NO873919L - Kloning og anvendelse av transaminasegenet tyrb. - Google Patents

Description

Det siste trinn av det novosyntesen av fenylalanin består i amidering av fenylpyruvat ved hjelp av en transaminase. Enskjønt forskjellige transaminaser er istand til å transami-nere fenylpyruvat til fenylalanin, oppfylles denne funksjonen i cellen hovedsakelig av den såkalte aromatiske transaminase. Den genetiske forkortelse for genet av den-; aromatiske transaminase i E.coli er tyrB (Umbarger, Ann.Rev. Biochemis-try 47 (1978), 533-606). I tilfelle av E.coli K12 er stillingen av genet på "bakteriekromosomet" nøyaktig kjent og genproduktet har fått E.C.-nr. 2.6.1.5 (Bachmann et al., Microbiological Reviews 44 (1980), 1-56).

I den europeiske søknad 0 116 860 omtales isoleringen av tyrB genet fra E.coli K12 samt kloning av dette aminotranferasegen på et multikopiplasmid. Det klonerte plasmid gis igjen tilbake til stammen, hvorfra genet opprinnelig var blitt isolert med det resultat at L-fenylalanin-produksJonen av denne stamme kunne økes rundt ca. 11$.

Det ble nu overraskende funnet at isoleringen av i E.coli ATCC 11303 tilstedeværende tyrB gen og dets kloning på et multikopiplasmid etter transformering av mikroorganismer med dette plasmid spesielt av utgangsstammen resulterer i en lo gangers økning av L-fenylananinutbyttet.

Oppfinnelsen vedrører således:

1. Et repliserende ekstra-kromosomalt element som inneholder det fra E.coli ATCC 11303 isolerte tyrB gen. 2. Anvendelsen av det under punkt 1 nevnte ekstra kromosomale element til fremstilling av aromatisk aminotransferase. 3. Anvendelsen av det under punkt 1 nevnte ekstra kromosomale element til overproduksjon av L-fenylananin i mikroorganismer som erkarakterisert vedat a) det ekstra kromosomale element innbringes i en mikro-organisme , b) tyrB genet i denne mikroorganismen eksprimeres og en aktiv aromatisk transaminase syntetiseres og c) transaminasen bevirker amineringen av fenylpyruvat.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere i det følgende respektivt

defineres i kravene.

Foruten villtypen E.coli ATCC 11303 kan det også anvendes dets varianter og mutanter. Eksempelvis kan det også anvendes en etter kjente metoder mutert stamme [E. Adelberg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 18, 788 (1965)] som ble seleksjonert til overproduksjon av L-fenylalanin. Den aromatiske aminotransferase fra E.coli ATCC 11303 hvortil tyrB genet koderer, syntetiserer bl.a. L-fenylananin fra fenylpyruvat idet en aminogruppe transfereres fra glutamat. Ved hjelp av den aromatiske transaminase kan det dessuten syntetiseres thyrosin, glutamat, aspartat og leucin. Aminosyrene isoleucin, malein, laucin, fenylalanin og glutaminsyre dannes ved hjelp av en transaminase hvortil genet ilvE koderer, mens aminosyrene aspartan, glutamat, fenylalanin og thyrosin syntetiseres av en transaminase for hvis ekspresjon aspC genet er ansvarlig. Riktignok viser hver av de nevnte transaminaser også en svak aktivitet ved syntesen av aminosyrer som egentlig mere spesifikt er å tilordne en av de to andre transaminaser.

