WO2000068371A1 - Procede de culture cellulaire - Google Patents

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cells
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Yasuko Ozaki
Yasuo Koishihara
Shin-Ichi Kaiho
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing cells.
  • the present invention also relates to a method for cloning cells. Further, the present invention relates to a method for producing a protein by cell culture. Background art
  • a cell group grown from a single cell has the same trait as each cell in the cell group.
  • Single cell cloning to obtain such a homogeneous cell group is a scientific It is an important technology both commercially and commercially. For example, to produce a pharmaceutical product that requires the production of a homogenous product, and in particular to produce a homogenous protein product, a single cell that produces the protein is selected, separated, By growing the cells, it is necessary to construct a homogeneous cell group that produces the protein. Therefore, single cell cloning is an indispensable technology for producing proteins, especially recombinant proteins.
  • spleen cells obtained from animals immunized with the antigen and immortalized mouse oral cells were hybridized by cell fusion.
  • a so-called limiting dilution method has been used, in which each cell of the heterogeneous hybridoma cell group thus produced is cultured with a single feeder cell.
  • the feeder may be spleen cells or the like that have lost the ability to proliferate by mitomycin treatment or radiation treatment. Has been used.
  • the feeder cells used in these methods are not a uniform cell group, and have disadvantages such as large variability due to experimental operations and the necessity of pretreatment for lacking proliferation ability. was there. Furthermore, depending on the type of cells, it may be difficult to grow cells from a single cell even with the addition of feeder cells and the addition of growth factor fetal serum. there were. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for culturing one cell or a method for cloning a cell, which does not have the drawbacks of the conventional limiting dilution method, and a method for obtaining protein by cell culture.
  • culturing one "transformed cell” means starting culturing from one cell, and a plurality of cells increased from one cell during the culturing process. Needless to say, this includes culturing cells.
  • Transformed cells include genetically engineered cells and hybridoma cells, cells that are constitutive, that is, cells that have been engineered to produce protein and that do not need to induce protein production.
  • Genetically modified cells refer to transformed cells into which a DNA encoding the protein has been introduced in order to confer the trait of constitutively producing the desired protein.
  • Genetically modified cells are prepared by ligating DNA encoding the desired protein to an appropriate expression vector and introducing the resulting expression vector into the cells by a commonly used method. .
  • Such genetically engineered cells include cells suitable for the preparation of genetically engineered cells, including cells inserted into the chromosome inside the transformed cells and cells maintained outside the chromosome. All types of host cells are included, but preferably eukaryotic cells.
  • Eukaryotic cells include animal cells, for example, mammalian cells, yeast cells, insect cells, and the like.
  • Preferred mammalian cells include CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero and the like.
  • the CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220), CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) or CHO DG44 (Urlaub, Getal., Cell (1983) 33 (2) 405-412) can be suitably used.
  • a hybridoma cell is a fusion of cells that produce the desired protein constitutively, for example, immunoglobulin-producing cells and compatible immortalized cells, for example, myeloma cells (P3K, ⁇ 2 / 0, U266)
  • immortalized cells obtained by means of immortalizing cells producing a desired protein, such as Epstein-Barr virus (EBV), as the hybridoma cells are also included.
  • Animal cells for example, cells of mice, rats, humans, and the like, are used as cells producing the desired protein to be used for the production of hybridoma cells.
  • the parent cell means a cell before transformation of the same strain as the cell producing the protein.
  • a cell used for preparing a cell that produces a protein is particularly preferred.
  • the parent cell of the genetically engineered cell is, for example, a cell used to introduce a DNA encoding a desired protein when producing a transformed cell, and is a non-transformed cell.
  • the parent cell of the hybridoma cell is, for example, an immortalized cell used for fusion with a cell that produces immunoglobulin.
  • selectable marker gene refers to a gene that gives a trait to selectively survive only cells that produce a desired protein.
  • the transformed cell producing the protein preferably contains a selectable marker-gene.
  • the parent cell preferably does not contain a selectable marker gene.
  • APH aminoglycoside transductase
  • thymidine kinase thymidine kinase
  • TK Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase
  • HPRT Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the cells may be cultured under conditions that cannot survive unless the selective genes are expressed. Such conditions include G418, addition of methotrexate, and the like.
  • One of the selection marker genes used in hybridoma cells is HPRT and the like.
  • the selectable marker gene may be introduced into the immortalized cells to be fused, or an immortalized cell already containing the selectable marker gene may be used to fuse this cell with a cell that produces the desired protein. .
  • Selectable marker gene is expressed in cells containing selectable marker gene
  • the culture may be performed under conditions that cannot survive unless the culture is performed. Such conditions include, for example, culture in a hypoxanthine-thymidine-free medium.
  • the protein produced by the cells may be any useful protein or physiologically active protein, and is preferably a human protein.
  • Such proteins include hormones (pituitary hormone-releasing factor, oxytocin, vasopressin, parathyroid hormone (PTH), parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), growth hormone, etc.
  • GH Mon
  • prolactin gastrin
  • Secretin cholecystokinin
  • insulin glucagon
  • calcitonin enzymes
  • enzymes eg, glucose oxidase
  • enzyme inhibition Agents eg, chymostatin
  • lymphokines eg, interleukin-11 (IL-1), IL-12, IL-3, IL-4, IL-15, IL-6) , IL-7, IL-18, IL-19, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15
  • TNF tumor necrosis factor
  • IFN interferon a
  • Interferon Interferoner
  • Interferon , Interferon ⁇ hematopoietic factors
  • erythropoietin EP0
  • thrombopoetin thrombopoetin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage Dicholoney stimulating factor
  • M-CSF
  • Culture or cloning of the cells may be performed under commonly used conditions.
  • the culture solution may be a commonly used culture solution, and for example, DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM and the like can be used.
  • a serum replacement solution for example, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS), can be used in combination with the culture solution, or a serum-free culture solution may be used.
  • the pH of the culture is preferably about 6-8.
  • the cells are preferably cells in the exponential growth phase. If the cells form a cluster, they can be loosened by using a syringe of an appropriate caliber. Dilute the obtained cell suspension appropriately, and inoculate the cell culture plate so that one cell becomes Z-well.
  • Parental cells are prepared in a similar manner, with about 1,000 to 20,000, preferably about 3,000 to 10,000, more preferably about 5,000 to 10,000, cells. Add the parent cell to the well containing one cell of interest. Then, culture may be performed under appropriate conditions. Culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 96 to 120 hours, and if necessary, the medium is replaced, aerated, and stirred under an appropriate concentration of carbon dioxide.
  • the cells to be cultured preferably contain the selectable marker gene, and the parent cell does not, so that the conditions under which the selectable gene is expressed kill the parent cell and the target cell.
  • the condition for expressing the selectable marker gene is, for example, when the selectable gene is dhfr, methotrexate may be added to the culture solution.
  • After the expression of the selectable marker gene continue culturing for an appropriate period of time, and confirm colony formation of the surviving cells by observing under a microscope, for example, a microscope. If colony formation is confirmed, increase the cell population as appropriate It can be transferred to a culture vessel and expanded. Since the obtained colony is derived from one cell, if colony formation is confirmed, it means that the cell has been closed.
  • a homogeneous protein By culturing the obtained colonies, subculturing and Z or expanding the culture as appropriate, and recovering the desired protein produced from the culture supernatant or cells, a homogeneous protein can be obtained. It can.
  • the obtained protein can be purified by a method known to those skilled in the art using a suitable combination of column chromatography and the like, and stored and used if desired. Since the protein obtained by expanding the single cell is homogeneous, subsequent purification is easy, and a protein with higher purity can be obtained in a high yield. Therefore, it is particularly useful for reducing production costs in the production of pharmaceuticals.
  • affinity one column chromatography for example, affinity one column chromatography to which an antibody to a protein is bound can be used. If the protein is an antibody, a protein A column and a protein G column can be used.
  • the protein cloned and produced by the single-cell cloning method of the present invention can be used particularly as a pharmaceutical composition.
  • the method of administration depends on the activity of the protein, but it can be administered parenterally systemically or locally.
  • intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or intraperitoneal administration can be selected, and the administration method can be appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • the pharmaceutical composition may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives together depending on the administration route.
  • surfactants, isotonic agents, stabilizing agents, buffers, solubilizing agents, soothing agents, sulfur-containing reducing agents, and antioxidants which are acceptable as pharmaceutical additives can be added. .
  • the parental CHO DG44 cells are subcultured and cultured in the medium of CHO-S-SFM1IDPM medium (GIBC0-BRL) supplemented with 1% HT supplement (GIBC0-BRL), and are in the logarithmic growth phase.
  • CHO DG44 cells were used.
  • CHO DG44 cells into which a gene encoding a humanized anti-HM1.24 antibody was incorporated were prepared by the method described in International Publication No. WO98 / 145580.
  • humanized anti-HM1.24 antibody-producing CH0 cells humanized anti-HM 1.24 antibody H chain expression vector HEF-RVHs-AHM-ga1 (FERM BP6127) and humanized anti-HM1.24 antibody A CHO cell was co-transformed with the HM1.24 antibody L chain expression vector HEF_RVLa-AHM-gc (FERM BP5645) and used as transformed cells.
  • the preparation of the humanized anti-HM1.24 antibody-producing CH0 cells was performed in the same manner as in International Publication No.W098 / 14580.
  • the cells were subcultured in a CD-CHO medium (GIBCO-BRL) supplemented with mL G418 (GIBCO-BRL), 50 nM MTX and 8 mM L-glutamine. Since these cells slightly formed a cell cluster, the cells were loosened by performing a syringe treatment with a 23 G needle. .
  • the cell concentration is adjusted using the medium to make one well, and the cell suspension is 250 mL. (20 ZmL).
  • Parent cell CHO DG44 cells 100 cells / well, 1,000 cells, 10,000 cells
  • the cell concentration was adjusted using the same medium so as to obtain a Z-well, and 150 mL of the CHO DG44 cell suspension (1 ⁇ 10 3 ZmL, 1 ⁇ 10 4 ZmL, 1 ⁇ 10 5 cells / m, respectively) .
  • each well has one human anti-HM1.24 antibody-producing CH0 cell. Fifteen similar 96-well plates were prepared for each, and a total of 144 samples were cultured.
  • (a) shows the number of colonies selected at the time of microscopy (after 14 days) (ie, the number of colonies that were passaged to 24 wells), and (b) shows the 24-well plate power.
  • the number of colonies expanded to 6 ⁇ el plate is shown.
  • the parent cell of 1,000 or 10,000 Zells By co-culturing, it was shown that the transformed cells could grow even at a cell concentration of 1 nowell, and single clones could be obtained.
  • the method using co-culture with parent cells was demonstrated.
  • single-cell cloning which was previously considered impossible, has become possible. Colonies that showed stable growth in the expanded culture using 24 ⁇ l plate were cultured in the presence of 640 zgZmL of G418 and 50 nM of MTX to obtain the desired homogenous anti-HM1.24 antibody. Production CH0 cells were obtained.
