JPS6398390A - アミノ基転移酵素遺伝子ｔｙｒＢのクローニングおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フェニルアラニンの新規（ｄｅ　ｎｏｖｏ）合成におけ
る最終段階は、アミノ基転移酵素（トランスアミナーゼ
）によるフェニルピルビン酸（フェニルピルベート）の
アミノ化である。いろいろの酵素がフェニルピルビン酸
をアミノ基転移によってフェニルアラニンとすることが
できるが、この機能は、いわゆる芳香族アミノ基転移酵
素によって細胞内で営まれる。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ
）の芳香族アミノ基転移酵素に対する、遺伝学で用いら
れる略号は、ｔｙｒＢである（Ｕｍｂａｒｇｅｒ、　Ａ
ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４７（１９７８）、　５３
３−８０８参照）、Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２の場合には、この遺伝子の染色体上
の位置は、正確に判明しており、この遺伝子産物も、酵
素番号が付与されている（酵素番号２゜６、　　　］、
、　　　５）　　　（Ｂａｃｈｍａｎｎ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、。

Ｍ）ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ！　Ｒｅｖｉｅｗｓ　４
４　（１９８０）ｌ−５６参照）。

ヨーロッパ公開特許出願節０．１１６，８６０号明細書
には、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２からのｔｙｒＢ遺伝子の
分離とこのアミノ基転移酵素のマルチコピー（ｍｕｌｔ
ｊｃｏｐｙ）プラスミドへのクローニングについての記
載がある。このクローニングした遺伝子を、その遺伝子
を分離した元の細菌株にもどすと、この細菌株における
し一フェニルアラニンの生産量が１１％まで増加する。

大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３に存在するｔｙｒＢ遺伝子を
分離し、マルチコピープラスミドでクローニングし、こ
のプラスミドで微生物、特に元の細菌株、を形質転換す
ると、驚くべきことに、Ｌ−フェニルアラニンの収量が
１０倍増加することがわかった。

かくして、本発明は以下のことに関するものである。

１、　　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１３０Ｂより分
離したｔｙｒＢ遺伝子を含む増殖性染色体外因子。

２、　芳香族アミノ基転移酵素合成のための、第１項に
規定した染色体外因子の使用。

３、以下の段階（ａ　−ｃ　）からなる、第１項に規定
した染色体外因子の微生物におけるし一フェニルアラニ
ンの過剰生産のための使用。

ａ）　微生物への染色体外因子の導入、ｂ）　当該微生
物におけるｔｙｒＢ遺伝子の発現と活性な芳香族アミノ
基転移酵素の合成、Ｃ）　アミノ基転移酵素によるフェ
ニルピルビン酸のアミノ化惹起。

本発明は以下の詳細な説明の項及び特許請求の範囲の項
で詳述及び規定されている。

野生型のＥ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１０３だけでなく
、その変種や突然変異体も使用することができる。例え
ば既知の方法（Ｅ、Ａｄｅｌｂｅｒｇ　　ｅｔａｔ、、
　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍ、１８，７８８（１９８５））で突然変異をおこ
させ、Ｌ−フェニルアラニンの過剰生産について選別し
た株を使用することもできる。ｔｙｒＢがコードする Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１３０３の芳香族アミノ基
転移酵素は、とりわけ、グルタミン酸（グルタメート）
からアミノ基を転移させることによりフェニルピルビン
酸からし一フェニルアラニンを合成する。さらにこのア
ミノ基転移酵素を用いて、チロシン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸（アスパルテート）およびロイシンも合成
することができる。アミノ酸のイソロイシン、バリン、
ロイシン、フェニルアラニン及びグルタミン酸は、１１
ｖＥ遺伝子がコードするアミノ基転移酵素を用いてつく
られる。一方、アミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン
酸、アエニルアラニンおよびチロシンは、その発現にａ
ｓｐＣ遺伝子が必要なアミノ基転移酵素によって合成さ
れる。しか１７なから、該アミノ基転移酵素は、別の二
つのアミノ基転移酵素のうちの一つに特異的に限定され
たアミノ酸合成においても又、弱い活性を示す。Ｌ−フ
ェニルアラニンの合成をさらに増加させるために、芳香
族アミノ基転移酵素をコードするｔｙｒＢ遺伝子をクロ
ーニングする。これは、Ｅ、ｃｏｌｉＡＴＣＣ］１３０
３からＤＮＡを分離することにより達成される。このＤ
ＮＡを部分消化し、生じた２０〜３０ｋｂの範囲にある
種々の大きさのフラグメントを、広範囲の宿主領域をも
つレプリコンを有するラスミドに連結し、λファージの
頭殻に包みこむ。用いられるラスミドは、ｐＩＭＳ６０
２６が好ましい。ラスミドｐＩＭｓ６０２６はラスミド
ｐＬＡＦＲ１（ＡＴＣＣ３７１６７）から次のようにし
て、すなわち市販のＥｃｏＲＩフラグメント（ファルマ
シア、ウプサラ、スエーデン；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）でそのフラグメン
ト上にトランスポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺
伝子を有するものをコスミドｐＬＡＦＲコの唯一のＥｃ
ｏＲＩ切断部位にクローニングすることによって、得ら
れる。挿入部として短いＤＮＡ片が残るように、Ｂａｍ
ＨＩで消化し、続いて再連結を行うことによって、Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントの大部分を欠失させることもできる
。この挿入部では、ＢａｍＨＩ切断箇所は二つのＥｃｏ
ＲＩ切断箇所に接することになる。このＢａｍＨＩ切断
箇所は、ラスミドｐＬＡＦＲ１には存在せず、クローニ
ングのために用いることができる。包み込みを行なった
ラスミドと適切に調製したＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＧ３０の
浮遊液とのインキュベーション（１ｎｃｕｂａＮｏｎ）
によってこのラスミドを微生物に導入する。Ｅ。

ｃｏｌｔ　　ＤＧ３０は、三種のアミノ基転移酵素、す
なわちａｓｐＣ，１ｌｖＥおよびｔｙｒＢ、を欠いてい
る。したがって、この株は完全培地では問題なく増殖す
るけれども、最少培地では種々のアミノ酸を合成できな
いので、増殖のためには、これらを外から供給しなけれ
ばならない。この株を用い、適切な培地を選択すること
により、取り込まれたＤＮＡが特定のアミノ基転移酵素
についての染色体の欠陥を補完できるものであるかどう
かをしらべることかできる。ｔｙｒＢ遺伝子の導入は、
無チロシン最少培地でのＥ、ｃｏｌｔＤＧ３０の増殖の
有無によって検出できる。チロシン合成についての染色
体の欠陥を、ｔｙｒＢ又は１ｌｖＥ又はａｓｐＣを含み
、Ｅ、ｃｏｌｉＡＴＣＣｌｌ、３０３に由来するＤＮＡ
の取り込みによって補完することができるクローンのみ
がこの最少培地で増殖することができる。ａｓｐＣ。

＝　　７　− ｔｙｒＢ、およびｉ　１ｖＥ遺伝子によってコードされ
るこの三つのアミノ基転移酵素は、すべて、チロシンを
作るけれども、その基質特異性が異る。

例えば、ｔｙｒＢ遺伝子によってコードされる芳香族ア
ミノ基転移酵素はケト前駆体からイソロイシンを作るこ
とはできないが、対応するケト前駆体からロイシンを高
収量で合成することができる。ａｓｐＣ遺伝子によって
コードされるアミノ基転移酵素は、イソロイシンを作る
こともできず又ロイシンに効率よく変換することもでき
ない。

従って、特定の遺伝子に特徴的なアミノ酸をのぞいて、
代謝に必要なアミノ酸を補充した最少培地上での増殖に
よって、どのアミノ基転移酵素を含むかという点に関し
て個々のクローンを区別することができる。この方法で
、ｔｙｒＢ遺伝子を含むＤ０３０株のクローンが選別さ
れる。

ここで、当該クローンが真にｔｙｒＢ遺伝子を持つかど
うかをしらべることか必要である。これには、クローン
からプラスミドＤＮＡを分離する必要がある。しかしな
から、Ｄ０３０株からのブラスミドＤＮＡの分離は困難
である。可能ではあっても、低収率である。かくして、
最少溶菌後、興味のあるクローンからのラスミドＤＮＡ
でＥ。

ｃｏｌｉ株を形質転換し、それから形質転換菌から、導
入ＤＮＡを高収量で再分離することができる。Ｅ、ｃｏ
　１　ｉ　　ＤＨＩ　　（ＡＴＣＣ３３８４９）は、こ
の目的に特に適切である。

次の段階では、再分離したラスミドＤＮＡを高いコピー
数のベクターと連結する。Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２株の染色
体遺伝子地図から、ｔｙｒＢ遺伝子はＣ１ａＩフラグメ
ント上に在ることがわかっている。Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｔ
ＡＣＣ１１３０３でもそうである可能性がある。そこで
、好ましいベクターとしてＣ１ａＩ切断箇所をもつマル
チコピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ）プラスミドｐＡＴ１５
３がもちいられる。ｐＡＴ１５３は塩基配列がわかって
おり、特に好ましい（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、　Ｅ、Ｌｌ
、　Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｌｏｎｅ。

ＶＣ）ｌ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｃｓｃｌ　１ｓｃｈａｆｔ
、　Ｗｃｉｎｈｃｉｍ参照）。

ラスミドＤＮＡとこのベクターとを、制限酵素Ｃ１ａＩ
で完全に消化する。二種のＤＮＡを混合し、連結し、こ
の連結産物を、フェニルアラニン産生を増加させたい宿
主微生物の受容細胞を形質転換するために使用する。用
いる細菌は腸内細菌、特にＥ、ｃｏｌｉ、が好ましい。

Ｅ、ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０Ｂおよびその突然変異体
および変種がとりわけ好ましい。耐性コロニーをアンピ
シリンで選別し、テトラサイクリン平板でレプリカ法に
よって、マーカ抑制を基にして、挿入の有無をしらべる
。プラスミドＤＮＡを最少溶菌によって適切なコロニー
から分離し、ベクター中のＣ１ａＩフラグメントの有無
を、制限酵素Ｃ１ａＩで完全消化することによってしら
べる。

この制限酵素による分析は、元のＤＮＡ断片に含まれる
すべてのＣ１ａＩフラグメントがこの方法でサブクロー
ニングされているということを確認するために行われる
。これらの限定Ｃ１ａＩフラグメントのひとつを含む各
クローンを、芳香族アミノ基転移酵素、すなわちｔｙｒ
Ｂの遺伝子産物、活性に関してアスパルテート−フェニ
ルピルベートアミノトランスフェラーゼ分析（ＡＰＦＡ
Ｔ）を用いて最終的にしらべる。この方法でｔｙｒＢ活
性を５〜１０倍、増加させることができる。アガロース
ゲル電気泳動で、宿主株のベクターはおよそ２．７ＭＤ
の大きさのＣ１ａＩフラグメントを含むことを示すこと
ができる。

本発明は以下の例に於て詳細に述べられている。

特に規定されない限り、百分率データは重量に関するも
のである。

例Ｉ Ｅ、ｃｏｌｔからのコスミドｐＩＭｓ６０２６の分離お
よび消化 Ｅ、ｃｏｌｔからコスミドｐＩＭｓ６０２６を分離する
ために用いられた方法は、ハンフリーらの方法（Ｂｌｏ
ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　３８３．４
５７−６３（１９７５）参照）か又は１０倍のスケール
で行ったバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドーリ−
（Ｄｏｌｙ）　”方法（Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　７二Ｌ５Ｌ参照）によるアルカリ溶菌のいず
れかであった。いずれの場合にも、プラスミドＤＮＡは
、塩化セシウム／臭化エチジウム密度勾配遠心法で少く
とも一回精製した。

コスミドｐＩＭｓ６０’２６は製造元である二ニー・イ
ングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ　）の指定した方法でＢａｍＨＩで完全に
消化された。消化が完全に行われたかどうか、しらべる
ために制限酵素反応物の混合液の一部をとって０．８％
アガロースゲルで電気泳動を行った。

臭化エチジウムで染色した後、短波長紫外線（２５４ｎ
ｍ）照射による単一のバンドの出現で消化の完全さが示
された。フェノール処理で、消化したコスミドＤＮＡか
ら制限酵素をとりのぞき、ＤＮＡをエタノールで沈殿さ
せ、７０％エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させ、テ
ィーイー（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ）リス、１ｍＭＥＤ
ＴＡＳｐＨ８，０）で適量とした。場合により、製造元
のベーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｌ　ｍ）の指示する方法でアルカリホスファタ
ーゼ処理をほどこした。１μｇアルカリホスファターゼ
（ＣＩ　Ｐ）を添加して３７℃、３０分間、反応混合液
のインキュベーションを行い、フェノール処理で酵素を
取除き、上に述べた方法でＤＮＡを精製した。ＤＮＡは
最終的に、ＴＥ緩衝液に再浮遊させた。

例２ Ｅ、ｃｏｌｔ　　ＡＴＣＣ１１３０３からのＤＮＡの部
分消化 Ｅ、ｃｏｌｔ　　ＡＴＣＣ１１３０３から、全ＤＮＡを
ｖ−ｖ　−（Ｍａｒｍａｒ）の方法（Ｊ、　Ｈｏｔ。

Ｂｊｏｌ、　５８．１５５−Ｌ［ｉ２．　（１９８１）
参照）で分離した。

分離した全ＤＮＡを、生成フラグメントが主に２Ｏ−３
０ｋｂの範囲の大きさとなるように、制限酵素Ｓ　ａ　
ｕ　３Ａで部分消化した。この目的のために適切なりＮ
Ａと酵素の比率、及び最適な酵素とＤＮＡの反応時間を
確立するために予備試験を行った。適切な方法はビーψ
アール伊エル（ＢＲＬ）刊行の「フォーカス（ｆｏｃｕ
ｓ　）（ｐａｇｅｄ、　ｖｏｌ　７　Ｎｏ２．１９８５
）に記載されている。

最適であると判明した反応時間の経過後、６５℃、１０
分間加熱することにより酵素を分解し、望ましい大きさ
のＤＮＡフラグメントが生じたか否かは、適切なりＮＡ
ママ−−例えばＥｃｏＲＩで消化したλフアージＤＮＡ
を用いてアガロースゲル電気泳動を行うことによりしら
べた。

例３ 制限酵素反応物の連結 部分的に５ａｕ３Ａで消化した、Ｅ、ｃｏｌｉＡＴＣＣ
ｌｌ、３０３からの全ＤＮＡとＢａｍＨＩで完全に切断
し、アルカリホスファターゼで処理したｐＩＭｓ６０２
６コスミドＤＮＡとをモル比１：５で混合した。この混
合物を、ニューイングランドバイオラブ社（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌａｂｓ　）が記載したように、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにとって最適なイオン強度となるよ
うに、数倍濃縮した緩衝液に混合し、１μｇの酵素と１
６℃で少くとも１４時間、インキュベションを行った。

この混合物の全容積は５０μｇで全ＤＮＡ濃度は２０μ
ｇ／ｍｌであった。

例４ ファージλの包みこみ（Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　）リガー
ゼによる反応の後、例３のようにして得られたＤＮＡは
インビトＯ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でファージλの頭殻に
包みこんだ。この目的のために必要な二種類の異った細
菌からの抽出物は、ホーン（ｌｌｏｈｎ）の方法（Ｗｕ
、　Ｒ，編；　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏ
ｌ、６８．　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、　２９９−３０９ページ（１９７９）参照
）で調製するか又はベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）かアマ−ジャム　
バラフラー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ。

Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｎｇ　）から購入できる。例３
のようにして得た混合物の３μｇとアマ−ジャム（Ａｍ
ｃｒｓｈａｍ）から供給され、直前に融解させた細菌抽
出物とを氷で冷却しつつ、十分に混合した。

この混合物を２０℃で３０〜６０分間、インキュベーシ
ョンし、その後、２００μｇのニスエム（ＳＭ）緩衝液
（１００ｍＭ　　ＮａＣ１゜１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，
５０ｍＭ　　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、０．
０１％ゼラチン）を加えた。この混合物を直接形質導入
に用いるか又は、後の使用に供するため、１０μΩのク
ロロホルムを添加して、４°Ｃで保存した。

例５ Ｅ、ｃｏｌｔ　　ＤＧ３０の形質導入 ０．４％のマルトースを、１％バクトドリプトン（Ｂａ
ｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　、　　０．　５％酵母抽
出物及び０．５％の塩化ナトリウムからなるしブロス（
Ｌ　ｂｒｏｔｈ　）の５ｍｌに添加し、この混合物に、
５０μ、Ｑの増殖静止期にあるＥ、ｃｏｌｉＤＧ３０の
液体培地を接種した。初期増殖静止期に到達するまでこ
れを３７℃、１２時間培養しｆコ。細菌を遠心沈殿させ
、塩化マグネシウム１０ｍＭ水溶液　２．５ｍｌに注意
深く再浮遊させた。例４の混合物１０μｇと、濃縮細菌
浮遊液２０μｇとを混合し、この混合物を室温で５０分
間、インキュベーションした。

その後、２００μｇのＬブロスを添加し、混合物を時々
、攪拌しなから１時間３７℃でインキュベーションした
。この５０μｇを２０μｇ　／　ｍｌのテトラサイクリ
ンを含むＬブロス寒天にうえた。

この寒天平板を少くとも１２時間３７°Ｃでインキュベ
ーションした。すでに記述した方法で、１バッチ当り平
均１０００コロニー得ることができた。

例６ ａｓｐＣ又は１ｌｖＥ又はｔｙｒＢ遺伝子を有するＥ、
ｃｏｌｉ　　ＤＧ３０の選別 光きに述べた方法で、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＧ３０の形質
導入後、２０μｇ　／　ｍｌのテトラサイクリンを含む
しブロス寒天上で得られたおよそ８００コロニーを最少
寒天培地に釣り上げた。最少寒天培地は、イソロイシン
、ロイシン、バリン、アスパラギン酸、フェニルアラニ
ンを添加したグルコース入りＭ９培地から成る。しかし
なから、ＤＧ３０株が同様に合成することができないア
ミノ酸、チロシンは当該培地には添加しなかった。釣り
上げた８００個のコロニーのうち、７個がこの最少培地
で増殖することができた。

Ｅ、ｃｏｌｔに導入された想定されうる三種の遺伝子ａ
ｓｐＣ及び１ｌｖＥ及びｔｙｒＢを識別するために、こ
れら７個のコロニーを上記の最少培地に再び釣り上げた
。この最少培地は下に挙げた表のアミノ酸を添加されて
いるか、各場合、−種類のアミノ酸を除いである。これ
ら各々の場合について、各遺伝子がコードするアミノ基
転移酵素はそれぞれ基質特異性を有する。

結果を下の表に示す。

クローン　　　アミノ酸添加培地に　　　想定され含ま
れないアミノ酸　　　る遺伝子 アスパラ　ロイシン　イソロイ　チロシンギン酸　　　
　　　　シン ２　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　　　　＋　　　　　　ｔｙｒＢ３　　　　　　　
　　　＋−＋　　　　　＋−１１ｖＥ４　　　　　　　
　　　　　　　＋　　　　　　＋＋−１１ｖＥ５　　　
　　　　＋　　　　　　　十　　　　　　　　　　　　
　＋　　　　　　ｔｙｒＢ６　　　　　　　＋　　　　
　　　十　　　　　　−＋　　　　　　ｔｙｒＢ７　　
　　　　　　　　　　　　＋−十　　　　　　＋　−１
１ｖＥ十　−増殖良好 ＋−＝増殖不良 −−増殖なし 例７ ｔｙｒＢ遺伝子の位置決定 マニアーティスらの方法（Ｍａｎｊａｔｉｓ　ｅＬ　ａ
ｌ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　３６６ペ
ージ〜３７０ページ（１９８２）参照）による最少溶菌
で、例６で得られたクローン１〜７からコスミドＤＮＡ
を得た。このコスミドＤＮＡをそれからＥ、ｃｏｌｉＤ
ＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入した。この菌から
高収量でコスミドＤＮＡを再分離することができた。

このＤＮＡで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉＤＨＩから本
来Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＧ３０のクローン５（例６参照）
から得られたプラスミドＤＮＡが、分離された。このプ
ラスミドＤＮＡを製造元のニューイングランドバイオラ
ブ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）の指示
に従って制限酵素Ｃ１ａ、Ｉで完全に消化した。ベクタ
ーｐＡＴ１．５３を同様に完全にＣ１ａＩで消化し、そ
の後アルカリホスファターゼ処理を行なった。この二つ
のＤＮＡを混合し例４ですでに述べた方法で連結し、Ｅ
。

ｃｏｌｔ　　ＡＴＣＣ１１３０３の受容菌を、このリガ
ーゼ混合物の例えば１ａＩｇで形質転換した。５０μｇ
　／　ｍｌのアンピシリンを含むしブロス甲板で選別し
た耐性コロニーをレプリカ法で２０μｇ　／　ｍｌのテ
トラサイクリンを含むしブロス平板でマーカーインアク
チベーションについて、すなわち挿入についてしらべた
。アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性の表現形質
を示すコロニーから、最少溶菌によってプラスミドＤＮ
Ａを分離し、ベクターｐＡＴ１５３中のＣ１ａＩ７ラグ
メントの有無をＣ１ａｌ制限酵素による完全消化でしら
べた。

例８ アミノ基転移酵素活性の検査 ＡＰＰＡＴ分析（シグマ・テスト・キット００３９０゜
このキットではα−ケトゲルタール酸（α−ケトグルタ
レート）かフェニルピルビン酸におきかえられた。）を
用いて芳香族アミノ基転移酵素、すなわちｔｙｒＢの遺
伝子産物、の活性についてしらべた。未形質転換出発菌
株、Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１３０３を比較のために用いた
。この測定によって、１例に於て出発菌株Ｅ、ｃｏｌｉ
　　ＡＴＣＣ１１３０３と比較してｔｙｒＢ活性の著量
な増加、特に５〜１０倍増加、か判った。

適切なマーカーを用いてアガロースゲル電気泳動で、ｔ
ｙｒＢ遺伝子活性の増加を示したこの株かｐＡＴ１５３
ベクターを含んでいることを示すことができた。このベ
クターはおよそ２．７ＭＤの大きさの編入Ｃ１ａＩフラ
グメントを含んていた。分離したプラスミドＤＮＡを再
びプラスミドをもたないＥ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１
３０３の形質転換に用いたとき、各事例につきｔｙｒＢ
活性の５〜１０倍増加をみとめることができた。このプ
ラスミドをｐＩＭｓ６０５６と名づけた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３から分
   離したｔｙｒＢ遺伝子を含む増殖性染色体外因子。 ２、マルチコピープラスミドである、特許請求の範囲第
   １項に記載の染色体外因子。 ３、マルチコピープラスミドがｐＡＴ１５３である、特
   許請求の範囲第２項に記載の染色体外因子。 ４、芳香族アミノ基転移酵素の合成のための、特許請求
   の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の染色体
   外因子の使用。 ５、微生物にＬ−フェニルアラニンを過剰産生させるた
   めの、以下のａ）〜ｃ）の段階からなる、特許請求の範
   囲第１項から第３項のいずれか１項に記載された染色体
   外因子の使用。 ａ）微生物に染色体外因子を導入し、 ｂ）当該微生物でｔｙｒＢ遺伝子を発現させ、活性な芳
   香族アミノ基転移酵素を合成し、 ｃ）該アミノ基転移酵素によってフェニルピルビン酸を
   アミノ化する。 ６、該微生物が腸内細菌である、特許請求の範囲第４項
   に記載された使用。 ７、該微生物がＥ．ｃｏｌｉである、特許請求の範囲第
   ５項に記載された使用。 ８、該微生物がＥ、ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ １１３０３およびその変種および突然変異体である、特
   許請求の範囲第７項に記載された使用。 ９、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に
   記載された染色体外因子で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ
   　ＡＴＣＣ１１３０３およびその変種および突然変異体
   。 １０、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ１１３０３およびその変
   種および突然変異体から得られるｔｙｒＢ遺伝子。