For ytterligere å øke syntesen av L-fenylalanin, doneres tyrB genet som koderer for den aromatiske aminotransferase. Man oppnår dette ved isolering av DNA fra E.coli ATCC 11303. Etter partiell fordøyning av DNA ligeres de dannede fragmenter som beveger seg i et størrelsesområde på 20-30 kb til et kosmid med et replikon som formidler et vidt vertsområde og sammenpakket i hodene av X-fagen. Fortrinnsvis anvendes kosmidet pIMS 6026. Kosmidet pIMS 6026 avleder seg fra kosmidet pLAFR 1 (ATCC 37167) ved at i EcoRI snittstedet av kosmidet pLAFR 1 ble det konert det handelsvanlige EcoRI fragment (Pharmacia, Uppsala, Sverige), hvorpå kanamycin-resistent genet av transposons Tn 903 ligger. Ved fordøyelse med Barn HI og etterfølgende religasjon kan den største del av det handelsvanlige EcoRI fragment deleteres således at det blir tilbake et kort stykke DNA som insersjon hvori et BamHI snittsted flankeres av to EcoRI snittsteder. Disse BamHI snittsteder som ikke er tilstede på kosmidet pLAFR 1 kan anvendes for kloningen. Ved inkubasjon av de innpakkede kosmider med en tilsvarende forberedt E.coli DG 30-suspen-sjon innsluses kosmidene i mikroorganismen. E.coli DG 30 har en def islens i de tre transaminaser aspC, ilvE og tyrB. Stammen vokser opp derfor uten problem på helmedium og imidlertid ved vekst på minimalmedium forsørges utenifra med forskjellige aminosyrer, da de ikke kan syntesiere selv. Ved egnet valg av medium kan det ved hjelp av stammen undersøkes om en utenifra opptatt DNA kan komplementere den kromosale defekt for en bestemt transaminase. Innslusning av tyrB genet detekterer man ved vekst av E.coli DG 30 på et thyro-sinfritt minimalmedium. På dette medium kan det bare vokse opp kloner som ved opptak av aspC , tyrB eller ilvE holdig DNA som opprinnelig stammer fra stammen E.coli ATCC 11303 kan komplementere deres kromosale defekt for syntesen av thyrosin. De tre transaminaser som koderes fra genene aspC, tyrB og ilvE adskiller seg i deres substratdesifitet enskjønt de alle tre er istand til å danne thyrosin.

Den aromatiske transaminase som koderes av genet tyrB kan eksempelvis ikke danne isoleucin fra ketofortrinnet, Imidlertid syntetiserer., leucin i gode utbytter fra de tilsvarende ketofortrinn. Transaminasene som koderer fra genet aspC kan hverken danne isoleucin eller det er effisient i omsetningen til leucin.

Følgelig kan de enkelte kloner ved vekst på et minimalmedium som er supplementert inntil en for det respektive gen karakteristisk aminosyre med for stoffskiftet essensielle aminosyrer aminosyrer adskilles med hensyn til den dannede transaminase. På denne måte seleksjoneres herav kloner fra DG 30 stammen som inneholder tyrB genet.

Det må nå undersøkes om klonen også virkelig har tyrB genet. Hertil må plasmid DNA Isoleres fra klonene. Isoleringen fra stammen DG 30 lykkes imidlertid bare med vanskeligheter. Det kan riktignok fåes plasmid DNA imidlertid bare i små utbytter. Etter minilyse transformeres derfor en E.coli stamme med kosmid DNA fra de interessante kloner, hvorfra deretter det innslusede DNA i gode utbytter kan reisoleres. E.coli DH 1 (ATCC 33849) er spesielt egnet hertil.

I neste trinn ligeres det reisolerte kosmid DNA med en vektor av høyt kopitall. Fra det kromosomale genkart av stammen E.coli K12 er det kjent at tyrB genet er lokalisert på et Clal fragment. Det besto den mulighet at dette også er tilfellet ved E.coli ATCC 11303. Av denne grunn anvendes som vektor fortrinnsvis et multikopiplasmid med et Clal snittsted spesielt foretrukket det i sin sekvens kjente pAT 153 (Winnacker E.L., Gene und Klone, VCH-Verlagsgesellschaft, Weinhrim).