  • a cream bar (Kurita Kogyo) was directly added to the obtained Protein A eluted fraction, and the mixture was stirred at 4 ° C to 10 ° C for 6 hours. Filtration was performed using a cellulose acetate filter (coming: 0.2 m) to obtain 2.65 L of a humanized anti-HM1.24 antibody solution.
  • the obtained humanized anti-HM1.24 antibody was confirmed to be substantially homogeneous by reversed-phase HPLC analysis.
  • CM conditioning medium
  • serum addition method serum addition method
  • cell lysate addition method Single cell cloning by the following methods.
  • CHO DG44 cells incorporating the gene encoding the humanized anti-PTHrP antibody were prepared by the method described in International Publication No. 98Z13388.
  • humanized anti-PTHrP antibody-producing CHO cells humanized anti-PTHrP antibody H chain expression vector hMBClHcDNA / pUC19 (FERM BP-5629) and humanized anti-PTHrP antibody L chain expression vector hMBClLq ⁇ CHO cells co-transformed with cDNA / pUC19 (FERM BP-5630)
  • GIBCO CHO-S-SFMII modified ZCD-CH0 medium half medium was used as a fresh medium for humanized anti-HM1.24 antibody-producing CH0 cells, and fresh human-type anti-PTHrP antibody-producing CHO cells.
  • GIBCO CHO-S-SFMI I medium was used as the medium.
  • humanized anti-HM1.24 antibody-producing CH0 cells or humanized anti-PTHrP antibody-producing CHO cells were diluted with fresh medium so that there was one cell per 0.2 ml. Then, 5,000,000 parental cells, DG44CH0 cells, were added and suspended. This cell suspension was seeded at 0.2nd per well in five 96-well plates.
  • the centrifuged supernatant of the transformed cell culture solution on the first day of culture was filtered through a 0.2 zm filter. To this filtrate, a suspension equivalent to 500 transformed cells on the first day of culture was added to make a total volume of 100 ml. This suspension was seeded at 0.2 ⁇ / well in five 96-well plates. In the method using the culture solution on the third day, the same procedure was carried out using a centrifuged supernatant of the transformed cell culture solution on the third day of the culture.
  • the transformed cell culture solution on the first day of culture was diluted with fresh medium to 1 cellZ200 ⁇ 1.
  • FBS Fetal Bovine Serum IS Cat at # 3000 Lot # 300050933
  • suspend and add 0.2 ml was seeded per 5 wells on 5 wells.
  • the transformed cell culture solution on the first day of culture was diluted with fresh medium to 1 cell / 200 fi 1.
  • the cell lysate precipitate was suspended in this diluted solution, and seeded on five 96-well plates at 0.2 m / well.
  • the preparation of cell lysate was performed as follows. That is, 5,000,000 parental cells on the third day of culture were centrifuged and suspended in 10 ml of sterile water. After freezing at minus 80 degrees and then thawing at 37 degrees twice, centrifuge at 3500 rpm for 60 minutes, rinse the precipitate with 10 ml of sterile water, and centrifuge again at 3500 rpm for 60 minutes. Cell lysate.

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Description

明 細 書 細胞の培養方法 技術分野
本発明は、 細胞の培養方法に関する。 また、 本発明は細胞のク ロ —ニング方法に関する。 さ らに本発明は、 細胞培養により タ ンパク 質を製造する方法に関する。 背景技術
単一の細胞から増殖した細胞群は、 細胞群を構成するひとつひと つの細胞が全く 同一の形質を有すると考えられており、 このような 均質な細胞群を得る為のシングルセルク ローニングは、 学術的にも 商業的にも重要な技術となっている。 例えば、 均質な製品を生産す るこ とが必要な医薬品の製造、 特に均質なタ ンパク質製剤を製造す る為には、 当該タ ンパク質を産生する単一の細胞を選択、 分離し、 そ して増殖させるこ とで、 当該タ ンパク質を産生する均質な細胞群 を構築する必要がある。 従って、 タ ンパク質、 特に組換えタ ンパク 質を生産するにあたっては、 シングルセルク ローニングは欠かせな い技術となっている。
これまで、 シングルセルク ローニングを必要とするモノ ク 口 一ナ ル抗体の作製に際しては、 抗原で免役した動物から得られる脾臓細 胞と不死化した ミ エ口一マ細胞とを細胞融合によりハイブリ ドーマ を作製し、 作製された不均質なハイプリ ドーマ細胞群のひとつひと つの細胞を、 フ ィ ーダ一細胞と共に培養する、 いわゆる限界希釈法 が用いられてきた。 この際、 フ ィ ーダ一と しては、 マイ トマイ シ ン 処理あるいは放射線処理する こ とで増殖能を欠如させた脾臓細胞等 が用いられてきた。
また、 培養が困難な場合には、 I L-6等の増殖因子を培養系にさ ら に添加するこ とが行われてきた。 しかしながら、 これらの方法で用 いられるフ ィ ーダ一細胞は均一の細胞群ではな く 、 実験操作による ばらつきがおおきいこ と、 増殖能を欠如させる為の前処理が必要な こ と等の不都合があった。 さ らには、 細胞によっては、 フ ィ ーダ一 細胞の添加、 さ らには増殖因子ゃゥ シ胎児血清の添加を行っても、 単一の細胞から増殖させる こ とが困難な場合もあった。 発明の開示
本発明は、 従来の限界希釈法の欠点を有しない、 1 個の細胞の培 養方法、 又は細胞のク ロ一ニング方法を提供する と共に、 細胞培養 により タ ンパク質を得る方法を提供する。
本発明者は、 鋭意研究の結果、 タ ンパク質を産生する形質転換細 胞あるいはハイプリ ドーマ細胞 1 個を、 その親細胞と共培養するこ とにより、 効率よ く均質な細胞群を構築するこ とができる こ とを見 ui しフ^。 発明の実施の形態
本発明において、 「 " 1 個" の形質転換細胞を培養する」 、 とは 、 1 個の細胞から培養を開始するこ とを意味し、 その培養の過程で 1 個の細胞から増加した複数の細胞を培養するこ とをも含むこ とは 言うまでもない。
形質転換細胞とは、 遺伝子操作細胞及びハイプリ ドーマ細胞を含 み、 構成的、 すなわちタ ンパク質を産生するよう に操作された細胞 であって、 その夕 ンパク質の産生を誘導する必要がない細胞である 遺伝子操作細胞とは、 所望のタ ンパク質を構成的に産生する形質 を与えるために、 該タ ンパク質をコー ドする DNAを導入した形質 転換細胞を意味する。 遺伝子操作細胞は、 所望のタ ンパク質をコー ドする D NAを適切な発現べクタ一と連結し、 得られた発現べク タ 一を通常使用される方法により細胞に導入して作製される。 このよ うな遺伝子操作細胞には、 該 D N Aが形質転換した細胞内部の染色 体に挿入されている細胞や染色体外部に維持されている細胞を含む 遺伝子操作細胞の調製に適した細胞と して、 全ての種類の宿主細 胞が含まれるが、 好ま し く は真核細胞が挙げられる。 真核細胞と し ては、 動物細胞、 例えば哺乳動物細胞、 酵母細胞、 昆虫細胞等が挙 げられる。 哺乳類細胞と しては、 好ま し く は CH0 ， COS 、 ミ エロー マ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa, Vero等が挙げられる。 CH 0 細胞と しては、 特に dhfr遺伝子を欠損した CH0 細胞である dhfr— CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) , CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60， 1275)あるいは CHO DG44 (Urlaub, Get al. , Cell (1983) 33 (2) 405-412 ) を好適に 使用するこ とができる。
ハイプリ ドーマ細胞とは、 所望のタ ンパク質を構成的に産生する 細胞、 例えば免疫グロプリ ン産生細胞とそれに適合性を有する不死 化細胞、 例えば骨髄腫細胞（P3K， ΥΒ2/0, U266)を融合させるこ とに より作製されるハイプリ ッ ド細胞を意味する。 その他に、 ハイプリ ドーマ細胞と して、 所望のタ ンパク質を産生する細胞を、 不死化さ せる手段、 例えば Epstein-Barrウ ィ ルス（EBV) の使用等により得ら れる不死化細胞も含む。 ハイプリ ドーマ細胞の作製に供せられる所 望のタ ンパク質を産生する細胞は、 動物細胞、 例えばマウス、 ラ ッ ト、 ヒ ト等の細胞が使用される。 親細胞とは、 タ ンパク質を産生する細胞と同 じ株（s t ra i n)の形質 転換される前の細胞を意味する。 親細胞と しては、 特にタ ンパク質 を産生する細胞の調製に用いた細胞が好ま しい。 遺伝子操作細胞の 親細胞は、 例えば形質転換細胞の作製に際し、 所望のタ ンパク質を コ一 ドする D N Aを導入する為に用いた細胞であり、 形質転換して いない細胞である。 ハイプリ ドーマ細胞の親細胞は、 例えば免疫グ ロブリ ンを産生する細胞と融合する為に用いられる不死化細胞であ 。
選択マーカー遺伝子とは、 所望のタ ンパク質を産生する細胞のみ 選択的に生存させる形質を与える遺伝子を意味する。 本発明におい て、 タ ンパク質を産生する形質転換細胞は、 好ま し く は選択マーカ —遺伝子を含んでいる。 親細胞は、 好ま し く は選択マーカー遺伝子 を含んでいない。
遺伝子操作細胞に使用される選択マーカ一遺伝子と して、 ァ ミ ノ グリ コ シ ド ト ラ ンスフ ヱラーゼ（APH) 遺伝子、 チ ミ ジ ンキナーゼ （
T K ) 遺伝子、 大腸菌キサ ンチ ングァニ ンホスホ リ ボシル ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ （H PRT) 遺伝子、 ジ ヒ ドロ葉酸還元酵素 （DHFR) 遺伝子 等が挙げられる。 従って、 タ ンパク質を生産する形質転換細胞を生 存させ、 かつ親細胞を死滅させる為には、 選択マ一力一遺伝子が発 現されないと生存できない条件下で細胞を培養すればよい。 このよ うな条件と して、 G 4 1 8、 メ ト ト レキセ一 トの添加、 等が挙げられる ハイプリ ドーマ細胞に使用される選択マーカ一遺伝子と して、 HP RT等が挙げられる。 融合に付される不死化細胞に選択マーカー遺伝 子を導入するか、 すでに選択マーカー遺伝子を含む不死化細胞を使 用 し、 この細胞と所望のタ ンパク質を産生する細胞とを融合すれば よい。 選択マーカー遺伝子を含む細胞を選択マーカ一遺伝子が発現 されないと生存できない条件下で培養すればよい。 このような条件 と して、 ヒポキサンチン一チ ミ ジン不含培地による培養、 等が挙げ れる。
細胞が産生するタ ンパク質は、 有用タ ンパク質あるいは生理活性 タ ンパク質であればいずれのものであってよ く 、 好ま し く はヒ ト タ ンパク質である。 このようなタ ンパク質と しては、 ホルモン （下垂 体ホルモ ン放出因子、 ォキシ ト シ ン、 バソプレツ シ ン、 副甲状腺ホ ルモン（PTH) 、 副甲状腺ホルモ ン関連ペプチ ド（PTHrP) 、 成長ホル モ ン （GH) 、 プロ ラ ク チン、 ガス ト リ ン、 セク レチ ン、 コ レシス ト キニン、 イ ンス リ ン、 グルカ ゴン、 カルシ トニン） 、 酵素 （例えば 、 グルコースォキシダ一ゼ） 、 酵素阻害剤 （例えば、 キモスタチン ) 、 リ ンフ ォカイ ンあるいはサイ ト力イ ン （例えば、 イ ンターロイ キン一 1 (IL— 1 ) ， IL一 2， IL— 3， IL- 4 , IL一 5， IL— 6， IL- 7 , IL一 8， IL一 9， IL- 10, IL一 11， IL一 12, IL— 13， IL一 15腫瘍壊死因子（TNF) 、 イ ンタ ーフ ヱ ロ ン a (IFNひ） 、 イ ンタ一フ ェ ロ ン 、 イ ンタ ーフ ェ ロ ン ァ 、 イ ンタ ーフ ェ ロ ン 、 イ ンタ一フ ェ ロ ン τ ) 、 造血因子 （例えば、 エ リ ス ロ ポエチ ン（EP0) 、 ト ロ ン ボポェチ ン（TP0) 、 顆粒球コ ロニー刺激因子 （G— CSF)、 マク ロフ ァ 一ジコ ロニー刺激因子 （M— CSF)、 顆粒球マク ロ フ ァ ー ジコ ロニ 一刺激因子 （GM - CSF)、 血液幹細胞増殖因子（SCF))、 成長因子ある いは増殖因子 （例えば、 血管上皮成長因子 （VEGF) 、 神経成長因子 (NGF) 、 繊維芽細胞増殖因子（FGF) 、 血小板由来増殖因子 （PDGF) 、 ト ラ ンスフ ォ ー ミ ング増殖因子 3 (TGF- β ) 、 白血球遊走阻止因 子（UF) 、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 、 オ ンコスタ チ ン M(OSM)) 、 免疫グロブリ ン （例えば、 ヒ ト抗体、 キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体 又はそれらの断片、 Fv， scFv (single chain Fv), scFvダイマ一） 等が挙げられる。 タ ンパク質はまた、 細胞がハイプリ ドーマ細胞で ある場合、 特に免疫グロブリ ンである。
細胞の培養又はク ローニ ングは、 通常使用される条件を用いれば よい。 はじめに所望のタ ンパク質を産生する細胞を適切な培養液に 懸濁する。 培養液は、 通常使用される培養液でよ く 、 例えば DMEM, MEM, R PM I 1 640 , I MDM 等を使用する こ とができる。 培養液には血清 補液、 例えば牛胎児血清（F C S ) 等の血清補液を併用する こ と もでき る し、 あるいは血清を含有しない培養液を用いてもよい。 培養液の pHは約 6〜 8 であるのが好ま しい。
細胞は、 好ま し く は対数増殖期にある細胞を用いる。 細胞がクラ スターを形成している場合、 適切な口径のシ リ ンジを用いてシ リ ン ジングするこ とにより細胞をほぐすこ とができる。 得られた細胞懸 濁液を適宜希釈し、 細胞培養用プレー 卜に細胞 1 個 Zゥェルとなる ように播種する。
親細胞も同様にして調製し、 約 1， 000〜20， 000個、 好ま し く は約 3， 000〜1 0， 000個、 より好ま し く は約 5， 000 ~ 1 0， 000個の親細胞を 目的の細胞 1 個が含まれるゥエルに添加する。 そ して、 適切な条件 下で培養すればよい。 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 9 6〜 1 2 0 時間行い、 必要に応じて適切な二酸化炭素濃度下で、 培地の交換、 通気、 撹拌を加える。
培養される細胞は好ま し く は選択マーカ一遺伝子を含み、 親細胞 はそれを含んでいないため、 選択マ一力一遺伝子が発現する条件に するこ とで親細胞は死滅し、 目的の細胞が生き残る。 選択マーカー 遺伝子が発現する条件は、 例えば選択マ一力一遺伝子が d h f rである 場合、 メ ト ト レキセー トを培養液に添加すればよい。 選択マーカー 遺伝子が発現された後、 適切な時間培養を続け、 検鏡、 例えば顕微 鏡下で観察するこ とによ り生き残った細胞のコ ロニー形成を確認す る。 コロニー形成が確認されれば、 細胞群を適宜より大きな細胞培 養器に移 し、 拡大培養をするこ とができる。 得られたコロニーは 1 個の細胞に由来するため、 コロニー形成が確認されれば細胞のク 口 一二ングがなされたこ とを意味する。
得られたコロニーの培養を続け、 適宜継代及び Z又は拡大培養し 、 産生された所望のタ ンパク質を培養上清または細胞から回収する こ とにより、 均質なタ ンパク質を得る こ とができる。 得られたタ ン パク質は、 適宜、 カラムク ロマ トグラフ ィ ー等を組み合わせて用い て、 当業者に公知の方法で精製し、 所望により保存して使用するこ とができる。 シングルセルを拡大培養する こ とで得られるタ ンパク 質は均質である こ とから、 その後の精製も容易であり、 より純度の 高いタ ンパク質を高収量で取得できる。 従って医薬品の生産におい ては特に生産コス 卜の削減に有用である。 ァフ ィ 二ティ 一カラムク 口マ トグラフ ィ 一に用いるカラムと しては、 例えば、 タ ンパク質に 対する抗体を結合させたァフ ィ 二ティ 一カラムク ロマ トグラフィ一 を用いるこ とができる。 また、 タ ンパク質が抗体であれば、 プロテ イ ン Aカラム、 プロテイ ン Gカラムを用いる こ とができる。
具体的には、 プロテイ ン Aを用いたカラムと しては、 Hyper D, S epharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。 イオン交換カラムク 口マ トグラフ ィ 一、 逆相カラムク ロマ トグラフ ィ ー、 ゲル濾過力ラ ムク ロマ トグラフ ィ 一等も好適に組み合わせて用いられる （St rate g i es for Protein Purification and Character i zat i on ： A Labor atory Course Manual. Ed. Daniel R. Mar s ak e t al. , Cold Spr i ng Harbor Laboratory Press, 1996) 0 また、 カラムク ロマ 卜 グラ フ ィ ー以外にも、 限外濾過膜法、 硫化ア ンモニゥム沈殿法を用いて 粗精製する方法も用いる こ とができる。
本発明のシ ングルセルク ローニング法でク ローニングされ、 生産 されたタ ンパク質は、 特に、 医薬組成物と して用いる こ とができる 。 投与方法は、 タ ンパク質の活性によるが、 非経口的に全身あるい は局所的に投与することができる。 例えば、 静脈内投与、 筋肉内投 与、 皮下投与、 腹腔投与を選択する こ とができ、 患者の年齢、 症状 により適宜投与方法を選択できる。 また、 医薬組成物は、 投与経路 次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであっても よい。 特に、 医薬添加物と して許容される界面活性剤、 等張剤、 安 定化剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 無痛化剤、 含硫還元剤、 酸化防止剤 を添加する こ とができる。
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、 本発明 の範囲を限定する ものではない。
実施例 1 . 親細胞との共培養
親細胞である CHO DG44細胞は、 1 % HT supplement (GIBC0-BRL 社製） 添加 CHO- S-SFM1IDPM培地（GIBC0-BRL社製） の培地を用いて継 代および培養し、 対数増殖期にある CHO DG44細胞を用いた。 ヒ ト型 化抗 HM1.24抗体をコ— ドする遺伝子を組み込んだ CHO DG44細胞は、 国際公開番号 WO 9 8 / 1 4 5 8 0 に記載された方法により調製 した。 得られたヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞 （ヒ ト型化抗 HM 1.24抗体 H鎖発現べク タ一 HEF- RVHs-AHM - gァ 1 (FERM BP6127) と ヒ ト型化抗 HM1.24抗体 L鎖発現べク タ一 HEF_RVLa- AHM - g c (FERM BP5 645)とを用いて CHO 細胞を同時形質転換したもの） を形質転換細胞 と して用いた。
ヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞の調製は、 国際公開番号 W0 9 8/14580 と同様の方法により行い、 このヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞は、 640〃 g /mL G418 (G I BCO- BRL社製） 、 50nM MTXおよ び 8 mM L—グルタ ミ ン添加 CD-CHO培地（GIBCO-BRL社製） にて継代 したものを用いた。 これらの細胞は若干細胞ク ラスタ一を形成して いたため、 2 3 G針でシ リ ンジング処理を行う こ とで細胞をほぐ し 。
ヒ ト型化抗 HMl.24抗体産生 CHO 細胞は、 継代に用いた培地で洗浄 したのち、 1個 ウエルとなるように該培地を用いて細胞濃度を調 製することで細胞懸濁液 250mL (20個 ZmL) と した。 親細胞である CHO DG44細胞は、 1 0 0個/ゥエル、 1, 000個 Zゥエル、 10， 000個
Zゥエルとなるように同じ培地を用いて細胞濃度を調製することで CHO DG44細胞懸濁液 150mL (各々 l x 103 個 ZmL、 1 x 104 個 ZmL 、 1 X 105 個 /mい と した。
ヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞懸濁液を 0. 0 5 mLおよび CH 0 DG44細胞懸濁液を 0. 1 mLづつ 9 6 ゥエルプレー 卜に播種した。 従って、 各ゥエルにはヒ 卜型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞が 1個づ つ存在する。 同様の 9 6 ゥエルプレー トを各々 1 5枚づっ作製し、 合計、 各々 1 4 4 0 サンプルの培養を行った。
37°C、 5%C02 イ ンキュベーターにて合計 1 4 日間培養した後検 鏡を行い、 コロニー形成の確認されたゥエルから細胞を採取し、 さ らに同じ培地を用いて 2 4 ゥエルプレー ト （ l mL) に拡大培養する ことで細胞の安定増殖を確認した。 検鏡により細胞のコ口ニーが確 認されたゥエルの数を表 1 に示した。
表 1
親株添加ア ツセィのク ロ一ニング結果
( a )
親株の細胞数 形成されたコ ロニー数
100個/ゥエル 0
1， 000個/ゥエル 6
10， 000個 zゥェル 5 8 計 6 4
( b )
親株の細胞数 形成されたコロニー数
1， 000個ノウエル 6
10, 000個 zゥエル 3 0 計 3 6
表 1 において、 （ a ) は、 検鏡時 （ 1 4 日後） に選択したコ ロニ —数 （すなわち、 2 4 ゥエルに継代したコロニー数） を示し、 （ b ) は 2 4 ゥエルプレー ト力、ら、 6 ゥエルプレー トに拡大したコロニ 一数を示す。
1 0 0個 Zゥエルの CHO DG44細胞と共培養したゥエルからはヒ ト 型化抗 H M 1 . 2 4 抗体産生 C H O細胞のコロニー形成は全く 得ら れなかつた力く、 1, 000個 Zゥエルも し く は 10, 000個 Zゥエルの CH0 DG44細胞と共培養した場合には各々 6個、 3 0 個づつのコ ロニー形 成が確認された。
従って、 1， 000個 Zゥエルも し く は 10， 000個 Zゥエルの親細胞と 共培養する こ とで、 1 個ノウエルの細胞濃度でも形質転換細胞は増 殖し、 シ ングルク ローンを得る こ とが可能である こ とが示され、 親 細胞との共培養を利用 した方法により、 これまで不可能と考えられ ていたシングルセルク ローニングが可能となった。 2 4 ゥエルプレ ー トを用いた拡大培養で安定増殖を示したコ ロニーは、 640 z gZ mLの G418および 50nMの MTX 存在下で培養し、 目的とする均質なヒ ト 型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞を取得した。
実施例 2 . 拡大培養
拡大培養したヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞 1X 105 個を、 Prima tone 10 g Z L添加 CHO S-SFMI I 培地 （ 6 L x 3 台） にて、 pH 7.2 、 D060%空気飽和、 6 0 rpm の条件下で 1 1 日間培養した。 3 台の培養上清を合わせ、 ザル トブラ ン P Hカプセル （ザル ト リ ウス ) にて濾過し、 rProtein A FF カラム（Pharmac i a) に負荷、 1M NaC 1/lOmMクェン酸リ ン酸緩衝液 pH 7. 5及び 1 0 mMクェン酸リ ン酸緩 衝液 PH7.5 で洗浄後、 2.5mM HC1 pH2.7の溶出条件にて溶出した。
ェン ド トキシンを除去するために、 得られた Protein A 溶出画分 にク リ ム一バー （栗田工業） を直接投入し、 4 °Cから 1 0 °Cにて 6 時間撹拌した。 セルロースアセテー トフ ィ ルター 0. 2 m (コ一 ニング） を用いて濾過する こ とで、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体溶液 2.65 Lを得た。 得られたヒ ト型化抗 HM1.24抗体は、 逆相 H P L C分析で ほぼ均質であるこ とが確認された。
実施例 3.
ヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞と、 ヒ ト型化抗 PTHrP 抗体産 生 CH0 細胞を用いて、 親細胞である CHO DG44細胞との共培養法によ るシングルセルク ローニングと、 その他の方法 （コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウム （CM) 法、 血清添加法、 cell lysate 添加法） によるシン グルセルク ローニングを比較した。 ヒ 卜型化抗 PTHrP 抗体をコー ドする遺伝子を組み込んだ CHO DG44 細胞は、 国際公開番号 98Z 13388 に記載された方法によ り調製した 。 得られたヒ ト型化抗 PTHrP 抗体産生 CHO 細胞 （ヒ ト型化抗 PTHrP 抗体 H鎖発現ベク ター hMBClHcDNA/pUC19 (FERM BP- 5629) と ヒ ト型 化抗 PTHrP 抗体 L鎖発現ベク ター hMBClLq λ cDNA/pUC19 (FERM BP- 5630) とを用いて CHO 細胞を同時形質転換したもの） を形質転換細 胞と して用いた。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞の新鮮 培地と して GIBCO CHO- S-SFMI I 改変 ZCD- CH0培地 （ハーフ培地） を 、 ヒ ト型化抗 PTHrP 抗体産生 CHO 細胞の新鮮培地と して GIBCO CHO - S-SFMI I 培地を用いた。
( 1 ) 親株との共培養法
培養 1 日目のヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞あるいは、 ヒ ト 型化抗 PTHrP 抗体産生 CHO 細胞を、 0.2mlあたり 1 個の細胞が存在 するよう に新鮮培地により希釈し、 これに 5， 000， 000個の親株細胞 である DG44CH0 細胞を加えて懸濁した。 この細胞懸濁液を 96ゥエル プレー ト 5枚に対し、 1 ゥエルあたり 0.2nd播種した。
( 2 ) コ ンディ ショ ンメディ ウム （CM) 法
培養 1 日目の形質転換細胞培養液の遠沈上清を 0.2 z mフ ィ ルタ 一で濾過した。 この濾液に、 培養 1 日目の形質転換細胞 500個相当 量の懸濁液を添加し、 全量を 100mlと した。 この懸濁液を 96ゥエル プレー ト 5枚に対し、 1 ゥエルあたり 0.2πΠ播種した。 3 日目の培 養液を用いる方法では、 培養 3 日 目の形質転換細胞培養液の遠沈上 清をもちいて同様の操作によ り行った。
( 3 ) 血清添加法
培養 1 日目の形質転換細胞培養液を 1 cellZ200 β 1 になるよう に新鮮培地に希釈した。 この希釈液 90mlに対し、 10mlの FBS (Fetal Bovine Serum I. S. C at #3000 Lot #300050933)を加え懸濁し、 96 ゥエルプレー 卜 5枚に対し、 1 ゥエルあたり 0.2ml播種した。
( 4 ) eel 1 sate 添加法
培養 1 日目の形質転換細胞培養液を 1 cell/200 fi 1 になるよう に新鮮培地に希釈した。 この希釈液に、 cell lysate の沈殿を懸濁 し、 96ゥエルプレー ト 5枚に対し、 1 ゥエルあたり 0.2m】播種した 。 尚、 cell lysate の調製は以下の様に行った。 すなわち、 培養 3 日 目の親株細胞 5， 000, 000個を遠心後、 無菌水 10mlに懸濁した。 マ ィナス 80度での凍結、 ついで 37度での融解を 2 回繰り返した後、 35 00回転で 60分遠心し、 沈殿を無菌水 10mlでリ ンス後、 再度 3500回転 で 60分遠心するこ とで cell lysate と した。
i±里
口木
各方法における ヒ ト型化抗 HM1.24抗体産生 CH0 細胞と ヒ ト型化抗 PTHrP 抗体産生 CHO 細胞のコ ロニー出願を、 播種後 20日後あるいは 21日後に観察し、 プレー トあたりのコロニー出現頻度を表 2 に示し た。 この結果、 いずれの細胞の場合も親株細胞との共培養により シ ングルセルク ロ一ニングが可能であった。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24 抗体の場合に観察されたよ う に、 他の方法でシ ングルセルク ローニ ングすることができない場合に、 親株細胞と共培養する シングルセ ルスク リ ーニングは効果のあるこ とが示された。 尚、 コ ン ト ロール と して、 形質転換細胞のみゥエルあたり 1 個、 3個、 10個、 30個、 100個播種した場合、 いずれの形質転換細胞の場合もゥエルあたり 30個あるいは 100個の細胞を播種した場合にはコ ロニーが形成され たが、 10個以下の形質転換細胞を播種した場合にはコ ロニ一の形成 は観察されなかつた。 表 2
各ク ローニング方法におけるコロニー出現数
( A) ヒ ト型化抗 PTHrP 抗体（day20)
ク ローニング方法 コ ロニー出現数
( coloni es/plate) 親株との共培養法 23.0
コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウム法 （ 1 日 目） 10.6
コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウ ム法 （ 3 曰 目） 6.6
血清添加法 27.2
Cell lysate 添加法 4.6
( B ) ヒ ト型化抗 HM1.24抗体（day21)
ク ローニング方法 コロニー出現数
(colonies/plate) 親株との共培養法 36.4
コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウ ム法 （ 1 日 目） 0.0
コ ンディ シ ョ ンメ ディ ウ ム法 （ 3 日 目） 0.0
血清添加法 0.0
Cell lysate 添加法 0.2
産業上の利用可能性
本発明により、 所望のタ ンパク質を産生する 1 個の細胞を培養又 はク ローニングすることが可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . タンパク質を産生する細胞の培養方法であって、 構成的に該 タンパク質を産生することができる 1個の形質転換細胞を、 該細胞 の親細胞と共培養することを特徴とする方法。
2 . タンパク質を産生する細胞のクローニング方法であって、 構 成的に該タンパク質を産生することができる、 1 個の形質転換細胞 を、 該細胞の親細胞と共培養することを特徴とする方法。
3 . 形質転換細胞がハイプリ ドーマ細胞又は遺伝子組換え細胞で ある請求項 1 又は 2 に記載の方法。
4 . ハイプリ ドーマ細胞又は遺伝子組換え細胞が選択マーカー遺 伝子を含む細胞である、 請求項 3 に記載の方法。
5 . 遺伝子組換え細胞が産生するタンパク質が生理活性物質であ る、 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
6 . 生理活性物質がホルモ ン、 酵素、 リ ンホカイ ン、 サイ トカイ ン、 成長因子、 増殖因子も しく は転写因子またはこれらの誘導体あ るいは阻害剤である、 請求項 1 から 5のいずれか 1 項に記載の方法 o
7 . ハイプリ ドーマ細胞又は遺伝子組換え細胞が産生するタ ンパ ク質が免疫グ口ブリ ンまたは免疫グ口ブリ ン誘導体である、 請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 免疫グ口ブ リ ンがマウ ス抗体、 ラ ッ ト抗体、 キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体又はヒ ト抗体である、 請求項 1 から 5 のいずれか 1項に 記載の方法。
9 . ヒ ト型化抗体がヒ ト型化抗 HM1 . 24抗体である請求項 8 に記載 の方法。
10. 免疫グロブリ ン誘導体が Fa b, F ( ab ' ) 2又は一本鎖 F vであ る、 請求項 Ί に記載の方法。
1 1. 形質転換細胞が哺乳動物細胞、 酵母細胞又は昆虫細胞である 請求項 1 から 1 0 に記載の方法。
12. 哺乳動物細胞が CH0 細胞である請求項 1 1 に記載の方法。
1 3. 共培養する親細胞の数が約 1 , 000〜1 0， 000である、 請求項 1 〜 1 2のいずれかに記載の方法。
14. タ ンパク質を製造する方法であって、
( 1 ) 該タ ンパク質を構成的に産生することができる様に遺伝子 操作した形質転換細胞を作製する工程、
( 2 ) 該形質転換細胞を一個づっ該形質転換細胞の親細胞と共培 養し、 所望の特性を有する形質転換細胞を選択する工程、
( 3 ) 工程 2で選択した形質転換細胞を継代及び Ζ又は拡大培養 する工程、
( 4 ) 培養上清または細胞から該タ ンパク質を回収する工程、 を 含む方法。
15. 請求項 1 4の方法によって生産されたタ ンパク質を含む医薬 組成物。
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