EA014525B1 - Антитела к склеростину и способы их применения - Google Patents

Антитела к склеростину и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA014525B1
EA014525B1 EA200600037A EA200600037A EA014525B1 EA 014525 B1 EA014525 B1 EA 014525B1 EA 200600037 A EA200600037 A EA 200600037A EA 200600037 A EA200600037 A EA 200600037A EA 014525 B1 EA014525 B1 EA 014525B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
beta
bone
binding
antigen
Prior art date
Application number
EA200600037A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600037A1 (ru
Inventor
Мэри И. Брункоу
Дейвид Дж. Гэлас
Брайан Ковасевич
Джон Т. Маллиген
Брайан У. Пипер
Джеффри Вэн Несс
Дейвид Дж. Уинклер
Original Assignee
Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33563705&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014525(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк. filed Critical Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк.
Publication of EA200600037A1 publication Critical patent/EA200600037A1/ru
Publication of EA014525B1 publication Critical patent/EA014525B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего. Увеличение минеральной плотности кости имеет применение при заболеваниях и состояниях, в которых низкая минеральная плотность кости характеризуется для такого состояния, как остеопения, остеопороз - переломы кости.

Description

Данное изобретение относится в общем к фармацевтическим продуктам и способам и более конкретно к способам и композициям, пригодным для увеличения минерального содержания кости. Такие композиции и способы могут быть использованы для лечения большого разнообразия состояний, в том числе, например, остеопении, остеопороза, переломов и других нарушений, в которых отличительным признаком заболевания является низкая минеральная плотность кости.
Уровень техники
Две или три отличающиеся фазы изменений костной массы встречаются на протяжении жизни индивидуума (см. \Уек1 1. Мей. 154:63-77, 1991). Первая фаза имеет место как у мужчин, так и у женщин и протекает для приобретения максимальной костной массы. Эта первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых пластинок роста и радиального роста вследствие скорости периостеального присоединения новых слоев (утолщения надкостницы). Вторая фаза начинается в возрасте около 30 лет для губчатой кости (плоских костей, таких как позвонки и таз) и в возрасте около 40 лет для кортикального слоя кости (например, длинных костей, находящихся в конечностях) и продолжается до старости. Эта фаза характеризуется медленным разрежением кости и встречается как у мужчин, так и у женщин. У женщин встречается также третья фаза разрежения кости, наиболее вероятно, обусловленная постклимактерической недостаточностью эстрогена. Во время только этой фазы женщины могут терять дополнительные 10% костной массы из кортикального слоя кости и 25% из губчатого компартмента (см. Ктддк, кирга).
Потеря минерального содержания кости может быть обусловлена большим разнообразием состояний и может быть результатом существенных медицинских проблем. Например, остеопороз является истощающим заболеванием у людей, характеризующимся заметными уменьшениями скелетной костной массы и минеральной плотности, структурным разрушением кости, включающим деградацию микроархитектуры кости и соответствующие увеличения хрупкости кости и подверженности к перелому у пораженных индивидуумов. Остеопорозу у людей предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более чем на одно стандартное отклонение, но менее чем на 2,5 стандартных отклонений ниже средней величины для кости молодого взрослого человека), состояние, обнаруживаемое у приблизительно 25 млн людей в Соединенных Штатах. Другие 7-8 млн пациентов в Соединенных Штатах диагностированы как имеющие клинический остеопороз (определяемый как минеральное содержание кости, которое более чем на 2,5 стандартных отклонений ниже минерального содержания кости зрелой кости молодого взрослого человека). Остеопороз является одним из требующих наибольших расходов заболеваний для системы здравоохранения, стоящим десятков миллиардов долларов ежегодно в Соединенных Штатах. Кроме связанных с медико-санитарной помощью расходов долгосрочное врачебное обслуживание и потерянные рабочие дни увеличивают финансовую и социальную стоимость этого заболевания. Во всем мире приблизительно 75 млн людей находятся при риске остеопороза.
Частота встречаемости остеопороза у населения увеличивается с возрастом, и среди членов ИндоЕвропейской группы населения остеопороз является преобладающим у женщин (которые составляют 80% пула пациентов с остеопорозом в Соединенных Штатах). Увеличенная хрупкость и подверженность к перелому скелетных костей у пожилых людей усугубляется увеличением риска случайных падений в этой популяции. Более 1,5 млн связанных с остеопорозом переломов костей сообщаются каждый год в Соединенных Штатах. Переломы тазобедренных суставов, кистей и позвонков находятся среди наиболее частых повреждений, связанных с остеопорозом. Переломы тазобедренных суставов, в частности, являются крайне неудобными и дорогими для пациента, а для женщин коррелируют с высокими коэффициентами смертности и болезненности.
Хотя остеопороз определяется как увеличение риска перелома вследствие уменьшения костной массы, ни одно из доступных в настоящее время лечений для скелетных нарушений, по существу, не может увеличивать плотность кости у взрослых. Все врачи хорошо понимают, что необходимы лекарственные средства, которые могли бы увеличивать плотность костей у взрослых, в частности костей кисти, позвоночника и тазобедренного сустава, которые находятся при риске в случае остеопении и остеопороза.
Существующие стратегии для предупреждения остеопороза могут предоставить некоторую пользу для индивидуумов, но не могут гарантировать освобождение от этого заболевания. Эти стратегии включают снижение физической активности (в частности, активностей, приводящих к увеличению массы) с достижением старости, включение достаточного количества кальция в пищевой рацион и избегание потребления продуктов, содержащих алкоголь или табак. Для пациентов, обнаруживающих клиническую остеопению или остеопороз, все существующие терапевтическиие лекарственные средства и стратегии направлены на уменьшение дополнительной потери костной массы ингибированием процесса резорбции костей, природного компонента процесса ремоделирования, который встречается конститутивно.
Например, в настоящее время для замедления потери костной массы прописывают эстроген. Однако имеется некоторая полемика относительно того, имеется ли долгосрочная польза для пациентов и имеется ли какой-то эффект вообще в случае пациентов в возрасте более 75 лет. Кроме того, считается, что применение эстрогена увеличивает риск рака молочной железы и эндометрия.
- 1 014525
Высокие дозы пищевого кальция (с витамином или без витамина Ό) также предлагаются для постклимактерических женщин. Однако высокие дозы кальция могут часто иметь неприятные побочные желудочно-кишечные эффекты, и постоянно должен проводиться мониторинг уровней кальция в сыворотке и моче (см. Кйоз1а аий Ктдзз, Мауо Οΐίη. Ргос. 70:978-982, 1995).
Другие терапевтические вещества, которые были предложены, включают кальцитонин, бисфосфонаты, анаболические стероиды и фторид натрия. Однако такие терапевтическиие вещества имеют нежелательные побочные действия (например, кальцитонин и стероиды могут вызывать тошноту и провоцировать иммунную реакцию, бисфосфонаты и фторид натрия могут ингибировать репарацию переломов, даже при умеренном увеличении плотности костей), которые могут предотвращать их применение (см. КНоЧа апй Βί§88, зирга).
Ни одна практикуемая в настоящее время терапевтическая стратегия не включает лекарственное средство, которое стимулирует или усиливает рост новой костной массы. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения минерализации кости и, следовательно, могут быть использованы для лечения широкого разнообразия состояний, в которых желательным является увеличение костной массы. Кроме того, данное изобретение обеспечивает другие, связанные с этим преимущества.
Сущность изобретения
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс или семейство ТОЕ-бетасвязывающих белков, а также анализы для отбора соединений, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, соединения, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, и способы использования таких соединений для лечения или предупреждения широкого разнообразия состояний.
В одном аспекте данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые выбирают из группы, состоящей из: (а) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность 8ЕО ГО N0: 1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или ее комплементарной последовательности; (Ь) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты (а) при жестких условиях; и (с) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТОЕ-бета-связывающий белок по (а) или (Ь). В родственных аспектах данного изобретения выделенные молекулы нуклеиновых кислот обеспечивают на основе гибридизации только с частью одной из вышеописанных последовательностей (например, для (а) гибридизация может быть с зондом из по меньшей мере 20, 25, 50 или 100 нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов 156-539 или 555-687 8Е0 ГО N0: 1). Как должно быть вполне очевидным, необходимая жесткость, используемая для гибридизации, может варьироваться на основании размера зонда. Например, для 25-мерного зонда жесткие условия могут включать следующее: 60 мМ Трис рН 8,0, 2 мМ ЭДТА, 5х среду Денхардта, 6х 88С, 0,1% (мас./об.) Ν-лаурилсаркозин, 0,5% (мас./об.) ΝΡ-40 (нонидет Р-40) в течение ночи при 45°С с последующими двумя промывками 0,2х 88С/0,1% ДСН при 45-50°С. Для 100-мерного зонда при условиях низкой жесткости подходящие условия могут включать следующее: 5х 88РЕ, 5х среду Денхардта и 0,5% ДСН в течение ночи при 42-50°С с последующими двумя промывками 2х 88РЕ (или 2х 88С)/0,1% ДСН при 42-50°С.
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют гомологию с последовательностями 8Е0 ГО N0: 1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 при уровне гомологии 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% с использованием алгоритма ^йЬит-Ыршап. Репрезентативные примеры таких выделенных молекул включают, например, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 12, 14 или 16, или имеют гомологию с этими последовательностями при уровне 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% гомологии с использованием алгоритма Ыртап-Реатзоп.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот обычно имеют размер менее чем 100 т.п.н. и, в некоторых вариантах осуществления, размер менее чем 50, 25, 10 или даже 5 т.п.н. Далее, выделенные молекулы нуклеиновых кислот в других вариантах осуществления не существуют в библиотеке других неродственных молекул нуклеиновых кислот (например, субклоне ВАС, таком как описанный в ОепВапк Ассеззюп № АС003098 и ЕМВ № АО171546). Однако выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут быть найдены в библиотеках родственных молекул (например, для перетасовки, такой как описанная в патентах США с номерами 5837458; 5830721 и 5811238). Наконец, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, описанные здесь, не включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют Эап. СегЬегиз, Сгеш1ш или 8С0Е (патент США № 5780263).
Данное изобретение обеспечивает также клонирующие векторы, которые содержат вышеупомянутые молекулы нуклеиновых кислот, и экспрессирующие векторы, которые содержат промотор (например, регуляторную последовательность), функционально связанный с одной из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот. Репрезентативные примеры подходящих промоторов включают тканеспецифические промоторы и промоторы на основе вирусов (например, промоторы на основе СМУ, такие как СМУ Ι-Е, ранний промотор 8У40 и МиЬУ ЬТВ). Экспрессирующие векторы могут быть также основаны на вирусах или произведены из вирусов (например, вирусный вектор). Репрезентативные примеры ви
- 2 014525 русных векторов включают вирусные векторы на основе вируса простого герпеса, аденовирусные векторы, аденовирус-ассоциированные векторы и ретровирусные векторы. Обеспечены также клетки-хозяева, содержащие или включающие любой из вышеупомянутых векторов (в том числе, например, клеткихозяева, полученные из человека, обезьяны, собаки, крысы или мыши).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы получения ТОР-бета-связывающих белков, предусматривающие стадию культивирования вышеупомянутой клетки-хозяина, содержащей вектор, при условиях и времени, достаточных для продуцирования этого ТОР-бета-связывающего белка. В других вариантах осуществления белок, продуцируемый этим способом, может быть дополнительно очищен (например, колоночной хроматографией, аффинной очисткой и т.п.). Таким образом, выделенные белки, которые кодируются вышеупомянутыми молекулами нуклеиновых кислот (например, 8ЕО Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16), могут быть легко получены в соответствии с описанием данного изобретения.
Следует также отметить, что вышеупомянутые белки или их фрагменты могут быть получены в виде слитых белков. Например, в одном аспекте обеспечены слитые белки, содержащие первый полипептидный сегмент, содержащий ТОР-бета-связывающий белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше, или его часть длиной по меньшей мере 10, 20, 30, 50 или 100 аминокислот, и второй полипептидный сегмент, содержащий не связывающий ТОР-бета белок. В некоторых вариантах осуществления вторым полипептидом может быть метка (тэг), подходящая для очистки или узнавания (например, полипептид, содержащий множественные анионные аминокислотные остатки - см. патент США № 4851341), маркер (например, зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза) или токсичная молекула (например, рицин).
В другом аспекте данного изобретения обеспечены антитела, которые способны специфически связывать вышеописанный класс ТОР-бета-связывающих белков (например, ВЕЕВ человека). В различных вариантах осуществления это антитело может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом (например, полученным из человека или мыши). В других вариантах осуществления это антитело является фрагментом антитела, который сохраняет связывающие характеристики целого антитела (например, Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ или Ρν-фрагментом или даже ΟΌΚ.). Обеспечены также гибридомы и другие клетки, которые способны продуцировать или экспрессировать вышеупомянутые антитела.
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы детектирования ТОР-бетасвязывающего белка, предусматривающие стадии инкубирования антитела, описанного выше, при условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения возможности для указанного антитела связывать ТОР-бета-связывающий белок, и детектирования этого связывания. В различных вариантах осуществления это антитело может быть связано с твердым носителем для облегчения промывки или разделения и/или помечено (например, маркером, выбранным из группы, состоящей из ферментов, флуоресцентных белков и радиоизотопов).
В других аспектах данного изобретения обеспечены выделенные олигонуклеотиды, которые гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с 8Е0 Ш N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 18 или ее комплементом при жестких условиях. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть обнаружен в последовательности, которая кодирует 8Е0 Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 15, 20, 30, 50 или 100 нуклеотидов. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид является меченным другой молекулой (например, ферментом, флуоресцентной молекулой или радиоизотопом). Обеспечены также праймеры, которые способны специфически амплифицировать все или часть вышеуказанных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ТОР-бета-связывающие белки. В данном контексте термин специфически амплифицировать должен пониматься как относящийся к праймерам, которые амплифицируют вышеупомянутые ТОР-бета-связывающие белки, а не другие ТОР-бетасвязывающие белки, такие как Эап. СегЬегик, ОгстНп или 8СОР (патент США № 5780263).
В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТОР-бета-связывающий белок, предусматривающие стадии инкубирования олигонуклеотида, описанного выше, при жестких условиях и детектирования гибридизации указанного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть меченным и/или связанным с твердым носителем.
В других аспектах данного изобретения обеспечены рибозимы, которые способны расщеплять РНК, которая кодирует один из вышеупомянутых ТОР-бета-связывающих белков (например, 8Е0 Ш N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14 или 16). Такие рибозимы могут состоять из ДНК, РНК (в том числе 2'-Ометилрибонуклеиновых кислот), аналогов нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислот, имеющих фосфоротиоатные связи) или их смесей. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК или кДНК), которые кодируют эти рибозимы, и векторы, которые способны экспрессировать или продуцировать рибозимы. Репрезентативные примеры векторов включают плазмиды, ретротранспозоны, космиды и векторы на основе вирусов (например, вирусные векторы, генерируемые, по меньшей мере, отчасти из ретровируса, аденовируса или аденоассоциированного вируса). Обеспечены также клетки-хозяева (например, клетки человека, собаки, крысы или мыши), которые содержат эти векторы. В не
- 3 014525 которых вариантах осуществления эти клетки-хозяева могут быть стабильно трансформированы вектором.
В следующих аспектах данного изобретения обеспечены способы получения рибозимов или синтетически, или транскрипцией ίη νίίτο или ίη νίνο. В других вариантах осуществления полученные таким образом рибозимы могут быть дополнительно очищены и/или приготовлены в виде фармацевтических композиций (например, рибозим или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот рибозим, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем). Подобным образом, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела или другие выбранные молекулы, описанные здесь, могут быть приготовлены в фармацевтических композициях.
В других аспектах данного изобретения обеспечены антисмысловые олигонуклеотиды, включающие молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 или с ее комплементом, причем указанный олигонуклеотид ингибирует экспрессию ТОЕ-бета-связывающего белка, описанного здесь (например, ВЕЕК, человека). В различных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет длину 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 50 нуклеотидов. Предпочтительно этот олигонуклеотид имеет длину менее чем 100, 75 или 60 нуклеотидов. Как должно быть вполне очевидно, этот олигонуклеотид может состоять из одного или нескольких аналогов нуклеиновых кислот, рибонуклеиновых кислот или дезоксирибонуклеиновых кислот. Далее, этот олигонуклеотид может быть модифицирован одной или несколькими связями, в том числе, например, ковалентной связью, такой как фосфоротиоатная связь, фосфотриэфирная связь, метилфосфонатная связь, метилен(метилимино)-связь, морфолино-связь, амидная связь, полиамидная связь, межсахарная алкильная связь с короткой цепью, циклоалкильная межсахарная связь, гетероатомная межсахарная связь с короткой цепью и гетероциклическая межсахарная связь. Один реперезентативный пример химерного олигонуклеотида описан в патенте США № 5989912.
Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерализации кости, предусматривающие введение в теплокровное животное эффективного количества описанного здесь рибозима. В родственных аспектах такие способы предусматривают стадию введения пациенту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, описанных здесь, которые способны продуцировать желаемый рибозим при условиях, способствующих транскрипции этой молекулы нуклеиновой кислоты для получения рибозима.
В других аспектах данного изобретения обеспечены трансгенные животные, не являющиеся человеком. В одном варианте осуществления обеспечено трансгенное животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТОЕ-бетасвязывающий белок, описанный выше, который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии гена, который введен в это животное или предка этого животного на эмбриональной стадии, при условии, что указанное животное не является человеком. В других вариантах осуществления обеспечены трансгенные животные с нокаутом гена, включающие животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат нарушение по меньшей мере одного аллеля эндогенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТОЕбета-связывающий белок, описанный здесь, где это нарушение предотвращает транскрипцию информационной РНК из указанного аллеля по сравнению с животным без этого разрушения, при условии, что это животное не является человеком. В различных вариантах осуществления этим нарушением является делеция, замена или инсерция нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления этим трансгенным животным является мышь, крыса, овца, свинья или собака.
В следующих аспектах данного изобретения обеспечены наборы для детектирования экспрессии ТОЕ-бета-связывающего белка, содержащие контейнер, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из (а) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 или 101; (Ь) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей комплемент нуклеотидной последовательности (а); (с) молекулы нуклеиновой кислоты, которая является фрагментом (а) или (Ь) с длиной по меньшей мере 15, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов. Обеспечены также наборы для детектирования ТОЕ-бета-связывающего белка, которые содержат контейнер, содержащий одно из описанных здесь антител против ТОЕ-бета-связывающего белка.
Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания одного или нескольких кандидатных молекул с ТОЕ-бета-связывающим белком, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, и выбранного члена ТОЕ-бета-семейства белков (например, ВМР 5 или 6), (Ь) определения, изменяет ли кандидатная молекула передачу сигнала члена ТОЕ-бетасемейства или изменяет ли связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула изменяет способность ТОЕ-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. В этом аспекте данного изобретения кандидатная молекула (кандидатные молекулы) могут изменять передачу сигнала или связывание, например, или уменьшением (например, ингибированием), или увеличением (например, усиле
- 4 014525 нием) передачи сигнала или связывания.
Еще в одном аспекте обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. Репрезентативные примеры кости или ее аналогов включают гидроксиапатит и пробы первичной кости человека, полученные посредством биопсии.
В некоторых вариантах осуществления описанных выше способов выбранная молекула содержится в смеси молекул, и эти способы могут дополнительно предусматривать стадию выделения одной или нескольких молекул, которые являются функциональными в этом анализе. В других вариантах осуществления ТСЕ-бета-семейство белков связывают с твердым носителем и измеряют связывание ТСЕ-бетасвязывающего белка, или ТСЕ-бета-связывающий белок связывают с твердым носителем и измеряют связывание ТСЕ-бета-белков.
С использованием таких способов, как описанные выше, большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность увеличивать минеральное содержание кости ингибированием связывания ТСЕ-бета-связывающего белка с ТСЕ-бета-семейством белков. Репрезентативные примеры таких молекул включают белки или пептиды, органические молекулы и молекулы нуклеиновых кислот.
В других родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, идентифицированной из описанных здесь анализов. В другом аспекте обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, которая ингибирует связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с ТСЕ-бета-суперсемейством белков, в том числе костных морфогенетических белков (ВМР). Репрезентативные примеры подходящих молекул включают антисмысловые молекулы, рибозимы, гены рибозимов и антитела (например, гуманизированное антитело), которые специфически узнают и изменяют активность ТСЕ-бета-связывающего белка.
В другом аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадии: (а) введения в клетки, которые направляются домой - в кость, вектора, который управляет экспрессией молекулы, ингибирующей связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с ТСЕ-бета-семейством белков и морфогенетическими белками кости (ВМР), и (Ь) введение содержащих вектор клеток в теплокровное животное. Должно быть понятно в данном контексте, что клетки направляются домой - в кость, если они локализованы в костном матриксе после периферического введения. В одном варианте осуществления такие способы дополнительно включают перед стадией введения выделение клеток из костного мозга, которые направляются домой - в кость. В следующем варианте осуществления клетки, которые направляются домой - в кость, выбирают из группы, состоящей из ί.Ό34+ клеток и остеобластов.
В других аспектах данного изобретения обеспечены (предпочтительно выделены) молекулы, которые ингибируют связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с ТСЕ-бета-суперсемейством белков.
В следующих вариантах осуществления эти молекулы могут быть обеспечены в виде композиции и могут дополнительно содержать ингибитор резорбции кости. Репрезентвтивные примеры таких ингибиторов включают кальцитонин, эстроген, бифосфонат, фактор роста, имеющий антирезорбирующую активность и тамоксифен.
Репрезентативные примеры молекул, которые могут быть использованы в вышеупомянутых контекстах, включают, например, рибозимы, гены рибозимов, антисмысловые молекулы и/или антитела (например, гуманизированные антитела). Такие молекулы могут в зависимости от их выбора использоваться для изменения, антагонистического или агонистического действия на передачу сигнала или связывание члена семейства ТСЕ-бета-связывающих белков, описанных здесь.
В различных вариантах осуществления данного изобретения вышеописанные молекулы и способы лечения или предупреждения могут быть использованы в случае таких состояний, как остеопороз, остеомаляция, периодонтальное заболевание, цинга, болезнь Кушинга, перелом кости, и состояний, обусловленных иммобилизацией конечности и применением стероидов.
Данное изобретение обеспечивает также антитела, которые специфически связываются с ТСЕ-бетасвязывающим белком, склеростином (8О8Т), и обеспечивает иммуногены, содержащие пептиды склеростина, произведенные из районов склеростина, которые взаимодействуют с членом ТСЕ-бетасуперсемейства, таким как костный морфогенетический белок. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО Ш N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 8О8Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СепВапк Асе. № N^004329 (8Е0 Ю N0: 102);
- 5 014525
Ό89675 (8ΕΟ ΙΌ N0: 103); ΝΜ_001203 (8Ер ΙΌ N0: 104); 875359 (8ΕΟ ΙΌ N0: 105); ΝΜ_030849 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 106); Ό38082 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 107); ΝΡ_001194 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 108); ΒΑΑ19765 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 109) или ААВ33865 (8Ε0 ΙΌ N0: 110), и где сайт связывания рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ способен связываться с полипептидом рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СепВапк Асе. № И25110 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 111); ΜΜ_033346 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 112); Ζ48923 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 114); САА88759 (8Ε0 ΙΌ N0: 115) или ΧΜ_001204 (8Ε0 ΙΌ N0: 113). В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина и которые нарушают образование гомодимера склеростина, где этот полипептид склеростина включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ΕΕ) ΙΌ N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения это антитело является поликлональным антителом. В других вариантах осуществления это антитело является моноклональным антителом, которое является моноклональным антителом мыши, человека, крысы или хомячка. Данное изобретение обеспечивает также гибридомную клетку или клетку-хозяина, которая способна продуцировать это моноклональное антитело. В других вариантах осуществления данного изобретения это антитело является гуманизированным антителом или химерным антителом. Данное изобретение обеспечивает дополнительно клетку-хозяина, которая продуцирует гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела является фрагментом Е(аЬ')2, ЕаЬ', ЕаЬ, Еб или Εν. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое является одноцепочечным антителом, и обеспечивает клетку-хозяина, которая способна экспрессировать это одноцепочечное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую такие антитела и физиологически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид, содержащий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (1) сайтом связывания рецептора типа Ι костного морфогенетического белка (ΒΜΡ) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ, где сайт связывания рецептора типа Ι ΒΜΡ способен связываться с полипептидом рецептора типа Ι ΒΜΡ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СеηΒаηк Асе. № ΧΜ_004329 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 102); Ό89675 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 103); ΜΜ_001203 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 104); 875359 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 105); ΜΜ_030849 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 106); Ό38082 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 107); №_001194 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 108); ΒΑΑ19765 (8Ε0 ΙΌ N0: 109) или ААВ33865 (8Ε0 ΙΌ N0: 110), и где сайт связывания рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ способен связываться с полипептидом рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СеηΒаηк Α^. № И25110 (8Ε0 ΙΌ N0: 111); ΧΜ_033346 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 112); Ζ48923 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 114); СΑΑ88759 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 115) или ΜΜ_001204 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 113). Данное изобретение обеспечивает также иммуноген, содержащий пептид, который содержит по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое нарушает образование гомодимера 808Т.
В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногены рассматриваемого изобретения связаны с молекулой-носителем. В некоторых вариантах осуществления молекула-носитель является полипептидом-носителем, и в конкретных вариантах осуществления этот полипептид-носитель является гемоцианином фиссуреллы.
Данное изобретение обеспечивает также способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, где (а) указанный полипептид 808Т включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, (Ь) это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (1) сайтом связывания рецептора типа Ι костного морфогенетического белка (ΒΜΡ) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ, (с) сайт связывания рецептора типа Ι ΒΜΡ способен связываться с полипептидом рецептора типа Ι ΒΜΡ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СеηΒаηк Α^. № ΜΜ_004329 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 102); Ό89675 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 103); ΜΜ_001203 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 104); 875359 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 105); ΜΜ_030849 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 106); Ό38082 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 107); №_001194 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 108); ΒΑΑ19765 (8Ε0 ΙΌ N0: 109) или ААВ33865 (8Ε0 ΙΌ N0: 110), и (б) сайт связывания рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ способен связываться с полипептидом рецептора типа ΙΙ ΒΜΡ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в СеηΒаηк Α^. № И25110 (8Ε0 ΙΌ N0: 111); ΧΜ_033346 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 112); Ζ48923 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 114); СΑΑ88759 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 115) или NΜ_001204 (8ΕΕ) ΙΌ N0:
- 6 014525
113).
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 8О8Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, предусматривающий иммунизацию животного, не являющимся человеком, иммуногеном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 8О8Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело нарушает образование гомодимера 8О8Т.
Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидными после ссылки на следующее подробное описание и сопутствующие фигуры. Кроме того, документы, включающие различные приведенные здесь ссылки, которые описывают более подробно некоторые процедуры или композиции (например, плазмиды и т.д.), полностью включены в качестве ссылок.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 является схематической иллюстрацией, сравнивающей аминокислотную последовательность Нитап Паи; Нитап СгетНп; Нитап СегЬегик и Нитап Веег. Стрелки указывают цистеиновый скелет.
Фиг. 2 суммирует результаты, полученные из обследования различных тканей человека на экспрессию гена ТСЕ-бета-связывающего белка, конкретно гена Нитап Веег. Полуколичественную процедуру полимеразной цепной реакции с обращенно-фазовой транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали для амплификации части этого гена из кДНК первой цепи, синтезированной из тотальной РНК (описано более подробно в примере 2 А).
Фиг. 3Α-3Ό суммируют результаты, полученные из гибридизации РНК ш кйи срезов эмбриона мыши с использованием кРНК-зонда, который комплементарен мышиному транскрипту Веег (описано более подробно в примере 2В). Панель ЗА является поперечным срезом эмбриона 10,5 брс. Панель 3В является сагиттальным срезом эмбриона 12,5 брс, и панели 3С и 3Ό являются сагиттальными срезами эмбрионов 15,5 брс.
Фиг. 4А-4С иллюстрируют, посредством Вестерн-блот-анализа, специфичность трех различных поликлональных антител в отношении их соответствующих антигенов (описано более подробно в примере 4). Фиг. 4А показывает специфическую реактивность анти-Н. Веег-антитела в отношении антигена Н. Веег, но не в отношении Н. Пап или Н. СгетНп. Фиг. 4В показывает реактивность анти-Н. СгешНпантитела в отношении антигена Н. СгетНп, но не Н. Веег или Н. Эап. Фиг. 4С показывает реактивность анти-Н. Пап-антитела в отношении Н. Пап, но не Н. Веег или Н. СгетНп.
Фиг. 5 иллюстрирует, посредством Вестерн-блот-анализа, селективность ТСЕ-бета-связывающего белка, Веег, в отношении ВМР-5 и ВМР-6, но не ВМР-4 (описано более подробно в примере 5).
Фиг. 6 демонстрирует, что ионное взаимодействие между ТСЕ-бета-связывающим белком, Веег, и ВМР-5 имеет константу диссоциации в диапазоне 15-30 нМ.
Фиг. 7 представляет выравнивание района, содержащего характерный цистиновый узел полипептида 8О8Т (склеростина) и его ближайших гомологов. Три дисульфидные связи, которые образуют цистиновый узел, проиллюстрированы жирными линиями. Дополнительная дисульфидная связь, показанная пунктирной линией, является уникальной для этого семейства, и она соединяет концы двух β-шпилек в 3П-структуре. Изображенные полипептиды являются 8О8Т: склеростин (8Е0 ГО NО: 126); ССНВ: Хорионический гонадотропин β человека (8ЕС ГО NО: 127); Е8НВ: бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона (8ЕС ГО NО: 128); Т8НВ: предшественник бета-цепи тиротропина (8Е0 ГО NО: 129); У\УЕ: фактор фон Виллебранда (8ЕС ГО NО: 130); МИС2: предшественник муцина 2 человека (8Е0 ГО NО: 131); СегЬегик 1 (гомолог Хепорик 1аеу1к) (8Е0 ГО NО: 132); ЦВМ: дтетНп (8Е0 ГО NО: 133); ΏΑΝ: (8Е0 ГО NО: 134); СТСЕ: предшественник фактора роста соединительной ткани (8Е0 ГО NО: 135); NОV: №уН (гомолог белка сверхэкспрессируемого гена нефробластомы) (8Е0 ГО NО: 136); СУВ6: (8Е0 ГО 137).
Фиг. 8 иллюстрирует 3П-модель внутреннего района (кора) 8О8Т (8О8Т_Соте).
Фиг. 9 представляет 3П-модель внутреннего района (кора) гомодимера 8О8Т.
Фиг. 10А и 10В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей Νοββίπ из пяти различных животных: человека ЩОСС_НиМАН 8ЕС ГО NО: 138); курицы ЩОСС_СН1СК, 8Е0 ГО NО: 139); Африканской шпорцевой лягушки ЩОСС_ХЕЖА. 8Е0 ГО NО: 140; NОСС_ЕυСВυ, 8Е0 ГО NО: 141); и полосатой перцины ЩОСС_2ЕВВА, 8Е0 ГО NО: 142); и 8О8Т из человека (8О8Т_НиМАН 8ЕС ГО 46), крысы (8О8Т_ВАТ, 8Ер ГО 65) и мыши (8О8Т_Моике, 8ЕС ГО 143).
Фиг. 11 иллюстрирует структуру комплекса №ддш/ВМР-7. Гомодимер ВМР показан на нижней части этой фигуры поверхностным способом. Гомодимер Νοββίπ показан на верхней части димера ВМР в виде огрубленного изображения. Круги очерчивают Ν-концевой связывающий район, внутренний (коровый) район и линкер между Ν-концевым и коровым районами.
Фиг. 12 иллюстрирует 3П-модель потенциального ВМР-связывающего фрагмента, локализованного в Ν-концевом районе 8О8Т. Димер ВМР показан поверхностным способом, а потенциальный ВМРсвязывающий фрагмент показан способом после изображения. Отмечен остаток фенилаланина, соот
- 7 014525 ветствующий гидрофобному карману на поверхности ВМР.
Подробное описание изобретения
Определения.
Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания приведение определений некоторых терминов и перечисление и определение аббревиатур, которые будут использованы далее.
Молекула включает белки или пептиды (например, антитела, рекомбинантные партнеры по связыванию, пептиды с желаемой аффинностью связывания), нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК, химерные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги нуклеиновых кислот, такие как ПНК) и органические или неорганические соединения.
ТОЕ-бета включает любой известный или новый член ТОЕ-бета-суперсемейства, который включает также костные морфогенетические белки (ВМР).
ТОЕ-бета-рецептор относится к рецептору, специфическому в отношении конкретного члена ТОЕ-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (ВМР)).
ТОЕ-бета-связывающий белок обозначает белок со специфической аффинностью связывания в отношении конкретного члена или субпопуляции членов ТОЕ-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (ВМР)). Конкретные примеры ТОЕ-бета-связывающих белков включают белки, кодируемые последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101.
Ингибирование связывания ТОЕ-бета-связывающего белка с ТОЕ-бета-семейством белков и костными морфогенетическими белками (ВМР) относится к молекулам, которые делают возможной активацию ТОЕ-бета- или костных морфогенетических белков (ВМР) или делают возможным связывание членов ТОЕ-бета-семейства, в том числе костных морфогенетических белков (ВМР), с их соответствующими рецепторами, посредством удаления или предотвращения ТОЕ-бета от связывания с ТОЕ-бетасвязывающим белком. Такое ингибирование может выполняться, например, молекулами, которые ингибируют связывание ТОЕ-бета-связывающего белка со специфическими членами ТОЕ-бетасуперсемейства.
Вектор обозначает ансамбль, который способен управлять экспрессией желаемого белка. Вектор должен включать промоторные элементы транскрипции, которые функционально связаны с представляющим интерес геном (представляющими интерес генами). Вектор может состоять из дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), рибонуклеиновых кислот (РНК) или комбинации этих двух компонентов (ДНК-РНК-химерный вектор). Необязательно, вектор може включать последовательность полиаденилирования, один или несколько сайтов рестрикции, а также один или несколько селектируемых маркеров, таких как неомицинфосфотрансфераза или гигромицинфосфотрансфераза. Дополнительно, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в описанные здесь векторы могут быть также включены другие генетические элементы, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции нуклеиновых кислот, энхансеры, последовательности, придающие индуцибельность транскрипции, и селектируемые маркеры.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Например, ДНК-молекула, которая кодирует ТОЕ-бетасвязывающий белок, которая была выделена из геномной ДНК эукариотической клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты может быть геномная ДНК, кДНК, РНК или молекула, составленная, по меньшей мере, частично из аналогов нуклеиновых кислот.
Выделенный полипептид является полипептидом, который, по существу, свободен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие небелковые примеси, ассоциированные с этим полипептидом в природе. Предпочтительно, такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. В некоторых вариантах осуществления конкретный препарат белка содержит выделенный полипептид, если он появляется номинально в виде единственной полосы при электрофорезе в ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси. Термин выделенный при применении к органическим молекулам (например, небольшим органическим молекулам) означает, что эти соединения являются более чем на 90% чистыми согласно способам, хорошо известным в данной области (например, ЯМР, точка кипения).
Склеростеоз является термином, который использовался Наикеи (1967) (Наикеи, Н.О., 8к1ето81еоке, ίη: Ορίΐζ, Н.; 8ο1ιιηίάΙ. Е., НаибЬисй бет Кшбегйебкипбе. ВетБи: Зргшдет (риЬ.) 6 1967. Рр. 351-355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. Подбородок имеет обычно квадратный вид в этом состоянии.
Гуманизированные антитела являются рекомбинантными белками, в которых определяющие комплементарность районы моноклональных антител мыши или другого животного, не являющегося
- 8 014525 человеком, были перенесены из вариабельных районов тяжелых и легких цепей из иммуноглобулина мыши или другого животного, не являющегося человеком, в вариабельный домен человека.
В данном контексте фрагмент антитела является частью антитела, такой как Р(аЬ')2, Е(аЬ)2, РаЬ', РаЬ и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против ТСР-бетасвязывающего белка связывается с эпитопом ТСР-бета-связывающего белка.
Термин фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент включает также любой синтетический или генетически сконструированный белок, который действует подобно антителу посредством связывания специфического антигена с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельного района легкой цепи, Ρν''-фрагменты, состоящие из вариабельных районов тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные районы легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (κΡν-белки), и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район.
Детектируемая метка является молекулой или атомом, которые могут быть конъюгированы с полипептидной частью, такой как часть антитела или часть нуклеиновой кислоты, для получения молекулы, полезной для диагностики. Примеры детектируемых меток включают хелаторы, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы, ферменты и другие маркерные молекулы.
В данном контексте иммуноконъюгат является молекулой, содержащей антитело против ТСРбета-связывающего белка или фрагмент антитела и детектируемую метку или эффекторную молекулу. Предпочтительно иммуноконъюгат имеет в грубом приближении такую же, или только слегка уменьшенную, способность связывать ТСР-бета-связывающий белок после конъюгации, что и до конъюгации.
Аббревиатуры.
ТСР-бета - трансформирующий фактор роста бета; ТСР-ЬВР - трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок (один репрезентативный ТСР-ЬВР обзначается как Н, ВЕЕВ); ВМР - костный морфогенетический белок; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР - ПЦР-процесс, в котором РНК сначала транскрибируют в ДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ); кДНК - любая ДНК, полученная копированием РНК-последовательности в ДНК-форму.
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс ТСР-бета-связывающих белков, а также способы и композиции для увеличения минерального содержания кости у теплокровных животных. Вкратце, данное изобретение основывается на неожиданном открытии, что мутация в гене, который кодирует новый член семейства ТСР-бета-связывающих белков, приводит к редкому состоянию (склеростеозу), характеризующемуся минеральными содержаниями кости, которые являются в один разчетыре раза более высокими, чем у нормальных индивидуумов. Таким образом, как обсуждается более подробно ниже, это открытие привело к развитию анализов, которые могут быть использованы для отбора молекул, которые ингибируют связывание ТСР-бета-связывающего белка с семейством белков ТСРбета и костными морфогенетическими белками (ВМР), и способов использования таких молекул для увеличения минерального содержания кости теплокровных животных (в том числе, например, людей).
Обсуждение заболевания, известного как склеростеоз
Склеростеоз является заболеванием, родственным атипичной минеральной плотности кости у людей. Склеростеоз является термином, который применялся Напкеп (1967, Напкеп, Н.С., 8к1его81еоке, ίη: Θρίΐζ, Н.; 8е1ишб1 Р., НапбЬией бет Кшбетйе11кипбе. Вет1ш: 8ртшдет (риЬ.) 6, 1967. р. 351-355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях.
В настоящее время известно, что склеростеоз является аутосомным полудоминантным нарушением, которое характеризуется широко диссеминированными склеротическими повреждениями кости у взрослого человека. Это состояние является прогрессирующим. Склеростеоз имеет также связанный с развитием аспект, который связан с синдактилией (два или более пальцев слиты вместе). Синдром склеростеоза ассоциирован с высоким ростом, и многие пораженные индивидуумы достигают высоты шесть или более футов. Минеральное содержание кости гомозигот может быть в 1-6 раз большим, чем наблюдаемое у нормальных индивидуумов, и минеральная плотность кости может быть в 1-4 раза выше нормальных величин (например, из непораженных сибсов).
Синдром склеростеоза встречается прежде всего у африканцев нидерланского происхождения в Южной Африке. Приблизительно 1/140 индивидуумов в населении Африки являются носителями этого мутированного гена (гетерозиготами). Эта мутация обнаруживает 100% пенетрантность. Имеются невероятные сообщения об увеличенной минеральной плотности кости в гетерозиготах без ассоциированных патологий (синдактилии или разрастания черепа).
Отсутствие аномалии системы гипофиз-гипоталамус наблюдали у пациентов со склеростеозом. В частности, по-видимому, нет сверхпродуцирования гормона роста и кортизона. Кроме того, уровни половых гормонов являются нормальными у пораженных индивидуумов. Однако маркеры обновления кос
- 9 014525 ти (остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С' типа 1 (Р1СР) и общая щелочная фосфатаза (см. Сош1ет, С., Сигг. Θρίη. ίη РНси. 7:243, 1995)) показывают, что имеется гиперостеобластическая активность, ассоциированная с этим заболеванием, но имеется нормальная - слегка уменьшенная активность остеокластов, как измерено с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, Ν-телопептида, гидроксипролина мочи, тартратустойчивых кислых фосфатаз плазмы и галактолилгидроксилизина (см. Сош1ет, кирга)).
Склеростеоз характеризуется непрерывным депонированием минералов кости по всему скелету во время времени жизни пораженных индивидуумов. В гомозиготах непрерывное депонирование минералов кости приводит к разрастанию кости в зонах скелета, в которых отсутствуют механорецепторы (череп, подбородок, мозговой череп). В гомозиготах со склеростеозом разрастание костей черепа приводит к сдавливанию черепа и со временем к смерти вследствие избыточного гидростатического давления на ствол мозга. Во всех других частях скелета имеется генерализованный или диффузный склероз. Кортикальные зоны длинных (трубчатых) костей сильно утолщаются, приводя к существенному увеличению прочности кости. Губчатые соединения увеличиваются по толщине, что, в свою очередь, увеличивает прочность губчатой кости. Склеротические кости, по-видимому, являются непрозрачными для рентгеновских лучей.
Как описано более подробно в примере 1, редкая генетическая мутация, которая является ответственной за синдром склеростеоза, была обнаружена в хромосоме 17 человека, которая кодирует новый член семейства ТСР-бета-связывающих белков (один репрезентативный пример назван Н. Веег). Как описано более подробно ниже, на основании этого открытия, механизм минерализации кости стал более полно понимаемым, что позволяет разработку анализов на молекулы, которые увеличивают минерализацию кости, и использование таких молекул для увеличения минерального содержания кости и для лечения или предупреждения большого числа заболеваний.
ТСР-бета-суперсемейство
Суперсемейство трасформирующих факторов роста бета (ТСР-бета) содержит различные факторы роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательности (как на вторичном, так и на третичном уровне). Известно, что это семейство белков проявляет широкий спектр биологических реакций, которые влияют на большое разнообразие типов клеток. Многие из членов семейства ТСРбета имеют важные функции во время эмбрионального развития в процессе приобретения упорядоченного распределения типов клеток и активностей и спецификации ткани; у взрослых члены этого семейства участвуют, например, в заживлении ран, репарации и ремоделировании кости и в модуляции иммунной системы. Кроме ТСР-бета, это суперсемейство включает костные морфогенетические белки (ВМР), активины, ингибины, факторы роста и дифференцировки (СЭР) и нейротрофические факторы глиального происхождения (СИИР). Первичная классификация установлена посредством общих признаков последовательности, которые относят конкретный белок к общему подсемейству. Дополнительное расслоение в этом подсемействе является возможным вследствие более строгой консервации последовательности между членами меньших групп. В некоторых случаях, таких как ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7, идентичность аминокислот может быть такой высокой, как 75%, среди членов этой меньшей группы. Этот уровень идентичности позволяет единственной репрезентативной последовательности иллюстрировать ключевые биохимические элементы данной подгруппы, которые выделяют ее из других членов большего семейства.
Кристаллическая структура ТСР-бета2 была определена. Общая укладка ТСР-бета2-мономера содержит стабильную, компактную цистеиновую подобную узлу структуру, образованную тремя дисульфидными мостиками. Димеризация, стабилизированная одним дисульфидным мостиком, является антипараллельной.
ТСР-бета передает сигналы посредством индукции образования гетероолигомерных комплексов рецепторов типа I и типа II. Трансдукция сигналов ТСР-бета включает эти два отличающиеся подсемейства типа I и типа II трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов. Были идентифицированы по меньшей мере семь рецепторов типа I и пять рецепторов типа II (см. Ка^аЬа!а е1 а1., СуЮкше Сго\\111 Рас1от К.еу. 9:49-61 (1998); М|уахопо е1 а1., Αάν. ^шипок 75:115-57 (2000)). Члены семейства ТСР-бета инициируют свое клеточное действие посредством связывания с рецепторами с присущей им серин/треонинкиназной активностью. Каждый член ТСР-бета-семейства связывается с характерной комбинацией рецепторов типа I и типа II, оба из которых являются необходимыми для передачи сигнала. В существующей модели активации рецептора ТСР-бета ТСР-бета-лиганд сначала связывается с рецептором типа II (ТЬЯ-П), который встречается в клеточной мембране в олигомерной форме с активированной киназой. После этого рецептор типа I (ТЬЯ-Ц, который не может связывать лиганд в отсутствие ТЬЯП, рекрутируется в этот комплекс для образования тройного комплекса лиганд/тип П/тип I. Затем ТЬЯ-П фосфорилирует ТЬЯИ преимущественно в домене, богатом остатками глицина и серина (С8-домене), в расположенном рядом с мембраной районе и тем самым активирует ТЬЯ-Т Затем эта активированная киназа рецептора типа I фосфорилирует конкретные члены 8шаб-семейства белков, которые перемещаются в ядро, где они модулируют транскрипцию специфических генов.
- 10 014525
Костные морфогенетические белки (ВМР) являются ключевыми регуляторными белками в определении минеральной плотности кости у людей
Главным успехом в понимании остеогенеза была идентификация костных морфогенетических белков (ВМР), также известных как остеогенные белки (ОР), которые регулируют дифференцировку хряща и кости ίη νίνο. ВМР/ОР индуцируют дифференцировку кости через каскад событий, которые включают образование хряща, гипертрофию и кальцификацию хряща, васкулярную инвазию, дифференцировку остеобластов и образование кости. Как описано выше, ВМР/ОР (ВМР 2-14 и остеогенные белки 1 и 2 (ОР-1 и ОР-2) (см., например, СепВапк Р12643 (ВМР-2); СепВапк Р12645 (ВМР3); СепВапк Р55107 (ВМР-3Б, фактор 10 роста/дифференцировки) (СБР-10)); СепВапк Р12644 (ВМР4); СепВапк Р22003 (ВМР5); СепВапк Р22004 (ВМР6); СепВапк Р18075 (ВМР7); СепВапк Р34820 (ВМР8); СепВапк С9ЕК05 (ВМР9); СепВапк О95393 (ВМР10); СепВапк О95390 (ВМР11, предшественник фактора 11 роста/дифференцировки (СЭЕ-11)); СепВапк О95972 (ВМР15)) являются членами суперсемейства ТСР-бета. Поразительное эволюционное сохранение между членами подсемейства ВМР/ОР предполагает, что они являются решающими в нормальном развитии и функционировании животных. Кроме того, присутствие множественных форм ВМР/ОР вызывает важный вопрос о биологическом значении этой видимой избыточности. Кроме постфетального хондрогенеза и остеогенеза ВМР/ОР играют множественные роли в скелетогенезе (в том числе, в развитии черепно-лицевых и зубных тканей) и в эмбриональном развитии и органогенезе паренхиматозных органов, в том числе почек. В настоящее время понятно, что природа основывается на общих (и находящихся в небольшом количестве) молекулярных механизмах, созданных для обеспечения появления специализированных тканей и органов. Суперсемейство ВМР/ОР является изящным примером бережливости природы в программировании множественных специализированных функций, использующих молекулярные изоформы с минорными вариациями в аминокислотных мотивах в высоко консервативных карбоксиконцевых районах.
ВМР синтезируются в виде больших белков-предшественников. После димеризации ВМР протеолитически расщепляются в клетке с образованием карбоксиконцевых зрелых белков, которые затем секретируются из клетки. ВМР, подобно другим членам семейства ТСР-бета, инициируют трансдукцию сигнала связыванием кооперативно с серин/треонинкиназными рецепторами как типа I, так и типа II. Рецепторы типа I, в отношении которых ВМР могут действовать в качестве лигандов, включают ВМРВΙΑ (также известный как ЛЬК-3), ВМРКПВ (также известный как ЛЬК-6), АЬК-1 и ЛЬК-2 (также известный как Лс1К-Г). Из рецепторов типа II, ВМР связывается с рецептором ВМР типа II (ВМРВ-П), активином типа II (Лс!К-П) и активином типа ПВ (Лс!К-ПВ). (См. Ва1етапк е! а1., кирга и ссылки в этой работе). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа I ВМР обеспечены в базе данных СепВапк, например, ИМ_004329 (8ЕС ГО ИО: 102, кодируемая 8Ер ГО ИО: 116); Ό89675 (8ЕС ГО ИО: 103, кодируемая 8ЕС ГО ИО: 117); ИМ_001203 (8ЕС) ГО ИО: 104, кодируемая 8ЕС ГО ИО: 118); 875359 (8ЕС ГО ИО: 105, кодируемая 8ЕС ГО ИО: 119); ИМ_030849 (8ЕС) ГО ИО: 106, кодируемая 8ЕС ГО ИО: 120) и Ό38082 (8ЕС ГО ИО: 107, кодируемая 8ЕС ГО ИО: 121). Другие полипептидные последовательности рецепторов типа I обеспечены в базе данных СепВапк, например, ИР_001194 (8 ЕС) ГО ИО: 108); ВАА19765 (8ЕС) ГО ИО: 109) и ААВ33865 (8ЕС) ГО ИО: 110). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа II ВМР обеспечены в базе данных СепВапк, например И25110 (8ЕС ГО ИО: 111, кодируемая 8ЕС) ГО ИО: 122); ИМ_033346 (8 ЕС) ГО ИО: 112, кодируемая 8ЕС) ГО ИО: 123); ИМ_001204 (8Е() ГО ИО: 113, кодируемая 8ЕС) ГО ИО: 124) и Ζ48923 (8ЕС) ГО ИО: 114, кодируемая 8ЕС) ГО ИО: 125). Дополнительные полипептидные последовательности рецепторов типа II также обеспечены в базе данных СепВапк, например САА88759 (8ЕС ГО ИО: 115).
ВМР, сходные с другими имеющими цистиновый узел белками, образуют гомодимерную структуру (8с11еиГ1ег е! а1., I. Мо1. Вю1. 287:103-15 (1999)). В соответствии с анализом эволюционного прослеживания, выполненного на семействе ВМР/ТСР-β, сайт связывания рецептора типа I ВМР и сайт связывания рецептора типа II ВМР были картированы на поверхности структуры ВМР (киш е! а1., Рто!еш Епд. 13:839-47 (2000)). Местоположение сайта связывания рецептора типа I на ВМР было позднее подтверждено рентгеновской структурой комплекса ВМР-2/рецептор ВМР (Июке1 е! а1., I. 1ош! 8игд. Лт. 83Л (8ирр1 1(Р!1)):87-814 (2001)). Предсказанный сайт связывания рецептора типа II хорошо согласуется с рентгеновской структурой комплекса ТСР-в3/рецептор типа II ТСР-β (Наг! е! а1., Иа!. 8!гис!. Вю1. 9:203208 (2002)), который имеет большое сходство с системой ВМР/рецептор ПЛ ВМР.
Антагонизм в отношении ВМР
Подсемейства ВМР и активина подвергаются значительной посттрансляционной регуляции, например ТСР-бета-связывающими белками. Существует сложная система внеклеточной регуляции, посредством которой синтезируется и экспортируется высокоаффинный антагонист, и затем он образует комплексы селективно с ВМР или активинами для разрушения их биологической активности (\ν.Ο. 8ιηί11ι (1999) ТЮ 15(1) 3-6). Ряд этих природных антагонистов были идентифицированы и, на основе дивергенции последовательности, эти антагонисты, по-видимому, эволюционировали независимо вследствие отсутствия сохранения первичной последовательности. Более ранние исследования этих антагонистов ярко
- 11 014525 выявили отличающуюся предпочтительность в отношении взаимодействия и нейтрализации ВМР-2 и ВМР-4. У позвоночных антагонисты включают ноггин, хордин, хординподобный, фоллистатин, Е8РВ, семейство белков ЭАХ/СегЬегик и склеростин (8О8Т) (см. Ва1етаик е! а1., кирга и ссылки в этой работе). Механизм антагонизма или ингибирования, по-видимому, отличается для различных антагонистов (1стига с1 а1., (1998) Ргос. Ыа11. Асаб. 8сЕ И8А 95 9337-9342).
Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на антагонисте ВМР ноггине были также картированы. Ноггин связывается с ВМР с высокой аффинностью (21ттегтаи е! а1., 1996). Исследование структуры комплекса ноггин/ВМР-7 выявило связывающие взаимодействия между этими двумя белками (Сторре е! а1., №1Шге 420:636-42 (2000)). Наложение структуры ноггин-ВМР-7 на модель комплекса передачи сигнала ВМР показало, что связывание ноггина эффективно маскирует обе пары связывающих эпитопов (т.е. сайтов связывания рецепторов типа I и типа II ВМР) на ВМР-7. Последовательности богатого цистеином каркаса ноггина предшествует Ν-концевой сегмент из приблизительно 20 аминокислотных остатков, который называют зажимом (клипом) (остатки 28-48). Сайт связывания рецептора типа I закрыт Ν-концевой частью домена-зажима ноггина, а сайт связывания рецептора типа II закрыт карбоксиконцевой частью этого домена-зажима. Две β-цепи во внутреннем (коровом) районе вблизи С-конца ноггина также контактируют с ВМР-7 при сайте связывания рецептора типа II. Этот способ связывания позволяет димеру ноггина эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (два сайта связывания рецептора типа I и два сайта связывания рецептора типа II) на димере ВМР.
Новые ТСЕ-бета-связывающие белки
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс ТСР-бета-связывающих белков, которые имеют почти идентичный цистеиновый (дисульфидный) каркас при сравнении с белками Нитап ΌΑΝ, Нитап СгетИи и Нитап СегЬегик и 8ССР (патент США № 5780263), но почти не имеют гомологии на уровне нуклеотидов (в отношении предшествующей информации см. в основном Нки, Ό.Β., Есоиот1бек, Α.Ν., Ааид, X., Е1тои, Р.М., Наг1аиб, Р.М.. ТНе Хеиорик ОогкаН/шд Рас1ог Стетйи [0.еи(1Пек а №ус1 Еатйу о! 8есге1еб Рто1ешк 11ι;·ιΙ АпЩдошхе ВМР АсбуШек, Мо1еси1аг Се11 1:673-683, 1998).
Репрезентативные примеры нового класса молекул нуклеиновых кислот, кодирующих ТСЕ-бетасвязывающие белки, описаны в последовательностях 8ЕС Ш ΝΟ: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Полинуклеотиды, описанные здесь, кодируют полипептид, названный Веег, который называют здесь также склеростин или 8О8Т. Следует также понимать, что репрезентативные члены этого класса связывающих белков включают варианты ТСЕ-бета-связывающего белка (например, 8ЕС Ш ΝΟ: 5 и 7). В данном контексте вариантный ген ТСЕ-бета-связывающего белка (например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант ТСЕ-бета-связывающего белка) обозначает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является модификацией 8ЕС Ш ΝΟ: 2, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. Такие варианты включают природно встречающиеся полиморфизмы или аллельные варианты генов ТСЕ-бета-связывающих белков, а также синтетические гены, которые содержат консервативные аминокислотные замены этих последовательностей аминокислот. Различные критерии, известные специалистам с квалификацией в данной области, показывают, являются ли аминокислоты в конкретном положении в пептиде или полипептиде подобными. Например, сходной аминокислотой или консервативной аминокислотной заменой является замена, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь, причем сходные аминокислоты включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, гистидин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который, как считается, более трудно классифицировать, имеет общие свойства с аминокислотами, которые имеют алифатические боковые цепи (например, Ьеи, Уа1, Не и А1а). В некоторых обстоятельствах замена глутамином глутаминой кислоты или аспарагином аспарагиновой кислоты может рассматриваться как сходная замена вследствие того, что глутамин и аспарагин являются амидными производными глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно.
Дополнительными вариантными формами гена ТСЕ-бета-связывающего белка являются молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат инсерции или делеции описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Вариантные гены ТСЕ-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы определением, гибридизуются ли эти гены с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ЕС Ю ΝΟ: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 в жестких условиях. Кроме того, вариантные гены ТСЕ-бета-связывающих белков должны кодировать белок, имеющий цистеиновый скелет основной цепи.
В качестве альтернативы, вариантные гены ТСЕ-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы сравнением последовательностей. В данном контексте две аминокислотные последовательности имеют 100% идентичность аминокислотной последовательности, если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для макси
- 12 014525 мального соответствия. Подобным образом, две нуклеотидные последовательности имеют 100% идентичность нуклеотидной последовательности, если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнения последовательностей могут выполняться с использованием стандартных программ программного обеспечения, таких как программы, включенные в компьютерный комплект биоинформатики ЬА8ЕВ6ΕΝΕ, который производится ΌΝΑ8ΤΑΚ (Майкоп \У1ксопкт). Другие способы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определением оптимального выравнивания хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, РегикИ апй Региккц Т1е 1п1егпе1 апй Не №\ν Вю1оду: Тоо1к Гог Сепотк апй Мо1еси1аг ВекеагсЕ (А8М Ргекк, 1пс. 1997), \Си е1 а1., (ейк.), ’ТпГогтайоп 8ирегЫдЕтеау апй Сотри1ег Ба1аЬакек оГ №.1с1ею Ас1йк апй Рго1етк, т Ме11юйк т Сепе Вю!ес1по1оду, радек 123-151 (СВС Ргекк, 1пс. 1997) и В1к1ор (ей.), Сшйе Ю Нитап Се по те Сотрийпд, 2пй ЕйШоп (Асайетю Ргекк, 1пс. 1998)).
Вариантные ТСЕ-бета-связывающие белки должны иметь по меньшей мере 50% идентичность аминокислотной последовательности относительно 8ЕО ΙΌ N0: 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65 и предпочтительно идентичность, большую чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95%. Альтернативно, варианты ТСЕбета-связывающих белков могут быть идентифицированы по наличию по меньшей мере 70% идентичности нуклеотидной последовательности относительно 8ЕО ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Кроме того, данное изобретение рассматривает варианты генов ТСЕ-бета-связывающих белков, имеющие 75, 80, 85, 90 или 95% идентичность относительно 8ЕО ΙΌ N0: 1 или 8Е0 ΙΌ N0: 100. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного гена ТСЕ-бета-связывающего белка или варианта ТСЕ-бета-связывающего белка, вариантный ТСЕ-бета-связывающий белок или полипептид, кодируемый вариантным геном ТСЕ-бета-связывающего белка, может быть функционально охарактеризован, например, его способностью связываться с выбранным членом ТСЕ-бета-семейства белков и/или ингибировать передачу сигнала выбранного члена ТСЕ-бета-семейства белков или его способностью связываться специфически с антителом против ТСЕ-бета-связывающего белка.
Данное изобретение включает функциональные фрагменты генов ТСЕ-бета-связывающих белков. В контексте данного изобретения функциональный фрагмент гена ТСЕ-бета-связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида ТСЕ-бета-связывающего белка, которая или (1) обладает вышеупомянутой функциональной активностью, или (2) специфически связывается с антителом против ТСЕ-бета-связывающего белка. Например, функциональный фрагмент гена ТСЕ-бета-связывающего белка, описанный здесь, содержит часть нуклеотидной последовательности 5ЕО ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 или 101.
2. Выделение гена ТСЕ-бета-связывающего белка.
Молекулы ДНК, кодирующие ТСЕ-бета-связывающий белок, могут быть получены скринингом библиотеки кДНК или геномной библиотеки человека с использованием полинуклеотидных зондов на основе, например, 8Е0 ΙΌ N0: 1. Например, первой стадией в получении кДНК-библиотеки является выделение РНК с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Обычно способы выделения РНК обеспечивают способ разрушения клеток, средство ингибирования РНКазной деградации РНК и способ отделения РНК от ДНК-, белковых и полисахаридных загрязнителей. Например, тотальная РНК может быть выделена замораживанием ткани в жидком азоте, растиранием замороженной ткани пестиком в ступке для лизиса клеток, экстракцией измельченной ткани раствором фенол/хлорорм для удаления белков и отделением РНК от оставшихся примесей селективным осаждением хлоридом лития (см., например, АикиЬе1 е1 а1., (ейк.), 81юг1 РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг Ью1оду, 3гй Еййюп, радек 4-1 - 4-6 (1оЬп ^йеу апй 8опк 1995) [АикиЬе1 (1995)]; \Си е! а1., Ме11юйк ш Сепе Вю1ес11по1оду, радек 33-41 (СВС Ргекк, Шс. 1997) |\Ми (1997)]). Альтернативно, тотальная РНК может быть выделена экстракцией измельченной ткани изотиоцианатом гуанидиния, экстракцией органическими растворителями и отделением РНК от загрязнителей с использованием дифференциального центрифугирования (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 4-1 - 4-6; \Си (1997), радек 33-41).
Для конструирования кДНК-библиотеки из препарата тотальной РНК предпочтительно выделяют поли(А+) РНК. Поли(А+) РНК может быть выделена из тотальной РНК с использованием стандартного способа олиго(йТ)-целлюлозной хроматографии (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 4-11 - 4-12). Двухцепочечные молекулы кДНК могут быть синтезированы из поли(А+) РНК с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см., например, \¥и (1997), радек 4146). Кроме того, для синтеза двухцепочечных молекул кДНК могут быть использованы коммерчески доступные наборы (например, ЫГе Тес1по1од1ек, Шс. (СайЪегкЬигд, Магу1апй); СЬ0№ТЕСН ЬаЬогаЮпек, Ьс. (Ра1о А1!о, СаЕГогша); Рготеда Согрогайоп (Майкоп, \С|ксопкт); и 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк (Ьа Йо11а, СаЕГогша)).
Основной подход для получения кДНК-клонов ТСЕ-бета-связывающих белков может быть модифицирован конструированием произведенной путем вычитания кДНК-библиотеки, которая обогащена специфическими в отношении ТСЕ-бета-связывающих белков кДНК-молекулами. Способы конструирования произведенных путем вычитания библиотек хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, 8агдеп1, !ко1а1юп о Г БШегепйаНу Ехргеккей Сепек, ш Ме111. Епхуто1.
- 13 014525
152:423, 1987 и \Уи с1 а1., (ебк.), Соикбисйои апб 8сгеешид оГ 8иЬк1гас1сб апб Сотр1е!е Ехргеккюп οΩΝΛ ЫЬгапс5. ш Мебюбк ш Сепе В1о!ескпо1оду, радек 29-65 (СВС Ргекк, 1пс. 1997)).
Различные клонирующие векторы являются подходящими для конструирования кДНК-библиотеки. Например, кДНК-библиотека может быть получена в векторе, полученном из бактериофага, таком как вектор λ д!10 (см., например, НиупН с! а1., Соикбисйид апб 8сгеешпд с^NΑ ЫЬтапек ΐπ Хд110 апб ХдШ, щ ΌΝΑ С1ошпд: А Ртасйса1 АрргоасН Уо1. I, С1оует (еб.), раде 49 (1ВЬ Ргекк, 1985); \Уи (1997), радек 4752). Альтернативно, двухцепочечные молекулы кДНК могут быть встроены в плазмидный вектор, такой как вектор рВ1иексг1р( (8!га!адеие С1ошид 8ук!етк; Ьа 1о11а, СаНГогп1а), ЬатЬбаСЕМ-4 (Рготеда Согр.; Маб1коп, \У1ксопкт) или другие коммерчески доступные векторы. Подходящие клонирующие векторы могут быть также получены из Американской Коллекции Типовых Культур (ВоскуШе, Магу1апб).
Для амплификации клонированных молекул кДНК кДНК-библиотеку встраивают в прокариотического хозяина с использованием стандартных способов. Например, кДНК-библиотека может быть введена в компетентные клетки Е. сой ΌΗ5, которые могут быть получены из ЫГе Тесйпо1од1ек, 1пс. (СаННегкЬигд, Магу1апб).
Библиотека геномной ДНК человека может быть получена способами, хорошо известными в данной области (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 5-1 - 5-6; \Уи (1997), радек 307-327). Геномная ДНК может быть выделена лизисом ткани детергентом Саркозилом, расщеплением этого лизата протеиназой К, осветлением посредством удаления нерастворимых остатков (дебриса) из лизата центрифугированием, осаждением нуклеиновой кислоты из лизата с использованием изопропанола и очисткой ресуспендированной ДНК в градиенте плотности хлорида цезия.
ДНК-фрагменты, которые являются подходящими для получения геномной библиотеки, могут быть получены случайным разрезанием геномной ДНК или частичным расщеплением геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Фрагменты геномной ДНК могут быть встроены в вектор, такой как бактериофаг или космидный вектор, в соответствии с общепринятыми способами, такими как использование расщепления рестриктазами для получения подходящих концов, использование обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения молекул ДНК и лигирование с использованием подходящих лигаз. Способы такой манипуляции являются хорошо известными в данной области (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 5-1 - 5-6; \Уи (1997), радек 307-327).
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют ТСЕ-бета-связывающий белок, могут быть также получены с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, имеющими нуклеотидные последовательности, которые основаны на нуклеотидных последовательностях гена ТСЕ-бета-связывающего белка человека, описанного здесь. Общие способы для скрининга библиотек с использованием ПЦР описаны, например, Уи е! а1., Ике оГ 1Не Ро1утегаке СНат Веас!юи !о 8сгееи РНаде ЫЬтапек, 1п Мебюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСВ Рго!осо1к: Сиггеп! Мебюбк апб Аррйсабопк, ТСН1(е (еб.), радек 211-215 (Нитапа Ргекк, 1пс. 1993). Кроме того, способы использования ПЦР для выделения родственных генов описаны, например, Ргек!оп, Ике оГ Педепега!е О11допис1еоббе Рптегк апб (Не Ро1утегаке Скат Веасбои !о С1опе Сепе Еатбу МетЬегк, т Мс(кобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСВ Рго!осо1к: Сиггеп! Мс(Нобк апб Аррйсабопк, ^Ы!е (еб.), радек 317-337 (Нитапа Ргекк, 1пс. 1993).
Альтернативно, геномные библиотеки человека могут быть получены из коммерческих источников, таких как ВсксагсН Сеиебск (Нип!куШе, АЬ) и Американская Коллекция Типовых Культур (ВоскуШе, Магу1апб). Библиотека, содержащая кДНК- или геномные клоны, может быть подвергнута скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов на основе 8ЕО Ш N0: 1, с использованием стандартных способов, описанных здесь и известных в данной области (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 6-1 - 6-11).
Антитела против ТСЕ-бета-связывающих белков, полученные как описано здесь, могут быть также использованы для выделения последовательностей ДНК, которые кодируют ТСЕ-бета-связывающий белок, из кДНК-библиотек. Например, эти антитела могут быть использованы для скрининга библиотек экспрессии λ§111, или эти антитела могут быть использованы для иммуноскрининга после отбора и трансляции гибридов (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 6-12 - 6-16; Матдобк е! а1., 8сгеешид λ, ехртеккюи НЬтапек χνίΐΗ апбЬобу апб рто!ет ргоЬек, ш ^NΑ С1ошид 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Еббюи, С1оует е! а1. (ебк.), радек 1-14 (ОхГогб Ишуегкйу Ргекк 1995)).
Последовательность кДНК ТСЕ-бета-связывающего белка или геномного фрагмента ТСЕ-бетасвязывающего белка может быть определена с использованием стандартных способов. Кроме того, идентификация геномных фрагментов, содержащих промотор или регуляторный элемент ТСЕ-бетасвязывающего белка, может быть достигнута с использованием хорошо установленных способов, таких как делеционный анализ (см. в общем АикиЬе1 (1995), кирга).
В качестве альтернативы, ген ТСЕ-бета-связывающего белка может быть получен синтезом молекул ДНК с использованием взаимно праймирующих длинных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, АикиЬе1 (1995), радек 8-8 - 8-9). Установленные способы с использованием полимеразной цепной реакции обеспечивают возможность синтеза молекул ДНК с длиной по меньшей мере две т.п.н. (Абапд е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 21:1131, 1993; ВатЬо! е! а1., РСВ
- 14 014525
Ме!кобк апб Аррксабоик 2:266, 1993; Όίΐΐοη е! а1., Ике оГ 1Нс Ро1утегаке Скат Кеасбоп Гог 1Нс Кар1б Сопδίπιοίίοη оГ ЗуШкекс СенеС. ίη Ме!кобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1к: СиггеШ Ме!кобк апб Аррбсабот, Акке (еб.), радек 263-268, (Нитаиа Ргекк, 1пс. 1993); Но1о^аскик е! а1., РСК Ме!кобк Арр1. 4:299, 1995).
3. Получение генов ТОЕ-бета-связывающих белков.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариантные гены ТОЕ-бета-связывающих белков, могут быть получены скринингом различных кДНК-библиотек или геномных библиотек полинуклеотидными зондами, имеющими нуклеотидные последовательности на основе 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101, с использованием процедур, описанных здесь. Варианты генов ТОЕ-бета-связывающих белков могут быть также сконструированы синтетически. Например, может быть изобретена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий консервативную аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. То есть могут быть получены варианты, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, в которых алкиламинокислотой заменяют алкиламинокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка, ароматической аминокислотой заменяют ароматическую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка, серосодержащей аминокислотой заменяют серосодержащую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка, гидроксисодержащей аминокислотой заменяют гидроксиаминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка, кислотной аминокислотой заменяют кислотную аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бетасвязывающего белка, основной аминокислотой заменяют основную аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка или двухосновной монокарбоновой аминокислотой заменяют двухосновную монокарбоновую аминокислоту в аминокислотной последовательности ТОЕбета-связывающего белка. Среди обычных аминокислот, например, консервативная аминокислотная замена иллюстрируется заменой среди аминокислот в каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. В выполнении таких замен важно, когда это возможно, сохранять цистеиновый скелет, показанный на фиг. 1.
Консервативные аминокислотные изменения в гене ТОЕ-бета-связывающего белка могут быть введены заменой другими нуклеотидами нуклеотидов, указанных в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены, например, олигонуклеотиднаправленным мутагенезом, линкер-сканирующим мутагенезом, мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. АикиЬе1 (1995), радек 8-10 - 8-22; МсРкегкоа (еб.), Б1гес1еб Миίадеηек: А Ргасбса1 Арргоаск (ΙΚΕ Ргекк 1991)). Функциональная способность таких вариантов может быть определена с использованием стандартного способа, такого как описанный здесь анализ. Альтернативно, вариантный полипептид ТОЕ-бета-связывающего белка может быть идентифицирован по способности специфически связывать антитела против ТОЕ-бета-связывающего белка.
Рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновых кислот могут выполняться для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ТОЕбета-связывающего белка. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и испытывают на активность или на способность связывать антитела против ТОЕ-бета-связывающего белка. Одной альтернативой экзонуклеазному расщеплению является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для спецификации получения желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена ТОЕ-бета-связывающего белка могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции.
Стандартные способы функционального анализа белков описаны, например, ТгеШег е! а1., Мо1ес. Осп. Оспе!. 240:113, 1993; СоШеШ е! а1., Ехр геккон апб ргебтшагу 6с1с11оп аηа1ук^к оГ Ле 42 кЭа 2-5А куШкеИже тбисеб Ьу китаη ίηΚΗεΓοη, ίη Вю1одюа1 ШсгГсгоп 8ук!етк, Ргосеебтдк оГ [8[К-ТН0 Меебид οη биегГегои 8ук!етк, СаШе1 (еб.), радек 65-72 (АцкоГГ 1987); Не^скта^ Тке ЕОЕ Кесер1ог, ίη Соп!го1 оГ Ашта1 Се11 Р^ο1^Ге^абοη, Уо1. 1, ВоунЮи е! а1., (ебк.) радек 169-199 (Асабетю Ргекк 1985); Соита111еаи е! а1., 1. Вю1. Скет. 270:29270, 1995; Еикипада е! а1., 1. Вю1. Скет. 270:25291, 1995; УатадисЫ е! а1., Вюскет. Ркагтасо1. 50:1295, 1995; Ме1ке1 е! а1., Р1зп! Мо1ес. Вю1. 30:1, 1996.
Данное изобретение рассматривает также функциональные фрагменты гена ТОЕ-бетасвязывающего белка, которые имеют консервативные замены аминокислот.
Вариантный ген ТОЕ-бета-связывающего белка может быть идентифицирован на основе структуры определением уровня идентичности с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 и 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, как обсуждалось выше. Альтернативный подход для идентификации вариантного гена на основе структуры заключается в определении, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный ген ТОЕ-бета
- 15 014525 связывающего белка, гибридизоваться в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 или ее частью с длиной по меньшей мере 15 или 20 нуклеотидов. В качестве иллюстрации жестких условий гибридизации молекула нуклеиновой кислоты, имеющая вариантную последовательность гена ТОР-бета-связывающего белка, может связываться с фрагментом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность из 8Е0 ΙΌ N0: 1, в буфере, содержащем, например, 5х88РЕ (1х88РЕ=180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,7), 5х раствор Денхардта (100х раствор Денхардта=2% (мас./об.) бычий сывороточный альбумин, 2% (мас./об.) Фиколл, 2% (мас./об.) поливинилпирролидон)) и 0,5% ДМН, при инкубировании в течение ночи при 55-60°С. Постгибридизационные промывки при высокой жесткости обычно выполняют в 0,5х88С (1х88С=150 мМ хлорид натрия, 15 мМ тринатрийцитрат) или в 0,5х88РЕ при 55-60°С.
Независимо от конкретной нуклеотидной последовательности вариантного гена ТОР-бетасвязывающего белка этот ген кодирует полипептид, который может быть охарактеризован его функциональной активностью или его способностью связываться специфически с антителом против ТОР-бетасвязывающего белка. Более конкретно, вариантные гены ТОР-бета-связывающих белков кодируют полипептиды, которые проявляют по меньшей мере 50% и предпочтительно большую чем 60, 70, 80 или 90% активность полипептидов, кодируемых геном ТОР-бета-связывающего белка человека, описанным здесь.
4. Получение ТОР-бета-связывающего белка в культивируемых клетках.
Для экспрессии гена ТОР-бета-связывающего белка молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот полипептид, должна быть функционально связана с регуляторными последовательностями, которые регулируют транскрипционную экспрессию, в экспрессирующем векторе и затем введена в клеткухозяина. Кроме регуляторных последовательностей транскрипции, таких как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут включать регуляторные последовательности трансляции и маркерный ген, который пригоден для отбора клеток, которые несут этот экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы, которые пригодны для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, обычно содержат (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующие бактериальный сайт инициации репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора этого экспрессирующего вектора в бактериальном хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, которые регулируют процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования.
ТОР-бета-связывающие белки данного изобретения предпочтительно экспрессируются в клетках млекопитающих. Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки Африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СВЬ 1587), клетки эмбриональной почки человека (293-НЕК; АТСС СВЬ 1573), клетки почки хомячка (ЬаЬу йатк!ег) (ВНК-21; АТСС СВБ8544), клетки почки собачьих (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичника Китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССБ61), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССБ82), клетки НеЬа 83 (АТСС ССБ2.2), клетки гепатомы крысы (Н-4-11-Е; АТСС СВЬ 1548), 8У40-трансформированные клетки почки обезьяны (С08-1; АТСС СВЬ 1650) и мышиные эмбриональные клетки (Ы1Н-3Т3; АТСС СВЬ 1658).
Для хозяина-млекопитающего регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, бычий папилломавирус, вирус обезьян или т.п., в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Подходящие регуляторные последовательности транскрипции и трансляции могут быть также получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Транскрипционные регуляторные последовательности включают промоторный район, достаточный для управления инициацией синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор мышиного гена металлотионеина I [Натег е! а1., I. Мо1ес. Арр1. Оепе!. 1:273, 1982], промотор ТК вируса герпеса [МсКшдй!, Се11 31:355, 1982], ранний промотор 8У40 |Вепо151 е! а1., №1иге 290:304, 1981], промотор вируса саркомы Рауса [Оогтап е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А 79:6777, 1982], промотор цитомегаловируса [Роескшд е! а1., Оепе 45:101, 1980] и промотор вируса опухоли молочной железы мыши (см., в общем, Е!сйеνеπу, Ехргеккюп ой Епдшеегей Рго!ешк ίη Маттайап Се11 Си1!иге, ίη Рго!ет Епдтееппд: Рппс1р1ек апй Ргтйсе, С1е1апй е! а1., (ейк.), радек 163-181 (йойп \УПеу апй 8опк, 1пс. 1996)).
Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т3, может быть использован для регуляции экспрессии гена ТОР-бета-связывающего белка в клетках млекопитающих, если этот прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (2йои е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529, 1990; Каийтап е! а1., ШсШс Ас1йк Век. 19:4485, 1991).
Гены ТОР-бета-связывающего белка могут быть также экспрессированы в бактериальных, дрожжевых клетках, клетках насекомых или клетках растений. Подходящие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов ТОР-бета-связывающих белков в прокариотическом хозяине, хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области и включают промоторы, способ
- 16 014525 ные узнавать полимеразы Т4, Т3, 8р6 и Т7, промоторы Рр и Ръ бактериофага лямбда, промоторы ίτρ, гесА, белков теплового шока, ЬасиУ5, !ас, 1рр-1ас8рг, ркоА и промоторы 1ас2 Е. соб, промоторы ВасШик киЬббк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы 8!гер!отусек, промотор ίη! бактериофага лямбда, промотор Ь1а рВВ322 и промотор САТ гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы обсуждались в обзоре Сбск, 1. Ιη6. МюгоЬю1. 1:277, 1987, \Уа1коп е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду οί Ле Сепе, 411' Еб. (Вещают Ситттк 1987) и АикиЬе1 (1995).
Предпочтительные прокариотические хозяева включают Е. соб и ВасШик киЬббк. Подходящие штаммы Е. соб включают ВЬ21(ПЕ3), ВЕ21(ПЕ3)рЬук8, ВЕ21(ПЕ3)рЬукЕ, ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ΌΗ5ΙΡ', ΌΗ5ΙΜ0Ε, ЭШ0В, ЭШ0В/р3, ΌΗ118, Сб00, №101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, ВК1, Υ1088, Υ1089, С8Ш8, ЕР1451 и ЕВ1647 (см., например, Вго\\'п (Еб.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬГах (Асабетю Ргекк 1991)). Подходящие штаммы ВасШик киЬббк включают ВР151, ΥΕ886, ΜΙ119, ΜΙ120 и В170 (см., например, Чагбу, ВасШик С1ошпд МеШобк, ίη ЭИА С1ошпд: А Ргасбса1 Арргоасб, С1оуег (еб.) (ΙΒ4 Ргекк 1985)).
Способы экспрессии белков в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, ^ббатк е1 а1., Ехргеккюп оГ Гогещп рго!ешк ίη Е. сой икшд р1акт1б уесЮгк апб рипбсабопк оГ кресШс ро1ус1опа1 апПЬоб1ек, ίη ЭИА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб ЕбШоп, С1оуег е! а1., (ебк.), раде 15 (ОхГогб Ишуегкйу Ргекк 1995); \Уагб е! а1., Сепебс МапрШабоп апб Ехргеккюп оГ АпбЬоб1ек, ίη Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Ргшс1р1ек апб Аррбсабопк, раде 137 (ХУПеу-Ыкк, Лс.
1995) и Сеогдюи, Ехргеккюп оГ Рго!етк ίη Вас!епа, ίη Рго!ет Епдтееппд: Рппар1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.), раде 101 (1обп \УПеу апб 8опк, Лс. 199б)).
Бакуловирусная система обеспечивает эффективное средство введения клонированных генов ТСЕбета-связывающих белков в клетки насекомых. Подходящие экспрессирующие векторы основаны на вирусе множественного ядерного полиэдроза Аи!одгарНа саШогтаса (АсМИРУ) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка 70 теплового шока (Нкр) ЭгокорШа, промотор немедленно раннего гена вируса множественного ядерного полиэдроза Аи!одгарба саШогшса (те-1) и задержанный ранний промотор 39К, промотор бакуловируса р 10 и промотор металлотионеина ЭгокорНба. Подходящие клетки-хозяева насекомых включают клеточные линии, полученные из ГРЬВ-8Г-21, клеточную линию пупального яичника 8робор!ега Ггид1регба, такую как 8Г9 (АТСС СРЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Г21 Чпубгодеп Согрогабоп; 8ап Э1едо, СА), а также клетки ЭгокорНба 8сбпе1бег-2. Установленные способы для получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах обеспечены Вабеу е! а1., МашрШабоп оГ Васи1оу1гик Уес!огк, ίη МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 7: Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к, Миггау (еб.), Радек 147-168 (ТНе Читана Ргекк, Шс. 1991), Ра!е1 е! а1., ТНе Ьаси1оу1гик ехргеккюп кук!ет, ίη ПЫА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб ЕбШоп, С1оуег е! а1., (ебк.), радек 205-244 (ОхГогб Ищуегкйу Ргекк 1995), АикиЬе1 (1995), радек 16-37 - 16-57, КГсНагбкоп (еб.), Васи1оу1гик Ехргеккюп Рго!осо1к (ТНе Иитапа Ргекк, Шс. 1995), и Ьискпоте, ('Тпкес! Се11 Ехргеккюп Тесбпо1оду, ίη Рго!еш Епдшееппд: Рппар1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.), радек 183-218 (1оНп ^беу апб 8опк, Шс. 1996)).
Промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы из САЫ (галактозы), РСК (фосфоглицераткиназы), АОЧ (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), ΗΙ84 (гистидинолдегидрогеназы) и т.п. Многие клонирующие векторы дрожжей были сконструированы и являются легко доступными. Эти векторы включают векторы на основе Υφ, такие как Υφ5, векторы ΥΚρ, такие как векторы ΥΚρ17, векторы УЕр, такие как ΥЕр13, и векторы ΥСр, такие как ΥСр19. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что имеется большое разнообразие подходящих векторов для экспрессии в клетках дрожжей.
Экспрессирующие векторы могут также вводиться в протопласты растений, ткани интактных растений или в выделенные клетки растений. Общие способы культивирования тканей растений обеспечены, например, М1к1 е! а1., Ргосебшек Гог Шбобистд Еоге1дп ЭИА т!о Р1ап!к, ίη Ме!1обк ίη Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду апб Вю!есбпо1оду, Сбск е! а1. (ебк.), радек 67-88 (СКС Ргекк, 1993).
Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева стандартными способами, в том числе, кальций-фосфатной трансфекцией, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной микроснарядами доставкой, электропорацией и т.п. Предпочтительно трансфицированные клетки отбирают и размножают для обеспечения рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат этот экспрессирующий вектор, стабильно интегрированный в геном клетки-хозяина. Способы введения векторов в эукариотические клетки и способы отбора таких стабильных трансформантов с использованием доминантного селектируемого маркера описаны, например, АикиЬе1 (1995) и Миггау (еб.), Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к (Иипи-та Ргекк 1991). Способы введения экспрессирующих векторов в бактериальные, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки растений обеспечены также АикиЬе1 (1995).
Общие способы экспрессии и извлечения чужеродного белка, продуцируемого системой клеток млекопитающего, обеспечена, например, Е!сбеуеггу, Ехргеккюп оГ Епдтеегеб Рго!ешк ίη Маттабап Се11 Си1!иге, ίη Рго!еш Епдтееппд: Рппс1р1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.), радек 163 (ХУНеу-Ыкк, Шс.
1996) . Стандартные способы извлечения белка, продуцируемого бактериальной системой, обеспечены, например, СпккНаттег е! а1., Рипйсабоп оГ оуег-ргобисеб рго!ешк Ггот Е. соб се11к, ίη ЭИА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб ЕбШоп, С1оуег е! а1., (ебк.), радек 59-62 (ОхГогб итуегкНу Ргекк 1995). Установ
- 17 014525 ленные способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Ктсйатбкоп (еб.), Васи1оу|ги5 Ехртеккюп Рго!осо1к (Тйе Нитапа Ргекк, Шс. 1995).
Более часто ТСЕ-бета-связывающий белок может быть выделен стандартными способами, такими как аффинная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, ионообменная хроматография, ВЖХ и т.п. Дополнительные вариации в выделении и очистке ТСЕ-бета-связывающего белка могут быть придуманы специалистами с квалификацией в данной области. Например, антитела против ТСЕ-бетасвязывающего белка, полученные как описано ниже, могут быть использованы для выделения больших количеств белка иммуноаффинной очисткой.
5. Получение антител к ТСЕ-бета-связывающим белкам.
Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются со склеростином, как описано здесь подробно. Антитела к ТСЕ-бета-связывающему белку могут быть получены, например, с использованием продукта экспрессирующего вектора в качестве антигена. Антитела, которые специфически связываются со склеростином, могут быть также получены с использованием пептидов, полученных из любой из полипептидных последовательностей склеростина, обеспеченных здесь (8Е0 Ш N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 и 65). Особенно предпочтительные антитела против ТСЕ-бетасвязывающего белка связываются специфически с ТСЕ-бета-связывающим белком 8Е0 Ш N0: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 и 65, но не с другими ТСЕ-бета-связывающими белками, такими как Эап. СегЬегик, 8ССЕ или Стетйп. Антитело данного изобретения (в том числе его фрагменты и производные) может быть поликлональным или, в частности, моноклональным антителом. Это антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов и может быть, например, ^С (в том числе изотипами ^С, которые для антител человека известны в данной области как IдС1, ^С2, ^С3, !дС4); антитело !дЕ; [§М или !дА. Антитело может быть получено из птицы или млекопитающих, предпочтительно, например, из мышиных, крысы, человека или другого примата. Когда это желательно, это антитело может быть интернализующим антителом.
Поликлональные антитела к рекомбинантному ТСЕ-бета-связывающему белку могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Сгееп е! а1., Ртобисбоп оГ Ро1ус1опа1 Апбкета, ίπ Iттипосйет^са1 Рго1осо1к (Майкоп, еб.), радек 1-5 (Нитапа Ргекк, 1992); АППатк е! а1., Ехртеккюп оГ Гогещг! рго!ешк ίΐ'ΐ Е. со11 иктд р1акпнб уесЮгк апб рипбсабопк оГ кресШс ро1ус1опа1 аибЬоб^ек, т ЭХА С1ошпд 2: Ехртеккюп 8ук!етк, 2пб Ебйюп, С1оуег е! а1., (ебк.), раде 15 (ОхГогб Ишуеткйу Ргекк 1995)). Хотя поликлональные антитела обычно индуцируются у животных, таких как крысы, мыши, кролики, козы или овцы, антитело против ТСЕ-бетасвязывающего белка данного изобретения может быть также получено из антитела примата (не человека). Общие способы индукции диагностически и терапевтически применимых антител у павианов может быть найдены, например, в Со1бепЬегд е! а1., ра!еп! риЬ11са1юг1 №. АО 91/11465 (1991) и в
Ьоктап е! а1., Ш!. I. Сапсег 46:310, 1990.
Это антитело должно содержать, по меньшей мере, домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может быть любого размера или любого аминокислотного состава и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, заключенную в каркасную последовательность. В общих чертах, этот домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (УН) и/или легкой (УО цепи. Так, например, домен ν-области может быть мономерным и быть νΗили ^-доменом, где они способны независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен ν-области может быть димерным и содержать νΗ-νΗ, νΗ-ν4 или νι.-νΗ-димеры, в которых νΗ- и νι,-цепи нековалентно связаны (сокращенно называется далее Еу). Однако если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны или непосредственно, например, через дисульфидную связь между двумя вариабельными доменами, или через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечного домена (сокращенно называемого здесь ксЕу).
Домен вариабельной области может быть любым природно встречающимся вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием способов конструирования рекомбинантных ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельных областей природного антитела посредством инсерций, делеций или замен в отношении аминокислотных последовательностей природных антител. Конкретные примеры этого типа включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один СЭВ и необязательно одну или несколько аминокислот каркасной области из одного антитела и остальную часть домена вариабельной области из второго антитела.
Этот домен вариабельной области может быть ковалентно связан при С-концевой аминокилоте по меньшей мере с одним другим доменом антитела или его фрагментом. Так, например, если присутствует νιι-домен в домене вариабельной области, он может быть связан с доменом иммуноглобулина СН1 или его фрагментом. Подобным образом, νι-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким путем, например, это антитело может быть ЕаЬ-фрагментом, где антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные ^-^-домены, ковалентно связанные на их С-концах с СН1 и Ск-доменом, со
- 18 014525 ответственно. Сн1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения домена шарнирной области, как обнаруживается в ЕаЬ'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены Сн2 и Сн3.
Другой формой фрагмента антитела является пептид, включающий единственный определяющий комплементарность район (СОЯ). СЭР-пептиды (минимальные единицы узнавания) могут быть получены конструированием генов, кодирующих СОЯ представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК продуцирующих антитело клеток (см., например, Ьатск е! а1., МеФойз: А Сотрапзоп !о Ме11юйз ш Епхуто1оду 2:106, 1991; Соипепау-Ьиск, Сепейс Матри1айоп оГ Мопос1опа1 АпйЬой1ез, ш Мопос1опа1 АпйЬоФез: Ргойисйоп, Епдшееппд апй Сйшса1 Аррйсайоп, Яй1еге1 а1. (ейз.), раде 166 (СатЬпйде Ишуег811у Ргезз 1995); и \Уагй е! а1., Сепейс Матри1айоп апй Ехргеззюп оГ АпйЬой1ез, ш Мопос1опа1 АпйЬой1ез: Ргтар1ез апй Аррйсайопз, ВйсН е! а1., (ейз.), раде 137 (^йеу-Ызз, 1пс. 1995)).
Антитела для применения в данном изобретении могут быть в общем моноклинальными (полученными общепринятыми процедурами иммунизацией и слияния клеток) или, в случае фрагментов, полученными из них с использованием любого стандартного химического способа, такого как восстановление или ферментативное расщепление, и/или способов расщепления, например, обработкой пепсином. Более конкретно, моноклональные антитела против ТСЕ-бета-связывающего белка могут быть генерированы с использованием различных способов. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам с квалификацией в данной области (см., например, КоЫег е! а1., №-11иге 256:495, 1975 и Сойдап е! а1., (ейз.), СиггеШ РгоЮсо1з ш 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 ОоНп \Уйеу апй 8опз 1991) [Сойдап]; Р1скз1еу е! а1., Ргойисйоп оГ топос1опа1 апйЬой1ез адашз! рго1етз ехргеззей т Е. сой, т ^NА С1ошпд 2: Ехргеззюп 8уз1етз, 2'1 Еййюп, С1оуег е! а1., (ейз.), раде 93 (0хГогй ипуегзйу Ргезз, 1995)).
Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъекцией мышей композицией, содержащей продукт гена ТСЕ-бета-связывающего белка, подтверждением присутствия продуцирования антитела взятием пробы сыворотки, удалением селезенки для получения В-лимфоцитов, слиянием этих Влимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, клонированием этих гибридом, отбором положительных клонов, которые продуцируют антитела к данному антигену, культивированием клонов, которые продуцируют антитела к данному антигену и выделением этих антител из гибридомных культур.
Кроме того, антитело против ТСЕ-бета-связывающего белка данного изобретения может быть получено из моноклонального антитела человека. Моноклональные антитела человека получают из трансгенных мышей, которые были получены генной инженерией для получения специфических антител человека в ответ на введение антигена. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепи человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфические в отношении антигенов человека, и эти мыши могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Способы получения антитела человека из трансгенных мышей описаны, например, Сгееп е! а1., №-11иге СепеЕ 7:13, 1994; ЬопЬегд е! а1., №-11иге 368:856, 1994, и Тау1ог е! а1., 1пЕ 1ттип. 6:579, 1994.
Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок-А-сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Сойдап, радез 2.7.1-2.7.12 апй радез 2.9.1-2.9.3; Вашез е! а1., Риййсайопз оГ 1ттипод1оЬш С (1дС), т МеФойз т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радез 79-104 (ТНе Нитапа Ргезз, 1пс. 1992)).
Для конкретных применений может быть желательным получение фрагментов антитела против ТСЕ-бета-связывающих белков. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антитела.
Фрагменты антител могут быть получены расщеплением пепсином или папаином целых антител общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином для обеспечения фрагмента 58, названного Е(аЬ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиол агента с получением моновалентных ЕаЬ'-фрагментов 3,58. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые возникают из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием пепсина производит два моновалентных ЕаЬ-фрагмента и Ес-фрагмент непосредственно. Эти способы описаны, например, Со1йепЬегд, патент США № 4331647, №зопоГГ е! а1., АгсН. ВюсНет. ВюрНуз. 89:230, 1960, Ройег, Вюсет. 1. 73:119, 1959, Ейе1тап е! а1., т МеЛойз т Епхуто1оду 1:422 (Асайетк Ргезз 1967) и Сойдап, радез 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4.
Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей для образования моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть использованы, пока эти фрагменты
- 19 014525 связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Альтернативно, это антитело может быть рекомбинантным или полученным генной инженерией антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипулирование и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, фаговых библиотек антител (см. СЫктеБ, БЭ. апб МсСайейу, I. Т1Ь!ес1. 10 80-84 (1992)), или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования ДНК и манипуляции с ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина, для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно.
Один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область, могут быть получены и использованы для трансформации подходящей клеточной линии, например, непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как мышиная линия N80, или бактериальной линии, такой как Е. соБ, в которых будет происходить продуцирование этого антитела. Для получения эффективной транскрипции и трансляции ДНК-последовательность в каждом векторе должна включать подходящие регуляторные последовательности, в частности, промоторную и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител таким путем обычно хорошо известны и рутинно используются. Например, основные процедуры молекулярной биологии описаны МашаБк е! а1. (Мо1еси1аг С1ошид, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, №е\г Уогк, 1989); секвенирование ДНК может выполняться, как описано 8аидег е! а1. (Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 74: 5463 (1977)) и ЛтегкНат 1и!етаБоиа1 р1с кециеистд БаибЬоок; сайт-направленный мутагенез может проводиться в соответствии со способом Кгатег е! а1. (№.1с1е1с Ас1бк Кек. 12, 9441, (1984); (Не АидБаи В1о!есЬио1оду Ь!б БаибЬоок; Киике1 Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 82:488-92 (1985); Киике1 е! а1., Ме(1юбк 1и Еηζуто1. 154:367-82 (1987)). Дополнительно, многочисленные публикации подробно описывают способы, подходящие для получения антител манипуляцией ДНК, создание экспрессирующих векторов и трансформацию подходящих клеток, например, как описано в обзоре Моии1аш А аиб Абаи, I К 1и Вю1ес1то1оду аиб ОеиеБс Еидшеегшд Кеу1е^к (еб. ТотЬк, М. Р., 10, С11ар1ег 1, 1992, 1и!егсер!, Аибоуег, ИК) и в 1и!ета!1оиа1 Ра!еи! 8ресШсаБои № \¥0 91/09967.
В некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с данным изобретением может иметь одну или несколько эффекторных или репортерных молекул, присоединенных к нему, и данное изобретение включает в себя такие модифицированные белки. Репортерной молекулой может быть детектируемая часть или метка, такая как фермент, цитотоксичный агент или другая репортерная молекула, в том числе, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа или биотин или т.п. Специфические в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка иммуноглобулин или его фрагмент могут быть радиоактивно помечены для диагностических или терапевтических применений. Способы радиоактивного мечения антител известны в данной области. См., например, Абатк 1998 1и У1уо 12:11-21; ШБииеи 1993 Ас!а 0исо1. 32:831-9. Терапевтические применения описаны более подробно ниже и могут включать использование специфического в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка антитела (или его фрагмента) вместе с другими терапевтическими агентами. Эффекторная или репортерная молекулы могут быть присоединены к этому антителу через любую доступную боковую цепь аминокислоты, концевую аминокислоту или, через углеводную функциональную группу, расположенную в этом антителе, когда она присутствует, при условии, что это присоединение или процесс присоединения не оказывает неблагоприятного влияния на связывающие свойства и применимость этой молекулы. Конкретные функциональные группы включают, например, любую свободную амино-, имино-, тиол-, гидрокси-, карбоксильную или альдегидную группу. Соединение антитела и эффекторной и/или репортерной молекулы (молекул) может быть достигнуто через такие группы и подходящую функциональную группу в этих эффекторных или репортерных молекулах. Эта связь может быть прямой или непрямой через спейсерные или мостиковые группы.
Эффекторные молекулы включают, например, противоопухолевые агенты, токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального (например, экзотоксин А Р. аегидшока) или растительного происхождения и их фрагменты (например, рицин и его фрагменты; гелонин растений, бриодин из Вгуоша бшка, или т.п.; см., например, ТБгикБ е! а1., 1996, Аиии. Кеу. 1ттиио1. 14: 49-71; Егаике1 е! а1., 1996, Саисег Кек. 56:926-32); биологически активные белки, например, ферменты; нуклеиновые кислоты и их фрагменты, такие как ДНК, РНК и их фрагменты; природно встречающиеся и синтетические полимеры (например, полисахариды и полиалкиленовые полимеры, такие как поли(этиленгликоль), и их производные); радионуклиды, в частности радиоиодид; и хелатированные металлы. Подходящие репортерные группы включают хелатированные металлы, флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть детектированы с помощью ЯМР и ЭПР (электорнный парамагнитный резонанс) спектроскопии. Подходящими применимыми эффекторными группами являются калихаемицин и его производные (см., например, 8ои!1 АЕпсаи Ра!еи! 8ресШса!юик №ок. 85/8794, 88/8127 аиб 90/2839).
Многочисленные другие токсины, в том числе химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антибиотики, индукторы апоптоза (или апоптогены, см., например, Огееи аиб Кееб, 1998, 8с1
- 20 014525 епсе 281:1309-1312) или т.п. известны лицам, знакомым с данной областью, и примеры, обеспеченные здесь, предназначены для иллюстрации без ограничения объема и идеи данного изобретения. Конкретные противоопухолевые агенты включают цитотоксические и цитостатические агенты, например, алкилирующие агенты, такие как азотные аналоги горчичного газа (например, хлорамбуцил, мелфалан, мехлорэтамин, циклофосфамид или урацилиприт) и их производные, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, бусульфан или цисплатин; антиметаболиты, такие как метотрексат, фторурацил, флоксуридин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, фторуксусная кислота или фторлимонная кислота, антибиотики, такие как блеомицины (например, блеомицина сульфат), доксорубицин, даунорубицин, митомицины (например, митомицин С), актиномицины (например, дактиномицин), пликамицин, калихаемицин и его производные, или эсперамицин и его производные; митотические ингибиторы, такие как этопозид, винкристин или винбластин и их производные; алкалоиды, такие как эллиптицин; полиолы, такие как таксицин-Ι или таксицин-ΙΙ; гормоны, такие как андрогены (например, дромостанолон или тестолактон), прогестины (например, мегестрола ацетат или медроксипрогестерона ацетат), эстрогены (например, диметилстилбестрола дифосфат, полиэстрадиола фосфат или эстрамустина фосфат) или антиэстрогены (например, тамоксифен); антрахиноны, такие как митоксантрон, мочевины, такие как гидроксимочевина; гидразины, такие как прокарбазин; или имидазолы, такие как дакарбазин.
Хелатированные металлы включают хелаты ди- или триположительных металлов, имеющих координационное число от 2 до 8 включительно. Конкретные примеры таких металлов включают технеций (Тс), рений (Кс), кобальт (Со), медь (Си), золото (Аи), серебро (Ад), свинец (РЬ), висмут (Βί), индий (Ιη), галлий (Са), иттрий (Υ), тербий (ТЬ), гадолиний (Об) и скандий (§с). Обычно этот металл предпочтительно является радионуклидом. Конкретные радионуклиды включают 99тТс, 186Ке, 188Ке, 58Со, 60Со, 67Си, 195Аи, 199Аи, 110Ад, 203РЬ, 206Βί, 207Βί, Ιη. 67Са, 68Са, 88Υ, 90Υ, 160ТЬ, 153Сб и 47§с.
Хелатированным металлом может быть, например, один из вышеуказанных типов металла, хелатированных любым подходящим полидентатным хелатообразующим агентом, например, ациклическими или циклическими полиаминами, простыми полиэфирами (например, кроун-эфирами и их производными); полиамидами; порфиринами и карбоциклическими производными. Обычно, тип хелатообразующего агента будет зависеть от используемого металла. Однако одной особенно применимой группой хелатообразующих агентов в конъюгатах по данному изобретению являются ациклические и циклические полиамины, особенно полиаминокарбоновые кислоты, например диэтилентриаминпентауксусная кислота и ее производные, и макроциклические амины, такие как циклические триазапроизводные и тетразапроизводные (например, описанные в Международной заявке на патент АО 92/22583) и полиамиды, в частности дезферриоксамин и его производные.
При использовании тиоловой группы в антителе в качестве точки присоединения это может быть достигнуто посредством реакции с тиоловой реактивной группой, присутствующей в эффекторной или репортерной молекуле. Примеры таких групп включают а-галогенкарбоновую кислоту или эфир, такой как иодацетамид, имид, такой как малеимид, винилсульфон или дисульфид. Эти и другие подходящие процедуры связывания описаны в общем виде и более конкретно в Международных заявках на патент АО 93/06231, АО 92/22583, АО 90/091195 и АО 89/01476.
Анализы для отбора молекул, которые увеличивают плотность кости
Как описано выше, данное изобретение обеспечивает способы отбора и/или выделения соединений, которые способны увеличивать плотность кости. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (например, кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания (или контактирования) выбранной молекулы с ТСЕ-бета-связывающим белком и выбранным членом белков ТСЕ-бетасемейства, (Ь) определения, стимулирует ли выбранная молекула передачу сигнала ТСЕ-бета-семейством белков или ингибирует связывание ТСЕ-бета-связывающего белка по меньшей мере с одним членом ТСЕ-бета-семейства белков. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность ТСЕ-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) экспонирования (контактирования, смешивания, объединения) выбранной молекулы клеткам, которые экспрессируют ТСЕ-бета-связывающий белок, и (Ь) определения, уменьшается ли экспрессия (или активность) ТСЕ-бета-связывающего белка в экспонированных клетках, или уменьшается ли активность ТСЕ-бета-связывающего белка, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. В одном варианте осуществления эти клетки выбраны из группы, состоящей из самопроизвольно перерожденной или неперерожденной кости нормального человека из костных биопсий и остеобластов теменной кости крысы. Способы детектирования уровня экспрессии ТСЕбета-связывающего белка могут выполняться в большом разнообразии форматов, известных в данной области и описанных здесь. Для детектирования и количественного определения экспрессии ТСЕ-бетасвязывающего белка могут быть использованы иммуноанализы, например противоточный иммуноэлектрофорез (С1ЕР), радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммунофер
- 21 014525 ментные анализы (ЕЬ18А), иммуноблот-анализы, такие как дот-блот-анализы и Вестерн-блоты, анализы ингибирования или конкурентные анализы и сэндвич-анализы (см. патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также АпйЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, кирга). Такие иммуноанализы могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении ТСР-бета-связывающего белка, такое как описанные здесь антитела против склеростина, или могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении репортерной молекулы, которая присоединена к ТСР-бета-связывающему белку. Уровень экспрессии полипептида может быть также определен определением количества ТСР-бетасвязывающего белка, которое связывается с лигандом ТСР-бета-связывающего белка. Например, связывание склеростина в пробе с ВМР может быть детектировано с использованием резонанса поверхностных плазмонов (8РВ). Альтернативно, может быть количественно определен уровень экспрессии мРНК, кодирующей специфический ТСР-бета-связывающий белок.
Репрезентативные варианты таких анализов обеспечены ниже в примерах 5 и 6. Вкратце, член ТСРбета-суперсемейства или ТСР-бета-связывающий белок сначала связывают с твердой фазой с последующим добавлением кандидатной молекулы. Затем в этот анализ добавляют меченый член ТСР-бетасуперсемейства или ТСР-бета-связывающий белок (т. е. меченым полипептидом является лиганд для полипептида, связанного с твердой фазой), твердую фазу промывают и количество связанного или меченого члена ТСР-бета-суперсемейства или ТСР-бета-связывающего белка определяют на твердом носителе. Молекулы, которые пригодны для применения в увеличении минерального содержания кости, как описано здесь, являются молекулами, которые уменьшают связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом или членами ТСР-бета-суперсемейства статистически значимым образом. Очевидно, что анализы, подходящие для использования в данном изобретении, не должны ограничиваться вариантами, описанными в примерах 2 и 3. В частности, многочисленные параметры могут быть изменены, например, связыванием ТСР-бета с твердой фазой или элиминацией полностью твердой фазы.
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) экспонирования (контактирования, смешивания, комбинирования) выбранной молекулы (кандидатного агента) клеткам, которые экспрессируют ТСР-бета, и (Ь) определения, изменяется ли активность ТСР-бета из указанных экспонированных клеток, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. Подобно описанным здесь способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки изменений экспрессии ТСР-бета-связывающего белка, обусловленных выбранным тест-соединением. В одном варианте осуществления данного изобретения кандидатным агентом является антитело, которое связывается с описанным здесь ТСР-бета-связывающим белком склеростином.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТСР-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом 8О8Т, с пептидом 8О8Т, в том числе, но не только, с описанными здесь пептидами, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело плюс (+) 8О8Т (антитело/8О8Т), и затем детектирования уровня (например, определения количества) комплекса 8О8Т/антитело для определения присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТСР-бета. Этот способ может выполняться с использованием 8РВ или любого числа других иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь, в том числе, ЕЬ18А, иммуноблоттинга или т.п. Путь передачи сигнала ТСР-бета включает путь передачи сигнала, при помощи которого ВМР связывается с рецептором типа I и рецептором типа II на клетке для стимуляции или индукции пути, который модулирует минеральное содержание кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с 8О8Т, стимулирует или усиливает путь для увеличения минерального содержания кости. Такое антитело может быть идентифицировано с использованием описанных здесь способов для детектирования связывания антитела с 8О8Т-специфическими пептидами.
Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антител, которые нарушают, ингибируют (в том числе конкурентно ингибируют) или предотвращают связывание ВМР с полипептидом 8О8Т, детектированием, связывается ли антитело с пептидами 8О8Т, которые находятся в районах или частях районов на 8О8Т, с которыми связывается ВМР, таких как пептиды на амино-концевой стороне 8О8Т, и пептиды, которые включают амино-концевые аминокислотные остатки и часть внутреннего района (босктд соге) 8О8Т (например, 8ЕЦ ГО ЫО: 47-64, 66-73 и 92-95). Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антитела, которое нарушает, предотвращает или ингибирует образование гомодимеров 8О8Т. Такое антитело, которое связывается специфически с 8О8Т, может быть идентифицировано детектированием связывания этого антитела с пептидами, которые произведены из внутренней части или карбоксиконцевого района 8О8Т (например, 8ЕО ГО ЫО: 74-91 и 96-99).
В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания или контактирования выбранной молекулы (кандидатного агента) с ТСР-бета-связывающим
- 22 014525 белком и выбранным членом белков ТСР-бета-семейства, (Ь) определения, увеличивает ли выбранная молекула передачу сигнала белков ТСР-бета-семейства, или ингибирует связывание ТСР-бетасвязывающего белка с белками ТСР-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность ТСР-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки стимуляции ТСР-бета, обусловленной выбранным тест-соединением. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 6 (см. также ЭигНат е! а1., Епбо. 136:1374-1380).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание ТСР-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. В данном контексте должно быть понятно, что выражение кость или ее аналог относится к гидроксиапатиту или поверхности, состоящей из порошкообразной формы кости, измельченной кости или интактной кости. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки ингибирования локализации ТСР-бета-связывающего белка в костном матриксе. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 7 (см., также №со1ак е! а1., Са1с1£. Т1ккие Ш!. 47:206-12 (1995)).
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом склеростина, способны конкурентно ингибировать связывание члена ТСР-бета-семейства с полипептидом склеростина. Способность антитела или фрагмента антитела разрушать или блокировать связывание члена ТСР-бета-семейства, такого как ВМР, со склеростином, может быть определена в соответствии с любым из описанных здесь способов. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут нарушать, блокировать или предотвращать связывание члена ТСР-бета-семейства со склеростином нарушением образования гомодимеров склеростина. Антитело, которое специфически связывается со склеростином, может быть также использовано для идентификации активности склеростина по ингибированию или нарушению связывания склеростина с ВМР. Альтернативно, это антитело или его фрагмент могут быть включены в анализ на основе клеток или в модели животного, в которых склеростин имеет определенную активность, для определения, изменяет ли антитело (увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) эту активность. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут быть использованы для испытания действия такого антитела в пути передачи сигнала и посредством этого модуляции (стимуляции или ингибирования) этого пути передачи сигнала. Предпочтительно связывание антитела с 8О8Т приводит к стимуляции или индукции пути передачи сигнала.
Хотя описанные здесь способы могут относиться к анализу индивидуальной тест-молекулы, данное изобретение не должно ограничиваться таким образом. В частности, выбранная молекула может содержаться в смеси соединений. Таким образом, описанные способы могут дополнительно включать стадию выделения молекулы, которая ингибирует связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСРбета-семейства.
Кандидатные молекулы
Большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность ингибировать связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства. Репрезентативные примеры, обсуждаемые более подробно ниже, включают органические молекулы (например, органические небольшие молекулы), белки или пептиды и молекулы нуклеиновых кислот. Хотя из приведенного ниже обсуждения должно быть очевидно, что описанные здесь кандидатные молекулы могут быть использованы в описанных здесь способах, должно быть также вполне очевидно, что такие молекулы могут быть также использованы в различных диагностических и терапевтических ситуациях.
1. Органические молекулы.
Многочисленные органические небольшие молекулы могут быть проанализированы на их способность ингибировать связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства. Например, в одном варианте осуществления данного изобретения подходящие органические молекулы могут быть выбраны или из химической библиотеки, где химикалии анализируют индивидуально, или из комбинаторных химических библиотек, где множественные соединения анализируют сразу, затем подвергают деконволюции для определения и выделения наиболее активных соединений.
Репрезентативные примеры таких комбинаторных химических библиотек включают библиотеки, описанные Адгайобк е! а1., 8ук!ет апб тебюб оП аи!отабса11у депегабпд сНет1са1 сотроипбк νίΐΐι бекпеб ргорегбек, патент США № 5463564; Агтк!гопд, Я.^., 8уп111ек1к оП сотЬта!опа1к аггаук оП огдапю сотроипбк 111гоид11 111е ике оП ти1бр1е сотропеп! сотЬта!опа1 аггау купШеык. \¥О 95/02566; Ва1бтап, И е! а1., 8и1Попат1бе бегб'аШ'ек апб (Ней ике, \¥О 95/24186; Ва1бтап, И е! а1., СотЬта!опа1 бШубгоЬепхоругап бЬгагу, XVО 95/30642; Вгеппег, 8., №\ν к11 Пог ргераппд сотЬта!опа1 бЬгапек, ХУО 95/16918; СЕепега, В. е! а1., Ргерагабоп оП ЕЬгагу оП гект-Ьоипб аготабс сагЬосубю сотроипбк, ^№О 95/16712; Е11тап, ТА., 8обб рЕаке апб сотЬта!опа1 куп1Нек1к оП Ьепхоб1ахерте сотроипбк оп а кобб кирроб, И8 Ра!
- 23 014525 еп! № 5288514; Бе1бег, Ε. е! а1., Nονе1 сотЬша!опа1 сотроипб БЬгапек, \¥0 95/16209; Ьетег, К. е! а1., Εηсобеб сотЬта!опа1 сНет1са1 НЬгапек. \¥0 93/20242; Ρηνίη. Μ.Κ. е! а1., Α те!1об Гог ргерагшд апб 8е1ес!1пд рБагтасеи!1са1 и§еГи1 поп-рерйбе сотроипбк Ггот а 8!гис!ига11у бКегее ипКег8а1 НЬгагу, XV0 95/04277; 8иттейоп, ΤΕ. апб Ό.Ό. Vе11е^. Μо^рЬо1^по-8иЬиш! сотЬта!опа1 йЬгагу апб те!1об, И8 Ρа!еп! № 5506337; Но1те§, С., '^е^бк Гог !1е 8о11б БНахе 8уп(Не515 оГ ТЫа/оКбтопе^ Μе!а!Ь^аζаπоπе8, апб ЭепмЦКех !БегоР', ν0 96/00148; ΡΙΠ^δ, СВ. апб СВ. Vе^. 8о11б-рБа5е 8уп(Не515 оГ Βепζ^т^баζо1е5. Те!. Ьейегк 37:4887-90, 1996; КиЫапб, Β. е! а1., 8о11б-5иррог1еб сотЬша!опа1 8уп(Не515 оГ 8!гис!ига11у Όίсегее в-Ьас!ат8, 1. Αιικγ. СБет. 8ос. 111:253-4, 1996; Ьоок, С.С. е! а1., Т1е Иепййсайоп оГ Сус1оохудепаке-1 [пЫЬПоге Ггот 4-Т1иахо1|бтопе СотЬта!опа1 ЫЬгапез, Β^γ^. апб Μеб. СБет. Ье!!ег§ 6:707-12, 1996.
2. Белки и пептиды.
Большой диапазон белков и пептидов может быть подобным образом использован в качестве кандидатных молекул для ингибиторов связывания ТСБ-бета-связывающего белка с членом ТСБ-бетасемейства.
a. Комбинаторные библиотеки пептидов.
Молекулы пептидов, которые являются предположительными ингибиторами связывания ТСБ-бетасвязывающего белка с членом ТСБ-бета-семейства, могут быть получены посредством скрининга комбинаторных библиотек пептидов. Такие библиотеки могут быть либо получены специалистом с квалификацией в данной области (см., например, патенты США с номерами 4528266 и 4359535 и публикации договора о патентной кооперации с номерами ν0 92/15679, ν0 92/15677, ν0 90/07862, ν0 90/02809), либо куплены из коммерчески доступных источников (например, №\ν Εпд1апб Βώ^δ Ρ1.Ό.™ ББаде Όίδр1ау Ρер!^бе ЫЬгагу Κι!).
b. Антитела.
Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с полипептидами склеростина, и способы применения таких антител. Данное изобретение обеспечивает также полипептидные иммуногены склеростина, которые могут быть использованы для получения и анализа этих антител. Эти антитела могут быть применимы для блокирования или нарушения связывания полипептида склеростина, который является ТСБ-бета-связывающим белком, с лигандом, в частности костным морфогенетическим белком, и могут также блокировать или нарушать связывание полипептида склеростина с одним или несколькими другими лигандами.
Молекула, такая как антитело, которое ингибирует связывание ТСБ-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами ТСБ-бета-семейства белков, в том числе одним или несколькими костными морфогенетическими белками (ΒΜΡ), является, как должно быть понятно, например, молекулой, которая делает возможной активацию члена ТСБ-бета-семейства или ΒΜΡ или делает возможным связывание членов ТСБ-бета-семейства, в том числе одного или нескольких ΒΜΡ, с их соответствующими рецепторами посредством удаления или предотвращения связывания члена ТСБ-бета-семейства с ТСБбета-связывающим белком.
Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать связывание ТСБ-бета-связывающего белка склеростина с одним или несколькими ΒΜΡ. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать (например, уменьшать статистически значимым образом) образование гомодимеров склеростина. Антитела данного изобретения могут быть применимы для увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости, с ослаблением посредством этого многочисленных состояний, которые приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, заболевания, генетической предрасположенности, несчастных случаев, которые приводят к дефекту кости (например, вследствие перелома), терапевтических веществ, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают образующие кость клетки, и обычного старения.
Полипептиды или пептиды, применимые для иммунизации и/или анализа склеростинспецифических антител, могут быть также выбраны посредством анализа первичной, вторичной и третичной структуры ТСБ-бета-связывающего белка в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области и описанными здесь, для определения аминокислотных последовательностей, которые с большей вероятностью будут генерировать антигенный ответ в животномхозяине (см., например, Nоνоΐпу, Μо1. Iттипо1. 28:201-207 (1991); Βе^ζоГ8ку, 8с1епсе 229:923-40 (1985)). Моделирование и результаты рентгеновской кристаллографии могут быть также использованы для предсказания и/или идентификации, какие части или районы ТСБ-бета-связывающего белка взаимодействуют с какими частями лиганда ТСБ-бета-связывающего белка, такого как ΒΜΡ. Могут быть сконструированы и получены пептидные иммуногены ТСБ-бета-связывающего белка, которые включают аминокислотные последовательности в частях или районах взаимодействия или окружают части или районы взаи
- 24 014525 модействия. Эти антитела могут быть использованы для блокирования или нарушения связывания ТСЕбета-связывающего белка с тем же самым лигандом и могут также блокировать или нарушать связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с одним или несколькими другими лигандами.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, рассматриваемые данным изобретением, включают антитела, которые способны специфически связываться со склеростином и конкурентно ингибировать связывание ТСЕ-бета-полипептида, такого как ВМР, со склеростином. Например, антитела, рассматриваемые данным изобретением, конкурентно ингибируют связывание полипептида склеростина с сайтом связывания рецептора типа Ι ВМР на ВМР или с сайтом связывания рецептора типа ΙΙ ВМР на ВМР или могут конкурентно ингибировать связывание склеростина с сайтами связывания как рецептора типа Ι, так и рецептора типа ΙΙ на ВМР. Не желая связывать себя теорией, авторы изобретения считают, что, когда антитело против склеростина конкурентно ингибирует связывание сайтов связывания типа Ι и/или типа ΙΙ полипептида ВМР со склеростином, блокируя таким образом антагонистическую активность склеростина, сайты связывания рецептора на ВМР являются доступными для связывания рецепторов типа Ι и типа ΙΙ, с увеличением посредством этого минерализации кости. Связывающее взаимодействие ТСЕ-бета-связывающего белка, такого как склеростин и ТСЕ-бета-полипептид, такой как ВМР, обычно имеет место, когда эта пара лигандов образует гомодимер. Таким образом, вместо или в дополнение к использованию антитела, специфического для склеростина, для блокирования, нарушения или предотвращения связывания склеростина с ВМР посредством конкурентного ингибирования связывания склеростина с ВМР, склеростин-специфическое антитело может быть использовано для блокирования или нарушения образования гомодимера склеростина.
В качестве примера, один димер Νοββίπ человека, который является антагонистом ВМР, который способен связываться с ВМР с высокой аффинностью (21ттегтап е1 а1., кирга), выделяли в комплексе с одним димером ВМР-7 человека и анализировали мультивалентной аномальной дифракцией (МАО) (Сгорре е1 а1., №1иге 420:636-42 (2002)). Как обсуждается здесь, это исследование выявило, что димер Νοββίπ может эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (сайты связывания рецепторов типа I и типа II) на димере ВМР. Определение местоположения аминокислот №ддт, которые контактируют с ВМР-7, может быть использовано в моделировании взаимодействия между другими ТСЕ-бетасвязывающими белками, такими как склеростин (8О8Т) и ВМР, и, следовательно, это будет способствовать конструированию пептидов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антител, которые блокируют или нарушают такое взаимодействие.
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т, конкурентно ингибируют связывание полипептида 8О8Т по меньшей мере с одним или обоими из сайтов: сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и сайтом связывания рецептора типа II ВМР, которые расположены на ВМР. Эпитопы на 8О8Т, с которыми связываются эти антитела, могут включать или быть включены в смежные аминокислотные последовательности, которые расположены в Ν-конце полипептида 8О8Т (аминокислоты в положениях приблизительно 1-56 8ЕО ГО NО: 46). Эти полипептиды могут также включать последовательность короткого линкерного пептида, который соединяет этот Νконцевой район с внутренним районом, например, полипептиды, представленные в 8ЕО ГО NО: 92 (человека) и 8ЕО ГО NО: 93 (крысы). Более короткие репрезентативные Ν-концевые пептидные последовательности 8О8Т человека (например, 8ЕО ГО NО: 46) включают 8ЕО ГО NО: 47-51, а репрезентативные пептидные последовательности 8О8Т крысы (например, 8ЕО ГО NО: 65) включают 8ЕО ГО NО: 57-60.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т и блокируют или конкурентно ингибируют связывание полипептида 8О8Т с ВМР, например, блокированием или ингибированием связывания аминокислот ВМР, соответствующих одному или нескольким из сайтов связывания рецепторов типа I и типа II, могут также специфически связываться с пептидами, которые включают аминокислотную последовательность, соответствующую внутреннему (коровому) району 8О8Т (аминокислоты в положениях приблизительно 57-146 8ЕО ГО NО: 46). Полипептиды, которые включают этот внутренний район, могут также включать дополнительные аминокислоты, простирающиеся на любом или на обоих Ν-конце и С-конце, например, для включения остатков цистеина, которые могут быть полезными для конъюгирования этого полипептида с молекулой-носителем. Репрезентативные внутренние полипептиды 8О8Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ГО NО: 94 и 8ЕО ГО NО: 95, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные внутренние пептидные последовательности 8О8Т человека представлены в 8ЕО ГО NО: 66-69, а репрезентативные внутренние последовательности 8О8Т крысы представлены в 8ЕО ГО NО: 70-73.
В другом варианте осуществления антитела, которые специфически связываются с полипептидом 8О8Т, нарушают (ингибируют, предотвращают или блокируют, например, уменьшают статистически значимым образом) образование гомодимера 8О8Т. Поскольку взаимодействие между 8О8Т и ВМР может включать гомодимер 8О8Т и гомодимер ВМР, антитело, которое предотвращает или нарушает образование гомодимера 8О8Т, может посредством этого изменять минеральную плотность кости, предпочтительно увеличивать минеральную плотность кости. В одном варианте осуществления антитела, кото
- 25 014525 рые связываются с внутренним районом 8О8Т, предотвращают образование гомодимера. Такие антитела могут также связываться с пептидами, которые включают последовательности смежных аминокислот, соответствующие внутреннему району, например, 8Е0 Ю ΝΟ: 74, 75 и 98 (8О8Т человека) и 8Е0 Ю ΝΟ: 76 и 99 (8О8Т крысы). Антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на С-концевом районе полипептида 8О8Т (приблизительно в положениях аминокислот 147-190 8ЕО Ш ΝΟ: 46 или 65), могут также нарушать образование гомодимера. Репрезентативные С-концевые полипептиды 8О8Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО Ш ΝΟ: 96 и 8ЕО Ш ΝΟ: 97, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 8О8Т человека представлены в 8ЕО Ш ΝΟ: 78-81, а репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 8О8Т крысы представлены в 8ЕО Ю ΝΟ: 86-88.
Описанные здесь полипептиды и пептиды 8О8Т, с которыми антитела могут специфически связываться, применимы в качестве иммуногенов. Эти иммуногены данного изобретения могут быть использованы для иммунизации животного для генерирования гуморального иммунного ответа, который приводит к продуцированию антител, которые специфически связываются с сайтом связывания рецептора типа I или типа II или с обоими, расположенными на ВМР, и включают пептиды, произведенные из Νконцевого района 8О8Т, или которые могут предотвращать образование гомодимера 8О8Т.
Такие полипептиды и пептиды 8О8Т, которые применимы в качестве иммуногенов, могут быть также использованы в способах скрининга проб, содержащих антитела, например, проб очищенных антител, антисывороток или супернатантов клеточных культур или любой другой биологической пробы, которая может содержать одно или несколько антител, специфических в отношении 8О8Т. Эти пептиды могут быть также использованы в способах идентификации и отбора из биологической пробы одной или нескольких В-клеток, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с 8О8Т (например, анализы образования бляшек и т.п.). Затем эти В-клетки используют в качестве источника, кодирующего 8О8Т-специфическое антитело полинуклеотида, который может быть клонирован и/или модифицирован рекомбинантными способами молекулярной биологии, известными в данной области и описанными здесь.
Биологическая проба обозначает в некоторых вариантах осуществления пробу, содержащую по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении полипептида 8О8Т, и биологическая проба может быть обеспечена получением пробы крови, образца биопсии, эксплантата ткани, культуры органа или любой другой ткани или препарата клеток из субъекта или биологического источника. Пробой может дополнительно называться препарат ткани или клеток, в котором морфологическая целостность или физическое состояние было разрушено, например, иссечением, диссоциацией, солюбилизацией, фракционированием, гомогенизацией, биохимической или химической экстракцией, измельчением в порошок, лиофилизацией, обработкой ультразвуком или любым другим способом для обработки пробы, полученной из субъекта или биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, не являющееся человеком, первичная культура клеток (например, В-клеток, иммунизированных 1и уйго) или адаптированная к культуре клеточная линия, в том числе, но не только, генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или иммортализируемые клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или дифференцируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т. п.
Пептидные иммуногены 8О8Т могут быть также получены синтезом серии пептидов, которые, в целом, представляют полную полипептидную последовательность полипептида 8О8Т и каждый из которых имеет часть аминокислотной последовательности 8О8Т, общую с другим пептидом в этой серии. Эта перекрывающаяся часть может состоять предпочтительно по меньшей мере из четырех аминокислот и более предпочтительно из 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. Каждый пептид может быть использован для иммунизации животного, сыворотки собирают из этого животного и испытывают в анализе для идентификации, какое животное продуцирует антитела, которые нарушают или блокируют связывание 8О8Т с ТСЕ-бета-белком. Затем получают антитела из таких идентифицированных иммунизированных животных в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Антитела, которые ингибируют связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с членом ТСЕ-бетасемейства, могут быть легко получены с использованием обеспеченного здесь описания. Особенно полезными являются антитела против ТСЕ-бета-связывающего белка, которые специфически связывают ТСЕ-бета-связывающий белок 8ЕО Ю ΝΟ: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, но не другие ТСЕ-бетасвязывающие белки, такие как Паи, СегЬегик, 8ССЕ или Сгетйи. В контексте данного изобретения, антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, одноцепочечные, химерные, иммуноглобулины с пересаженными СПК., антиидиотипические антитела и фрагменты этих антител (например, вариабельные области ЕаЬ, Еб, ЕаЬ' и Е(аЬ')2 или определяющие комплементарность районы). Как описано выше, предполагается, что антитела являются специфическими против ТСЕ-бета-связывающего белка или против конкретного члена ТСЕ-бета-семейства, если они связываются с Ка, равной или большей чем 107 М-1, предпочтительно равной или большей чем 108 М-1, и не связываются с другими ТСЕ
- 26 014525 бета-связывающими белками или связываются с Ка, равной или меньшей чем 106 М-1. Аффинность антитела в отношении его родственного антигена выражают обычно в виде константы диссоциации Кс, и анти-808Т-антитело специфически связывается с членом ТОР-бета-семейства, если оно связывается с Кс, равной или меньшей чем 10-5 М, более предпочтительно равной или меньшей чем 10-6 М, еще более предпочтительно равной или меньшей чем 10-7 М и даже еще более предпочтительно равной или меньшей чем 10-8 М. Кроме того, антитела данного изобретения предпочтительно блокируют, нарушают или ингибируют (например, уменьшают со статистической значимостью) связывание ТОР-бетасвязывающего белка с членом ТОР-бета-семейства. Аффинность моноклонального антитела или партнера связывания, а также ингибирование связывания могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. 8са!сйагй, Апп. КУ. Асай. 8с! 51:660-672, 1949). Аффинность может быть также легко определена с использованием резонанса поверхностных плазмонов (8РВ; В1Асоге, Вюкепког, Р1кса!а^ау, N1). Для резонанса поверхностных плазмонов молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают действию лигандов в подвижной фазе, идущей вместе с потоком клеток. Если связывание лиганда с иммобилизованной мишенью имеет место, локальный показатель преломления изменяется, приводя к изменению угла 8РВ, которое может быть подвергнуто мониторингу в реальном времени детектированием изменений в интенсивности отраженного света. Скорости изменения сигнала 8РВ могут анализироваться для получения видимых констант скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих величин дает видимую константу равновесия (аффинность) (см., например, ^о1йй е! а1., Сапсег Век. 53:2560-65 (1993)).
Антитело в соответствии с данным изобретением может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, например 1дО, 1дЕ, 1дМ, 1дИ или 1дА, и может быть любым из различных изотипов, которые могут составлять класс (таким как 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4 класса 1дО человека). Оно может быть получено или произведено из животного, например домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются ими, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна, корову, лошадь, овцу, козу, верблюда, человека или другого примата. Это антитело может быть интернализующимся антителом.
Хорошо известные в данной области способы могут быть использованы для генерирования антител, поликлональных антител или моноклональных антител, которые являются специфическими в отношении ТОР-бета-связывающего белка, такого как 808Т. Антитела могут быть также получены в виде генетически сконструированных иммуноглобулинов (1д) или 1д-фрагментов, сконструированных таким образом, что они имеют желаемые свойства. Например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, антитела могут включать рекомбинантный 1дО, который является химерным слитым белком, имеющим по меньшей мере один домен вариабельной области (V) из первого вида млекопитающего и по меньшей мере один домен константной области из второго, отличающегося вида млекопитающего. Наиболее часто, химерное антитело имеет последовательности вариабельной области мыши и последовательности константной области человека. Такой мышь/человек-химерный иммуноглобулин может быть гуманизирован пересадкой определяющих комплементарность районов (СОВ), происходящих из мышиного антитела, которые придают специфичность связывания в отношении антигена, в районы каркасной области (V) человека и происходящие из человека константные области. Фрагменты этих молекул могут быть генерированы протеолитическим расщеплением или, необязательно, протеолитическим расщеплением с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также генерированы рекомбинантными способами генной инженерии.
Некоторые предпочтительные антитела являются антителами, которые ингибируют или блокируют активность ТОР-бета-связывающего белка в анализе ш νίΐΐΌ, как описано здесь. Связывающие свойства антитела в отношении ТОР-бета-связывающего белка могут быть, как правило, оценены с использованием способов иммунодетектирования, включающих, например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЬ18А), иммунопреципитацию, иммуноблоттинг, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкуренции и т. п., которые могут легко выполняться специалистами с обычной квалификацией в данной области (см., например, патенты США с номерами 4376110 и 4486530; Наг1оте е! а1., АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988)).
Иммуноген может состоять из клеток, экспрессирующих ТОР-бета-связывающий белок, очищенных или частично очищенных ТОР-бета-связывающих полипептидов или их вариантов или фрагментов (т.е. пептидов) или пептидов, полученных из ТОР-бета-связывающего белка. Такие пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением большего полипептида, рекомбинантными молекулярными методологиями или могут быть синтезированы химически. Например, здесь обеспечены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ТОР-бета-связывающие белки, так что лица с квалификацией в данной области могут рутинным образом получить ТОР-бета-связывающие белки для использования в качестве иммуногенов. Пептиды могут быть химически синтезированы способами, описанными здесь и известными в данной области. Альтернативно, пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением ТОР-бета-связывающего белка, и индивидуальные пептиды могут быть выделены способами, известными в данной области, такими как электрофорез в полиакриламидном геле, или любым количест
- 27 014525 вом из способов жидкостной хроматографии или других способов разделения. Пептиды, применимые в качестве иммуногенов, обычно могут иметь аминокислотные последовательности по меньшей мере из 4 или 5 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности ТСЕ-бета-связывающего белка, такой как описанные здесь, и предпочтительно имеют по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 или 20 последовательных аминокислот ТСЕ-бета-связывающего белка. Некоторые другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 6, но не более чем 12, последовательных аминокислот последовательности ТСЕ-бета-связывающего белка, а другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 21, но не более чем 50, последовательных аминокислот полипептида 8О8Т. Другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 или любое целое число аминокислот между 21 и 100, включительно, последовательных аминокислот и между 100 и 190 последовательных аминокислот последовательности ТСЕ-бетасвязывающего белка.
Как описано здесь, поликлональные антитела могут быть легко получены специалистом с обычной квалификацией в данной области из различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, различная домашняя птица, кролики, мыши, овцы, козы, павианы или крысы. Обычно, ТСЕ-бетасвязывающий белок или его уникальный пептид из 13-20 аминокислот или описанный здесь (предпочтительно конъюгированный с гемоцианином фиссуреллы сшиванием с глутаровым альдегидом), используют для иммунизации животного с использованием внутрибрюшинной, внутримышечной, интраокулярной, интрадермальной или подкожной инъекций, вместе с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда, или системой адъювантов К1Ь1 (Сопха СогрогаДоп, 8еай1е, АА). См. также, например, Наг1о\у е1 а1., кирга. Обычно, после первой инъекции животные получают одну или несколько бустер-иммунизаций в соответствии с предпочтительной схемой, которая может варьироваться в соответствии, 1п1ег а11а, с антигеном, адъювантом (если его вводят) и/или конкретным видом животного. Иммунный ответ может быть подвергнут мониторингу периодическим взятием крови животного и получением и анализом сывороток в иммуноанализе, таком как ЕЫ8А или диффузионный анализ Оухтерлони или т. п., для определения титра специфических антител. Особенно предпочтительные поликлональные антитела будут давать детектируемый сигнал в одном из этих анализов, таком как ЕД18А, который предпочтительно является по меньшей мере в три раза большим, чем фон. После того как титр животного достиг плато в отношении его реактивности с белком, могут быть получены большие количества антисывороток либо еженедельными взятиями крови, либо обескровливанием животного.
Поликлональные антитела, которые связываются специфически с ТСЕ-бета-связывающим белком или пептидом, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием белка А. Альтернативно, может выполняться аффинная хроматография, где ТСЕбета-связывающий белок или пептид либо антитело, специфическое в отношении константной области 1д конкретного иммунизированного вида животного, иммубилизовано на подходящем твердом носителе.
Антитела для применения в данном изобретении включают моноклональные антитела, которые получают общепринятыми процедурами иммунизации и слияния клеток, описанными здесь и известными в данной области. Моноклональные антитела могут быть легко получены с использованием общепринятых способов (см., например, КоЫег е1 а1., Ыа1иге 256:495, 1975; СоЬдап е1 а1., (ебк.), Сиггеп! РгоФсок ίη 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 (1оЬп А11еу апб 8опк 1991) [СоДдап]; патенты США с номерами КЕ32011, 4902614, 4543439 и 4411993, которые включены здесь в качестве ссылки; см. также Мопос1опа1 АпйЬоб1ек, НуЬпботак: А №\ν Оппспкюп т Вю1одюа1 Апа1укек, Р1епит Рпекк, Кеппек МсКеагп, апб ВесЫо1 (ебк.), 1980, и АпДЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Наг1ом апб Ьапе (ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогайгу, 1988, которые включены здесь в качестве ссылок; Рюкк1еу е1 а1., РгобисДоп оГ топос1опа1 апДЬоб1ек адатй ргсЛеиъ ехргеккеб т Е. сок, т ОЫА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8у51ет5, 2пб Ебйюп, С1оуег е1 а1. (ебк.), раде 93 (ОхГогб Ишуегкйу Ргекк 1995)). Фрагменты антител могут быть получены из антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, протеолитическим расщеплением (например, при помощи папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также созданы рекомбинантными способами генной инженерии.
Вкратце, в одном варианте осуществления животное, такое как крыса, мышь или хомячок, иммунизируют ТСЕ-бета-связывающим белком или частью района его последовательности, в том числе пептидами в районе, описанном здесь. Этот белок может быть смешан с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или адъювант К1Ь1, для увеличения полученного иммунного ответа. Спустя одну-три недели после начальной иммунизации животное повторно иммунизируют другой бустериммунизацией и испытывают на реактивность в отношении белка с использованием описанных здесь анализов. После того как животное достигает плато в его реактивности в отношении инъецированного белка, его умерщвляют и собирают органы, которые содержат большие количества В-клеток, такие как селезенка и лимфатические узлы. Суспензии клеток собранных селезенок и/или лимфатических узлов сливают с подходящими клетками миеломы, которые сенсибилизированы лекарственным средством, для создания гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело. Подходящие гибридомные линии включают, например, N8-0, 8Р20, N8-1 (АТСС Νθ. Т1В 18) и Р3Х63 - Ад 8.653 (АТСС Νθ. СКВ 1580).
- 28 014525
Лимфоидные клетки (например, селезенки) и миеломные клетки могут быть объединены на несколько минут с агентом, усиливающим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем посеяны при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридомных клеток, но не неслитых миеломных клеток. После слияния эти клетки могут быть помещены в культуральные чашки, содержащие подходящую среду, такую как ΚРМI 1640 или БМЕМ (модифицированная Дульбекко среда Игла) (ЖН Вюкаепсек, Ьепеха, Капкак), а также дополнительные ингредиенты, такие как фетальная телячья сыворотка (ФТС, т.е. из Нус1опе, Ьодап, Шай или ЖН Вюкаепсек). Дополнительно, эта среда должна содержать реагент, который избирательно позволяет расти слитым клеткам селезенки и миеломы, такой как НЛТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) (81дта С'11еппса1 Со., 8!. Ьошк, М1ккоил). Спустя приблизительно семь дней полученные слитые клетки или гибридомы могут быть подвергнуты скринингу для определения присутствия антител, которые являются реактивными с ТСР-бета-связывающим белком (в зависимости от используемого антигена) и которые блокируют, нарушают или ингибируют связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически связываются со склеростином или его вариантом, являются предпочтительными.
Большое разнообразие анализов может быть использовано для определения присутствия антител, которые являются реактивными в отношении белков данного изобретения, включающих, например, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8Л), дот-блот-анализы, вестерн-блоты, иммунопреципитацию, анализы ингибирования или конкуренции и сэндвич-анализы (см., например, патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также ЛпДЬоНек: Л ЬаЬота!оту Мапиа1, Нат1оте апй Ьапе (ейк.), СоИ 8ргшд НатЬот ЬаЬота!огу, 1988)). Эти гибридомы клонируют, например, клонированием с использованием лимитирующих разведений или выделением бляшек с использованием мягкого агара и повторно анализируют. Таким образом может быть выделена гибридома, продуцирующая антитела, реактивные в отношении желаемого белка.
Моноклональные антитела из гибридомных культур могут быть выделены из супернатантов гибридомных культур. Альтернативным способом получения мышиного моноклонального антитела является инъецирование этих гибридомных клеток в брюшную полость сингенной мыши, например, мыши, которая была обработана (например, праймирована пристаном) для усиления образования асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок А-Сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Сойдап на страницах 2.7.1-2.7.12 и на страницах 2.9.1-2.9.3; Вашек е! а1., РштДсайоп оГ [ттшюд1оЬи1ш С ([дС), ш МеЛойк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (Тйе Нитапа Ргекк, Нс. 1992)). Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например, изотипа тяжелой или легкой цепи, специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящего лиганда, иммобилизованного на твердом носителе, включают Белок А, Белок С, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и ТСР-бета-связывающий белок или его фрагмент либо вариант.
Кроме того, антитело против ТСР-бета-связывающего белка данного изобретения может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть генерированы любым числом способов, с которыми знакомы специалисты с обычной квалификацией в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, трансформацию периферических клеток крови (например, содержащих В-лимфоциты) человека вирусом Эпстейна-Барра (ЕВУ), ш νίΙΐΌ иммунизацию В-клеток человека, слияние клеток селезенки из иммунизированных трансгенных мышей, несущих инсертированные гены иммуноглобулина человека, выделение из фаговых библиотек У-области иммуноглобулина человека или другие процедуры, известные в данной области и основанные на раскрытии данной заявки. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены из трансгенных мышей, которые были получены с использованием генной инженерии для продуцирования специфических антител человека в ответ на введение антигена. Способы получения антител человека из трансгенных мышей описаны, например, Сгееп е! а1., Иа!иге Сепе!. 7:13, 1994; ЬопЬетд е! а1., Иа!иге 368:856, 1994; Тау1ог е! а1., Ж!. Iттиη. 6:579, 1994; 8. Ра!еп! № 5877397; Вгиддетапп е! а1., 1997, Сигг. Орш. Вю!есйпо1. 8:455-58; 1акоЬоуйк е! а1., 1995, Лпп. И.У. Лсай. 8а. 764:525-35. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей (см. также Вгиддетапп е! а1., Сигг. Орш. Вю!есйпо1. 8:455-58 (1997)). Например, трансгены иммуноглобулина человека могут быть минигенными конструкциями или транслокусами на искусственных хромосомах дрожжей, которые подвергаются специфической в отношении В-клеток реаранжировке ДНК и гипермутации в лимфоидной ткани мыши. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые затем могут продуцировать антитела человека, специфические в отношении этого антигена. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей могут быть использованы для полу
- 29 014525 чения гибридом, секретирующих антитело человека, в соответствии с описанными здесь способами. Поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека, могут быть также получены из крови этих иммунизированных животных.
Другой способ получения моноклональных антител, специфических в отношении ТСР-бетасвязывающего белка человека, включает иммортализацию периферических клеток крови человека трансформацией ЕВУ. См., например, патент США № 4464456. Такая иммортализованная линия Вклеток (или линия лимфобластоидных клеток), продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически связывается с ТСР-бета-связывающим белком (или его вариантом или фрагментом), может быть идентифицирована обеспеченными здесь способами иммунодетектирования, например, ЕЬ18А, и затем выделена стандартными способами клонирования. Стабильность лимфобластоидной клеточной линии, продуцирующей антитело против ТСР-бета-связывающего белка, может быть улучшена слиянием этой трансформированной клеточной линии с мышиной миеломой с получением гибридной мышьчеловек клеточной линии в соответствии со способами, известными в данной области (см., например, С1акку е! а1., НуЬпбоша 8:377-89 (1989)). Еще одним способом генерирования моноклональных антител человека является иммунизация ίη νίΙΐΌ, которая включает праймирование В-клеток селезенки человека антигеном с последующим слиянием праймированных В-клеток с гетерогибридным партнером слияния. См., например, Воегпег е! а1., I. 1ттипо1. 147:86-95.
В некоторых вариантах осуществления отбирают В-клетку, которая продуцирует антитело против 8О8Т, и вариабельные области легкой и тяжелой цепей клонируют из этой В-клетки в соответствии со способами молекулярной биологии, известными в данной области (\УО 92/02551; патент США 5627052; ВаЬсоок е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 93:7843-48 (1996)) и описанными здесь. Предпочтительно, Вклетки из иммунизированного животного выделяют из селезенки, лимфатического узла или пробы периферической крови с использованием отбора клетки, которая продуцирует антитело, которое специфически связывается с 8О8Т. В-клетки могут быть также выделены из людей, например, из пробы периферической крови. Способы детектирования отдельных В-клеток, которые продуцируют антитело с желаемой специфичностью, хорошо известны в данной области, например, способ образования бляшек, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции, стимуляция ш νίίΐΌ с последующим детектированием специфического антитела и т.п. Способы отбора продуцирующих специфическое антитело В-клеток включают, например, получение суспензии отдельных В-клеток в мягком агаре, который содержит 8О8Т или его пептидный фрагмент. Связывание специфического антитела, продуцируемого В-клеткой в ответ на антиген, приводит к образованию комплекса, который может быть видимым в виде иммунопреципитата. После отбора В-клеток, продуцирующих специфическое антитело, гены этого специфического антитела могут быть клонированы выделением и амплификацией ДНК или мРНК в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Для конкретных применений могут быть желательными фрагменты антител против ТСР-бетасвязывающего белка. Фрагменты антител, Р(аЬ')2, РаЬ, РаЬ', Ρν, Рс, Рб, сохраняют антигенсвязывающий сайт целого антитела и, следовательно, связываются с тем же самым эпитопом. Эти антигенсвязывающие фрагменты, произведенные из антитела, могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом этого антитела, например, расщеплением пепсином или папаином целых антител в соответствии с общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с получением фрагмента 58, названного Р(аЬ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиолы агента с получением моновалентных фрагментов 3,58 РаЬ'. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые присходят из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием папаина дает два моновалентных РаЬ-фрагмента и непосредственно Рс-фрагмент. Эти способы описаны, например, Со1бепЬегд, патент США № 4331647, №копоГГ е! а1., Агсй. Вюсет. Вюрйук. 89:230, 1960; Ройег, Вюсйет. I. 73:119, 1959; Ебе1тап е! а1., т МеЙюбк т Еηζуто1оду 1:422 (Асабетк Ргекк 1967); и Сойдап страницы 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких цепей (Рб), дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть также использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Фрагмент антитела может быть также любым синтетическим или генетически сконструированным белком, который действует подобно антителу, т. е. связывается со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельной области легкой цепи, '^''-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (ксΡν-белки) и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район. Антитело данного изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере один домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может иметь любой размер или аминокислотный состав и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответст
- 30 014525 венную за связывание антигена, которая является смежной или находится в рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В общем, домен вариабельной области (ν) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (Ун) и/или легкой (УД цепей иммуноглобулина. Таким образом, например, домен ν-области может быть мономерным и может быть или νι-доменом, который способен независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен ν-области может быть димерным и содержать димеры ν^ν^ Ун-^ или ν,.-ν^. Предпочтительно, димер ν-области содержит по меньшей мере одну цепь ν4 и по меньшей мере одну цепь ν^ которые нековалентно ассоциированы (далее называемые Ρν). Если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны либо непосредственно, либо, например, через дисульфидную связь между двумя вариабельными доменами, или через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечной цепи Еу (ксЕу).
Домен вариабельной области может быть любым природно встречающися вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием рекомбинантных способов генной инженерии ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельной области специфического антитела посредством инсерций, делеций или изменений в аминокислотных последовательностях этого специфического антитела. Конкретные примеры включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один СОВ и необязательно одну или более аминокислот каркасной области из первого антитела и остальной домен вариабельной области из второго антитела.
Домен вариабельной области может быть ковалентно присоединен при С-концевой аминокислоте по меньшей мере к одному другому домену антитела или его фрагменту. Так, например, ^-домен, который присутствует в домене вариабельной области, может быть связан с СН1-доменом иммуноглобулина или его фрагментом. Подобным образом, νι-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким образом, например, это антитело может быть ЕаЬ-фрагментом, в котором антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные ν^ и νι,-домены, ковалентно связанные при их С-концах с СН1и Ск-доменом, соответственно. СН1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения шарнирной области или части домена шарнирной области, как обнаружено в ЕаЬ'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены СН2 и СН3.
Другой формой фрагмента антитела является пептид, содержащий единственный определяющий комплементарность район (СОВ). СЭВ-пептиды (минимальные узнающие единицы) могут быть получены конструированием полинуклеотидов, которые кодируют СОВ представляющего интерес антитела. Такие полинуклеотиды получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области с использованием мРНК антитело-продуцирующих клеток в качестве матрицы (см., например, Ьагбск е! а1., Ме!1обк: А Сотрашоп !о Мебюбк т Е11хуто1оду 2:106, 1991; СоибепауЬиск, Сепебс Матри1абоп оГ Мопос1опа1 АпбЬоб^ек, т Мопос1опа1 АгП1Ьоб1ек: Ргобисбоп, Епдтеебпд апб С1шюа1 Аррбсабопк, Вй!ег е! а1. (ебк.), раде 166 (СатЬббде итуегкйу Ргекк 1995) и Аагб е! а1., Сепебс Машри1абоп апб Ехргеккюп оГ АпбЬоб^ек, 61 Мопос1опа1 Ап11Ьоб1ек: Рг1пс1р1ек апб Аррбсабопк, Вис11 е! а1., (ебк.), раде 137 (Абеу-Ыкк, 61с. 1995)).
Альтернативно, антитело может быть рекомбинантным или сконструированным антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипуляцию и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, библиотек фаг-антитело (см. СЧнкххеП апб МсСаГГебу, Т1Ыес11. 10:80-84 (1992)), или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования и манипуляции этой ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина или для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно.
Химерные антитела, специфические в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка, которые включают гуманизированные антитела, могут быть также генерированы в соответствии с данным изобретением. Химерное антитело имеет по меньшей мере один домен константной области, полученный из первого вида млекопитающего, и по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из второго, отличающегося вида млекопитающего (см., например, Могбкоп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ст И8А 81:685155 (1984)). В предпочтительных вариантах осуществления химерное антитело может быть сконструировано клонированием полинуклеотидной последовательности, которая кодирует по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из моноклонального антитела не человека, такой как вариабельная область, полученная из моноклонального антитела мыши, крысы или хомячка, в вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну константную область человека (см., например, 8Ып е! а1., Мебюбк Епхуто1. 178:459-76 (1989); Аа11к е! а1., №с1ею Ас1бк Век. 21:2921-29 (1993)). В качестве примера, полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела, может быть встроена в вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность константной области легкой цепи каппа. В отдельном векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариа
- 31 014525 бельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, может быть клонирована в рамке считывания с последовательностями, кодирующими константную область ЦО человека, например, константную область ^О1 человека. Конкретная выбранная константная область человека может зависеть от эффекторных функций, желаемых для конкретного антитела (например, фиксация (связывание) комплемента, связывание с конкретным Ес-рецептором и т.д.). Предпочтительно, сконструированные векторы будут трансфицироваться в эукариотические клетки для стабильной экспрессии этого химерного антитела. Другим способом, известным в данной области, для генерирования химерных антител является гомологичная рекомбинация (например, патент США № 5482856).
Химерное антитело не человек/человек может быть дополнительно генетически сконструировано для создания гуманизированного антитела. Такое гуманизированное антитело может содержать множество СБК, полученных из иммуноглобулина вида млекопитающего, не являющегося человеком, по меньшей мере одну вариабельную каркасную область человека и по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина человека. Применимые стратегии для конструирования гуманизированных антител могут включать, например, для иллюстрации, а не для ограничения, идентификацию вариабельных каркасных областей человека, которые являются наиболее гомологичными относительно каркасных областей не человека химерного антитела. Не желая связывать себя теорией, авторы считают, что такая стратегия может увеличивать вероятность того, что это гуманизированное антитело будет сохранять специфическую связывающую аффинность в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка, которая в некоторых предпочтительных вариантах осуществления может быть, по существу, такой же аффинностью в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка или его варианта или фрагмента, а в некоторых вариантах осуществления может быть более высокой аффинностью в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка. См., например, 1опск е! а1., 1986 №11иге 321:522-25; Шесктам е! а1., 1988 №11иге 332:323-27. Таким образом, конструирование такого гуманизированного антитела может включать определение конформаций петель СБК и структурных детерминант вариабельных областей не человека, например, компьютерным моделированием, и затем сравнение петель и детерминант СБК с известными структурами петель и детерминантами СБК человека. См., например, Раб1аг1 е! а1., 1995 ЕА8ЕВ 9:133-39; Ско!к1а е! а1., 1989 №1!иге, 342:377-383. Компьютерное моделирование может быть также использовано для сравнения структурных шаблонов человека, выбранных по гомологии последовательности, с вариабельными областями не человека. См., например, Ва)ога1к е! а1., 1995. Ткег. ^тшок 2:95-103; ЕР-0578515-А3. Если гуманизация этих СБК не человека приводит к уменьшению аффинности связывания, компьютерное моделирование может способствовать идентификации специфических аминокислотных остатков, которые могли бы быть изменены способами сайт-направленного или иного мутагенеза для частичного, полного или супра-оптимального (т.е. увеличение до уровня, большего, чем уровень негуманизированного антитела) восстановления аффинности. Специалисты с обычной квалификацией в данной области знакомы с этими способами и смогут легко понять многочисленные вариации и модификации в отношении таких стратегий конструирования.
Один подобный способ получения гуманизированного антитела называют облицовкой. В данном контексте термины облицованные ЕК и рекомбинантно облицованные ЕК относятся к селективной замене остатков ЕК, например из У-области тяжелой или легкой цепи грызуна, остатками ЕК человека для обеспечения ксеногенной молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, который сохраняет по существу всю структуру укладки нативного полипептида ЕК. Способы облицовки основаны на понимании того, что характеристики связывания лиганда антигенсвязывающего сайта определяются прежде всего структурой и относительным расположением наборов СБК тяжелой и легкой цепей на антигенсвязывающей поверхности. БаСек е! а1., Апп. Кет. Вюскет. 59:439-73, 1990. Таким образом, антигенсвязывающая специфичность может быть сохранена в гуманизированном антителе только при тщательном поддержании структур СБК, их взаимодействия друг с другом и их взаимодействия с остальными доменами вариабельной (У) области. С использованием способов облицовки ЕК-остатки наружной части (например, доступные для растворителя), с которыми легко сталкивается иммунная система, селективно заменяют остатками человека для обеспечения гибридной молекулы, которая содержит либо слабо иммуногенную, либо по существу неиммуногенную облицованную поверхность.
Способ облицовки использует доступные данные о последовательности для вариабельных областей антитела человека, собранные КаЬа! е! а1., ίη Зсциспсск оГ Рго!етк оГ Iттиηο1οд^са1 Шегек!, 4'1' еб., (И.8. Бер!. оГ Неа11к ааб НитаЬ ЗеМсек, И.8. Оονе^ηтеη! Ргт!тд 0ГПсе, 1987), усовершенствования в отношении базы данных КаЬа! и других И.8. и иностранных баз данных (как нуклеиновых кислот, так и белков). Доступность для растворителя аминокислот У-области может быть расшифрована из известной трехмерной структуры фрагментов антител человека и мыши. Сначала ЕК этих вариабельных доменов представляющей интерес молекулы антитела сравнивают с соответствующими ЕКпоследовательностями вариабельных областей человека, полученных из вышеуказанных источников. Затем наиболее гомологичные У-области человека сравнивают остаток-за-остатком с соответствующими мышиными аминокислотами. Остатки в мышиных ЕК, которые отличаются от копии человека, заменяют остатками, присутствующими в соответствующей области человека, с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. Переключение остатка проводят только с частями, кото
- 32 014525 рые, по меньшей мере, частично являются экспонированными (доступными для растворителя), и соблюдают осторожность в замене аминокислотных остатков, которые могут иметь значимое влияние на третичную структуру доменов У-области, таких как пролин, глицин и заряженные аминокислоты.
Таким образом, полученные облицованные антигенсвязывающие сайты конструируют для сохранения СБК-остатков грызунов, остатков, по существу, примыкающих к СБК, остатков, идентифицированных как скрытые или в основном скрытые (недоступные для растворителя), остатков, которые, как считается, участвуют в нековалентных (например, электростатических или гидрофобных) контактах между доменами тяжелых и легких цепей, и остатков из консервативных структурных областей ЕК, которые, как считается, влияют на канонические третичные структуры петель СБК. Затем эти критерии конструирования используют для получения рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, которые объединяют СЭК как тяжелой, так и легкой цепи антигенсвязывающего сайта в ЕК, похожие на ЕК человека, которые могут быть использованы для трансфекции клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител человека, которые проявляют антигенную специфичность молекулы антитела грызуна.
Дополнительным способом отбора антител, которые специфически связываются с ТСЕ-бетасвязывающим белком или его вариантом или фрагментом, является фаговый дисплей. См., например, ХУйНег е! а1., 1994, Аппи. Кеу. Iттипο1. 12:433-55; ВшГоп е! а1., 1994, Айу. Iттипο1. 57:191-280. Комбинаторные библиотеки генов вариабельной области иммуноглобулина человека и мыши могут быть созданы в векторах-фагах, которые могут быть подвергнуты скринингу для отбора ^-фрагментов (ЕаЬ, Ρν, кЕу или их мультимеров), которые связываются специфически с ТСЕ-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. См., например, патент США № 5223409; ХУПКат Б. Нике е! а1., Сепегайоп оГ а Ьагде СотЬша!юпа1 ЫЬгагу оГ !1е [ттипод1оЬт Керейо1ге т Р1аде ЬатЬйа, 8с1епсе 246:1275-1281, БесетЬег 1989; см. также Ь. 8ак!гу е! а1., С1ошпд оГ Фе Iттипο1οд^са1 Керейоие ш ЕксйепсЫа сой Гог Сепегайоп оГ Мопос1опа1 Са!а1у!ю АпйЬой1ек: Сопк!гис!юп оГ а Неауу Сйаш УапаЬ1е Кедюп-8ресШс с^NΑ ЫЬгагу, Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 86:5728-5732, Аидик! 1989; см., также Мюйе11е А1!шд-Меек е! а1., Мопос1опа1 АпйЬойу Ехргеккюп ЫЬгапек: А Кар1й А1!ета1гее !о НуЬпйотак, 8!га!ед1ек ш Мо1еси1аг Вйоду 3:1-9, 1апиагу 1990; Капд е! а1., 1991, Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 88:4363-66; НоодепЬоот е! а1., 1992, I. Мо1ес. Вю1. 227:381-388; 8сЫеЬикй е! а1., 1997, НуЬпйота 16:47-52 и ссылки в них). Коммерческая система является доступной из 81га1адепе (Ьа 1о11а, Сай&гша), которая позволяет получать антитела с использованием рекомбинантных способов. Вкратце, мРНК выделяют из популяции В-клеток и используют для создания экспрессионных библиотек кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина в векторах IттиηοΖар(Н) и IттипοΖар(^). Затем положительные бляшки могут быть превращены в нелитическую плазмиду, которая делает возможным высокие уровни экспрессии фрагментов моноклональных антител из Е. сой. Альтернативно, библиотека, содержащая множество полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты вариабельной области Ιβ, может быть встроена в геном нитчатого бактериофага, такого как М13 или его вариант, в рамке считывания с последовательностью, кодирующей белок оболочки фага. Слитым белком может быть слияние белка оболочки с доменом вариабельной области легкой цепи и/или с доменом вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕаЬ-фрагменты иммуноглобулина могут быть также представлены на частице фага (см., например, патент США № 5698426). Эти векторы могут быть подвергнуты скринингу индивидуально или коэкспрессированы с образованием ЕаЬ-фрагментов или антител (см. Нике е! а1., кирга; см. также 8ак1гу е! а1., кирга).
Подобным образом, части или фрагменты, такие как ЕаЬ- и Еν-фрагменты, антител могут быть также сконструированы с использованием общепринятого ферментативного расщепления или способов рекомбинантных ДНК для включения вариабельных областей гена, который кодирует специфически связывающее антитело. В одном варианте осуществления эти гены, которые кодируют вариабельную область из гибридомы, продуцирующей представляющее интерес моноклональное антитело, амплифицируют с использованием нуклеотидных праймеров для вариабельной области. Эти праймеры могут быть синтезированы специалистом с обычной квалификацией в данной области или могут быть куплены из коммерчески доступных источников. 8!га!адепе (Ьа 1о11а, СайГогша) продает праймеры для вариабельных областей иммуноглобулина мыши и человека, среди прочих, праймеры для областей УНа, УНЬ, УНс, УНй, СН1, У|. и Сь. Эти праймеры могут быть использованы для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые затем могут быть встроены в векторы, такие как IттиηοΖΑР™ Н или ИптипοΖΑР™ Ь (8!га!адепе) соответственно. Затем эти векторы могут быть введены в Е. сой, дрожжи или системы на основе млекопитающего для экспрессии. С использованием этих способов могут быть получены большие количества одноцепочечного белка, содержащего слияние доменов УН и У|, (см. Вий е! а1., 8с1епсе 242:423-426, 1988). Кроме того, такие способы могут быть использованы для изменения мышиного антитела на антитело человека без изменения связывающей специфичности этого антитела.
В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения комбинаторные фаговые библиотеки могут быть также использованы для гуманизации вариабельных областей не человека. См., например, Кокок е! а1., 1996 I. Вю1. С1ет. 271:22611-18; Кайег е! а1., Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 95:8910
- 33 014525
15. Фаговая библиотека может быть подвергнута скринингу для отбора представляющей интерес вариабельной области 1д с использованием способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь, и таким образом может быть отобрана ДНК-последовательность встроенного в фаг гена иммуноглобулина с использованием стандартных способов. См. 8атЬгоок е! а1., 2001, Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рпид НагЬог Ргекк. Затем выбранная 1д-кодирующая последовательность может быть клонирована в другой подходящий вектор для экспресси этого 1д-фрагмента или, необязательно, может быть клонирована в вектор, содержащий константные области 1д, для экспрессии полных цепей иммуноглобулина.
В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение предусматривает 808Тспецифические антитела, которые являются мультимерными фрагментами антител. Применимые методологии описаны в общем, например, в Наубеи е! а1., 1997, Сигг 0рт. 1ттиио1. 9:201-12; Со1ота е! а1., 1997, №а!. Вю1ес1то1. 15:159-63). Например, мультимерные фрагменты антител могут быть получены фаговыми способами с образованием миниантител (патент США № 5910573) или диантител (НоШдег е! а1., 1997, Саисег 1ттиио1. 1ттиио!Бег. 45:128-130).
В некоторых вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении 808Т, может быть антителом, которое экспрессируется в виде внутриклеточного белка. Такие внутриклеточные антитела называют также интрателами, и они могут содержать ЕаЬ-фрагмент или предпочтительно содержать ксЕу-фрагмент (см., например, БесегГ е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8сг И8А 98:4764-49 (2001)). Каркасные области, фланкирующие СБК-районы, могут быть модифицированы для улучшения уровней экспрессии и растворимости интратела в интрацеллюлярной стесненной среде (см., например, ^оги е! а1., I. Вю1. СБет. 275:2795-803 (2000)). Интратело может быть направлено в конкретные клеточные местоположение или органеллу, например, конструированием вектора, который содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области интратела, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует конкретный антиген-мишень в этой клетке (см., например, Огаик-Ройа е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 15:1182-91 (1995); Ьеиег е! а1., Еиг. I. ВюсБет. 267:1195-205 (2000)). Интратело может быть введено в клетку различными способами, доступными для квалифицированного специалиста, в том числе с использованием вектора генотерапии или липидной смеси (например, Ргоуес!ш™, изготовляемого 1тдеиех СогрогаБои, 8аи Б1едо, СА) или в соответствии с фотохимическими способами интернализации.
Введение аминокислотных мутаций в молекулу иммуноглобулина, специфического в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка, может быть полезным для увеличения специфичности или аффинности ТОЕ-бета-связывающего белка или изменения эффекторной функции. Иммуноглобины с более высокой аффинностью в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка могут быть генерированы сайт-направленным мутагенезом конкретных остатков. Трехмерное молекулярное моделирование при помощи компьютера может быть использовано для идентификации аминокислотных остатков, которые должны быть изменены для улучшения аффинности в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка. См., например, Моии!а1и е! а1., 1992, В1о!есБио1. Оеие!, Еид, Кеу. 10: 1-142. Альтернативно, комбинаторные библиотеки СБК могут быть генерированы в фаге М13 и подвергнуты скринингу на фрагменты иммуноглобулина с улучшенной аффинностью. См., например, О1акег е! а1., 1992, I. 1ттиио1. 149:3902-3913; ВагЬак е! а1., 1994, Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А 91:3809-13; патент США № 5792456.
Эффекторные функции могут быть также изменены сайт-направленным мутагенезом. См., например, Описан е! а1., 1988, №а!иге 332:563-64; Могдаи е! а1., 1995, 1ттиио1оду 86:319-24; ЕдБ!ебагеебеБКоибп е! а1., 1997, В1о!есБщциек 23:830-34. Например, мутация сайта гликозилирования на Ес-части иммуноглобулина может изменять способность этого иммуноглобулина фиксировать комплемент. См., например, \УпдБ1 е! а1., 1997, Тгеибк Вю1ес1то1. 15:26-32. Другие мутации в доменах константной области могут изменять способность иммуноглобулинов фиксировать комплемент или осуществлять антителозависимую клеточную цитотоксичность. См., например, Оиисаи е! а1., 1988, №а!иге 332:563-64; Могдаи е! а1., 1995, 1ттиио1оду 86:319-24; 8еике1 е! а1., 1997, Мо1. 1ттиио1. 34:1019-29.
Согласно некоторым вариантах осуществления вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, не человека, человека или гуманизированные, любой из описанных здесь 1д-молекул могут быть сконструированы в виде одноцепочечных Еу (ксЕу)-фрагментов (одноцепочечных антител). См., например, ВБб е! а1., 1988, 8стеисе 242:423-426; Ник!ои е! а1., 1988, Ргос. №а!1. Асаб. 8сг И8А 85:5879-5883. Мультифункциональные кЕу-слитые белки могут быть генерированы связыванием полинуклеотидной последовательности, кодирующей ксЕу-полипептид, в рамке считывания по меньшей мере с одной полинуклеотидной последовательности, кодирующей любой из различных известных эффекторных белков. Эти способы известны в данной области и описаны, например, в ЕР-В1-0318554, патенте США № 5132405, патенте США № 5091513 и патенте США № 5476786. В качестве примера, эффекторные белки могут включать последовательности константной области иммуноглобулина. См., например, Но11еиЬаидБ е! а1., 1995, I. 1ттиио1. Ме!Бобк 188:1-7. Другими примерами эффекторных белков являются ферменты. В качестве неограничивающего примера, такой фермент может обеспечивать биологическую активность для терапевтических целей (см., например, 81етегк е! а1., 1997, Вюсоищд. СБет. 8:510-19) или могут обеспечивать детектируемую активность, такую как катализируемое пероксидазой хрена превращение любого из
- 34 014525 хорошо известных субстратов в детектируемый продукт, для диагностических целей. Другие примеры слитых ксЕу-белков включают слияния [д-токсина или иммунотоксинов, в которых ксЕу-полипептид слит с токсином.
ксЕу-фрагмент или любой описанный здесь фрагмент может в некоторых вариантах осуществления быть слит с пептидным или полипептидным доменом, который делает возможным детектирование специфического связывания между этим слитым белком и антигеном (например, ТСЕ-бета-связывающим белком). Например, домен слитого полипептида может быть полипептидом аффинной метки для детектирования связывания слитого ксЕу-белка с ТСЕ-бета-связывающим белком любым из различных способов, которые известны специалисту с квалификацией в данной области. Примеры пептидной метки включают авидин, стрептавидин или Н1к (например, полигистидин). Способы детектирования могут также включать, например, связывание слитого с авидином или стрептавидином белка с последовательностью биотина или миметика биотина (см., например, Ьио е1 а1., 1998, 1. Вю1ес11по1. 65:225 и ссылки в этой статье), прямую ковалентную модификацию слитого белка детектируемой частью (например, метящей частью), нековалентное связывание слитого белка со специфически меченой репортерной молекулой, ферментативную модификацию детектируемого субстрата слитым белком, которая включает часть, имеющую ферментативную активность, или иммобилизацию (ковалентную или нековалентную) слитого белка на подложке из твердой фазы. Другие применимые аффинные полипептиды для конструирования слитых ксЕу-белков могут включать слитые со стрептавидином белки, описанные, например, в АО 89/03422, патенты США с номерами 5489528, 5672691, АО 93/24631, патенты США 5168049, 5272254; слитые с авидином белки (см., например, ЕР 511747); фермент, такой как глутатион-8-трансфераза; и полипептид белка А 81ар1гу1о аигеик.
Полинуклеотиды, кодирующие антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с ТСЕ-бета-связывающим белком, описанным здесь, могут быть размножены и экспрессированы в соответствии с любой из различных хорошо известных процедур разрезания, лигирования, трансформации и трансфекции нуклеиновых кислот с использованием любого количества известных экспрессирующих векторов. Так, в некоторых вариантах осуществления экспрессия фрагмента антитела может быть предпочтительной в прокариотическом хозяине, таком как ЕксНепсЫа со11 (см., например, Р1иск11шп е1 а1., 1989, МеЫобк Епхуто1. 176:497-515). В некоторых других вариантах осуществления может быть предпочтительной экспрессия антитела или его фрагмента в эукариотической клетке-хозяине, в том числе в дрожжах (например, 8ассНаготусек сегеу1к1ае, ЗсЫхокассНаготусек ротЬе и РюЫа ракЮпк). клетках животных (в том числе клетках млекопитающих) или клетках растений. Примеры подходящих клеток животных включают, но не ограничиваются ими, миелому (например, мышиную клеточную линию ЖО), клетки СО8, СНО или гибридомные клетки. Примеры клеток растений включают клетки табака, кукурузы, сои и риса.
После получения подходящих антител они могут быть выделены или очищены многими способами, хорошо известными специалистам с обычной квалификацией в данной области (см. АпНЬоб1ек: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Наг1о\\' апб Ьапе (ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЫгу Ргекк, 1988). Подходящие способы включают аффинные колонки с иммобилизованным пептидом или белком (в том числе, использующие антитела против константной области, присоединенные к матриксу колонки), ВЖХ или ОФ-ВЖХ, очистку на колонках с белком А или белком С или комбинацию этих способов.
с. Мутантные ТСЕ-бета-связывающие белки.
Как описано здесь и ниже в примерах (например, примерах 8 и 9), измененные версии ТСЕ-бетасвязывающего белка, которые конкурируют со способностью нативного ТСЕ-бета-связывающего белка блокировать активность конкретного члена ТСЕ-бета-семейства, должны приводить к увеличенной плотности кости. Таким образом, мутанты ТСЕ-бета-связывающего белка, которые связываются с членом ТСЕ-бета-семейства, но не ингибируют функцию этого члена ТСЕ-бета-семейства, удовлетворяют этим критериям. Эти мутантные версии должны эффективно конкурировать с эндогенными ингибиторными функциями ТСЕ-бета-связывающего белка.
б. Получение белков.
Описанные здесь полипептиды включают ТСЕ-бета-связывающий белок склеростин и его варианты и антитела или их фрагменты, которые специфически связываются со склеростином. Полинуклеотиды, которые кодируют эти полипептиды, включают производные генов, которые являются по существу сходными с этими генами, и выделенные молекулы нуклеиновых кислот, и, при необходимости, белки (в том числе пептиды и полипептиды), которые кодируются этими генами и их производными. В данном контексте считается, что нуклеотидная последовательность является по существу сходной, если (а) эта нуклеотидная последовательность получена из кодирующего района вышеуказанных генов и молекул нуклеиновых кислот и включает, например, части этой последовательности или аллельные вариации обсуждаемых выше последовательностей, или альтернативно, кодирует молекулу, которая ингибирует связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с членом ТСЕ-бета-семейства; (Ь) эта нуклеотидная последовательность способна гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями данного изобретения при умеренной, высокой или очень высокой жесткости (см. 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЫгу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаЫгу Ргекк, ΝΥ, 1989); и/или (с) эти ДНК-последовательности
- 35 014525 являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода относительно ДНКпоследовательностей, определенных в (а) или (Ь). Далее, описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты включает как комплементарные, так и некомплементарные последовательности, при условии, что эти последовательности в остальном удовлетворяют приведенным здесь критериям. В контексте данного изобретения, высокая жесткость означает стандартные условия гибридизации (например, 5Х88РЕ, 0,5% ДСН при 65°С или эквивалентные условия).
Структура белков, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот, описанных здесь, может быть предсказана из первичных продуктов трансляции с использованием функции графика гидрофобности, например, Р/С Сепе ог 1п!еШдепебск 8ш!е (1п!еШдепебск, Моип1аш У1ете, СаНГогша) или в соответствии со способами, описанными Ку!е апб ЭооКШе (I. Мо1. Вю1. 157:105-132, 1982).
Белки данного изобретения могут быть получены в форме кислотных или основных солей или в нейтральной форме. Кроме того, индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, могут быть произведены различные замены, делеции или добавления в отношении аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот, общий эффект которых заключается в сохранении или дополнительном увеличении или уменьшении биологической активности мутантного белка или белка дикого типа. Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода, например, может быть значительное варьирование в нуклеотидных последовательностях, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность.
Другие производные описанных здесь белков включают конъюгаты этих белков с другими белками или полипептидами. Это может выполняться, например, синтезом слитых на Ν-конце или на С-конце белков, которые могут быть добавлены для облегчения очистки или идентификации белков (см. патент США № 4851341, см. также Норр е! а1., Вю/ТссНпо1оду 6:1204, 1988). Альтернативно, слитые белки, такие как ЕЬАС®/ТСЕ-бета-связывающий белок, могут быть сконструированы для помощи в идентификации, экспрессии и анализе этого белка.
Белки данного изобретения могут быть сконструированы с использованием большого разнообразия описанных здесь способов. Далее, могут быть введены мутации в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, которые позволяет лигировать ее с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемую инсерцию, замену или желаемую делецию аминокислоты.
Альтернативно, могут быть использованы олигонуклеотид-направленные сайт-специфические (или сегмент-специфические) мутагенезы для обеспечения измененных гена или молекулы нуклеиновой кислоты, имеющих конкретные кодоны, измененные в соответствии с требуемыми заменой, делецией или инсерцией. Примерные способы получения таких изменений, изложенных выше, описаны ^Уа1бсг е! а1. (Сепе 42:133, 1986); Ваиег е! а1. (Сепе 37:73, 1985); Сга1к (ВюТесйтциек, 1апиагу 1985, 12-19); 8тйй е! а1. (Сепсис Еидтеебид: Рбпс1р1ек апб Ме!йобк, Р1епит Ргекк, 1981) и 8атЬгоок е! а1. (кирга). Делеционные или укороченные производные белков (например, растворимая внеклеточная часть) могут быть также сконструированы с использованием сайтов подходящих рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), рядом с желаемой делецией. После рестрикции выступы могут быть заполнены, и эта ДНК может быть повторно лигирована. Примерные способы получения изменений, изложенных выше, описаны 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8рйпд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, ΝΥ, 1989).
Мутации, которые производят в молекулах нуклеиновых кислот данного изобретения, предпочтительно сохраняют рамку считывания кодирующих последовательностей. Кроме того, эти мутации предпочтительно не будут создавать комплементарных районов, которые при транскрипции могли бы гибридизоваться с образованием вторичных мРНК-структур, таких как петли или шпильки, которые могут неблагоприятно влиять на трансляцию этой мРНК. Хотя сайт мутации может быть заданным, необходимо, предварительно определить мутацию рег ке. Например, для выбора оптимальных характеристик мутантов в конкретном сайте может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени, и экспрессированные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на увеличение или потерю или сохранение биологической активности. Альтернативно, мутации могут вводиться в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими проводить лигирование с фрагментами этой нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемые аминокислотные инсерцию, замену или делецию.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки данного изобретения, могут быть также сконструированы такими способами, как ПЦР-мутагенез, химический мутагенез (Эппктеа1сг апб К1тебтк!, РNΑ8 83:3402-3406, 1986), принудительными ошибочными включениями нуклеотидов (например, Ыао апб ТС1ке Сепе 88:107-111, 1990) или использованием случайным образом мутагенизированных олигонуклеотидов (Ногтей/ е! а1., Сепоте 3:112-117, 1989).
Данное изобретение обеспечивает также манипуляцию и экспрессию вышеописанных генов и молекул нуклеиновых кислот культивированием клеток-хозяев, содержащих вектор, способный экспрессировать вышеописанные гены. Такие векторы или векторные конструкции включают либо синтетические,
- 36 014525 либо полученные из кДНК молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие желаемый белок, которые функционально связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции или трансляции. Подходящие регуляторные элементы могут быть произведены из различных источников, в том числе бактериальных, грибных, вирусных генов, генов млекопитающих, насекомых или растений. Выбор подходящих регуляторных элементов зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко выполнен лицом с обычной квалификацией в данной области. Примеры регуляторных элементов включают промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, терминатор транскрипции и последовательность связывания рибосом, в том числе сигнал инициации трансляции.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из вышеописанных белков, могут быть легко экспрессированы в большом разнообразии прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, в том числе бактериальных клетках, клетках млекопитающих, дрожжевых или других грибных клетках, вирусных клетках, клетках насекомых или клетках растений. Способы трансформации или трансфекции таких клеток для экспрессии чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Пакша е! а1., И8 Ра!еи! № 4704362; Ншиеи е! а1., Ргос. №Н. Асаб. 8ск И8А 75:1929-1933, 1978; Миггау е! а1., И8 Ра!еи! № 4801542; Иркйай е! а1., И8 Ра!еи! № 4935349; Надеи е! а1., И8 Ра!еи! № 4784950; Ахе1 е! а1., И8 Ра!еи! № 4399216; Соеббе1 е! а1., И8 Ра!еи! № 4766075; и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1, 2иб еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1989; в отношении клеток растений см. Схако аиб Майои, Р1аи! Рйукю1. 104:1067-1071, 1994; и Ракхко\гкк| е! а1., В1о!есй. 24:387-392, 1992).
Бактериальные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения, включают Е. сой, ВасШик киЬййк, 8а1тоие11а 1ур1итипит и различные виды в родах Ркеиботоиак, 8йер!отусек и 8!арйу1ососсик, а также многие другие виды бактерий, хорошо известные специалисту с обычной квалификацией в данной области и описанные здесь. Репрезентативный пример бактериальной клетки-хозяина включает Е. сой ЭН5а (8!га!адеие, Ьа 1о11а, СайГогша).
Бактериальные экспрессирующие векторы предпочтительно содержат промотор, который функционирует в клетке-хозяине, один или несколько селектируемых фенотипических маркеров и бактериальный сайт инициации репликации. Репрезентативные промоторы включают систему промотора βлактамазы (пенициллиназы) и лактозы (см. С На ид е! а1., №1иге 275:615, 1978), промотор РНКполимеразы Т7 (8!иб1ег е! а1., Ме!Н. ЕихушоН 185:60-89, 1990), промотор лямбда (Е1уш е! а1., Сеие 87:123126, 1990), промотор йр (№сйо1к аиб УаиоГкку, Ме!й. ш Еихуто1оду 101:155, 1983) и промотор !ас (Кикке1 е! а1., Сеие 20:231, 1982). Репрезентативные селектируемые маркеры включают различные маркеры устойчивости к антибиотикам, такие как гены устойчивости к канамицину или ампициллину. Многие плазмиды, подходящие для трансформации клеток-хозяев, хорошо известны в данной области, в том числе, среди других, рВК322 (см. Войуаг е! а1., Сеие 2:95, 1977), плазмиды рИС18, рИС19, рИС118, рИС119 (см. Меккшд, Ме!й. ш Еихуто1оду 101:20-77, 1983 и Угёйа аиб Мекктд, Сеие 19:259-268, 1982) и рИН8А, рИН16а, рИН18А и рВ1иексйр! М13 (8йа1адеие, Ьа 1о11а, СайГогша).
Дрожжевые и грибные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения, включают, среди прочих, 8ассНаготусек ротЬе, 8ассНаготусек сегеуШае, роды РюЫа или К1цууеготусек и различные виды рода АкрегдШик (МсКшдй! е! а1., патент США № 4935349). Подходящие экспрессирующие векторы для дрожжей и грибов включают, среди прочих, УСр50 (АТСС №. 37419) для дрожжей и атб8клонирующий вектор рУ8 (ТигиЬи11, Вю/ТесНгю1оду 7:169, 1989), УКр7 (81гиН1 е! а1., Ргос. №Н. Асаб. 8сН И8А 76:1035-1039, 1978), УЕр13 (Вгоасй е! а1., Сеие 8:121-133, 1979), рГОВ249 и рГОВ219 (Веддк, ХаИие 275:104-108, 1978) и их производные.
Предпочтительные промоторы для применения в дрожжах включают промоторы из гликолитических генов дрожжей (Нйхетаи е! а1., 1. Вю1. Сйеи. 255:12073-12080, 1980; А1Ьег аиб 1<а\\'акакН 1. Мо1. Арр1. Сеие!. 1:419-434, 1982) или гены алкогольдегидрогеназы (Уоиид е! а1., ш Сеиейс Еидтеепид оГ М1сгоогдашктк Гог Сйетюа1к, Нойаеибег е! ай, (ебк.), р. 355, Р1еиит, №\ν Уогк, 1982; Аттегег, Ме!Н. Еихуто1. 101:192-201, 1983). Примеры применимых промоторов для грибных векторов включают промоторы, произведенные из гликолитических генов АкрегдШик тби^к, например, промотор абН3 (Мс Кшдй! е! а1., ЕМВО 1. 4:2093-2099, 1985). Экспрессионная единица может также включать терминатор транскрипции. Примером подходящего терминатора является терминатор абН3 (Мс Кшдй! е! а1., кирга, 1985).
Как и в случае бактериальных векторов, дрожжевые векторы будут обычно включать селектируемый маркер, которым может быть один из любого числа генов, которые проявляют доминантный фенотип, для которого существует фенотипический анализ, позволяющий выбрать трансформанты.
Предпочтительными селектируемыми маркерами являются маркеры, которые дополняют ауксотрофию клетки-хозаяина, обеспечивают устойчивость к антибиотику или позволяют клетке использовать конкретные источники углерода, и включают №2 (Вгоасй е! а1., 1Ь1б.), ига3 (Во!к!ет е! а1., Сеие 8:17, 1979) или Н1к3 (8!шН1 е! а1., 1Ь1б.). Другим подходящим селектируемым маркером является ген са!, который придает устойчивость к хлорамфениколу дрожжевым клеткам.
Способы трансформации грибов хорошо известны в литературе и были описаны, например, Веддк (1Ь1б.), НИтеи е! а1. (Ргос. №И. Асаб. 8сН И8А 75:1929-1933, 1978), Уе1!ои е! а1. (Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 81:1740-1747, 1984) и Кикке1 (№!иге 301:167-169, 1983). Генотип клетки-хозяина может содержать гене
- 37 014525 тический дефект, который комплементируется селектируемым маркером, присутствующим на экспрессирующем векторе. Выбор конкретного хозяина и селектируемого маркера находятся в пределах уровня обычной квалификации в данной области.
Протоколы для трансформации дрожжей также хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Например, трансформация может легко выполняться либо получением сферопластов дрожжей с ДНК (см. Ншпеп е! а1., РNА8 И8А 75:1929, 1978), либо обработкой щелочными солями, такими как Ь1С1 (см. 1!оН е! а1., 1. Вас!епо1оду 153:163, 1983). Трансформация грибов может также проводиться с использованием полиэтиленгликоля, как описано Си11еп е! а1. (Вю/ТесЬпо1оду 5:369, 1987).
Вирусные векторы включают векторы, которые содержат промотор, который управляет экспрессией выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует желаемый белок, как описано выше. Большое разнообразие промоторов может быть использовано в контексте данного изобретения, в том числе, например, такие промоторы, как МоМЬУ ЬТЯ, Я8У ЬТЯ, Епепй МцЬУ ЬТЯ, аденовирусный промотор (0Нпо е! а1., 8с1епсе 265:781-784, 1994), промотор/энхансер неомицинфосфотрансферазы, поздний промотор парвовируса (Коейпд е! а1., Нит. Сепе ТНегар. 5:457-463, 1994), ТК-промотор герпесвируса, промотор 8У40, энхансер/промотор гена металлотионеина На, немедленно ранний промотор цитомегаловируса и немедленно поздний промотор цитомегаловируса. В особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, промотором является тканеспецифический промотор (см., например, XV 0 91/02805; ЕР 415731 и XV0 90/07936). Репрезентативные примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают специфический для нервных клеток промотор енолазы, промотор тромбоцитарного фактора роста бета, промотор костного морфогенетического белка, промотор альфа1химерина человека, промотор синапсина Ι и промотор синапсина ΙΙ. Кроме вышеуказанных промоторов, другие, вирус-специфическиие промоторы (например, ретровирусные промоторы, в том числе указанный выше, а также другие, например, ВИЧ-промоторы), промоторы гепатита, герпеса (например, ЕВУ) и специфические в отношении бактерий, грибов или паразитов (например, малярийные) промоторы, могут быть использованы для нацеливания на специфическую клетку или ткань при инфицировании вирусом, бактерией, грибом или паразитом.
Клетки млекопитающих, подходящие для проведения данного изобретения, включают, среди прочих, клетки С08, СНО, 8а08, остеосаркомы, К8483, МС-63, первичные остеобласты и клетки стромы костного мозга человека или млекопитающего. Экспрессирующие векторы млекопитающих для применения в проведении данного изобретения будут включать промотор, способный управлять транскрипцией клонированного гена, молекулы нуклеиновой кислоты или кДНК. Предпочтительные промоторы включают вирусные промоторы и клеточные промоторы. Специфические для кости промоторы включают промотор сиалопротеина кости и промотор для остеокальцина. Вирусные промоторы включают немедленно ранний промотор цитомегаловируса (ВозНаг! е! а1., Се11 41:521-530, 1985), немедленно поздний промотор цитомегаловируса, промотор 8У40 (8иЬгаташ е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 1:854-864, 1981), ММТУ ЬТЯ, Я8У ЬТЯ, промотор металлотионеина-1, Е1а адновируса. Клеточные промоторы включают промотор мышиного металлотионеина-1 (Ра1тйег е! а1., патент США № 4579821), промотор УК мыши (Вегдтап е! а1., Ргос. №·ι!1. Асай. 8ст И8А 81:7041-7045, 1982; Сгап! е! а1., ШсЫс Ас1йз Яез. 15:5496, 1987) и промотор Ун мыши (ЬоН е! а1., Се11 33:85-93, 1983). Выбор промотора будет зависеть, по меньшей мере частично, от желаемого уровня экспрессии или от трансфицируемой клеточной линии.
Такие экспрессирующие векторы могут содержать также ряд сайтов сплайсинга РНК, расположенных справа от промотора и слева от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес пептид или белок. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из генов аденовируса и/или иммуноглобулина. В этих экспрессирующих векторах содержится также сигнал полиаденилирования, расположенный справа от представляющей интерес кодирующей последовательности. Подходящие сигналы полиаденилирования включают ранние или поздние сигналы полиаденилирования из 8У40 (КаиГтап апй 8Ьагр, 1Ь1й.), сигнал полиаденилирования из района Е1В аденовируса 5 и терминатор гена гормона роста человека (Ье№!о е! а1., №1с1ею Ас1йз Яез. 9:3719-3730, 1981). Экспрессирующие векторы могут включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как состоящий из трех частей лидер аденовируса 2, расположенный между промотором и сайтами сплайсинга РНК. Предпочтительные векторы могут также включать энхансерные последовательности, такие как энхансер 8У40. Экспрессирующие векторы могут также включать последовательности, кодирующие РНК аденовируса УА. Подходящие экспрессирующие векторы могут быть получены из коммерческих источников (например, 81га1адепе, Ьа 1о11а, СаЪГогша).
Векторные конструкции, содержащие клонированные ДНК-последовательности, могут быть введены в культивируемые клетки млекопитающего, например, опосредованной фосфатом кальция трансфекцией ^1д1ег е! а1., Се11 14:725, 1978; Согзаго апй Реагзоп, 8отайс Се11 Сепейсз 7:603, 1981; СгаНат апй Уап йег ЕЬ, У1го1оду 52:456, 1973), электропорацией (№итапп е! а1., ЕМВ0 1. 1:841-845, 1982) или опосредованной ДЭАЭ-декстраном трансфекцией (АизиЬе1 е! а1., (ейз.), Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНп Уйеу апй 8опз, 1пс., NΥ, 1987). Для идентификации клеток, которые были стабильно трансфицированы вектором или в которые была интегрирована клонированная ДНК, селектируемый
- 38 014525 маркер обычно вводят в эти клетки вместе с представляющими интерес геном или кДНК. Предпочтительные селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих, включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемым маркером может быть амплифицируемый селектируемый маркер. Предпочтительными амплифицируемыми селектируемыми маркерами являются ген ОНРВ и ген устойчивости к неомицину. Селектируемые маркеры обсуждаются в обзоре ТЫ11у (Маттайап Се11 Тесйпо1оду, Вийегоойй РиЬйкйегк, 8!опейат, Маккасйикейк, который включен здесь в качестве ссылки).
Клеткам млекопитающих, содержащим подходящий вектор, дают расти в течение некоторого периода времени, обычно 1-2 дней, до начала экспрессии представляющей интерес ДНКпоследовательности. Затем отбор с использованием лекарственного средства используют для отбора на рост клеток, которые стабильно экспрессируют селектируемый маркер. Для клеток, которые были трансфицированы амплифицируемым, селектируемым маркером, концентрация лекарственного средства может быть увеличена ступенчатым образом для отбора на увеличенную копийность клонированных последовательностей, с увеличением посредством этого уровней экспрессии. Клетки, экспрессирующие введенные последовательности, отбирают и подвергают скринингу на продуцирование представляющего интерес белка в желаемой форме или при желаемом уровне. Затем, клетки, которые удовлетворяют этим критериям, клонируют и используют для увеличения масштаба для продуцирования.
Протоколы для трансфекции клеток млекопитающих хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Репрезентативные способы включают опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, электропорацию, липофекцию, опосредованную ретровирусом, аденовирусом и слиянием протопластов трансфекцию (см. 8атЬгоок е! а1., кирга). Голые векторные конструкции могут также поглощаться мышечными клетками или другими подходящими клетками после инъекции в мышцу млекопитающего (или других животных).
Способы использования клеток-хозяев насекомых и клеток-хозяев растений для получения полипептидов известны в данной области и описаны здесь. Многочисленные клетки-хозяева насекомых могут быть также применимы в данном изобретении. Например, применение бакуловирусов в качестве векторов для экспрессии гетерологичных ДНК-последовательностей в клетках насекомых обсуждались в обзоре ЛАткоп е! а1. (Рекйс. 8с1. 28:215-224, 1990). Многочисленные векторы и клетки-хозяева растений, известные в данной области, могут быть также использованы в данном изобретении, например, использование АдгоЬас!ейит гЫходепек в качестве векторов для экспрессии генов и молекул нуклеиновых кислот в клетках растений (см. обзор 81пкаг е! а1., I. Вюкск (Вапда1оге 11:47-58, 1987)).
В родственных аспектах данного изобретения белки данного изобретения могут экспрессироваться в трансгенном животном, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат ген, который кодирует желаемый белок и который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии этого гена. Альтернативно, подобным образом могут быть получены трансгенные животные, которые лишены желаемого гена (например, мыши с нокаутом гена). Такие трансгенные животные могут быть получены в различных животных, не являющихся людьми, в том числе мышах, крысах, кроликах, овцах, собаках, козах и свиньях (см. Наттег е! а1., №1иге 315:680-683, 1985, Ра1тйег е! а1., 8с1епсе 222:809-814, 1983, Вппк!ег е! а1., Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 82:4438-4442, 1985, Ра1тйег апй Вппк!ег, Се11 41:343-345, 1985, и патенты США с номерами 5175383, 5087571, 4736866, 5387742, 5347075, 5221778 и 5175384). Вкратце, экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты, подлежащую экспрессии, вместе с подходящим образом расположенными регуляторными последовательностями экспрессии, вводят в пронуклеусы оплодотворенных яиц, например, микроинъекцией. Интеграцию инъецированной ДНК детектируют блот-анализом ДНК из проб ткани. Предпочтительно, чтобы введенная ДНК была включена в зародышевую линию животного таким образом, что она передается потомству этого животного. Тканспецифическая экспрессия может достигаться посредством использования тканеспецифического промотора или посредством использования индуцируемого промотора, такого как промотор гена металлотионеина (Ра1тйег е! а1., 1983, кирга), который делает возможной регулируемую экспрессию этого трансгена.
Белки могут быть выделены, среди других способов, культивированием подходящих систем хозяина и вектора для продуцирования рекомбинантных продуктов трансляции, как описано здесь. Супернатанты из таких клеточных линий или белковые включения или целые клетки, из которых этот белок не секретируется в супернатант, могут быть затем обработаны различными процедурами очистки для выделения желаемого белка. Например, супернатант может быть сначала сконцентрирован с использованием коммерчески доступных фильтров для концентрирования белков, таких как ультрафильтрационное устройство Атюоп или Мййроге РеШсоп. После концентрирования конъюгат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как, например, антитело против этого белка (например, антитело, которое специфически связывается с полипептидом, который должен быть выделен), связанное с подходящим носителем. Альтернативно, для очистки этого белка могут быть использованы анионо- или катионообменные смолы. В качестве следующей альтернативы, одна или несколько стадий обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЖХ) могут быть использованы для дополнительной очистки этого белка. Другие способы выделения белков данного изобретения хорошо из
- 39 014525 вестны в данной области.
Чистота выделенного полипептида может быть определена способами, известными в данной области и описанными здесь, такими как гель-электрофорез и хроматографические способы. Предпочтительно, такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. В некоторых специфических вариантах осуществления белок считается выделенным в контексте данного изобретения, если никакой другой нежелаемый белок не детектируется согласно анализу электрофорезом в ДСН-ПААГ, с последующим окрашиванием Кумасси синим. В других вариантах осуществления желаемый белок может быть выделен таким образом, что нежелаемый другой белок не детектируется согласно анализу электрофорезом в ДСН-ПААГ после окрашивания серебром.
3. Молекулы нуклеиновых кислот.
В других аспектах данного изобретения обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, которые способны ингибировать связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства. Например, в одном варианте осуществления обеспечены антисмысловые олигонуклеотидные молекулы, которые специфически ингибируют экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот ТСР-бетасвязывающего белка (см., в общем, НйакЫта е! а1., ш Мо1еси1аг Вю1оду оП ЯИА: №\ν РегкресЕтек (М. Шоиуе апб В.8. Эибоск, ебк., 1987, Асабетк Ргекк, 8ап Окдо, р. 401); ОЕдопис1еоббек: Апбкепке [пШЫ!огк оП Сепе Ехргеккюп (1.8. СоЕеп, еб., 1989, МасМШап Ргекк, Ьопбоп); 8!ет апб СЕепд, 8с1епсе 261:10041012, 1993; АО 95/10607; патент США № 5359051; АО 92/06693 и ЕР-А2-612844). Вкратце, такие молекулы конструируют таким образом, что они являются комплементарными району транскрибируемой мРНК-последовательности ТСР-бета-связывающего белка или способны образовывать пары оснований Уотсона-Крика с этим районом. Полученная двухцепочечная нуклеиновая кислота подавляет последующий процессинг мРНК, предотвращая тем самым синтез белка (см. пример 10).
В других аспектах данного изобретения обеспечены рибозимы, которые способны ингибировать связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства. В данном контексте рибозимы включают РНК-молекулы, которые содержат антисмысловые последовательности для специфического узнавания и расщепляющую РНК ферментативную активность. Каталитическая цепь расщепляет специфический сайт в РНК-мишени при более высокой концентрации, чем стехиометрическая концентрация. Большое разнообразие рибозимов может быть использовано в контексте данного изобретения, в том числе, например, молотоголовый рибозим (например, описанный Рогк!ег апб 8утопк, Се11 48:211220, 1987; Наке1оПП апб Сег1асЕ, Иа!иге 328:596-600, 1988; Аа1Ьо! апб Вгиешпд, Иа!иге 334:196, 1987; Наке1оПП апб Сег1асЕ, Иа!иге 334:585, 1988); шпилечный рибозим (например, описанный Наке1оПП е! а1., патент США № 5254678, выданный 19 октября 1993 г., и Нетре1 е! а1., Европейский патент № 360257, опубликованный 26 марта 1990 г.) и рибозимы на основе рибосомной РНК Те!гаЕутепа (см. СесЕ е! а1., патент США № 4987071). Рибозимы данного изобретения обычно состоят из РНК, но могут также состоять из ДНК, аналогов нуклеиновых кислот (например, фосфоротиоатов) или их химер (например, ДНК/РНК/РНК).
4. Метки.
Продукт гена или любые описанные выше и ниже кандидатные молекулы могут быть помечены различными соединениями, в том числе, например, флуоресцентными молекулами, токсинами и радионуклидами. Репрезентативные примеры флуоресцентных молекул включают флуоресцеин, белки РЕусоЬ111, такие как фикоэритрин, родамин, Техасский красный и люцифераза. Репрезентативные примеры токсинов включают рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, антивирусный белок фитолакки американской, тритии, токсин 8Е1де11а и экзотоксин А. Ркеиботопак. Рерпезентативные примеры радионуклидов включают Си-64, Са-67, Са-68, Ζγ-89, Яи-97, Тс-99т, ЯЕ-105, Рб-109, Тп-111, ^123, ^125, Σ-131, Яе-186, Яе-188, Аи-198, Аи-199, РЬ-203, А!-211, РЬ-212 и В1-212. Кроме того, описанные выше антитела могут быть также помечены или конъюгированы с одним партнером пары связывания лиганда. Репрезентативные примеры включают авидин-биотин, стрептавидин-биотин и рибофлавинрибофлавинсвязывающий белок.
Способы конъюгирования или мечения описанных здесь молекул репрезентативными метками, указанными выше, могут быть легко выполнены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. ТпсЕоШесепе АпйЬобу Соп)ида!е, патент США № 4744081; АпйЬобу Соп)ида!е, патент США № 5106951; Р1иогодешс Ма!епа1к апб ЬаЬеЕпд ТесЕтциек, патент США № 4018884; Ме!а1 ЯабюписЕбе ЬаЬе1еб Рго!етк Пог П1адшкк апб ТЕегару, патент США № 4897255; и Ме!а1 ЯабюписЕбе СЕе1абпд Сотроипбк Пог [трготеб СЕе1а!юп Ктебск, патент США № 4988496; см., также Iηтаη, Ме!Еобк И'1 Епхуто1оду, Уо1. 34, АйтИу ТесЕтциек, Епхуте Рипйсабоп: Рай В., 1акоЬу апб АбсЕек (ебк.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, р. 30, 1974; см. также АйсЕек апб Вауег, ТЕе Аν^б^η-В^обη Сотр1ех ш Вкапа1убса1 Аррбсабопк, Апа1. ВксЕет. 171:1-32, 1988).
- 40 014525
Фармацевтические композиции
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает также различные фармацевтические композиции, содержащие одну из вышеуказанных молекул, которая ингибирует связывание ТСР-бетасвязывающего белка с членом ТСР-бета-семейства, вместе с фармацевтически или физиологически приемлемыми носителем, эксципиентами или разбавителями. Обычно такие носители должны быть нетоксичными в отношении реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Обычно получение таких композиций влечет за собой объединение терапевтического агента с буферами, антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными (менее чем 10 остатков) полипептидами, белками, аминокислотами, углеводами, в том числе, глюкозой, мальтозой, сахарозой или декстринами, хелатообразующими агентами, такими как ЭДТА, глутатионом и другими стабилизаторами и эксципиентами. Примером подходящих растворителей являются нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть приготовлены для введения различными способами введения. Обычно тип носителя выбирают на основе способа введения. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для любого подходящего способа введения, в том числе, например, местного, перорального, назального, внутриоболочечного, ректального, вагинального, сублингвального или парентерального введения, в том числе, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной, внутриполостной, внутриканальной или интрауретральной инъекцией или инфузией. Фармацевтическая композиция (например, пероральное введение или доставка инъекцией) может быть в форме жидкости (например, элексира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии). Жидкая фармацевтическая композиция может включать, например, один или более из следующих компонентов: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты; антиоксиданты, хелатообразующие агенты; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительным является применение физиологического солевого раствора и инъецируемая фармацевтическая композиция является предпочтительно стерильной.
Описанные здесь композиции могут быть приготовлены для пролонгированного высвобождения (т.е. композиция, такая как капсула или тампон, которые выполняют медленное высвобождение соединения после введения). Такие композиции могут быть обычно приготовлены с использованием хорошо известной технологии и введены, например, перорально, ректально или имплантацией под кожу или имплантацией в желаемом месте-мишени. Формы пролонгированного высвобождения могут содержать агент, диспергированный в матриксе-носителе и/или содержащийся в резервуаре, окруженном регулирующей скорость высвобождения мембраной. Носители для применения с такими композициями являются биосовместимыми и могут быть также биодеградируемыми; предпочтительно эта композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Количество активного соединения, содержащегося в композиции пролонгированного высвобождения, зависит от места трансплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и характера состояния, подлежащего лечению или предотвращению. Иллюстративные носители, применимые в этой связи, включают микрочастицы поли(сополимера лактида и гликолида), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и т. п. Другие иллюстративные носители задержанного высвобождения включают супрамолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкую гидрофильную внутреннюю часть (например, сшитый полисахарид или олигосахарид) и, необязательно, наружный слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и заявки РСТ \О 94/20078, \\'О 94/23701 и \\'О 96/06638).
В другом иллюстративном варианте осуществления используют биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолат) в качестве носителей для композиций этого изобретения. Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США с номерами 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344; 5407609 и 5942252. Системы носителя из модифицированного корового белка вируса гепатита В, такие как описанные в заявке \О 99/40934 и процитированных в ней ссылках, также будут применимы для многих приложений. Другая иллюстративная система носителя/доставки использует носитель, содержащий состоящие из частиц белковые комплексы, такие как описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать в хозяине ответы в виде цитотоксических Т-лимфоцитов, рестриктированных по классу I.
В другом иллюстративном варианте осуществления используют коровые (внутренние) частицы фосфата кальция в качестве носителей или в качестве матриксов регулируемого высвобождения для композиций данного изобретения. Примеры частиц из фосфата кальция описаны, например, в опубликованной заявке на патент \О 00/46147.
Для фармацевтических композиций, содержащих полинуклеотид, кодирующий антитело против
- 41 014525
808Т и/или модулирующий агент (такой как полипептид, и/или модулирующий агент, генерируемые ш 81!и), этот полинуклеотид может присутствовать в любой из различных систем доставки, известных специалистам с обычной квалификацией в данной области, в том числе в нуклеиновой кислоте и бактериальных, вирусных системах экспрессии и системе экспрессии млекопитающего. Способы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эта ДНК может быть голой, как описано, например, в И1тег е! а1., 8с1епсе 259:1745-1749, 1993, и обсуждается в обзоре СоБеп, 8с\'1епсе 259:1691-1692, 1993. Поглощение голой ДНК может быть увеличено нанесением в виде покрытия этой ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в эти клетки.
Развитие подходящих схем введения доз и лечения для использования конкретных композиций, описанных здесь, в различных схемах лечения, включающих, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и соответствующую композицию, хорошо известно в данной области, некоторые из них вкратце обсуждаются ниже для целей иллюстрации.
В некоторых применениях описанные здесь фармацевтические композиции могут доставляться посредством перорального введения животному. В этом случае, эти композиции могут быть приготовлены с инертным разбавителем или с ассимилируемым годным в пищу носителем, или они могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены непосредственно в пищевой продукт рациона.
В некоторых обстоятельствах будет желательной доставка фармацевтических композиций, описанных здесь, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно. Такие подходы хорошо известны квалифицированному работнику, некоторые из которых дополнительно обсуждаются, например, в патентах США с номерами 5543158; 5641515 и 5399363. В некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены растворы активных соединений в виде свободного основания или фармацевтически приемлемых солей в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Могут быть также приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях или в маслах. При обычных условиях хранения и использования эти препараты обычно будут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Иллюстративные фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий (например, см. патент США № 5466468). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы она могла легко вводиться с использованием шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Должная текучесть может поддерживаться, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и/или использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может облегчаться различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимерозалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть получена применением в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
В одном варианте осуществления для парентерального введения в водном растворе этот раствор должен быть подходящим образом забуферен, если это необходимо, и жидкий растворитель сначала должен быть сделан изотоническим с использованием достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи стерильная водная среда, которая может быть использована, будет известна специалистам с квалификацией в данной области в свете данного описания. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора №101 и либо добавлена к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо введена в предлагаемом месте инфузии (см., например, КепипДопА ΡБа^тасеиΐ^са1 8с1епсе5, 15411 еб, рр. 1035-1038 апб 1570-1580). Некоторое варьирование дозы будет, необязательно, иметь место в зависимости от состояния проходящего лечение субъекта. Кроме того, для введения человеку препараты должны, конечно, удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, требуемым службой биологических стандартов Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (ΕΌΑ).
В другом варианте осуществления данного изобретения описанные здесь композиции могут быть приготовлены в нейтральной форме или в форме соли. Иллюстративные фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная
- 42 014525 кислоты и т. п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы должны вводиться способом, совместимым с данной дозовой формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным.
Носители могут дополнительно содержать любой из перечисленных и все перечисленные растворители, дисперсионные среды, носители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, растворы носителей, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, рассматривается их применение в терапевтических композициях. В эти композиции могут быть также включены дополнительные активные ингредиенты. Выражение фармацевтически приемлемые относится к молекулярным частицам и композициям, которые не производят аллергической или сходной вредной реакции при введении человеку.
В некоторых вариантах осуществления липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, липидные частицы, пузырьки (везикулы) и т.п. используют для введения композиций данного изобретения в подходящие клетки/организмы-хозяева. В частности, композиции данного изобретения могут быть приготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, либо наночастице или т.п. Альтернативно, композиции данного изобретения могут быть связаны, ковалентно или нековалентно, с поверхностью таких носителей.
Образование и применение липосомы и липосома-подобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств обычно известно специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Ьакк, Тгепйк Вю!есЬпо1. 16(7):307-21, 1998; Такакига, И1рроп К1пкйо 56(3):691-95, 1998; Сйапйгап е! а1., ННап I. Ехр. Вю1. 35(8):801-09, 1997; Магда1й, Сгй. Веу. Тйег. Эгид Саглег 8ук!. 12(23):233-61, 1995; патент США № 5567434; патент США № 5552157; патент США № 5565213; патент США № 5738868 и патент США № 5795587, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки в его полном виде).
Липосомы успешно использовали с рядом типов клеток, которые обычно трудно трансфицировать другими процедурами, в том числе с суспензиями Т-клеток, культурами первичных гепатоцитов и клетками РС 12 (Вепшчкеп е! а1., I. Вю1. Сйет. 265(27): 16337-42, 1990; Ми11ег е! а1., БИЛ Се11 Вю1. 9(3):22129, 1990). Кроме того, липосомы свободны от ограничений длины ДНК, которые являются типичными для систем доставки на основе вирусов. Липосомы использовали эффективно для введения генов, различных лекарственных средств, радиотерапевтических агентов, ферментов, вирусов, факторов транскрипции, аллостерических эффекторов и т. п. в различные культивируемые клеточные линии и в различных животных. Кроме того, применение липосом, по-видимому, не связано с аутоиммунными реакциями или неприемлемой токсичностью после системной доставки.
В некоторых вариантах осуществления липосомы образуют из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами (МЬУ)).
Альтернативно, в других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает такие фармацевтически приемлемые формы композиций данного изобретения, как нанокапсулы. Нанокапсулы могут обычно захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (см., например, ОшгИапагСиеггего е! а1., Бгид Беу. М. РНагт. 24(12):1113-28, 1998). Во избежание побочных эффектов вследствие избыточной внутриклеточной нагрузки полимерами могут быть сконструированы ультратонкие частицы (с размерами около 0,1 мкм) с использованием полимеров, способных деградироваться ш у|уо. Такие частицы могут быть приготовлены, как описано, например, Соиугеиг е! а1., Сп!. Веу. Тйег. Бгид Сатег 8ук!. 5(1):1-20, 1988; ζπγ МиЫеп е! а1., Еиг. I. РНагт. Вюрйагт. 45(2):149-55, 1998; ΖатЬаиx е! а1., I. Соп1го11еа Ве1еаке 50(1-3):31-40, 1998 и патенте США № 5145684.
Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения могут быть помещены в контейнеры вместе с упаковочным материалом, который обеспечивает инструкции в отношении применения таких фармацевтических композиций. Обычно такие инструкции будут включать реальное выражение, описывающее концентрацию реагентов, а также в некоторых вариантах осуществления, относительные количества ингредиентов эксципиента или разбавителей (например, воды, солевого раствора или ФСБ), которые могут быть необходимыми для воссоздания этой фармацевтической композиции.
Способы лечения
Данное изобретение обеспечивает также способы увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости. Вкратце, многочисленные состояния приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, болезнь, генетическое предрасположение, несчастные случаи, которые приводят к прекращению использования кости (например, вследствие перелома), терапевтические средства, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают костеобразующие клетки, и нормальное старение. Посредством использования описанных здесь молекул, которые ингибируют связывание ТСР-бета-связывающего белка с членом ТСР-бета-семейства, такие состояния могут лечиться или
- 43 014525 предотвращаться. В данном контексте должно быть понятно, что минеральное содержание кости считается увеличившимся, если минеральное содержание кости увеличилось статистически значимым образом (например, более чем на половину стандартного отклонения) в выбранном участке.
Большое разнообразие состояний, которые приводят к потере минерального содержания кости, может лечиться описанными здесь молекулами. Пациенты с такими состояниями могут быть идентифицированы посредством клинического диагноза с использованием хорошо известных способов (см., например, Наткойк Ргтар1ек оГ Шет! Мебюше, МсОга^-НШ, Лс.). Репрезентативные примеры заболеваний, которые могут лечиться, включают дисплазии, в которых имеется атипичный рост или развитие кости. Репрезентативные примеры таких состояний включают ахондроплазию, ключично-черепной дизостоз, энхондроматоз, фиброзную дисплазию, болезнь Гоше, гипофосфатемический рахит, синдром Марфана, множественные костно-хрящевые экзостозы, нейрофиброматоз, несовершенный остеогенез, остеопетроз, остеопойкилоз, склеротические повреждения, переломы, периодонтальное заболевание, псевдоартроз и пиогенный остеомиелит.
Другие состояния, которые могут лечиться или предотвращаться, включают большое разнообразие причин остеопении (т.е. состояния, которое вызывает более чем одно стандартное отклонение минерального содержания кости или плотности ниже максимума минерального содержания скелета в молодости). Репрезентативные примеры таких состояний включают анемические состояния, состояния, обусловленные стероидами, состояния, обусловленные гепарином, нарушения костного мозга, цингу, недостаточность питания, недостаточность кальция, идиопатический остеопороз, врожденную остеопению или остеопороз, алкоголизм, хроническую болезнь печени, старость, постклимактерическое состояние, олигоменорею, аменорею, беременность, сахарный диабет, гипертиреоз, болезнь Кушинга, акромегалию, гипогонадизм, иммобилизацию или неиспользование, синдром рефлекторно-симпатической дистрофии, транзиторный регионарный остеопороз и остеомаляцию.
В одном аспекте данного изобретения минеральное содержание или плотность кости может увеличиваться введением теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, которая ингибирует связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства. Примеры теплокровных животных, которые могут лечиться, включают как позвоночных, так и млекопитающих, в том числе, например, людей, лошадей, коров, свиней, овец, собак, кошек, крыс и мышей. Репрезентативные примеры терапевтических молекул включают рибозимы, гены рибозимов, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела (например, гуманизированные антитела или любое другое описанное здесь антитело).
В других аспектах данного изобретения обеспечены способы увеличения плотности кости, предусматривающие стадии введения в клетки, которые направляются домой - в кость, вектора, который управляет экспрессией молекулы, ингибирующей связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства, и введения векторсодержащих клеток теплокровному животному. Вкратце, клетки, которые направляются домой - в кость, могут быть получены непосредственно из кости пациентов (например, клетки из костного мозга, такие как СБ34+, остеобласты, остеоциты и т.п.) из периферической крови или из культур.
Вектор, который управляет экспрессией молекулы, которая ингибирует связывание ТОЕ-бетасвязывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства, может быть введен в клетки. Репрезентативные примеры подходящих векторов включают вирусные векторы, такие как герпесвирусные векторы (например, патент США № 5288641), аденовирусные векторы (например, А0 94/26914, А0 93/9191; Ко11к е! а1., РХА8 91(1):215-219, 1994; Какк-Е1к1ег е! а1., Рт§ 90(24):11498-502, 1993; Оиζтаη е! а1., СйсцИйоп 88(6):2838-48, 1993; Оиζтаη е! а1., Сй. Кек. 73(6): 1202-1207, 1993; /аЬпег е! а1., Се11 75(2):207-216, 1993; Ь1 е! а1., Нит Оспс Ткег. 4(4):403-409, 1993; СаШаиб е! а1., Еиг. 1. №игокск 5(10:1287-1291, 1993; УтсеШ е! а1., N81. Оспс!. 5(2):130-134, 1993; ,1аПе е! а1., N81. Оспс!. 1(5):372-378, 1992; и 1,е\гего е! а1., Оспс 101 (2):195-202, 1991), аденоассоциированные вирусные векторы (А0 95/13365; Е1о!!е е! а1., РХА8 90(22):10613-10617, 1993), бакуловирусные векторы, парвовирусные векторы (Коегтд е! а1., Нит. Оспс Ткегар. 5:457-463, 1994), поксвирусные векторы (Ратсак ааб Рао1ейи, РХА8 79:4927-4931, 1982 и 0хак| е! а1., Вюскет. Вюркук. Кек. Сотт. 193(2):653-660, 1993) и ретровирусы (например, ЕР 0415731; XV 0 90/07936; А0 91/0285, XV0 94/03622; XV0 93/25698; А0 93/25234; патент США № 5219740; А0 93/11230; XV0 93/10218). Могут быть также сконструированы вирусные векторы, которые содержат смесь различных элементов (например, промоторов, последовательностей оболочки и т. п.) из различных вирусов или невирусных источников. В различных вариантах осуществления, либо сам вирусный вектор, либо вирусная частица, которая содержит этот вирусный вектор, могут быть использованы в описанных ниже способах и композициях.
В других вариантах осуществления данного изобретения молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют молекулу, которая ингибирует связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с членом ТОЕ-бетасемейства, могут вводиться различными способами, в том числе, например, введением асиалоозомукоида (А80К), конъюгированного с комплексами поли-Ь-лизин-ДНК (Спк1аг1о е! а1., РХА8 92122-92126, 1993), ДНК, связанной с убитым аденовирусом (Сшзе1 е! а1., Нит. Оспс Ткег. 3(2): 147-154, 1992), цитофектинопосредованным введением (^МΚIЕ-^0РЕ, У1са1, СакГогша), прямой инъекцией ДНК (Аскаб1 е! а1., №а
- 44 014525 !иге 352:815-818, 1991); ДНК-лиганда (Аи е! а1., I. оГ Вю1. Сбет. 264:16985-16987, 1989); липофекцией (Ее1дпег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А 84:7413-7417, 1989); липосомами (Рюкебпд е! а1., Сбс. 89(1):1321, 1994; и Аапд е! а1., РNА8 84:7851-7855, 1987); бомбардировкой микроснарядами (АпШатк е! а1., РNА8 88:2726-2730, 1991) и прямой доставкой нуклеиновых кислот, которые кодируют сам этот белок, отдельно (νίΕ апб Най, Сапсег Век. 53:3860-3864, 1993) или с использованием комплексов ПЭГнуклеиновая кислота. Репрезентативные примеры молекул, которые могут быть экспрессированы векторами данного изобретения, включают рибозимы и антисмысловые молекулы, которые обсуждались более подробно выше.
Определение увеличенного минерального содержания кости может выполняться непосредственно с использования рентгеновских лучей (например, Эиа1 Епегду Х-гау АЪкогр!Ыоте!гу или ОЕХА) или опосредованно на основе маркеров обновления кости (таких как остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1 (РК’Р) и общая щелочная фосфатаза; см. Сот1ег, С., Сигг. Орт. т Вбей. 7:243, 1995) или с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, N-телопептида, гидроксипролина мочи, тартрат-резистентных кислых фосфатаз и галактозилгидроксилизина плазмы; см. Сот1ег, кирга). Количество массы кости может быть также рассчитано из масс тела или другими способами, известными в данной области (см. Си^ииекк-Ηеу, Ме!аЬ. Вопе Ищ. апб Ве1а!. Век. 5:177-181, 1984).
Как будет очевидно специалисту с квалификацией в данной области, количество и частота введения будет зависеть, конечно, от таких факторов, как характер и тяжесть показания, подлежещего лечению, желаемой реакции, состояния пациента и т.д. Обычно, эти композиции могут вводиться различными способами, как отмечалось выше.
Следующие примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
Примеры
Пример 1. Склеростеоз картируется на длинном плече хромосомы 17 человека.
Генетическое картирование дефекта, ответственного за склеростеоз у людей, локализовало ген, ответственный за это нарушение, в районе хромосомы 17 человека, который кодирует новый член семейства ТСЕ-бета-связывающих белков. При склеростеозе скелетная кость проявляет существенное увеличение минеральной плотности относительно минеральной плотности непораженных субъектов. Кость в голове также обнаруживает избыточный рост. Пациенты со склеростеозом являются обычно здоровыми, хотя они проявляют вариабельные степени синдактилии при рождении и вариабельные степени черепного сдавления и сдавления нервов в черепе.
Анализ сцепления дефекта гена, связанного со склеростеозом, проводили применением способа картирования гомозиготности к пробам ДНК, собранным из 24 Южно-Африканских семей, в которых имело место данное заболевание. (8ЬеГйе1б е! а1., 1994, Нитап Мо1еси1аг Сепебск 3:1331-1335. 'Тбепбйсабоп оГ а Вагбе(-В1еб1 купбгот 1осик оп сбготокоте 3 апб еуа1иабоп оГ еГПс1еп1 арргоасб !о бото/удокбу тарртд). Африканское население Южной Африки является генетически гомогенным; это население являются потомством небольшого числа основателей, которые колонизировали эту зону несколько столетий назад, и оно было изолировано географическими и социальными барьерами со времени основания. Склеростеоз является редким повсюду в мире вне этого Африканского сообщества, что предполагает, что мутация в этом гене присутствовала в популяции основателей и с тех пор увеличивалась численно вместе с увеличением этой популяции. Использование картирования гомозиготности основывается на предположении, что маркеры картирования ДНК, смежные с рецессивной мутацией, должны быть, вероятно, гомозиготными у пораженных субъектов из находящихся в кровном родстве семей и в изолированных популяциях.
Набор из 371 микросателлитного маркера (Векеагсб Сепебск, 8е! 6) из аутосомных хромосом был выбран для типирования пулов ДНК из проб пациентов со склеростеозом. Пробы ДНК для этого анализа были взяты из 29 пациентов со склеростеозом в 24 семьях, 59 непораженных членов семей и ряда неродственных контрольных субъектов из той же самой популяции. Эти пулы состояли из 4-6 индивидуумов: либо пораженных индивидуумов, пораженных индивидуумов из находящихся в кровном родстве людей, родителей и непораженных сибсов, либо неродственных контролей. В пулах неродственных индивидуумов и в большинстве пулов с пораженными индивидуумами или членами семей анализ маркеров показал несколько размеров аллелей для каждого маркера. Один маркер, Ό1781299, обнаруживал признак гомозиготности: одна полоса в нескольких пулах пораженных индивидуумов.
Все 24 семьи со склеростеозом типировались с 19 маркерами в целом в районе Ό1781299 (в 17д12с|21). Было показано, что пораженные индивидуумы из каждой семьи являются гомозиготными в этом районе, и 25 из 29 индивидуумов были гомозиготными в отношении гаплотипа кора; каждый из них имел одни и те же аллели между 01781787 и Ό178930. Другие четыре индивидуума имели одну хромосому, которая совпадала с этим гаплотипом, и вторую, которая не совпадала. В сумме, эти данные неоспоримо предполагают, что этот район из 3 мега (106) пар нуклеотидов содержал мутацию склеростеоза. Анализ последовательности большинства экзонов в этом районе из 3 мега (106) пар нуклеотидов идентифицировал нонсенс-мутацию в кодирующей последовательности нового ТСЕ-бета-связывающего белка (С^Тмутация в положении 117 8Е0 ГО NО: 1 приводит к стоп-кодону). Было показано, что эта мутация явля- 45 014525 ется уникальной относительно пациентов со склеростеозом и носителей Африканского происхождения. Идентичность этого гена дополнительно подтверждали идентификацией мутации в его интроне (А^Тмутации в положении +3 этого интрона), которая приводит к неправильному процессингу мРНК в единственном, неродственном пациенте с диагностированным склеростеозом.
Пример 2. Тканеспецифичность экспрессии гена ТСЕ-бета-связывающего белка.
A. Экспрессия гена Веег человека при помощи ОТ-ПЦР.
Первую цепь кДНК получали из следующих проб тотальной РНК с использованием коммерчески доступного набора (8ирегкспр1 Ргеатрййсайоп 8ук1ет Гог Г1гк1-81гапб с^NΆ8уη1Ηек^к, ГГ'е Тесйпо1о§1ек, КоскуШе, ΜΌ): мозг человека, печень человека, селезенка человека, тимус человека, плацента человека, скелетная мышца человека, щитовидная железа человека, гипофиз человека, остеобласт человека (NНОк1 из С1опейск Согр., 8ап Бхедо, СА), клеточная линия остеосаркомы человека (8аок-2, АТСС # НТВ-85), кость человека, костный мозг человека, хрящ человека, кость зеленой мартышки, 8ассКаготусек сегеУ181ае и моноциты периферической крови человека. Все пробы РНК покупали из коммерческого источника (С1оп1есК, Ра1о А11о, СА), за исключением следующих, которые получали у себя в лаборатории: остеобласт человека, клеточная линия остеосаркомы человека, кость человека, хрящ человека и кость зеленой мартышки. Полученные у себя пробы РНК получали с использованием коммерчески доступного набора (ТК1 Кеадеп1, Мо1еси1аг Кекеагсй Сеп1ег, 1пс., Стстпай, ОН).
ПЦР выполняли на этих пробах и дополнительно на геномной пробе человека в качестве контроля. Смысловой олигонуклеотидный праймер Веег имел последовательность 5'-ССССАССТССАСААСААСААС-3' (8Е^ ΙΌ NО: 19). Антисмысловой олигонуклеотидный праймер Веег имел последовательность 5'-ССАСТССССССАССАСАСС-3' (8Е^ ΙΌ NО: 20). Кроме того, ПЦР выполняли с использованием праймеров для гена бета-актина человека в качестве контроля. Смысловой олигонуклеотидный праймер бета-актина имел последовательность 5'-АССССААСССССАСААСАТСАСС-3' (8Е^ ΙΌ Ш: 21). Антисмысловой олигонуклеотидный праймер бета-актина имел последовательность 5'-СААСТССАСССССАССТАССА-3' (8Е^ ΙΌ NО: 22). ПЦР выполняли с использованием стандартных условий в реакциях по 25 мкл с температурой отжига 61°С. Тридцать два цикла ПЦР выполняли с праймерами Веег, и двадцать четыре цикла выполняли с праймерами бета-актина.
После амплификации 12 мкл из каждой реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием бромидом этидия; см. фиг. 2А.
B. РНК-гибридизация т кйи срезов мышиного эмбриона.
Полноразмерную кДНК мышиного Веег (8Е^ ΙΌ NО: 11) клонировали в вектор рСК2.1 (йпчНодеп, СайкЬаб СА) в антисмысловом и смысловом направлении с использованием протокола изготовителя. 358альфа-СТР-меченые смысловой и антисмысловой кРНК-транскрипты синтезировали с использованием реагентов транскрипции т νίίΓο, поставляемых АтЬюп, Ιπο. (Аикйп, ТХ). Гибридизацию т кйи выполняли в соответствии с протоколами йуопк е1 а1. (I. СеП Вю1. 111:2427-2436, 1990).
кРНК-зонд мышиного Веег детектировал специфическую мРНК, экспрессируемую в нервной трубке, зачатках конечностей, кровеносных сосудах и остеогенных хрящах развивающихся эмбрионов мыши. Панель А на фиг. 3 показывает экспрессию в апикальном эктодермальном выступе (аег) зачатка конечности (1), кровеносных сосудах φν) и нервной трубке (п1). Панель В показывает экспрессию в 4-ом желудочке головного мозга (4). Панель С показывает экспрессию в мандибулярных (та), цервикальных позвонках φν), затылочной кости (ос), небе (ра) и кровеносном сосуде φν). Панель Ό показывает экспрессию в ребрах (г) и клапане сердца фа). Панель А является поперечным срезом эмбриона 10,5 брс. Панель В является сагиттальным срезом эмбриона 12,5 брс и панели С и Ό являются сагиттальными срезами эмбрионов 15,5 брс.
Ьа=жаберная дуга, К=сердце, 1е=мозговой пузырь (передний мозг), Ь=головной мозг, Злобноносовая масса, д кишечник, К сердце, | чеелюсть, 1ι печень, 1и=легкое, о1=ушной пузырек, ао=, кс спинной мозг, ккт скелетная мышца, пк носовая пазуха, 1К тимус, 1о=язык, й=передняя конечность, б1=диафрагма.
Пример 3. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Веег.
А. Экспрессия в клетках СО8-1.
ДНК-последовательность, кодирующую полноразмерный белок Веег человека, амплифицировали с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров ПЦР: 5'-олигонуклеотидный праймер имел последовательность ЗААОСТТООТАССАТОСАССТСССАС-З’ (ЗЕО Ю N0:23) и содержал сайт рестрикции ΗΐηάΙΙΙ (жирный шрифт) с последующими 19 нуклеотидами гена Веег, начинающимися с пары оснований 6, перед предполагаемым аминоконцевым старт-кодоном (АТС). 3'-олигонуклеотидный праймер имел последовательность 5’-АА6СТТСТАСТТОТСАТСОТСОТССТТОТА(ЗТСОТАООС(ЗТТСТССАОСТ-3· (ЗЕО ю N0:24) и содер жал сайт рестрикции НтбШ (жирный шрифт) с последущим стоп-кодоном обращенного комплемента (СТА) с последующим обращенным комплементом эпитопа ГЙАС (подчеркнутым, 81дта-А1бпсй Со., 81. Ι.οιιίκ, МО), фланкированным обращенным комплементом нуклеотидов, кодирующих 5 карбоксиконцевых аминокислот Веег. Продукт ПЦР ТА-клонировали (Опдта1 ТА С1отпд К11, йнчНодеп, СайкЬаб
- 46 014525
СА), и индивидуальные клоны подвергали скринингу секвенированием ДНК. Затем клон с подтвержденной последовательностью расщепляли НтбШ и очищали на 1,5% агарозном геле с использованием коммерчески доступных реагентов ('^ЬАцшск Се1 Ех!гас!юп Кй, ^^адеп 1пс., Уа1епс1а, СА). Затем этот фрагмент лигировали с расщепленной НтбШ, обработанной фосфатазой плазмидой рс^NΑ3.1 (1пуйгодеп, Саг1кЬаб СА) с использованием ДНК-лигазы Т4. Е. сой ЭН10В трансформировали и высевали на чашки со средой ЬВ с 100 мкг/мл ампициллина. Колонии, несущие желаемый рекомбинант в правильной ориентации, идентифицировали с использованием скрининга на основе ПЦР с применением 5'-праймера, соответствующего сайту промотора Т7/праймирования в рс^NΑ3.1, и 3'-праймера с последовательностью 5'-ССАСТССССССАССАСАСС-3' (8Е^ ГО N0: 25), которая соответствует обращенному комплементу внутренней последовательности ВЕЕВ. Последовательность этого клонированного фрагмента подтверждали секвенированием ДНК.
Клетки СО8-1 (АТСС № СВЬ-1650) использовали для трансфекции. 50 мкг экспрессионной плазмиды рс^NΑ-Вее^-Ε1ад трансфицировали с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с протоколами, поставляемыми изготовителем ('ГОЕАЕГОех!гап ТгапкГесНоп Кй, 81дта СНет1са1 Со. 8!. Ьошк, МО). Конечной средой после трансфекции была ЭМЕМ (ЫГе ТесНпо1од1ек, ВоскуШе, МЭ), содержащая 0,1% фетальную телячью сыворотку. После 4 дней в культуре эту среду удаляли. Экспрессию рекомбинантного ВЕЕВ анализировали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестернблоттинга с использованием моноклонального антитела М2 против ЕЬАС® (81дта-А1бпсН Со., 8!. Ьошк, МО). Очистку рекомбинантного белка ВЕЕВ выполняли с использованием аффинной колонки с антиЕЬАС-М2-антителом (МаттаНап Тгапшеп! Ехргеккюп 8ук!ет, 81дта-А1бпсН Со., 8!. Ьошк, МО). Профиль колонки анализировали с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела М2 против ЕЬАС®.
В. Экспрессия в клетках насекомых 8Е9.
Последовательность гена Веег человека амплифицировали с использованием ПЦР со стандартными условиями и следующими праймерами:
Смысловой праймер: 5’ОТСОТСООАТССАТ6СО6ТООСА6ССОТТСААОААТОАТ-3’ (ЗЕО Ю N0:26)
Антисмысловой праймер:
5’0ТС6ТСАА0СТТСТАСТТ6ТСАТС0ТССТТ0ТА0ТС6ТАС6С0ТТСТССА0СТС00 С-3’ (ЗЕО Ю N0:27)
Полученная кДНК содержала кодирующий район Веег с двумя модификациями. Ν-концевой сигнал секреции был удален и эпитопная метка ЕЬАС (81дта) была слита в рамке считывания с С-концевой стороной инсерта. Добавляли сайты клонирования ВатН1 и НтбШ, и этот ген субклонировали в вектор рМе1Вас (1пуйгодеп) для переноса в бакуловирусный экспрессирующий вектор с использованием стандартных способов.
Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие белок Веег, получали с использованием набора для трансфекции Вас-№В1ие (1пуйгодеп) и очищали в соответствии с инструкциями изготовителя.
Клетки 8Е9 (1пуйгодеп) поддерживали в среде ТNМ_ΕΗ (1пуйгодеп), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Для экспрессии белка культуры 8Е9 во вращающихся колбах инфицировали при множественности заражения (МО1), большей чем 10. Пробы среды и клеток брали ежедневно в течение пяти дней и экспрессию Веег подвергали мониторингу при помощи Вестерн-блоттинга с применением моноклонального анти-ЕЕАС-М2-антитела (81дта) или поликлональной кроличьей антисыворотки против Веег.
После пяти дней инфицированные бакуловирусом клетки 8Е9 собирали центрифугированием, и ассоциированный с клетками белок экстрагировали из осадка клеток с использованием высокосолевого буфера для экстракции (1,5 М №С1, 50 мМ Трис рН 7,5). Экстракт (20 мл на 300 мл культуры) осветляли центрифугированием, диализовали три раза против четырех литров забуференного Трисом солевого раствора (150 мМ №С1, 50 мМ Трис рН 7,5) и опять осветляли центрифугированием. Эту высокосолевую фракцию наносили на Нйгар Нерагт (РНагтас1а; объем слоя 5 мл), промывали интенсивно забуференым НЕРЕ8 солевым раствором (25 мМ НЕРЕ8 7,5, 150 мМ №С1), и связанные белки элюировали градиентом 150 мМ №С1 - 1200 мМ №С1. Элюцию Веег наблюдали при приблизительно 800 мМ №С1. К содержащим Веег фракциям добавляли 10% глицерин и 1 мМ ДТТ и их замораживали при -80°С.
Пример 4. Получение и испытание поликлональных антител к Веег, СгетНп и Эап.
А. Получение антигена.
ДНК-последовательности Веег человека, СгетНп человека и Пап человека амплифицировали с использованием стандартных ПЦР-способов со следующими олигонуклеотидными праймерами:
Н. Веег (Веег человека)
Смысловой: б’-ОАСТТООАТСССАОСССТОССАООССТТС-З’ (ЗЕО Ю N0:28)
Антисмысловой: б’-АОСАТААССТТСТАСТАОСССТТСТССАО-З’ (ЗЕО Ю
N0:29)
Н. СгетНп
- 47 014525
Смысловой: 5’-ОАСТТООАТССОААОООАААААОААА6ОО-3’ (8ЕО Ю N0:30) Антисмысловой: 5’-А6САТААОСТТТТААТССАААТСОАТООА-3’ (8ЕО Ю N0:31)
Н. Пап
Смысловой: 5’-АСТАСОАОСТСООССССАССАСССАТСААСАА(3-3’ (8Е0 Ю
N0:32)
Антисмысловой: 5’-АСТТАОААОСТТТСАОТССТСАОСССССТСТТСС-3’ (8Е0
Ю N0:33)
В каждом случае приведенные праймеры амплифицировали весь кодирующий район минус сигнальная последовательность секреции. Полученные последовательности включают сайты рестрикции для субклонирования в бактериальный экспрессирующий вектор рРЕ-30 (Р1адеп 1пс., Уа1епс1а, СА) в сайтах ВатЫ/НтбШ для Веег и СгетНп и сайтах 8асI/Н^ηбIII для Пап. рРЕ30 содержит кодирующую последовательность для метки 6х Н1к на 5'-конце района клонирования. Эти полные конструкции трансформировали в штамм Е. со11 М-15/рВер (Р1адеп ^с), и индивидуальные клоны подтверждали секвенированием. Экспрессию белка в М-15/рВер и очистку (аффинное связывание метки 6хН1к с Ы1-ЫТА, связанным с Сефарозой) выполняли, как описано изготовителем (Р1адеп, ТЬе СЯАехргеккюшкЦ
Полученный из Е. со11 белок Веег извлекали в значительном количестве с использованием солюбилизации в 6М гуанидине и диализовали до 2-4 М для предотвращения осаждения во время хранения. Белки СгетНп и Пап извлекали в более высоком количестве с солюбилизацией в 6 М гуанидине, и концентрация гуанидина после очистки была 0,5 М.
B. Получение и испытание поликлональных антител.
Поликлональные антитела к каждому из этих трех антигенов получали в кролике и в курице в качестве хозяев с использованием стандартных протоколов (В & В АпНЬобу, 81ап\хоос1, \.А.; 81апс1ай рго!осо1 Гог гаЬЬб ^ттиη^ζаΐюη апб а пике га ^есоνе^у; 8Ьог! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду. 2пб ебйюп. 1992. 11.37-11.41. Соп1г1Ьи!огк Не1еп М. Соорег апб Υνоηηе Ра!егкоп; антитела курицы были получены с 81та!еЦ1с Вюко1и!юпк, Ватопа, С.А.).
Кроличьи антисыворотки и фракцию куриного яйца подвергали скринингу на активность посредством Вестерн-блоттинга. Каждый из трех антигенов разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозу 0,45 мкм (Ы^ех, 8ап Бхедо, СА). Эту мембрану разрезали на полоски, причем каждая полоска содержала приблизительно 75 нг антигена. Полоски блокировали в 3% В1оШпд Сгабе В1оск (Вю-Ваб ЬаЬога1:опек, Негси1ек, СА) и промывали 3 раза в буфере 1Х Трис-буфер-солевой раствор (ТВ8)/0,02% Твин. Первичное антитело (кровопускания перед иммунизацией, кроличьи антисыворотки или куриного яйца в разведениях в диапазоне 1:100-1:10000 в блокирующем буфере) инкубировали с этими полосками в течение 1 ч при осторожном качании. За второй серией трех промывок 1Х ТВ8/0,02% Твин следовала одночасовая инкубация со вторичным антителом (конъюгированное с пероксидазой ослиное антитело против кроличьего иммуноглобулина, АтегкЬат ЫГе 8с1епсе, Р1кса!а^ау, N1; или конъюгированное с пероксидазой ослиное антитело против куриного иммуноглобулина, Дасккоп ^типоВекеагсЬ, \ек! Слоте, РА). Выполняли конечный цикл из 3х промывок 1Х ТВ8/0,02% Твин и полоски проявляли с использованием субстрата Ρυιιιί-ΡίηΙιΙ \ек!егп В1оШпд 8иЫга!е (ВосЬе Мо1еси1аг ВюсЬет1са1к, МаппЬе1т, Сегтапу).
C. Испытание перекрестной реактивности антител.
Согласно протоколу, описанному в предыдущем разделе, нитроцеллюлозные полоски Веег, СгешИп или Пап инкубировали с разведениями (1:5000 и 1:10000) из соответствующих кроличьей антисыворотки или !дУ куриного яйца, а также с антисыворотками или !дУ куриного яйца с разведениями (1:1000 и 1:5000), приготовленными с оставшимися двумя антигенами. Эти увеличенные уровни несовпадающих антител использовали для детектирования связывания низкой аффинности этими антигенами, которое можно обнаружить только при увеличенной концентрации. Протокол и продолжительность развития являются одинаковыми для всех трех событий связывания с использованием описанного выше протокола. Не наблюдали антигенной перекрестной реактивности для любого из испытанных антигенов.
Пример 5. Взаимодействие Веег с белками ТСР-бета-суперсемейства.
Взаимодействие Веег с белками из различных филогенетических плечей ТСР-бета-суперсемейства исследовали с использованием способов иммунопреципитации. Очищенные ТСР-31, ТСР-32, ТСР-33, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 и СБЫР получали из коммерческих источников (В&Б кук!етк; МтпеароНк, МЫ). Репрезентативный протокол является следующим. Частично очищенный Веег диализовали в забуференный НЕРЕ8 солевой раствор (25 мМ НЕРЕ8 7,5, 150 мМ ЫаС1). Иммунопреципитации выполняли в 300 мл СР-буфера (150 мМ ЫаС1, 25 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1,4 мМ β-меркаптоэтанол, 0,5% Тритон Х-100 и 10% глицерин). 30 нг рекомбинантного белка ВМР-5 человека (В&Б кук!етк) наносили на 15 мкл РЬАС-аффинного матрикса (81§та; 8ΐ. Ьошк МО) в присутствии и в отстутствие 500 нг меченного РЬАС-эпитопом Веег. Белки инкубировали в течение 4 ч при 4°С, и затем ассоциированные с этим аффинным матриксом белки промывали 5 раз в СР-буфере (1 мл на одну промывку). Связанные белки
- 48 014525 элюировали из аффинного матрикса в 60 мкл 1Х буфера для взятия проб для ДСН-ПААГ. Белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ, и ассоциированный с Веег ВМР-5 детектировали с использованием Вестерн-блота с применением антисыворотки против ВМР-5 (ВекеагсН П1адпок11ск, Ыс.) (см. фиг. 5).
Анализ связывания лиганда Веег.
Белок ЕЬАС-Веег (20 нг) добавляют к 100 мкл ФСБ/0,2% БСА и адсорбируют в каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета, предварительно покрытого моноклональным антителом против ЕЬАС (81дта; 81. Ьошк МО), и блокируют 10% БСА в ФСБ. Это выполняют при комнатной температуре в течение 60 мин. Этот раствор белка удаляют, и лунки промывают для удаления несвязавшегося белка. Добавляют ВМР-5 в каждую лунку в концентрациях в диапазоне от 10 пМ до 500 нМ в ФСБ /0,2% БСА и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор для связывания удаляют и планшет промывают три раза по 200 мкл ФСБ/0,2% БСА. Затем уровни ВМР-5 детектируют с использованием антисыворотки ВМР-5 посредством ЕЫ8А (Е.М. АикиЬе1 е1 а1. (1998) Сиггеп1 Рго1осо1к ш Мо1. Вю1. Уо1. 2, 11.2.1-11.2.22). Специфическое связывание рассчитывают вычитанием неспецифического связывания из общего связывания и анализируют с использованием программы ЫСА^Ж (Мипкоп апб РобЬагб, Апа1. ВюсНет., 107, р. 220-239 (1980)).
В вариации этого способа Веег конструируют и экспрессируют в виде слитого с Ес человека белка. Подобным образом конструируют лиганд ВМР и экспрессируют в виде мышиного Ес-слияния. Эти белки инкубируют вместе и анализ проводят, как описано Ме11ог е1 а1., с использованием гомогенного детектирования с разделенной во времени флуоресценцией (С.А. Ме11ог е1 а1., 1. о£ Вюто1 ^сгеешпд, 3(2) 91-99, 1998).
Пример 6. Анализ-скрининг на ингибирование связывания ТСЕ-бета-связывающего белка с членами ТСЕ-бета-семейства.
Описанный выше анализ повторяют с двумя исключениями. Во-первых, концентрацию ВМР поддерживают фиксированной при Кс, определенной предварительно. Во-вторых, коллекцию кандидатных антагонистов добавляют при фиксированной концентрации (20 мкМ в случае коллекций малых органических молекул и 1 мкМ в исследованиях антител). Эти кандидатные молекулы (антагонисты) связывания ТСЕ-бета-связывающего белка включают органические соединения, полученные из коммерческих или внутренних коллекций, представляющих разнообразные химические структуры. Эти соединения готовят в виде исходных растворов в ДМСО и добавляют в лунки для анализа при < 1% конечного объема при стандартных условиях анализа. Их инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с ВМР и Веег, раствор удаляют и связанный ВМР определяют количественно, как описано выше. Агенты, которые ингибируют 40% связывания ВМР, наблюдаемого в отсутствие соединения или антитела, считают антагонистами этого взаимодействия. Затем их оценивают в качестве потенциальных ингибиторов на основе исследований с титрованием для определения их констант ингибирования и их влияния на связывающую аффинность ТСЕ-бета-связывающего белка. Могут также проводиться контрольные анализы сравнимой специфичности для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста посредством исследований с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентное исследование с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
Пример 7. Ингибирование локализации ТСЕ-бета-связывающего белка в матриксе кости.
Оценку ингибирования локализации в матриксе кости (гидроксиапатите) проводят с использованием модификаций в отношении способа Николаса (№со1ак, V. Са1с1£ Т1ккие Ы1 57:206, 1995). Вкратце, 125Ь меченый ТСЕ-бета-связывающий белок получают, как описано №со1ак (кирга). В каждую лунку 96луночного планшета с полипропиленовой фильтрующей мембраной (Ро1уй11гошс, АеутоШН МА) добавляют гидроксиапатит. ТСЕ-бета-связывающий белок добавляют к 0,2% альбумину в ФСБ. Лунки, содержащие матрикс, промывают 3 раза этим буфером. Адсорбированный ТСЕ-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М №1ОН и определяют количественно.
Идентификацию ингибитора проводят посредством инкубирования ТСЕ-бета-связывающего белка с тест-молекулами и нанесением этой смеси на матрикс, описанный выше. Матрикс промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный ТСЕ-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М №1ОН и определяют количественно. Агенты, которые ингибируют 40% связывания ТСЕ-бетасвязывающего белка, наблюдаемого в отсутствие соединения или антитела, считают ингибиторами локализации в кости. Эти ингибиторы дополнительно характеризуют посредством исследований доза-ответ для определения их констант ингибирования и их влияния на связывающую аффинность ТСЕ-бетасвязывающего белка.
Пример 8. Конструирование мутанта ТСЕ-бета-связывающего белка.
А. Мутагенез.
Полноразмерная кДНК ТСЕ-бета-связывающего белка в плазмиде рВ1иекспр1 8К служит в качестве матрицы для мутагенеза. Вкратце, подходящие праймеры (см. приведенное выше обсуждение) используют для генерирования ДНК-фрагмента полимеразной цепной реакцией с использованием ДНКполимеразы Vеи1 (Νον Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА). Полимеразная цепная реакция протекает в течение 23 циклов в буферах, обеспечиваемых изготовителем, с использованием температуры отжига 57°С. Затем этот продукт подвергают действию двух рестриктаз и после выделения с использованием электрофореза
- 49 014525 в агарозном геле опять лигируют в плазмиду рВВР4-503, из которой совпадающая последовательность была удалена ферментативным расщеплением. Целостность мутанта подтверждают секвенированием ДНК.
В. Экспрессия в клетках млекопитающих и выделение мутантного ТОР-бета-связывающего белка.
Мутантные кДНК ТОР-бета-связывающего белка переносят в рс^NА3.1, экспрессирующий вектор млекопитающих, описанный в примере 3. После подтверждения этой последовательности, полученные конструкции трансфицируют в клетки С08-1, и секретируемый белок очищают, как описано в примере 3.
Пример 9. Модели животных - I. Генерирование трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ген Веег.
ВАС-клон 15О5 ~200 т.п.н., выделенный из библиотеки геномной ДНК мыши С1ТВ (распространяемой Векеагсй Оепейск, Нип!^Ше, АЬ), использовали для определения полной последовательности гена Веег мыши и его 5'- и 3'-фланкирующих районов. 8а11-фрагмент 41 т.п.н., содержащий полный ген, плюс ~17 т.п.н. 5'-фланкирующей и ~20 т.п.н. 3'-фланкирующей последовательности субклонировали в сайт ВатН1 космидного вектора 8ирегСок1 (8!га!адепе, Ьа 1о11а, СА) и размножали в штамме Е. сой ЭН10В. Затем из этой космидной конструкции М1и1 - Аν^II-фрагмент рестрикции 35 т.п.н. (8ЕЦ ΙΌ N0: 6), включающий полный ген Веег, а также 17 т.п.н. и 14 т.п.н. 5'- и 3'-фланкирующей последовательности, соответственно, очищали из геля с использованием общепринятого способа и использовали для микроинъекции мышиных зигот (ЭХХ Тгапкдешск; патент США № 4873191). Животных-основателей, в которых этот клонированный ДНК-фрагмент интегрировался случайным образом в геном, получали при частоте 5-30% выживших детенышей. Присутствие трансгена определяли проведением блот-анализа по Саузерну геномной ДНК, экстрагированной из небольшого количества мышиной ткани, такой как кончик хвоста. ДНК экстрагировали с использованием следующего протокола: ткань расщепляли в течение ночи при 55% в буфере для лизиса, содержащем 200 мМ №С1, 100 мМ Трис рН 8,5, 5 мМ ЭДТА, 0,2% ДСН и 0,5 мг/мл протеиназы К. На следующий день ДНК экстрагировали один раз смесью фенол/хлороформ (50:50), один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали этанолом. После ресуспендирования в ТЭ (10 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТА) 8-10 мкг каждой пробы ДНК расщепляли рестрикционной эндонуклеазой, такой как ЕсоВ1, подвергали гель-электрофорезу и переносили на заряженную найлоновую мембрану, такую как НуВопйХ+ (Атегкйат, Аг1шд!оп Не1дй!к, 1Ь). Затем полученный фильтр гибридизовали с радиоактивно меченым фрагментом ДНК, происходящим из локуса гена Веег мыши и способным узнавать как фрагмент из локуса эндогенного гена, так и фрагмент другого размера, происходящий из трансгена. Животных-основателей разводили до нормальных трансгенных мышей для получения достаточных количеств трансгенного и нетрансгенного потомства, в котором можно определять эффекты сверхэкспрессии гена Веег. Для этих исследований животных разного возраста (например, 1 день, 3 недели, 6 недель, 4 месяца) подвергали ряду различных анализов, предназначенных для определения макроскопического образования скелета, минеральной плотности кости, минерального содержания кости, активности остеокластов и остеобластов, степени эндохрящевого окостенения, образования хряща и т. д. Транскрипционная активность из этого трансгена может быть определена экстракцией РНК из различных тканей и использованием ОТ-ПЦР-анализа, который использует преимущество полиморфизмов единственного нуклеотида между мышиной линией, из которой получен этот трансген (1298ν/Τ), и линией мышей, используемой для микроинъекции ДНК [(С57ВЬ5/1х81Е/1)Р2].
Модели животных - II. Разрушение гена Веег мыши гомологичной рекомбинацией.
Гомологичная рекомбинация в эмбриональных стволовых клетках (Е8) может быть использована для инактивации эндогенного гена Веег мыши и затем генерирования животных, несущих мутацию с потерей функции. Репортерный ген, такой как ген β-галактозидазы Е. сой, был встроен в нацеливающий вектор таким образом, что его экспрессия регулируется промотором и сигналом инициации трансляции эндогенного гена Веег. Таким путем могут быть определены пространственные и временные паттерны (распределения) экспрессии гена Веег в животных, несущих аллель-мишень.
Этот нацеливающий вектор конструировали сначала клонированием отобранной с использованием лекарственного средства, запускаемой промотором фосфоглицераткиназы (РОК) кассеты с геном устойчивости к неомицину (пео) из рОТ-Ы29 (№\ν Епд1апй Вю1аЬк, Веуег1у, МА), в клонирующий вектор р8Р72 (Рготеда, Майкоп, XVI). Использовали ПЦР для фланкирования этой кассеты РОКпео сайтами 1охР бактериофага Р1, которые являются сайтами узнавания для Сге-рекомбиназы Р1 (Ноекк е! а1., РNА8 И8А, 79:3398, 1982). Это делает возможным последующее удаление маркера пео-устойчивости в Е8-клеткахмишенях или полученных из Е8-клеток животных (патент США 4959317). Праймеры ПЦР состояли из последовательности 1охР из 34 нуклеотидов (п!й), 15-25-нуклеотидов, комплементарных 5'- и 3'-концам кассеты РОКпео, а также сайтов узнавания рестриктаз (ВатНЙ в смысловом праймере и ЕсоВI в антисмысловом праймере) для клонирования в р8Р72.
- 50 014525
Последовательность смыслового праймера была 5’ААТСТООАТССАТААСТТСОТАТАОСАТАСАТТАТАСОААОТТАТСТССАООАТТСОА
ОСОССССТ-3’ (ЗЕО Ю N0:34); последовательность антисмыслового праймера была 5’ААТСТСААТТССАССООТОТТААТТАААТААСТТСОТАТААТОТАТОСТАТАСОА АОТТАТАОАТСТАОАОТСАОСТТСТОА-3’ (ЗЕО Ю N0:35).
Следующей стадией было клонирование ХМ-НтбШ-фрагмента 3,6 т.п.н., содержащего ген βгалактозидазы Е. сой и сигнал полиаденилирования 8У40 из р8Ув (С1оп!есЬ, На1о Α1ΐ(τ СΑ). в плазмиду р8Ρ72-ΡСΚпео. Короткое плечо гомологии из локуса гена Βее^ мыши генерировали амплификацией фрагмента 2,4 т.п.н. из ВАС-клона 15С5. 3'-конец этого фрагмента совпадал с сайтом инициации трансляции гена Βее^. и антисмысловой праймер, используемый в ПЦР, также включал 30 нуклеотидов, комплементарных 5'-концу гена β-галактозидазы, так что его кодирующий район мог быть слит с сайтом инициации Βее^ в рамке считывания. Подходом, использованным для введения короткого плеча в плазмиду р8Ρ72-βдаί-ΡСΚпео. была линеаризация этой плазмиды в сайте слева от гена в-да1 и затем котрансформация этого фрагмента с коротким плечом продукта ПЦР и отбор плазмид, в которых этот продукт ПЦР интегрировался посредством гомологичной рекомбинации. Смысловой праймер для амплификации этого короткого плеча включал 30 нуклеотидов, комплементарных вектору р8Ρ72. для создания возможности этого события рекомбинации.
Последовательность смыслового праймера была 5’АТТТАООТОАСАСТАТА(ЗААСТСОАОСАОСТ(ЗААССТТААССАСАТООТО(ЗСТСАС
ААССАТ-3’ (ЗЕО Ю N0:36) и последовательность антисмыслового праймера была 5’-ААССАСС0ССА0Т6ААТСС0ТААТСАТ60ТСАТ0СТ0ССА60Т0САС0АСС0СА3’ (ЗЕО Ю N0:37).
Длинное плечо из локуса гена Βее^ генерировали амплификацией фрагмента 6,1 т.п.н. из ВАСклона 15С5 с праймерами, которые также вводят сайты редко-разрезающих (редкощепящих) ферментов 8§τΑΙ, Бзе^ Αδ^ и ΡасI.
Конкретно, последовательность смыслового праймера была 5’АТТАССАССООТОАСАСССОСТТССТОАСАО-З’ (ЗЕО Ю N0:38); последовательность антисмыслового праймера была 5’АТТАСТТААТТАААСАТСОСОСОССАТАТООСССбССССТААТТОСООСОСАТССТТ ААТТ-3’ (ЗЕО Ю N0:39).
Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор ТА (Iпν^!^одеп. СагЕЬаб СΑ) в виде промежуточной стадии.
Эта нацеливающая конструкция гена Βее^ мыши включала также второй селектируемый маркер, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса Ι (Н8УТК) под контролем элемента длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (К8У ЬТК). Экспрессия этого гена делает клетки млекопитающих чувствительными (и нежизнеспособными) к ганцикловиру; таким образом, она является удобным путем для отбора против неомицин-устойчивых клеток, в которых эта конструкция была интегрирована негомологичным событием (патент США 5464764). Кассету К8УЬТК-Н8УТК амплифицировали из рΡ81337 с использованием праймеров, которые делают возможным последующее клонирование в сайты БδеI и Αδ^ векторной плазмиды длинного плеча-ТА. Для этой ПЦР последовательность смыслового праймера была 5'-ΑТТΑСССССССССССΑΑΑССΑΑТТСΑΑСΑ ТСТСЛ-3' (8Ε^ ГО N0: 40); последовательность антисмыслового праймера была 5'-ΑТТΑСССССССССССТСΑСΑССССССΑСССΑССТ-3' (8Ε^ ГО N0: 41).
Конечная стадия в конструировании этого нацеливающего вектора включала клонирование 8§τΑΙΑδ^-фрагмента 8,8 т.п.н., содержащего длинное плечо и ген К8УЕТК-Н8УТК, в сайты 8§τΑΙ и Αδ^ плазмиды р8Ρ72- короткое плечо-βдаί-ΡСΚпео. Этот нацеливающий вектор линеаризовали расщеплением либо Αδ^, либо Насй перед электропорацией в клетки Ε8.
Пример 10. Опосредованная антисмысловым олигонуклеотидом инактивация Βее^.
Антисмысловые олигонуклеотиды из 17 нуклеотидов получают в перекрывающемся формате таким образом, что 5'-конец первого олигонуклеотида перекрывает кодон инициации трансляции ΑυС транскрипта Βее^. а 5'-концы последовательных олигонуклеотидов встречаются в 5-нуклеотидных приращениях при движении в 5'-направлении (до 50 нуклеотидов далее) относительно ΑυС Βее^. Соответствующие контрольные олигонуклеотиды конструируют и получают с использованием эквивалентного состава оснований, но перераспределенного в последовательности, для ингибирования какой-либо значимой гибридизации с кодирующей мРНК. Доставку реагентов к клеточной тест-системе проводят посредством доставки с использованием катионных липидов (ΡΈ. Бе1§пег, Ρ^ос. №!1. Αсаά. 8ст υ8Α 84:7413, 1987). 2 мкг антисмыслового олигонуклеотида добавляют к 100 мкл среды с уменьшенным содержанием сыво
- 51 014525 ротки (Ор!1-МЕМ Ι среда с уменьшенным содержанием сыворотки; ЫГе ТесНпо1од1ек, СайЕегкЬигд МО) и смешивают с реагентом Липофектином (6 мкл) (ЫГе ТесНпо1од1ек, СайЕегкЬигд МО) в 100 мкл среды с уменьшенным содержанием сыворотки. Эти компоненты смешивают, дают возможность образоваться комплексу в течение 30 мин при комнатной температуре, и эту смесь добавляют к предварительно посеянным клеткам МС3Т3Е21 или К8483. Эти клетки культивируют и извлекают мРНК. мРНК Веег подвергают мониторингу с использованием ОТ-ПЦР вместе с Веег-специфическими праймерами. Кроме того, отдельные экспериментальные лунки собирают, и уровни белка определяют с использованием способов Вестерн-блоттинга, описанных в примере 4. Клетки собирают, ресуспендируют в буфере для лизиса (50 мМ Трис рН 7,5, 20 мМ ИаС1, 1 мМ ЭДТА, 1 % ДСН), и растворимый белок собирают. Этот материал наносят на 10-20%-градиентный денатурирующий гель для электрофореза в ДСН-ПААГ. Разделенные белки переносят на нитроцеллюлозу и проводят Вестерн-блоттинг, как описано выше, с использованием описанных реагентов-антител. Параллельно, контрольные олигонуклеотиды добавляют к идентичным культурам и экспериментальные операции повторяют. Уменьшение уровней мРНК Веег или белка считают значимым, если обработка антисмысловым олигонуклеотидом приводит к 50% изменению в любом случае по сравнению с контрольным перемешанным олигонуклеотидом. Эта методология делает возможными селективную инактивацию гена и последующую характеристику фенотипа минерализованных узелков в модели культуры ткани.
Пример 11. Моделирование района (кора) склеростина.
Способы узнавания гомологии (например, РМ-ВЬА^Т (А1!ксНи1 е! а1., ИисШс Ас1бк Кек. 25:3389-402 (1997)), ЕИСИЕ (81ί е! а1., I. Мо1. Вю1. 310:243-57 (2001)) предполагали, что внутренний район (кор) 8О8Т (8О8Т_Соге) принимает укладку цистинового узла. ЕИСИЕ является чувствительным способом для детектирования гомологии между последовательностями и структурами. Хорионический гонадотропин β человека (НСС-β), для которого известна экспериментально определенная 3И-структура, идентифицировали при помощи ЕИСИЕ (8Н1 е! а1., кирга) как самый близкий гомолог 8О8Т_Соге. Таким образом, НСС-β использовали в качестве структурного шаблона для построения 3И-моделей для 8О8Т_Соге.
Выравнивание 8О8Т_Соге и его близких гомологов показано на фиг. 7. Среди гомологов, показанных в этом выравнивании, только НСС-β (ССИВ) имел известную 3И-структуру. Идентичность последовательности между 8О8Т_Соге и НСС-β была приблизительно 25%. Восемь остатков СΥ8 были консервативными во всем семействе, подчеркивая общее структурное сходство между 8О8Т_Соге и НСС-β. Три пары цистинов (1-5, 3-7, 4-8) образовывали дисульфидные связи (показанные жирными линиями на фиг. 7) в конфигурации узла, которая была характерной для укладки цистинового узла. Дополнительная дисульфидная связь (2-6), показанная пунктирной линией на фиг. 7, была уникальной для этого семейства и отличала это семейство белков от других семейств с цистиновым узлом (например, ТСЕ-β, ВМР).
8О8Т_Соге моделировали с использованием РИВ (Вегтап е! а1., Ас!а Сгук!а11одг. Ό. Вю1. Сгук1а11одг. 58(Р! 6 Р!1):899-907 (2002)), вход ШСЫ, 3И-структура НСС-β (№и е! а1., 8йис!иге 2:545-58 (1994)), в качестве структурного шаблона. Модели рассчитывали с использованием программы МОИЕЬЕК (8ай апб В1ипбе11, I. Мо1. Вю1. 234:779-815 (1993)). Снимок наилучшей модели показан на фиг. 8.
Большинство белков с цистиновыми узлами образуют димеры вследствие отсутствия гидрофобного кора в мономере (8сНеиГ1ег е! а1., кирга; 8сН1ипеддег апб Сги!!ег, 1. Мо1. Вю1. 231:445-58 (1993); \Уи е! а1., кирга). 8О8Т, по-видимому, подчиняется тому же самому правилу и образует гомодимер для увеличения его стабильности. Конструирование модели для димеризованного района 8О8Т_Соге представляло несколько трудностей, которые было бы важно преодолеть, так как (1) сходство последовательности между 8О8Т_Соге и НСС-β было низким (25%); (2) вместо гомодимера, НСС-β образовывал гетеродимер с НССα; и (3) ряд различных родственных конформаций мономеров наблюдали в димеризованных белках с цистиновыми узлами из различных семейств (например, РИСЕ, ТСЕ-β, нейротрофин, ΙΕ-17Ε, гонадотропин), что предполагало, что димерная конформация 8О8Т могла бы значимо отклоняться от гетеродимерной конформаций НСС-α/β. При конструировании этой модели НСС-α заменяли НСС-β из гетеродимерной структуры (ШСИ), с использованием способов структурного наложения, комбинированных с мануальной коррекцией, и затем строили модель гомодимера 8О8Т_Соге в соответствии с этой псевдоструктурой гомодимера НСС-β.
Пример 12. Моделирование взаимодействия 8О8Т-ВМР.
Этот пример описывает белковое моделирование сайтов связывания рецепторов типа Ι и типа ΙΙ на ВМР, которые участвуют во взаимодействии между ВМР и 8О8Т.
Конкурентные исследования продемонстрировали, что 8О8Т конкурировал с рецепторами как типа Ι, так и типа ΙΙ за связывание с ВМР. В конкурентном анализе на основе ЕЫ8А ВМР-6 селективно взаимодействовал с покрытой склеростином последовательностью (300 нг на лунку) с высокой аффинностью (Кс=3,4 нМ). Увеличивающиеся количества рецептора ТА ВМР (Ес-слитой конструкции) конкурировали со склеростином за связывание с ВМР-6 (11 нМ) (^50=114 нМ). 10-кратный молярный избыток этого рецептора ВМР был достаточным для уменьшения связывания склеростина с ВМР-6 приблизительно на 50%. Эту конкуренцию наблюдали также со слитым белком ВМР-рецептор ΙΙ-Ес (Ιίβ0=36 нМ) и ИАИ (ГС5о=43 нМ). Специфичность этого анализа была показана отсутствием конкуренции за связывание
- 52 014525
ВМР-6 между склеростином и слитым белком гАсбут К1В-Ес, членом семейства рецепторов ТОЕ-β, который не связывал ВМР.
Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на полипептиде ВМР были картированы и пространственно разделены (8сБеиГ1ег е! а1., кирга; Оиик е! а1., кирга; №1ске1 е! а1., кирга; Наг! е! а1., кирга). №оддт, другой антагонист ВМР, который связывается с ВМР с высокой активностью, контактирует с ВМР при обоих сайтах связывания рецептора типа I и рецептора типа II через №-концевую часть №оддт (Огорре е! а1., кирга). Две β-цепи в районе кора вблизи С-конца также контактируют с ВМР при сайте связывания рецептора типа II.
Мануально доведенное выравнивание №оддт и 808Т показало, что эти два полипептида имеют сходство последовательности между №-концевыми частями этих белков и между районами внутренней части (кора). Выравнивание аминокислотных последовательностей представлено на фиг. 10. Остатки цистеина, которые образуют характерный цистиновый узел, были консервативными между №оддт и 808Т. Общая идентичность последовательностей была 24%, а идентичность последовательностей в №концевом связывающем районе (положения 1-45 выравнивания) была 33%. Сообщалось, что два остатка в №-концевом связывающем районе №оддт, а именно, Ьеи (Ь) в положении 21 выравнивания и О1и (Е) в положении 23, играют важную роль в связывании ВМР (Огорре е! а1., кирга). Оба остатка были также консервативными в 808Т. Сходство последовательности в районе кора (положения 131-228 выравнивания) было приблизительно 20%, но каркас сук-узла сохранялся и достаточное количество ключевых остатков были консервативными, подтверждая гомологию между №оддт и 808Т.
Структуру №оддт сравнивали с 808Т также для выяснения, каким образом димеризуются два мономера 808Т. Как показано на фиг. 11, структура №оддт предполагала, что линкер между №-концевым районом и районом кора не только играл роль в соединении этих двух районов, но также образовывал часть границы раздела димеризации между двумя мономерами №оддт. Одним большим различием между №оддт и 808Т было то, что линкер между №-концевым районом и районом кора был гораздо более коротким в 808Т.
С-концевой район 808Т может играть роль в димеризации 808Т. Последовательность №оддт заканчивалась районом кора, тогда как 808Т имел дополнительный С-концевой район. В структуре №оддт дисульфидная связь соединяла С-концы двух мономеров №оддт. Таким образом, С-концевой район 808Т начинался близко к границе раздела двух мономеров и мог способствовать димеризации. Кроме того, предсказание вторичной структуры показало, что некоторые части С-концевого района 808Т имели тенденцию образования спиралей. Этот район в 808Т может быть ответственным за активность димеризации, возможно, через упаковку спираль-спираль, которая имитировала функцию более длинного линкера в №оддт. Другим различием между структурой №оддт и 808Т была инсерция аминокислоты в районе кора 808Т в положениях 169-185 выравнивания (см. фиг. 10). Эта инсерция удлиняла 0-шпильку, которая была направлена к поверхности раздела димеризации в структуре №оддт (показано на фиг. 11 в виде района петли в середине этих мономеров и выше С-концевого остатка Сук). Эта удлиненная βшпилька могла также способствовать димеризации 808Т.
Пример 13. Конструирование и получение пептидных иммуногенов 808Т.
Этот пример описывает конструирование пептидных иммуногенов 808Т, которые используют для иммунизации животных и генерирования антител, которые блокируют взаимодействия между ВМР и 808Т и предотвращают образование димеров мономеров 808Т.
Связывающие ВМР фрагменты.
Общее сходство между 808Т и №оддт и сходство между №-концевыми районами этих двух полипептидов предполагают, что 808Т может взаимодействовать с ВМР подобно взаимодействию №оддт. То есть №-концевой район 808Т может взаимодействовать с сайтами связывания рецептора как типа I, так и типа II на ВМР, а часть района внутренней части (кора) (положения аминокислот 190-220 в выравнивании на фиг. 10) может взаимодействовать с сайтом связывания рецептора типа II таким образом, что антитела, специфические для этих районов 808Т, могут блокировать или нарушать связывание ВМР с 808Т.
Аминокислотные последовательности этих полипептидных фрагментов 808Т для 808Т крысы и человека являются следующими.
5ОЗТ_1Ч_ипкег:
№-концевой район (включает короткий линкер, который соединяется с районом кора)
Человек:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΕΙ-ΟΕΥΡΕΡΡΡΕΙ-ΕΝΝΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚΟνδΕΥδ (3ΕΩ Ю N0:92)
Крыса:
ΟθννθΑΓΚΝΟΑΤΕ1ΙΡΟΙ_ΡΕΥΡΕΡΡΟΕ1_ΕΝΝΟΤΜΝΡΑΕΝΟΟΚΡΡΗΗΡΥΟΤΚθνδΕΥδ (ЗЕО Ю N0:93)
- 53 014525
Часть района кора, которая, вероятно, контактирует с ВМР при его сайте связывания рецептора типа II (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СУ8):
Человек: ΟΙΡΟΡΥΒΑΟΒνθΙΧΟΡΟΟΕΑΡΒΑΒΚνΡί.νΑδΟ (δΕΟ Ю N0:94)
Крыса: ΟΙΡΟΡΥΡΑΟΡνΟΕΕΟΡΟΟΑΑΡΡδΡΚνΚίνΑδΟ (δΕΟ Ю N0:95)
Фрагменты димеризации 808Т.
С-концевой район 808Т, вероятно, участвует в образовании гомодимеров 808Т (см. пример 12). Удлиненная β-шпилька может также играть роль в образовании гомодимера. Антитела, которые специфически связываются с такими районами, могут предотвращать или нарушать димеризацию мономеров 808Т, что, в свою очередь, может подавлять взаимодействие между 808Т и ВМР. Полинентидные фрагменты в 808Т крысы и человека, соответствующие этим районам, являются следующими.
808Т_С: С-концевой район
Человек: ΙΤΡΕΗΝ0δΕΙΚ0Ρ0ΤΕΑΑΡΡ0Κ0ΡΚΡΡΡΒΑΡδΑΚΑΝ0ΑΕ1_ΕΝΑΥ (δΕΟ Ю N0:96)
Крыса: ΙΤΡΡΗΝΟδΕ1_ΚΟΡΟΡΕΤΑΡΡΟΚΟΡΚΡΡΡΒΑΒΟΑΚΑΝΟΑΕ1_ΕΝΑΥ (8Е0
Ю N0:97)
ЗОЗТ_Соге_р1тег. Часть района кора, которая, вероятно, участвует в димеризации 808Т (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СУ8):
Человек: ΟΟΡΑΒΕΕΡΝΑΙΟΡΟΚννννΒΡδΟΡΟΕΒΟ (δΕΟ Ю N0:98)
Крыса: ΟΟΡΑΒΙΕΡΝΑΙ6ΚνΚ\ΛΛ/νΡΡΝΟΡ0ΡΒΟ (8Е0 Ю N0:99)
Связывающий ВМР фрагмент на Мконце 808Т.
Ключевой Мконцевой связывающий район 808Т (положения 1-35 выравнивания на фиг. 10) моделировали на основе структуры комплекса М)ццп1/ВМ1Р-7 (вход № 1М4и Банка данных белков) и выравнивания аминокислотных последовательностей (см. фиг. 10) для идентификации аминокислотных остатков Мконца 808Т, которые, вероятно, взаимодействуют с ВМР. Модель 808Т представлена на фиг. 12. В этой сравнительной модели, фенилаланин (РНе, Е) в положении 8 выравнивания (см. стрелку и сопутствующий текст) в последовательности 808Т выступает в гидрофобный карман на поверхности ВМРдимера. Тот же самый признак выпуклость-в-углубление наблюдали в структуре комплекса ВМР и рецептора типа I (№ске1 е! а1., зирга), где РНе85 этого рецептора соответствует тому же самому карману, что является ключевым признаком узнавания лиганд-рецептор типа I для членов ТСЕ-бетасуперсемейства (включающего в себя, например, ТСЕ-бета-семейство, ВМР-семейство и т.п.). Согласно этой модели, консервативным является также управляемый пролином (Рго) виток, который позволяет N концевому связывающему фрагменту проходить вдоль поверхности ВМР-димера, перемещаясь от сайта связывания рецептора типа I к сайту связывания рецептора типа II на другой стороне этого комплекса. Консервативным является также другой управляемый пролином (Рго) виток вблизи карбокси-конца связывающего фрагмента, который затем соединяется с районом линкера. Сильные контакты между 808Т и ВМР являются очевидными на фиг. 12.
Пептидные иммуногены.
Были сконструированы пептиды для включения Мконцевого района 808Т, который, как было предсказано, осуществляет контакт с ВМР-белками. Эти пептидные последовательности представлены ниже. Для иммунизации животных эти пептидные последовательности были сконструированы так, что они являются перекрывающимися, и был добавлен дополнительный цистеин к С-концу для облегчения сшивания с КРП. Затем эти пептиды использовали для иммунизации. Пептидные последовательности этих иммуногенов являются следующими:
- 54 014525
ЗОЗТ человека:
ΟΟννΟΑΓΚΝϋΑΤΕΙΙΡΕΙ-ΟΕΥ (ЗЕО ГО N0:47)
ΤΕΙΙΡΕΙ_(3ΕΥΡΕΡΡΡΕΙ-ΕΝΝ (ЗЕО ГО N0:48)
ΡΕΡΡΡΕ1_ΕΝΝΚΤΜΝΚΑΕΝ<30 (ЗЕО ГО N0:49)
ΚΤΜΝΡΑΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚ (ЗЕО ГО N0:50)
ΡΡΡΗΗΡΕΕΤΚΟνδΕΥδ (ЗЕО ГО N0:51)
Пептиды ЗОЗТ человека с дополнительным Суз:
ΟΟννΟΑΕΚΝΟΑΤΕπΡΕΙΟΕΥ-Ο (ЗЕО ГО N0:52)
ΤΕΠΡΕΙ.(3ΕΥΡΕΡΡΡΕΙ.ΕΝΝ-0 (ЗЕО ГО N0:53)
ΡΕΡΡΡΕ1_ΕΝΝΚΤΜΝΡΑΕΝ60-0 (ЗЕО ГО N0:54)
ΚΤΜΝΚΑΕΝΟΟΚΡΡΗΗΡΡΕΤΚ-С (ЗЕО ГО N0:55) ΚΡΡΗΗΡΡΕΤΚ0ν3ΕΥ3-0 (ЗЕО ГО N0:56)
ЗОЗТ крысы:
ΟΟννΟΑΡΚΝϋΑΤΕΙΙΡΟΙΡΕΥΡΕΡΡ (ЗЕО ГО N0:57)
ΡΕΡΡΟΕΙ-ΕΝΝΟΤΜΝΕΑΕΝΟΟ (ЗЕО ГО N0:58)
ΕΝΟΟΠΡΡΗΗΡΥϋΤΚϋνδΕΥδ (ЗЕО ГО N0:59)
ΤΕΙΙΡΟΙ_ΡΕΥΡΕΡΡΟΕΙ_ΕΝΝ (ЗЕО ГО N0:60) Пептиды ЗОЗТ крысы с дополнительным Суз:
ΟΟννΟΑΡΚΝϋΑΤΕΙΙΡΟΙΡΕΥΡΕΡΡ-Ο (ЗЕО ГО N0:61)
ΡΕΡΡ0Εί_ΕΝΝ0ΤΜΝΡΑΕΝ(30-0 (ЗЕО ГО N0:62)
ΕΝΟΟΡΡΡΗΗΡΥΟΤΚϋνδΕΥδ-Ο (ЗЕО ГО N0:63) ΤΕΙΙΡ<31_ΡΕΥΡΕΡΡ0ΕΙ_ΕΝΝ-0 (ЗЕО ГО N0:64)
Следующие пептиды были сконструированы таким образом, что они содержат аминокислотную часть района кора, которая, согласно предсказанию, осуществляет контакт с ВМР-белками. Цистеин добавляли на С-конце каждого пептида для конъюгации с КЬН, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации. В Оосктд Соге №!егтта1 Рерббе внутренний цистеин заменяли на серин во избежание двойной конъюгации с КЬН.
Для 808Т человека:
Аминокислотная последовательность без добавленных остатков Сук:
. □оск1пд_Соге_М-(епти‘па1_Рер(1с1е: ΙΡϋΡΥΡΑΟΡνΟίΙΟΡΟΟΕΑΡ (ЗЕО ГО
N0:66)
Ооск1пд_Соге_С-1епп1па1_Рер(1с1е: 0Ι_Ι_0Ρ(36ΕΑΡΡΑΡΚνΡΐνΑδ (ЗЕО ГО
N0:67)
Аминокислотная последовательность с добавленными остатками Сук:
□оск1пд_Соге_М4егт1па1_Рер11с1е: ΙΡϋΚΥΕΙΑ0Κν0Ι_Ι_0Ρ06ΕΑΡ-0 (ЗЕО Ю
N0:68)
Ооск1пд_Соге_С4егт1па1_РерЬ’с1е: ΟίΕΟΡΟΟΕΑΡΡΑΡΚνΡίνΑδ-Ο (ЗЕО Ю
N0:69)
Для 808Т крысы:
Аминокислотная последовательность без добавленных или замененных остатков Сук:
Ооск1пд_Соге_М-1егт1па1_Рер11с1е: ΙΡϋΚΥΚΑΟΡνθΙ-1-ЗРбС (ЗЕО Ю N0:70) □оск1пд_Соге_С4егт1па1_Рерйс1е: ΡΟΟΑΑΡΚδΚΚνΚΙΛ/Αδ (ЗЕО Ю N0:71) Пептидные иммуногены с добавленными или замененными остатками Суз: Ооск1пд._Соге_М4егт1па1_Рерйс1е: ΙΡΟΚΥΚΑΟΚνΟίΧδΡΟΟ-Ο (ЗЕО Ю N0:72) Ооск1пд_Соге_С-{егт1па1_Рер{1с1е: ΡΘΘΑΑΡΚδΚΚνκΙΑ/Αδ-Ο (8Е0 Ю N0:73)
Два района в 808Т, которые потенциально взаимодействуют с образованием гомодимеров 808Т, включают аминокислоты с районом кора 808Т, которые не присутствуют в ^ддш. Пептиды 808Т человека, сконструированные таким образом, что они содержат эту последовательность, имели С-концевой Сук или ^концевой Сук, который был конъюгирован с КЬН. Для пептида 808Т крысы цистеин добавляли к карбокси-концу последовательности (8Ε^ ΙΌ N0: 76). Конъюгированные с КЬН пептиды использовали для иммунизации.
- 55 014525
Для δΟδΤ человека:
ΟΟΡΑΕΦΙΡΝΑΙΟΚΟΚννννΚΡδ (ЗЕО Ю N0:74)
ΙΟΡΟΚννννΡΡδΟΡΟΡΡΟ (ЗЕО Ю N0:75)
Для δΟδΤ крысы:
ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡϋΡΡ (δΕΟ Ю N0:76) Пептид δΟδΤ крысы с добавленным цистеином ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡΟΕΚ-С (ЗЕО Ю N0:77)
Второй район в 8О8Т, который потенциально взаимодействует с образованием гомодимеров 8О8Т, включает С-концевой район. Пептидные иммуногены конструировали таким образом, чтобы они включали аминокислотные последовательности в этом районе (см. ниже). Для конъюгации с КЬН добавляли остаток цистеина к С-концевой стороне, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации.
Для δΟδΤ человека:
ΚΠΙ-ΤΠΓΗΝΩδ Ε1_ΚΩΡΩΤΕΑΑ (δΕΩ Ю N0:78)
ΕίΚΩΡΩΤΕΑΛ ΡΡΩΚΩΡΚΡΡΡ (δΕΩ Ю N0:79) ΠΡΩΚΩΠΚΡΡΡ ίΤΑΡδΑΚΑΝΩΑ (δΕΩ Ю N0:80) ΡΑΗδΑΚΑΝΩΑ ΕΙ.ΕΝΑΥ (δΕΩ Ю N0:81) Пептидные иммуногены с Суз, добавленным на С-конце: ΚΚΙ/ΓΉΡΗΝΩδ Ε1_ΚΩΕΩΤΕΑΑ-Ω (δΕΩ Ю N0:82) ΕΙ_ΚϋΕΩΤΕΑΑ РРОКСРКРРР-С (δΕΩ Ю N0:83) ΡΡΩΚΟΡΚΡΡΡ ΡΑΡδΑΚΑΝΩΑ-С (δΕΩ Ю N0:84) ΡΑΚδΑΚΑΝΩΑ ΕΙ_ΕΝΑΥ-Ω (δΕΩ Ю N0:85) Для δΟδΤ крысы:
ΚΡί.ΤΚΡΗΝΩδΕΙ_Κ0Ρ(3ΡΕΤΑΡΡΩ (δΕΩ Ю N0:86) ΚΩΡΚΡΚΡΚΑΡΟΑΚΑΝΩΑΕΙ-ΕΝΑΥ (δΕΩ Ю N0:87) δΕΙ.ΚΟΕΩΡΕΤΑΚΡΩΚΩΡΚΡΚΡΠΑΠ (δΕΩ Ю N0:88) Пептидные иммуногены с Суз, добавленным на С-конце: ΚΚί-ΤΡΕΗΝΩδΕί-ΚΟΕΩΡΕΤΑΡΡΩ-Ω (δΕΩ Ю N0:89) ΚΩΡΚΡΡΡΚΑΡΟΑΚΑΝΩΑΕΙΕΝΑΥ-С (δΕΩ Ю N0:90) δΕΙΚΩΡΩΡΕΤΑΡΡΩΚΩΗΚΡΡΡΡΑΡ-С (δΕΩ Ю N0:91)
Пример 14. Анализ для детектированы связывания антител с ТСР-бета-связывающим белком.
Этот пример описывает анализ для детектирования связывания лиганда, например антитела или фрагмента антитела, со склеростином.
Слитый белок РЕЛО®-склеростин получали в соответствии с протоколами, обеспеченными изготовителем (81§та ЛИпсИ, 8!. Ьошк, МО), и как описано в патенте США № 6395511. Каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета покрывают моноклональным антителом против РЬЛО® (81§та ЛИпсИ) и затем блокируют 10% БСА в ФСБ. Слитый белок (20 нг) добавляют к 100 мкл ФСБ/0,2% БСА и адсорбируют на 96-луночном планшете в течение 60 мин при комнатной температуре. Этот раствор белка удаляют, и лунки промывают для удаления несвязанного слитого белка. ВМР, например, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 или ВМР-7, разводят в ФСБ/0,2% БСА и добавляют в каждую лунку при концентрациях в диапазоне 10 пМ-500 нМ. После инкубирования в течение 2 ч при комнатной температуре этот раствор для связывания удаляют, и планшет промывают три раза 200 мкл ФСБ/0,2% БСА. Связывание ВМР со склеростином детектируют с использованием поликлональной сыворотки или моноклонального антитела, специфических в отношении ВМР, и подходящего фермент-конъюгированного реагента второй стадии в соответствии со стандартными способами ЕЫ8Л (см., например, ЛикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1 Вю1. Уо1. 2, 11.2.1-11.2.22 (1998)). Специфическое связывание рассчитывают вычитанием неспецифического связывания из общего связывания и анализируют с использованием программы ЬЮЛИЭ (Мипкоп апб РобЬагб, Лпа1. ВюсИет. 107:220-39 (1980)).
Связывание склеростина с ВМР детектируют также гомогенным детектированием с разделенной во времени флуоресценцией (Ме11ог е! а1., I. Вюто1. 8сгееп1пд, 3:91-99 (1998)). Полинуклеотидную последовательность, кодирующую склеростин, функционально связывают с константной областью иммуноглобулина человека в рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты и экспрессируют в виде слитого белка Рс человека-склеростин в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Подобным образом, лиганд ВМР конструируют и экспрессируют в виде слитого белка ВМРмышиный Рс. Эти два слитых белка инкубируют вместе и анализ проводят, как описано Ме11ог е! а1.
Пример 15. Анализ-скрининг на антитела, которые ингибируют связывание членов ТСР-бетасемейства с ТСР-связывающим белком.
Этот пример описывает способ для детектирования антитела, которое ингибирует связывание члена ТСР-бета-семейства со склеростином. ЕЫ8Л выполняют, по существу, как описано в примере 14, за ис
- 56 014525 ключением того, что концентрацию ВМР поддерживают фиксированной при ее Кс (определенной, например, анализом ВМсоге). Кроме того, антитело или библиотеку или коллекцию антител добавляют в лунки до концентрации 1 мкМ. Антитела инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с ВМР и склеростином, раствор удаляют и связанный ВМР определяют количественно, как описано (см. пример 14). Антитела, которые ингибируют 40% связывания ВМР, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают антагонистами этого взаимодействия. Эти антитела дополнительно оценивают в качестве потенциальных ингибиторов выполнением исследований с титрованием для определения их констант ингибирования и их действия на связывающую аффинность ТСР-бета-связывающего белка. Анализы контролей сравнимой специфичности могут быть также проведены для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентного исследования с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
Пример 16. Ингибирование локализации ТСР-бета-связывающего белка в матриксе кости.
Оценку ингибирования локализации в матриксе кости (гидроксиапатите) проводят с использованием модификаций в отношении способа Николаса (№со1ак, V. Са1с1П Т1ккие Ш!. 57:206-12 1995). Вкратце, '^-меченый ТСР-бета-связывающий белок получают, как описано №со1ак (кирга). В каждую лунку 96луночного планшета, снабженную полипропиленовой фильтрующей мембраной (Ро1уП11гоп1с, Аеутои!Е МА), добавляют гидроксиапатит. ТСР-бета-связывающий белок, разведенный в 0,2% альбумине в ФСБ, затем добавляют в лунки. Лунки, содержащие матрикс, промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный ТСР-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М ИаОН и затем определяют количественно.
Антитело, которое ингибирует или нарушает связывание ТСР-бета-связывающего белка склеростина с гидроксиапатитом, идентифицируют посредством инкубирования ТСР-бета-связывающего белка с этим антителом и нанесением этой смеси на матрикс, описанный выше. Матрикс промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный склеростин элюируют с использованием 0,3 М ИаОН и затем определяют количественно. Антитело, которое ингибирует уровень связывания склеростина с гидроксиапатитом по меньшей мере на 40% по сравнению с уровнем связывания, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают ингибиторами локализации в кости. Такое антитело дополнительно характеризуют посредством исследований доза-ответ для определения его константы ингибирования и его влияния на связывающую аффинность ТСР-бета-связывающего белка.
На основании вышеизложенного, хотя конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны для целей иллюстрации, различные модификации могут быть произведены без отклонения от идеи и объема данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, за исключением прилагаемой формулы изобретения.
- 57 014525
Список последовательностей
ΞΕΰϋΕΝΟΕ ΒΙ3ΊΊΝ0 <110> Вгипкон, Магу Е.
0а1аз, ϋθνίά σ.
КоУасеу1сН, Вг1ап
МиШдап, ОоЬп Т.
Раерег, Вгуап И.
Уап Ыезз, йе££геу
И1пк1ег, Оау±с1 0.
<12 0 > С0МР031Т10НЗ МП? МЕТНСЮЗ РОК.
ΙΝΟΒ,ΕΆΒΙΝΟ ΒΟΝΕ ΜΙΝΞΗΆΒΙΖΑΤΙΟΝ
<130> 60117-136
<140>
<141> 2004-06-15
<150> ИЗ 10/463,190
<151> 2003-06-16
<160> 143
<170> ЕазЕЗЕО £ог Пхпскжз Уегзхоп 3.0
<210> 1
<211> 2301
<212> ΌΝΑ
<213> Ното заръеп
<400> 1
ададссЕдЪд сЬасЬддаад дЬддсдЪдсс сЕссЕсЕддс ЬддЬассаЬд садсЬсссас 60 ЬддсссЪдЕд ЬсРсдЬсЬдс сбдсЕддРас асасадссЕЕ ссдЕдЕадЬд дадддссадд 120 ддрддсаддс дРЬсаадааЪ даЬдссасдд аааЬсаЪссс сдадсЕсдда дадЕассссд 180 адссРссасс ддадсЬддад аасаасаада ссаЕдаассд ддсддадаас ддадддсддс 240 сЕссссасса ссссЕЬЕдад -ассааадасд ЕдЬссдадЕа садсЬдссдс дадсЕдсасЬ 300 РсасссдсЕа сдрдассдаб дддссдЬдсс дсадсдссаа дссддСсасс дадсЕддЕдР 360 дсЕссддсса дрдсддсссд дсдсдссЬдс Ьдсссаасдс саЬсддссдс ддсаадЕддС 420 ддсдассЕад Ьдддсссдас РЬссдсСдса Ессссдассд сСассдсдсд садсдсдЬдс 480 адсЬдсРдЬд ЬсссддЕддЕ даддсдссдс дсдсдсдсаа ддЬдсдссЕд дЕддссЬсде 540 дсаадЕдсаа дсдссЬсасс сдсбЬссаса ассадЪсдда дсбсааддас ЬЪсдддассд 600· аддссдсЕсд дссдсадаад ддссддаадс сдсддссссд сдсссддадс дссааадсса 660 ассаддссда дсЕддадаас дссЬасЬада дсссдсссдс дссссЕсссс ассддсдддс 720 дссссддссс Рдаасссдсд ссссасаЬЕЬ сЕдСссЕсЕд сдсдЬддЬЕЬ даЕЕдбЬЬаЬ 780 аЬЬЬсаЕЕдР аааРдссЕдс аасссадддс адддддсбда дассЕЕссад дсссЕдадда 840 аЬсссдддсд ссддсааддс сссссЬсадс ссдссадсЕд аддддЕссса сддддсаддд 900 дадддааЬЬд ададЕсасад асасЕдадсс асдсадсссс дссЬсЬдддд ссдссЕассЕ 960 РЪдсЬддЕсс сасЬЕсадад даддсадааа ЕддаадсаЬЕ ЕЬсассдссс ЬддддЕЕЬЬа 1020 адддадсддр дбдддадЬдд дааадСссад ддасЕддЕЕа адааадЬЬдд аЕаадаЕЕсс 1080 сссЕЕдсасс ЕсдсЬдссса Рсадааадсс ЕдаддсдЕдс ссададсаса адасЬддддд 1140 саасЬдЕада ЬдЕддЕЬЕсЬ адЬссЬддсЕ сЬдссасЬаа сЫздсбдЬдЬ аассЕЕдаас 1200 ЪасасааЕЕс ЕссЬЬсддда ссЕсааЬЬЕс сасЬРЕдЬаа ааЕдадддЪд даддбдддаа 1260 ЬаддаЕсЕсд аддадасЕаЕ ЬддсаЕаЬда Ызссааддао ЬссадЬдссЕ ЬРЕдааЕддд 1320 сададдЬдад ададададад адааададад адааЬдааЕд садЕЬдсаЬЬ даеесадЬдс 1380 сааддСсасС РссадааРЬс ададЬЕдрда ЬдсЬсЕсЬЕс Ьдасадссаа адаЬдааааа 1440
- 58 014525 сааасадааа ЕссЕддаада сссЕссаЕсЕ ддЬдддаддд асссаЕадсс ссЕЕдсаддс саосдссЕЕс ЕсЕЕасаЕдЕ дсЕдЕасаЕа ааЕсаЕЕЕсс ЕЕЕааасада ЕЕссасдЕдд аЕЕЕаЕЕЕЕс ааЕаЕЕдсЕЕ асааЕдааЕс ааааааадЕа адсЕаЕдсЕд сааадаааЕа аЕадаааЕса аЕдЕЕЕЕааа ссдадддадс Едсссассас даЕддсаЕаЕ ЕдсЕдадааа адасаассЕс адсасаЕдас дасЕЕдЕсса ЕсасЕЕаадЕ ЕаЕдааЕЕаа .аЕдассдааа аададЕсЕаЕ сЕЕсссадсс асаЕсаЕоса саЕссдсссс дЕсассЕЕсс адссаЕсаса Есасддасас сЕЕасасЕаа сЕдсададса ЕЕасЕЕЕсЕд аЕаЕдааадс саадааЕдаа ЕаЕЕЕаЕдса садЕсЕдЕЕс 9
ЕЕаЕддсЕда ЕддсЕЕСССС ЕЕддддЕада аасЕЕсссаа даададаадЕ аасЕсасада аЕЕЕсЕдссЕ аадааЕаЕЕа ЕааЕадсЕдс ЕдЕадЕЕЕЕЕ сЕдсаддасЕ адЕадЕддЕЕ ааадЕЕЕЕЕс ЕЕссададЕс саЕаЕЕЕасд ддаЕдЕЕЕдд аааддададд ададсадсаЕ даааддЕЕса ссадсасаЕс адаааасадс ЕЕдддддааа сасссааааа ааЕЕдЕЕааа ддЕсдЕЕЕЕЕ ЕЕЕааададЕ ЕЕдЕададаа сададасаЕЕ дсЕдасааас сЕассЕссас дЕссдадддЕ сссЕссоосд аддасасЕдд ссЕЕЕЕдада ЕЕсЕЕасЕдс аасЕасаадЕ ЕсЕЕЕЕЕдаа аааааааадЕ ЕЕддсааЕЕс ЕаадЕЕасаЕ ЕдасааЕдЕЕ дЕЕааЕааад
1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2301 <210> 2 <211> 213' <212> РКТ <213> Ното зариеп <400> 2
МеЕ 1 Θΐη Ьеи Рго Ьеи 5 А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 10 Суз Ьеи Ьеи Уа1 Низ 15 ТЬг
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 О1и (31у С1п С1у Тгр (31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг (31и Не 11е Рго (31и Ьеи С1у О1и Туг Рго <31и Рго Рго Рго
35 40 45
<31и Ьеи С1и Азп Азп Ьуз ТЬг МеЕ Азп Агд А1а <31и Азп <31у С1у Агд
50 55 60
Рго РГО Низ Низ Рго РЬе (31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд С1и Ьеи Нйз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр <31у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг <31и Ьеи Уа1 Суз Зег <31 у <31п Суз (31у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е С1у Агд б1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
О1у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1
130 135 140
<31п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у С1у <31и А1а РГО Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 15 5 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Низ Азп <31п
165 170 175
Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе <31у ТЬг С1и А1а А1а Агд Рго Θΐη Ьуз (31у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп <31п А1а <31и
195 200 205
Ьеи (31и Азп А1а Туг
210 <210> 3 <211> 2301 <212> ША <213> Ното зариеп <400> 3 ададссЬдЬд еддсссЬдЬд ддЬддсаддс адссессасс сессссасса ЬсасссдсЬа дсессддсса ддсдассЬад адсЬдседЬд дсаадЬдсаа аддссдсЬсд ассаддседа дссссддссс аееесаЬЬдЬ аЬсссдддсд дадддааСЬд ЬЬдсЬддесс адддадедде сссеедсасс сааседЬада еасасааеес Ьаддаесесд сададдЬдад сааддесасе сааасадааа Ьсседдаада сссЬссаЬсЬ ддЬдддаддд асссаЬадсс ссЬЬдсаддс сассдссеес ЬсЬеасаЬдЬ дсЬдЬасаеа ааесаЬЬесс Ьссааасада еЬссасдЬдд аеееаееььс ааЬаеедсее асааЬдааЬс сеасСддаад есЬсдесЕдс дЪЬсаадаае ддадсЬддад ссссееедад сдЬдассдае дЬдсддсссд Сдддсссдас есссддЬдде дсдссесасс дссдсадаад дсЬддадаас едаасссдсд аааЬдсседс ссддсааддс ададЬсасад сасЬСсадад дЬдддадЬдд есдседесса едеддееЕсе ессеесддда аддадасЪае ададададад ессадааеес ааааааадка адсЬабдсЬд сааадаааеа аЕадаааЬса аЬдСЕЬЬааа ссдадддадс едсссассас даеддсаЕаЬ едсЕдадааа адасаассес адсасасдас дасеедесса есасееааде еаедааееаа аедассдааа деддсдСдсс седседдЕас даЕдссасдд аасаасаада ассааадаед дддссдЕдсс дсдсдссЕдс ЕЕссдсЕдса даддсдссдс сдсЕЕссаса ддссддаадс дссЕасЕада ссссасаЕЕЕ аасссадддс сссссЕсадс асасЕдадсс даддсадааа дааадЕссад Есадааадсс адЕссЕддсЕ ссЕсааЕЕЕс ЕддсаЕаЕда адааададад ададЕЕдЕда аададЕсЕаЕ сЕЕсссадсс асаЕсаЕсса саЕссдсссс дЕсассЕЕсс адссаЕсаса Есасддасас сЕЕасасЕаа сЕдсададса еьасьеьсьд асасдааадс саадааЕдаа ЕаЕЕЕаЕдса садЕсЕдЕЕс д сЕссЕсЕддс асасадссЕЕ аааЕсаЕссс ссаЕдаассд ЕдЕссдадСа дсадсдссаа Едсссаасдс Ессссдассд дсдсдсдсаа ассадЕсдда сдсддссссд дсссдсссдс сЕдессСсед адддддсьда ссдссадсЕд асдсадсссс ЕддаадсаЕЕ ддасЕддЕЕа ЕдаддсдЕдс сЕдссасЕаа сасЕЕЕдЕаа ЕЕссааддас адааЕдааЕд ЕдсЕсЕсЕЕс ЕЕаЕддсЕда ЕддсЕЕсссс ььдддд^ада аасЕЕсссаа даададаадЕ аасЕсасада аЕЕЕсЕдссЕ аадааЕаЕЕа ЕааЕадсЕдс ЕдЕадЕЕЕЕЕ сЕдсаддасЕ адЕадЕддЕЕ ааадЕЕЕЕЕс ЕЕссададЕс
ЕддЕассаЕд ссдЕдЕадЕд сдадсЕсдда ддсддадаас садсЕдссдс дссддЕсасс саЕсддссдс сЕассдсдсд ддЕдедесЕд дсЕсааддас сдсссддадс дссссЕсссс сдедЕддЕЕЕ дассЕЕссад аддддЕссса дссЕсЕдддд ЕЕсассдссс адааадЕЕдд ссададсаса сЕЕдсЕдЕдЕ ааЕдадддЕд ЕссадЕдссЕ садЕЕдсаЕЕ Ьдасадссаа саЕаЕЕЕасд ддаЕдЕЕЕдд аааддададд ададсадсаЕ даааддЕЕса ссадсасаЕс адаааасадс еедддддааа сасссааааа ааЕЕдЕЕааа ддЕсдЕЕЕЕЕ ЕЕЕааададЕ ЕЕдЕададаа сададасаЕЕ садсЕсссас дадддсЕадд дадЕассссд ддадддеддс дадсЕдсасЕ дадсЕддЕдЕ ддсаадЕддЕ садсдсдЕдс дЕддссЕсде ЕЕсдддассд дссааадсса ассддсдддс даЕЕдЕЕЕаЕ дсссЕдадда еддддсаддд ссдссЕассЕ ьдддд^ь^ьа аЕаадаЕЕсс адасЕддддд аассЕЕдаас даддЕдддаа ЕЕЕдааЕддд даЕЕсадЕдс адаЕдааааа дсЕдасааас сЕассЕссас дЕссдадддЕ сссЕсссссд аддасасЕдд ссЕЕЕЕдада ЕЕсЕЕасЕдс аасЕасаадЕ есееьЕЕдаа аааааааадЕ ЕЕддсааЕЕс ЕаадЕЕасаЕ ЕдасааЕдЕЕ дЕЕааЕааад
120
180
240 300 360 42 0
480 540 600
660 72 0
780 840 900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 п 1 η л ώ х и и 2160 2220 2280 2301
<210> 4
<211> 23
<212> РВ.Т
<213> Ното зар1еп
<400> 4
МеЕ О1п Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 Суз Ьеи Ьеи Уа1 Н1з ТЬ.г
1 5 10 15
А1а РЬ.е Агд Уа1 Уа1 О1и С1у
<210> 5 <211> 2301 <212> ЬЫА <213> Ното зархеп <400> 5
- 60 014525 ададссЕдЕд сЕасЕддаад дЕддсдЕдсс сЕссЕоЕддс ЕддЕассаЕд садсЕсссас60
ЕддсасЕдЕд ЕсЕсаЕсЕдс сЕдсЕддЕас асасадссЕЕ ссдЕдЕадЕд дадддссадд120 ддЕддсаддс дЕЕсаадааЕ даЕдссасдд аааЕсаЕссд сдадсЕсдда дадЕассссд180 адссЕссасс ддадсЕддад аасаасаада ссаЕдаассд ддсддадаас ддадддсддс240 сЕссссасса ссссЕЕЕдад ассааадасд ЕдЕссдадЕа садсЕдссдс дадсЕдсасЕ300
ЕоасссдсЕа сдЕдассдаЕ дддссдЕдсс дсадсдссаа дссддЕсасс дадсЕддЕдЕ360 дсЕссддсса дЕдсддсссд дсдсдссЕдс Едссоаасдс саЕсддссдс ддсаадЕддЕ420 ддсдассЕад Ьдддсссдас ЕЕссдсЕдса Ессссдассд сЕассдсдсд садсдсдЕдс480 адсЕдсЕдЕд ЕсссддЕддЕ даддсдссдс дсдсдсдсаа ддЕдсдссЕд дЕддссЕсдЕ540 дсаадЕдсаа дсдссЕсасс сдсЕЕссаса ассадЕсдда дсЕсааддас ЕЕсдддассд600 аддссдсЕсд дссдсадаад ддссддаадс сдсддссссд сдсссддадс дссааадсса660 ассаддссда дсЕддадаас дссЕасЕада дссодсссдс дссссЕсссс ассддсдддс720 дссссддссс Едаасссдсд ссссасаЕЕЕ сЕдЕссЕсЕд сдсдЕддЕЕЕ даЕЕдЕЕЕаЕ780 аЕЕЕсаЕЕдЕ аааЕдссЕдс аасссадддс адддддсЕда дассЕЕссад дсссЕдадда840 аЕсссдддсд ссддсааддс сссссЕсадс ссдссадсЕд аддддЕссса сддддсаддд900 дадддааЕЕд ададЕсасад асасЕдадсс асдсадсссс дссЕсЕдддд ссдссЕасоЕ960
ЕЕдсЕддЕсс сасЕЕсадад даддсадааа ЕддаадсаЕЕ ЕЕсассдссс ЕддддЕЕЕЕа1020 адддадсддЕ дЕдддадЕдд дааадЕссад ддасЕддЕЕа адааадЕЕдд аЕаадаЕЕсс1080 сссЕЕдсасс ЕсдсЕдссса Есадааадсс ЕдаддсдЕдс ссададсаса адасЕддддд1140 саасЕдЕада ЕдЕддЕЕЕсЕ адЕссЕддсЕ сЕдссасЕаа сЕЕдсЕдЕдЕ аассЕЕдаас1200
ЕасасааЕЕс ЕссЕЕсддда ссЕсааЕЕЕс сасЕЕЕдЕаа ааЕдадддЕд даддЕдддаа1260
ЕаддаЕсЕсд аддадасЕаЕ ЕддсаЕаЕда ЕЕссааддас ЕссадЕдссЕ ЕЕЕдааЕддд1320 сададдЕдад ададададад адааададад адааЕдааЕд садЕЕдсаЕЕ даЕЕсадЕдс1380 сааддЕсасЕ ЕссадааЕЕс ададЕЕдЕда ЕдсЕсЕсЕЕс Едасадссаа адаЕдааааа1440 сааасадааа ааааааадЕа аададЕсЕаЕ ЕЕаЕддсЕда саЕаЕЕЕасд дсЕдасааас1500
ЕссЕддаада адсЕаЕдсЕд сЕЕсссадсс ЕддсЕЕсссс ддаЕдЕЕЕдд сЕассЕссас1560 сссЕссаЕсЕ сааадаааЕа асаЕсаЕсса ЕЕддддЕада аааддададд дЕссдадддЕ1620 ддЕдддаддд аЕадаааЕса саЕссдсссс аасЕЕсссаа ададсадсаЕ сссЕсссссд1680 асссаЕадсс аЕдЕЕЕЕааа дЕсассЕЕсс даададаадЕ даааддЕЕса аддасасЕдд1740 ссЕЕдсаддс ссдадддадс адссаЕсаса аасЕсасада ссадсасаЕс ссЕЕЕЕдада1800 сассдссЕЕс Едсссассас Есасддасас аЕЕЕсЕдссЕ адаааасадс ЕЕсЕЕасЕдс1860
ЕсЕЕасаЕдЕ даЕддсаЕаЕ сЕЕасасЕаа аадааЕаЕЕа ЕЕдддддааа аасЕасаадЕ1920 дсЕдЕасаЕа ЕдсЕдадааа сЕдсададса ЕааЕадсЕдс сасссааааа ЕсЕЕЕЕЕдаа1980 ааЕсаЕЕЕсс адасаассЕс ЕЕасЕЕЕсЕд ЕдЕадЕЕЕЕЕ ааЕЕдЕЕааа аааааааадЕ2040
ЕЕЕаааоада адсасаЕдас аЕаЕдааадс сЕдсаддасЕ ддЕсдЕЕЕЕЕ ЕЕддсааЕЕс2100
ЕЕссасдЕдд дасЕЕдЕсса саадааЕдаа адЕадЕддЕЕ ЕЕЕааададЕ ЕаадЕЕасаЕ2160 аЕЕЕаЕЕЕЕс ЕсасЕЕаадЕ ЕаЕЕЕаЕдса ааадЕЕЕЕЕс ЕЕдЕададаа ЕдасааЕдЕЕ2220 ааЕаЕЕдсЕЕ ЕаЕдааЕЕаа садЕсЕдЕЕс ЕЕссададЕс сададасаЕЕ дЕЕааЕааад2280 асааЕдааЕс аЕдассдааа д2301 <210> 6 <211> 213 <212> РРТ <213> Ното заргеп <400> 6
МеЕ 1 (31 η Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Не Суз Ьеи Ьеи Уа1 Н±з 15 ТЬг
5 10
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 <31и (31у (31 п (31у Тгр αΐη А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг О1и 11е 11е Агд <31и Ьеи (31у (31и Туг Рго С1и Рго Рго Рго
35 40 45
С1и Ьеи О1и Азп Азп Ьуз ТЬг МеЕ Азп Агд А1а (31и Азп (31у (31у Агд
50 55 60
Рго Рго НЬз НЬз Рго РЬе <31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег (31и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд О1и Ьеи ΗΪ3 РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр О1у Рго Суз Агд Зег
- 61 014525
85
А1а Ьуз Рго νβΐ 100 ТЬг <31и Ьеи Уа1
Агд Ьеи Ьеи 115 Рго Азп А1а Не (31у 120
61 у Рго 13 0 Азр РЬе Агд Суз 11е 135 Рго
61п 145 Ьеи Ьеи Суз Рго 61у 150 С1у О1и
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз 165 Ьуз Суз Ьуз
Зег С1и Ьеи Ьуз 180 Азр РЬе С1у ТЬг
Агд Ьеи Ьуз 01и 210 Рго 195 Азп Агд А1а Рго Туг Агд А1а Агд 200
90 95
Суз 105 Зег С1у 61п Суз <31у 110 Рго А1а
Агд <31у Ьуз Тгр Тгр 125 Агд Рго Зег
Азр Агд Туг Агд 140 А1а <31п Агд Уа1
А1а Рго Агд 155 А1а Агд Ьуз Уа1 Агд 160
Агд Ьеи 170 ТЬг Агд РЬе Н1з Азп 175 О1п
С1и 185 А1а А1а Агд Рго С1п 190 Ьуз 61у
Зег А1а Ьуз А1а Азп 205 О1п А1а О1и
<210> 7 <211> 2301 <212> ΟΝΑ <213> Ното заргеп <400 ададссСдЬд ЬддсссСдЬд ддЬддсаддс адссЬссасс с ^ссссз.с с а СсасссдсСа дсЬссддсса ддсдассСад адсСдсСдСд дсаадСдсаа аддссдсЬсд ассаддссда дссссддссс аССЬсаЬСдС аЬсссдддсд дадддааССд ЬСдсЬддСсс адддадсддС сссССдсасс саасСдСада ЬасасааСЬс СаддаСсСсд сададдСдад сааддЬсасС сааасадааа ЬссСддаада сссЬсса&сС ддЬдддаддд асссаСадсс ссЬЬдсаддс сассдссССс СсЬЬасаЬдС дсЬдСасаСа > 7 сСасЬддаад СсСсдСсЬдс дССсаадааС ддадсЬддад ссссЬЬЬдад сдСдассдаС дЬдсддсссд Сдддсссдас ЬсссддСддЬ дсдссСсасс дссдсадаад дсЬддадаас Сдаасссдсд аааЬдссЬдс ссддсааддс ададЬсасад сасССсадад дСдддадЬдд ЬсдсЬдссса СдСддССЬсС ЬссЬЬсддда аддадасЬаЬ ададададад ЬссадааЬСс ааааааадСа адсЬаСдсЬд сааадаааЬа аЬадаааСса аЬдСЬЬСааа ссдадддадс Ьдсссассас даСддсаСаЬ СдсСдадааа дьддсдедсс сЬдсЬддСас даСдссасдд аасаасаада 3 ЛЛЧ О ОГГ-З ПГ» дддссдСдсс дсдсдссСдс СЬссдсЬдса даддсдссдс сдсСЬссаса ддссддаадс дссСасСада ссссасаЬСЬ аасссадддс сссссЬсадс асасЬдадсс даддсадааа дааадСссад Ьсадааадсс адЬссЬддсЬ ссЬсааСССс КддсаЬаЬда адааададад ададЬСдСда аададСсЪаС сССсссадсс асаЬсаСсса саСссдсссс дЬсассЬСсс адссаСсаса Ссасддасас сЬЬасасСаа сСдсададса сЬссСсСддс асасадссЬС аааЬсаСссд ссаЬдаассд ♦“ ζτ4~ /л/»<№ гт4- а а ν. х- ν <-л дсадсдссаа Сдсссаасдс Ьссссдассд дсдсдсдсаа ассадСсдда сдсддссссд дсссдсссдс сСдСссСсСд адддддсСда ссдссадсЬд асдсадсссс СддаадсаСЬ ддасСддЬЬа СдаддсдСдс сСдссасСаа сасСЬЬдСаа СЬссааддас адааСдааЬд ЬдсЬсСсЬСс ССаЬддсЬда ЬддсЬСсссс ь^ддддьада аасССсссаа даададаадС аасЬсасада аССЬсЬдссС аадааЬаЬСа СааЬадсСдс
СддСассаСд ссдЬдСадЬд сдадсЬсдда ддсддадаас саде Сдс сдс дссддЬсасс саСсддссдс сСассдсдсд ддЬдсдссСд дсСсааддас сдсссддадс дссссСсссс сдсдСддСЬС дассСЬссад аддддЬссса дссЬсЬдддд ССсассдссс адааадССдд ссададсаса сЬЬдсСдСдС ааСдадддСд СссадЪдссС садССдсаСЬ Ьдасадссаа саЬаЬСЬасд ддаЬдСЬСдд аааддададд ададсадсаС даааддСЬса ссадсасаСс адаааасадс ьсдддддааа сасссааааа садсСсссас дадддссадд дадЬассссд ддадддсддс дадсСддЬдС ддсаадЬддС садсдсдСдс дСддссЬсдС ССсдддассд дссааадсса ассддсдддс даССдССЬаС дсссЬдадда сддддсаддд ссдссЬассЬ ьддддьсеса аЬаадаСЬсс адасСддддд аассСЬдаас даддЬдддаа ЬССдааСддд даСЬсадСдс адаЬдааааа дсЬдасааас сСассСссас дСссдадддС сссЬсссссд аддасасСдд ссСЬЬЬдада ССсСЬасЬдс аасЬасаадС СсСЬЬССдаа
120
180 240 О пл «д ν ν
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 192 0 1980
- 62 014525 ааксаккксс кккааасада ккссасдкдд акккаккккс аакаккдскк асаакдаакс адасаасскс адсасакдас дасккдксса ксасккаадк какдааккаа акдассдааа ккаскккскд акакдааадс саадаакдаа какккакдса садкскдккс 9 кдкадккккк скдсаддаск адкадкддкк ааадкккккс ккссададкс ааккдккааа ддксдккккк кккааададк ккдкададаа сададасакк аааааааадк ккддсааккс каадккасак кдасаакдкк дккаакааад
2040
2100
2160
2220
2280
2301 <210> 8 <211> 213 <212> РКТ <213> Ното зарТеп <400> 8
Мек 1 СТп Ьеи Рго Ьеи 5 А1а Ьеи Суз Ьеи УаТ 10 Суз Ьеи Ьеи УаТ НТз 15 ТЬг
АТа РЬе Агд УаТ Уа1 СТи СТу СТп СТу Тгр СТп АТа РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
АТа ТЬг СТи Не 11е Агд СТи Ьеи О1у СТи Туг Рго СТи Рго Рго Рго
35 40 45
СТи Ьеи СТи Азп Азп Ьуз ТЬг Мек Азп Агд АТа СТи Азп СТу СТу Агд
50 55 60
Рго Рго НТз Н±з Рго РЬе СТи ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег СТи Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд С1и Ьеи НТз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго УаТ ТЬг СТи Ьеи УаТ Суз Зег СТу С1п Суз СТу Рго АТа
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп АТа 11е О1у Агд СТу Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
С1у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд АТа СТп Агд УаТ
13 0 135 140
(31п Ьеи Ьеи Суз Рго 01у СТу СТи АТа Рго Агд АТа Агд Ьуз УаТ Агд
145 150 155 160
Ьеи УаТ АТа Зег Суз ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп СТп
165 170 175
Зег 01 и Ьеи Ьуз Азр РЬе СТу ТЬг СТи А1а АТа Агд Рго СТп Ьуз СТу
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд АТа Агд Зег АТа Ьуз АТа Азп СТп АТа СТи
195 200 205
Ьеи СТ и Азп А1а Туг
210
<210> 9 <211> 642 <212> ΌΝΑ <213> СегсорТкЬесиз рудегукЬгиз <400 акдсадсксс дкддадддсс ддададкасс аакддадддс сдададскдс ассдадккдд сдсддсаадк дсдсадсдкд скддкддсск саскддссск адддд^ддса ссдадссксс ддссксссса аскксасссд кдкдскссдд ддкддсдссс кдсадскдск сдкдсаадкд дкдксккдкс ддсскксаад ассддадскд ссассссккк скасдкдасс ссадкдсддс дадкдддссс дкдксссддк саадсдсакс кдсскдскдд аакдакдсса дадаасааса дадассааад дакдддссдк ссддсасдсс дасккссдск ддкдссдсдс асссдскксс касасдсадс сддаааксак адассакдаа асдкдкссда дссдсадсдс кдскдсссаа дсакссссда сдсдсдсдсд асаассадко сккссдкдка ссссдадскс ссдддсддад дкасадскдс саадссадкс сдссаксддс ссдскассдс сааддкдсдс ддадсксаад
12 0 180 240 300 360 420 480 540
- 63 014525 дасЬЕсддЬс ссдаддссдс Есддссдсад аадддссдда адссдсддсс ссдсдсссдд 600 ддддссааад ссааЕсаддс сдадсЕддад аасдссЕасЕ ад 642 <210> 10 <211> 213 <212> РРТ <213> СегсорхЕЬесиз рудегуЕЬгиз <400> 10
МеЕ 1 01 η Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 Суз Ьеи Ьеи Уа1 Нхз 15 А1а
5 10
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 61и 61у 61п 61у Тгр 61п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг 61и Не 11е Рго 61и Ьеи 61у 61и Туг Рго 61и Рго Рго Ρχ-ο
35 40 45
61 и Ьеи 61и Азп Азп Ьуз ТЬг МеЕ Азп Агд А1а 61и Азп 61у 61у Агд
50 55 60
Рго Рго Нхз ΗΪ3 Рго РЬе (31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег 61и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд 01 и Ьеи Нхз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр 61у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг 61и Ьеи Уа1 Суз Зег 61у 61п Суз 61у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е 01 у Агд 61у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
61у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а 61п Агд Уа1
13 0 135 140
61п Ьеи Ьеи Суз Рго 61у 61у А1а А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхд Азп 61п
165 170 175
Зег 61и Ьеи Ьуз Азр РЬе 61у Рго 61и А1а А1а Агд Рго 61п Ьуз 61у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд РГО Агд А1а Агд С1у А1а Ьуз А1а Азп 61п А1а 61и
195 200 205
Ьеи 01 и Азп А1а туг
210
<210> 11 <211> 638 <212> ϋΝΑ <213> Миз тизси1и5 <400> 11· аЕдсадсссЕ сасЕадсссс дЕдссЬсаВс ЕдссЕасЕЬд ЕдсасдсЕдс сЕЕсЕдЬдсЕ60 дЕддадддсс аддддЕддса адссЕЬсадд ааЕдаЕдсса сададдЬсаЕ сссадддсЕЬ120 ддададЬасс ссдадссЕсс ЬссЕдадаас аассадасса Едаассдддс ддадааЕдда1а0 ддсадассЕс сссассаЕсс сЕаЕдасдсс аааддЕдЕдЬ ссдадЕасад сЕдссдсдад240 сЕдсасЕаса сссдоЕЕссЕ дасадасддс ссаЕдссдса дсдссаадсс ддЬсассдад300
ОЕддЕдОдсЕ ссддссадЕд сддссссдсд сддсЕдсЕдс ссаасдссак сдддсдсдЕд360 аадЕддЬддс дсссдаасдд ассддаЕЕЕс сдсЕдсаЕсс сддаЕсдсЕа ссдсдсдсад420 сдддЕдсадс ЕдсЬдЕдссс сдддддсдсд дсдссдсдсЬ сдсдсааддЕ дсдЕсЕддЕд480 дссЬсдСдса адЕдсаадсд ссЕсасссдс ЕЕссасаасс адЕсддадсЕ сааддасЬЕс540 дддссддада ссдсдсддсс дсадаадддЕ сдсаадссдс ддсссддсдс ссддддадсс600 ааадссаасс аддсддадсЕ ддадаасдсс ЕасЕадад638 <210> 12
- 64 014525
<211> <212> <213> 211 РКТ Миз тизси1из
<40О> 12
МеЕ (31 п Рго Зег Ьеи А1а Рго Суз Ьеи 11е Суз Ьеи Ьеи Уа1 Нхз А1а
1 5 10 15
А1а РЬе Суз А1а Уа1 С1и О1у (31п (31у Тгр <31п А1а РЬе Агд Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг С1и Уа1 Не Рго 31у Ьеи О1у (31и Туг Рго (31 и Рго Рго Рго
35 40 45
<31и Азп Азп О1п ТЬг МеЬ Азп Агд А1а (31и Азп (31у (31у Агд Рго Рго
50 55 60
ΗΪΒ Нхе Рго Туг Азр А1а Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз Агд С1и
65 70 75 80
Ьеи Нхз Туг ТЫ Агд РЬе Ьеи ТЫ Азр (31у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз
85 90 95
Рго Уа1 ты (31и Ьеи Уа1 Суз Зег (31у (31п Суз <31у Рго А1а Агд Ьеи
100 105 110
Ьеи Рго Азп А1а 11е С1у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп <Э1у Рго
115 120 125
Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а (31п Агд Уа1 (31п Ьеи
130 135 140
Ьеи Суз Рго <31у <31у А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1
145 150 155 160
А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Ηί3 АЗП (31п Зег С1и
165 170 175
Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у Рго <31и ТЬг А1а Агд Рго О1п Ьуз О1у Агд Ьуз
180 185 190
Рго Агд Рго О1у А1а Агд О1у А1а Ьуз А1а Азп <31п А1а <31и Ьеи <31и
195 200 205
Азп А1а Туг
210
<210> 13 <211> 674 <212> ΌΝΑ <213> КаБРиз погуедхсиз <400: даддассдад ссЬдссБдсР адааЬдаЬдс Рададаасаа аБдасассаа ссдасддссс ГГГ’Г’Г'Г’ГГГ'ГТГ’ГТ э — ссдасЬЬссд дсддсдсддс есасссдсЫ адаадддБсд адаасдссРа
ЬдсссРБссБ
РдЬасаОдса сасадаааЬс ссадассаЬд адасдрдрсс дОдссдсадЬ ΓΤΓ’ίΤΤΠίΤΤΓ’Γ’Γ' -, X---, — — сЬдсаЬсссд дссдсдсЪсд ссасаасс ад саадссдсдд сЬад ссО^сЬддса дссЫсдЫд аЬсссдддас аассдддссд дадСасадсБ дссаадссдд Я Й ГТТГ’Г’Й (- пгт -даБсдсеасс сдсааддрдс рсддадсЬса ссссдсдссс ссаЬдсадсБ сБдОддадад ЬсадададЬа адаасддадд дссдсдадск БсассдадБЬ ГГГТНГТНГТ1ГТЙ Й дсдсдсадсд дБсОддОддс аддасЬЬсдд ддддадссаа срсаскадсс ссаддддрдд сссададссБ садасссссс дсасБасасс ддрдрдсрсд ГТ I- ГТ ГТ Ь ГТГГ Н ГТ н ддЬдсадсБд сБсдЬдсаад ассЬдадасс адссаассад ссЬЬдссБЬд саадссБЬса ссРсаддаас сассаЕссЫ: сдсБЬсдкда ддссадБдсд ССГГ^ Я Г’ГГГГЯГ1 ------сБдЬдссссд Бдсаадсдсс дсдсддссдс дсддадсЬдд
12 0 180 240 300 360 42 0 480 54 0 600 660 674 <210> 14 <211> 213 <212> РР-Т <213> КаББиз погуедхсиз
- 65 014525 <400> 14
МеЕ 1 <31п Ьеи Зег Ьеи А1а Рго Суз Ьеи А1а Суз Ьеи Ьеи Уа1 ΗΪ3 15 А1а
5 10
А1а РЬе Уа1 А1а Уа1 (31и Зег <31п <31у Тгр (31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг (31и Не 11е Рго С1у Ьеи Агд (31и Туг Рго (31и Рго Рго О1п
35 40 45
<31 и Ьеи (31и Азп АЗП (31п ТЬг МеЕ Азп Агд А1а (31и Азп (31у С1у Агд
50 55 60
Рго Рго Н1з ΗΪ3 Рго Туг Азр ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег <31и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд <31и Ьеи ΗΪ3 Туг ТЬг Агд РЬе Уа1 ТЬг Азр (31у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг (31и Ьеи Уа1 Суз Зег С1у (31п Суз <31у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е С1у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп
115 120 125
(31у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1
13 0 135 140
(31п Ьеи Ьеи Суз Рго (31у <31у А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Низ Азп <31п
165 170 175
Зег <31 и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у Рго (31и ТЬг А1а Агд Рго (31п Ьуз <31у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд (31у А1а Ьуз А1а Азп <31п А1а С1и
195 200 205
Ьеи О1и Азп А1а Туг
210 ’ <210> 15 <211> 532 <212> ЬЫА <213> Воз Ъогиз <400> 15 адаабдаЕдс сасадаааЕс аЬссссдадс ЬдддсдадЬа ссссдадссб сЕдссададс Ьдаасаасаа дассаЕдаас сдддсддада асддадддад ассЕссссас сассссЕЕЕд адассааада сдссбссдад ЕасадсЕдсс дддадсЕдса сЕЕсасссдс ЬасдЬдассд аЬдддссдЕд ссдсадсдсс аадссддкса ссдадсЕддЕ дСдсбсдддс садЬдсддсс сддсдсдссЬ дсЕдсссаас дссаЬсддсс дсддсаадЬд дбддсдссса адсдддсссд асЕЬссдсбд сабссссдас сдскассдсд сдсадсдддЕ дсадсбдЪЬд ЕдЕссСддсд дсдсддсдсс дсдсдсдсдс ааддЬдсдсс ЬддЬддсоЬс дЬдсаадЕдс аадсдссЕса сЕсдсЕЕсса сааосадЕсс дадсЕсаадд асЬЬсдддсс сдаддссдсд сддссдсааа сдддссддаа дсЕдсддссс сдсдсссддд дсассааадс садссдддсс да
0 180. 240 300 360 420 480 532
<210> 16
<211> 176
<212> РВТ
<213> Воз Согиз
<400> 16
Азп Азр А1а ТЬг О1и Не 11е Рго <31и Ьеи <31у С1и Туг Рго <31и Рго
1 5 10 15
Ьеи Рго <31и Ьеи Азп Азп Ьуз ТЬг МеЕ Азп Агд А1а <31и Азп <31у С1у
20 25 30
- 66 014525
Агд Рго Рго Нхз Нхз Рго РЬе <31и ТЬг Ьуз Азр А1а Зег С1и Туг Зег
35 40 45
Суз Агд О1и Ьеи Шз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд
50 55 60
Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг О1и Ьеи Уа1 Суз Зег О1у О1п Суз <31у Рго
65 70 75 80
А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не <31у Агд О1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго
85 90 95
Зег 01 у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд
100 105 110
Уа1 (31 η Ьеи Ьеи Суз Рго О1у О1у А1а А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1
115 120 125
Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхз Азп
13 0 135 140
<31п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе <31у Рго (31и А1а А1а Агд Рго О1п ТЬг
145 150 155 160
<31у Агд Ьуз Ьеи Агд Рго Агд А1а Агд О1у ТЬг Ьуз А1а Зег Агд А1а
165 170 175
<210> 17 <211> 35828 <212> ША <213> Миз тивсигиз <220>
<221> тхзс_£еаЬиге <222> (1) .. (35828) <223> η = А,Т,С ог (3 <400> 17 сдсдЕЪЬЬдд Ьдадсадсаа сЬдсЬдсаса аааддсаакс даасСЬаЕЕс дсааЬддадЬ сасдсадсдд сааЬсдаааа аЬссРдсдЪд аЬдадссадс ааассЬддЬд ЕЬдаЬассаа дааЕдЬдсдд сдсЬддаЬде сЬддсЬСссС аЕдЬссдсас садсадЬдсс дЕсдаЬадЬа даЕссдссЕЬ дЬСасддддс дЬЬСааддсд ЕСЬссдЕЬсЕ даааадааад дааасдасад ЬсЕдСЕЕЬЕд ЕссдЕддаа.!: аадсддЕсаа асаЬдадааЬ ЕасЬссссдс дсаЬдаадсд сссааадЕдс сЬдассксад ЕассасдиЬс ЬсЬЬаасадд ссЬадЬЕсЬд садЕдаддЬс асдЕЕасаак сЕдддЪдЬдд аЕасссСада ададдаадка асЬЬадаЕдд ааааааасаа дсассасЪад даааЬдЬдка сЕЬЕадксаи дЕЬаЫзааЬа адаБаааадЕ ЬддсаЕдаЬс аадассссаЬ ЫаЫзааадЬ аЕддсЕдадд ддсЕдЬаадд РаддассЕдс ЬдссЕадссО
ЕаЬЕдсдсЕС сдаЬдадссЕ дассдадсЕд дассадсдса дЬсаОЬсаЬс ааддаспдсс сссРсадссд дЬдассаака дсадаасаад дСаассдкса саЕЬдааасд ЕРдаЕсдааа сасааадсаа акддсадсад ддссаЕсаЕд аЕддааЕдЕЕ ЬдсааЬЬдаЬ ааЬЬаЫзаЕс ддсдассЕсд сдддСЬЕЬсд ЕсЕЕсдЬсаС аасЫгааЬдЕ дЕдсЪдааад сдадсЕЕЬЬЬ: даасааЬдда адЕсаасааа Ьсдсддссдс аЬааБасдас даддадсЕдд асЪссдсакд ссксЬассад сЬсСддсЕЕд ЬддсЪдддсЕ дксЕсЕЬддс ассдЬддааЬ дЬсидссЫгс адсЬЬСЬссЬ дЬссдкдЬса дсЬдадссаа ддсЬЫссЬд ааЕдаСааад асссдадсса ЕаЬЕаЕЬдад сЕсдЬаЬдЕд адааЕЕЬсЕс адсадЕддда сасаРЕдсад даадаЕссас ссЕаадсЬсЕ дЕЬЕЕЕдсас аЕсЬеесааЬ дксЫгасаЬд дсадсададс сададдддЬЕ
ЕддсдСЬдад аСЬдаЬассЕ ЬЬсдбдасас сдЕсЬссЬЕс ЕдаЕсдсааа ЕддЬдсЬаБс ЕсЬасаасаЬ садссЬЬддЕ дкдссдаЬаа дЬЬсааадСЬ асдсдсЬдаа ааасдсЕдсЕ асаадааадс даЬддаЬдаа Ессссддкдд ЕдЕЬаЕсЕдд аЬЕЕдсдддЬ ссЬЬЬссддс сРаСЕЬаЪда аааЪЕЬЕссд ЬЬЬЬаЬЬЬаа ааЬасссСсЬ ддссЕсЕдЪс дЕЕЬссЬЕСс аадсададсЕ ЕаЬсдаЬдаЕ ЬсасЬаЬадд даЕсдасдсс сссададасд ссссссаасс ддсЕЕдддсд дддЪсааддс сдсдсдбсаЬ дЕдасадсСд дСЬдссаЬдд саасдддаЬд ддаааЕссаа аЬасссЕааа дсЬЬсЕссад аЕааадЬЬЬд ЬсЬдааааЬЬ ссЕссЬааЬЬ ЬЪсЬЬаЬЬЫ: ааааадаааа дадаассааЬ аЕЕаасасса дЪЬдддЬЬРЕ саЬдааЬдЕд аскаддаадс даЕддссддд ЪдЕдееЕссЕ дЪсскдсасс ЕсасаСдаЫ: адЪсЬсадас
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620
- 67 014525 асЬЬдддддс Ьсааасасса асддьеддаС сдЬддсЬдСд адсксадСсд адаадссадд ЬСаСсСдсад ЬссСЬСдссс аасЬдсаСас дддсЬЬссдд сСсадддсдС Ьддасадсдс ссЬЬкескдЬ ЬакссЕсСсЕ ЬаааЪЬЬдда ЬЬсЬаасЬсс асЬдСадСЕа ЬЬсЬЬсассс дЬасЬдаддд аадсаьсадд ссссассссс ддсасаддас аСЬдадассс ЬдддСсЬЬас дадСдсЕадд Ьссксасаас асададддсС адддаасадс Ь· ζ г<—»4“ ι-аа'-'-аааа1ЬасдддсЬсс скдкесаЬЬЬ садааасСдд аасассадЪд дакасдсадд дсдсЬддссс сЬдддассЬд аСабдссасс адЬскдСдсс ЬадсЬдЬдсЬ саЬдЬдЬдкд ссассСЬаЬЬ дскдсЬддсс аддддсаЬдЬ дсскдадсас ссадааСЬсс ассксдссад дЬЬаадксес дскддсЬадк дсадасаддк ЬЬдкдсЬсса дадаасЬссс ЬккддсЬсЫ: асасасасас дсксадЬдас сскддсЬЬаа дссссЬаддд СаааксЬда!:
аддЬЕдсаЬд СаСддЬдЬЬс ^ЗдЬддЕада саЬЬсЬЬдск сЕдсаЬадЬс дддсЪЬддсд ЬаддЕЪдссЬ ЬсСаЬдсааа сЕааадссаа сасаЬссЕсЕ дададдсада ЬсСддсЬсад ссбдсадааЬ СаддЕадаса ЬдЬЬдСдадд саксдЕаСЬд ссадЕдСддЕ адЬсассдаа асддассасЬ сЬсЬдссаас ассссаадса даЬаЬаадбд адасаЬСсса ЬдддСааасС аССссаддЬд аЬаддааЬбд ссдсаддаЬд аЪдддсдСдд даддддадад СЪаЬЬдссаа СссассасЬд дсаЬсассса сЕадсЬЬсЬа адЬЬсаассС акаааааЬдд сЪЪссЬссаа аасЬадддаЬ аЬадасаЬда ссССЕсссЬЬ сасасаЬдсс ССЬЬдаддса адЬдадсЬсе дсЬдддссад сдСааадасС сссадЬдддд аддааЪдадС ссЕдссдскс ддЬсадасад СсксссЬсЬд ЬададдсЬЬс Ьассаскдда ддкддасддЬ асасасасас ЬдддсаЫзЬс сассЬксЪаа ссасЬЪссск сссЬсЪдссЬ
ЬасЬдсаЬсд асЬсбЬсада дадскдадак сскдадсаад Ькадддаасс дЬсЬсаддад аддсаСадЬд ЬсЬдассЬСд дссЬааадс!: саддссадЬд дддаддЬддд садсссаЬаЬ ЬЬаддсЬсСд ддасЬсЕдса ддааадсдаа дддддсЬаск аддаССдаСс саЫВаЬЕса сааадаасЬд адаасасЕсС дЬСддсасЕд дсЬкдсЬЬаа асЬсЬадддЬ саддсСадсс ЬдЬдсСасса ЬдаЬадсадс асаддсдааЬ дассасаадС дксаЬдадаЬ даддсСсдда ссСсссаЬсс сдСссСдааЬ сдаддаЬЬсЬ садбдсЬЬас ЬааддаасдС ададдссссс ЬаадЬдЬссЬ сааСддаЬаа ЬааЕСдадСд аЬаддЪСдаЬ дддбсЬсСЪс ддадССсЬдс дсЬЬЬкаЬдС скдссасаЬс сЬЬЬссЬасс ддссасдасЬ дсЬссскдса дасадааддс ьдддддаддд сЬдддЕасас сЬЬасадаад дсаЬаскдсЬ асасасасас ЬдаасаЬссс аксЬаЬаЬЫ: Ьсдсассбас скдадссакд сЕЬаСЬСсса асддЬддСдд аСаЬддасдс ЬддсЬаааса ЬсЬсссадкс ссЬдсЬЬдсЕ ЬсаддасЬда асаедддддс СсЬЬсдЬсса адддадЬсбд ддсададссЬ дадсасаддс ССсасддддд ддадасаскд дддссЬсЬЬЬ сБадСдсЬад сССсадддад дЕассСассс асадассдаа ССаасасСса сЬаЬссасаЬ дсЬЬдбсЕдс скаЪЬСССс!: ЬсасасЬсаЬ ЬдксЬдасСс асасасассд дссЬасасад сЬаЬЬСдддд 9^-99^ »59«·» Сс£Ссс1гсс1: аддЬсЕдкдд дскдссдадд ддсаксассЬ СЫгдаааддд асассссддс асЬкдааааа асаЬдСдадс ЬааЬаЬЬЬса ЬдсссаЬЬЪЬ асЬдаасасс ссЬдаСссЬд СССЬсЬскас сдсдЬЬдддд сссадсскдк сЬЬЬЬаЬЬдд ддсЪсадддЬ дссдсадаса Сдададддкс дкддсссасЪ адсадсСЬсс ЬСсЪаЬЬдас дкаСсадсСс асасаадска ЬдаадкЬадс ЬаЬсЬЬЬдск аЬЬдсЬддаЬ ддаасадссс
Сасддадсас ЬсаСсаСддЬ асБсЬЬсадс дасЬсасадд сЬсссЬассЬ дддддасадд ЬддсЬдссЬЬ дсЬдсЬсадс ссЕдааасСс ЬдЬдадсЬдс ЬдсадсЕсЕЬ асаЕссссас дддддддддд сЕЕЬдкаада дассаЬЬсад асаЬЬдсада ссйдасаСдЬ сдкаасаддс дссЕЬддааЕ ддсссЬЬЬаа ЕЬЬасадада аЬддЕаааЬд СЬСЬЬсЬсдЬ аЕссЬЬсСсс ссбдЬадсЬЬ дааддадсСд ааддкдддда аадсСдссдд ^о.^ССЗ.СЗ.^0 сЬСссЕссЬС сЕсаддасаС дсаддкссСЬ асЪСдддсаЪ ссасадаСЬС асссакддад ддСЕссадаа сдаЬдддддс дасадададс ЬЕЕаСЬсаСд дЬскЬсаабс дддсЬсаСЬд сЬсссЬадсс аЬскдаасбЬ ЬЬдадсаадЬ сЬаддсаЕЬс садсадссЬа дааадСад да асадддсада дсаддкдкаа скдЬссЬддЬ ЬддСдСаасд аададсЬсаЕ аЬЬЬСдаЬаЬ асасаккСсс дсссЬдСЕас ддЬЬЬсесСс ааЬаасЬдад сЬасСаСдЬд дсасеедскд аЬЬсЬдЬсаа дбсадссЬсс саасЬаксса СЬдСЕдадкЬ ддадаасаса СдддаддаЬс сЬддассаад асЬккссааЬ кссЬсссаЬс сссассссса ддддсадбсс Саскдсадкк ЬсааддСасс дадссЕсада дасадЬЬсса ассдЕадсад аЬааасасса сасксаддас ддааааасЬа дсадддсЬдд ЬдСЕсдааЬс саЬддсСЬас дЬскабасса дддаааСссс адддаадсад ЬаассдСаСа аддсадсддд ссддддсСдс сасссадсЕд сакдсасдЬс сааддссааЬ саЬЬдассад сдсаадсссЕ адаСсссааа сасЬдсаЬаЬ аддадЫгадд СаЬдЬдЬаЬа дЬкссссасс дкСкаЪсЬад сЬдддаскдс аддбссскад даассаЬЬсс аЬдадЪддЬс дадаЬасЬдд скдааЪдада Сдксадеада ЬЬддссЬЬсЬ даЫзсссааа дббсаасадс ЬсасдааЕда дссЫгаасЬа сЬсЬддСдЬЬ сССсЬдадаа скдсадсЬсб ЬЬадасаЬаа
1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 •з О ЙГГ\ > <_1 V 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040
- 68 014525 ааасдЕсЕсЕ ссЕЕаадаЕЕ ЕЕаЕЕдаЕса аааЕЕсаЕсс ЕаадаЕЕЕЕд ЕЕдддаЕдсс ааЕдсЕсЕдд сдаЕдасдаа ааддссаддд ссадссдЕЕс адЕдаддсЕЕ ддсаЕЕсЕдс ссЕЕдЕдЕаЕ ссЕЕЕддсаа дссЕЕсаддс адЕдЕЕсасЕ ЕЕдЕдддЕас сЕддЕдссЕЕ дсаддасЕсЕ ЕадсЕдддса ааЕасЕсЕЕа ддадасаддд дсЕсЕдЕдад ЕадаЕдссаа дсасЕсаЕдЕ адЕдададад асасадасаЕ аЕсаЕдЕдЕЕ ддЕЕдЕаасЕ сасЕдЕссад даааддЕадд дЕдсдЕЕЕда ЕсЕЕЕссааа ддаЕдаЕдаЕ сЕссаЕсЕЕЕ дссссЕдддд ЕддссЕдддд ЕдЕаЕссдЕд сааЕаддссЕ аддЕсададс адсЕадсддс саадссадЕд ЕЕсдссЕсЕд дЕдЕдаЕдад ЕссЕЕЕсЕЕс дЕдаЕдсада дЕдЕдЕдЕдЕ ддсЕсаЕадЕ даЕдсаддда дсаЕЕдЕЕдд ЕааааааЕас аЕдЕдЕдсса аасЕддадЕЕ ссЕаЕдсаад ЕЕсЕсЕЕааа дЕсаЕЕаадЕ аЕдЕдассаЕ адссаааасЕ сЕЕсаЕдасс аасЕаасЕса ЕЕаасЕдаЕс дЕЕдЕдадад даадЕдассЕ аадсаасЕЕЕ ЕсссдЕсааа сссЕаЕддЕс ЕдЕдсЕЕсЕс сасссЕЕсЕс сЕЕЕасЕЕсс ддддадасЕд асссЕаЕсЕа ЕддЕЕсЕсдд дсдддЕддЕЕ асЕдсЕаада дЕдддЕасас адддаасадд дсЕдаадЕдс аааЕсЕдддЕ ааЕсаЕсада адаЕссЕдсс ЕЕЕЕаадссс даассаддса дададЕдсас дЕдЕдссадд ЕсЕааддадд дадсаЕдсЕс сдддаЕсадЕ ааадЕддддд ддЕадааада ЕааЕдссЕдЕ дсссддЕдда садааддада дасЕссЕадс СЕЕЕдЕЕЕсЕ ЕсааЕсЕЕдд ЕдЕаадсаад ЕдадЕЕссдд аадддЕадад адЕЕаадсаЕ здддддддд!: аЕЕЕЕЕссЕд ссассаЕЕдс сддааасада ЕЕдЕдЕдЕаЕ сЕдсаддаад дададдадад ддЕдЕдЕдЕд ЕЕаЕссаЕЕЕ сдЕдЕдЕдсд ддаддаддЕЕ адсаддаадЕ аЕасасдЕдд Ессддсасад сасссссаЕд
ЕсадсЕаааЕ ЕссЕЕсасаЕ Еааааадсса ЕдЕдсассЕЕ ЕсасаЕдЕЕа дсЕдЕЕссад аддаддЕадд дсЕдЕасаЕЕ ссЕсЕЕааЕс асЕсЕддаЕа асаЕддсадЕ ЕсЕЕЕЕЕдда даЕсЕЕЕддЕ ЕаЕсЕЕасса ддассаЕдЕс дсЕдаасааа ЕааааЕддаЕ ЕдсЕаадаЕа ааЕссаЕЕас ЕЕддсдасЕа дддсададЕд дсааасЕддс ЕЕаасаЕаЕа ссасаЕдсас ЕдсасасЕсд аЕЕададЕЕс дадЕаддааа дсдЕдЕдаад ссЕдЕдддаа аааадссссЕ дасЕсссаЕс ддддЕдсада даддаддЕдЕ ЕдсЕддаааЕ дЕддаЕсЕдЕ асЕдддЕдаЕ дЕсЕсЕдЕЕЕ ааЕсЕсасЕд ссасасЕЕса аадаЕЕЕЕЕЕ ддсдадсЕсс ЕсЕдЕдЕддд даддддЕддд асадЕдассЕ ЕЕЕссЕЕдЕс адссдЕдЕдЕ дЕдЕдЕдЕдЕ дЕдддсадда дадддаЕасс ЕдЕдЕдЕдЕЕ аЕЕЕаЕЕЕЕЕ ддаасссЕЕд дЕдадЕсссс дсадЕЕаЕсЕ сададасаЕд дсаадсассЕ ЕЕсЕЕсаЕдЕ
ЕЕадасааЕа ддсасдадЕа дЕЕдЕсЕЕЕс дсасааЕсса садааЕдЕас сссссЕассЕ аЕдсЕддаас сЕдЕаасада ссЕдЕсасас даЕддадаас ЭдЬЬЗЗксаЕ сЕасадддаа сЕддааЕдЕЕ сЕаддсаЕад ссЕддЕЕЕсЕ дсддддаЕЕд асЕддссЕсЕ аааЕддаЕас Едадаааасс ассааЕдааЕ дссЕдссЕдЕ ЕаассадааЕ ададададаа аЕдда.саадЕ ддсЕЕаЕсас асаддааадЕ ддадссЕддд даддсдЕЕдЕ асаддадддЕ дсЕдадаасЕ ЕсЕдаЕдЕад ддадаЕдсЕс аддЕддЕддс ддссдадсаЕ дЕаЕддссад дЕЕЕаЕсдад ЕдЕЕЕсдЕЕЕ саЕадсссад дадасЕадас ЕЕссадсЕдс сЕдЕдсадда дадсаддЕдд даЕдаддЕда ЕЕддссЕсЕс сЕЕдадаааЕ дЕдЕдЕдЕдЕ дЕдЕЕЕдЕдЕ аддааЕаадс ададааддаа дЕЕЕаЕаЕЕЕ аЕдЕдсасдЕ даддссасаа ЕдасаЕдЕЕЕ дсЕдадссаЕ аЕдддаЕЕЕа дЕааадссаЕ ссссЕдЕссс ааЕсЕЕасЕд ЕдаадсЕЕЕа ассЕдсЕсаа ЕасдааЕаЕс адсЕЕЕдаса ЕсЕдаддсЕд адсдддЕсас с^дддааадс ссаасссдад асддссЕЕдс ссЕсаЕЕсад ЕаЕаЕдсЕда ЕссЕдсЕадЕ ЕддсссЕсдЕ ссссадсаЕа саЕсссадад аЕсЕдассас ЕддссЕсЕсЕ аддддсЕадд ассададЕЕЕ ааЕсссадаа адсаааасас ЕаааасаЕЕд дЕдсдЕЕЕда асасаЕааЕЕ дЕдадЕдадс ЕЕЕдЕдЕаЕа дЕдддсЕддд ддссасссЕд ЕЕаддЕааЕа даддаЕсЕдд ЕЕааЕЕсЕдд саЕЕсасЕса саасссЕддс сддддссаса ЕдсЕсЕЕдЕд ЕЕЕдадасад дсЕдсддада ЕссасссЕдс саддЕддадЕ даааЕдсаад аЕдаададад даддадддса ссЕсссссас ЕсЕдадЕЕЕс дЕдЕдЕдЕдЕ дЕаЕдЕдЕдЕ ЕдЕаддсЕда аЕЕаадддад дЕаЕЕддааа дЕдЕдЕдссЕ дддддсаЕсЕ дсЕдддаасЕ сЕсЕссадЕс сдЕаЕддаЕЕ сассасаасс сЕссаЕссЕс дЕЕдЕддааЕ ЕЕасааЕЕдЕ ддааддааса ЕЕаададЕас аддЕдсаЕсс ЕЕЕЕддаадс ЕЕсадсаЕсс ЕдсадасЕЕЕ сссЕЕсЕссЕ ЕадЕЕааадд ддаасЕсЕдд сЕЕдЕЕЕЕда ЕЕЕЕссссаЕ ЕсЕддадссЕ ЕддЕдЕЕсас сЕссддЕдсс ЕЕдсададсЕ сЕаЕссасЕЕ адсадддадд ддаЕсЕсЕад сЕсдддаддс ЕдадсЕсЕдд аадаадасад асасасаЕаЕ Едааададад асасссаЕдс ададддадсс асЕддадсаЕ сададддЕсс дссададада дсаадЕадад дЕсадсадЕЕ сЕсадсадад ЕсЕддаадаа ддЕдсЕЕддд Едссаддсас асЕсЕЕдсЕа даддддаддд дааЕдаЕдас дЕддадЕддс саададаЕдд аддсЕдддсЕ дсЕсссЕдса ЕЕсссЕЕсЕЕ сасЕЕсасЕд дЕдЕдЕдЕдЕ садЕдддааЕ ддсадЕдЕдд сЕасаададд ЕасаЕЕсЕЕЕ дсаЕдадЕЕс даЕссссЕдд даассссддЕ сЕдаааЕсса ЕааЕдЕддсд дсаасадЕда саЕЕсЕсаад
5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460
- 69 014525 сассксккдс кдаадксаса асасаскаск дкдкакдсас кссскддадс асккдаакск кскссдсскд кдкасаккдк дссакссксс касакддккк ксасааадкд скддададак кддкддскса дскасадкдк сассссадаа ассаскдккс сасасакккд касакдкакк ддддакдкса адд^бдааск какксккккк кдсадкксаа ассасасскд кдаадддакд ксксссааск кдкддакксд сскксксаск кддададакд 4- >—* л*ч /-ч —, л—лл—, —ч 4* <·ν ν. и. и. ν- сьук- а. и у садккккссд дсакддкдак садккассас асадссдскс адкскдскск сссаасСсЪдсссасадсск асадкакасс сдддддссас адссаксскк кскдкддсак дддасасддд ссасдадсск ддкссксаса адкддадака ааккаккксс ксссададдс акскакакск ададсдакдс аккасаааса кккаксскда дккдскаккс дкдкдкдсас кдаааддссс кдкдсаддак кддададада кдаассксдс ддаскксасд кскдсскскд садсскдсас дЬаскдсакк акдкдссаса кддадккаса ааадсаадса ддккссаккд кккдкдскаа кдссксадсс сакдккккдк кдсадкксас ддсаскдаск садссакска асксасакаа адсссасксс аддсккскаа кдкдссксак какккаккдк дадкаккдкд саддксакса кккксссскд адкдаскссс аскддаксак аскддаскдд дадскакккс дддккддадк аскскскасс дсксадссдк ссаккдскдд сддкддадаа акдсккдккд дксксссскд сссаасдска дадкаскдкд ссадсксаак сккккдсада саскссскдс кссассскка ксскдкаакк адакасакск саскскксак ддкаааддаа дсссдасасд даккадкдас ккадааккаа каксккдакк дскдскксад сккдддсадд аасааасааа аккакадкдк каадаакаак дддкдсакак скскдсксас сскдаааскд дададсааад кддассккдк кксксаккак есдскддада ссскксскдд сксксдскск кдкдкасада ддсадсдкдк сккккааскд какддасаса дадададкаа ксскссксск ксаадаскда кдаакддсас дсксккссад каасдадакс аакааакааа акдккссскс саасскддкк асасдккскк адккдкдкдк аасаддддас кдкдкддсад аддкдддддс кдкскссасс кааккскккд асакдадсдк ддкккдссад ксаасксакс кадаксакка каададсасс дсадкадддд ссксккдаса какддаадас ккксккдсад дккаксдсск аддсадаакс дасадаскад ддкскдаскд ассассадас дддадсасак какдкскскс садкдассса дасссскссс скакдсааас ссскдскдад кадаккксса адакаскаса скккддаакд адссккссск дкккссссск сааасаааса кддкдадккс каддаддадд дккддааддд сскддссакк асксдскдда ааадааасад акдкдкдсас ккдкакдкск асадкдкдса кскдадкакк скккккккаа каскакддад дадскдсскд скдаддсадс кдкадскада кдскскакад дадкдскадд аддакаасак аасссдкдак аддкссддад кдасдссскс кскккаааас ссасдкскск касккдддсс кскадкаадк дсдкдкдддс адкксккккс сааакдсскк ккдккссака ксккададка аЬддддссдд ддаадссада адаасааскк адсккдасак аккскккккк даакдссскк дсдсаддкдк ссскдскдкс кккдаскдкк дссдддкдск ассксакдак дкдадаксдд ссааддаддд ддадддссск асдкдсссас даадаадскс сскдаддкда дддкдддадд ссасскдддк асаддссскд дсадасдаак аааадаадда каддддссск кккааадкдк даддакддск ккксадаака ааддассксс аадксаксас аасскадсса дкдсскдксс касдддаддс садааасдад сскккаааад акккдссада ссддддксас кскдсасаск кдддккскда асакаккккк дссадаадад дкдкдддкдс ксксадкасс акаксккдск сскдадскдд акдасаддсд ксакасадад саадааасаа кксааккссс ккскддкдкд асасасасас дсскасадка ксккккскдс кдсакаккас ссакдсакдд кксааксакд касссаскда дсссаааскд ккддааккас ддаадсдсас даасадсккс асадааадкк кддсксскск ааааадаскк ссададдксс и С 3.«.С у и 5°·9 сскддксакк асадкдаадк кдкссаккдс дсддсадаад ссссаасдак сааддкдааа ддсадссакд акскдкссса сскаадаадк ддкксаддкк дскаксаддд кскксскдкд асскссссак дасаккаадк аааааааддс кдддкаадса дссккдссад скдккссккк садддкдкаа акккддадаа дссаадкдск аккдсадскс ссккддддас кскдскддкк асккддсддс ааскккскаа даккдаасак дсададссдк сккакдксад скскдскакс акккдкккдк дссакддссд кдддаассаа сккскксакк какскаакка ссксаасскк адкддкааск ааддкскддд аасксадддд адсаассаса кскдаадаса асасааккас сксссаддкк кскдкддадс кскдсдкккк сасадкдкдк кдддккссад дасаксксса дскккдсаск дакдкдкаск акдскдсадд адкскаакдс сксадкдсса асссаскдад аккадддддс кдадкксаак 4— —> Л-* Л-Ч 4— 4» 4искдддкдддк кдддскксса сдсдадддск акддасдкса ддскксскдд скскадддкд кккаддааас скскддксск кскдсксскк какдкссскд кдсакддссс кддкссадаа дкскдкксск кскдаадсад кдсаккккаа аакссакккк ададсккасд дсккдккада адкссадсск ккдсааддак кдссаксскд акдкссдкдд адааддаааа ссасддкдкс ассакдадаа дддьддкккк аакссксккд садссассас
8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 Ί Л О ПЛ ΧΥώ Υ V 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11880
- 70 014525 сссадсассс дадЕассссд ЕдссЕдссЕд аЕаЕсаддда ЕсаЕддЕЕаа ассЕдЕсЕЕа ЕдсадссЕдд ддсЕддСсаЕ адссаадЕЕд саЕЕЕсаааа дададдааад саЕдаЕЕдса ддЕсааддаЕ ЕаддЕЕЕСдд ЕссЕддаасЕ сЕЕЕдадддс адЕЕсаадаЕ дсЕдсЕЕдад саЕдасЕЕЕд асасадЕсЕс дадддСддде дасадЕсасЕ адаЕЕссЕдд дЕЕЕаЕаааа сдЕддсЕдсс аадЕддЕдда ссасЕЕЕсЕа СсЕсааЕсЕЕ аЕЕдЕсЕЕда дсЕсЕЕсЕдд асссдссасс дддЕдссЕЕЕ даадсасЕда ЕааЕЕсЕЕЕЕ ЕдЕаЕЕссаЕ даададдсЕс ЕдддаддЕсс СаасдсасЕс ЕдЕЕЕссСЕЕ ЕЕдЕЕадСЕЕ ссЕдссссЕд садЕасадса дсЕаададЕд дЪддсЕссад аЕасссасаЕ сЕадсссЕЕд ЕЕсЕддсЕаа аЕддаддаад аддасасЕад ЕЕаЕдсЕддд аЕЕЕЕЕЕЕаа сЕдададсЕд ддсЕдЕддЕд дсЕадссЕдЕ дасаЕсаддд Еадаадсдда аЕддаЕдЕда ддсасаЕадд ЕдЕаЕадада ЕаддаЕдЕсЕ ЕЕЕЕЕдЕЕда ддЕааддаас ддаЕдЕсасЕ аЕддЕсаЕЕд ссЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕдСассЕсад ЕаасасЕдЕа аасаааасаа аСдЕсЕасад адсаЕддЕсС аСЕЕЕдддсЕ сдсЕсЕдЕад ЕдддасдааЕ ааЕЕаададЕ дсЕдЕЕсЕЕд адссаЕсЕсс ЕсЕЕЕдЕсЕа ЕЕсссЕассс адсассЕасЕ сЕЕЕссаЕЕа сЕадсЕасЕа сдЕдадЕадд аЕаддааЕЕа ЕдасЕЕаЕаа сЕааадЕсЕд дадсасадас дсЕссадсас сссаадЕддд ссассЕЕаад ЕсЕЕаЕааЕа асаддсЕЕЕд ЕЕЕссЕсЕдс ададддсадд ЕдссаЕссдд ЕааадЕЕдЕа ьдйдЕдЕЕЕд ЕдаддЕадда ссссЕдЕссс ЕЕЕЕЕсЕаас сасасЕдсЕс дЕссададда асадаЕасас даддЕасдас сдЕаадасЕЕ адддаЕдадЕ аддаддаЕаа Едаааадада аЕЕдаааада дддЕдадЕда асадсЕассЕ ддЕдсаЕдад садаЕссЕЕд ЕдсаЕдадса дЕдЕдЕсддс сдЕсЕсаЕаа дадЕЕдЕЕдЕ ЕасаддадЕЕ аЕаЕСЕсааа аЕдссЕЕЕЕс сссадддЕаа ЕссссЕаЕЕс ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕсЕЕЕадЕЕЕ дадСЕдасад аасаааасас дсссадЕЕса асдЕаЕсдад ЕЕддЕЕЕЕЕд ассаддсЕдд дссассасЕд ЕдссадсЕсд дсЕЕддассЕ ададааддаа ддСаасасаЕ сЕдссЕсЕЕс ддааассЕсЕ дддсЕдааад ЕЕсЕЕсаддЕ дддьддддьь адддЕдСЕсс асаЕссаддЕ ссЕдссСЕЕЕ ЕаасасЕЕас ЕсЕЕаадЕЕа ЕдЕддаЕааЕ ЕЕдсЕЕаЕад сдаддаЕаад ЕссЕдаЕсдЕ садсдЕЕадд ддаСддЕддд даддаааадд ассааааЕаа ддсЕЕЕЕЕаЕ ЕсЕсаддсЕд ЕдссЕссаад аЕСЕаааааЕ ЕЕдддЕадда ЕссаддассЕ асаСаааааЕ ЕсЕддааадс асададасад адддддадса аЕассадЕса аддссссадд аааадаЕдЕа дасаЕдЕдда сЕааЕсЕсса асссЕдЕЕЕс дддссааадд сдЕдссдсад дЕсддсдсас аадсссаЕЕЕ сдЕддддсас Едсададааа ЕЕсадсЕЕЕа сададсЕдсЕ адассЕсЕда СдЕдЕдасса СЕЕЕЕЕЕЕЕд ссаадсддсЕ аасЕддЕЕса сасааассаа Едададдсад асЕссадсса адасадддЕЕ СсЕсааасЕЕ сссаасЕаад ЕЕааадсЕаа даааЕсЕдсс дЕдааааЕЕд ддЕдасасаЕ ЕдддЕЕддЕс ЬЕдЕдддаас ЕасаасддЕЕ ааааЕассда дддааЕссЕд сссссссссс аааааЕЕаса ссаддддЕад саааЕдаддд ЕЕЕЕаадааЕ дссаЕддсса ЕаЕЕЕаадаЬ адаЕЕЕЕсЕс адсаЕадада ЕЕаасЕссдЕ дЕдаддсада ааадЕЕЕадс аЕдЕсЕЕаса дЕдЕдсЕЕЕа дссЕЕдаасЕ ЕдсЕаддасЕ ааЕсассЕад ссЕдадЕЕЕа сЕддссЕсса ааааЕдаадс ЕддсаЕасЕд аааадаасЕс сддддаасЕЕ ЕЕдсасссас ЕаЕЕддсЕдс ааЕсааддЕЕ саасЕссаЕс ссЕссдддад ааааасЕЕЕа сддасаддсд дсаЕсаЕдад ЕдсасдЕссЕ
ЕаЕдадаасс ссддаЕссса ссЕСссЕЕдд адЕдЕаадас дсаададдса Есасадсадд садсааассЕ дсссадааЕд сЕсЕЕдсЕса ЕдСдЕЕаЕда ааасаЕсЕдд адасаддаад дддсЕасддЕ ЕсЕсЕдЕдЕа ададаЕсЕдс аЕЕссаЕЕаа дЕадаадсад сссаасадЕд ЕддсЕсссса адсаЕЕдаас ассссаЕадд аЕдаадааад сЕЕддЕЕддс ЕдЕЕдЕддаа даЕадЕдЕЕс аассЕсЕЕсс аасаЕааааа дЕсЕдЕЕЕсЕ аасЕсЕЕддс ЕсЕсасЕЕдд дсадддддса дсЕаааЕдЕЕ асаддаааЕЕ дааЕадсЕдд ааааадЕдаЕ дсасЕдЕсас сЕсЕадЕсЕа ЕЕасааадас ЕаасЕдсЕдЕ ЕсЕдаЕсдсс аааадсасаЕ дддсЕддада дЕЕсссадаа ЕдддсаЕсЕд сСЕЕааааас ЕдЕаадЕсса адддбдЬдсЕ дддсадЕдаа ЬасЕддасаа аЕЕддсЕдса адаЕдадЕдд ааааадсдас дЕдаЕсаадд аЕааадаааЕ адЕсЕсдЕдд ададсссЕад ддсЕдЕддЕд ададсЕдЕЕЕ дсадссЕддЕ адддааадаа ЕсадсадЕдЕ ддадаадсад адсададсЕд ддЕсасаЕад аадЕдассаС аЕасааЕдЕд дададдаааа дсЕадссадд ассдссдааа сссаадаЕсс дсссЕддсЕд сЕдасЕсЕдс аааааааааа ЕсЕсаддссЕ ЕссаадЕдса дЕсдаЕЕддд ЕсЕссасЕсЕ асадссасад адссЕЕЕддд ЕЕЕдссЕсдЕ аадссаассс ЕаЕссаЕдда Есадасссад ЕддЕЕЕсЕсЕ ЕЕдсЕдЕЕсЕ ссаЕасЕаад ссЕЕЕадсас сЕдЕЕдаддс ЕЕааЕсаада дЕсЕЕЕЕЕса аЕаЕЕЕаасЕ ЕсадЕддасс сЕдссаддса ссассадЕдЕ дЕсЕдЕЕЕЕд ддкддЕдсЕд ЕдссссЕдсс дссассасас дадддЕЕсса ссЕаЕасЕдд сЕсЕЕадсас сЕссСаааас ЕсЕсаЕддЕд дддддЕЕддд ааЕЕсЕЕЕдс сЕссадддаа ЕЕЕдсдЕаас ЕЕдсЕдЕдад адааадаасд ЕЕадсссСса ааЕдаааааа ЕааддЕсдЕд дЕаадЕаадд сЕддасЕддс
11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 12900 12960 13020 13080 13140 13200 13260 13320 13380 13440 13500 13560 13620 13680 13740 13800 13860 13920 13980 14040 14100 14160 14220 14280 14340 14400 14460 14520 14580 14640 14700 14760 14820 14880 14940 15000 15060 15120 15180 15240 15300
- 71 014525 абсЬЬЬддбд ЬЬсаадаасБ аааааассба дсаададдаС ссааассааа дададсабдд абссасбдад дЬЪдадбааа саасаааадс ЬсбЬссдаад асдадаЬаЬд ЬаааЬааабс аасадааддс сабдддссда ссьсббдЬбд ддссасбсбс аддасадаЬс даассаЬЬаЬ саабаддааа аддадасбдд ададабадаЬ аСЬаддаадс дбсададсад сдссасадаС Ьдсаддбдда асадссЬссб садсббссдс сбсссЪдбдд абадассбда аддасссада ЬдсЬдбасаа ЬсЬаассЬса садссбаасс сбдадааада абдбааБаад ббддссдсаа ссабдадбЬс ЬЬдссбсбсс ддЬдсбдадс с^дддбсаЬа ссссадааЬс дадсааасас ддааЬЬбддб сбддсссаса саадсЬсаЫ: дададсбддс сассбдддад абдасдсбаа даддааасаЬ дддсбббааа ИссбссассЬ сдсЬдссЬЬс ддЬсабссса ссдддсддад аадаадсаса сЪЬсададдб ддаадаабас адсЬдбддад дЬсбаЬбаса Ьссаддбдбд ддсдадЬЬбд садсааассс ддбдддддбд асссбддддс адсабсдаЬЬ сааассаадд дбссададбЬ абдсссСсЬЬ ЬЬаааааааа аддсасдасд ддадддбсса асасбасссс ЬдсесдсСЬд дсабсаббаа ддЬдсбсаса дсбЬЬсбддс аддесасада сасссссаас аддЪаЬсада сЬдсаЬЬдаЬ ддассддсса сдасасЬдаЬ ЬсссадЬсЬЬ садссссЬсс сабддсссбс даЬддсбббс дсбдбеьдбд дсабдаадас дадЪСдаддд ЬааабдЬсЬс сассбссбса сЬаадаааба даадссбддс ссЬддсЬаад сасбддЬЬЬб аабдбддадс сЬЬсааЬадб бдсссссаас сЬббаасбаа саадсЬддаЬ дЬЬбдЬЬЬЬд ЬЬдабаЬсЬд бдбдбсссЬд дЬдссадсад дсасассссЪ дддассадсс ааддсаассд ддсадсаЬдс ЬдЬдсбдбдд дддсЬЬддад ааЬддаддса ббадбддддд ЬЬдЬдбдддЬ Ьадсасадса дддаааЬддд аЬбаЬсбсаа д^ддьдьдса ааддбабсБд акбаЬдЬсас ддддбддддд ббдасбдсад асЬдасЬЬаа ддсбддСдад саааЬсссад сбддЬдсдбс аааааааааа дсаддсасса дададабадд ааьсасадас абббЬЬссЬд ддбддссадс дааЬсссддд ссадасаддд саааадддсс аабддссаса дбссссбЬсс дбдСдддбда ссбасаадбс ЬсаЬЬассса ссЬссаддда ессБСЪЬдса сЬдсбасЪдс ЬдабЬЬаЬаЬ абассабаад аЬдадЬЬсда даааддсадд адбсададаб ддбсЬсссаЬ аЬдадддааа садддаадда ааЬсасабдб даададаааЬ ЬддддбсааЬ адддбдсььд сссссааааа дассаЬбадс ЬссдссЬЬсЬ адааЬдссбд аааассасад ссбсассаас сааЬЬЪддаа Ьсбссасссс сЬдсЬссадс ЬаЬсСаддсЬ адсссЬсасЬ адддссаддд адЬассссда дассбсссса ддддддбссь ддсбадссЬс ЬбадаассЬд
ЬадддадаЬс ааЬаббаааа ссбабадсса дддсбдЬаса асаададЬдЬ асадаааЬаЬ сббаассЬЬд ссбсааабда абддсбсадЬ саассасабд Ьдаадасадс аааадссааа сдадссабсс сСддЬаадсб аааасаасаа ЬЬасдЬссад абааЬсбссс сссаддадсб ЬЬаасадбсс адсббсбаас дсбддбЬЪЬд ЬдаддддасЬ садаадаЬда даддсаддбд дббадсабас ЬддддадЬсс ссЪсаддЬдб аддсбдадса аЬаЬаЬаЬсс аддсбдддда абссссадса (зддаббсбдд ссбдбсЬсад дсасссасаа бдаббЬбЬЬд асЬдссЬЬСд аабддадсса Ьсаададада дддаЬЬссЬЬ сасадсаадс ддсабссЬЬс СддсаддддЬ дбадаадссс аддддсссад ссбдасбдсс дссссссссс дЬббасбдад сссссасссс ссдЬссЬЬаЬ ддасаседда адссссдЬдс дбддсаадсс дссбссбссб ссабсссбаЬ дддаддбдас ЬдсЬасаЬса дадддсадса абаааабссс ааааадаада сдддсасббд дсаадассдб ЫхаЬадСдад сбааасбдса ддаааЬдаЬа адааааадаа дддбаададс дбддсбсаса басадбдбас ссдадсааас ЬдЬдаааадд садЬЬЬсбсб асааасаааа саддЬддсдд абсадсаддЬ дсссбсЬссс асаЬбссада аасЬЬсасад Ьсбдссссда ЬсЪдЬсбдсс аааддаддас дсададссбЬ сасадсдддс ЬссаассЬЬс даасссбссс ЬЬддаЬЬЬсЬ абсссЫдда дабдабабдд ассабдбдда дддсббасЬд ддааЬаасЬЬ адасасасдд сбаадааабд дсасассадс аддбсссбсб ЬсЬссЬЬддб Ьаааддсабс дбдадасссб ЬдссЬсЬддд аасаааЬдас сасЫгдЬЬЬа ддадссадас сЬдсссдЬдд ссаасасаса сббдадаадб асссссдбда ЬддсЬддсаб дссЬдбдсба сбсаЬсЬдсс ЫзсаддааЬд дадаасаасс дасдссааад ьддддсддбб дддсадддас Ь^ддддддсЪ бссдааб-(:а1: аЬСаааааас дааадсбдда сдЬссссааа сддссЬсдсб дЬсааЬаддд адддЬЬббдЬ ааааадаааа асссдасбдс ассаЬсбдба ббасаЬабаа саддссссса садддсбасс дбаЬасссЫ: бссададссс аадЬдЬЬсса ддбдсбдЪда аадбсбддад дсаддддааа сбсЬддкадд аддааасбда ЬЪдбааадсЬ ссаддсадаб дсадаадсбс Ьаддсддасс ЬдбсЬсадбд СссбсбссЫ: ЬбдбдсЬ-Ьад ЬсЬЬасабсб ЬаададбдсЬ ааааЬаассЬ дссадсбадс дддадаабда ддддддддба аааЬбсбдбд сбаЬаадбса Ьдссбддбдд садааЪЬдба сббсссаддд аддббададб ьдддбддддд сЬЬддсЬада сбЬЬдЬЬаад ааббаааадс даддбаседд сЬссбсдддЬ сббдддаддд ддаддадддб даддсададд ссдадбдссс басЬЬдбдса абдссасада адассабдаа дбасдддабд ЬЬадсаЬсЬЬ асаЬЬЬдссб ддЬадададс
15360 15420 15480 15540 15600 15660 15720 15780 15840 15900 15960 16020 16080 16140 16200 16260 16320 16380 16440 16500 16560 16620 16680 16740 16800 16860 16920 16980 17040 17100 17160 17220 17280 17340 17400 17460 17520 17580 17640 17700 17760 17820 17880 17940 18000 18060 18120 18180 18240 18300 18360 18420 18480 18540 18600 18660 18720
- 72 014525 асссааддса дкакдакддк ассадкдддд ксссасакда ддсксскдад садакдсаад ккадкксссс дддкккдкад саддкддсас асадсадааа аксасдсасд адааакдасс сасакдскдк аддадсакдс ккддааадсс кдсаддддкд дккдкдсссс скдддакккк кадасаддас адакададса ссаасссаак ассадсксаа кдкддкадса сдаааддссс ксасссккдс дсаадсадсс дадддддккд асскдссскк
4— ,· к_, и. V-, и. к-и дддкддаддс ссададаакс аадкдакакд ссассасакд акааадксас дсаассскад сккдсссадд дкддсакдкд сасккдссск скдкддаддс дааскадсад ккдскддкса сссксскдкс аакдсадкса ссааааскад адкаааккаа сссссссссс кккккксскк ссасасакдд кдкссаадад сксскксссс ддкасасада ааадскакад кскасксдсс дддадссада садссскдсс дасдсдссдс скассссдск ккаддаадда скаааскдда дадаадкдда ккдаддссад дссасдкадк асадакдкдд асададсксс аксксаскдс ддкккддааа ксасдсаксс сдскксскда ддссадкдсд ссдаасддас скдкдссссд кдсаадсдсс дсдсддссдс дсддадскдд акксдккккс кддадккссс дддьддддкь дкдддакддд ЬЬааадддаа скаскссккс кддссаскда акадддассд адададдада дскдкккдкк ксааакскдс ссададссад ададкдкккд дакдддсдск сскдддскас дсссдакдка ддаааадсаа адкдккксак кссссддкдс аадададаад скскскссдс садасддссс дссссдсдсд сддакккссд ддддсдсддс ксасссдскк адаадддксд адаасдсска адкдкааадс адсссадкад сссдсдддсс ддкскккска дддадкдкдд сасссааакд дкдкдакдкк дааскскдск асаддддадд ддсксссадс скксаааксс
ЬдаддЕсадс сдаадскддс аккаасасдд кссксскаад дакдаддаса саддксадак дкдаддскдд акдссадакд ссакссакдд аддкааадаа ддссссадск кдаадакдда скдддадкаа даададскда даскддаадс аккдддкккд ддкдддаасс кдаадссадд дкскдсксаа кдадсссада дддккадсак асакдадддд садскдадкд ааакдксссс дадсккдсас сскдасссса дскккдсскс ададссадса садададакд сскддддкдд саакдаакдд ддкддддкдд садскддадд ссакккдкдк дддаддадад сксакккксс ксскадссад каадддакдк ддаддааадд сдкккккдса даддаадкдс ккдасскаад кссккссскд ддсааасадд ссксссссас дссадссаса даадддкддс ааддсскаса дкдааддкдс аксскддсск скдсссскск ккакдксака ккдаксскда сассакддаа аккадккааа адссксссак ссакскаадс аддадддсад дсаксадасс кадаадакак ддадаасада скскаадкса дакссадсса асаадададк скддкакаса дсаддкдска дккккдддкс адааскссда сссаадксдс ассдссссдс ссссасскдд ддксскакаа дадссскддс аксскаддка дссссссссд кккддддсаа дкксккккск садсскддас скккддксдс ккксаадкск аакдааккск сскссасадс адскдксскд акккаккасс сскдддакас сдсссскдкс ссадкддскд дкдкддскад аддскассад дсадддскдд дккадкаддс асааадсскк дддкдддакс дадаадккса адассаксса кссккааска акааааассс ааксксаааа дскдссаакк акадкддакд аадксдккда аксскддддс скккаадкас сскдсссаса даксасааад ссскдддккс сааддасадд дадададаад сксскксска каакссакас адакксдааа ддкддаадда дсадассадк скддсскадд адакдкдксс дадкасадск дссдсдадск акдссдсадс дссаадссдд ксаасдадкк дскдскдссс аасдссаксд ддсдсдкдаа скдсаксссд даксдскасс дсдсдсадсд дссдсдсксд сдсааддкдс дкскддкддс ссасаассад ксддадскса аддаскксдд саадссдсдд сссддсдссс ддддадссаа скададсдад сссдсдсска кдсадссссс скдсадссса ддссаддддк дссааасккк адассдсадд кссккскдсс сдскдсдддд аддададдаа дсккдадксс садаскскдс сссксдссдд асскакасад дасааддсад аасдааадас скдддаскдд ккакддасдк кааадсскдс дкдддскада кадддкккск дддскасдкд дккскскккк ддкасддкск дадаккссаа ддаккддддк ассссдкдка ддккадддда дадаккдкдд кдддсаассд сксдссдсск сададдкккд дсккссссса акакскддда кадддааддс садддкссда дсакдддскк скадскдскд скдкаскака дааассдада кддкккдакс аддаакссск каааадааса кдкакдадса акксскдадд дддкдддддк дасаскссад адсккдссас дссассссаа ддсаскаккс акассасскс ссксссссск ддскккддка сккккддадд ксакддкадд ддскдддсак сссккдадка аасааакдск дадкдаадад садаксаскк сссссссссс скдкдакаак какссскасс кксааккаас ддакдаддад сскадкассд сасадссадк скдаккскдк аасскакккк ааадкаадкд ссадддкддд дсдсадддса скдсадсссс дсаскасасс ддкдкдсксс дкддкддсдс ддкдсадскд сксдкдсаад дссддадасс адссаассад дсдсдакссд ссадассдкд дакддддадд скадссссдд кдккксс'асс асадкаадак дассскдасс кскккдкааа даскддкдад сскадаадаа сксскксскс дадакддкдд
18780 18840 18900 18960 19020 19080 19140 19200 19260 19320 19380 19440 19500 19560 19620 19680 19740 19800 19860 19920 19980 20040 20100 20160 20220 20280 20340 20400 20460 20520 20580 20640 20700 20760 20820 20880 20940 21000 21060 21120 21180 21240 21300 21360 21420 21480 21540 21600 21660 21720 21780 21840 21900 21960 22020 22080 22140
- 73 014525 аадддссада дЕсаЕаЕЕдЕ дссадЕсасс асасаЕЕЕсЕ аЕЕааааада аадсЕдЕсад ЕЕасЕЕЕсЕд дсасаЕддад дасЕсаЕсса ЕЕЕЕсЕсаЕЕ аЕсдсЕЕЕдЕ ддсаЕЕдЕЕа асасасааЕд Едасаасасс дЕсасаЕьса асссЕсассс ЕЕЕсассдад ЕсЕсссасаа ЕдЕсЕсЕЕса аддЕЕсаЕдд ЕссЕсЕсЕсЕ ЕсаЕЕссЕЕс сааадссаад ЕЕЕЕасассЕ саасаЕсадд аддддЕдЕда ЕсаассЕсЕс саасасЕЕЕа дсЕЕссаЕсЕ сдддсаадсЕ ЕдааЕЕсссс ддЕдЕсссЕд ааЕдЕсЕЕад дадддЕдадд адсЕЕссссс дадсссадЕд адссддсада садаададад адасЕссасЕ ЕссассаЕсс ададЕссаад Едсаддадад сааасаааса ддЕсаддЕЕа ддсдсссаЕс ддадсасдЕд ЕЕааЕаддсЕ сасасасаса ЕЕасаЕЕсЕа ададссасад дддЕсЕдсад ссЕдЕаЕааа ссЕдассасЕ ссссаЕсЕда ЕЕсЕЕдЕЕЕЕ дЕдЕадсаЕЕ асЕддасЕЕд ааЕсасасЕс ааадддаЕЕЕ ЕсссаЕссЕЕ дЕсЕадааас аЕааЕасддд дсдссасадс ЕдЕадаЕЕЕЕ дддддддЕад сааадасЕда ЕаадЕЕаЕЕЕ даадсасаад аЕааадасаа ЕсЕсдссасЕ ЕссдасЕдсЕ ЕссЕЕЕссЕЕ садссЕсссЕ ссадЕЕсссЕ адаЕдЕЕсаЕ дЕЕадсЕдаа аасЕсЕЕдсс ЕдЕааадссс асдддаЕадЕ ЕасааЕЕдад аЕадаадЕдЕ дсЕссЕдсЕЕ аадсаадаЕд сЕсссЕсссЕ ааЕссадЕса ЕдаЕЕЕдЕдЕ сЕсЕасЕдсЕ ЕаааЕдааЕЕ ЕддЕЕссада адсаддаддс а Е дда ддс ад аааасааЕЕс ддсаЕаддЕд дасаааЕааЕ ЕдсЕдсЕада сасаЕааада ЕЕЕадсаЕдс ЕдаЕдсссаа асЕаддЕЕдд аасааааааа дадЕЕЕаЕЕЕ адааадааса ЕдсЕЕддддЕ дададЕсаад сасасасаса адаасааасс ддЕссссасЕ аддсЕЕссЕд сссЕсЕЕсса даддаЕдада дддсасаЕда дЕЕЕдЕдаЕЕ ЕасаадссЕд садасадЕЕа сЕддсссссс ЕсЕасасаас дЕсссЕЕдсс ададсдЕсдЕ дддддддддс ассасссаса ааЕЕдЕЕааа дддддЕЕддд аадссдсдЕЕ аЕдссаасаЕ ЕдЕдЕдЕддЕ ЕдааЕсЕсда дЕсаЕсЕсас сЕсЕддЕадс ЕдсааассЕд ЕЕадсЕдасс ддЕссаддЕс сЕсссасЕсс ЕсЕасЕЕдсЕ ЕдссссЕдаа сассссасЕа дЕсЕсаЕсЕд дассадЕЕса аааадссЕЕс ЕаЕдддЕсЕд а^^дддадЕЕ ссадддЕЕЕЕ адЕдсаЕсЕЕ аЕдЕдсасас сЕааасссад аЕсааЕаЕса ЕЕссаддаад саЕддадасс дсЕЕдсааЕЕ саадаЕсадЕ аадасассдд дЕЕаЕддЕда ддсЕдесЕда сасаддсЕда ссЕЕдЕаЕЕс асссааасас дсЕдЕдаЕсс аасаааасаа аЕддааадЕЕ аасаасаддс асадссадас садасадада саЕдсасаса аЕЕссЕссЕс сЕсЕЕЕдааа ддЕдасссад саддЕЕсссЕ дсасЕЕдддс ддЕсЕсаддЕ ЕааЕЕЕаддЕ дЕдссЕдадд ЕдадссасЕд даададсадЕ адЕЕЕааддЕ аддасассас сдЕдсЕдЕсс ддадддедса аЕсЕЕЕЕЕдЕ аддддаддад дсЕддЕдадЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕа ЕЕЕЕЕЕсЕЕд ЕЕЕЕЕдЕЕЕЕ дсаддаддсЕ ЕсссЕЕсссЕ ссЕЕдЕддса дсЕсЕсаЕЕс асЕсЕссаса аЕсссаЕЕдс аЕсаадсссс дасассасаЕ ссЕЕссадда ЕЕЕдаЕЕссс дссаадЕссЕ ЕсаЕЕдддсс сааадсадад дЕддддЕадЕ сдаддссааЕ дЕЕЕЕдЕЕЕЕ ЕдсдЕдаддд ЕдддддЕЕда сссЕсасЕдд ЕдЕсЕЕЕдаа дасЕЕЕЕсад ЕЕддссадсс даадсЕдада ЕссЕддЕасЕ ЕЕдЕасЕдЕс ссссадддда аддадааддд дсададсЕдд ссаЕсасаЕд ассЕаддасЕ саЕЕассаса аасааааааа аЕаЕЕсЕасс ЕдаЕсЕддда асддддсЕЕд дасадаадда ссасЕсасЕЕ аЕаааддада ЕдасЕЕддас адссасадас даааддадсс сЕЕссссаЕЕ сЕЕдддааад дЕаЕдадЕдс адаЕсадаад ЕдЕдддЕдсЕ дЕсссдсссс сдЕЕддадда сЕссЕдссЕд ЕсЕдадасад адЕдЕЕаЕас аааЕсаЕЕЕс адададсдЕЕ ЕЕддсдаасЕ ададЕЕсадЕ Еададааадд ЕЕдЕЕЕЕЕЕс дЕддЕсЕЕдЕ ЕддЕсасаад аЕасдЕдЕЕЕ сссадсЕддд сЕдЕсЕЕсса ЕссЕссЕЕдс адЕддсссЕд дааЕЕссЕЕс сЕдЕсссадс ааЕЕсЕадаЕ дсЕЕдаЕаЕЕ аадсЕЕЕЕЕс дсааЕдссЕд асаЕЕсаЕаа сЕЕддсЕаЕд дЕЕЕЕЕЕЕда даасЕсЕаЕс ассЕдддссЕ сЕЕЕсЕдЕЕЕ аааЕассаЕЕ ддааЕссадд ссасааддса садддЕасЕс ЕдсассЕдЕЕ аЕдЕасЕаас садЕдаЕЕсс дЕсссадасЕ ссдЕддаЕдс ссадддаЕда ЕдсЕЕЕсЕдд аададддааа аасссааддЕ ЕссаЕддддЕ ЭЗЗдЬддЕас ЕаЕЕааЕсас аасасасаса сЕсасЕсдаа сааадЕЕдса ЕЕдЕЕдсадд асЕдаааЕсЕ сасаЕЕсссс сЕЕддадЕдс ЕЕссасаадЕ ЕЕЕЕдсЕЕда аЕддсаЕсад аддаасадаа саасЕдссЕЕ аасЕдддсЕЕ ссасссасдд саЕаЕсЕЕас аЕаЕдсЕдад садасассЕс ЕдЕаасадаа ЕЕссаЕдЕда дасаЕаЕЕЕа садЕдЕЕааЕ сссдассада ЕЕЕдЕсаасс асссааассЕ ссЕЕЕдаааа ЕсаЕсдЕсаЕ ааадЕдсасд ЕссадасссЕ сддсЕаЕссс сссЕдЕсЕЕа дЕсЕдаЕдЕд сЕЕсссЕЕдЕ дддаЕаааЕд ааааЕдЕдаа дсЕсЕЕссЕЕ асссаасасЕ аддсссЕдЕс ЕЕЕдааасЕд ссЕааЕаЕаа ЕЕдЕассЕдс саасЕсссаа дадЕдсЕдсЕ саЕссЕдаад дЕдЕддЕдса аддаЕЕаааа садсЕаЕдса ЕдЕдсЕЕсад адааддааса сЕсЕаадсаа адддадссса ддддсаЕсад дасадасада ааасаааааа ссаааЕЕдЕа сЕасааддсЕ ЕсЕаЕддсад адддсЕЕдЕа сасасасаса дадссссЕас дааасссааа даадасадад ддЕдсЕдада аасссЕдЕсЕ асссЕддЕЕЕ аЕЕдааадЕд аЕаЕаЕдссЕ аЕасссЕдда ссЕддаЕссЕ
22200 22260 22320 22380 22440 22500 22560 22620 22680 22740 22800 22860 22920 22980 23040 23100 23160 23220 23280 23340 23400 23460 23520 23580 23640 23700 23760 23820 23880 23940 24000 24060 24120 24180 24240 24300 24360 24420 24480 24540 24600 24660 24720 24780 24840 24900 24960 25020 25080 25140 25200 25260 25320 25380 25440 25500 25560
- 74 014525 ссддаададс дсЕааадада сдЕаасдЕда ЕадсадсЕсЕ ЕдсЕЕЕдаад ЕЕддддаадс ЕЕЕсссЕдад сЕЕЕЕдЕЕдд сддаЕсЕсЕд сЕасасадад сааааасдаа ЫхЬЬЬдЬссс ЕсаЕссддас ЕсЕддддсЕд адсааддадЕ сЕдаЕдЕдса Ессасадасс ЕдддсЕдддс ЕдддаЕЕаса ссадаЕсЕда ддаЕЕсЕасЕ дсадЕЕсЕЕа адсдаадсад адааадддЕс аЕасаЕддаа саддЕЕсасс ЕасЕдЕсадЕ адсЕсссЕда ЕсасаЕЕсЕс аЕаЕдаЕЕсс ассЕддадсЕ дддаддаада ссадЕсЕсЕс адаааддада асЕдадЕасс дЕдддасЕсс даЕсЕдааЕд аадсЕасЕЕЕ ЕсЕсЕдЕаЕс адаааЕсссс ддсссааадс дЕЕсаЕЕдсЕ ааасаассЕд саааЕсЕаса сЕсаЕЕдсЕа сЕЕЕдддаЕЕ Едддададас сЕадсаадаа аЕЕааасЕЕЕ дддааасада ЕссЕаЕадад ЕЕдЕссЕссс ЕаЕаЕдаддд дЕсЕддадаа сасасасаса дадсаадЕас ЕсЕЕдсссЕа адасадссадсаддадасаа дасЕадддса адЕсЕЕаЕЕс ЕддсЕдаддЕ ЕсссЕдссЕд садЕсаддсс дЕддаддЕад ЕдадЕЕсаса ааасссЕдЕс сааасадааа ЕЕЕдссаЕЕЕ асасссадаа ддЕддаЕЕдд аЕдЕддЕдса ддЕаЕдддса ссЕссссссЕ ЕддсЕадсЕЕ дЕсаЕаЕаЕд дЕдсЕЕдсаа ЕЕсЕаЕЕааа ддссЕдсЕда аддасааада адддааддаа ссЕддЕдЕас асасЕдддаа саЕдссЕдаа адаааддсаа ЕдЕаЕдссЕа ЕссЕЕЕЕссЕ ддсадЕдддс Едааддассс сЕасадаЕдд дддЕдаддса адсЕдсдЕдд ЕадсссадЕд ЕддЕссадсс ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ асссЕадсЕд сЕдссЕсЕдс ЕасЕЕЕаада дЕадааЕЕдд ЕЕсЕасдааа адаааЕадЕд адЕасЕддда ЕдадаЕддЕс ссаЕасассЕ ддссЕЕсссЕ сЕЕдЕЕасЕд сЕЕдссЕдда ааааадаааа сдаддаддЕд ЕсЕддддЕаа ддЕсасЕаса сасасасаса адЕасЕЕааа ЕдадЕЕдааа сдсЕсЕЕадс аддададЕЕЕ дддЕдаЕссс сЕЕааЕаадЕ ссадЕЕаЕсЕ ссЕдЕаааЕд адЕссааадс сасЕЕдссЕЕ дссадссЕдд Есдааааааа аасаадссад ЕадасЕаааа ссадаЕдЕаЕ ЕЕадаЕддса Еадсааасда саЕдсаадса ЕЕЕаасаЕдд дЕаддЕссса адсасассЕд ддсааЕсддЕ дЕаЕЕЕсЕаЕ дадЕсаадЕд ааЕдаааасЕ аЕдаассада аЕдЕЕаЕсЕд асадаадсса даааЕддаад даадсЕдддс дсадддсадЕ асадЕсаЕсЕ адсЕдсадЕд ададдассас дадасададд дадассааад садасадсса сЕддсададд СЕадЕЕЕссЕ ЕдЕЕЕЕддЕЕ ЕссЕддаасЕ сЕссЕаадЕд дададададд адЕсЕЕсаЕа ЕсЕсЕсаЕдд асадЕсасад адаЕдаааас ЕЕЕЕдсадад ЕЕЕдсЕдссЕ ддаЕсассса ЕсдЕсааадс ЕддаЕаасЕЕ ЕЕадсЕддса дсдадЕаадд саадааддсс дададЕЕсЕс сасасасаса аЕЕдЕдЕдаЕ ассаааЕддс сасЕаадсса сЕЕЕЕадЕса ссадЕдасас сссадЕЕЕдд асЕЕссаадЕ ЕдЕссаЕЕсЕ ссЕЕсааЕЕЕ дааЕсссадс ЕсЕасддадЕ сааааасааа адЕдЕЕЕдЕс дасЕсдддаа ддаадаЕддс ЕдддсЕдддЕ ддаадЕЕЕдс даадссаадд дсаЕсЕсЕса дддаЕсЕдса дсЕЕЕЕЕЕаЕ ЕдааЕдасЕд ЕаааЕсааЕд дддадЕдада ЕдддаЕЕсда ЕдааЕададд саЕддддЕЕЕ аааадаадад сааЕЕаасда ЕдЕдддсасЕ аЕЕддадасЕ ддддсЕссЕд аЕадаЕдЕсЕ сдассЕсЕдс сдададаЕда дадддаааса аЕдссааддс ддадЕдсЕда ЕссадЕЕдсЕ ЕддЕЕЕЕдЕЕ сасЕсЕдЕад сЕддааЕЕаа ааЕдЕаЕаад ЕЕссаддЕаа асЕсссЕЕсс ЕсЕсЕаасдЕ ЕЕЕассЕадЕ сЕссЕааЕдд ЕаЕдЕсассЕ ссассЕЕдса асадЕсддЕс дЕасаЕЕдса сасадаЕада ЕдЕаааЕдЕЕ ЕдЕдааЕаЕа саасЕсадЕд ссасааадаа ЕдЕдЕдЕдЕд сссЕдададд
ЕсасЕдаддЕ аЕаддассаЕ сдаЕддсссЕ ддсаддадаЕ асЕЕдЕЕЕсЕ ЕсаассЕЕад адсЕЕЕсаЕа аЕЕаадаадд дадЕЕссаад адаааЕааад сссдЕаЕЕЕЕ адсаддЕсЕс ЕааЕдЕдсЕд дЕддЕЕасда асадаасаас дасадссЕЕа ЕЕддссЕдда ЕаЕсЕсЕдсс дЕдддЕЕсЕд сЕЕсаЕсЕсс адссссЕдсс дсаадссЕсд ддсЕсдддаЕ саддаадддЕ дсаЕЕдсааЕ ЕаддЕддЕдЕ Едсдссдсаа даадддадсЕ дадасЕЕдас адсЕЕсдЕсс дсаадааада ЕдссЕдасаа аЕддЕсаддд сЕЕдЕдсЕсЕ ЕсддсЕдаЕс аЕддЕдсаЕд дддаЕааадс ЕддЕЕЕЕЕсд ассаддсЕдд аддссЕдсдс ЕаЕЕаЕааЕЕ ЕсЕсссасад ссадЕааЕЕс ЕЕЕдддсаЕд дЕсадсаЕЕЕ сЕасаЕддад дассЕдсЕсс ссЕссадаас ЕдддЕЕдЕаЕ ЕааЕдЕсЕад ддсссЕддад саЕддаЕдЕа аадсасЕдаа сссаЕасаса аааааддаад асЕсЕдаЕдЕ саЕаасаасс
ЕсЕЕЕсЕдЕд дааЕдЕЕссЕ дЕдЕадЕЕаЕ аЕдЕаЕЕссс сЕЕЕсЕддад асаадаЕсас аддаасассс сададасадЕ асадссаддс ааааадаааа аЕЕааЕсаЕа ЕсЕсЕдЕЕЕс садЕЕдсаса ЕдасЕдсадд асЕдЕдЕдЕа дддЕадЕдЕЕ дсЕЕдссаас ЕсссЕадЕдс ддсЕЕЕдаас ссадасссЕд ссЕдсасЕса адассссаЕс аЕддадаЕас адддсссЕдс ддсЕсЕЕсад ЕддадЕсада ЕЕаддаЕаЕЕ ЕЕдааЕдаЕд ЕЕдЕдЕдЕсс ЕЕдЕссаада ЕсЕдаааада адсЕдсадда даддадЕсад асадсЕасЕд аЕддсассЕс дЕЕЕддаЕаЕ асссЕдасса аддсадддЕЕ ссЕсдаасЕс сассасЕдсс ссаддЕЕаЕа асаЕдссаса ЕааасЕдЕдЕ адЕсЕдаадЕ ддадсададс ададддддсс ЕЕдддаадсЕ Есададссаа сасЕдЕсааЕ аааЕдаааад даддсЕддсЕ ааЕдддссса ддЕаЕдЕсЕа сасасасаса аааааЕсЕда сасаЕдсЕса асасЕдЕЕдд
25620 25680 25740 25800 25860 25920 25980 26040 26100 26160 26220 26280 26340 26400 26460 26520 26580 26640 26700 26760 26820 26880 26940 27000 27060 27120 27180 27240 27300 27360 27420 27480 27540 27600 27660 27720 27780 27840 27900 27960 28020 28080 28140 28200 28260 28320 28380 28440 28500 28560 28620 28680 28740 28800 28860 28920 28980
- 75 014525 сЕдЕдЕдсЕс Едсадсадас ЕЕсадааадЕ дасЕсЕаддс ЕсЕЕЕсссЕс ЕссЕсссдЕс ЕЕадасаЕаа аЕЕсЕдЕдЕс дадЕсдсссЕ ьдд^ддсасЕ дддсааЕдЕЕ ссаЕдддЕЕа даддсааада ЕдсЕЕадЕдЕ ааааЕдсаЕЕ ЕаЕассаЕдЕ ЕадасадЕЕд ссЕЕЕдЕааа аЕЕсЕсааад ЕсдадЕсасс дсЕсаЕдааа саааадсаЕд ЕасЕЕЕаааа ЕддааасЕда аададададЕ сссаадааас ЕсЕдссаЕаа сЕсЕсссаса дЕдддааЕда аасЕдаЕсЕа дсЕЕЕдаЕЕс аасадссЕсЕ ЕЕаЕсЕдЕЕд сссаЕЕЕЕас сЕаЕдЕЕсЕс аадддЕддад асЕЕаадЕЕЕ ссЕсааасЕЕ ЕЕааасасЕа сЕЕаЕдсЕда садааЕсЕЕс ЕддсддсдЕа ЕасаааЕсЕЕ асЕадссЕса ЕсссЕЕсссЕ ЕЕЕаддЕЕдс ЕасЕдддссЕ дааасЕсЕдЕ сЕддссааса дссададЕса аадЕсасссЕ ЕЕЕдсададЕ дЕЕдЕЕЕаЕЕ садЕсдддЕд аааадаааЕа сссЕддддаа сЕсЕааЕсЕс асдЕЕЕЕЕсЕ ЕасаЕаЕдсЕ саЕсЕдЕддс ЕддддЕддаа ЕдЕддсЕсса сасЕЕадЕЕс дсЕЕЕддсЕс ЕЕссасаЕдд садЕдЕсЕсЕ сЕдддадЕЕс дддаааассЕ адаадЕсЕад ааддЕдааас дЕдЕдЕдЕдЕ сЬссЁааааа д£дЪд£с£дд ЕдасасЕссс дсадсаддЕд аддадЕссЕЕ ааадсЕасЕд сЕЕаадЕаса саЕдЕасасс саЕсасЕЕсЕ асааддЕада ЕссасассЕЕ ЕадЕдсдЕЕЕ даЕсЕссЕдс ддссссЕЕсЕ ЕсаааЕасаа дддадсЕддс ссадсассса ЕсЕдассЕсс аЕссаЕсЕсЕ даадаЕдЕса асссЕЕдсаа ддсЕасЕдад ддЕсЕЕддаа сссасасаЕд саЕааддЕад аассссаЕсЕ аЕдааЕддаЕ аЕдассЕсса сЕЕаддсЕЕс ддЕадЕЕаас дЕЕсааасса садЕаЕЕЕаЕ садддзсада сЕдаааадас сасадссаЕс дадЕЕЕдсаа ссЕЕсЕсаад саЕсасдддд саддасаЕЕа ЕЕдсддЕдЕЕ ааЕдаЕаЕса сдаддссддд ЕЕдаЕЕЕссЕ
ЕааадсдЕсЕ садсссЕдаа Ессаддассд дсаасдсЕЕа ассЕддасаЕ ЕсаасааЕаа аЕЕсссссас ЕЕадЕЕассЕ аддЕдаЕдсЕ ааадссадсс ЕЕсЕсаааса асдадссаЕд ЕсЕЕЕдасЕЕ дЕдЕдЕдЕдЕ ЕаЕдЕаЕаад ЕдсЕдаадда саасссссса ЕсЕаЕдаасс саЕаЕЕЕссс сааасссЕсЕ сасасасааа аЕЕсЕЕаЕЕа дссЕЕЕЕддЕ даЕсЕадааа ссаддаасас ссЕдЕаЕдса аЕссадасаа ЕдссЕддсад ЕЕаЕсаадда ЕсадсадЕЕа саЕдаЕддсЕ аЕадасаада сЕадссЕсаЕ сЕдсссадЕс ЕЕЕаЕаадаа аЕддсЕсЕад ЕссасаЕддЕ ЕдсЕдЕддсЕ ддЕЕЕсЕЕса ссаЕЕдЕдсс ЕааЕдадсЕа ссаЕдаЕдЕЕ сададЕсдЕд сассдааааЕ садЕдсссЕа дЕаасаасаа дасаддЕдда ааЕаЕддЕда ЕсЕдсасаЕс дЕдЕЕЕдЕдд сЕадсадсас аЕдддддадс ЕЕдадддсса аддЕЕаЕЕЕс ЕЕЕЕЕсаЕЕс асадсдсддс сссЕсЕдЕсЕ дЕсЕддЕЕЕд дЕссЕЕсЕад ссЕдсасЕсЕ ссЕсЕдддас ааааЕадаЕд сЕасЕсЕдад ЕадсЕсЕЕас сЕссЕЕссаЕ ЕдЕаадаЕаЕ ЕдаЕсЕасас аааададддд дЕдаЕдсаЕа Едаддссадс дЕдЕдЕдЕдЕ ЕаЕЕЕдссЕд сЕаддсаЕад ссаЕдЕдддЕ сЕдаассаЕс ЕааасЕдаас ЕадддаасаЕ сасасасаса дасЕаЕдсЕЕ дддсаддЕЕс Есасадсадд Едадсадддд ЕдссЕсЕсад дссЕадддда ЕаЕЕЕЕЕЕЕа аааадЕаааа ададЕЕсЕдд ЕЕсаасЕдЕа ссЕадЕссЕс дссадаЕсаЕ аЕЕЕдссаЕд адаЕаЕсЕдс дддЕаааддЕ ддадададад ЕаЕдЕдЕаас Едассссаад аЕсЕддааад ЕЕаадааадЕ аЕссадсаЕд адсааааааа даассааддс ЕЕаЕсЕаааа ддсссдЕЕда дсссЕддадЕ дЕдасссддд ЕдЕадЕЕдса асЕдааЕдса ЕддсЕЕсддс адддссссЕс адаЕдасада ЕдЕдЕсЕдса аддсаасЕад ЕссЕдадЕсд дЕЕЕссЕЕсс сЕдсЕадсаЕ ддЕдсаЕдЕс сссЕсЕдссд аадЕаЕааса саадсЕдЕдЕ адсасЕЕаЕЕ ЕЕсЕЕЕаасЕ ссЕддЕЕсдс ЕсЕЕЕсЕаса адсаадсЕсс ЕЕсадЕЕдЕс ссЕЕЕсаЕсс ЕаддЕЕасаЕ дЕдЕдЕааЕЕ сасаЕасдса асЕсссЕада дсЕЕдаадсЕ ЕсЕссадЕсЕ аЕссЕЕаЕса ЕсасЕаЕЕса сасасададЕ ЕдсЕаааада саадаЕЕддЕ Есадаадддс дсЕдддассЕ адаЕЕссаЕа адЕЕдададд ЕсЕддаддад аасаЕаЕаЕа сЕдсссЕЕдс ЕсЕсЕдсЕЕс Едсаададса ЕЕаааасЕас адЕддаЕаЕЕ аЕЕЕдЕсЕсс дсЕЕдссаса аададаЕЕсс сссааЕаадЕ дааЕдаЕдсс адасааЕЕдс ддсЕЕддЕЕа ааддЕссЕса дсасассЕсЕ адЕЕсЕааЕа даЕааасЕЕс сасасаЕсЕд ЕЕдааЕЕсса аддаЕаЕсЕд адссЕЕЕЕдс сдЕдЕЕдсЕд садсЕдсЕса ссЕадаасас ЕаасЕсЕаЕс даааасадЕд аЕЕссдЕддЕ сЕаЕЕЕссдЕ ЕсЕЕдсЕддд саддсадасЕ ЕсЕЕсадааЕ сдаддсЕдса ЕдЕЕддсЕЕЕ ааЕаааЕаЕЕ ааЕаддЕддс сЕЕЕсааасс ЕЕсЕЕссЕЕс аадсЕдадад аддаЕаЕсса аддаддадас аадсасЕЕад адЕдаЕассс ЕаааадЕсЕа ЕдЕаЕдЕаЕд асЕададЕса ааасЕссЕдЕ ссадаЕдЕдс дЕдадсаЕсс сЕЕсЕасЕЕд саЕдсасЕса сЕЕЕссЕада асЕддсдЕас садссЕдЕас ЕдссЕсЕсад адаЕсЕдссЕ сЕдссЕдадЕ аддааЕсадд ЕаЕаЕаЕаЕЕ ЕЕсадаЕсЕЕ саддддаЕсс ссаааЕдсЕс ЕддасасЕдЕ ЕсдаЕЕсЕЕЕ Едададааса аааЕсЕдаса сдЕаадЕЕдЕ ааадаЕадЕЕ ссЕдаЕадад аЕсссддааа ЕЕдсасаЕдс ссадаадЕса аааЕаааЕЕа саааассасЕ аадссаадсЕ ЕаасЕссЕад ддЕЕсЕдЕда аЕаЕЕдасЕЕ асЕаадЕЕЕд дЕдаЕсЕаса ЕЕсаадссЕс саадссЕдЕд асЕЕддссаа саассЕддас асааааддсЕ сЕдЕсаасЕЕ дсссадЕдда
29040 29100 29160 29220 29280 29340 29400 29460 29520 29580 29640 29700 29760 29820 29880 29940 30000 30060 30120 30180 30240 30300 30360 30420 30480 30540 30600 30660 30720 30780 30840 30900 30960 31020 31080 31140 31200 31260 31320 31380 31440 31500 31560 31620 31680 31740 31800 31860 31920 31980 32040 32100 32160 32220 32280 32340 32400
- 76 014525 дЕсЕдЕдЕас дддддаадсЕ ааЕЕЕаадаЕ ссссдсссЕд ааааЕдЕддс сЕсЕдссадс ссаасЕЕЕЕд адддааддсЕ ЕЕадЕЕадсЕ ддЕЕЕссдсс саддьдддсс аЕаЕдадсЕс ЕдадаасЕдд дсададаЕсЕ сЕдЕсЕсаад асасасаЕдс саааЕасаЕа сЕссЕЕадЕа сЕЕсаЕсЕЕд ЕссдЕсаЕЕс даЕааадаса ЕЕсЕдЕЕсаЕ сЕЕсассаса Ессаассадс ЕЕЕсссЕссЕ аасдаЕЕаса дсЕдддаЕда ссдаадсЕда ссЬ^ссз.с^Ь ЕддЕддЕдсЕ ЕЕЕЕсЕдсЕЕ дсадааадаЕ аЕадЕЕасЕд дадасЕсЕаа дааЕддассс аЕддЕсЕдда асЕддсадсс ЕддаддддсЕ ааддЕдсЕдс дЕЕЕадддад аЕддЕЕдаЕд ЕдссадсЕЕс ЕасасаЕсса ЕдададЕдЕд адсЕаЕсЕсс адсассссад дссдЕддасс сасаассаЕЕ ЕЕдадасадд ЕддссЕсдаа сссаЕЕсЕЕа ЕЕадсЕдсЕд аЕсссЕдасЕ сссдаасаад ЕЕасасЕсЕЕ сссЕаадсса адЕсассаса
Есасадддад дЕсддсссад, ааЕдадЕсЕс ЕсааЕсЕддс ЕддассдЕдЕ сссддЕдссЕ аЕдаЕддЕдЕ сЕЕсадддад ЕссассЕддЕ сЕсаЕссасс аЕЕддЕсасЕ асЕдадЕссЕ адЕЕсааЕЕс ЕааадсЕссЕ ааасаадаЕд асаЕасаЕсс саЕааааааа ЕссЕддсЕас асЕссЕсЕдЕ аЕааасЕссс сасасЕасаа ссддссадсЕ дсЕссЕссаЕ асаддсссад дааЕсЕасса аддаадссаа аЕЕсасаЕЕЕ дЕссаддаад ддьддьддьд ЕЕасаааасЕ дасЕЕаЕдсс ЕсаааадЕаа ааЕссадаЕЕ адаЕадаадд садаадсаЕс сЕдаЕдаддЕ ЕааадсдЕда ад^дддадсс дЕддддаЕЕЕ адЕЕддаасЕ сасаЕсЕдсс ааададдаад дсаадсссЕа ЕдадсЕддаа садссЕдЕдс сасссасадд ЕЕЕсасаЕса дЕЕЕсЕсЕдЕ сЕсадаааЕс аЕддЕдаЕсс ЕсЕЕсЕдадс сдддсссдаЕ ЕссадЕсссЕ ссссЕЕдсЕс ссЕсЕдЕаад сссЕсЕддад дадддбддса ЕдасЕЕЕЕЕс сЕсаЕЕсасд ЕаадЕаадас дссддсасда ЕЕЕссЕЕЕсд дсдссдддЬд ЕсаЕсЕадсс сссЕЕаЕссд ЕЕдсссЕЕЕЕ ссдсЕассас дсдддаЕддс ссадсасаЕд ддссадасад даасаЕсааа асасасаддс ЕаааЕасаЕа дсЕсЕЕдЕса асЕЕЕдсаЕд ЕсЕаааЕЕЕс адЕсассдЕд аадЕадЕсса дсЕасссадс ЕсЕддсЕЕсЕ ссЕЕсЕЕЕсЕ ЕдаааЕЕадс ссаддссЕЕЕ сЕдааЕЕЕаа |-|-г а г Ь гг а г*п ΊдЕддЕддЕдд ЕЕЕсЕааЕЕс ЕаЕаЕаадаЕ ЕЕсЕаЕЕЕаЕ аЕдЕаЕЕЕаа Есасддсаса садададддЕ ассададаЕЕ сЕдЕадсадс асаЕдададд дЕддЕдЕдда аааасадддд ссссассссс адЕадссЕас ддсЕссЕдЕс сЕаЕЕЕЕадд ЕЕдсдЕаааа асаадЕаЕдЕ ЕддсаЕсЕЕс дЕадЕссЕдд сЕдддаЕЕаа адЕддЕЕдаа ЕассЕддЕас саадЕссадЕ адсЕсдаЕЕа ЕддасЕЕдЕЕ асаасЕаада дЕдЕдЕддас аадсссЕддЕ сссЕЕЕсЕсЕ ЕдЕдсЕсасЕ аадЕсаааЕЕ аассадддаЕ даааддадас асЕсЕЕЕааа сЕсссЕЕсад сЕдЕсЕсЕдс адЕЕссЕада ЕдЕЕассаЕд ЕЕддЕЕддЕа даЕдЕаЕЕЕс сссадссЕаа ддЕсаассЕс ааасасаЕдс сасасаЕаса сссссасЕаа ссЕЕЕЕссад ЕЕссссЕдсс ддассадЕЕЕ ассЕсЕсЕдд ссЕдсааасс аЕдЕссЕада сссЕЕсЕссЕ адЕЕЕддддЕ дсЕЕЕдсЕсс ааЕсасасЕс гтЬгг+- г»1-гтгтгт1Э Э г-33 О’ЕддЕддЕддЕ ЕЕаЕасааад аЕааадаЕда асасссЕЕаЕ аааааааЕЕс адЕаЕддадЕ ссаадасааа дсЕаадЕдда ссЕссдсЕда ЕдаЕдЕсЕЕд дасаддсадс ссаЕсасасЕ ЕдЕсЕддсас ЕдддсаЕдсс саддаЕдсад ааЕааддаЕЕ дсаадЕдсЕд аЕдсаЕсЕдЕ сЕаассссса сЕдЕссЕдда аддЕдЕдЕдс аЕЕЕсдддсс ааЕсЕЕЕаЕс ЕссЕдддссс дсЕсаЕссЕд дсЕЕЕсЕЕЕа ЕааЕасЕЕсс асаЕдЕЕсаЕ ссЕсЕасддд ЕЕЕЕсЕЕада аЕЕсаЕаддд Еаааадддаа ддсддЕсЕаа ссддаддЕаа аЕдЕсаЕсса даааадаЕЕс ссасЕадЕсс аадсадсасс дссассаадд аЕаЕдсЕЕдс садсассЕдд ЕЕадЕааЕса ЕЕдЕсЕссас асасассЕда ЕасаЕасасс ддсЕЕсаасЕ саааддсЕЕЕ сЕЕЕЕсЕЕЕс аЕЕсасссас ЕдсЕдЕассс ЕЕсадссЕад ааЕсЕссЕЕс дассЕсЕааЕ ассЕсададЕ ссддаЕЕсЕд садсЕдддЕЕ г-ггтгч агт-Н гтгг+т'г ддЕддЕддЕд дасаааЕсЕд сЕЕЕаЕдсса асаЕддЕаЕЕ сссадЕссЕЕ сддадЕдЕдд ЕдссЕсдссЕ ддааЕасадд ддддсЕссад дадЕсассЕс сЕсааддаЕд ддсЕсссаЕа садсЕсаадс ассЕсЕЕсЕд ддсЕдссада аЕдсссдссс ЕЕдаЕЕЕаЕс ЕЕсаЕдЕаЕс ЕЕсЕЕЕЕЕЕд асЕсасЕЕЕд сассасдссс асасасаЕдЕ сссЕддддсс даЕсаадЕсс дсЕсссЕддс сЕсаадЕЕдЕ сЕсаадсасд дсдЕдЕддЕЕ с^дддддаад аассадЕаЕс асЕЕаЕссас сдЕЕЕЕЕсЕа дЕЕасаЕдсЕ аасдаадЕЕд ЕассЕдддаЕ сасЕЕссддЕ ЕсаЕссаЕсс дЕадЕсЕЕдд ЕдЕсаЕЕЕаа ЕдсааааЕсд ааддсаддда дЕдададасс асасасаааЕ асасссЕсса аасаЕЕсссЕ ЕсЕЕсЕаЕЕЕ ЕсЕЕЕаааЕс ЕсЕсЕаддда ссассссЕдс ЕддасссЕдд ссЕсЕддЕЕс аЕЕсЕсЕсса дЕсЕЕддЕса садсадддда асаддсадЕЕ сЕдаддсадс г-ι 1“ гтггЬгггтк- ГТГ1 ЕдЕдЕдЕдЕд ссЕсаЕаЕад сЕЕаЕЕадса дсЕЕЕЕдЕЕд ааааддЕдаа адЕссЕдсса ссЕааддаас аЕсадассса дЕдддсдссс дддЕассаЕЕ сЕЕЕЕсааса дсЕсЕдддсЕ ЕсЕдЕдаЕЕс дассаЕсадд ЕаддаЕдсЕс ддддЕЕддсс Еааааасада Едаааадсда ЕЕЕЕдЕЕЕЕЕ Еадассаддс ддсссЕаасс ссаЕЕаддда ЕдддсЕссЕд адЕЕссЕддд сЕдЕЕсЕЕас сЕдссасадЕ дааадЕссЕд дсдсЕЕасдЕ
32460 32520 32580 32640 32700 32760 32820 32880 32940 33000 33 060 33120 33180 33240 33300 33360 33420 33480 33540 33600 33660 33720 33780 33840 33900 33960 34020 34080 34140 34200 34260 34320 34380 34440 34500 34560 34620 34680 34740 34800 34860 34920 34980 35040 35100 35160 35220 35280 35340 35400 35460 35520 35580 35640 35700 35760 35820
- 77 014525 асдЬдЬдс
35828
Еададдадаа сЕдадддааа ададдддсЕЕ ЗдЕддсдЕдс ссЕдсЕддЕа ЕдаЕдссасд даасаасаад дассаааддЕ аасЕЕсЕсЕЕ ссадсасЕдд дссЕЕсаааЕ даддасдсЕд аааадаааад ЕассасЕддд сассддасас сссаддаддЕ ддЕадЕдада ЬдЕддддддд ссссЕдсадЕ ЕЕЕЕсддсас адсадсаЕсс сЕЕдссЕсаЕ асададаадс аЕдддддсдЕ аддЕддсада ЕдЕЕдддасЕ ЕсЕЕсааааЕ ЕдддсЕссад ЕддасЕссса ЕсЕдсададд ЕсссЕдддса ааассадссс ЕдЕдсЕЕдсЕ ЕсЕЕаадасЕ дддЕддасЬд ассаЕаддад ЕсЕдссЕдсс дЕдсссадса адсЕсадддс сссадсссад ддЕдсЕддда ЕЕЕЕсЕсЕдд ЕдаЕЕссЕЕЕ ссасадсадс дЕссассссЕ ЕдЕдсЕдадЕ аЕаадаадас аЕаЕдЕдсса ддсддсссаЕ
<210> 18
<211> 9301
<212> ΌΝΑ
<213> Ното зархеи
<400> 18
дЕсЕЕЕдддд саЕдддасса Еаааааддсд ссЕссЕсЕдд сасасадссЕ даааЕсаЕсс ассаЕдаасс аЕддддЕдда сдддаддсЬЕ Есдаддааса ЕсаддЕдсад дддЕддЕдад дСЬЬсааада аадддаасаа ЬсЬаЬдседд даасссссад ададсЕдадд ЕдЕдддддас дЕдсаЕЕдсс адЕЕЕЕадсс ЕсЕдЕдсадд Ессаддддад ссаддЕдаса сЕдаааЕдас даадЕссасЕ аЕддддЕдсЕ ддаддасаад сдасЕдссЕд сдададдсса аадЕдссЕдд ааЕдссоосс асадассада сЕЕсададЕд аЕЕЕЕЕсаЕЕ дЕасЕсасас асаЕддЕсаа садддадЕаЕ дададссадд сссЕаЕддЕа ссЕсссаЕдд ссссадддаа сЕдддссЕса саадЕсЕааЕ ЕдсссЕдаЕЕ сссаадЕддс асЕЕасссЕд сссадаадад ааЕддЕаЕЕЕ ЕЕЕдсадаса адддЕЕЕдсЕ дсссЕдсссс ассдЕдЕсЕс сЕддЕассаЕ ЕссдЕдЕадЕ ссдадсЕсдд дддсддадаа ддададааЕЕ ддаадасЕдд дЕсЕЕдссЕд аддсаЕдадд ддЕаЕддсаЕ аЕсЕссЕссЕ ддЕаадддад ЕддЕддсЕдЕ сЕсдаадддд ЕдЕдаассЕд адаЕсЕссас саЕддссЕдс ссЕдасаЕдд адЕадддаса ддадааддаа дЕдЕдсаЕсЕ асЕЕсадасЕ дсссаддсЕс ааааадддса„асЕдсаЕддд ддсдссЕссс аадддсЕдЕа садссссЕда ссЕаддддсд Едассасаса аадсадсссс ддддЕддддд сЕЕЕсЕЕдЕс дасдассадс ддЕдЕдЕдса сассаЕдадд ЕсааЕдЕЕЕд ддааадЕаас аЕдсЕсдаас дЕддадЕссд дЕаЕЕсЕсаЕ дааЕЕсоЕдЕ ЕаЕЕассЕЕс Еддаааадда сссаддссад аааЕдаЕааЕ ЕсЕдсаЕЕдс ддаадаадад сЕдадсасас адссЕдЕссЕ ддсЕддадас дсадсЕссса ддадддссад ададЕасссс сддадддсдд сЕЕадЕаааа ддЕадассса даддЕддддд саасадасдс садддсаЕса дддааЕаЕад ссЕсссаЕсс ссссассаса аадааасадд дЕЕЕдаЕсса ааадсадЕдд ссадддадсЕ дЕдсадсЕда ЕсЕдЕссЕса даддаасссЕ ддсЕсЕаЕаа аададсЕЕсс сЕддасссса ссоасадсЕс аддаасссаа ддаадссаса сЕаЕЕсЕсда сасаЕЕссад адасдаЕддс дЕддссЕЕсЕ асаЕЕддаас ЕаЕЕЕааааа ддддаЕсадд сдсссаЕЕса ЕддсадсЕда дасадЕаааа дсададссЕс дадаЕдсадс ЕдаЕааЕдад ссЕдаЕсасс ааЕЕаассЕс аЕЕЕдддада ддасссЕдсд ааЕааЕасаЕ дЕдЕдЕааЕд ададдЕЕаад сссЕЕЕсссЕ саЕЕддсЕдд сададссЕдЕ сЕддсссЕдЕ ЗЗдЬддсадд дадссЕссас ссЕссссасс даЕссЕдддд дЕдаадаЕЕд аадааЕддсЕ ЕддЕдададс даасаддсЕс дадссасдЕс асадаасадс садасссаса ЕЕссаддсас асЕдсаадаЕ ддаддааддс ддсасЕЕдаа дЕссаддссс дсадссассс дддЕЕссЕдд ЕЕддсаддаа сЕдЕссЕсЕд дсссЕссссд аддс с аде са ддасс с Е ссд сссЕЕсЕадд асасааааЕд ЕдсЕсаааас ааадссдсаа сссЕдсадад адЕддссаса сЕдЕссссЕс ЕаЕссссаЕд дсЕсссассс ссаддссЕсд даЕаасасад ассЕдЕаддЕ адсадсссЕс сасЕсЕЕдсс ссадссЕЕЕЕ ддддЕЕддас ЕссссЕЕсад ЕасЕссЕЕЕс адссададсс дсасаадЕдЕ аасадссдас даЕЕаасЕсд даасЕЕдссс сссЕссдддд саЕдаадсад дсЕасЕддаа дЕсЕсдЕсЕд сдЕЕсаадаа сддадсЕдда ассссЕЕЕда аддЕЕЕЕада сЕддссЕсЕд сдсЕддЕдса ссадддсадд аддддсЕсад садсЕдсЕдд ассЕдЕдддд ЕсаЕддааЕс ЕсадЕаасЕЕ адсссЕддЕд садададдса ддааЕдддад Еддаддддад садЕсссаас ЕсаддссЕдс ЕссЕдаддсс дссаЕЕаЕсс ссЕсасаасс сааддЕсадс ЕссассЕЕдс ааадЕсаЕда ааЕдсссссЕ дЕдаддаЕдс ЕсЕссссЕдс ЕсЕддЕЕЕдд ааассЕЕЕдд аЕсЕаадЕсс дадсссааЕс аасаадаааЕ ЕЕЕдддЕсад адсЕссаЕсс ддадссаааа дддсаадъьс асасЕдссЕЕ ЕсссЕсдссЕ ЕссаЕссссЕ аддсадаадд ддсЕЕаааЕс дсЕЕЕсадсЕ сааЕдсЕЕдд аадаЕдасас
120
180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2830 2940
- 78 014525 сЕдсадЕдад садддЕдсдс ЕдЕЕсадддд дасдддссдд ссасадасдЕ ддссдЕдссд сдсдссЕдсЕ ЕссдсЕдсаЕ аддсдссдсд дсЕЕссасаа дссддаадсс ссЕасЕадад сссасаЕЕЕс асссадддса ссссЕсадсс сасЕдадсса аддсадаааЕ ааадЕссадд садааадссЕ дЕссЕддсЕс сЕсааЕЕЕсс ддсаЕаЕдаЕ дааададада дадЕЕдЕдаЕ ададЕсЕаЕЕ ЕЕсссадссЕ саЕсаЕссаЕ аЕссдсссса ЕсассЕЕссд дссаЕсасаа сасддасаса ЕЕасасЕааа ЕдсададсаЕ ЕасЕЕЕсЕдЕ ЕаЕдааадсс аадааЕдааа аЕЕЕаЕдсаа адЕсЕдЕЕсЕ даЕдЕддЕсЕ ЕсЕЕддЕсас ддсааЕЕаЕд аЕЕЕсЕЕсас ссаЕдсЕддс ЕадсЕссссс дсЕЕдасЕсс сссЕдсЕЕсс аддаЕЕсаса даЕсссЕсЕс ЕЕсЕдЕЕЕЕс сЕддсаЕада ЕсЕЕсдаадЕ адссЕссЕдс ЕадсЕдадЕЕ ддЬдддаЕдд сссасааада ЕЕдааЕЕааЕ сЕЕссЕдддд сдаЕддадсс аддададсЕЕ саааадссЕс Ессадддсад дЕссдадЕас садсдссаад дсссаасдсс ссссдассдс сдсдсдсаад ссадЕсддад дсддссссдс сссдсссдсд ЕдЕссЕсЕдс дддддсЕдад сдссадсЕда сдсадссссд ддаадсаЕЕЕ дасЕддЕЕаа даддсдЕдсс ЕдссасЕаас асЕЕЕдЕааа ЕссааддасЕ дааЕдааЕдс дсЕсЕсЕЕсЕ ЕаЕддсЕдас ддсЕЕссссд Ьдддд^адаа асЕЕсссааа аададаадЕд асЕсасадас ЕЕЕсЕдссЕа адааЕаЕЕаЕ ааЕадсЕдсс дЕадЕЕЕЕЕа ЕдсаддасЕд дЕ адЕ ддЕ ЕЕ аадЕЕЕЕЕсЕ ЕссададЕсс саЕЕЕЕдЕса ЕададсЕсса ЕсЕЕссЕЕЕд ссадддсаЕд ЕЕссааааЕд ЕЕдсссадда сассЕсссас ЕЕадЕЕЕдсс ЕЕасЕЕдЕса ЕссЕсЕдадд саЕЕЕдасад саасасааад дЕддаЕЕЕда асЕЕсЕсЕса адсаЕсЕЕса ЕсаасЕддаа аадсЕдаддЕ саЕсаЕсаЕс сЕссадсссс сЕддЕдЕЕЕд ЕссассадсЕ Еддадасадд ддд^ддссад адсЕдссдсд ссддЕсассд аЕсддссдсд Еассдсдсдс дЕдсдссЕдд сЕсааддасЕ дсссддадсд ссссЕсссса дсдЕддЕЕЕд ассЕЕссадд ддддЕсссас ссЕсЕддддс ЕсассдсссЕ дааадЕЕдда сададсасаа ЕЕдсЕдЕдЕа аЕдадддЕдд ссадЕдссЕЕ адЕЕдсаЕЕд дасадссааа аЕаЕЕЕасдд даЕдЕЕЕддс ааддададдд дадсадсаЕс аааддЕЕсаа садсасаЕсс даааасадсЕ Ьдддддаааа асссаааааЕ аЕЕдЕЕаааа дЕсдЕЕЕЕЕЕ ЕЕааададЕЕ ЕдЕададааЕ ададасаЕЕд ассасасаЕд ассЕЕддаса аааадЕсаЕд дЕааЕаассЕ сЕдЕЕсЕсаЕ ЕсаадЕдсад Ессассаадс аЕссасасЕЕ ЕсЕсЕЕсссс ЕЕссадсссс ЕсаЕЕсаЕдд ссаадЕасаа ЕдссЕссЕдд аадЕсЕсдсс даЕдаададЕ адсЕЕЕаааЕ сссЕссЕдаЕ аадЕсЕЕЕда сдаддаддсс аассссадса сЕададсаЕс сЕЕддсаааа дсдддсддсс адсЕдсасЕЕ адсЕддЕдЕд дсаадЕддЕд адсдсдЕдса ЕддссЕсдЕд Есдддассда ссааадссаа .ссддсдддсд аЕЕдЕЕЕаЕа сссЕдаддаа ддддсадддд сдссЕассЕЕ ддддЕЕЕЕаа ЕаадаЕЕссс дасЕдддддс ассЕЕдаасЕ аддЕдддааЕ ЕЕдааЕдддс аЕЕсадЕдсс даЕдааааас сЕдасааасЕ ЕассЕссасс ЕссдадддЕд ссЕсссссда ддасасЕддс сЕЕЕЕдадас ЕсЕЕасЕдсЕ асЕасаадЕд сЕЕЕЕЕдааа ааааааадЕЕ ЕддсааЕЕсЕ аадЕЕасаЕа дасааЕдЕЕа ЕЕааЕааада асдЕсаЕЕЕс сассЕЕЕдас ЕЕЕаЕсссЕЕ садссЕЕдЕа ЕдЕаЕсасЕс ЕЕЕсссЕаЕс ЕЕссЕасЕда адсассссса ЕаассЕЕсса ЕЕЕЕдЕсЕас аддассадсс ЕЕсаддасса дЕадаааЕдЕ ЕссссааддЕ аасссЕааад ЕаадЕссадс дасЕЕдЕсад ЕаддЕдЕдад ЕсадЕдадсс дЕсаЕЕЕддс ЕдддассЕЕс дсадддсЕдд асссЕсасдс сасссдсЕас сЕссддссад дсдассЕадЕ дсЕдсЕдЕдЕ саадЕдсаад ддссдсЕсдд ссаддссдад ссссддсссЕ ЕЕЕсаЕЕдЕа Есссдддсдс адддааЕЕда ЕдсЕддЕссс дддадсддЕд ссЕЕдсассЕ аасЕдЕадаЕ асасааЕЕсЕ аддаЕсЕсда ададдЕдада ааддЕсасЕЕ ааасадаааа ссЕддаадаа ссЕссаЕсЕс дЕдддаддда сссаЕадсса сЕЕдсаддсс ассдссЕЕсЕ сЕЕасаЕдЕд сЕдЕасаЕаЕ аЕсаЕЕЕсса ЕЕааасадаа ЕссасдЕддд ЕЕЕаЕЕЕЕсЕ аЕаЕЕдсЕЕЕ сааЕдааЕса ЕдЕсааадЕЕ ЕдсЕсЕсЕдд ссЕЕЕссааа ЕссЕЕЕЕадс сссЕдсЕсаа ЕдасаЕддда сЕссаааЕдд аЕаасЕааЕс дадаЕдЕЕсс ассасЕасЕЕ ЕддссаадЕс дсЕсасадда аддаЕсЕЕса дЕсЕЕааЕад ЕЕасЕсЕЕса сЕассЕЕддд ЕЕЕаасЕасс ЕдддЕаЕсад ссЕдсадааа
Ессдадддда сЕдсааЕада ддЕддадада дсдссЕсЕсЕ дЕдассдаЕд Едсддсссдд дддсссдасЕ сссддЕддЕд сдссЕсассс ссдсадаадд сЕддадаасд даасссдсдс ааЕдссЕдса сддсааддсс дадЕсасада асЕЕсададд ЕдддадЕддд сдсЕдсссаЕ дЕддЕЕЕсЕа ссЕЕсдддас ддадасЕаЕЕ дадададада ссадааЕЕса аааааадЕаа дсЕаЕдсЕдс ааадаааЕаа ЕадаааЕсас ЕдЕЕЕЕааад сдадддадса дсссассасЕ аЕддсаЕаЕс дсЕдадааас дасаассЕсЕ дсасаЕдаса асЕЕдЕссас сасЕЕаадЕЕ аЕдааЕЕаас Едассдааад дасасссЕЕс ЕддсссЕЕдЕ сссадассдс адссЕссссЕ аадссЕЕсса ддссЕЕсЕсЕ ЕсаЕдсадаЕ сЕсЕЕЕсЕЕЕ ааЕсЕсссаЕ ЕддЕЕссЕаа сЕдсЕЕадЕа аасЕЕсаЕсЬ ааадЕдддсс ЕдсЕддаЕдс дЕЕдсссЕаа ддаасссасс ааЕаасссас ЕддссддЕсс аЕссаЕдсаЕ
3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360
- 79 014525 саЕдадЕдЕс сЕдададдса ЕдЕЕЕдЕЕЕд аЕсЕсддсЕЕ сададЕадсЕ ададасдддд дссЕдссЕсд здЕЕддЕдЕЕ саЕасЕЕддд асаЕдддсаа адЕааЕЕЕдс ЕдЕЕдсЕЕад сааадасЕдс ЕассдадЕсс ааассЕаддд сссаЕЕасса ЕЕЕаЕддааа даасааасаа ЕЕсЕдддддЕ дддаЕадаад ЕсЕсЕсасас дЕасаааЕса ддассссааа ададссЕдса дЕдссаЕдЕс аасссддсЕс ссссасссса сЕсадсЕаЕЕ аддсадддда ЕсдЕЕЕасас дасссааЕсЕ дсдЕддЕддс даддЕсасда асаааааЕЕа асаддадааЕ сссЕссадсс асЕдсаддаа садсассдас ааЕдасдЕЕс дададасЕаа аЕдсссааЕЕ адсЕддсадс дадаЕддаад ЕддЕсаЕдсс ааддададдд дасЕддаЕдс ддадссЕсаЕ аЕааасаЕЕЕ адсаЕаЕада с
Есадддссса дЕдсддЕсса ЕЕЕЕдадаса асЕдсаасЕЕ дддаЕЕасад ЕЕЕсассаЕд дссЕсссааа ЕдааЕсЕдад сЕсадЕЕссЕ ЕаассаддЕс ЕсЕдЕддадд адаЕЕЕЕсса аадЕдсаЕдд ЕЕдссаЕдЕд ЕсЕдсЕЕЕсЕ сдадддддаа дЕЕаЕаЕЕсЕ садассЕадс асадссадас даааЕаддЕс асасасасад ддссасаЕЕЕ аЕЕсссЕдЕЕ даадссассЕ ссасасссдс ссадаЕсаЕЕ ЕЕсЕЕддаас дддсадсЕЕЕ аЕаЕЕссЕсЕ сЕдЕаддсса дддсадЕааа ЕсасассЕдЕ дЕЕададасЕ дсааддсаЕд ддсЕЕдаасс сЕддсаасад даасссаддЕ ЕссЕдсадда ЕдсЕЕЕадад аЕЕсаЕсаЕЕ ЕсссЕасааЕ дадсадсЕдс дададдддЕд адсадаЕЕЕа ЬетздЗаЕдда садсЕдЕдад ддадсЕсаса адЕасааЕдЕ садсссЕдаа дааЕаЕдада дЕдддЕдддд дадЕсЕсдсЕ сЕдссЕЕссс дЕдсдЕдсса ЕЕддссаддс дЕдсЕдддаЕ дадасЕдаад ЕдсссЕассс асасЕдЕЕЕЕ ддаЕдаддда ддкддадаад сЕдсЕсаЕдд сааддсааса дддассЕдаа ааааассЕда ассЕасаЕдд Ьдддаддддс ЕсадддсЕЕд ссЕЕЕсЕсЕс асасасасас асасааддад ЕЕссЕЕдааЕ дсдадЕаадс ссассЕссса даЕЕаЕадсЕ сЕдсссЕсЕд дассаасадс ЕадЕсааЕдс адсдЕааЕЕ а ЕЕаЕаЕддЕд ааЕсссадЕа ддссЕддсса дЕддсаЕдса саддаддсад адсаадасЕЕ ааЕдааЕдад ааддсдадас ассдаассЕд ссЕЕддсадд ЕдЕсЕддддЕ аддЕаддада сададсасас аддсддаддс даддаадада ссаддсасса дддадЕдсЕд ссдддааЕдд ддсддссадд дсаддЕадда асасдддсЕс сЕаЕЕдссса ддаЕЕсаадЕ ссасдссЕдд ЕадЕсЕсдаа ЕасаддсдЕд сассаадддд сЕсасЕЕдад дЕассаадЕд ЕадЕддЕЕад ддддсЕЕсЕа дЕадаадада ьдддддЕасс даЕасаддаЕ аддсЕаааЕЕ ддЕсЕаЕаад адсаЕЕЕЕдЕ ЕаЕЕааЕадЕ ЕсЕсЕсЕсЕс асдсЕсЕдЕа дЕаааддааа саддсаддас саадЕЕсада ссЕдсЕссЕЕ сЕддддссЕд ЕсЕЕсЕсссЕ ЕдаддсЕссЕ дассаЕдЕдс ЕЕаасадсЕс сссаЕдсЕаЕ сЕЕЕдддасд дсаЕддсааа ссЕдЕааЕсс аддЕЕдсадЕ саЕсЕсаааа дадаададад асЕдддЕсаЕ адсссЕдааа ЕасЕдааЕсс дссЕаадсЕЕ даЕаддЕасс ассЕссссЕд аддддадаЕд дддЕдаЕсаЕ сссЕадсЕсЕ дсааддадаЕ ааадЕЕсЕсд ссаддсаЕЕЕ аасададаса ЕдддЕсаддЕ ддсЕддадЕд даЕЕсЕссЕд сЕааЕЕЕЕЕд сЕсЕЕдассЕ адссассаса ЕЕаааЕдЕЕЕ сЕдсЕЕадаа ЕЕаЕдддааЕ ддааадсЕЕс ддсадааддс аЕссассаЕЕ аддааЕЕсса ддаЕсадссс дЕаддЕсддд ссЕддсдсса ЕдЕадддддс сЕдададЕаа ЕсЕсЕсЕсЕс ддддЕсЕасЕ адаасдЕЕдд ЕЕасдсадсЕ дЕсасадаса дасасадссс сассдЕссЕЕ ЕдЕссааддд ЕЕЕдЕддсЕд сЕддЕЕЕдсс ссасЕЕсЕас ЕаададсЕдс Есааддсддд ассссаЕсЕЕ саддЕасЕсд дадссаадаЕ даааааддаЕ дддсЕдадЕс дддЕасЕдаа дЕдсаЕдссЕ ЕЕЕсЕЕасдд сЕдсссасса саЕаадддад ссЕдасаасЕ Зддсдддада ЕсаЕЕсаЕЕс дддсаЕдЕдд ддаЕааЕдда ааадаааааЕ сЕдаддаддЕ
ЕсЕЕссаЕсс ЕЕдЕдЕЕдЕЕ садЕдЕсаса ссЕсадссЕс ЕаЕЕЕЕЕдаЕ саадЕдаЕсЕ сссадсссса Едсссасадс ссЕддЕдддс ссаадаЕадд асааадЕддд аЕадсссаад ссЕсаасаЕд адсааЕдЕсс аддсЕдсааЕ ЕЕададдЕЕа аЕсадаааад ддддсасаЕд дасадасада асЕсЕсЕсЕс ЕаЕдсЕссаа аддадссаса дддадддЕдд ссаааадсЕд ЕдЕдсЕссас ссЕдссасаЕ саддсааддд дадаЕдсадд садддЕддЕс ЕсЕааааааЕ аасЕЕдсЕдд ЕддаЕсассЕ ЕасЕаааааЕ ддаддсЕдад ЕдЕдссасЕд асЕдЕсааЕс ассаЕадЕдд дддЕдсссЕд дЕЕсаЕдддЕ сЕдсссЕсса ададддссад дЕдддааада ЕссЕдадддс ддаадЕдааа саЕЕдсЬасЕ ЕЕдЕааЕсЕЕ сддаЕаасаа ааадсЕддЕд ддсаЕЕЕдад
6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8230 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240
9300
9301 <210> 19 <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедцепсе <220>
- 80 014525
<223> Ргхтег £ог РСК
<400> 19 ссддадсЬдд адаасаасаа д 21
<210> 20 <211> 19 <212> та <213> Αιΐίίίοίβΐ Зедиепсе
<220> <223> РКхтег £ог РСК
<400> 20 дсасЕддссд дадсасасс 19
<210> 21 . <211> 23 <212> ША <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 21 аддссаассд сдадаадаЬд асе 23
<210> 22 <211> 21 <212> ΌΝΑ <213> АгЫ£1сха1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 22 даадрссадд дсдасдБадс а 21
<210> 23 <211> 25 <212> υΝΑ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220> . <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 23 аадсЬЬддЕа ссаЬдсадсЬ сссас 25
<210> 24 <211> 50 <212> ША <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
- 81 014525
<210> 25
<211> 19
<212> ША
<213> АгС1££с£а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК
<400> 25
<210> 26
<211> 39
<212> ΟΝΑ
<213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 26
<210> 27
<211> 57
<212> ША
<213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Рг1тег £ог РСК
<400> 27
<210> 28
<211> 29
<212> ϋΝΑ
<213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 28
дасССддаСс ссаддддЬдд саддсдСЬс
<210> 29 <211> 29 <212> ША <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргйтег £ог РСК
<400> 29
адсаЬаадсЬ ЬсСадСаддс дССсСссад
- 82 014525
<210> 30 <211> 29 <212> ОНА <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК
<400> 30
дасЬЬддаЬс сдаадддааа аадаааддд
<210> 31 <211> 29 <212> ША <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК.
<400> 31
адсаЬаадсЬ СССааЬссаа аЬсдаРдда
<210> 32 <211> 33 <212 > ША <213> АгЪ1£1С1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК
<400> 32
аскасдадср сддссссасс асссаЪсаас аад
<210> 33 <211> 34 <212> ША <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК
<400> 33
асЬЬадаадс ЬЬЬсадЪссЬ садсссссЪс БЬсс
<210> <211> <212> <213> 34 66 ΌΝΑ АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223> Ргхтег £ог РСК
<400> 34
ааЬсЪддаЬс саЬаасЬЬсд ЬаЬадсаЬас аЪЬаЬасдаа дЬЬаЬсЬдса ддаЪЬсдадд дссссЬ
- 83 014525
<210> 35 <211> 82 <212> ϋΝΑ <213> Агк1£1С1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ργϊγπθγ £ог РСК
<400> 35
<210> 36
<211? 62
<212> ϋΝΑ
<213> Агк1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргатег £ог РСК
<400> 36
<210> 37 <211> 54 <212> ϋΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег £ог РСК.
<400> 37
<213> Агк££1С1а1 Зедиепсе
<220> <223> Рггтег £ог РСК
<400> 38
<210> 39
<211> 61
<212> ΟΝΑ
<213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Рг£тег £ог РСК
<400> 39
- 84 014525
<210> 40
<211> <212> <213> 34 ША АгЕи£исиа1 Зедиепсе
<220> <223> Ргитег £ог РСК
<400> 40
аЕЕасддссд дссдсааадд ааЕЕсаадаЕ сЕда
<210> 41
<211> 34
<212> ША
<213> АгЕ1£исиа1 Зедиепсе
<220> <223> Ргитег £ог РСК
<400> 41
аЕЕасддсдс дссссЕсаса ддссдсассс адсЕ <210> 42 <211> 184 <212> РИТ <213> Ното зариепа <400> 42
МеЕ 1 Зег Агд ТЬг А1а 5 Туг ТЬг νβΐ <31у А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи (31у
10 15
ТЬг Ьеи Ьеи Рго А1а А1а (31и (31у Ьуз Ьуз Ьуз (31у Зег (31 п <31у А1а
20 25 30
Не Рго Рго Рго Азр Ьуз А1а (31п Низ Азп Азр Зег (31и (31 п ТЬг (31п
35 40 45
Зег Рго (31 п (31п Рго <31у Зег Агд Азп Агд (31у Агд <31у (31п <31 у Агд
50 55 60
(31у ТЬг А1а МеЕ Рго <31у (31и (31и Уа1 Ьеи С1и Зег Зег (31п С1и А1а
65 70 75 80
Ьеи Низ Уа1 ТЬг (31и Агд Ьуз Туг Ьеи Ьуз Агд Азр Тгр Суз Ьуз ТЬг
85 90 95
(31п Рго Ьеи Ьуз (31п ТЬг Не Низ <31и (31и (31у Суз Азп Зег Агд ТЬг
100 105 110
11е 11е Азп Агд РЬе Суз Туг б1у (31п Суз Азп Зег РЬе Туг Не Рго
115 120 125
Агд Низ Не Агд Ьуз (31и (31и (31у Зег РЬе (31п Зег Суз Зег РЬе Суз
130 135 14 0
Ьуз Рго Ьуз Ьуз РЬе ТЬг ТЬг МеЕ МеЕ Уа1 ТЬг Ьеи Азп Суз Рго (31и
145 150 155 160
Ьеи С31п Рго Рго ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Агд Ча.1 ТЬг Агд Уа1 Ьуз (31п Суз
165 170 175
Агд Суз Не Зег Не Азр Ьеи Азр
180
<210> 43 <211> 267
- 85 014525 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 43
Мек 1 НХ8 Ьеи Ьеи Ьеи РЬе 5 С1п Ьеи Ьеи Та1 10 Ьеи Ьеи Рго Ьеи О1у 15 Ьуз
ТЬг ТЬг Агд Нхз О1п Азр ’С1у Агд 01 п Азп С1п Зег Зег Ьеи Зег Рго
20 25 30
Уа1 Ьеи Ьеи Рго Агд Азп О1п Агд 01 и Ьеи Рго ТЬг О1у Азп Нхз О1и
35 40 45
(31и А1а <31 и О1и Ьуз Рго Азр Ьеи РЬе Уа1 А1а Уа1 Рго Нхз Ьеи Уа1
50 55 60
А1а ТЬг Зег Рго А1а С1у 01и О1у 01 п Агд 01п Агд О1и Ьуз Мек Ьеи
65 70 75 80
Зег Агд РЬе 01у Агд РЬе Тгр Ьуз Ьуз Рго О1и Агд О1и Мек Нхз Рго
85 90 95
Зег Агд Азр Зег Азр Зег О1и Рго РЬе Рго Рго О1у ТЬг С1П Зег Ьеи
100 105 но
Не (31η. Рго Не Азр С1у Меб Ьуз Мек О1и Ьуз Зег Рго Ьеи Агд О1и
115 120 125
С1и А1а Ьуз Ьуз РЬе Тгр Нхз Нхз РЬе Мек РЬе Агд Ьуз ТЬг Рго А1а
13 0 135 14 0
Зег С1п 01 у Уа1 11е Ьеи Рго Не Ьуз Зег Нхз О1и Уа1 Нхз Тгр О1и
145 150 155 160
ТЬг Суз Агд ТЬг Уа1 Рго РЬе Зег 01 п ТЬг Не ТЬг Нхз О1и 01у Суз
165 170 175
О1и Ьуз Уа1 Уа1 Уа1 О1п Азп Азп Ьеи Суз РЬе О1у Ьуз Суз О1у Зег
180 185 190
Уа1 Нхз РЬе Рго О1у А1а А1а С1п Нхз Зег Нхз ТЬг Зег Суз Зег Нхз
195 200 205
Суз Ьеи Рго А1а Ьуз РЬе ТЬг ТЬг Мек Нхз Ьеи Рго Ьеи Азп Суз ТЬг
210 215 220
О1и Ьеи Зег Зег Уа1 Не Ьуз Уа1 Уа1 Мек Ьеи Уа1 О1и О1и Суз О1п
225 230 235 240
Суз Ьуз Уа1 Ьуз ТЬг С1и НХЗ С1и Азр О1у Нхз Не Ьеи Нхз А1а О1у
245 250 255
Зег <31п Азр Зег РЬе Не Рго 01у Уа1 Зег А1а
260 265 <210> 44 <211> 180 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 44
Мек. 1 Ьеи Агд Уа1 Ьеи 5 57а1 О1у А1а νηΐ Ьеи Рго 10 А1а Мек Ьеи Ьеи А1а 15
А1а Рго Рго Рго 11е Азп Ьуз Ьеи А1а Ьеи РЬе Рго Азр Ьуз Зег А1а
20 25 30
Тгр Суз О1и А1а Ьуз Азп 11е ТЬг О1п Не Уа1 О1у Нхз Зег 01у Суз
35 40 45
С1и А1а Ьуз Зег Не С1п Азп Агд А1а Суз Ьеи О1у О1п Суз РЬе Зег
50 55 60
Туг Зег Уа1 Рго Азп ТЬг РЬе Рго О1п Зег ТЬг 01и Зег Ьеи Уа1 Нхз
65 70 75 80
Суз Азр Зег Суз Мек Рго А1а О1п Зег Мек Тгр С1и 11е Уа1 ТЬг Ьеи
85 90 95
- 86 014525
61и Суз Рго (31у 100 Нйз 61и (31и Уа1 Рго Агд 105 Уа1 Азр Ьуз Ьеи 110 Уа1 (31и
Ьуз Не Ьеи Н1а Суз Зег Суз (31п А1а Суз 61у Ьуз 61и Рго Зег ΗΪ3
115 12 0 125
<31и С1у Ьеи Зег Уа1 Туг Уа1 С1п 61у 61и Азр б1у Рго (31у Зег (31п
130 135 140
Рго 61у ТЬг ΗΪ3 Рго Н1з Рго ΗΪ3 Рго ΗΪ3 Рго Ηίθ Рго (31у С1у С1п
145 15 0 155 160
ТЬг Рго (31и Рго б1и Авр Рго Рго (31у А1а Рго ΗΪ8 ТЬг (31и (31 и 61и
165 170 175
61у А1а (31и Азр
180 <210> 45 <211> 642 <212 > ША <213> Ното зархепз <220>
<221> СЬЗ <222> (1)..(639) <400> 45
а Ед МеЕ 1 сад сЕс сса сЕд дсс сЕд СдС сЕс дЕс Сдс сЕд сЕд дЕа сас аса 48
(31п Ьеи Рго Ьеи А1а 5 Ьеи Суз Ьеи Ча1 10 Суз Ьеи Ьеи Уа1 ΗΪ 5 15 ТЬг
дсс ЕЕс сдЕ дЕа д^д дад ддс сад ддд ьдд сад дед ЕЕс аад ааЕ даЕ 96
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 (31и (31у (31П (31у Тгр (31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
дсс асд даа аЕс аЕс ссс дад сЕс дда дад Еас ссс дад ссЕ сса ссд 144
А1а ТЬг (31и Не Не Рго 61и Ьеи (31у С1и Туг Рго 61и Рго Рго Рго
35 40 45
дад сЕд дад аас аас аад асе аЕд аас едд дед дад аас дда ддд едд 192
61и Ьеи (31 и Азп Азп Ьуз ТЬг МеЕ Азп Агд А1а (31и Азп (31у <31у Агд
50 55 60
ссЕ ссс сас сас ссс ЕЕЕ дад асе ааа дас дбд Ссс дад Еас аде Еде 240
Рго Рго ΗΪ3 Н1з Рго РЬе (31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег 61и Туг Зег Суз
65 70 75 80
сдс дад сЕд сас ЕЕс асе сдс сас дед асе дас ддд ссд Еде сдс аде 288
Агд С1и Ьеи Н1з РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр (31у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
дсс аад ссд дЕс асе дад сЕд дЬд Еде Есс ддс сад Еде ддс ссд дед 336
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг 31 и Ьеи Уа1 Суз Зег (31у (31 п Суз (31у Рго А1а
100 105 но
сдс сЕд сЕд ссс аас дсс аЕс ддс сдс ддс аад ьдд Едд еда ссЕ адЕ 384
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е (31у Агд <31у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 12 0 125
ддд ссс дас ЕЕс сдс Еде аЕс ССС дас сдс Сас сдс дед сад сдс дЕд 432
61у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1
- 87 014525
135
140
сад скд сЕд ЕдЕ ссс Рго ддь ддь дад дед ссд сдс дед сдс аад Ьуз дьд Уа1 сдс Агд 160 480
Θΐη Ьеи 145 Ьеи Суз 01у 150 О1у О1и А1а Рго Агд 155 А1а Агд
сЕд дьд дсс Есд Еде аад Еде аад сдс сЕс асе сдс ЕЕс сас аас сад 528
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп <31п
165 170 175
Есд дад сЕс аад дас ЕЕс ддд асе дад дсс дсЕ сдд ссд сад аад ддс 576
Зег О1и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у ТЬг 01 и А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз 01у
180 185 190
сдд аад ссд сдд ссс сдс дсс сдд аде дсс ааа дсс аас сад дсс дад 624
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп О1п А1а б1и
195 200 205
сЕд дад аас дсс Еас Еад 642
Ьеи (31и Азп А1а Туг 210
<210> 46 <211> 190 <212> РК.Т <213> Ното зараепз <400> 46
С1п С1у Тгр О1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг О1и Не Не Рго О1и
1 5 10 15
Ьеи О1у (31и Туг Рго (31и Рго Рго Рго О1и Ьеи О1и Азп Азп Ьуз ТЬг
20 25 30
МеЕ Азп Агд А1а 01и Азп О1у 01у Агд Рго Рго Ηίβ Ηίβ Рго РЬе О1и
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег 01 и Туг Зег Суз Агд О1и Ьеи Ηίβ РЬе ТЬг Агд
50 55 60
Туг Уа1 ТЬг Азр О1у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг 01и Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Суз Зег (31у С1п Суз О1у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не
85 90 95
(31у Агд 01у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег О1у Рго Авр РЬе Агд Суз Не
100 105 но
Рго Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Рго О1у О1у
115 120 125
О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз
130 135 140
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Н1з Азп О1п Зег О1и Ьеи Ьуз Азр РЬе О1у
145 150 155 160
ТЬг О1и А1а А1а Агд Рго 01п Ьуз С1 у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а
165 170 175
Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп 01п А1а 01 и Ьеи 01и Азп А1а Туг
180 185 190
<210> 47 <211> 20 <212> РЕТ
- 88 014525
<210> 52 <211> 21
- 89 014525 <212> ΡΚΤ <213> Аг£х£1сха1 Зедиепсе <220>
<223> Нишап ЗОЗТ рерРхйе £гадтепЬ Ή£Й адс11.£хопа1 сузСехпе асЗДей <400> 52 <31п <31у Тгр Θΐη А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг 01и Не 11е Рго <31и 15 10 15
Ьеи (31у <31и Туг Суз <210> 53 <211> 21 <212> РКТ <213> Аг£х£1сха1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫЬе £гадтеп£ ю1РЬ ас1с11е1опа1 сузРехпе а<Ме<1 <400> 53
ТЬг С1и Не 11е Рго С1и Ьеи (31у С31и Туг Рго С1и Рго Рго Рго б1и 15 10 15
Ьеи С1и Азп Азп Суз <210> 54 <211> 21 <212> РКТ <213> Аг£1£хсха1 Зедиепсе <220 >
<223> Нитап ЗОЗТ реррхйе £гадтеп£ ихСИ а0.<3.х£хопа1 сузРехпе а<3.с1ес1 <400> 54
Рго С1и Рго Рго Рго 61и Ьеи С1и Азп Азп Ьуз ТЬг Мер Азп Агд А1а 15 10 15
О1и Азп С1у С1у Суз
О А
Ли V <210> 55 <211> 21 <212> РКТ <213> АгРх£хс1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ реррхйе £гадтепр мхРЬ абДхРхопа! сузРехпе асДес! .
<400> 55
Ьуз ТЬг Мер Азп Агд А1а <31и Азп <31у О1у Агд Рго Рго Нхэ Н1з Рго
- 90 014525
<210> 59
<211> 20
<212> РК.Т
<213> Каккиз пог^7ед1сиз
<400> 59
СТи Азп СТу СТу Агд Рго Рго ΗΪ3 Ηίθ Рго Туг Азр ТЬг Ьуз Азр Уа1
1 5 10 15~
Зег СТи Туг Зег
20
- 91 014525 <210> 60 <211> 20 <212 > РН.Т <213> ЕаЕЕиз погуедхсиз <400> 60
ТЬг С1и Не 11е Рго С1у Ьеи Агд 1 5
Ьеи <31и Азп Азп <210> 61 <211> 25 <212> РЕТ <213 > АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> ЕаЕ ЗОЗТ рерЕЬбе £гадтепЕ аббеб <400> 61
С1п О1у Тгр 01п А1а РЬе Ьуз Азп
5
Ьеи Агд 61и Туг Рго (31и Рго Рго
О1и Туг Рго С1и Рго Рго О1п С1и
10 15
м!ЕЬ абб1Е1опа1 сузЕед.пе
Азр А1а ТЬг 01и 11е 11е Рго С1у
10 15
Суз
25
<210> 62 <211> 21 <212> РЕТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > ЕаЕ ЗОЗТ рерЕабе £гадтепЕ аббеб <400> 62
Рго 01и Рго Рго б1п 01и Ьеи 01и
5
01и Азп 01у 01у Суз <210> 63 <211> 21 <212> РРТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> ЕаЕ ЗОЗТ рерЕабе £гадтепЕ аббеб <400> 63
01и Азп О1у О1у Агд Рго Рго Н1з
5
Зег 01и Туг Зег Суз и1Ы1 аббаЕдопа! сузЕебпе
Азп Азп С1п ТЬг МеЕ Азп Агд А1а
10 15
мтЕЬ абб1Е1опа1 сузЕедпе
Н1з Рго Туг Азр ТЬг Ьуз Азр Уа1
10 15
- 92 014525 <210> 64 <2Ц> 21 <212> РЕТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Как ЗОЗТ рерЫбе £гадтепк И1£Ь абб!Ыопа1 сувЬехпе аббеб <400> 64
ТЬг (31и Не 11е Рго 31 у Ьеи Агд (31и Туг Рго (31и Рго Рго О1п <31и
Ί X с Ί Л ПС XV XV
Ьеи (31и Ав η Азп 20 Суз
<210> 65 <211> 190 <212> РЕТ <213 > Каккиз пог’хедхсиз
<400> 65
О1п <31у Тгр <31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг <31и 11е 11е Рго (31у
1 5 10 15
Ьеи Агд <31 и Туг Рго <31и Рго Рго <31п (31и Ьеи С1и Азп Азп (31п ТЬг
20 25 30
Мек Азп Агд А1а (31и Азп С1у (31у Агд Рго Рго ΗΪ8 Н1з Рго Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег (31и Туг Зег Суз Агд б1и Ьеи Н1з Туг ТЬг Агд
50 55 60
РЬе Уа1 ТЬг Азр <31у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг Б1и Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Суз Зег (31у (31п Суз В1у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е
85 90 95
<31 у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп С1у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е
100 105 110
Рго Азр Агд Туг Агд А1а (31п Агд Уа1 (31п Ьеи Ьеи Суз Рго В1у В1у
115 120 125
А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз
13 0 135 140
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ8 Азп (31п Зег (31и Ьеи Ьуз Азр РЬе 51у
145 150 155 160
Рго <31и ТЬг А1а Агд Рго 61п Ьуз 61у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а
165 170 175
Агд (31у А1а Ьуз А1а Азп С1П А1а (31и Ьеи (31и Азп А1а Туг
180 195 190
<210> 66
<211> 20
<212> РН.Т
<213> Ното зархепз
<400> 6 6
- 93 014525
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а б1п Агд Уа1 61п Ьеи Ьеи Суз 15 10 <31у О1и А1а Рго
Рго С1у <210> 67 <211> 20 <212> РКТ <213> Ното зархепв <400> 67
С1п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у <31у (31и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд 15 10 15
Ьеи Уа1 А1а Зег <210> 68 <211> 21 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Нитап ЗОЗТ рерЕхйе £гадтеп£ ΉΗι а<3.<11Ыоп.а1 суз£е1пе а<М.ес1 <400> 68
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд Уа1 С1п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у 15 10 15
С1у <31и А1а Рго Суз <210> 69 <211> 21 <212> РКТ <213 > АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Нитап ЗОЗТ рерЫйе ггадтепЕ νΐΕΗ айй.1Е1опа1 сузЕехпе а (Ией.
<400> 69 <31п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у С1у С1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд 15 10 15
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз <210> 70 <211> 17 <212> РКТ <213> КаЕЕиз Ногчедхсиз <400> 70
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд Уа1 С1п Ьеи Ьеи Суз Рго О1у
- 94 014525
5
51у
15 <210> 71 <211> 16 <212> РЕТ .
<213> Каккив пог^-ед1сиз <400> 71
Рго 51у <31у А1а А1а Рго Агд Зег
5
Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег
15 <210> 72 <211> 18 <212> РЕТ <213 > Агк1£1с1а1 Зес[иепсе <220>
<223> Как ЗОЗТ реркТЬе £гадтепк а<1с1е<1 <400> 72
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п
5 '
51у Суз
И1к11 аЬЫкТопа! сузкехпе
Агд Уа1 51п Ьеи Ьеи Зег Рго <31у
15 <210> 73 <211> 17 <212> РЕТ <213> Агк1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Как ЗОЗТ рерк±с!е £гадтепк а<1с1ес1 <400> 73
Рго 51у 51у А1а А1а Рго Агд Зег
5
Суз мТкй аскНкъопа! сузкедпе
Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег
15 <210> 74 <211> 20 <212> РЕТ <213> Ното зараепз <400> 74
Суз С1у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго
5
Тгр Агд Рго Зег
Азп А1а Не 51у Агд 51 у Ьуз Тгр
15
- 95 014525 <210> 75 <211> 16 <212> РКТ <213 > Ното зариепз <400> 75
11е В1у Агд (31у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег <31у Рго Азр РЬе Агд Суз
1 5 10 15
<210> 76 <211> 18 <212> РЕТ <213> КаЕЕиз погуедисиз <400> 76 Рго Азп А1а 11е (31у Агд 57а1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп С1у Рго Азр
1 5 10 15
РЬе Агд <210> 77 <211> 19 <212> РК.Т <213> АгЕи£ис1а1 Зедиепсе <220>
<223 > КаЕ ЗОЗТ рерЕибе £гадтепЕ м±ЕЬ а<ИиЕиопа1 сузЕеипе аЬйеб.
<400> 77
Рго Азп А1а 11е (31у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп С1у Рго Азр
1 5 10 15
РЬе Агд Суз
<210> 78 <211> 20 <212> РК.Т <213> Ното зариепз <400> 78
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Низ Азп С1п
5
ТЬг С1и А1а А1а
Зег б1и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у
15 <210> 79 <211> 20 <212> РКТ <213> Ношо зариепз
- 96 014525 <400> 79 <31 и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31 у ТЬг
5
Ьуз Рго Агд Рго
С1и А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз (31 у Агд <210> 80 <211> 20 <212> РЙТ <213> Ното зархепз <400> 80
Д'Г’Гт ΡττΊ τί Тлга ΠΊ лг Δν-η· Тлгс Оу'гл Дггг Όκη Δ т-гт о Δ -угт· Осу ΔΊ а Тлге· * аа. 3 *· ·* ·—' '-Ι-.ΧΧ Χ-Ι^τ ы ,---1- 2 * ха- Д л. ·*. ·^ л аа_ *. Α- ΑΖ л л ХА СА А А А. с^ к_/ —. А. а ХА СА А_|_у аЗ
10 15
А1а Азп (31п А1а <210> 81 <211> 16 <212 > РН.Т <213> Ното зариепз <400> 81
Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп (31п А1а (31и Ьеи <31и Азп А1а Туг
5 10 15 <210> 82 <211> 21 <212> РЕТ <213 > АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Нитап ЗОЗТ рерЫЬе ТгадтепЬ νζΐΕΗ а<М.1Ыопа1 сузЕеапе аЬЬеЬ <400> 82
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхз Азп <31п Зег (31 и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у 15 10 15
ТЬг (31и А1а А1а Суз <210> 83.
<211> 21 <212> РК.Т <213 > АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерШйе £гадтепЬ ш±Ь ас!<ИЫопа1 сузЕегпе асЙеб.
<400> 83 (31и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у ТЬг С31и А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз (31у Агд
10 15
- 97 014525
Ьуз Рго Агд Рго Суз <210> 84 <211> 21 <212 > РНТ <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтепЬ у/±Ыа ас!<11Е1опа1 сузЕеапе аййед.
<400> 84
Агд Рго Θΐη Ьуз <31у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз 15 10 15
А1а Азп О1п А1а Суз <210> 85 <211> 17 <212> РН.Т <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе ГгадтепЬ νίίΕΐι а(3.<ИЕ1опа1 сузЕеЬпе асйеб.
<400> 85
Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп О1п А1а О1и Ьеи О1и Азп А1а Туг
1 5 10 15
Суз
<210> 86
<211> 23
<212> РКТ
<213> КаЕЬиз погуедбсиз
<400> 86
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп О1п Зег <31и Ьеи Ьуз Азр РЬе <31у
1 5 10 15
Рго (31и ТЬг А1а Агд Рго С1п <210> 87 <211> 23 <212> РК.Т <213> НаЕЬиз погуедЬсиз <400> 87
Ьуз О1у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд О1у А1а Ьуз А1а Азп <31п 15 10 15
А1а О1и Ьеи О1и Азп А1а Туг
- 98 014525 <2Ю> 88 <211> 24 <212> РЕТ <213> ИаЕЕиз погуедбсиз <400> 88
Зег Оби Ьеи Ьуз Азр РЬе Обу Рго бби ТЬг Аба Агд Рго (Збп Ьуз 61у 1 5 -10 15
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд <210> 89 <211> 24 <212> РИТ <213 > АгЕб£бсбаб Зедиепсе <220>
<223> КаЕ ЗОЗТ рерЕббе £гадтепЕ мбЕЬ абббЕбопаб сузЕебпе аббеб <400> 89
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нбз Азп Сбп Зег (Зби Ьеи Ьуз Азр РЬе Сбу
Ю 15
Рго Оби ТЬг Аба Агд Рго Обп Суз <210> 90 <211> 24 <212> РИТ <213> АгЕб£бсбаб Зедиепсе <220>
<223 > НаЕ ЗОЗТ рерЕббе £гадтепЕ мбЕЬ абббЕбопаб сузЕебпе аббеб <400> 90
Ьуз Обу Агд Ьуз
Аба Оби Ьеи Оби
Рго Агд Рго Агд
Азп Аба Туг Суз
Аба Агд Обу Аба
Ьуз Аба Азп Сбп <210> 91 <211> 25 <212> РИТ <213> АгЕб£бсбаб Зедиепсе <220>
<223> НаЕ ЗОЗТ рерЕббе £гадтепЕ здбЕЬ абббЕбопаб сузЕебпе аббеб <400> 91
- 99 014525
51η Б1у Тгр 61п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг 51и Не Не Рго 51и
1 5 10 15
Ьеи 51у 51и Туг Рго 51и Рго Рго Рго 51и Ьеи 51 и Азп Азп Ьуз ТЬг
20 25 30
Мек Азп Агд А1а 51и Азп 61у 51у Агд Рго Рго ΗΪ3 Н1з Рго РЬе 51и
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег 51и Туг Зег
50 55
51п 51у Тгр 51п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг 61и Не Не Рго 61у
1 5 10 15
Ьеи Агд 51 и Туг Рго 51и Рго Рго 51п Б1и Ьеи 51и Азп Азп 51п ТЬг
20 25 30
Мек Азп Агд А1а 61и Азп 61у Б1у Агд Рго Рго Нхв Н13 Рго Туг Азр
35 40 . 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег 51и Туг Зег
50 55
Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а Б1п Агд Уа1 61п Ьеи Ьеи Суз Рго
1 1 5 10 15
61у 61у 51и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз
20 25 30
- 100 014525
1015 (31у С1у А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз
2530 <210> 96 <211> 44.
<212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 96
Ьеи ТЬг 1 Агд РЬе Нхз Азп <31п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе е1у ТЬг 15 61и
5 10
А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз 61у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег
20 25 30
А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а 61и Ьеи С1и Азп А1а Туг
35 40
<210> 97 <211> 44 <212> РКТ <213> КаЕЕиз погчедхсиз <400> 97
Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп С1п Зег <31и Ьеи Ьуз Азр РЬе 01у Рго С1и
1 5 10 15
ТЬг А1а Агд Рго 61п Ьуз С1у Агд Ьуз РГО Агд Рго Агд А1а Агд С1у
20 25 30
А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а б1и Ьеи б1и Азп А1а Туг
35 40
<210> 98 <211> 26 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 98
Суз 61у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е 61у Агд С1у Ьуз Тгр
1 5 10 15
Тгр Агд Рго Зег б1у Рго Азр РЬе Агд Суз
25 <210> 99 <211> 26 <212> РКТ <213> КаЕЕиз погчедхсиз <400> 99
Суз (31у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е <31 у Агд Уа1 Ьуз Тгр
1 5 10 15
Тгр Агд Рго Азп С1у Рго Азр РЬе Агд Суз
20 25
- 101 014525 <210> 100 <211> 570 <212> ША <213> Ното зар^епз <400> 100 саддддЕддс аддсдЕЕсаа дааЕдаЕдсс асддаааЕса ЕссссдадсЕ сддададЕас 60 сссдадссЬс сассддадсЬ ддадаасаас аадассаЕда асодддсдда даасддаддд 120 сддссЕсссс ассассссЕЕ Едадассааа дасдЕдрссд адЕасадсЕд ссдсдадсЕд 180 сасЕЕсассс дсЕасдЬдас сдаЕдддссд Едссдсадсд ссаадссддЕ сассдадсЕд 240 дЕдРдсЕссд дссадЕдсдд сссддсдсдс сЕдсЕдссса асдссаЕсдд ссдсддсаад 300 ЕддЕддсдас сЕадЕдддсс сдасЕЕссдс ЕдсаЕссссд ассдсЕассд сдсдсадсдс 360 дЕдсадсрдс ЕдЕдЬсссдд ЕддЕдаддсд ссдсдсдсдс дсааддЕдсд ссЕддЕддсс 420 ЬсдЬдсаадЬ дсаадсдссЕ сасссдсЕЕс сасаассадЬ сддадсЕсаа ддасЬЕсддд 480 ассдаддссд сЕсддссдса даадддссдд аадссдсддс сссдсдсссд дадсдссааа 540 дссаассадд ссдадсЕдда даасдссЬас 570 <210> 101 <211> 570 <212> ЬЫА <213> КаЕЬиз победа сиз <400> 101 са9999ьддс аадссЬЬсаа дааЬдаЕдсс асадаааЕса ЕсссдддасЕ садададЕас 60 ссададссЬс сЕсаддаасЬ ададаасаас садассаЕда ассдддссда даасддаддс 120 адассссссс ассаЬссЕЕа Сдасассааа дасдЕдЕссд адЕасадсЕд ссдсдадсЕд 180 сасЕасассс дсЕЕсдЕдао сдасддсссд ЕдссдсадЕд ссаадссддЕ сасодадЕЕд 240 дЕдЕдсЕсдд дссадЕдсдд ссссдсдсдд сЕдсЕдссса асдссаЕсдд дсдсдЕдаад 300 ЕддЕддсдсс сдаасддасс сдасЕЕссдс ЕдсаЕсссдд аЕсдсЕассд сдсдсадсдд 360 дЕдсадсЕдс ЕдЕдссссдд сддсдсддсд ссдсдсЕсдс дсааддЕдсд ЕсЕддЕддсс 420 ЕсдЕдсаадЕ дсаадсдссЕ сасссдсЕЕс сасаассадЕ сддадсЕсаа ддасЕЕсдда 480 ссЕдадассд сдсддссдса даадддЕсдс аадссдсддс сссдсдсссд дддадссааа 540 дссаассадд сддадсЕдда даасдссЬас 570 <210> 102 <211> 532 <212> РЕТ .
<213> Ното зарЬепз <400> 102
Мер ТЬг Θΐη Ьеи Туг Не Туг Не Агд Ьеи Ьеи С31у А1а Туг Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не Не Зег Агд Уа1 (31п (31у С1п Азп Ьеи Авр Зег МеЕ Ьеи ΗΪ8 (31у
20 25 30
ТЬг С1у МеЕ Ьуз Зег Азр Зег Азр <31 п Ьуз Ьуз Зег (31и Азп (31у Уа1
35 40 45
ТЬг Ьеи А1а Рго (31и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
(31у Ηί3 Суз Рго Азр Азр А1а 11е Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп (31у
65 70 75 80
ΗΪ8 Суз РЬе А1а 11е Не (31и (31и Азр Азр (31п (31у С31и ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
А1а Зег <31у Суз МеЕ Ьуз Туг 51и 51 у Зег Азр РЬе (31п Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а Θΐη Ьеи Агд Агд ТЬг 11е (31и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
- 102 014525
Ьеи Суз 130 Азп Θΐη Туг Ьеи (31п Рго 135 ТЬг Ьеи Ргр Рго 14 0 Уа1 Уа1 Не (31у
Рго РЬе РЬе Азр (31у Зег 11е Агд Тгр Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи Не Зег Мер
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Не А1а Мер 11е 11е РЬе Зег Зег Сув РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз Ηίβ Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд Агд Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи Б1и С1п Азр С31и А1а РЬе Не Рго νηΐ С31у (31и Зег Ьеи Ьуз Авр
195 200 205
Ьеи 11е Азр (31η Зег (31п Зег Зег б1у Зег С1у Зег С31у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 (31п Агд ТЬг Не А1а Ьуз (31п Не (31п Мер Уа1 Агд (31п Уа1
225 23 0 235 240
Б1у Ьуз (31 у Агд Туг (31у б1и Уа1 Тгр МеР (31у Ьуз Тгр Агд (31у (31и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг (31и Б1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд (31и ТЬг (31и Не Туг (31п ТЬг Уа1 Ьеи Мер Агд Нхз 51и Азп Не
275 280 285
Ьеи 51у РЬе 11е А1а А1а Азр Не Ьуз Й1у ТЫ 51 у Зег Тгр ТЬг е1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг Н1в (31и Азп О1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
3 05 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз (31у Ьеи Суз Ηΐβ Ьеи Нхз ТЫ (31и Не Туг Б1у ТЬг
340 345 350
С1п О1у Ьуз Рго А1а Не А1а Н1в Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп Не
355 360 365
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп б1у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи (31у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп С1и Уа1 Азр νηΐ Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 С1у ТЬг Ьуз Агд Туг Мер А1а Рго <31и Уа1 Ьеи Азр (31и Зег
405 410 415
Ьеи Азп Ьуз Азп Н1з РЬе (31п Рго Туг 11е Мер А1а Азр 11е Туг Зег
420 425 43 0
РЬе 51у Ьеи 11е Не Тгр (31и Мер А1а Агд Агд Суз Не ТЫ С31у С31у
435 440 445
Не Уа1 (31 и (31и Туг (31 п Ьеи Рго Туг Туг Азп Мер Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг (31и Азр Мер Агд (31и Уа1 Уа1 Суз νηΐ Ьуз Агд Ьеи Агд
л сс Л П ГУ Л 7С 4 8 п
*х и х , ч/ •х /
Рго 11е Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр (31и Суз Ьеи Агд А1а νδΐ
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи Мер Зег б1и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мер Уа1 (31и Зег С1п
515 52 0 525
Азр Уа1 Ьуз 11е
53 0
<210> 103
<211> 502
<212> РКТ
- 103 014525 <213> Ното зараепз <400> 103
Мер 1 Ьеи Ьеи Агд Зег 5 А1а 01у Ьуз Ьеи Азп Уа1 10 О1у ТЫ Ьуз Ьуз 15 01и
Азр 01у 01и Зег ТЬг А1а Рго ТЬг Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз ΗΪ3 Н1з Н1з Суз Рго О1и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр С1у Туг Суз РЬе ТЫ МеЕ Не 01и 01и Азр Азр Зег 01у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 ТЬг Зег С1у Суз Ьеи С1у Ьеи О1и О1у Зег Азр РЬе О1п
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЫ Рго 11е Рго Н13 О1п Агд Агд Зег Не 01и Суз Суз
85 90 95
ТЫ О1и Агд Азп С1и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Нхз Рго ТЫ Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр О1у Рго Не Нхз Нхз Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи 11е Зег Уа1 ТЬг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Не Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд О1п С1и ТЫ Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Ые О1у Ьеи 01и С1п Азр С1и ТЬг Туг 11е Рго Рго О1у С1и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Не С1и О1п Зег О1п Зег Зег О1у Зег О1у Зег О1у Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 С1п Агд ТЫ Не А1а Ьуз О1п Не С1п МеЕ Уа1 Ьуз
195 200 205
(31п Не (31у Ьуз 01 у Агд Туг 01у О1и Уа1 Тгр МеЕ 61у Ьуз Тгр Агд
210 215 220
(31у 01и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЫ ТЫ 01и О1и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд С1и ТЫ С1и Не Туг О1п ТЫ Уа1 Ьеи МеЕ Агд ΗΪ3 О1и
245 250 255
Азп Не Ьеи (31у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз О1у ТЬг О1у Зег Тгр
260 265 270
ТЬг (31п Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг ΗΪ3 О1и Азп О1у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ты Ьеи Азр А1а Ьуз Зег МеЕ Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег О1у Ьеи Суз Н1з Ьеи Нхз ТЬг 01и Не РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг С1п С1у Ьуз Рго А1а Не А1а Ηί3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп Не Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп 01 у ТЬг Суз Суз Не А1а Азр Ьеи 01у
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе Не Зег Азр ТЫ Азп 01и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд Уа1 01у ТЬг Ьуз Агд Туг МеЕ Рго Рго О1и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
С1и Зег Ьеи Азп Агд Азп Нхз РЬе С1п Зег Туг Не МеЕ А1а Азр МеЕ
385 390 395 400
Туг Зег РЬе С1у Ьеи Не Ьеи Тгр 01и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
О1у О1у Не Уа1 О1и О1и Туг О1П Ьеи Рго Туг Нхз Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 430
- 104 014525
Зег Азр Рго Зег Туг б1и Азр МеЕ Агд 0111 11е Уа1 Суз 445 11е Ьуз Ьуз
435 440
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр О1и Суз Ьеи Агд
450 455 460
О1п МеЕ О1у Ьуз Ьеи МеЕ ТЬг (31и Суз Тгр А1а Низ Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеЕ Зег О1и
485 490 495
Зег б1п Азр 11е Ьуз Ьеи
500
<210> 104 <211> 502 «ч . г>пт глх <213> Ното зариепз <400> 104
МеЕ 1 Ьеи Ьеи Агд Зег 5 А1а 01у Ьуз Ьеи Азп 10 Уа1 01у ТЬг Ьуз Ьуз 15 С1и
Азр С1у О1и Зег ТЬг А1а Рго ТЬг Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз Низ Низ Низ Суз Рго 01и Азр Зег Уа1 Азп Азп 11е Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр О1у Туг Суз РЬе ТЬг МеЕ Не О1и С1и Азр Азр Зег С1у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 ТЬг Зег О1у Суз Ьеи С1у Ьеи С1и С1у Зег Азр РЬе С1п
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЬг Рго 11е Рго Н1з О1п Агд Агд Зег Не О1и Суз Суз
85 90 95
ТЬг О1и Агд Азп О1и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Низ Рго ТЬг Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр 01 у Рго Не Низ Низ Агд А1а Ьеи
115 12 0 125
Ьеи 11е Зег Уа1 ТЬг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Не Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд О1п О1и ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
11е О1у Ьеи О1и С1п Азр С1и ТЬг Туг Не Рго Рго С1у 01и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Пе О1и 01 п Зег 01 п Зег Зег О1у Зег О1у Зег О1у Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 О1п Агд ТЬг 11е А1а Ьуз С1п Не О1п МеЕ Уа1 Ьуз
195 200 205
О1п 11е 01 у Ьуз С1у Агд Туг О1у О1и Уа1 Тгр МеЕ О1у Ьуз Тгр Агд
210 215 220
О1у О1и Ьуз Уа1 А1а Ча1 Ьуз νηΐ РЬе РЬе ТЬг ТЬг 01 и О1и А1а Зег
225 23 0 235 240
Тгр РЬе Агд О1и ТЬг О1и 11е Туг С1П ТЬг Уа1 Ьеи МеЕ Агд Низ О1и
245 250 255
Азп Не Ьеи О1у РЬе 11е А1а А1а Азр 11е Ьуз О1у ТЬг О1у Зег Тгр
260 265 270
ТЬг С1п Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг Низ О1и Азп О1у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег МеЕ Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег О1у Ьеи Суз Низ Ьеи Низ ТЬг С1и 11е РЬе
- 105 014525
305 310 315 320
Зег ТЫ 01п 01у Ьуз Рго А1а Не А1а Нхз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп 11е Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп О1у ТЬг Суз Суз Не А1а Азр Ьеи О1у
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе Не Зег Азр ТЬг Азп 01и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 3 65
Азп ТЬг Агд Уа1 01у ТЬг Ьуз Агд Туг Мек Рго Рго 01и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
01и Зег Ьеи Азп Агд Азп Н1з РЬе 01п Зег Туг Не Мек А1а Азр Мек
385 39 0 395 400
Туг Зег РЬе 01у Ьеи Не Ьеи Тгр О1и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
01у 01у 11е Уа1 О1и О1и Туг 01п Ьеи Рго Туг Нхз Азр Ьеи νηΐ Рго
420 425 430
Зег Азр Рго Зег Туг 01и Азр Мек Агд О1и Не Уа1 Суз Не ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд РГО Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр О1и Суз Ьеи Агд
450 455 460
01п Мек 01у Ьуз Ьеи Мек ТЫ О1и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мек Зег 01и
485 490 495
Зег 01п Азр 11е Ьуз Ьеи
500 <210> 105 <211> 532 <212> РКТ <213> Каккиз зр <400> 105
ТЬг 01п Ьеи Туг ТЫ Туг Не Агд Ьеи Ьеи 01у А1а Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не Не Зег Нхз . Уа1 01п О1у С1п Азп Ьеи Азр Зег Мек Ьеи Нхз О1у
20 25 30
ТЫ 01у Мек Ьуз Зег Азр Уа1 Азр 01п Ьуз Ьуз Рго 01и Азп 01у УаХ
35 40 45
ТЫ Ьеи А1а Рго 01и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
01у Нхз Суз Рго Азр Азр А1а Не Азп Азп ТЫ Суз Не ТЬг Азп О1у
65 70 75 80
Нхз Суз РЬе А1а Не Не О1и О1и Азр Азр 01п 01у С1и ТЬг ТЫ Ьеи
85 90 95
ТЫ Зег 01у Суз Мек Ьуз Туг 01и 01у Зег Азр РЬе О1П Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а 01п Ьеи Агд Агд ТЬг 11е 01и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп 01п Туг Ьеи 01п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не О1у
13 0 13 5 140
Рго РЬе РЬе Азр 01у Зег УаХ Агд Тгр Ьеи АХа УаХ Ьеи Не Зег Мек
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Уа1 А1а Мек Не Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз Нхз Туг Суз Ьуз Зег 11е Зег Зег Агд О1у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
- 106 014525
Ьеи Оби 01п Азр Оби Аба РЬе ббе Рго 200 Уаб Обу Оби Зег 205 Ьеи Ьуз Азр
195
Ьеи 11е Азр Обп. Зег Сбп Зег Зег Обу Зег Обу Зег Обу Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уаб Сбп Агд ТЫ ббе Аба Ьуз Обп Тбе Сбп МеЕ Уаб Агд Обп Уаб
225 230 235 240
Обу ьуз Сбу Агд Туг Обу Оби Уаб Тгр МеЕ Обу Ьуз Тгр Агд Сбу Оби
245 250 255
Ьуз Уаб Аба Уаб Ьуз Уаб РЬе РЬе ТЬг ТЬг Оби Оби Аба Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд Сби ТЬг Оби ббе Туг Обп ТЬг Уаб Ьеи МеЕ Агд Нбз Оби Азп 1бе
275 280 285
Ьеи Обу РЬе ббе Аба Аба Азр Тбе Ьуз Обу ТЫ Обу Зег Тгр ТЬг Сбп
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 1бе ТЫ Азр Туг Нбз Оби Азп Обу Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз Аба ТЫ Ьеи Азр ТЬг Агд Аба Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Аба Туг
325 330 335
Зег Аба Аба Суз Обу Ьеи Суз Нбз Ьеи Нбз ТЬг Оби 1бе Туг Обу ТЬг
340 345 350
Обп Обу Ьуз Рго Аба 1бе Аба Нбз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп 1бе
355 360 3 65
Ьеи 1бе Ьуз Ьуз Азп Обу Зег Суз Суз Тбе Аба Азр Ьеи Сбу Ьеи Аба
370 375 380
Уаб Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЫ Азп Оби Уаб Азр 1бе Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уаб Обу ТЫ Агд Агд Туг МеЕ Аба Рго Оби Уаб Ьеи Азр Оби Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп Нбз РЬе Обп Рго Туг 1бе МеЕ Аба Азр 1бе Туг Зег
420 425 430
РЬе Обу Ьеи ббе ббе Тгр Оби МеЕ Аба Агд Агд Суз 1бе ТЬг Сбу Обу
435 440 445
1бе Уаб Оби Оби Туг Обп Ьеи Рго Туг Туг Азп МеЕ Уаб Рго Зег Азр
450 4 55 460
Рго Зег Туг Оби Азр МеЕ Агд Оби Уаб Уаб Суз Уаб Ьуз Агд Ьеи Агд
465 47 0 475 480
Рго 1бе Уаб Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр Оби Суз Ьеи Агд Аба Уаб
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи МеЕ Зег Оби Суз Тгр Аба Нбз Азп Рго Аба Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЫ Аба Ьеи Агд ббе Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи Аба Ьуз МеЕ Уаб Оби Зег Сбп
515 520 525
Азр Уаб Ьуз ббе
53 0
<210> 606
<211> 532
<212> РНТ
<213> КаЕЕиз позгуедбсиз
<400> 106
МеЕ ТЬг Обп Ьеи Туг ТЬг Туг 1бе Агд Ьеи Ьеи Обу Аба Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
Тбе Тбе Зег Нбз Уаб Сбп Сбу Сбп Азп Ьеи Азр Зег МеЕ Ьеи Нбз Сбу
20 25 30
ТЫ Обу МеЕ Ьуз Зег Азр Уаб Азр Сбп Ьуз Ьуз Рго Оби Азп Обу Уаб
- 107 014525
35 40 45
ТЬг Ьеи А1а Рго 01и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
С1у Ηίβ Суз Рго Азр Азр А1а 11е Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп О1у
65 70 75 80
Н1з Суз РЬе А1а Не Не 01и 01и Азр Азр 01п 01 у О1и ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
ТЬг Зег О1у Суз Мек Ьуз Туг 61и 01у Зег Азр РЬе 01п Суз Ьуз Авр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а 01п Ьеи Агд> Агд ТЬг Не 01и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 12 0 125
Ьеи Суз Азп οίη Туг Ьеи 01п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Х7а1 Уа1 Не О1у
13 0 135 14 0
Рго РЬе РЬе Азр О1у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Зег Мек
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Х7а1 А1а Мек 11е Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз ΗΪ3 Туг Суз Ьуз Зег 11е Зег Зег Агд О1у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи 01и О1п Азр С1и А1а РЬе 11е Рго Уа1 01у 01и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи Не Азр С1п Зег С1п Зег Зег 01 у Зег 01у Зег О1у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 С1п Агд ТЬг Не А1а Ьуз 01 п Не 01п Мек Уа1 Агд 01п Уа1
225 230 235 240
01у Ьуз 01у Агд Туг О1у 01и Уа1 Тгр Мек О1у Ьуз Тгр Агд С1у С1и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг 01и С1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд Б1и ТЬг О1и 11е Туг Θΐη ТЬг Уа1 Ьеи Мек Агд Н18 01и Азп Не
275 280 285
Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр 11е Ьуз 01у ТЬг С1у Зег Тгр ТЬг С1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг Низ 01и Азп О1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз 01у Ьеи Суз Шз Ьеи Н1з ТЬг 01и Не Туг 01у ТЬг
340 345 350
О1П О1у Ьуз Рго А1а Не А1а Н1з Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп Не
355 360 3 65
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп С1у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи О1у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп 01 и Уа1 Азр 11е Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 О1у ТЬг Агд Агд Туг Мек А1а Рго 01и Уа1 Ьеи Азр 01и Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп Шз РЬе С1п Рго Туг Не Мек А1а Азр 11е Туг Зег
420 42 5 43 0
РЬе С1у Ьеи Не 11е Тгр О1и Мек А1а Агд Агд Суз Не ТЬг О1у 01у
435 440 445
Не Уа1 61 и б1и Туг С1п Ьеи Рго Туг Туг Азп Мек Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг С1и Азр Мек Агд 01и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго 11е Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр С1и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
435 490 495
- 108 014525
Ьеи Ьуз Ьеи Мер 500 Зег 01и Суз Тгр А1а 505 Н1з Азп Рго А1а Зег 510 Агд Ьеи
ТЬг А1а Ьеи Агд Пе Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мер Уа1 01и Зег (31п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз Не
53 0
<210> 107 <211> 532 <212> РК.Т <213> КаРРиз погуедхсиз
<400> 107
Мер ТЫ <31п Ьеи Туг ТЬг Туг 11е Агд Ьеи Ьеи О1у А1а Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не Пе Зег Н1з Уа1 б1п 01у О1п Азп Ьеи Азр Зег Мер Ьеи НЬз 01у
20 25 30
ТЫ О1у Мер Ьуз Зег Азр Уа1 Азр О1п Ьуз Ьуз Рго С1и Азп 01у Уа1
35 40 45
ТЫ Ьеи А1а Рго 01и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
01у ΗΪ3 Суз Рго Азр Азр А1а Не Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп С1у
65 70 75 80
ΗΪ3 Суз РЬе А1а Не Не О1и 01и Азр Азр 01п О1у 01и ТЬг ТЫ Ьеи
85 90 95
ТЬг Зег С1у Суз Мер Ьуз Туг О1и 01у Зег Азр РЬе О1п Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а О1п Ьеи Агд Агд ТЬг Не С1и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп б1п Туг Ьеи 01п Рго ты Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не О1у
13 0 135 140
Рго РЬе РЬе Азр О1у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Зег Мер
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Уа1 А1а Мер 11е Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе 'Суз Туг
165 170 175
Ьуз ΗΪ3 Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд О1у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи 01и С1п Азр 51и А1а РЬе Не Рго Уа1 О1у <31и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи Не Азр Θΐη Зег 01п Зег Зег б1у Зег 01у Зег 01у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 01 п Агд ТЬг Не А1а Ьуз 01п Не 01п Мер Уа1 Агд п Уа1
225 230 235 240
<31у Ьуз О1у Агд Туг 01у О1и Уа1 Тгр Мер О1у Ьуз Тгр Агд 01у 01и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЫ С1и б1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд О1и ТЬг (31и Не Туг О1п ТЬг νηΐ Ьеи Мер Агд ΗΪ8 01и Азп Не
275 280 285
Ьеи 01у РЬе Не А1а А1а Азр 11е Ьуз 01у ТЬг 01у Зег Тгр ТЬг 01п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг Н1з О1и Азп 01у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз О1у Ьеи Суз Н1в Ьеи ΗΪ3 ТЫ О1и Не Туг 01 у ты
- 109 014525
340 345 . 350
31η О1у Ьуз Рго А1а 11е А1а Шз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп 11е
355 360 365
Ьеи 11е Ьуз Ьуз Азп (31у Зег Суз Суз 11е А1а Азр Ьеи О1у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп 01 и Уа1 Азр 11е Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 О1у ТЬг Агд Агд Туг МеЕ А1а Рго О1и Уа1 Ьеи Азр 01и Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп ΗΪ3 РЬе О1п Рго Туг Не МеЕ А1а Азр 11е Туг Зег
420 425 43 0
РЬе 01у Ьеи Не Не Тгр 01и МеЕ А1а Агд Агд Суз 11е ТЬг 01у О1у
435 4.40 445
Не Уа1 01и С1и Туг 01п Ьеи Рго Туг Туг Азп МеЕ Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег туг 61и Азр МеЕ Агд 01и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго 11е Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр 01и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи МеЕ Зег О1и Суз Тгр А1а Н±з Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеЕ Уа1 О1и Зег О1п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз· Не
530
<210> 108 <211> 502 <212 > РК.Т <213> Ното а зар1епз
<400> 108
МеЕ Ьеи Ьеи Агд Зег А1а 01у Ьуз Ьеи Азп Уа1 01у ТЬг Ьуз Ьуз О1и
1 5 10 15
Азр 01у 01и Зег ТЬг А1а Рго ТЬг Рго Агд Рго Ьуз νβΐ Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз Н1з Ηί3 Н1з Суз Рго О1и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр О1у Туг Суз РЬе ТЬг МеЕ Не 01и О1и Азр Азр Зег 01 у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 ТЬг Зег О1у Суз Ьеи О1у Ьеи 01и О1у Зег Азр РЬе О1п
65 70 75 80
ГЧ/я Дтгг Д ЯТЭ ТЬг Рго Не Рго Н1з 01п Агд Агд Яег Не 01и ηνα Суз
— --- ““Τ' —
85 эУ 95
ТЬг С1и Агд Азп 0111 Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Н1з Рго ТЬг Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр С1у Рго Не ΗΪ8 Н1в Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи 11е Зег Уа1 ТЬг 57а 1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Не Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд О1п О1и ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Не 01у Ьеи С1и О1п Азр О1и ТЬг Туг Не Рго Рго О1у О1и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Не 01и 01п Зег 01п Зег Зег 01у Зег 01у Зег 01 у Ьеи
180 185 190
- 110 014525
Рго Ьеи Ьеи Уа1 195 61п Агд ТЬг Не А1а Ьуз 200 О1п Не 61п 205 МеЕ Уа1 Ьуз
01п 11е 61у ьуз 61у Агд Туг 61у б1и Уа1 тгр МеЕ 61у Ьуз Тгр Агд
210 215 220
61у 61и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЫ 61и 61и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд (31и ТЬг 61и 11е Туг б1п ТЬг Ча1 Ьеи МеЕ Агд Ηίβ 61и
245 250 255
Азп Не Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз 61у ТЫ 61у Зег Тгр
260 2 65 270
ТЬг О1п Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг ΗΪ8 (31и Азп О1у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег МеЕ Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег 61у Ьеи Суз ΗΪ8 Ьеи Н1з ТЫ 61и Не РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг 61п 61у Ьуз Рго А1а Не А1а ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп Не Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп 61у ТЬг Суз Суз Не А1а Азр Ьеи <31у
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе Не Зег Азр ТЬг Азп 61и Уа1 Азр 11е Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд Уа1 61у ТЬг Ьуз Агд Туг МеЕ Рго Рго 61и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
61и Зег Ьеи Азп Агд Азп Н1э РЬе 61п Зег Туг Не МеЕ А1а Азр МеЕ
385 390 395 400
Туг Зег РЬе 61у Ьеи Не Ьеи Тгр 61и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
61у 61у Не Уа1 61и 61и Туг 61п Ьеи Рго Туг Н18 Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 43 0
Зег Азр Рго Зег Туг 61и Азр МеЕ Агд 61и Не Уа1 Суз Не Ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр 61и Суз Ьеи Агд
450 455 460
О1п МеЕ 61у Ьуз Ьеи МеЕ ТЬг 61и Суз Тгр А1а ΗΪ8 Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеЕ Зег 61и
485 490 495
Зег 61п Азр 11е Ьуз Ьеи
500
<210> 109 <211> 502 <212> РК.Т <213> Ното заргепз <400> 109
МеЕ Ьеи Ьеи Агд Зег А1а 61у Ьуз
1 5
Азр 61у 61и Зег ТЬг А1а Рго ТЫ
20
Ьуз Суз ΗΪ8 Н±з Н13 Суз Рго 61и
35 40
ТЬг Азр 01 у Туг Суз РЬе ТЬг МеЕ
50 55
Рго Уа1 Уа1 ТЫ Зег 61у Суз Ьеи
Ьеи Азп 10 \7а1 <31у ТЬг Ьуз Ьуз 61и 15
Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
25 Азр Зег Уа1 Азп Азп 30 Не Суз Зег
Не 61и 61 и Азр 45 Азр Зег 61у Ьеи
61у Ьеи 61и 60 61у Зег Азр РЬе 61п
- 111 014525
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЬг Рго Не Рго НХЗ 51п Агд Агд Зег 11е 51и Суз Суз
85 90 95
ТЬг 51и Агд Азп (31и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Нхз Рго ТЫ Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр 61у Рго 11е Нхз Нхз Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи 11е Зег Уа1 ТЬг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи 11е Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд 51п 61и ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
11е 51у Ьеи (31и С1п Азр 51и ТЬг Туг Не Рго Рго 51у 51и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Не С1и 51П Зег 51П Зег Зег С1у Зег В1у Зег О1у Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 •51п Агд ТЬг 11е А1а Ьуз 51п Не 61п Мек Уа1 Ьуз
195 200 205
б1п 11е (31у Ьуз СПу Агд Туг 51у 61и Уа1 Тгр Мек 51у Ьуз Тхр Агд
210 215 220
51у (31и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг б1и 51и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд 61и ТЫ 51и Не Туг 51п ТЬг Уа1 Ьеи Мек Агд Нхз О1и
245 250 255
Азп. 11е Ьеи <31у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз 51у ТЫ 51у Зег Тгр
260 265 270
ТЫ (31п Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг Шз 51и Азп 51у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег Мек Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег 51у Ьеи Суз Нхз Ьеи Нхз ТЫ 51и Не РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг (31п С1у Ьуз Рго А1а Не А1а Нхз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп 11е Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп (31у ТЬг Суз Суз Не А1а Авр Ьеи (31у
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе Не Зег Азр ТЬг Азп 61и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд Уа1 б1у ТЬг Ьуз Агд Туг Мек Рго Рго 51и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
(31и Зег Ьеи Азп Агд Азп Нхз РЬе 51п Зег Туг 11е Мек А1а Азр Мек
385 390 395 400
Туг Зег РЬе (31у Ьеи 11е Ьеи Тгр 51и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
(31 у (31 у 11е Уа1 51 и 51 и Туг 51п Ьеи Рго Туг Нхз Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 43 0
Зег Азр Рго Зег Туг 61и Азр Мек Агд 51и Не Уа1 Суз Не Ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр 51и Суз Ьеи Агд
450 455 460
(31п Мек С1у Ьуз Ьеи Мек ТЬг 51и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мек Зег С1и
485 490 495
Зег <31п Азр Не Ьуз Ьеи
500
- 112 014525 <210> 110 <211> 532 <212> РКТ <213> КаЕЕиз зр <400> 110
МеЕ ТИг 61п Ьеи Туг ТИг Туг Не Агд Ьеи Ьеи 61у 10 А1а Суз Ьеи 15 РЬе
1 5
11е Не Зег Н1з Уа1 61п 61у 61п Азп Ьеи Азр Зег МеЕ Ьеи ΗΪ3 61у
20 25 30
ТИг б1у МеЕ Ьуз Зег Азр Уа1 Азр 61п Ьуз Ьуз Рго 61и Азп 61у Уа1
35 40 45
ТИг Ьеи А1а Рго 61и Азр ТИг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
61у ΗΪ3 Суз Рго Азр Азр А1а Не Авп Азп ТИг Суз Не ТИг Азп 61у
65 70 75 80
Н13 Суз РЬе А1а Не Не 01и 61и Азр Азр 61п 61у 61и ТИг ТЬг Ьеи
85 90 95
ТИг Зег 61у Суз МеЕ Ьуз Туг 61и 61 у Зег Азр РЬе 61п Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а 61п Ьеи Агд Агд ТИг Не 61и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп 61п Туг Ьеи 61п Рго ТИг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не 61у
13 0 135 140
Рго РЬе РЬе Азр 61у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Зег МеЕ
14 5 150 155 160
А1а Уа1 Суд Не Уа1 А1а МеЕ Не Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз Нхз Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд 61 у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи 61и 61п Азр 61и А1а РЬе Не Рго Уа1 61у 61и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи 11е Азр 61п Зег С1П Зег Зег 61у Зег 61у Зег 61у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 61п Агд ТЬг 11е А1а Ьуз 61п Не 61п МеЕ Уа1 Агд 61п Уа1
225 230 235 240
61у Ьуз 61у Агд Туг 61у 61и Уа1 Тгр МеЕ 61у Ьуз Тгр Агд 61у 61и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТИг ТИг 61и 61 и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд 61и ТИг 61и Не Туг 61п ТИг Уа1 Ьеи МеЕ Агд Н1з 61и Азп Не
275 280 285
Ьеи 61у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз 61у ТИг 61 у Зег Тгр ТИг 61п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг ΗΪ3 61 и Азп 61у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз 61у Ьеи Суз Н4з Ьеи ΗΪ3 ТЬг 61и Не Туг 61 у ТЬг
340 345 350
(31п 61у Ьуз Рго А1а Не А1а Н1з Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп 11е
355 360 365
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп 61у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи 61у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТИг Азп 61 и Уа1 Азр Не Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 61у ТИг Агд Агд Туг МеЕ А1а Рго 61 и Уа1 Ьеи Азр 61 и Зег
- 113 014525
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп Н1з РЬе (31п Рго Туг Не МеЕ А1а Азр 11е 43 0 Туг Зег
420 425
РЬе 61у Ьеи 11е Не Тгр С1и МеЕ А1а Агд Агд Суз Не ТЬг (31у <31у
43 5 440 445
Не Уа1 (31и <31и Туг <31п Ьеи Рго Туг Туг Азп МеЕ Уа1 Рго Зёг Азр
450 455 460
Рго Зег Туг 01и Азр МеЕ Агд 01и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго 11е Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр (31и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи МеЕ Зег 61 и Суз Тгр А1а Низ Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд 11е Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеЕ Уа1 (31и Зег С1п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз Не
53 0
<210> 111 <211> 530 <212> РЕТ <213> Ното зариепз
<400> 111
МеЕ ТЬг Зег Зег Ьеи (31 п Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг Не Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег (31п Азп (31п 61и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг <31п (31п Азр Ьеи О1у 11е (31у (31и
35 40 45
Зег Агд 11е Зег Низ (31и Азп (31у ТЬг 11е Ьеи Суз Зег Ьуз (31 у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг (31у Ьеи Тгр (31и Ьуз Зег Ьуз (31у Азр Не Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз Б1п (31 у Суз Тгр Зег Низ Не 61у Азр Рго С1п (31и Суз Низ Туг
85 90 95
(31и С1и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не (31п Азп (31у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 120 125
б1и Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Низ Зег
13 0 135 14 0
РЬе Азп Агд Азр С1и ТЬг 11е 11е Не А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе (31у Туг Агд МеЕ Ьеи ТЬг
165 170 175
О1у Азр Агд Ьуз (31 п (31у Ьеи Низ Зег МеЕ Азп МеЕ МеЕ б1и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег (31и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи (31 и Ьеи
195 200 205
Не (31у Агд С1у Агд Туг (31у А1а Уа1 Туг Ьуз б1у Зег Ьеи Азр (31и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а νηΐ Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд (31п Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп (31и Ьуз Азп 11е Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеЕ (31и Низ Азр Азп
245 250 255
- 114 014525
Не А1а Агд РЬе 260 11е Уа1 01у Азр О1и Агд Уа1 265 ТЬг АБа Азр 270 01у Агд
МеС О1и Туг Беи Беи Уа1 МеС б1и Туг Туг Рго Азп (31у Зег Беи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Беи Зег Беи Н1я ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег Зег Суз Агд Беи
290 295 300
А1а Н13 Зег Уа1 ТЬг Агд 01у Беи А1а Туг Беи НБз ТЫ 01и Беи Рго
305 310 315 320
Агд (31у Азр ΗΪ3 Туг Буз Рго А1а 11е Зег ΗΪ3 Агд Азр Беи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Беи 57а1 Буз Азп Азр 01 у ТЬг Суз Уа1 11е Зег Азр РЬе
340 345 350
01у Беи Зег Мер Агд Беи ТЬг 01у Азп Агд Беи Уа1 Агд Рго 01 у О1и
355 360 3 65
01и Азр Азп А1а А1а 11е Зег О1и Уа1 01у ТЬг 11е Агд Туг МеС АБа
370 375 380
Рго О1и Уа1 Беи О1и О1у А1а Уа1 Азп Беи Агд Азр Суз С1и Зег А1а
385 390 395 400
Беи Ьуз 01п Уа1 Азр МеС Туг А1а Беи 01у Беи 11е Туг Тгр 01 и 11е
405 410 415
РЬе МеС Агд Суз ТЬг Азр Беи РЬе Рго 01у С1и Зег Уа1 Рго 01и Туг
420 425 43 0
О1п МеС А1а РЬе О1п ТЬг О1и Уа1 01у Азп Н1з Рго ТЫ РЬе О1и Азр
435 440 445
МеС 01п Уа1 Беи Уа1 Зег Агд О1и Буз 01п Агд Рго Буз РЬе Рго 01и
450 455 460
А1а Тгр Буз О1и Азп Зег Беи А1а Уа1 Агд Зег Беи Буз 01и ты 11е
465 470 475 480
(31 и Азр Суз Тгр Азр О1п Авр А1а 01 и А1а Агд Беи ТЫ А1а О1п Суз
485 490 495
А1а 01и О1и Агд МеС А1а 01и Беи МеС МеС 11е Тгр О1и Агд Азп Буз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЬг Уа1 Азп Рго МеС Зег ТЬг А1а МеС О1п Азп 01и
515 52 0 525
Агд Агд
530
<210> 112 <211> 530 <212> РКТ <213> Ното зарБепз
<400> 112
МеС ТЬг Зег Зег Беи 01п Агд Рго Тгр Агд УаБ Рго Тгр Беи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг 11е Беи Беи Уа1 Зег ТЬг АБа АБа АБа Зег 01п Азп О1п 01и Агд
20 25 30
Беи Суз АБа РЬе Буз Азр Рго Туг О1п 01п Азр Беи 01у 11е 01 у 01и
35 40 45
Зег Агд 11е Зег Нхя 01 и Азп О1у ты 11е Беи Суз Зег Ьуз 01у Зег
50 55 60
ТЫ Суз Туг О1у Беи Тгр 01и Буз Зег Буз 01у Азр 11е Азп Беи Уа1
65 70 75 80
Буз 01 п 01 у Суз Тгр Зег ΗΪ3 11е 01у Азр Рго 01п 01и Суз НБз Туг
85 90 95
О1и 01и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег 11е О1п Азп О1у ТЬг
- 115 014525
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уаб Азп РЬе ТЬг
115 120 125
Сби Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Нбз Зег
130 135 140 (
РЬе Азп Агд Азр Сби ТЬг ббе ббе ббе Аба Ьеи Аба Зег Уаб Зег Уаб
145 150 155 160
Ьеи. Аба Уаб Ьеи Тбе Уаб Аба Ьеи Суз РЬе Сбу Туг Агд МеЕ Ьеи ТЬг
165 170 175
Сбу Азр Агд Ьуз Сбп Сбу Ьеи Нбз Зег МеЕ Азп МеЕ МеЕ Сби Аба Аба
180 185 190
Аба Зег Сби Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи Оби Ьеи
195 200 205
1бе Сбу Агд Сбу Агд Туг Сбу Аба Уаб Туг Ьуз Сбу Зег Ьеи Азр Сби
210 215 220
Агд Рго Уаб Аба Уаб Ьуз Уаб РЬе Зег РЬе Аба Азп Агд Сбп Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп Сби Ьуз Азп ббе Туг Агд Уаб Рго Ьеи МеЕ Сби Нбз Азр Азп
245 250 255
ббе Аба Агд РЬе ббе Уаб Сбу Азр Сби Агд Уаб ТЬг Аба Азр Сбу Агд
260 265 270
МеЕ Сби Туг Ьеи Ьеи Уаб МеЕ Сби Туг Туг Рго Азп Сбу Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Нбз ТЬг Зег Азр Тгр Уаб Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
Аба Нбз Зег Уаб ТЬг Агд Сбу Ьеи Аба Туг Ьеи Нбз ТЬг Сби Ьеи Рго
3 05 310 315 320
Агд Сбу Аьр Нбз Туг Ьуз РхО •п 1 — лхл ббе Зег Н13 Аху Авр Ьеи Азп Зсь
325 330 335
Агд Азп Уаб Ьеи Уаб Ьуз Азп Азр Сбу ТЬг Суз Уаб 1бе Зег Азр РЬе
340 345 350
Сбу Ьеи Зег МеЕ Агд Ьеи ТЬг Сбу Азп Агд Ьеи Уаб Агд Рго Сбу Сби
355 360 365
Сби Азр Азп Аба Аба Не Зег Сби Уаб Сбу ТЬг Тбе Агд Туг МеЕ Аба
370 375 3 80
Рго Сби Уаб Ьеи Сби Сбу Аба Уаб Азп Ьеи Агд Азр Суз Сби Зег Аба
385 390 395 400
Ьеи Ьуз Сбп Уаб Азр МеЕ Туг Аба Ьеи Сбу Ьеи Тбе Туг Тгр Сби Не
405 / 410 415
РЬе МеЕ Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго Сбу Сби Зег Уаб Рго Сби Туг
420 425 430
Сбп МеЕ Аба РЬе Сбп ТЬг Сби’ Уаб Сбу Азп Нбз Рго ТЬг РЬе Сби Азр
435 440 445
МеЕ Сбп Уаб Ьеи Уаб Зег Агд Сби Ьуз Сбп Агд Рго Ьуз РЬе Рго Сби
450 455 460
Аба Тгр Ьуз Сби Азп Зег Ьеи Аба Уаб Агд Зег Ьеи •Ьуз Сби ТЬг Не
465 470 475 480
Сби Азр Суз Тгр Азр Сбп Азр Аба Сби Аба Агд Ьеи ТЬг Аба Сбп Суз
485 490 495
Аба Сби Сби Агд МеЕ Аба Сби Ьеи МеЕ МеЕ Тбе Тгр Сби Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уаб Зег Рго ТЬг Уаб Азп Рго МеЕ Зег ТЬг Аба МеЕ Сбп Азп Сби
515 520 525
Агд Агд
530
- 116 014525 <210> 113 <211> 1038 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400> 113
Мер 1 ТЬг Зег Зег Ьеи 5 51п Агд Рго Тгр Агд Уа1 10 Рго Тгр Ьеи Рго 15 Тгр
ТЬг Не Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег 51п Азп 51п 51 и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг 51п О1п Азр Ьеи 61у Не 51у 61и
35 40 45
Зег Агд 11е Зег Н1з С1и Азп 51у ТЬг Не Ьеи Суз Зег Ьуз 61 у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг 51у Ьеи Тгр 61и Ьуз Зег Ьуз 51у Азр 11е Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз 51п 51у Суз Тгр Зег Нйз Не 51у Азр Рго 61 п 61и Суз ΗΪ8 Туг
85 90 95
(31и С1и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не 51п Азп 61у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 12 0 125
С1и Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Н1з Зег
130 135 140
РЬе Азп Агд Азр 51 и ТЬг Не Не 11е А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе 51у Туг Агд МеЕ Ьеи ТЬг
165 170 175
61у Авр Агд Ьуз 51п 51у Ьеи Н1з Зег МеЕ Азп МеЕ МеЕ 51и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег 51и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи 51и Ьеи
195 200 205
11е 51у Агд 61у Агд Туг 61у А1а Уа1 Туг Ьуз 51у Зег Ьеи Азр 51и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд 51п Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп 51и Ьуз Азп Не Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеЕ 51и Н18 Азр Азп
245 250 255
Не А1а Агд РЬе Не Уа1 51у Азр 51и Агд Уа1 ТЬг А1а Азр 51у Агд
260 265 270
МеЕ 61и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеЕ 51и Туг Туг Рго Азп 51у Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Н1з ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
А1а Н1з Зег Уа1 ТЬг Агд 51у Ьеи А1а Туг Ьеи Н1з ТЬг 51и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд 51у Азр Н1з Туг Ьуз Рго А1а Не Зег Ηί3 Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Азп Азр 51у ТЬг Суз Уа1 Не Зег Азр РЬе
340 345 350
51у Ьеи Зег МеЕ Агд Ьеи ТЬг 51у Азп Агд Ьеи 57а 1 Агд Рго 51у 61и
355 360 365
С1и Азр Азп А1а А1а Не Зег 61и Уа1 51у ТЬг Не Агд Туг МеЕ А1а
370 375 380
Рго 51и Уа1 Ьеи 51и 51у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Суз 51и Зег А1а
385 390 395 400
Ьеи Ьуз 51п Уа1 Азр МеЕ Туг А1а Ьеи 51у Ьеи 11е Туг Тгр 51и Не
- 117 014525
405 410 415
РЬе МеЕ Агд Суз 420 ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго 425 01у 01и Зег Уа1 Рго 430 С1и Туг
01п МеЕ А1а РЬе 01п ТЫ 01и Уа1 01у Азп Н1з Рго ТЫ РЬе С1и Азр
435 440 445
,МеЕ 61п Уа1 Ьеи Уа1 Зег Агд О1и Ьуз О1п Агд Рго Ьуз РЬе Рго О1и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз С1и Авп Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз 01и ТЫ Не
465 470 475 480
<31 и Азр Суз Тгр Азр 01 п Азр А1а 01и А1а Агд Ьеи ТЫ А1а 01п Суз
485 490 495
А1а 01 и 01и Агд МеЕ А1а О1и Ьеи МеЕ МеЕ 11е Тгр 01и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЫ Уа1 Азп Рго МеЕ Зег ТЫ А1а МеЕ 01п Азп 01и
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег Н13 Азп Агд Агд Уа1 Рго Ьуз Не 01у Рго Туг Рго
530 535 540
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг 11е 01и Азр Зег Не ΗΪ3 ΗΪ3 ТЬг Азр
545 550 555 560
Зег Не Уа1 Ьуз Азп Не Зег Зег О1и Н1з Зег МеЕ Зег Зег ТЬг Рго
565 570 575
Ьеи ТЬг 11е С1у С1и Ьуз Азп Агд Азп Зег 11е Азп Туг 01и Агд С1п
580 585 590
б1п А1а 01п А1а Агд 11е Рго Зег Рго О1и ТЫ Зег Уа1 ТЫ Зег Ьеи
595 600 605
Зег ТЬг Азп ТЬг ТЬг ТЫ ТЫ Азп ТЬг ты 01у Ьеи ТЬг Рго Зег ТЬг
610 615 620
(31у МеЕ ТЬг ТЬг Не Зег 01и МеЕ Рго Туг Рго Азр 01и ТЫ Азп Ьеи
625 63 0 635 640
Н1з ТЬг ТЬг Азп Уа1 А1а 01п Зег Не О1у Рго ТЬг Рго Уа1 Суз Ьеи
645 650 655
01п Ьеи ТЬг О1и 01и Азр Ьеи О1и ТЬг Азп Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз 01и
660 665 670
Уа1 Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз 01и Зег Зег Азр 01и Азп Ьеи МеЕ С1и ΗΪ8
675 680 685
Зег Ьеи Ьуз С1п РЬе Зег О1у Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег ТЫ Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи Не Ьуз Ьеи А1а Уа1 О1и А1а ТЫ 01 у 01п
705 710 715 720
01п Азр РЬе ТЬг 01п ТЫ А1а Азп 01у О1п А1а Суз Ьеи Не Рго Азр
725 730 73 5
Уа1 Ьеи Рго ТЬг 01п Не Туг Рго Ьеи Рго Ьуз 01п С1п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго ТЬг Зег Ьеи Рго Ьеи Азп ТЬг Ьуз Азп Зег ТЫ Ьуз 01и
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз РЬе 01у Зег Ьуз Ηίβ Ьуз Зег Азп Ьеи Ьуз О1п Уа1
770 775 780
С1и ТЬг О1у Уа1 А1а Ьуз МеЕ Азп ТЬг Не Азп А1а А1а 01и Рго Ηίβ
785 790 795 800
Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг МеЕ Азп 01у Уа1 А1а 01у Агд Азп ΗΪ3 Зег Уа1
805 810 815
Азп. Зег Н1з А1а А1а ТЫ ТЫ 01п Туг А1а Азп 01у ТЫ Уа1 Ьеи Зег
820 825 830
О1у 01 п ТЬг ТЬг Азп Не Уа1 ты Н1з Агд А1а 01п О1и МеЕ Ьеи С1п
835 840 845
Азп 01п РЬе Не С1у. О1и Азр ТЬг Агд Ьеи Азп Не Азп Зег Зег Рго
850 855 860
- 118 014525
Азр С1и Нхз 01и Рго Ьеи Ьеи Агд Агд СХи СХп С1п А1а С1у Нхз Азр
865 870 875 880
С1и б1у ναΙ ьеи Азр Агд Ьеи Уа1 Азр Агд Агд СХи Агд Рго Ьеи 01 и
885 890 895
С1у 01у Агд Ткг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег С1и
900 905 910
С1п Азр Уа1 Ьеи А1а С1п 01у Уа1 Рго Зег Ткг АХа АХа Азр Рго СХу
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд А1а СХп Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
930 935 94 0
А1а Ткг Азп 7а1 Ьеи Азр СХу Бег Зег Пе СХп 1Хе СХу СХи Зег Ткг
945 950 955 960
<31п Азр С1у Ьуз Зег 01 у Зег СХу СХи Ьуз Не Ьуз Ьуз Агд УаХ Ьуз
965 970 975
Ткг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег Т11Г Тгр ναΐ Не Зег
9Θ0 985 990
ТЬг 01и Зег Ьеи Азр Суз СХи Уа1 Азп Азп Азп 01 у Зег Азп Агд А1а
995 1000 1005
Уа1 Нхз Зег Ьуз Зег Зег Ткг АХа УаХ Туг Ьеи А1а СХи С1у СХу Ткг
1010 1015 1020
А1а Ткг ТЬг Мек Уа1 Зег Ьуз Азр 1Хе СХу Мек Азп Суз Ьеи
1025 1030 1035
<210> 114 <211> 1038 <212> РКТ <213> Ното зархепз
<400> 114
Мек Ткг Зег Зег Ьеи С1п Агд Рго Тгр Агд УаХ Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
Ткг 1Хе Ьеи Ьеи νηΐ Зег Ткг АХа АХа АХа Зег С1п Азп 01п СХи Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а Рке Ьуз Азр Рго Туг СХп С1п Азр Ьеи СХу Не СХу СХи
35 40 45
Зег Агд 11е Зег Нхз СХи Азп СХу Ткг Не Ьеи Суз Зег Ьуз СХу Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг С1у Ьеи Тгр СХи Ьуз Зег Ьуз СХу Азр Не Азп Ьеи УаХ
65 70 75 80
Ьуз СХп СХу Суз Тгр Зег Нхз Не С1у Азр Рго СХп СХи Суз Нхз Туг
85 90 95
СХи С1и Суз Уа1 Уа1 Ткг Ткг Ткг Рго Рго Зег Не СХп Азп С1у Ткг
100 105 110
Туг Агд Рке Суз Суз Суз Зег Ткг Азр Ьеи Суз Азп УаХ Азп Рке Ткг
115 12 0 125
С1и Азп Рке Рго Рго Рго Азр Ткг Ткг Рго Ьеи Зег Рго Рго Нхз Зег
13 0 135 140
РИе Азп Агд Азр СХи Ткг 11е Не 11е АХа Ьеи АХа Зег Уа1 Зег УаХ
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи 11е УаХ АХа Ьеи Суз Рке СХу Туг Агд Мек Ьеи Ткг
165 170 17 5
СХу Азр Агд Ьуз СХп СХу Ьеи Нхз Зег Мек Азп Мек Мек СХи А1а А1а
180 185 190
А1а Зег С1и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи СХи Ьеи
195 200 205
Не СХу Агд СХу Агд Туг СХу АХа Уа1 Туг Ьуз СХу Зег Ьеи Азр С1и
- 119 014525
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд О1п Азп РЬе
225 23 0 235 240
Не Азп 01и Ьуз Азп 11е Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеЕ О1и Низ Азр Азп
245 250 255
11е А1а Агд РЬе Не Уа1 01у Азр 01и Агд Уа1 ТЬг А1а Азр О1у Агд
260 265 270
МеЕ 01и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеЕ 01и Туг туг Рго Азп О1у Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Низ ТЬг Зег Авр Тгр Уа1 Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
А1а Низ Зег Уа1 ТЫ Агд 01у Ьеи А1а Туг Ьеи Низ ТЬг О1и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд 01у Азр Низ Туг Ьуз Рго А1а Не Зег Низ Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Азп Азр О1у ТЬг Суз Х7а1 Не Зег Азр РЬе
340 345 350
(31у Ьеи Зег МеЕ Агд Ьеи ТЬг О1у Азп Агд Ьеи Уа1 Агд Рго 01у О1и
355 360 365
01и Азр Азп А1а А1а 11е Зег 01и Уа1 О1у ТЬг Не Агд Туг МеЕ А1а
370 375 380
Рго 01и Уа1 Ьеи О1и О1у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Суз 01и Зег А1а
385 390 395 400
Ьеи. Ьуз 01П Уа1 Азр МеЕ Туг А1а Ьеи 01у Ьеи Не Туг Тгр 01и Не
405 410 415
РЬе МеЕ Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго О1у О1и Зег Уа1 Рго О1и Туг
420 425 430
01п МеЕ А1а РЬе С1п ТЬг О1и Уа1 01у Азп Низ Рго ТЬг РЬе О1и Азр
435 440 445
МеЕ 01п Уа1 Ьеи Уа1 Зег Агд О1и Ьуз О1П Агд Рго Ьуз РЬе Рго О1и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз О1и Азп Зег- Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз 01и ТЬг 11е
465 470 475 480
О1и Азр Суз Тгр Азр 01 п Азр А1а О1и А1а Агд Ьеи ТЬг А1а 01п Суз
485 490 495
А1а О1и 01и Агд МеЕ А1а 01и Ьеи МеЕ МеЕ Не Тгр О1и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЬг Уа1 Азп Рго МеЕ Зег ТЬг А1а МеЕ 01п Азп О1и
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег Низ Азп Агд Агд Уа1 Рго Ьуз Не О1у Рго Туг Рго
530 535 540
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг Пе О1и Азр Зег Не Н1з Низ ТЬг Азр
545 550 555 560
Зег Не Уа1 Ьуз Азп Не Зег Зег О1и Низ Зег МеЕ Зег Зег ТЬг Рго
565 570 575
Ьеи ТЬг 11е 01у О1и Ьуз Азп Агд Азп Зег 11е Азп Туг 01и Агд О1п
580 585 590
О1п А1а 01п А1а Агд 11е Рго Зег Рго 01и ТЬг Зег Уа1 ТЬг Зег Ьеи
595 600 605
Зег ТЬг Азп ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Азп ТЬг ТЬг 01у Ьеи ТЬг Рго Зег ТЬг
610 615 62 0
О1у МеЕ ТЬг ТЬг Не Зег 01и МеЕ Рго Туг Рго Азр О1и ТЬг Азп Ьеи
625 63 0 635 64 0
Низ ТЬг ТЬг Азп Уа1 А1а С1п Зег Не 01у Рго ТЬг Рго Уа1 Суз Ьеи
645 650 655
б1п Ьеи ТЬг О1и О1и Азр Ьеи 01и ТЬг Азп Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз 01и
660 665 670
- 120 014525
Уа1 Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз 01и Зег Зег Азр 01и Азп Ьеи МеР 685 01и Нхз
675 680
Зег Ьеи Ьуз 01п РЬе Зег О1у Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег ТЬг Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи Ые Ьуз Ьеи А1а Уа1 01и А1а ТЬг 01у О1п
705 710 715 720
01п Азр РЬе ТЬг Б1п ТЬг А1а Азп 01 у 01п А1а Суз Ьеи 11е Рго Азр
725 730 735
Уа1 Ьеи Рго ТЬг 01п Не Туг Рго Ьеи Рго Ьуз 01 п О1п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго ТЬг Зег Ьеи Рго Ьеи Азп ТЬг Ьуз Азп Зег ТЬг Ьуз О1и
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз РЬе 01у Зег Ьуз Нхз Ьуз Зег Азп Ьеи Ьуз 01п Уа1
770 775 780
Б1и ТЬг 01у Уа1 А1а Ьуз Мер Азп ТЬг 11е Азп А1а А1а О1и Рго Нхз
785 790 795 800
Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг Мер Азп О1у Уа1 А1а О1у Агд Азп Нхз Зег Уа1
805 810 815
Азп Зег Нхз А1а А1а ТЬг ТЬг С1п Туг А1а Азп Агд ТЬг Уа1 Ьеи Зег
820 825 83 0
01у О1п ТЬг ТЬг Азп Ые Та! ТЬг Нхз Агд А1а О1п 01и МеР Ьеи О1п
835 840 845
Азп. 01п РЬе Не О1у 01и Азр ТЬг Агд Ьеи Азп Не Азп Зег Зег Рго
850 855 860
Азр О1и Нхз 01и Рго Ьеи Ьеи Агд Агд О1и 01п 01п А1а О1у Ηί з Азр
865 870 875 880
О1и 01у Уа1 Ьеи Авр Агд Ьеи Уа1 Азр Агд Агд О1и Агд Рго Ьеи О1и
885 890 895
О1у О1у Агд ТЬг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег О1и
900 905 910
С1п Азр Уа1 Ьеи А1а 01п О1у Уа1 Рго Зег ТЬг А1а А1а Азр Рго О1у
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд А1а О1п Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
930 935 940
А1а ТЬг Азп Уа1 Ьеи Азр О1у Зег Зег Не О1п Не 01у О1и Зег ТЬг
945 950 955 960
Б1П Азр 01у Ьуз Зег 01у Зег О1у Б1и Ьуз Не Ьуз Ьуз Агд Уа1 Ьуз
965 970 975
ТЬг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег ТЬг Тгр Уа1 11е Зег
980 985 990
ТЬг О1и Зег Ьеи Азр Суз О1и Уа1 Азп Азп Азп О1у Зег Азп Агд А1а
995 1000 1005
Уа1 ΗΪ3 Зег Ьуз Зег Зег ТЬг А1а Уа1 Туг Ьеи А1а 01и О1у 01у ТЬг
1010 1015 1020
А1а ТЬг ТЬг Мер Уа1 Зег Ьуз Азр 11е 01у Мер Азп Суз Ьеи
1025 1030 1035
<210> 115
<211> 1038
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 115
МеР ТЬг Зег Зег Ьеи О1п Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг Не Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег 01п Азп О1п 01 и Агд
- 121 014525
25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг 61п 61п Авр Ьеи 61у 45 11е 61у 61и
35 40
Зег Агд Не Зег Н1з 61 и Авп 61у ТЬг Не Ьеи Суз Зег Ьуз 61у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг 61у Ьеи Тгр 61и Ьув Зег Ьув 61у Авр Не Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз 61п 61у Суз Тгр Зег Н1з Не 61у Азр РГО 61п 61и Сув Н1з Туг
85 90 95
61 и 61и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не 61п Азп 61у.ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Сув Сув Зег ТЬг Авр Ьеи Суз Авп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 120 125
61и Азп РЬе Рго Рго Рго Авр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Н18 Зег
130 135 140
РЬе Азп Агд Азр 61 и ТЬг 11е Не Не А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Ча1
145 15 0 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе 61у Туг Агд МеЕ Ьеи ТЬг
165 170 175
61у Азр Агд Ьув 61п 61 у Ьеи ΗΪ8 Зег МеЕ Азп МеЕ МеЕ 61и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег 61и Рго Зег Ьеи Авр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи 61и Ьеи
195 200 205
11е 61у Агд 61у Агд Туг 61у А1а Уа1 Туг Ьуз 61у Зег Ьеи Азр 61и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Авп Агд 61п Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп 61и Ьув Авп Не Туг Агд Ча1 Рго Ьеи МеЕ 61и Ηίβ Авр Авп
Й Л Г о г· п пег* Л 30
Не А1а Агд РЬе Не Уа1 61у Авр 61и Агд Уа1 ТЬг А1а Авр 61у Агд
260 265 270
МеЕ 61и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеЕ 61и Туг Туг Рго Азп 61у Зег Ьеи Сув
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи ΗΪ8 ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег Зег Сув Агд Ьеи
290 295 300
А1а Н13 Зег Уа1 ТЬг Агд 61у Ьеи А1а Туг Ьеи ΗΪ8 ТЬг 61и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд 61у Азр Н1в Туг Ьуз Рго А1а Не Зег Ηίβ Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьув Авп Азр 61у ТЬг Сув \7а1 Не Зег Азр РЬе
340 345 350
61у Ьеи Зег МеЕ Агд Ьеи ТЬг 61у Авп Агд Ьеи Ча1 Агд Рго 61у 61и
355 360 3 65
61и Азр Авп А1а А1а Не Зег 61и Уа1 61у ТЬг Не Агд Туг МеЕ А1а
370 375 380
Рго 61и Уа1 Ьеи 61и 61у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Сув 61и Зег А1а
385 390 395 400
Ьеи Ьуз 61п Уа1 Авр МеЕ Туг А1а Ьеи 61у Ьеи Не Туг Тгр 61и Не
405 410 415
РЬе МеЕ Агд Суз ТЬг Авр Ьеи РЬе Рго 61у 61и Зег Уа1 Рго 61и Туг
420 425 430
61п МеЕ А1а РЬе 61п ТЬг 61и Уа1 61у Авп ΗΪ8 Рго ТЬг РЬе 61и Авр
435 440 445
МеЕ 61п Уа1 Ьеи Уа1 Зег Агд 61и Ьуз 61п Агд Рго Ьув РЬе Рго 61и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз 61и Авп Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз 61и ТЬг Не
465 470 475 480
- 122 014525
01и Азр Суз Тгр Азр 485 01п Азр А1а О1и А1а Агд Ьеи ТЫ А1а 01п Суз
490 495
А1а С1и 01и Агд Мер А1а О1и Ьеи Мер Мер Не Тгр 01и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЬг Уа1 Азп Рго Мер Зег ТЬг А1а МеР О1п Азп 01и
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег НХЗ Азп Агд Агд Уа1 Рго Ьуз Ые 01у Рго Туг Рго
53 0 535 540
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг Не 01и Азр Зег Ые Н13 Н±з ТЬг Азр
545 550 555 560
Зег Не Уа1 Ьуз Азп Ые Зег Зег О1и Н1з Зег Мер Зег Зег ТЬг Рго
565 570 575
Ьеи. ТЬг Ые 01у 01и Ьуз Азп Агд Азп Зег 11е Азп Туг 01и Агд О1п
580 585 590
01п А1а 01п А1а Агд Не Рго Зег Рго О1и ТЬг Зег Уа1 ТЬг Зег Ьеи
595 600 605
Зег ТЬг Азп ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Азп ТЬг ТЬг 01у Ьеи ТЫ Рго Зег ТЬг
610 615 62 0
01у Мер ТЬг ТЬг Ые Зег 01и Мер Рго Туг Рго Азр 01и ТЬг Авп Ьеи
625 63 0 63 5 640
Н13 ТЬг ТЬг Азп Уа1 А1а 01п Зег 11е 01у Рго ТЬг Рго Уа1 Суз Ьеи
645 650 655
01п Ьеи ТЬг 01и 01и Азр Ьеи С1и ТЬг Азп Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз 01и
660 665 670
Уа1 Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз О1и Зег Зег Азр 01и Азп Ьеи Мер 01и ΗΪ3
675 680 685
Зег Ьеи Ьуз 01п РЬе Зег 01у Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег ТЫ Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи 11е Ьуз Ьеи А1а Уа1 01и А1а ТЫ 01у 01п
705 710 715 720
С1п Азр РЬе ТЫ С1п ТЬг А1а Азп 01у О1П А1а Суз Ьеи Ые Рго Азр
725 730 735
Уа1 Ьеи Рго ТЬг 01п Не Туг Рго Ьеи Рго Ьуз 01п О1п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго ТЬг Зег Ьеи Рго Ьеи Азп ТЬг Ьуз Азп Зег ТЬг Ьуз О1и
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз РЬе 01у Зег Ьуз Н13 Ьуз Зег Азп Ьеи Ьуз 01п Уа1
770 775 780
О1и ТЬг 01у Уа1 А1а Ьуз Мер Азп ТЬг Ые Азп А1а А1а О1и Рго Н1з
785 790 795 800
Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг МеР Азп О1у Уа1 А1а 01у Агд Азп ΗΪ3 Зег νηΐ
805 810 815
Азп Зег Н1з А1а А1а ТЬг ТЬг О1п Туг А1а Азп Агд ТЬг Уа1 Ьеи Зег
820 825 830
01у ΟΙ п ТЬг ТЬг Азп 11е Уа1 ТЬг ΗΪ3 Агд А1а С1п 01и Мер Ьеи 01п
835 840 845
Азп 01п РЬе Ые 01у 01 и Азр ТЬг Агд Ьеи Азп Ые Азп Зег Зег Рго
850 855 860
Азр 01и ΗΪ3 01и Рго Ьеи Ьеи Агд Агд О1и О1п 01п А1а 01у ΗΪ3 Азр
865 870 875 880
51и 01у Уа1 Ьеи Азр Агд Ьеи Уа1 Азр Агд Агд С1 и Агд Рго Ьеи О1и
885 890 895
С1у 01у Агд ТЬг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег 01и
900 905 910
01п Азр Уа1 Ьеи А1а 01п 01у Уа1 Рго Зег ТЬг А1а А1а Азр Рго 01у
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд А1а 01п Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
- 123 014525
930 935 940
А1а ТЬг Азп Уа1 Ьеи Азр О1у Зег Зег 11е О1п Не О1у С1и Зег ТЬг
945 950 955 960
О1п Азр 01у Ьуз Зег (31у Зег С1у <31и Ьуз Не Ьуз Ьуз Агд Уа1 Ьуз
965 970 975
ТЬг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег ТЬг Тгр Уа1 Не Зег
980 985 990
ТЬг С1и Зег Ьеи Азр Суз 01и Уа1 Азп Азп Азп <31у Зег Азп Агд А1а
995 1000 1005
Уа1 Нхз Зег Ьуз Зег Зег ТЬг А1а Уа1 Туг Ьеи А1а О1и <31у С1у ТЬг
1010 1015 1020
А1а ТЬг ТЬг МеЕ Уа1 Зег Ьуз Азр 11е С1у МеЕ Азп Суз Ьеи
1025 1030 1035 <2Ю> 116 <211> 2932 <212> ΟΝΑ <213> Ното зархепз <400> 116 дсЕссдсдсс дадддсЕдда ддаЕдсдЕЕс ссЕддддЕсс ддасЕЕаЕда аааЕаЕдсаЕ 60 садЕЕЕааЕа сЕдЕсЕЕдда аЕЕсаЕдада ЕддаадсаЕа ддЕсааадсЕ дЕЕЕддадаа 120 ааЕсадаадЕ асадЕЕЕЕаЕ сЕадссасаЕ сЕЕддаддад ЕсдЕаадааа дсадЕдддад 180 ЕЕдаадЕсаЕ ЕдЕсаадЕдс ЕЕдсдаЕсЕЕ ЕЕасаадааа аЕсЕсасЕда аЕдаЕадЕса 240 ЕЕЕаааЕЕдд ЕдаадЕадса адассааЕЕа ЕЕаааддЕда садЕасасад дааасаЕЕас 300 ааЕЕдаасаа ЕдасЕсадсЕ аЕасаЕЕЕас аЕсадаЕЕаЕ ЕдддадссЕа ЕЕЕдЕЕсаЕс 360 аЕЕЕсЕсдЕд ЕЕсааддаса дааЕсЕддаЕ адЕаЕдсЕЕс аЕддсасЕдд даЕдаааЕса 420 дасЕссдасс адааааадЕс адааааЕдда дЕаассЕЕад сассададда ЕассЕЕдссЕ 480 ЕЕЕЕЕааадЕ дсЕаЕЕдсЕс адддсасЕдЕ ссадаЕдаЕд сЕаЕЕааЕаа сасаЕдсаЕа 540 асЕааЕддас аЕЕдсЕЕЕдс саЕсаЕадаа даадаЕдасс адддадааас сасаЕЕадсЕ 600 ЕсадддЕдЕа ЕдаааЕаЕда аддаЕсЕдаЕ ЕЕЕсадЕдса аадаЕЕсЕсс аааадсссад 660 сЕасдссдда сааЕадааЕд ЕЕдЕсддасс ааЕЕЕаЕдЕа ассадЕаЕЕЕ дсаасссаса 720 сЕдсссссЕд ЕЕдЕсаЕадд ЕссдЕЕЕЕЕЕ даЕддсадса ЕЕсдаЕддсЕ ддЕЕЕЕдсЕс 780 аЕЕЕсЕаЕдд сЕдЕсЕдсаЕ ааЕЕдсЕаЕд аЕсаЕсЕЕсЕ ссадсЕдсЕЕ ЕЕдЕЕасааа 840 саЕЕаЕЕдса ададсаЕсЕс аадсадасдЕ сдЕЕасааЕс дЕдаЕЕЕдда асаддаЕдаа 900 дсаЕЕЕаЕЕс садЕЕддада аЕсасЕаааа дассЕЕаЕЕд ассадЕсаса аадЕЕсЕддЕ 960 адЕдддЕсЕд дасЕассЕЕЕ аЕЕддЕЕсад сдаасЕаЕЕд ссааасадаЕ ЕсадаЕддЕс 1020 сддсаадЕЕд дЕаааддссд аЕаЕддадаа дЕаЕддаЕдд дсаааЕддсд Еддсдааааа 1080 дЕддсддЕда аадЕаЕЕсЕЕ ЕассасЕдаа даадссадсЕ ддЕЕЕсдада аасадаааЕс 1140 ЕассааасЕд ЕдсЕааЕдсд ссаЕдаааас аЕасЕЕддЕЕ ЕсаЕадсддс адасаЕЕааа 1200 ддЕасаддЕЕ ссЕддасЕса дсЕсЕаЕЕЕд аЕЕасЕдаЕЕ ассаЕдаааа ЕддаЕсЕсЕс 1260 ЕаЕдасЕЕсс ЕдаааЕдЕдс ЕасасЕддас ассададссс ЕдсЕЕаааЕЕ ддсЕЕаЕЕса 1320 дсЕдссЕдЕд дЕсЕдЕдсса ссЕдсасаса даааЕЕЕаЕд дсасссаадд ааадсссдса 1380 аЕЕдсЕсаЕс дадассЕааа дадсааааас аЕссЕсаЕса адаааааЕдд дадЕЕдсЕдс 1440 аЕЕдсЕдасс ЕдддссЕЕдс ЕдЕЕаааЕЕс аасадЕдаса саааЕдаадЕ ЕдаЕдЕдссс 1500 ЕЕдааЕасса дддЕдддсас сааасдсЕас аЕддсЕсссд аадЕдсЕдда сдааадссЕд 1560 аасааааасс асЕЕссадсс сЕасаЕсаЕд дсЕдасаЕсЕ асадсЕЕсдд ссЕааЕсаЕЕ 1620 ЕдддадаЕдд сЕсдЕсдЕЕд ЕаЕсасадда дддаЕсдЕдд аадааЕасса аЕЕдссаЕаЕ 1680 ЕасаасаЕдд ЕассдадЕда ЕссдЕсаЕас даадаЕаЕдс дЕдаддЕЕдЕ дЕдЕдЕсааа 1740 сдЕЕЕдсддс сааЕЕдЕдЕс ЕааЕсддЕдд аасадЕдаЕд ааЕдЕсЕасд адсадЕЕЕЕд 1800 аадсЕааЕдЕ садааЕдсЕд ддсссасааЕ ссадссЕсса дасЕсасадс аЕЕдадааЕЕ 1860 аадаадасдс ЕЕдссаадаЕ ддЕЕдааЕсс саадаЕдЕаа аааЕсЕдаЕд дЕЕааассаЕ 1920 сддаддадаа асЕсЕадасЕ дсаадаасЕд ЕЕЕЕЕассса ЕддсаЕдддЕ ддааЕЕадад 1980 ЕддааЕаадд аЕдЕЕаасЕЕ ддЕЕсЕсада сЕсЕЕЕсЕЕс асЕасдЕдЕЕ сасаддсЕдс 2040 ЕааЕаЕЕааа ссЕЕЕсадЕа сЕсЕЕаЕЕад даЕасаадсЕ дддаасЕЕсЕ ааасасЕЕса 2100 ЕЕсЕЕЕаЕаЕ аЕддасадсЕ ЕЕаЕЕЕЕааа ЕдЕддЕЕЕЕЕ даЕдссЕЕЕЕ ЕЕЕаадЕддд 2160 ЕЕЕЕЕаЕдаа сЕдсаЕсаад асЕЕсааЕсс ЕдаЕЕадЕдЕ сЕссадЕсаа дсЕсЕдддЕа 2220
- 124 014525 скдааккдсс кдкксакааа асддкдсккк скдкдааадс сккаадаада кааакдадсд2280 садсададак ддадааакад аскккдсскк ккасскдада сакксадккс дкккдкаккс2340 касскккдка ааасадсска кадакдакда кдкдкккддд акаскдскка ккккакдака2400 дкккдксскд кдкссккадк дакдкдкдкд кдкскссакд сасакдсасд ссдддакксс2460 кскдскдсса кккдааккад аадаааакаа кккакакдса кдсасаддаа дакаккддкд2520 дссддкддкк ккдкдсккка аааакдсаак акскдаосаа дакксдссаа ксксакасаа2580 дссакккаск ккдсаадкда дакадскксс ссассадскк каккккккаа сакдааадск2640 дакдссаадд ссаааадаад кккааадсак скдкаааккк ддаскдкккк сскксаасса2700 ссаккккккк кдкддккакк акккккдкса сддааадсак сскскссааа дккддадскк2760 скаккдссак даассакдск касааадааа дсасккскка ккдаадкдаа кксскдсакк2820 кдакадсаак дкаадкдсск акаассакдк кскакаккск ккакксксад каасккккаа2880 аадддаадкк акккакаккк кдкдкакаак дкдскккакк кдсаааксас со2932 <210> 117 <211> 1575 <212> ϋΝΑ <213> Ното заркепз <400> 117 дсаааскксс ааададдакд сассассакк асдакдакад дааддсксад кдскдсасад аасададакк кдкадкккдс ассадасскс кссскдадад скддкссааа какддддаад ассасададд сакдааааса ккдкасскаа ассскадасд ккасасасад адкаааааса дккаааккка ааасдскака касаксакдд дкаксаддад сссксккакд аассддкдда дсксасаакс ксададкссс ссаасаддка ккдакаасак дкдададкас дкссадаада аададдакда акккксадкд аааддаасда ккдккдакдд ксккддксск дакасадсак асккааккда ддаскакадс кккддакддд аадссадскд ккккдддккк ксасадаска скаааксаак ааакскккад ккокддкдаа ккадкдакас кдсскссада скдасакдка дкакадкдда аддасакдад дсадкдакда скдсаксаад аддасаккаа ссскк дсккккдсда адсссссасс сксадксаас скскдддккд ксдддасаск акдкаакааа асскакасас каксакакка кдддккадаа дсадксксад каадсадакк ааадкддсдк дкксададад саккдскдса ксакдаааак дскдаадкка касксааддс дааааакдда ааакдаадкк адкдккддас кадккккддс адаакассад ддадаккдкд дкдкскаадд дскдасадсс аскскдакад адкдсаддаа ссссдкссаа аакакккдса сскдкддкса сссакксскс дасскасасс сасадддскк ккккдккаск саддакдааа адсксаддаа садакддкда ддсдаааадд асадааакак дакаксааад ддкксссккк дсскаскскк ааассадсаа асккдскдка дасакассас дададсккда сксаксоккк сккссккакс кдсаксаада садакдддаа скдсдддкка дададдаааа ааккааакдк аддксккдсд дсасадасдд сккскддккд аксааадаад скасаскдсс касккакакс кссддкакаа сккасакксс дкддаксадд аасадаккдд кадскдкдаа аксадасадк ддасадддкс акдаккакск скдксадкдд ккдсссаксд ккдскдасск скаасасксд асадааакса дддаддккдс акдасскадк адккасдссс аасксакдас адаааасаск дкаадсакск дддсассаад ккдкааакдс акаккдкккс сскаддаска аксааккдаа кссаккдааа кдкдаскдкс аадасаадаа ксскддадаа сскссскскд ааааддксдс адкдкксккс дккдакдадд скддасссад даадкссасс сккакдксак адакскдааа дддсскддск адккддсасс сккссадкск каддадакдк дсссадкдас сксаккссса адаакдскдд кдссааааку скдсадааад
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1575 <210> 118 <211> 2032 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз <400> 118 сдсддддсдс ддадксддсд дддссксдсд ддасдсдддс адкдсддада ссдсддсдск 60 даддасдсдд дадссдддад сдсасдсдсд дддкддадкк садсскаскс ккксккадак 120 дкдаааддаа аддаадакса ккксакдсск кдккдакааа ддкксадаск кскдскдакк 180 сакаассакк кддскскдад скакдасаад ададдаааса аааадккааа сккасаадсс 240
- 125 014525
ЕдссаЕаадЕ ааЕдЕдддса ЕЕдсдЕЕдЕа дасддаЕаЕЕ ддЕЕдссЕад адаадаЕсаа сЕдссЕссаЕ аЕаЕсЕдЕда ЕаЕаааадас аЕЕссЕссЕд ЕсаддссЕсс аЕЕддаааад дЕдааадЕдЕ л СасткдК Чета дддЕссЕдда ЕаЕсЕдаадЕ адЕддсЕЕаЕ саЕсдадаЕс дассЕдддсс асЕсдадЕЕд ааЕсасЕЕсс дЕЕдсЕадда сЕадЕдссса сдссссЕсаЕ аЕдасадааЕ асасЕЕдсса саЕсЕсЕдса ЕаадсаЕсса сЕЕЕсаддда ЕсЕдЕЕЕдЕа дадаадсааа ссаадааада ааЕдссасса дЕЕЕсасдаЕ дасЕадаадд ЕЕдааЕдсЕд Едааааасад сЕдЕсЕдЕ-ад аадааассад дадааЕсссЕ сЕсЕдсЕддЕ дЕсдсЕаЕдд ЕсЕЕсассас Тсгастсгся Есга — -1·;^--сссадЕЕдЕа ссассасссЕ дЕсаЕЕЕаса ЕдаааадЕаа ЕддсЕдЕЕаа дсассааасд адЕсЕЕасаЕ даЕдЕдЕаЕс дЕдассссЕс Есссааассд дсЕдддсЕса аааЕдЕсада дааадссаас садЕасаадс дсдассЕддд ддеддадааа сЕЕссЕЕдаЕ ддаЕддЕдад ссаЕЕдЕсса даЕадаадад сЕсадаЕЕЕЕ сасадааадд адаЕЕЕЕдЕЕ ЕЕЕдсЕсЕЕд ассЕсдаЕас дададасЕЕа ссаааддасЕ ддаадЕЕЕдд ададдаадсс ааасаЕЕЕЕд ссЕааЕсаса адасдсЕааа сасадаааЕс ааасаЕЕсЕд аЕЕЕаЕЕадЕ сЕаЕаЕдссЕ саЕддсЕдас аддаддЕаЕа ЕЕаЕдаддас дЕддадсадЕ сааЕссЕдса дЕсссаддас аддЕасЕсЕЕ сЕЕдаасаЕс сааадасада ссдЕЕдддЕа аасаЕдсЕЕЕ адЕасадссс даадасЕсад даЕдасЕсЕд садЕдЕсддд аасдааЕдЕа даЕддассЕа дЕссЕЕаЕса адсаЕЕдддЕ аЕЕдадсадЕ аЕадсЕаадс аЕдддааадЕ адсЕддЕЕса сгстЕЕЕсяЕЕсг -2—1---------дасЕаЕсаЕд ЕсааЕдсЕда ЕЕЕадЕасЕс дЕдаадаааа даЕасаааЕд ссадаадЕдЕ аЕдЕаЕадЕЕ дЕддаадааЕ аЕдадддада даЕдадЕдЕс ЕсааддсЕда аЕЕааасЕсЕ сЕдЕЕЕдЕдд дЕссЕдсЕЕс даадсЕссса асЕЕдЕЕсаа
ЕдсдаадЕдс ссассссссд ЕсаасааЕаЕ ддЕЕдссЕдЕ асасЕсссаЕ аЕааадассЕ Еасассасад ЕаЕЕаЕЕЕЕд Еадаасадда сЕсададсЕс адаЕЕсадаЕ ддсдЕддсда дададасада сЕдсадаЕаЕ ааааЕддЕЕс адЕЕадссЕа ааддсааасе аЕддаасЕЕд аадЕЕдасаЕ Еддасдадад ЕЕддссЕсаЕ ассадсЕЕсс ЕЕдЕдЕдсаЕ ЕааддсадаЕ садсссЕдсд даЕаддадад дсададсааа ссадЕдддЕЕ дааддадада даЕаЕдаЕдс аддааааЕЕа 300 ЕссаааддЕс 360 ЕЕдсадсаса 420 ддЕсасЕЕсЕ 480 ЕссЕсаЕсаа 540 асасссЕаса 600 ддсЕЕЕасЕЕ 660 ЕЕасЕЕСсдд 720 ЕдааасЕЕас 780 аддаадЕдда 840 ддЕдааасад 900 аааддЕадсЕ 960 ааЕаЕаЕсад 1020 1080 ссЕЕЕаЕдаЕ 1140 сЕсЕЕсЕдЕс 1200 адсааЕЕдсс 1260 сЕдЕаЕЕдсЕ 1320 ассассЕаас 1380 сЕЕдаасада 1440 ссЕЕЕдддад 1500 ЕЕаЕсаЕдас 1560 саадаадЕЕа 1620 дддаааасЕс 1680 ддЕЕаадааа 1740 даааадЕаад 1800 адасаЕсааа 1860 садассЕсас 1920 ЕЕдаЕссдЕд 1980 аЕ 2032 <210> 119 <211> 3167 <212> ΏΝΑ <213> КаЕЕиз зр.
<400> 119 дааЕЕсаЕда ЕсЕадссаса ЕЕЕдЕЕсЕЕс ассадЕааЕе асЕЕасаЕса сЕадаЕадЕа ааЕддадЕда сасЕдсссад аЕадаадаад ЕсЕдаЕЕЕЕс еддассааЕЕ ЕЕсЕЕЕдаЕд дссаЕдаЕсд ададдЕсдЕЕ сЕдааадасс дЕЕсадсдаа ддадаадЕаЕ асЕдаадаад дааааЕаЕас ЕаЕЕЕдаЕЕа даЕддаааса ЕсЕсЕдадаа ЕдЕааддааа ааддЕддссс даЕЕасЕддд ЕдсЕссаЕдд сдЕЕадсасс аЕдасдсЕаЕ аЕдаЕсаддд ааЕдсаадда ЕдЕдсаасса де аде дЕ с ед ЕсЕЕсЕссад асаассдЕда ЕдаЕЕдасса сЕаЕЕдссаа ддаЕдддЕаа сЕадсЕддЕЕ ЕЕддЕЕЕЕаЕ сЕдаЕЕасса
ЕаддЕсааад дЕсЕдаадаа ссЕсдЕЕсад ддасаддаса адссЕдЕсЕд ЕасЕддЕаЕд ададдасасс ЕааЕаасаса адааассасд ЕЕсассаааа аЕаЕЕЕдсад аЕддсЕддсЕ сЕдсЕЕсЕдЕ сЕЕддаасад дЕсасааадс асадаЕЕсад аЕддсдЕддЕ Еададаааса адсЕдсадас ЕдадааЕддд сЕдЕЕЕддад адсадсаддЕ ЕааддссдЕЕ сдЕдсдааЕЕ ЕЕсаЕсаЕЕЕ аааЕсадасд ЕЕассЕЕЕсЕ ЕдсаЕаасЕа ЕЕаасЕЕсЕд дсссадсЕас ссЕасасЕдс дЕдсЕсаЕсЕ ЕасааасаЕЕ даЕдаадсаЕ ЕсЕддЕадЕд аЕддЕЕсддс дааааадЕдд даааЕсЕасс аЕЕаааддса ЕсЕсЕсЕаЕд аааЕЕддаас дааадЕсаЕЕ ЕасЕЕсадЕд ддасааЕдас сЕсаЕдЕЕса Еддассадаа ЕааааЕдсЕа аЕддссаЕЕд ддЕдЕаЕдаа дсаддасааЕ ссссЕдЕсдЕ сЕаЕддсЕдЕ асЕдЕаадад ЕЕаЕЕссадЕ даЕсЕддаЕЕ аддЕЕддЕаа сЕдЕсааадЕ адаеддЕдЕЕ ссддЕЕссЕд асЕЕссЕдаа
ЕасадЕЕЕЕа дЕсаадЕдаЕ ааасадсадд ЕсадсЕаЕас адддсадааЕ даадссддаа ЕЕдсЕсадда сЕЕЕдссаЕЕ дЕаЕдааддс адааЕдЕЕдЕ ЕаЕаддссса сЕдЕаЕЕдЕс ЕаЕсЕсаадс аддадааЕса ассЕЕЕаЕЕд аддссддЕаЕ аЕЕЕЕЕЕасс ааЕдсдЕсаЕ дасЕсадсЕд аЕдЕдссасс
120
180
240
300
360 420 480 540
600
660
720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200
- 126 014525 сЕддасасса сасасадааа ааааасаЕсс аааЕЕсааса сддЕасаЕдд аЕсаЕддсЕд асаддаддаа ЕсЕЕаЕдаад сдсЕддааса саЕааЕссад дааЕсссадд ЕЕсасссдад сЕссЕсЕаса ЕЕддадсЕЕс ЕаааЕдЕддд аЕаадаадЕс ЕдЕдааадсс сЕасададаа ЕдддаЕдсЕд сЕдсЕдссаЕ адЕддЕЕЕаа ЕдЕаасЕдаа сЕаЕдЕаЕаа ЕЕЕддЕааЕЕ ассаЕасЕЕЕ ЕдсаЕассЕс дЕдЕаЕсаЕд ЕЕЕассЕаса ддаааЕдаЕЕ сасЕаасасЕ аЕдасЕаЕаа ЕсссЕаасЕЕ ЕЕаЕЕаааЕа дадсссЕасЕ ЕЕЕаЕддсас ЕЕаЕЕаадаа дЕдасасааа сЕссадаадЕ асаЕсЕасад ЕсдЕддадда асаЕдсдЕда дЕдаЕдааЕд саЕссадасЕ аЕдЕааадаЕ даадддЕдда ЕсЕЕсасадд адасаЕадда сЕЕЕЕдаЕдс ЕсЕддЕсааа ЕЕааддаааЕ ааЕаЕсЕдЕс ссЕддЕЕдаЕ дддсЕЕасаа аЕаЕдсааЕа дЕаасЕЕсЕс адЕдЕссаЕа аЕЕЕЕЕдЕЕа дааадаааЕд ЕдаЕсаааЕЕ ЕдЕадЕдЕдс ЕасЕсаЕЕсЕ ЕааадЕадад ЕЕасЕаадаЕ аЕдЕаЕсЕЕа дЕдаадасаа ааааааЕдЕа саадЕЕадсЕ дсааддсаад аааЕддЕадЕ ЕдаадЕЕдас дсЕддасдад сЕЕЕддЕЕЕд аЕаЕсааЕЕа ддЕсдЕдЕдЕ ЕсЕЕсдадсс сасадсЕЕЕд ЕЕдасаааса дЕЕадсаЕдд сЕдсЕаасад сЕЕсадасаЕ сЕЕЕЕЕддЕЕ сЕсЕддЕЕас ЕадЕдадсЕс ЕдЕдЕЕсЕдЕ даЕддЕдсаЕ дасаадааЕд ЕсЕааЕсдас ЕассаасЕЕЕ дасЕсдаасЕ ЕаЕааЕЕссЕ ссЕсЕЕссЕд сЕддадЕсЕЕ ЕЕЕЕаЕЕЕЕс дЕасааааса сЕдЕдЕасда аЕЕдЕсЕсаЕ дсЕаЕсЕааа ададдсадаа ЕаЕЕЕЕаааа
ЕаЕЕсЕдсЕд ссЕдсааЕЕд ЕдсЕдЕаЕЕд аЕасссЕЕда адссЕдадЕа аЕсаЕЕЕддд ссаЕаЕЕаса дЕдааасдсЕ дЕЕЕЕдаадс адааЕсаада дЕЕЕЕдадаа асЕаддаЕдЕ ЕааасЕЕЕса дсЕдЕЕсЕЕЕ ЕЕЕаЕдааЕЕ ЕсасЕаЕссЕ адсададаЕд сЕсЕдЕааас саЕдссЕсЕд ЕдааддЕЕдс аЕЕсдссааЕ аЕЕЕЕЕадса дЕЕЕЕссЕсс ссЕаЕссада дадЕсЕдссЕ ЕдЕЕсЕсддЕ ааааЕсЕЕса дсЕсасЕсдд аЕЕЕсадааЕ аЕсЕЕЕЕаЕд ЕсЕЕЕЕдааа дЕасссадЕс а з а а. з а в. з з а.
ссЕдЕддЕсЕ сЕсаЕсдада сЕдассЕддд асассадддЕ аааассаЕЕЕ адаЕддсссд асаЕддЕдсс ЕдсддссааЕ ЕдаЕдЕсада адасдсЕсдс адааЕЕЕада сддсЕЕддЕЕ ддасЕсЕдса дсдЕаЕддас дсаЕсаадас дЕссаЕааад дадаааддса адссЕддасЕ аЕаЕдсаЕас асаддасддЕ сЕсаЕаааад ЕааЕадЕЕдЕ адЕсассаЕЕ аЕЕддсдсЕс ЕасЕдсаЕсЕ ассЕсЕЕааа ЕадссЕЕЕаЕ ЕсЕсасддсЕ ЕсаЕдЕаЕЕЕ аддаЕдЕсад ЕЕЕддЕЕЕЕа ЕассасаЕЕЕ ааааааа дЕдссассЕс 1260 ссЕдаададс 1320 ссЕадсЕдЕЕ 1380 дддсассадд 1440 ссадсссЕас 1500 ЕсдсЕдЕаЕЕ 1560 ЕадЕдассса 1620 сдЕсЕсЕаас 1680 аЕдсЕдддсс 1740 ааадаЕддЕЕ 1800 сЕдсаадааа 1860 ЕссадасЕсЕ 1920 дааЕдсаддд 1980 адсЕЕЕдЕЕЕ 2040 ЕссааЕссЕд 2100 ЕддЕдсЕЕЕс 2160 ЕаЕЕЕдсссЕ 2220 аЕдаЕсЕсЕЕ 2280 садасЕЕссЕ 2340 аЕЕЕдЕддсс 2400 ссаЕсЕассЕ 2460 аааддссааа 2520 ЕЕдЕЕЕЕссЕ 2580 асЕдЕсЕЕда 2640 даЕсассаЕд 2700 аадддаааЕЕ 2760 ЕсЕадссаЕЕ 2820 даЕссЕсадЕ 2880 ааааасЕЕса 2940 сЕдаЕЕЕЕса 3000 ЕааЕЕЕсЕдд 3060 асасЕдЕаса 3120 3167 <210> 120 <211> 3167 <212> ϋΝΆ <213 > КаЕЕиз пог’хедбсиз <400> 120 дааЕЕсаЕда ЕсЕадссаса ЕЕЕдЕЕсЕЕс ассадЕааЕс асЕЕасаЕса сЕадаЕадЕа ааЕддадЕда сасЕдсссад аЕадаадаад ЕсЕдаЕЕЕЕс сддассааЕЕ ЕЕсЕЕЕдаЕд дссаЕдаЕсд ададдЕсдЕЕ сЕдааадасс дЕЕсадсдаа ддадаадЕаЕ даЕддаааса ЕсЕсЕдадаа ЕдЕааддааа ааддЕддссс даЕЕасЕддд ЕдсЕссаЕдд сдЕЕадсасс аЕдасдсЕаЕ аЕдаЕсаддд ааЕдсаадда ЕдЕдсаасса дсадсдЕссд ЕсЕЕсЕссад асаассдЕда ЕдаЕЕдасса сЕаЕЕдссаа ддаЕдддЕаа
ЕаддЕсааад дЕсЕдаадаа ссЕсдЕЕсад ддасаддаса адссЕдЕсЕд ЕасЕддЕаЕд ададдасасс ЕааЕаасаса адааассасд ЕЕсассаааа аЕаЕЕЕдсад аЕддсЕддсЕ сЕдсЕЕсЕдЕ сЕЕддаасад дЕсасааадс асадаЕЕсад аЕддсдЕддЕ сЕдЕЕЕддад адсадсаддЕ ЕааддссдЕЕ сдЕдсдааЕЕ ЕЕсаЕсаЕЕЕ аааЕсадасд ЕЕассЕЕЕсЕ ЕдсаЕаасЕа ЕЕаасЕЕсЕд дсссадсЕас ссЕасасЕдс дЕдсЕсаЕсЕ ЕасааасаЕЕ даЕдаадсаЕ ЕсЕддЕадЕд аЕддЕЕсддс дааааадЕдд аааЕЕддаас дааадЕсаЕЕ ЕасЕЕсадЕд ддасааЕдас сЕсаЕдЕЕса Еддассадаа ЕааааЕдсЕа аЕддссаЕЕд ддЕдЕаЕдаа дсаддасааЕ ссссЕдЕсдЕ сЕаЕддсЕдЕ асЕдЕаадад ЕЕаЕЕссадЕ даЕсЕддаЕЕ аддЕЕддЕаа сЕдЕсааадЕ
ЕасадЕЕЕЕа дЕсаадЕдаЕ ааасадсадд ЕсадсЕаЕас адддсадааЕ даадссддаа ЕЕдсЕсадда сЕЕЕдссаЕЕ дЕаЕдааддс адааЕдЕЕдЕ ЕаЕаддссса сЕдЕаЕЕдЕс ЕаЕсЕсаадс аддадааЕса ассЕЕЕаЕЕд аддссддЕаЕ аЕЕЕЕЕЕасс
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
- 127 014525 аскдаадаад даааакакас какккдакка скддасасса сасасадааа ааааасаксс ааакксааса сддкасакдд аксакддскд асаддаддаа ксккакдаад сдскддааса сакаакссад дааксссадд кксасссдад сксскскаса ккддадсккс кааакдкддд акаадаадкс кдкдааадсс скасададаа кдддакдскд скдскдссак адкддкккаа кдкааскдаа скакдкакаа кккддкаакк ассакасккк кдсакасскс дкдкаксакд кккасскаса ддааакдакк саскаасаск акдаскакаа кссскааскк ккаккааака скадскддкк ккддккккак скдаккасса дадссскаск кккакддсас ккаккаадаа дкдасасааа скссадаадк асакскасад ксдкддадда асакдсдкда дкдакдаакд сакссадаск акдкааадак даадддкдда кскксасадд адасакадда сккккдакдс кскддксааа ккааддааак аакакскдкс сскддккдак дддсккасаа акакдсаака дкаасккскс адкдкссака акккккдкка дааадааакд кдаксааакк кдкадкдкдс касксаккск кааадкадад ккаскаадак акдкакскка дкдаадасаа аааааакдка кададаааса адскдсадас кдадаакддд саадккадск дсааддсаад ааакддкадк кдаадккдас дскддасдад скккддкккд акаксаакка ддксдкдкдк кскксдадсс сасадскккд ккдасаааса дккадсакдд скдскаасад скксадасак скккккддкк скскддккас кадкдадск с кдкдккскдк дакддкдсак дасаадаакд кскааксдас кассаасккк дасксдааск какаакксск сскскксскд скддадкскк ккккаккккс дкасааааса скдкдкасда аккдксксак дскакскааа ададдсадаа каккккаааа дааакскасс аккаааддса кскскскакд каккскдскд сскдсааккд кдскдкаккд акасссккда адсскдадка аксакккддд ссакаккаса дкдааасдск дккккдаадс адааксаада дккккдадаа аскаддакдк каааскккса дскдкксккк кккакдаакк ксаскаксск адсададакд скскдкааас сакдсскскд кдааддккдс акксдссаак акккккадса дккккссксс сскакссада дадкскдсск кдкксксддк ааааксккса дсксасксдд аккксадаак аксккккакд ксккккдааа дкасссадкс аааааааааа адасддкдкк ссддкксскд аскксскдаа сскдкддкск сксаксдада скдасскддд асассадддк аааассаккк адакддсссд асакддкдсс кдсддссаак кдакдксада адасдсксдс адаакккада сддсккддкк ддаскскдса дсдкакддас дсаксаадас дкссакааад дадаааддса адсскддаск акакдсакас асаддасддк сксакаааад каакадккдк адксассакк аккддсдскс каскдсакск ассксккааа кадсскккак ксксасддск ксакдкаккк аддакдксад кккддкккка кассасаккк ааааааа аакдсдксак 1080 дасксадскд 1140 акдкдссасс 1200 дкдссасскс 1260 сскдаададс 1320 сскадскдкк 1380 дддсассадд 1440 ссадссскас 1500 ксдскдкакк 1560 кадкдассса 1620 сдкскскаас 1680 акдскдддсс 1740 ааадакддкк 1800 скдсаадааа 1860 кссадаскск 1920 даакдсаддд 1980 адскккдккк 2040 кссааксскд 2100 кддкдскккс 2160 какккдссск 2220 акдакскскк 2280 садаскксск 2340 акккдкддсс 2400 ссакскасск 2460 аааддссааа 2520 ккдкккксск 2580 аскдксккда 2640 даксассакд 2700 аадддааакк 2760 кскадссакк 2820 дакссксадк 2880 ааааасккса 2940 скдаккккса 3000 каакккскдд 3060 асаскдкаса 3120 3167 <210> 121 .
<211> 3003 <212> ΏΝΑ <213> Каккиа погуедхсиа <400> 121
и. и слу и-схо. саддасасдк скдкскдккс кддкакдааа ддасасскка каасасакдс аассасдкка ассаааадсс кккдсадсск дскддскдкд сккскдккас ддаасаддак асааадскск дакксадакд с 5 дсдааккдда аксакккскс ксадасдкдд ссккксккаа акааскаакд асккскдддк садскасдса асаскдсссс сксакскска ааасаккаск даадсаккка ддкадкддак дкксддсадд +- ♦- Ζ4 «я /-+4- /-г·^ 'у
и. и-’-.длу иуисаи саакдаскса акдкксаадд ассадаадаа аакдскаккд дссаккдскк дкакдаадка ддасаакада скдксдккак кддскдкскд дкаададкак ккссадкадд скддаккасс ккддкааадд , ЛЧ “1 —ι
(.аучаауачч дскакасаск дсадаакска дссддаааак сксаддасас кдссаккака кдааддскск акдккдксдд аддсссаккс каккдксдсс сксаадсада адааксаскд кккаккддкк ссддкакдда касаксадак дакадкакдс ддадкдасдк кдсссадакд даадаадакд дакккксаак ассаакккдк кккдакддса акдаксдкск ддксдккаса ааадасскда садсдааска даадкакдда дкддсссдда каскдддадс кссакддкас кадсассада асдскаккаа аксадддада дсааддаккс дсаассаака дсдкссдакд кскссадскд ассдкдаскк ккдассадкс ккдссаааса кдддкааакд
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
- 128 014525 дСдЬддЬдаа адааасадаа ЕдсадасаЕЕ дааЕдддЕсЕ дЕЕадсЕЕаЕ аддсаадссЕ ЕддЕадЕЕдс адЕЕдасаЕа ддасдададс ЬддЕЕЕдаЕс ЕсааЕЕасса сдЬдЕдЕдЕд ЕсдадссдЕЕ адсЕЕЕдада асааасадЕЕ адсаЕддасЕ сЕаасадЕаа садасаЕдсЕ ЕЕЕддЕЕЕЕЕ ЬддЕЕасЕса ЕдадсЕсадс дЕЕсЬдЕсЕс ддЕдсаЕсаЕ аадааЕдЕда ааЕсдасаЕЕ саасЕЕЕаЕЕ ЕсдаасЕдЕЕ ааЕЕссЕссЕ сОЕссЕддад дадЕсЕЕЕдЕ ЕаЕЕЕЕсааа саааасадсЕ ЕдЕасдааЕЕ дЕсЕсаЕаЕс аЕсЕаааЕсЕ ддсадаадЕа ЕСЕ ааадЕддсЕд аЕсЕассада аааддсассд сЕсЕаЕдасЕ ЕсЕдсЕдссЕ дсааЕЕдсЕс ЕдЕаЕЕдсЕд сссЕЕдааса сЕдадЕаааа аЕЕЕдддада ЕаЕЕасааса ааасдсЕЕдс ЕЕдаадсЕда аЕсаадаада ЕЕдадааада аддаЕдЕсдд асЕЕЕсадда дЕЕсЕЕЕдсд аЕдааЕЕдса сЕаЕссЕдЕс ададаЕддад ЕдЕааасадс дссЕсЕдаЕа аддЕЕдсаса сдссааЕсЕс ЕЕЕадсаЕаа ЕЕссЕссадЕ аЕссадааЕЕ ЕсЕдссЕЕас ЕсЕсддЕасс аЕсЕЕсаЕад сасЕсддЕсЕ ЕсадааЕЕса ЕЕЕЕаЕдадд ЕЕЕдаааЕЕЕ сссадЕсЕас
ЕсааадЕаЕЕ сддЕдЕЕааЕ дЕЕссЕддас ЕссЕдаааЕд дЕддЕсЕдЕд аЕсдадассЕ ассЕдддссЕ ссадддЕддд ассаЕЕЕсса СддсссдЕсд ЕддЕдссЕад ддссааЕсдЕ ЕдЕсадааЕд сдсЕсдсааа аЕЕЕадасЕд сЕЕддЕЕЕсс сЕсЕдсадаа ЕаЕддасадс ЕсаадасЕсс саЕааадЕдд аааддсаЕаЕ сЕддасЕаЕд ЕдсаЕассад ддасддЕаЕЕ аЕаааадсса ЕадЕЕдЕааа сассаЕЕЕЕд ддсдсЕсасЕ ЕдсаЕсЕдаЕ ЕсЕЕааааад ссЕЕЕаЕЕсЕ сасддсЕдаЕ ЕдЕаЕЕЕааа аЕдЕсадсЕд ддЕЕЕЕаЕаа сасаЕЕЕаса
ЕЕЕЕассасЕ дсдЕсаЕдаа ЕсадсЕдЕаЕ ЕдссасссЕд ссассЕссас даададсааа адсЕдЕЕааа сассаддсдд дсссЕасаЕс сЕдЕаЕЕаса ЕдасссаЕсЕ сЕсЕаассдс сЕдддсссаЕ даЕддЕЕдаа саадаааЕЕс адасЕсЕсЕс ЕдсадддЕЕд ЕЕЕдЕЕЕЕаа ааЕссЕдаЕа ЕдсЕЕЕсЕдЕ ЕЕдсссЕсЕа аЕсЕсЕЕЕдд асЕЕссЕсЕд ЕдЕддссадЕ ЕсЕассЕЕдЕ ддссааасЕа ЕЕЕЕссЕЕЕЕ дЕсЕЕдаасс сассаЕдЕдс ддаааЕЕдЕд адссаЕЕЕЕЕ ссЕсадЕдда аасЕЕсасас аЕЕЕЕсааЕд ЕЕЕсЕддЕсс сЕдЕасаЕЕа даадаадсЕа ааЕаЕасЕЕд ЕЕдаЕЕасЕд дасассадад асадаааЕЕЕ аасаЕссЕЕа ЕЕсаасадЕд ЕасаЕддсЕс аЕддсЕдаса ддаддааЕсд ЕаЕдаадаса ЕддаасадЕд ааЕссадсаЕ ЕсссаддаЕд асссдаддаа сЕсЕасаЕсЕ дадсЕЕсада аЕдЕдддсЕЕ адаадЕсЕсЕ дааадссЕЕа сададааааЕ даЕдсЕдссЕ сЕдссаЕддд ддЕЕЕаааЕа аасЕдаадЕа ЕдЕаЕааадЕ ддЕааЕЕаЕЕ аЕасЕЕЕдаа аЕассесЕда ЕаЕсаЕдЕдЕ ассЕасаЕас ааЕдаЕЕЕаа ЕаасасЕЕЕа асЕаЕаааЕд сЕаасЕЕдЕд ЕЕаааЕаааа дсЕддЕЕьад дЕЕЕЕаЕадо аЕЕассаЕда сссЕасЕсаа аЕддсасдса ЕЕаадааааа асасаааЕда садаадЕдсЕ ЕсЕасадсЕЕ ЕддаддааЕа ЕдсдЕдаддЕ аЕдааЕдЕсЕ ссадасЕсас ЕааадаЕЕЕд дддЕддадЕЕ ЕсасаддсЕд саЕаддасЕЕ ЕЕдаЕдссЕЕ ддЕсааасЕс аддаааЕЕад аЕсЕдЕсЕдЕ ддЕЕдаЕдаЕ сЕЕасаадас ЕдсааЕаЕсЕ асЕЕсЕсЕас дЕссаЕадас ЕЕЕдЕЕаЕаЕ адаааЕдссЕ ЕсаааЕЕсЕд адЕдЕдсЕЕЕ ЕсаЕЕсЕдЕа адЕададсЕд сЕаадаЕаЕЕ ЕаЕсЕЕадсЕ аадасааада аааЕдЕаЕаЕ
900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3003 <210> 122 <211> 2063 <212> ЬЫА <213> Ното зархепз <400> 122 дааЕЕссддЕ ЕдаЕддЕдЕЕ ааЕЕЕсЕЕЕЕ сддсссЕддс ЕсдсадааЕс ддЕдададЕа ЕаЕддссЕЕЕ сасаЕЕддад ЕсааЕЕсада ЕЕЕасЕдада сдадаЕдада дссЕЕаЕдсЕ аасаЕдаЕдд даЕдаЕдаЕд ддЕдаЕддЕЕ сЕЕЕдсссЕс дддЕдсссЕд аадаасддсЕ дааЕсЕсЕса дддадаааЕс аЕссссаада аЕддаасаЕа аЕЕЕЕссасс сааЕааЕсаЕ ЕЕддаЕасад аддсадсадс дЕдаЕддЕда ЕЕЕдсаЕсЕЕ сЕдаЕЕсЕЕд дсЕассаЕдд аЕдЕдсдЕЕЕ ЕдааааЕддд ааааддддас дЕдЕсасЕаЕ ссдЕЕЬсЕдс ЕссЕдасаса ЕдсЕЕЕддса ааЕдЕЬдаса аЕссдаассс
ЕдаЕддЕдаЕ ссаЕЕсаЕда дсЕддсссад ассаЕссЕдс ааадаЕссдЕ асааЕаЕЕаЕ аЕаааЕсЕЕд даадааЬдЕд ЕдЕЕдЕадса асассасЕса ЕсадЕсЕсЕд ддадассдЕа ЕсЕсЕЕдаЕс даддаЕдаЕд асЕаадЕасЕ ддаЕдасЕЕс ЕддЕсадсас аЕсадсаада дсЕсдааадд Еаааасаадд ЕадЕаасЕас садаЕЕЕаЕд дЕссассЕса ЕаЕЕадсЕдЕ аасааддЕсЕ ЕадаЕааЕсЕ дЕдаЕдаЕда сЕЕаЕЕадЕд сЕсдсЕдсад ЕдсддсЕдсЕ ссЕЕдддаЕа ЕадсассЕдс аЕдЕЕддЕсЕ сасЕссЕссс ЕааЕдЕсаас ЕЕсаЕЕЕаас ЕЕЕдаЕадЕЕ ЕсасадЕаЕд дааасЕдЕЕд
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
- 129 014525 дадсЕдаЕЕд дЕЕдсЕдЕаа ЕасададЕдс дЕсасЕдсад ЕЕаЕдсаадЕ ЕсЕдЕЕасЕа ссЕдсааЕЕЕ ЕдЕдЕЕаЕЕа ддддаддаад дЕдсЕадаад ЕаЕдсЕсЕЕд дааЕссдЕас даддаЕаЕдс ааадааааЕа даЬдсададд аЕЕЕдддааа ааЕдаасдЕа асдЕдЕдааа ЕдааЕсдсЕд садсасЕдсЕ аддааЕдаас ЕЕЕааасаЕд дссдаддЕсд аадЕдЕЕЕЕс сЕЕЕдаЕдда аЕддасдсаЕ аЕЕЕаадЕсЕ даддасЕддс сссаЕсдада дЕдасЕЕЕдд аЕааЕдсадс дадсЕдЕдаа дасЕааЕсЕа сададЕас са аддЕЕсЕсдЕ дссЕддсадЕ сЕсддсЕЕас дааасаааЕс ддЕдадЕсаа асЕсссЕаЕЕ дасЕдЕдаад дЕЕЕассЕЕд ЕдЕсЕдЕдаа садаадаЕдЕ аЕаЕддадса сЕЕЕдсааас асаЕдасаас ддааЕаЕЕЕд ссасасаадЕ ЕЕаЕсЕЕсас ЕЕЕааасадс асЕдЕссаЕд саЕаадсдад сЕЕдадддас ЕЕдддадаЕа даЕддсЕЕЕЕ дЕсЕадддаа даддЕсасЕс ЕдсасадЕдЕ ЕдЕдадссса сасаадаЕдд сЕсЕЕаадсд ЕсаасааЕаа садааддадд аЕдЕЕЕЕсаа ЕЕа дЕаЕаЕааад сдЕсадааЕЕ аЕЕдсссдсЕ сЕЕдЕдаЕдд дасЕдддЕаа асадааЕЕас адаааЕдЕсс аддсЕдасЕд дЕЕддсасЕа ЕдЕдааЕсад ЕЕЕаЕдадаЕ садасададд ааасададас ааддадасаа дсЕдаддааа асадЕсааЕс саааЕсадда дЕддсдсссс ЕддсадЕаас сасЕдсЕаса дссЕаЕддад дсЕссЕЕдда ЕЕаЕсаасда ЕЕаЕадЕЕдд адЕасЕаЕсс дсЕсЕЕдссд сасдаддада ЕадЕдааааа даааЕадасЕ ЕсадаЕаЕаЕ сЕЕЕдаааса дЕасадассЕ ЕЕддааасса ссаадЕЕссс ЕсдаадасЕд ддаЕддсЕда сааЕдЕсЕас ЕсаддЕдааа ЕссассЕддд адддсадЕЕс ассаЕддЕдЕ ЕдаааЕЕаЕЕ
ЕдадсдЕсса 840 ааадаасаЕЕ 900 адаЕдадада 960 сааЕддаЕсЕ 1020 ЕсЕЕдсЕсаЕ 1080 ЕсаЕЕаЕааа 1140 ЕдаЕддаасс 1200 ддЕдсдссса 1260 ддсассадаа 1320 адЕадасаЕд 1380 сЕЕсссаддд 1440 ЕсссасЕЕЕЕ 1500 адаадссЕдд 1560 ЕЕдддассад 1620 асЕЕаЕдаЕд 1680 ЕдсЕаЕдсад 1740 адаЕсаадаа 1800 ЕсаЕсЕссас 1860 аЕЕссаааЕс 1920 сЕааадаЕаЕ 1980 ЕЕЕЕдсаЕса 2040 2063 <210> 123 <211> 1964 <212> ОНА <213> Ното зариепз <400> 123 аЕЕЕсЕЕЕЕс ддсссЕддсд сдсадааЕса дЕдададЕад аЕддссЕЕЕд асаЕЕддада сааЕЕсадаа ЕЕасЕдадаа дадаЕдадас ссЕЕаЕдсЕЕ асаЕдаЕдда адсЕдаЕЕдд ЕЕдсЕдЕааа асададЕдсс ЕсасЕдеада ЕаЕдсаадЕа сЕдЕЕасЕад сЕдсааЕЕЕс дЕдЕЕаЕЕад дддаддаада ЕдсЕадаадд аЕдсЕсЕЕдд ааЕссдЕасс аддаЕаЕдса аадааааЕад аЕдсададдс ЕЕЕдддааад аЕдаасдЕад
ЕЕЕдсссЕсс ддЕдсссЕдд адаасддсЕа ааЕсЕсЕсаЕ ддадаааЕса Ессссаадад ЕддаасаЕас ЕЕЕЕссассЕ ааЕааЕсаЕЕ ЕддаЕасада ддсадсадса ссдаддЕсда адЕдЕЕЕЕсс ЕЕЕдаЕддаа ЕддасдсаЕд ЕЕЕаадЕсЕс аддасЕддсЕ ссаЕсдадаЕ ЕдасЕЕЕдда ЕааЕдсадсс адсЕдЕдаас асЕааЕсЕаЕ ададЕассад ддЕЕсЕсдЕд ссЕддсадЕд ЕсддсЕЕасЕ ааасаааЕсЕ дЕдадЕсаас
ЕдаЕЕсЕЕдд сЕассаЕдда ЕдЕдсдЕЕЕа дааааЕддда аааддддаса ЕдЕсасЕаЕд сдЕЕЕсЕдсЕ ссЕдасасаа дсЕЕЕддсаЕ аЕдЕЕдасад ЕссдаасссЕ ЕаЕддадсад ЕЕЕдсааасс саЕдасааса дааЕаЕЕЕдс сасасаадЕд ЕаЕсЕЕсаса ЕЕааасадса сЕдЕссаЕда аЕаадсдадд ЕЕдадддасЕ ЕдддадаЕаЕ аЕддсЕЕЕЕс ЕсЕадддааа аддЕсасЕса дсасадЕдЕд дЕдадсссаа ас а ада Е ддс сЕддсссадд ссаЕссЕдсЕ аадаЕссдЕа сааЕаЕЕаЕд ЕаааЕсЕЕдЕ аадааЕдЕдЕ дЕЕдЕадсас сассасЕсад садЕсЕсЕдЕ дадассдЕаа сЕсЕЕдаЕсЕ ЕаЕаЕааадд дЕсадааЕЕЕ ЕЕдсссдсЕЕ ЕЕдЕдаЕдда асЕдддЕаад садааЕЕасс даааЕдЕссЕ ддсЕдасЕдд ЕЕддсасЕаЕ дЕдааЕсадс ЕЕаЕдадаЕд адасададдЕ аасададасс аддадасааЕ сЕдаддааад садЕсааЕсс аааЕсаддаЕ даЕдасЕЕсс ддЕсадсасЕ Есадсаадае сЕсдаааддЕ аааасаадда адЕаасЕасс адаЕЕЕаЕдЕ ЕссассЕсаЕ аЕЕадсЕдЕЕ асааддЕсЕЕ адаЕааЕсЕд сЕссЕЕддаЕ ЕаЕсаасдаа ЕаЕадЕЕдда дЕасЕаЕесс сЕсЕЕдссдЕ асдаддадаЕ адЕдаааааЕ аааЕадасЕд садаЕаЕаЕд ЕЕЕдааасаа ЕасадассЕс ЕддааассаЕ саадЕЕссса сдаадасЕдЕ даЕддсЕдаа ааЕдЕсЕасЕ саддЕдаааа
ЕсдсЕдсадс 60 дсддсЕдсЕЕ 120 сЕЕдддаЕад 180 адсассЕдсЕ 240 ЕдЕЕддЕсЕс 300 асЕссЕсссЕ 360 ааЕдЕсаасЕ 420 ЕсаЕЕЕаасс 480 ЕЕдаЕадЕЕд 540 сасадЕаЕда 600 ааасЕдЕЕдд 660 дадсдЕссад 720 аадаасаЕЕЕ 780 даЕдададад 840 ааЕддаЕсЕЕ 900 сЕЕдсЕсаЕЕ 960 саЕЕаЕааас 1020 даЕддаассЕ 1080 дЕдсдсссад 1140 дсассадаад 1200 дЕадасаЕдЕ 1260 ЕЕсссадддд 1320 сссасЕЕЕЕд 1380 даадссЕдда 1440 Едддассадд 1500 сЕЕаЕдаЕда 1560 дсЕаЕдсада 1620 даЕсаадааа 1680
- 130 014525 сдЬдЬдаааа сСсссСаССс СсССаадсдд СддсдссссС ссассСдддС дааСсдсСдд асСдСдаадС саасааСааС ддсадСааса дддсадССса адсасСдсСд СССассССдс адааддаддс асСдсСасаа ссаСддСдСс ддааСдаасС дСсСдСдааа СдССССсаад ссСаСддадС даааССаССС ССааасабдс адаадаСдСС СаааааСааа ааааааасСд сССС саСсСссасС 1740
ССссааассс 1800
СааадаСаСа 1860
СССдсаСсаС 1920 1964 <210> 124 <211> 3611 <212> ΏΝΑ <213> Ното зарБепз <400> 124 сдссссссда ссСддаСаСС ддсСсссСдс ддсдааддаа ааадсСсСдс дддсаддаЬс ССсссаСаСС ссдсадсддс дсСдсССсдс дддаСаддСд ассСдсСаСд СддСсССаса ссСсссСсаа дСсаасСССа СССаассдад аСадССдссС адСаСдааса сСдССддадс сдСссадССд аасаСССаса дадададсса ддаСсСССаСдсСсаССсСд СаСааассСд ддаассСдСд сдсссадддд ссадаадСдс дасаСдСаСд ссаддддааС асССССдадд дссСддааад дассаддаСд аСдаСдаССС аСдсадааСд даССаССсСС ааСаСССссС ааССсааССа дСсассадсс ддсаСдасСа дССдсасадС ассаасаадс сСсаСддадс адсССдсССС садасСдсаа сСссссаадс ссссддаСсд СССССдаСаС СССссссаса сссссссадс адсСаддСсс адСссасддд СсссССсССС ссСддсдддС адааСсаада ададСадааС дссСССддда ССддадаСсс ССсадааСдд сСдадааССС аСдадасаас СаСдсСССдд СдаСддаддс СдаССддссд сСдСаааадС дадСдссССС сСдсадаСдд дсаадСаС.СС. ССасСададд сааСССссса ССаССадСда аддаадаСаа Садааддадс сСсССддасС ссдСассада аСаСдсаддС ааааСадссС сададдсСсд дддааадааа аасдсаассС ссСссСсаСа сСдадсаССс асЬаСдаасд СсСссассаа сСаСаСсСда сааССдддсс Садасссааа асСсСсССаа асссасСсаС аСддссаадс адсадаассС ааСссссдсс сдСдааасса дасаСдссСС сдсдадддад СсСсаСсадс ададаадасд дсссСссСда дсссСддсСа асддсСаСдС сСсСсаСдаа даааСсаааа ссаададСдС аасаСассдС СссассСссС ааСсаССдсС аСасадааСд адсадсаСсс аддСсдаСаС дССССссССС даСддаасаС асдсаСддаа _аадСсСссас асСддсССаС СсдадаСССа сСССддасСд СдсадссаСа СдСдаасССд ааСссаССдд дСассадаСд СсСсдСдСсС ддсадСдадд дсССасСдса саааСсСдСд дСсасаСааС саССдаадас СаСдСссадс асадсаадса сасаасаасс даСдссаСас аассссСдСс адаадССдаС асадССсадС аааасССдса аСдСССдаСС Ссссаадада сСссдсассс сдадддаааЬ ссдСССддад адаааСдаад саСССдСссС адесСсссдд СССССддсСд ссасддасса дсдСССааад ааСдддасаа ддддасаСаа сасСаСдаад ССсСдсСдСС дасасаасас ССддсаСсад ССдасаддад даасссСсСс ддадсадСаС дсааассдСс дасаасаССд СаСССдсССд асаадСдасС сССсасасад аасадсадаа СссаСдаддс адсдаддССд адддасСдСд дадаСаСССа дсССССсада адддааааас СсасСсаадд садСдСдсСд адсссаасад аддсдСдСдс СсСаСссаСс асассСССда саадсСсдаа асааасасса ссадаСдааа СдсССасадс аадаассСса ддсссадасс дСадаадсаа ссСдаСдССс ссСасСадСС
СддаСаСдСС ааСССддддд ддссдсддса ддааСсссСд ССсааасСдС сСдСССсСсс дсссадддаС СссСдсСддС аСссдСаСса сассасдссс аСсССдСааа ааСдСдСадС дСадсасада сасСсадСсс СсСсСдСаСС ассдСаааса ССдаСсСада аСаааддсСс адааССССаС сссдссССаС СдаСддадСа дддСаадсСс ааССассасд аСдСссСадС СдасСддааа дсасСаСсад ааСсадсССС СдадаСдСас сададдССдд ададасссаа адасааСсда аддаааддаС СсааСссааС саааааССдд аСасСдасад сСаСадддда Сссссадссс саддасСсас саааСсСдса Сдасадаада аддааадссс сасСдадсад сСддасадса СдссСасСса СдссСССдаа
ССсСсссада асССсССсСС ссссдСссда садсддсаСд аССдСдаСас дссддСсСас дасССссСсд садсасСдсд дсаадассСС даааддСадс асааддаСдС аасСассасС СССаСдСааС ассСсаССса адсСдССССд аддСсССсас СааСсСдааа сССддаСдад саасдаааад адССддадаС сСаСсссааС ССдссдСсСС аддадаСсаС даааааСдаС СадасСддСд аСаСаСддса дааасаадСа адассСсССс ааассаСссс дССсссадаа адасСдССдд ддсСдаасСС дСсСасСдсС СссССаСсса саСсдСдаад аааааассда СдааасаадС дссаадСасС СассасаааС адасССддаа СдаСдадааС СасСадССсС ддасССсаса даСсСаСссС сассаааааС
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700
- 131 014525
Есаасаааад дааасЕддад ассаЕдааЕд ЕаЕдссааЕд даааЕдЕЕдс даЕдадсаЕд даЕсдЕсЕЕд аасаасадса дсадаЕссЕд дссасаааЕд ЕсаддаЕсад сдссссЕсса адЕаасаддд дсЕасаасса аЕддадЕдаа аааасЕдсЕЕ адссссддсЕ ЕЕдссаадаЕ дЕдЕддсадд ддасадЕасЕ адааЕсадЕЕ адссЕЕЕасЕ Еддасаддад аЕссаЕдЕЕс ддссаЕсааа ЕссЕддаЕдд дЕдаааадаЕ ссЕдддЕсаЕ садЕЕсаЕЕс ЕддЕдЕсЕаа аЕЕаЕЕЕЕЕЕ Е ааааЕЕЕддс дааЕасааЕс Еадааассас аЕсЕддссаа ЕаЕЕддЕдад дадасдадад ддаасддсса адаасаадаЕ дсссадаада садсадЕаЕа саадааасдЕ сЕссасЕдаа саааЕссадс адаЕаЕадда дсаЕсаЕЕЕа адсаадсаса ааЕдсадсад адЕдЕЕаасЕ асаассааса дасасссддс саасаадсЕд сЕадааддЕд дЕЕсЕЕдсас дсасададдс садаЕаддЕд дЕдаааасЕс ЕсдсЕддасЕ асЕдсЕдЕЕЕ аЕдаасЕдЕс аасаЕдсада ааЕсааасЕЕ аассЕсаЕдЕ сссаЕдсЕдс ЕадЕдасаса ЕдааЕаЕЕаа дссаЕдаЕда дссдаасЕаа адддЕдЕЕсс сЕааЕЕсЕсЕ адЕсаасаса ссЕаЕЕсЕсЕ дЕдаадЕсаа ассЕЕдсада ЕдЕдаааЕдЕ адаЕдЕЕЕаа дааасаадЕс 2760 ддЕдасадЕс 2820 сасаасссаа 2880 Еадддсссаа 2940 ЕЕссадЕссЕ 3000 адд^дЬЕсЕд зобо ЕЕссааЕаас 3120 аадсасадса 3180 ддаЕсЕЕЕса 3240 адаЕддсааа 3300 ЕаадсддЕдд 3360 сааЕааЕддс 3420 аддаддсасЕ 3480 ЕЕЕсаадссЕ 3540 аааЕаааааа 3600 3611 <210> 125 <211> 3871 <212> ΌΝΑ <213> Ното заргепз <400> 125 ддссЕссдса сЕасдаддда сЕЕссдЕЕЕд дададаааЕд адссаЕЕЕдЕ асдадссЕсс ЕдаЕЕсЕЕдд сЕассаЕдда ЕдЕдсдЕЕЕа дааааЕддда аааддддаса ЕдЕсасЕаЕд сдЕЕЕсЕдсЕ ссЕдасасаа дсЕЕЕддсаