KR20130055411A - 치료용 항체 융합 단백질 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TNFR-Fc 융합 단백질을 높은 발현율로 안전하게 생산할 수 있는 신규 현탁 세포주에 관한 것으로, 본 발명에 따른 현탁 세포주는 무혈청 배지에서도 안정화된 TNFR-Fc 융합 단백질을 고효율로 발현시켜 TNFR-Fc 융합 단백질의 대량생산에 적합하다.

Description

치료용 항체 융합 단백질 제조방법 {Method of preparing a therapeutic antibody fusion protein}
본 발명은 TNF 수용체 및 IgG 의 Fc 부분을 융합시킨 융합 단백질을 생산하는 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포주에 도입하기 위한 벡터, 및 상기 세포주를 무혈청 배지에서 현탁 배양하여 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis)은 만성 염증성 질환으로 관절의 통증, 뻣뻣한 느낌, 열감, 부종 및 홍반 등이 나타나며 시간이 지남에 따라 관절이 보기 흉하게 변형 또는 손상되는 증상이 나타난다. 염증으로 인해 관절막을 이루는 조직이 두꺼워지면서 인대, 연골 또는 뼈를 파고 들어 손상시키고, 흔히 대칭적인 패턴으로 잘 나타난다. 류마티스 관절염은 자가 면역 질환의 일종으로 생각되며, 류마티스 관절염에서는 바이러스나 박테리아 등을 공격하는 면역 체계의 이상으로 정상적인 조직인 활액막 또는 관절 조직 등을 침범하는 것으로 알려져 있다. 활액막에 염증이 생기면 효소가 분비되는데, 시간이 지남에 따라 이 효소들과 특정 면역 세포들이 관절 근처의 힘줄 및 인대를 공격하게 된다.
류마티스 관절염의 치료에는 크게 네 가지 계열의 약물들 즉, 비스테로이드성 항염증제, 부신피질 호르몬 제제, 항류마티스 약제 (disease modifying anti-rheumatic drugs; DMARDs) 및 생물학적 제제가 사용된다. 비스테로이드성 항염증제에는 NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drugs), 살리실산염 및 선택적 COX-2 길항제 등 다양한 계열의 약제가 개발되어 있고, 대부분 DMARD와 함께 사용되어야 한다. 이들 약물은 대부분 장에서 흡수되어 주로 간에서 대사되고, 부작용은 위장, 신장, 피부 및 중추신경계 순으로 나타난다. 부신피질 호르몬 제제는 관절의 염증성 통증에 일시적이고 빠른 경감 효과를 보인다. 그러나 장기적으로 투여할 경우 골다공증, 백내장, 쿠싱증후군 및 혈당 상등 등의 부작용이 발생할 수 있다. 항류마티스 약제 (DMARDs)는 골미란과 관절의 손상을 감소시키는 효과가 입증되어 관절염 치료에 있어서 기본이 되는 가장 중요한 약제이다. 메토트렉세이트 (methotrexate; MTX)는 가장 선호되는 DMARD이며 비교적 안전하지만, 구역감, 구강 궤양, 간독성, 골수 억제 및 약물 유발성 폐렴 등이 부작용이 있다. 경한 질환의 초기에 하이드록시클로로퀸 (hydroxycholoroquine)을 사용해 볼 수 있는데, 이 또한 비교적 안전하지만 망막독성이 있다. 레플루노마이드 (leflunomide)는 피미리딘 합성을 억제하면서 작용하는데, 설사, 두통 및 고혈압 등을 일으킬 수 있다. 생물학적 제제로는 TNF-alpha 길항제 및 anakinra (IL-1 수용체 길항제) 등을 들 수 있다. 이 중 특히 TNF-alpha 길항제는 DMARD에 반응이 없는 중등도 이상의 류마티스 관절염 환자에서 증상과 증후 조절에 효과적이었으며, 효과도 1~2주 내에 나타난다.
면역에 관여하는 여러 사이토카인들 중 종양괴사인자 (Tumor necrosis factor, TNF)는 특히 염증 반응에서 중요한 역할을 하고 있어, 이 물질의 기능 차단은 면역 이상으로 유발된 염증 치료제 개발에서 매우 중요한 표적이 된다. 생체 내 TNF 감소를 목적으로 개발된 바이오 신약에는 항-TNF 항체, 또는 TNF 수용체 (TNF Receptor, TNFR) 및 면역글로불린 G (Immunoglobulin, IgG)의 Fc 부분을 융합시킨 융합 접합체의 두 종류가 있다. 항체 제제는 한번 투여로 효과가 수 주간 지속된다는 것이 장점이나, 과량 투여로 인해 이 약물의 효과를 차단하는 항체가 체내에서 쉽게 만들어 진다는 단점이 있다. 반면 수용체-면역글로불린 융합 단백질 치료제는 주 2회 투약의 번거로움이 있으나, 적은 양의 투여로 동일한 효과를 얻을 수 있고 차단 항체의 부작용이 항체보다 적어 부작용 감소 및 효능 개선의 장점이 있다. 전자의 예로는 센토코 (Centocor)사의 레미케이드 (Remicade®)와 애보트 (Abbott)사의 휴미라 (Humira®)가, 후자의 예로는 암젠 (Amgen)사의 엔브렐 (Enbrel®) 이 각각 시판되고 있다.
이뮤넥스 (Immunex)사가 개발한 엔브렐 (Enbrel®, 성분명: etanercept)은 TNF 억제제의 일종으로 TNF 수용체 및 IgG의 Fc 부분 (TNFR-Fc) 융합 단백질이며, 1998년 류마티스 관절염 치료제로 미국 FDA 승인을 받았다. 엔브렐은 류마티스 관절염 치료 효능 외에도 세계 최초로 소아성 (4～17세) 류마티스 관절염에 대한 적응증을 가지고 있으며, 최근에는 건선 (psoriasis) 적응증을 승인 받아 그 시장이 계속적으로 증가되어 공급량의 증대가 절실히 요구되고 있다.
TNFR-Fc 융합 단백질을 고효율로 생산하기 위해서 배양 기간의 연장, 생존 세포의 농도 증가 및 세포 단위 생산성의 증가를 유도하는 다양한 방법이 연구되고 있다. 이 중에 세포 단위 생산성을 높이기 위해, 세포 배양 중에 부티르산나트륨 (sodium butyrate) 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)와 같은 화학 물질을 공급하거나, 과삼투압 스트레스 및 낮은 온도 등의 환경적 스트레스를 적용시키고 있다. 하지만 이런 방향의 접근 방식은 세포 단위 생산성을 증가시키는데 한계가 있다. 즉, 세포 자체의 단위 생산성을 높이는 것이 더 확실한 방법이라 하겠다.
이에 본 발명자들은 TNFR-Fc 융합 단백질을 높은 발현율로 안전하게 생산할 수 있는 신규한 현탁 세포주를 구축하였고, 상기 세포주가 무혈청 배지에서도 안정화된 TNFR-Fc 융합 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TNF 수용체 및 항체의 Fc 부분을 융합시킨 융합 단백질을 생산하는 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질을 생산하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질을 생산하는 세포주를 무혈청 배지에서 현탁 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 TNFR(Tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질을 고효율로 생산할 수 있으며, 무혈청 배지에서의 적응성이 우수한 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는 TNFR-Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 및 gIVS 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 것이다.
바람직하게, 본 발명은 TNFR 및 항체 Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 유전자 및 서열번호 2의 gIVS (globin intervening sequence) 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 재조합 세포주에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 벡터는 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 세포주는 CHO 세포주일 수 있으며, 무혈청 배지에서 배양된 현탁 세포주일 수 있다.
바람직하게, 상기 세포주는 한국 세포주 은행에 수탁번호 KCLRF-BP-00273으로 기탁된 세포주인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 TNFR 및 항체 Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 유전자 및 서열번호 2의 gIVS 유전자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 벡터는 DHFR 유전자를 더 포함할 수 있으며, 도 1의 개열지도를 가지는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 현탁 배양하는 단계를 포함하는, TNFR 및 항체 Fc 가 융합된 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 TNFR 및 항체 Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 및 gIVS 유전자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질 전환된 재조합 세포주를 제공한다.
본 발명에서 융합 단백질은, 두 개 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 말하며, 본 발명에서는 TNFR 및 항체의 Fc 부분이 연결된 단백질을 의미한다. 상기 항체는 인간 IgG 서브클래스의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 이용될 수 있고, 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었다.
본 발명에서 gIVS (globin intervening sequence) 유전자는 토끼 베타 글로빈에서 유래된 것으로, 상기 TNFR-Fc 융합 단백질의 발현시 전사 효율을 높여 궁극적으로 고효율의 융합 단백질 발현을 가능하게 한다. 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 gIVS 유전자 서열을 서열번호 2로 나타내었다.
바람직하게, 본 발명의 벡터는 메토트렉세이트를 이용하여 유전자를 증폭시키기 위해 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자를 더 포함할 수 있다. DHFR 은 다이하이드로폴산을 테트라하이드로폴산으로 환원시키는 효소로서, 핵산 합성에 필수적인 효소이며 세포성장에 반드시 필요한 효소이다. 메토트렉세이트는 DHFR 저해제로서 폴산이 다이하이드로폴레이트(FH2)를 거쳐 테트라하이드로폴레이트(FH4)로 환원되는 것을 억제시킨다. 본 발명에서는 목적 단백질인 TNFR-Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 DHFR 유전자의 인근에 위치하게 되어, 인위적으로 배지 내 메토트렉세이트 농도를 단계별로 높여줄 때마다 세포주에서 생존에 필요한 DHFR 유전자와 함께 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 함께 증폭되므로, TNFR-Fc 융합 단백질을 고발현시키는데 보다 적합할 수 있다.
본 발명의 목적상 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 인트론, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pAD11 벡터를 백본으로 사용하였으며, pAD11은 CMV (cytomegalovirus)로부터 유래된 프로모터, 우태 성장 호르몬으로부터 유래된 폴리 (A) 서열 (poly (A) sequences), 토끼 베타 글로빈에서 유래된 gIVS (globin intervening sequence) 및 기타 요소를 포함한다. 본 발명에서는 상기 pAD11 의 CMV 프로모터의 5'에 마우스 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자 (Pubmed, NM 010049)를 추가하였으며, TNFR-Fc의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 분자를 삽입하여 이를 pAD11-pro 로 명명하였으며, 그 구조를 도 1에 나타내었다.
본 발명이 벡터로 형질 질환되어 TNFR-Fc 융합 단백질을 생산하는 능력을 가지는 세포주는 바람직하게는 동물 세포이며, CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, CV1, MDCK, 293, 3T3, PC 12, 하이브리도마 (hybridoma) 또는 미엘로마 (myeloma) 세포 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, CHO 세포인 것이 바람직하며, dhfr- CHO 세포인 것이 보다 바람직하다.
바람직하게, 본 발명의 세포주는 무혈청 배지에서 배양된 현탁 세포주일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 TNFR-Fc 융합 단백질의 발현율을 높이기 위해 코돈이 최적화된 서열번호 1의 TNFR-Fc의 유전자 (국제공개번호 05/012353), 및 전사 효율을 높이기 위해 토끼 베타 글로빈에서 유래된 서열번호 2의 gIVS 유전자 (Mol Cell Biol, 1988 8:4395)를 포함하는 도 1의 벡터를 CHO 세포에 도입하였고, 상기 벡터가 트랜스팩션된 CHO 세포주를 HT (hypoxanthine & thymidine)가 제거된 배지에서 limiting dilution 방법으로 배양하여 클론을 1차 선별하였다. 또한, 1차 선별된 각각의 클론을 메토트렉세이트로 적응시켜 목적 유전자를 증폭시키고, 상기 메토트렉세이트에 적응된 클론 중 생산성이 우수한 CHO 세포주를 무혈청의 배지에서 현탁 배양하여 TNFR-Fc 융합 단백질을 생산하는 세포주를 최종적으로 결정하였으며, 상기 재조합 세포주를 DETA417 로 명명하고 2011년 10월 17일자로 한국 세포주 연구재단 (서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소)에 기탁하였으며, 수탁번호 KCLRF-BP-00273을 부여받았다. 따라서, 바람직하게 본 발명의 재조합 세포주는 상기 수탁번호 KCLRF-BP-00273의 세포주이다.
이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 세포주는 TNFR-Fc 융합 단백질을 고효율로 생산할 수 있으며, 무혈청 배지에서의 적응성이 우수한 특징이 있다.
또한, 본 발명은 또한 상기 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 현탁 배양하는 단계를 포함하는, TNFR 및 항체 Fc 가 융합된 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 TNFR-Fc 융합 단백질 생산 세포주는 무혈청 배지에서 정상정인 성장을 나타내었으며 (도 5), 융합 단백질의 생산성 또한 꾸준히 증가하여 최종 약 150mg/L의 단백질 농도에 도달하였다 (도 6). 또한, 배양액 내에 발현된 TNFR-Fc 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인할 수 있었다 (도 7).
본 발명은 TNFR-Fc 융합 단백질을 고발현하는 동물 세포주를 구축하였으며, 상기 세포주를 통하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 높은 생산성을 달성시키고, 무혈청 배지에서도 안정화된 TNFR-Fc 융합 단백질을 고효율로 발현시켜 절감된 원가로 생산할 수 있다.
도 1은 발현 벡터 pAD11-pro의 제작과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 TNFR-Fc 융합 단백질 발현 세포주의 제작 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 1차 선별된 TNFR-Fc 융합 단백질 발현 클론의 초기 생산성을 나타낸 도면이다.
도 4는 1차 선별된 TNFR-Fc 융합 단백질 발현 클론의 각 농도별 메토트렉세이트 (MTX) 적응 후 생산성을 나타낸 도면이다.
도 5는 최종 선별된 TNFR-Fc 융합 단백질 발현 세포주의 무혈청 현탁 배양에의 적응 (cell density 및 viability)을 나타낸 도면이다.
도 6은 최종 선별된 TNFR-Fc 융합 단백질 발현 세포주의 무혈청 현탁 배양에의 적응 완료 후 세포 성장 및 생산성을 나타낸 도면이다.
도 7은 TNFR-Fc 융합 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다 (레인 1: 레더, 레인 2: 무혈청 현탁 배양에서 생산된 TNFR-Fc 융합 단백질, 레인 3: 레더).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< 실시예 1> TNFR - Fc 융합 단백질의 발현 벡터의 제작
발현 벡터 pAD11은 RcCMV 골격 (backbone)으로부터 수득하였다 (Invitrogen, Carlsbad 로부터 가능). pAD11은 CMV (cytomegalovirus)로부터 유래된 프로모터, 우태 성장 호르몬으로부터 유래된 폴리 (A) 서열 (poly (A) sequences), 토끼 베타 글로빈에서 유래된 gIVS (globin intervening sequence) 및 기타 요소를 포함한다. pAD11 벡터를 제조하기 위하여는 RcCMV (Invitrogen) 벡터를 여러 군데 변형시켰다. 우선, 네오마이신 저항성 (neomycin resistant) 부위는 Xho I 효소에 의해 제거시키고, gIVS를 CMV 프로모터 부위의 3' 에 추가시켰다. 또한 마우스 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자 (Pubmed, NM 010049)는 CMV 프로모터의 5' 에 추가시켰다. TNFR-Fc의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 분자를 수득하기 위하여, 유전자는 TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스에 의해 합성하였다. pAD11 벡터 내로 TNFR-Fc 유전자를 삽입하기 위하여 EcoR I 부위를 TNFR 유전자의 5' 말단에 생성시켰으며, Xba I 부위를 Fc 유전자의 3' 말단에 생성시켰다. 이 TNFR-Fc 유전자는 EcoR I 및 Xba I 부위를 사용하여 pAD11에 서브클로닝 시켰고, 이를 pAD11-pro로 명명하였다 (도 1).
< 실시예 2> TNFR - Fc 융합 단백질 생산 세포주의 선별
유전자 도입하기 이틀 전에 dhfr 유전자가 결실된 CHO (DG44) 세포를 6-웰 플레이트에 10% 우태아 혈청과 HT (hypoxanthine & thymidine)이 포함된 MEM-alpha (Sigma) 배지에서 1 X 105 cells/ml 의 농도로 계대 배양하였다. 배양 48시간 후, 세포 컨플루언시 (confluency)가 50% 정도이며 균등하게 분포되어 있는지 확인하고, 리포펙타민 (Gibco, USA)을 이용하여 실시예 1에서 제조한 pAD11-pro를 CHO 세포 내에 도입하였다. 배양 24 시간 후 HT supplement가 제거된 MEM-alpha 배지로 변경하였고, 이를 한 개의 웰 당 100 개의 세포가 들어갈 수 있도록 96-웰 플레이트에 세포를 접종하였다. 96-웰 플레이트 상에서 3~4일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 배양 7일부터 HT가 제거된 배지에서도 성장하는 콜로니가 96-웰 플레이트의 각 웰에 형성되기 시작하였다. 약 3주 간의 선별 과정을 수행한 후, 이를 계대 배양하여 각각 2개의 96- 웰 플레이트로 나눈 다음 한 개는 콜로니가 생성된 웰에 한하여 배양 상등액 내 TNFR-Fc 융합 단백질의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였고, 다른 한 개는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide : Thiazolyl blue) 분석을 실시하였다. 두 가지 결과를 계산하여 발현이 상대적으로 높은 클론들을 선별하여 19개의 클론들을 얻었다 (1차 세포주 선별).
1 차 선별된 각 클론들을 10% dFBS가 첨가된 MEM-alpha 배지에서 dhfr 저해제인 메토트렉세이트 (MTX, methotrexate)의 농도를 20 nM에서 100 nM까지 점차적으로 높여 처리함으로써 TNFR-Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자들이 동시에 증폭되도록 하였다. MTX에 적응 배양하면서 각 MTX 농도별로 세포의 생산성을 확인하였고, 높은 세포 생산성을 가진 클론 한 개를 선별하였다 (2차 세포주 선별) (도 2).
< 실시예 3> 선별된 TNFR - Fc 융합 단백질 생산 세포주의 현탁 배양 적응
선별되어 동결 보관 중인 세포주를 37 ℃ 항온조에서 해동한 다음 T-175 플라스크에서 MEM-alpha 배지 (10% 우혈청 및 50 nM MTX 포함)에 키워 세포를 준비했다. T-175 플라스크에서 완전히 자라면, 용기에서 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 0.25% 트립신 용액 5mL을 첨가하여 부착되어 있는 세포를 떨어지게 하였다. 이렇게 T-175 플라스크에서 분리된 세포를 MEM-alpha 배지를 이용하여 모은 다음 원심분리를 하였다. 세포 외의 상등액을 모두 제거하고 MEM-alpha 배지 (10% 우혈청 및 50 nM MTX 포함)에 세포를 다시 풀어 준 다음 T-175 플라스크에 계대 배양하였다.
3회 계대 배양된 세포를 트립신 용액으로 플라스크에서 분리시킨 다음 20mL의 무혈청 배지 (EX-CELL CHO DHFR- medium, Sigma)에 풀어 주었다. 이렇게 풀어준 세포를 원심분리하여 모으고, 이 세포를 2회 같은 방법으로 실시하여 잔존하는 MEM-alpha를 제거하여 주었다. 모은 세포를 무혈청 배지 (EX-CELL CHO DHFR- medium, Sigma)로 현탁하고 초기 세포 농도를 5 X 105 cells/mL로 조정하여 30mL의 세포를 포함하는 용액으로 만든 다음 125mL의 현탁 배양 플라스크에 접종하였다.
현탁 배양은 100 rpm으로 교반하면서 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 실시하였다. 매 3일 마다 무혈청 배지를 교환하여 주었고, 이 때 세포농도가 1 X 106 cells/mL 이상이면 다시 세포농도가 5 X 105 cells/mL이 되도록 조정하였다. 이렇게 30 계대 이상 배양하여 90% 이상의 세포가 정상적으로 자라도록 하였다. 이 세포를 원심분리하여 모은 다음 1 X 107 cells/vial 농도가 되도록 무혈청 동결 보관용 배지 (DMSO, serum free cell freezing medium, Sigma)로 조정한 후 동결 보관하였다.
< 실험예 1> TNFR - Fc 융합 단백질 생산 세포주의 생산성 측정
실시예 2의 방법으로 각 클론들이 발현하는 TNFR-Fc 융합 단백질의 양은 TNFR ELISA 키트 (R&D Systems)을 사용하여 확인하였다. 1차 선별되었던 클론들의 생산성을 도 3에 나타내었다.
이렇게 선별한 클론들은 20 nM MTX를 첨가하여 배양을 시작하였으며, 점차적으로 100 nM까지 MTX 농도를 높임으로써 생산성이 증가하도록 유도하였다. 1차 선별되었던 19개 클론들을 각 MTX 농도 단계별로 생산성을 확인하였으며, 이 중 대표적인 3개 클론의 생산성을 도 4에 나타내었다. MTX의 처리를 통해 생산성 향상이 이루어졌으나, 100 nM 이상의 MTX 농도부터는 더 이상의 생산성 증가가 나타나지 않고, 오히려 생산성이 감소하였다. MTX 적응 배양 후의 2차 세포주 선별 결과 50 nM MTX 농도에서 TNFR-Fc 융합 단백질 생산성이 가장 높은 한 개의 클론을 최종으로 결정하였다.
< 실험예 2> TNFR - Fc 융합 단백질 생산 세포주의 무혈청 배지에서의 생산성 측정
동결 보관된 세포를 해동한 다음 50 mL 코니칼 튜브에 옮기고 10 mL 무혈청 배지 (EX-CELL CHO DHFR- medium, Sigma) 용액으로 희석하였다. 세포를 원심분리하여 모음 다음 10 mL의 무혈청 배지로 풀어준 후, 30mL의 무혈청 배지를 첨가하여 T-175 플라스크에 옮겨 담았다. 이를 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 키웠다. 24 시간 후 60 mL의 무혈청 배지를 첨가하여 250 mL 현탁배양 플라스크에 옮겨 담궜다. 이 플라스크 용기를 100 rpm으로 교반하면서 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다.
5 X 105 cells/mL 의 세포농도로 접종하여 3일간 배양한 후 이 때 도달한 세포의 농도에 관계없이 희석하여 다시 세포농도를 5 X 105 cells/mL로 조정하였다. 이를 11 passage까지 반복하여 실시한 후에 세포의 조정 농도를 2 X 105 cells/mL로 변경하였다. 역시 3일간 배양 후 희석하여 다시 세포농도를 2 X 105 cells/mL로 조정하였다. 이를 40 passage까지 반복하여 95% 이상의 세포가 정상적으로 살아 가게 되는 것을 확인하였다 (도 5).
무혈청 배지에서 정상적인 성장이 이루어지는 세포의 융합 단백질의 생산성을 확인하기 위하여, 세포 농도를 3 X 105 cells/mL로 접종한 후 교반하면서 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 배지의 교환 없이 9일간 배양하였다. 24시간마다 한 번씩 배양 시료를 채취하여 융합 단백질의 농도를 측정하였다. 무혈청 배지에 적응된 이 세포는 최대 5 X 106 cells/mL의 세포 농도에 도달하였으며, 배양이 종료되었던 배양 9 일차의 cell viability는 약 90 %였다. 융합 단백질의 생산성 또한 꾸준히 증가하여 최종 약 150 mg/L의 단백질 농도에 도달하였다 (도 6).
< 실험예 3> TNFR - Fc 융합 단백질 생산 세포주에 의해 생산된 단백질의 확인
무혈청 배지 (EX-CELL CHO DHFR- medium, Sigma)에서 적응 배양을 마치고 최종으로 결정된 TNFR-Fc 융합 단백질 생산 세포주를 DETA417 로 명명하고, 2011년 10월 17일자로 한국 세포주 연구 재단 (서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소)에 기탁하여, 수탁번호 KCLRF-BP-00273을 부여받았다. 상기 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 3일간 배양한 후 배양액 내에 발현된 TNFR-Fc 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 먼저 4~12% SDS-PAGE를 이용하여 배양액을 전기 영동 실시하였고, 이를 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 5% 스킴 밀크 (skim milk) 용액으로 처리하였다. 이 막에 흡착된 TNFR-Fc 융합 단백질을 확인하기 위하여 TNFR 다클론항체를 1차 처리 후, 알칼라인 포스파타제가 결합되어 있는 다클론항체를 사용하였다. 기질 용액을 첨가하여 발색 시킨 후 분자량 150,000 Da의 단백질을 확인할 수 있었다 (도 7).
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00273 20111017
<110> DONG-A PHARM. CO., LTD. PROGEN CO., LTD. <120> Method of preparing a therapeutic antibody fusion protein <130> DPP20116266KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotid sequences encoding an TNFR-Fc fusion protein <400> 1 atggctcccg tggccgtgtg ggccgctctg gccgtgggcc tggagctgtg ggccgctgcc 60 cacgccctgc ctgcccaggt ggcctttaca ccctatgctc ccgagcccgg cagcacctgc 120 agactgagag agtactacga ccagacagcc cagatgtgtt gcagcaagtg cagccccggc 180 cagcacgcca aggtgttctg caccaagacc agcgacaccg tgtgtgacag ctgcgaggac 240 agcacctaca cccagctgtg gaactgggtg cccgagtgcc tgagctgtgg cagcagatgc 300 agctccgacc aggtggagac ccaggcctgc accagagagc agaatagaat ctgcacctgc 360 agacctggct ggtactgtgc cctgagcaag caggagggct gcagactgtg tgcccctctg 420 agaaagtgca gacctggctt tggcgtggcc agacccggca ccgagaccag cgacgtggtg 480 tgcaaaccct gtgcccctgg caccttcagc aacaccacat ccagcaccga catctgcaga 540 ccccaccaga tctgcaacgt ggtggccatt cccggcaatg ccagcatgga tgccgtgtgc 600 accagcacca gccccaccag aagcatggcc cctggcgccg tgcacctgcc ccagcccgtg 660 agcaccagaa gccagcacac ccagcccaca cccgagccca gcacagcccc tagcaccagc 720 ttcctgctgc ccatgggccc cagccctcct gccgagggca gcacaggcga tgagcccaag 780 agctgcgaca agacccacac ctgtcctcct tgccctgccc ccgagctgct gggcggcccc 840 agcgtgttcc tgtttccccc taaacccaag gacaccctga tgatcagcag aacacccgag 900 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggatcccg aggtgaagtt caactggtac 960 gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaaaccca gagaggagca gtacaacagc 1020 acctacagag tggtgagcgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080 tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cctgccccca tcgagaagac catcagcaag 1140 gccaagggcc agcccagaga gccccaggtg tacaccctgc ctcccagcag agaggagatg 1200 accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctatcccag cgacattgcc 1260 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aataactaca agaccacacc tcccgtgctg 1320 gacagcgatg gcagcttctt tctgtacagc aagctgaccg tggacaagag cagatggcag 1380 cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1440 aagagcctga gcctgagccc tggcaagtga 1470 <210> 2 <211> 573 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> gene <222> (1)..(573) <223> gIVS <400> 2 gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60 ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaacgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180 cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240 atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300 tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360 ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420 cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480 tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540 aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cag 573

Claims (5)

  1. TNFR (Tumor necrosis factor receptor) 및 항체 Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 유전자 및 서열번호 2의 gIVS (globin intervening sequence) 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 재조합 세포주 (수탁번호 KCLRF-BP-00273).
  2. TNFR(Tumor necrosis factor receptor) 및 항체 Fc 를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 유전자 및 서열번호 2의 gIVS (globin intervening sequence) 유전자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자를 추가로 포함하는 것인 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인 벡터.
  5. 제1항의 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 현탁 배양하는 단계를 포함하는, TNFR 및 항체 Fc 가 융합된 융합 단백질을 제조하는 방법.
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