PT85752B

PT85752B - Processo para provocar a sobreproducao de l-fenilalanina em microorganismos e para a producao do gene de transaminase tyr b

Info

Publication number: PT85752B
Application number: PT85752A
Authority: PT
Inventors: Hans-Matthias Deger; Johann Then; Gerhard Wohner; Martyn Robinson; Andrew Doherty; Udiger Marquatdt
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-18
Publication date: 1990-08-31
Also published as: PT85752A; DE3631829A1; JP2760788B2; FI874058A; JP2760973B2; FI874058A0; IE872530L; ATE92104T1; CA1341096C; DE3786728D1; JPS6398390A; DK490187A; CN87106923A; JPH09107966A; ZA877031B; US5091314A; EP0260597B1; EP0260597A3; DK490187D0; KR880004090A

Description

A última operação da sintese ae novo da fenilalanina consiste na eliminação de piruvato de fenilo com auxílio de transiminase. pão obstante várias transaminases estarem em posição de transaminarem piruvato de fenilo com obtenção de fenilalanina, esta função é realizada principalmente nas células pela assim chamada transaminase aromática. A abreviatura genética para o gene de transaminase aromática em Ξ. co li é tyrb (Umbarger, Ann. Rev. piochemistry 47 (1978), 333-606)· • No caso de E. coli K12, sabe-se exactamente a posição do gene

no cromossoma das bactérias e o produto genético tem o número E. C. 2.6.1.5 (Bachmann e col., Microbiological Reviev?s 44 (1980), 1 - 56).

No pedido de patente Europeia

116 860, descrevesse o isolamento do gene tyrb do microrganis mo E. coli K12 assim como a clonagem deste gene de aminotransfarase para um plasmídio de cópias múltiplas. 0 plasmídio clona do é adicionado de novo à estirpe, a partir da qual o gene foi originalmente isolado, com o resultado de a produção de L-fenilalanina ter sido aumentada nesta estirpe para cerca de 11$.

A Requerente descobriu agora surpreendentemente que o isolamento do gene tyrb existente em R, coli ATCC 11505 e a sua clonagem num plasmídio de múltiplas cópias, depois da transformação de microrganismos com este plasmídeo, especialmente da estirpe de partida, tem como resultado um rendimento dez vezes maior da L-fenilalanina.

A invenção refere-se, portanto, a;

1. um elemento extracromossómico replicante que contém o gene tyr B isolado de R. coli ATCC 11505;

2. a utilização do elemento extracromossónico mencionado em 1) para a síntese da aminotransferase aromática;

5. a utilização do elemento extracromossómico mencionado em 1) para a sobreprodução de l-fenilalanina em microrganismos, que se caracteriza pelo facto de

a) se introduzir o elemento extracromossómico num microrganismo ;

b) se exprimir o gene tyr B neste microrganismo e sintetizar-se uma transaminase aromática activa e

c) a transaminase realizar a aminação de piruvato de feni- lo.

A presente invenção é esclarecida por menorizadamente na seguinte descrição e definida nas Reivindicações da Patente.

Além do tipo espontâneo E. coli ATCC 11505, podem também utilizar-se os seus variantes e mutantes. por exemplo, pode também empregar-se uma estirpe obtida por mu- * tação, de acordo com métodos conhecidos (E. Adelberg e col., • Biochem. Biophys. Res. Comm., 18, 788 (1965)), que foi seleccio

nada relativamente à sobreprodução de 1-fenilalanina. A aminotransferase aromática proveniente de E. coli ATOO 11305 codifica o gene tyr B, sintetiza, entre outros, a L-fenilalanina do piruvato de fenilo, em que um grupo amino é transferido do glutamato. Com o auxílio da transaminase aromática, podem sintetizar-se, além da tirosina, glutamato, aspartato e leucina. os aminoácidos isoleucina, valina, leucina, fenilalamina e ácido glutâmico são formados com o auxílio de uma transaminase, para os quais codifica o gene ilvE, enquanto os aminoácidos aspartato, glutamato, fenilalanina e tirosina são sintetizados para uma transaminase, para cuja expressão é responsável o gene aspC. Sobretudo, cada uma das mencionadas transaminases possui também uma ligeira aetividade na síntese de aminoácidos que são ordenados de maneira específica por uma das duas outras transaminases.

Para aumentar ainda mais a síntese de L-fenilalanina, clona-se o gene TyrB, que codifica a aminotrans ferase aromática, consegue-se isto por isolamento do DNA de

E. coli ATCC 11303. Depois da digestão parcial do DITA, os fragmentos obtidos que estão incluídos num intervalo de tamanhos de 20 a 30 kb, são ligados num cosmídio com um replicão que arranja um outro intervalo do hospedeiro e é embalado na cabeça do fago lambda. De preferência, utiliza-se o cosmídio pIMS 6026. 0 cosmídio pIMS 6026 deriva do cosmídio pLAFR 1 (ATCC 37167), de modo que no sítio único de corte com EcoRI do cosmídio pLAFR 1 foi clonado o fragmento Eco Ri (pharmacia, Upsala, Suécia), no qual se liga o gene de resistência à canamicina do transposao Tn 903. Por digestão com BamHI e subsequente religação, pode-se deletar a maior parte do fragmento Eco RI usual no comércio, de modo que, como inserção, se mantém uma curta peça DITA na qual um sítio de corte com BamHI é flanqueado por dois sítios de cor te com Eco RI. Este sítio de corte com BamHI, que não existe no cosmídio pLAFR 1, pode ser utilizado para a clonagem. por incubação dos cosmídios empacotados com uma suspensão de E. coli DG 30 correspondentemente previamente obtida encerram-se os cosnídios nos microrganismos. 0 microrganismo E. coli DG 30 tem * ima deficiência nas três transaminases aspe, ilvE e tyrB. A es- • tirpe desenvolve-se, portanto, em meio completo, na realidade

sem problemas, mas no desenvolvimento em meio mínimo abastece-se com diferentes aminoácidos do exterior, porque ela própria não os pode sintetizar.

Mediante apropriada escolha do meio, pode investigar-se, com o auxílio da estirpe, se um dos DNA exteriores pode complementar o defeito cromossómico para uma determinada transaminase. Detecta«se a existência do gene tyrB por desenvolvimento do E. coli DG- 30 num meio mínimo isento de tirosina. Neste meio, só se podem desenvolver clonas que, por recebimento de DITA que contém aspC, tyrB ou ilvE, o qual deriva originalmente da estirpe E. coli ATCC 11303, podem complementar o seu defeito cromossómico para a síntese da tirosina. As três transaminases que são codificadas pelos genes aspo, tyrB e ilvE diferenciam-se pela sua especificidade do substracto, muito embora todos três estejam em posição de formar tirosina.

A transaminase aromática que é codifi cada pelo gene tyrB pode, por exemplo, não formar isoleucina a partir dos seus precursores de cetona, mas porventura, sintetizar leucina com bons rendimentos a partir dos correspondentes compostos prévios contendo cetona. A transaminase que é codifi» cada pelo gene aspe não pode nem formar isoleucina nem ser usada eficientemente na reacção para a formação de leucina.

De maneira correspondente, os clones individuais podem diferenciar-se por desenvolvimento num meio mínimo que é suplementado relativamente a um aminoácido caracte rístico para o correspondente gene com os aminoácidos essenciais para o metabolismo das substânnias, relativamente à transaminase contida. Desta maneira, seleccionam-se cloh.es da estirpe DG-30, que contêm o gene tyrB.

Deve então ensaiar-se se os clones possuem o gene tyrB também activo. para esse efeito, isolam-se os DNA do plasmídio dos clones. 0 isolamento a partir da estirpe DG 30 topa, no entanto, apenas com dificuldades. Na verdade, pode obter-se DNA-plasmídio embora apenas com pequenos rendimen tos. Depois da minílise, transforma-se uma estirpe de E. colis com os DNA do cosmídio, a partir dos clones interessantes, a pai * tir dos quais se pode re-isolar o DNA inserido com bons rendi2_nentos. Para o efeito, é especialmente apropriado o microrganis-

mo E. coli DH 1 (ATCC 33849).

Na fase seguinte, liga-se o DNA do cosmídio re-isolado com um vector de elevado número de cópias. A partir da carta de genes cromossómica da estirpe E. coli K12, sabe-se que o gene tyrB está localizado num fragmento Ciai. Com preende-se, portanto, a possiblidade de este ser também o caso em E. coli ATCC 11303· Por este motivo, emprega-se como vector, de preferência, um plasmídio de multicópias, com uma posição de corte Ciai* em especial, prefere-se o pAT 153 conhecido na sua sequência (E. b. Winnacker, Gene und Klone, VCH-Verlagsgesellschaft, Weinheim).

cosmídio-DNA e o vector são digeridos completamente com a enzima de restrição Ciai. Os dois DNA são reunidos, ligados um com o outro e as células competentes dum microrganismo hospedeiro transformadas com ela, no qual a produção de fenilalanina se pretende ser aumentada. De preferên cia, empregam-se Enterobactérias, especialmente, E. coli, de que se prefere de maneira muito especial E. coli ATCC 11303, assim como os seus mutantes e variantes. Seleccionam-se as colónias resistentes a Ampicilina e ensaiam-se com base na inibição de marcadores por replica plating sobre placas de tetraciclina, relativamente à sua incorporação. A partir das correspondentes colónias, isola-se plasmídio-DNA por minílise e ensaia-se por digestão completa com a enzima de restrição Ciai a existência de fragmentos de Ciai no vector. Por análise de restrição, garante-se que todos os fragmentos de Ciai contidos no corte original de DNA foram subclonados desta maneira. Einalmente, ensaiam-se os clones que respectivamente contêm um destes fragmentos Ciai definidos por meio do ensaio de aspartato-piruvato de fenilo-amino^ransferase (AP?AT) relativamente à actividade da transaminase aromática, ou seja, o produto genético tyrB. Proceiendo desta maneira, pode conseguir-se um aumento de actividade 3e iyrB de um factor de 5 até 10. Por electroforese em gel de igarose, pode mostrar-se que, no vector da estirpe hospedeira, está contido um fragmento Ciai, com o tamanho de 2,7 ED.

Nos seguintes Exemplos, descreve-se pormenorizadamente a invenção. As indicações das percentagens, se não se fizer outra referência, referem-se a peso.

Exemplo 1

Isolamento e Digestão do Çosmídio pII.íS 6o26, a partir de E. coli para o isolamento do çosmídio plMS 6o26, realizou-se ou uma lise de acordo com o método referido por Humphreys e col. (Biochem. Biophys. Acta 383, 457 - 463 (1975)) ou uma line alcalina, de acordo com Birnboim e Doly (iTucleic Acids Res., 7 : 151), numa escala décupla. Em ambos os casos, purificou-se o plasmídio-DITA, pelo menos uma vez, por centrifugação em gradiente de densidade de CsCl/Etpr.

çosmídio plMS 6026 foi digerido com pletamente com a enzima de restrição pamHI, tendo-se procedido de acordo com as indicações do fabricante, new England piolabs, para verificar se esta digestão estava ou não completa, colocou -se uma parte alíquota da mistura de restrição num gel de agaro se a 0,8/ e submeteu-se a electroforese. 0 aparecimento de apenas uma banda depois do tingimento com brometo de etídio e irra diação com luz ultravioleta de comprimento de onda curto (254 nm), serviu como indicação de uma digestão completa.

Do cosmídio-DITA digerido eliminou-se a enzima de restrição por fenolização, precipitou-se o DITA por meio de etanol, lavou-se com etanol a 70/ e, depois de se secar sob vácuo, retomou-se num volume apropriado de tampão TE (10 mH 3e Tris; 1 mM de EDTA, pH 8,0). λ escolha, realizou-se o tratanento com fosfatase alcalina, de acordo com as indicações do fabricante, Boehringer Mannheim. Depois da adição de um microlitro de fosfatase alcalina (CIP), incubou-se a 37° 0 durante trinta minutos, eliminou-se a enzima da mistura reaccional por fenolização e purificou-se o DITA, como se descreveu acima. Por fim, suspendeu-se em tampão TE.

Exemplo 2

Dige-stão Parcial do DITA de E. coli ATOO 11303 isolamento do DITA total a partir de E. coli ATCC 11303, realizou-se de acordo com o método descrito por Marmur em j. Mol. Biol., 53, 155 - 162 (1961). 0 DITA total isolado foi digerido parcialmente com a enzima de restrição Sau3A, de maneira a obterem-se, principalmente, fragmentos com um intervalo de tamanhos de 20 a 50 kb. para o efeito, determi nou-se, em ensaios prévios, a proporção óptima de DNA θ de enzima para essa finalidade, assim como a duração de actuação da enzima sobre o DITA. A correspondente maneira de proceder está descrita na revista publicada pela firma BRL Focus, volume 7, N² 2 (1985), na página 5.

Depois de decorrido o tempo de reacção considerado óptimo, destruiu-se e enzima por aquecimento a 65° C durante um intervalo de tempo de dez minutos e ensaiou-se a formação de fragmentos de dita pertencentes ao intervalo de tamanhos pretendido, por electroforese em agarose com marcadores de DITA apropriados, por exemplo, com DITA do fago lambda, digerido com EcoRl.

Exemplo 5

Ligação da Mistura da Restrição

DNA total parcialmente digerido com Sau5A de E. coli ATOO 11505 foi adicionado com cosmídio-DITA pIMS 6o26, que foi completamente cortado com BamHI e tratado com fosfatase alcalina, numa proporção molar de cerca de 1 ; 5. A mistura resultante foi misturada com um tampão várias vezes concentrado, de acordo com as indicações de ITew England Biolabs, de modo que resultou uma concentração iónica óptima para a enzi ma T4-DNA-ligase e incubou-se cora 1 microlitro da enzima a 16° C pelo menos durante catorze horas. 0 volume total da mistura era de cerca de 50 microlitros, com uma concentração de DHA total de 2o jug/ml.

Exemplo 4

Empacotamento em Pagos Lambda

Depois de realizada a reacção com ligase, o DJTA obtido de acordo com o Exemplo 5, in vitro, foi empacotado na cabeça de fagos lambda. Os extractos necessários pa ra o efeito podem obter-se a partir de duas estirpes de bactérias diferentes, de acordo com B. Hohn, em R. WU, editor ; Recombinant DITA, Methods in Enzymology, volume 68, Academic Press, Nova Iorque, páginas 299 - 309 (1979) ou referidas por Boe hringer/Mannheim ou Amersham Buchler, Braunschweig.

Misturaram-se 5 microlitros da mista ra obtida de acordo com o Exemplo 5 profundamente com extractos de bactérias da firma Amersham, imediatamente descongeladas antes sob arrefecimento com gelo. Incubou-se a mistura a 20° C durante 30 - 6o minutos e, em seguida, adicionaram-se 200 microlitros de tampão SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO^, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,01$ de gelatina). Esta mistura ou foi empregada directamente numa reacção de transdução ou foi guardada depois da adição de 10 microlitros de clorofórmio a 4° C, para posterior utilização.

Exemplo 5

Transdução de E. coli DG 30

A 5 ml de caldo I, que consiste em 1% de Bacto-Trypton, 0,5$ de extracto de levedura e 0,5$ de NaCl, adicionaram-se 0,4$ de maltose e vacinou-se com 50 microlitros de uma cultura líquida de E. coli DG 30 na fase de desen volvimento estacionária. Incubou-se a 37° C durante doze horas; até se atingir uma fase estacionária prematura. Centrifugaram-se as bactérias e ressuspenderam-se cuidadosamente em 2,5 ml de uma solução aquosa que era 10 mM em Mgdg . Misturaram-se 10 microlitros da mistura de acordo com o Exemplo 4 com 2o microli tros da suspensão de bactérias concentrada e incubou-se à tempe. ratura ambiente durante cinquenta minutos.

Em seguida, adicionaram-se 200 microlitros de caldo L θ incubou-se a 37° 0 durante uma hora, sacudindo acasionalmente a mistura.

Placaram-se respectivamente 50 microlitros da mistura reaccional em agar-caldo L, que continha 2o p.g/ml de tetraciclina.

Cultivaram-se as placas pelo menos doze horas a 37° C. De acordo com a maneira de proceder descrita, foi possível obter, em média, mil colónias, a partir de uma mistura reaccional.

Exemplo 6

Seleccionamento de E. coli DG 30 com um G-ene aspC ou ilvE ou

1·

picaram-se cerca de oitocentas colónias que foram obtidas depois da transdução de E. coli DG 30, de acordo com o processo descrito, para agar-caldo L, que continha 2o ug/ml de tetraciclina. 0 agar mínimo consistia em meio mg com glucose (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972), que foi suplementado com os aminoácidos isoleucina, leucina, valina, ácido aspártico e fenilala nina. No entanto, não se adicionou o aminoácido tirosina, que a estirpe DG 30 igualmente não pode sintetizar. Das oitocentas colónias picadas neste meio mínimo, apenas sete se conseguiram desenvolver.

Para diferenciação dos três genes possíveis, aspC, ilvS e tyrB em E. coli DG 30, estas colónias foram novamente picadas no meio mínimo acima mencionado, que foi suplementado com os aminoácidos referidos até respectivamente se obter um para o qual uma das transaminases é codificada por um dos genes apresentasse especificidade relativamente ao substracto.

resultado obtido é indicado na Tabela seguinte:

Clone Meio Mínimo suplementado até presumível

	Asp	Leu	Ile	Tyr	Gene
1	+	+	-	+	tyrB
2	+	4r	-	+	tyrB
3	-	+~	+	+-	ilvE
4	-	+-	+	+-	ilvE
5	4-	4-	-	4-	tyrB
6	+	+	-	+	tyrB
7	-	4““	+	+-	ilvE

+ = bom desenvolvimento.

+- = mau desenvolvimento.

= ausência de desenvolvimento.

Exemplo 7

Localização do Gene tyrB

Por minílise, de acordo com Maniatis

V»

e col., Oold Spring Harbor, páginas 366 - 570 (1982), obteve-se o cosmídio-BKA dos clones 1 a 7, que se obtiveram de acordo com o Exemplo 6.

Em seguida, incorporou-se este cosmí dio-BNA em E. coli BH1 (ATOO 55849), a partir do qual se pode novamente reisolar com bons rendimentos.

Bigeriu-se completamente o plasmídio-BNA que se obteve originalmente a partir do clone 5 de E. coli BB 30 (veja-se Exemplo 6), a partir do qual se isolou a estirpe E. coli BH 1 com este B1TA transformado e digeriu-se completamente com a enzima de restrição Olal, seguindo-se as instruções do fabricante, New England Biolabs. Bigeriu-se igualmente de ma neira completa o vector p AT 155 que, em seguida, foi ainda submetido a um tratamento com fosfatase alcalina. E.euniram-se os dois BNA, ligaram-se um com o outro procedendo de acordo com o modo operatórioque já se descreveu no Exemplo 4 e transformaram-se células competentes da estirpe E. coli ATCC 11505 com uma alíquota da mistura contendo ligase, por exemplo, 10 microlitros. Ensaiaram-se colónias resistentes ern placas de caldo I que continham 50 jug/ml de ampicilina e ensaiaram-se por replica plating em placas de caldo L com 2o jug/ml de tetraciclina, sobre a inactivação dos marcadores e, por consequência, da sua formação. Bas colónias que apresentaram o fenotipo Ap^rTc^s, isolou-se por minílise plasmídio-BITA e ensaiou-se por completa digestão com a enzima de restrição Olal relativamente à existência de fragmentes Olal no vector pAT153.

Exemplo 8

Ensaio de Actividade de Transaminase

Os clones obtidos de acordo com o Exemplo 7 foram ensaiadas por meio do ensaio de AppAT (ensaio de aspartato-piruvato de fenilo-aminotransferase, embalagem de ensaio Sigma 00390, em que se substituiu -oetoglutarato por piruvato de fenilo) relativamente à actividade de transaminase aromática, ou seja, do produto genético tyrB. Como comparação, serviu a estirpe de saída E. coli ATCC 11303 não transformada.

• Assim, foi possível medir-se um nítido aumento da actividade de • tyrB, na realidade de um factor compreendido entre 5 e 10 rela-

tivamente à estirpe de saída E. ooli ATOO 11303.

Por electroforese em gel de agarose com utilização de marcadores apropriados, foi possível verificar que, na estirpe que apresentava a elevada actividade genética de tyrB, estava contido o vector pAT 153, que continha in serido um fragmento de Ciai com cerca de 2,7 MD de tamanho. Com DNA do plasmídio isolado, transformou-se de novo a estirpe E. coli ATOC 11303 sem plasmídio e foi possível em todos os ca sos observar-se um aumento de actividade genética de tyrB de um factor de 5 - 10. Ao correspondente plasmídio atribuiu-se a designação de pILIS 6056·

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lâ -

Processo para provocar a sobreprodução de L-fenilalanina em microrganismos, caracterizado por

a) se inserir um elemento extracromosómico que contém o gene tyrB isolado de E. coli ATOO 11303 num microrganismo,

b) se exprimir o gene tyrB no microrganismo e se sintetizar uma tr.ansaminase aromática activa e

c) a transaminase realizar a aminação de piruvato de fenilo.

- 2a - processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser uma Ent e r ob akt e r i um.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser B. coli.

_ 2j.a — processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser E. coli ATCC 11303 assim como os seus variantes e mutantes.

- 5a Processo para a preparação dum elemento extracromossómico replicante, caracterizado pelo facto de o elemento replicante conter gene tyrB isolado de E. coli ATOO L13O3.

Processo de acordo com a caracterizado pelo facto de o referido elemento so^zmico ser um plasmídeo de cópias múltiplas.

reivindicação extracromos- 7a Processo de acordo com a reivindicação

6, caracterizado pelo facto de o mencionado elemento ser o pias ,:iídeo de cópias múltiplas pAT 153.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo facto de o citado elemento provocar a síntese de transaminase.

— 9 a —

Processo para obtenção de E. coli

ATCC 11505 θ seus variantes e nutantes, caracterizado pelo facto de se transformar o microrganismo com o elemento extracromos sómico de acordo com a reivindicação 5.

- 10S Processo para a preparação de gene tyrB, caracterizado pelo facto de ser obtido a partir de E. coli ATCC 1150Õ e/ou dos seus variantes e mutantes.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 19 de Setembro de 1986, sob o rb. y 36 51 829.9.