é seleccionado porque pode resultar numa elevada expressão de proteína. Para abordar este ponto mais directamente, compararam-se os níveis de proteína H-ras nos focos pRas-neo com os dos clones resistentes a g-418. o nível mais elevado de p21 num clone resisten

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te a G418 que não tinha focos de actividade foi de 0,5 ng/pg de proteína e o nível mais baixo num foco foi de 2 ng/jig (Quadro III)· As células NIH 5T5 em crescimento contém cerca de 0,1 ng do total de p21 (proteínas Η-, K-, e N-ras) por pg de proteínas. Assim, a transformação está rigorosamente correlacionada com um elevado nível de acumulação de p21.

2· Transfecção com H-ras e um Segundo Gene Nao-Seleccionado

Em experiências de co-transfecção introduziu-se um mini-gene tPA no plasmídeo tPA-25. 0 plasmídeo bacteriano pTTC18 foi também usado como uma sequência de ADN não seleccionada. Os vectores transportando o mini-gene H-ras, juntamente com cas setes tran serie ia nais tPA ou neo, foram criadas para examinar a introdução ligada de um gene não seleccionado. Os vectores ras-neo foram descritos acima. Nos vectores ras-tPA, a seauéncia codificando cADN de tPA foi inserida entre o promotor SV-40 precoce (pRas-tPA) ou o promotor RSV-LTR (pFas-RstPA) e 0 sinal de poliadenilação da hormona do crescimento bovino· Estas cassetes de transcrição de tPA foram colocadas a jusante do ras em p^,rERcHras com a mesma orientação transcriciohais que o ras.

Os vectores tPA-25 e pNERcHras foram co-transfectados a velocidades diferentes na presença de ADN transportados, só se obtiveram alguns focos nestas transfecções . Gomo ima primeira selecção em relação à secreção de tPA, os focos foram sequestra dos em cilindros de clonação e incubados durante a noite com meio fresco que foi ensaiado em relação à actividade TPA.

SÓ os focos de aparecimento mais rápido tinham actividade significativa e a caracterização posterior foi limitada a estes clones. Estes clones foram expandidos em cultura maciça sem subclonação e foram analisados para sequências de ADN e de ARN de ras e de tPA. Cada uma continha mais de 100 mini-genes ras potencionalmente funcionais e níveis ainda superiores de seanén cia tPA. Os níveis de ARN de ras e de tPA fora™ medidos por análise de mancha Northern em relação a ADN de plasmídeos padrão. A proporção ARN/ADN para tPA era mais de lo vezes inferior que para ras. Não se sabe se esta pronorção baixa para tPA resulta

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ar/ -' ·

-17- -X’/ de transcrição ineficaz ou de instabilidade do mARN de tPA. Contudo, em ambos os clones, o numero de cópias de tPA era 5~10 vezes superior ao de ras e uma baixa proporção ARN/ADN foi consistentemente observada para ras ou para tPA em células possuindo um elevado número de cópias do gene respectivo (notar clones 14.2, 15.2, Bl-5, B2A e 38f2 no Quadro II).

Para comparar os níveis de tPA produzido numa base por célula com outras linhas celulares, dois destes clones, e B₂, foram em primeiro lugar, subclonados. Para ensaiar em relação à produção de tPA, as células foram colocadas em placa, em duplicado, a densidades subconfluentes e incubadas durante dois dias com meio padrão. 0 meio e um extracto celular de uma placa foram testados em relação à actividade de tPA enquanto o número de células foi determinado a partir da segunda placa, os resultados para um subclone de B₂ que contém cerca de I50 cópias do minigene tPA, estão apresentados no Quadro II. Estes clones segregam cerca de 50 vezes menos tPA que uma linha celular de ovário de hamster chinês optimlzada possuindo cerca de 4oO cópias de um minigene tPA amplificado. A ausência de actividade tPA no extracto celular indica que o tPA não se acumula intracelularmente.

Nas co-transfecções acima, a proporção molecular dos plasmídeos tPA e ras foi de 2-4 para 1 e em cada linha celular, o núme-o de cópias de tPA era superior na de ras. Para examinar melhor o efeito da proporção de plasmídeos nas co-transfecções, pRAS-neo foi co-transfectado com o plasmídeo bacterian.o pi^T0-18 com proporções entre 1:2 e 1:100· Diversos focos individuais de cada uma destas transfecções foram isolados e os níveis de sequência de ADN de ras e de puc-18 foram quantificados por aná lise em mancha. De uma maneira geral, a proporção de sequência em cada grupo de transfectantes era paralela, mas não era idêntica a, em relação à admissão dos dois plasmídeos. Assim, o nú mero de cópias de um gene não ligado pode variar em células co-transfectadas alterando a sua proporção para o gene ras. Note-se contudo, que números muito elevados de genes não resultaram numa elevação correspondente de níveis estáveis de ARN (Quadro II)· Não se sabe se esta eficácia reduzida em elevado número

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de cópias reflecte limitações impostas pelas células ou pela metodologia, sabe-se, por exemplo, que certas linhas celulares são incapazes de exprimir grandes.quantidades de certas proteínas. 0 que é importante, contudo, é ene usando o método do invento, um grande número de genes foram integrados num só ciclo de transfecção e selecção.

T^Tm mini-gene tPA conduzido por um promotor SV4O ou RSV foi inserido no vector de expressão p^vERcHras com a mesma orientação transcricional (ver aoima). Estes vectores foram transfectados para células NIH 5T5 e os focos resultantes foram seleccionados em relação à secreção de tPA. vários dos focos de crescimento mais rápido mostraram actividade significativa e foram subclonados e expandidos. Diversas destas linhas foram analisadas em relação a ADN, ARN e proteína de ras e de tPA como acima descrito. Estes resultados estão resumidos no Quadro II. Duas destas linhas segregaram níveis wuito mais elevados de tPA que os observados para as células co-transformadas, embora sejam níveis ainda inferiores aos de linha de células GHO optimizada.

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-19Quadro I - Eficácia de transformação

Plasmídeo	Quantidade (pg)	Foc os	G418 colonias	Eficácia
Foc os	G418r
Exp. 1
pYERcHras	0,1	4o		400
PVERT24	0;02	1200		60.000
Exp · 2'
pVERcHras	5	240		48
PFERT24	0;l	225		2300
Exp. 3
pRas-neo	0,5	6	620	12	1200
pT2 4-n eo	0,1	300	300	3000	3000

a) A quantidade indicada de plasmídeo foi precioitada juntamente com 10 /ig de ADN de NIH 3T3 e adicionado a cerca de 10 células NIH 3T3 numa placa de cultura de 6o mm.

b) Numero total de focos ou de colónias por placa transfeç tada. Este valor é uma média de duas placas transfectadas na Exp.l; nos outros ensaios só uma placa foi transfectada. As transfeçções de controlo só com ADN de 3T3 não deram quaisquer focos.

c) 0 número de focos ou de colónias G418^r/pg ADN/10^ células. As transfecções de ADF na Exo 1 foram efectuadas como des crlto por Wigler e col., e na Exp 2 e 3 como descrito por Copeland e col·, A eficácia de transformação 10 vezes superior na Exp 1 pode ter resultado desta diferença processual.

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SKB CASE 14J65

-2βQuadro II - Resnwo da Expressão de ras e de TPA

Linha	ras
Pro-	Pro-
celn-			teí-	ARN/	•bei-
lar	ADN5	ARNb	nac	/ADNd	nae
	(có-	(pg/	(ng/		AFN
	st pia )	/pg)	/pg)

TPA

	Proteí-	Pro teí
ADNa	ARNb	f nax		nag~
(có-	Pg/	(pg/cé-		ARN
pia^)	/pg	lnl^la

H-ras

2,1	50	5	8,0	0,1	1,6
14,2	210	2,5	2,7	0,01	1,1
15,2	74o	3	2 ,0	0,004	1,7
1B	40	2	5,3	0,08	1,7
T24
ras
6	2	0,1	0,2	0,05n	2h
R1	2		0,3
R2	3		0,4
R3	2		0,2
3T3	-	-	0,1
Co-trans-
f eccão
TP-A^eso ras
Al	60
Bl-5	50	2,5	3,3	0,05	1,3
B2A	40	1/5	2,0	0,04	1,3
Transfec-
ção ligada
de TPA/pe-
so ras
TPA(SV4o)
13f3	4o	1,5	7	0,04	4,7
13f8	80	2	7	0,02	5,5
13Γ9	60	1,5	3	0,03	2,0
13fl3	6o	2	4	0,03	2,0
TPA(RSV)
38f2	37o	2,5	6	0,007	2,4

350

350	1,0		0,003
150	0,5	0,15	0,003	0,03
4o	0,9	1,1	0,03	1,2
80	1,0	0,28	0,01	0,3
6o	0,9	0,60	0,02	0,7
60	0,8	0,14	0,01	0,2
370	0/9	0,19	0,002	0,2

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SKB CASE 34565 cf--

a) Numero de cópias da unidade de transcrição intacta ror equivalentes de genoma 2N calculado em relação a quantidades conhecidas de plasmídeo manchas de ADN.

b) pg de ARN de ras ou de TPA por pg de ARN celular total, As quantidades de ARN ae ras e de TPA foram calculadas a rartir de manchas Northern (1,5 kD para ras e 4,0 kD para TPA) em relação a quantidades conhecidas de ADN de plasmídeo manchado em ranhuras sobre um filtro paralelo.

c) ng de p21 ror pg do total de proteínas solúveis em Triton X-100 como medido a partir de imunomancha com veco^binantes puros H-ras p21 como padrão.

d) Proporção de (pg de ARN de rag/mg de ARN total) para (cópias de ADN/2N) ou valores correspondentes para TPA.

e) Proporção de (ngp21/pg proteína) para (pg de ARN de ras/mg de ARN total).

f) A cuantidade total de actividade TPA no melo, em relação a cuantidades conhecidas de TPA purificado, ar»ós dois dias de incubação divididos pelo número de células e dias de incubação.

g) Proporção de actividade (pg/célula/dia) para (pg de ARN de TPA/mg de ARN total) .

h) estas proporções são muito aproximadas devido aos níveis muito baixos de ARN de ras e de proteína e devido à contribuição provável significativa de proteínas ras endógenas.

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SKB OASE 14J65

-22Quadro III

Resumo da Expressão de ras em transformantes ras/neo

Linha celular	ADNC (cónias/2N)	p21d (ng/pg)
Transformantes T24 ras/neoa
focos: F1	6	0,5
F2	7
G418r G1	2	0,2
G2	2
transformantes H-ras/neo
focos: SF1	75
SF2	75	2 ,0
G418r: 5G2	30	0,2
5g4	3	0,2
5G5	30	0,5
O,5G4	15	0,2
O,5G5	2	0,2
O,5G6	30	0,3
- a 106 células 3T3 foram	transfectadas	cow 0,1 pg de pT24·
-neo mais lo pg de ADN	3T3
- b 106 células 3T3 foram	transfectadas	com 0,5 ou 5 pg de
pRas-neo mais lo pg de	ADN 3T3. Os	clones ou focos de·
signados por 5G- ou 5F	eram da tran,	sfecção de 5 pg ® o

marcados 0,5 & eram da transfecção 0,5 pg

- c Ver nota inferior a no Quadro II

- d Ver nota c no Quadro II

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SKB CASE 14365

-23Quad.ro IV - Transfecções cora ADN genómico

	Linha celular	ras	T-, d Focos	0-418 d	Eficácia0
		Copia		Colónias	Focos	G418r
	H-ras 2,Ia	50	0		0
	Ras-neo 5F2D	75	0	117	0	25
	T24-6a	2	7	0	0,2	-
	T24-neo Fl^	6	10	10	0,3	2,2
k	A5-lc	2	61
	5T3	—	0		0

a Descrito no Quadro II b Descrito no Quadro III c célula NIH 3T3 transformada pelo gene T24 ras genómico. Esta linha celular é ura transfomante secundário de NIH -3T3 derivado da transformação por ADN genómico da linha celular do carcinoma da bexiga T24.

d 20 pg de ADN genómico da linha celular indicada foram precipitados e adicionados em duplicado a Ιοθ células NIH-3T3 numa placa de cultura de 6o ^T1ra dia após a transfecção, cada placa foi dividida para três placas de 100 rara. Para medir a resistência a G418, 1/9 da cultura, removido durante a divisão celular foi cul tivada em 600 pg/ml de G418. As células transfectadas com ADN T24-6, que não transporta um gene neo, foram usadas como nm controlo negativo. Os focos e as colónias G 418¹° foram contados no dia 23 e sã© dados como números totais para todas as placas.

e Ntímero de focos ou colónias G418^r por pg de ADN

A descrição e exemplos acima reveIamcompletagente este invento incluindo as suas concretizações preferidas. Este invento, contudo não está limitado às construções anui reveladas mas, pelo contrário, abrange todas as modificações e variantes dentro do alcance das reivindicações que se seguem.

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SKB CASE 14565

Claims (4)

15. -Processo para a produção de uma linha celular de mamífero recombinante possuindo múltiplas cópias de u^w pene com interesse, caracterizado pelo facto de compreender:

(1) co-transfecção de uma célula de mamífero, que pode ser transformada por expressão aumentada de um proto-oncogene, com o gene em questão e com o proto-oncogene e (2) selecção de transfectantes que são transformados e que exnrimeri o gene com interesse.

2 5. - Processo, de acordo oom a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do proto-oncogene ser um oncogene H-ras, N-ras ou K-ras normal.

5 5. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do proto-oncogene ser um gene H-ras normal.

4 5. - Processo, de acordo co* a reivindicação 2, caracterizado pelo facto da célula a ser transfectada ser uma célula f ibroblástica de ratazana inibida por contacto.

52. - Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto da célula a ser transfectada ser uma célula NIH 5T5·

65. - Linha de células de mamífero recombinante preparada a partir do nrncesso da reivindicação 1.

7 5. - Processo para a preparação de um produto de gene com interesse caracterizado pelo facto de compreender cultivar a linha celular da reivindicação 6 e isolar e purificar o produto de gene com interesse a partir dela.

Lisboa, 21 SET. 1987

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