Kosmid DNA og vektoren fordøyes fullstendig med restriksjonsenzymet Clal. De to DNA er has sammen, legeres med hverandre og kompetente celler av en vertsorganisme hvori fenylala-ninproduksjonen skal økes transformeres hermed. Fortrinnsvis anvendes enterobakterier spesielt E.coli idet E.coli ATCC 11303 samt dets mutanter og varianter er spesielt foretrukket. Resistente kolonier seleksjoneres over ampicillin og undersøker ved hjelp av Marker Inhibering med "replika plating" på tetracyklinplatter og innbygning. Fra de tilsvaraende kolonier isoleres med minilyse plasmid DNA og ved fullstendig fordøyning med restriksjonsenzymet Clal undersøkes nærvær av Clal fragmenter i vektoren. Ved restriksjonsanalyse sikres at alle i det opprinnelige DNA avsnitt Inneholdte Clal fragmentet er blitt subklonert på denne type. Kloner som respektivt inneholder en av disse definerte Clal fragmenter undersøkes endelig ved hjelp av aspartan-fenylpyruvat-aminotransferase (APPAT) prøven på aktiviteten av den aromatiske transaminase, altså av genproduktet av tyrB. På denne måten lar det seg oppnå en økning av tyrB aktiviteten rundt faktoren 5-10. Ved: agarosegel elektroforese kan det vises at i vektoren av vertsstammen er det inneholde et ca. 2,7 MD stort Clal fragment.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av følgende eksempler. Hvis intet annet er angitt, refererer prosenan-givelser seg til vekten.

Eksempel 1

Isolering og fordøyning av kosmidet pIMS 6026 fra E.coli.

For isoleringen av kosmid pIMS 6026 fra E.coli ble det gått frem enten ifølge Humphreys et al., [Biochemical Biophys. Acta 383, 457-63 (1975)] eller gjennomført i 10 ganger større målestokk enn alkalisk lyse ifølge Birnboim og Doly [Nucleic Acids Res. 7:151]. I ethvert tilfelle ble plasmid DNA minst renset 1 gang ved CsCl/EtBr-tetthetsgradrient sentrifugering.

Kosmidet pIMS 6026 ble fordøyet fullstendig med restriksjonsenzymet BamHI idet det ble gått frem etter angivelser fra fremstilleren New England Biolabs. For undersøkelse av fullstendigheten av denne fordøyelse ble en aliquot av restriksjonsblandingen påført på en 0,856-ig agarosegel og underkastet elektroforese. Opptreden bare av ett bånd etter farging med ethidiumbromid og bestråling med kortbølget UV-lys (254 nm) tjente som henvisning til en fullstendig fordøyelse. Fra de fordøyede kosmid-DNA ble restriksjonsenzymet fjernet ved fenalisering, DNA utfelt ved hjelp av eteanol vasket med 70#-ig etanol og etter tørking under vakuum opptatt i et egnet volum av TE-puffer (10 mM tris; 1 mM EDTA, pH 8.0). Etter valg ble dessuten gjennomført en behandling med alkalisk fosfatase etter angivelse av frem stilleren Boehringer Mannheim. Etter tilsetning av IjjI med alkalisk fosfatase (CIP) ble det inkubert 30 minutter ved 37°C, enzymet fjernet ved fenalisering fra reaksjonsblandin-gen og DNA renset som beskrevet ovenfor. Endelig ble den resuspendert i TE-puffer.

Eksempel 2

Partiell fordøyelse av DNA fra E.coli ATCC 11303.

Isoleringen av det samlede DNA fra E.coli ATCC 11303 ble gjennomført etter metoden av Marmur i J. Mol. Biol. 53, 155-162 (1961). Det isolerte samlede DNA ble partielt fordøyet med restriksjonsenzymet Sau3A således at det hovedsakelig oppsto fragmenter i et størrelsesområde på 20-30 kb. Dertil ble det i forforsøk fastslått det hertil optimale forhold mellom DNA og enzym samt den optimale innvirkningstid av enzymet på DNA. Den tilsvarende fremgangsmåte er omtalt i det av firma BRL utgitte hefte "focus". vol. 7, nr. 2 (1985) på side 3. Etter utløp av den optimalt bestemte reaksjonstid ble enzymet ødelagt ved oppvarmning ved 65°C over et tidsrom på 10 minutter, og dannelsen av DNA fragmenter i det ønskede størrelsesområdet undersøkt ved agarose gel elektroforese med egnede DNA marakerere, f.eks. med EcoRI fordøyet DNA av f agen

Eksempel 3

Ligasjon av restriksjonsblandingene.

Med Sau3A partielt fordøyet samlet DNA fra E.coli ATCC 11303 ble hatt sammen, med pIMS 6026 kosmid DNA som var spaltet fullstendig med BamHI og var blitt behandlet med alkalisk fosfatase i et molart forhold på ca. 1:5. Den resulterende blanding ble blandet med en flere ganger konsentrert puffer Ifølge angivelsene av New England Biolabs således at det fremkom en for enzymet T4 DNA ligase optimal ionekonsentra-sjon og Inkubert med 1 p av enzymet i minst 14 timer ved 16°C. Blandingens samlede volum utgjorde derved 50 pl med en samlet DNA konsentrasjon på 20 pg/ml.

Eksempel 4

Innpakning i X fagen.

Etter foretatt llgasereaksjon ble Ifølge eksempel 3 dannet DNA innpakket in vitro i hodene av X fagen. De dertil nødvendige ekstrakter fra to forskjellige bakteriestammer kan fremstilles ifølge Hohn, B. i wU, R., redaksjon: Recombinant DNA, Methods in Enzymology, vol. 68, Academic Press, New York, s. 299-309 (1979) eller refereres av Boehringer/Mannheim eller Amersham Buchler, Braunschweig. 3 pl av den ifølge eksempel 3 dannede, blanding ble grundig blandet med umiddelbart på forhånd opptint bakterieekstrakter fra firma Amersham under isavkjøling. Blandingen ble inkubert 30-60 minutter ved 20° C og deretter tilsatt 200 pl SM-puffer (100 mM MgS04 , 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0, 01% gelatin). Denne blanding ble enten anvendt direkte i en transduksjonsreaksjon eller etter tilsetning av 10 pl kloroform oppbevart ved 4°C til senere anvendelse.

Eksempel 5.

Transduksjon av E.coli DG 30.

5 ml L-buljong bestående av 1$ bakto-trypton, 0, 5% gjæreks-trakt og 0, 5% NaCl, ble tilsatt 0,4$ maltose og podet med 50 pl av en væskekultur av E.coli DG 30 i den stasjonære vekstfase. Det ble inkubert 12 timer ved 37°C inntil det var oppnådd den tidlige stasjonære fase. Bakteriene ble frasen-trifugert og forsiktig resuspendert med 2,5 ml av en vandig> oppløsning som var 10 M molar på MgC^. 10 pl av denne blanding Ifølge eksempel 4 ble blandet med 20 pl av den konsentrerte bakteriesuspensjon, og inkubert 50 minutter ved værelsestemperatur.

Deretter ble det tilsatt 200 pl L buljong og inkubert 1 time ved 37°C idet blandingen under tiden ble ristet. Respektivt 50 pl av blandingen ble utplantert på L buljongagar som inneholdt 20 pg/ml tetracyklin. Platene ble dyrket minst 12 timer ved 37° C. Ved den omtalte måte kunne det av en blanding gjennomsnittlig oppnås 1000 kolonier.

Eksempel 6.

Seleksjonering av E.coli DG 30 med et aspC- eller IlvE- eller tyrB gen.

Rundt 800 kolonier som var blitt dannet etter transduksjon av E.coli DG 30 etter den omtalte fremgangsmåte på L buljongagar som inneholdt 20 pg/ml tetracyklin ble "prikket" på minimal agar. Minimal agaren besto av M9 medium med glukose (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972), som var blitt supplementert med aminosyrene isoleucin, leucin, valin, asparaginsyre og fenylalanin. Aminosyren tyrosin som likeledes ikke mere kan syntetiseres stammen DG 30 ble imidlertid ikke satt til mediet. Av de 800 "prikkede" kolonier kunne 7 vokse opp på minimalmedium.

For adskillelse av de tre mulige gener aspC, ilvE og tyrB i E.coli DG 30 ble disse 7 kolonier igjen "prikket" på oven-nevnte minimalmedium som var supplementert med de oppførte aminosyrer inntil respektivt en for hvilken en av transaminasene som koderes fra et av genene viser substratspesifitet.

Resultatene er oppført i følgende tabell:

Eksempel 7.

Lokalisering av tyrB genet.

Ved minilyse ifølge Maniatis et al., Cold Spring Harbor, side 366-370 (1982), ble det fremstilt cosmid DNA av klone 1-7, som ble dannet ifølge eksempel 6. Deretter ble dette kosmid DNA innsluset i E.coli DH1 (ATCC 3384 9) og i fra de gode utbytter igjen kunne reisoleres.

Det ble isolert plasmid-DNA som opprinnelig var fremstilt fra klone 5 av E.coli DG 30 (se eksempel 6) av en med denne DNA transformerte stamme E.coli DH1 og fullstendig fordøyet med restriksjonsenzymet Clal idet det følges angivelsen av fremstilleren New England Biolabs. Likeledes fullstendig fordøyet med Clal ble vektoren pAT 153 som dessuten deretter ble underkastet en behandling med alkalisk fosfatase. De to DNA ble ført sammen, legert med hverandre etter den i eksempel 4 allerede"* omtalte måte og kompetente celler av stammen E.coli ATCC 11303 transformert med alikvot av ligaseblandingen, f.eks. 10 pl. Resistente kolonier ble seleksjonert på L buljongplater som inneholdt 50 pg/ml ampicillin og ved hjelp av "replica plating" på L buljonpla- ter undersøkt med 20 pg/ml tetracyklin på markeringsaktiver-ing og dermed innbygning. Fra kolonier som har fenotypen Ap<r>i-cs ble det ved minilyse isolert plasmid DNA og ved fullstendig fordøyning med restriksjonsenzymet Clal undersøkt nærvær av Clal fragmenter i vektoren pAT153.

Eksempel 8. s

Undersøkelse av transaminaseaktiviteten.

De ifølge eksempel 7 dannede kloner ble ved hjelp av APPAT-prøven (aspartan-fenylpyruvat-aminotransferase analyse Sigma prøvesett G0390 idet cx-ketoglutarat ble erstattet med fenylpyruvat) undersøkt på aktiviteten av den aromatiske transaminase, altså genproduktet av tyrB. Som sammenligning tjente den ikke transformerte utgangsstamme E.coli ATCC 11303. Derved kunne i ett tilfelle måles en tydelig økning av tyrB aktiviteten, nemlig rundt faktoren 5-10 i forhold til utgangsstammen E.coli ATCC 11303.

Ved agarosegel elektroforese under anvendelse av egnede markerere kunne det vises at i den stamme som har øket tyrB genaktivitet, var det inneholdt en liten pAT 153 vektor som inneholdt innbygget et rundt 2,7MD stort Clal fragment. Ble med det isolerte plasmid DNA igjen transformert en plasmidløs stamme E.coli ATCC 11303 så kunne det ihvert tilfelle iakttas en økning av tyrB genaktivitet rundt faktoren 5-10. Det tilsvarende plasmid fikk betegnelsen pIMS 6056.

Claims (10)

1. Et repliserende ekstra kromosomalt element som inneholder fra E.coli ATCC 11303 isolert tyrB gen.

Ekstra kromosomalt element ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et multikopiplasmid.

3. Ekstrakromosomalt element ifølge krav 2, karakterisert ved at det er multikopiplasmidet pAT 153.

4. Anvendelsen av det ekstrakromosomale element ifølge ett eller flere av kravene 1-3 til fremstilling av aromatisk transaminase .

5. Anvendelse av det ekstrakromosomale element ifølge ett eller flere av kravene 1-3 til overproduksjon av L-fenylalanin i mikroorganismer karakterisert ved at a) det ekstrakromosomale element innbringes i en mikroorga-nisme , b) tyrB genet eksprimeres i mikroorganismen og en aktiv aromatisk transaminase syntetiseres og c) transaminasen bevirker amineringen av fenylpyruvat.

6. Anvendelse ifølge krav 4 karakterisert ved at mikroorganismen er en enterobakterie.

7. Anvendelse ifølge krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er E.coli.

8. Anvendelse ifølge krav 7, karakterisert ved at mikroorganismen er E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter.

9. E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter transformert med det ekstra kromosomale element ifølge ett eller flere av kravene 1-3.

10. tyrB gen oppnådd fra E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter.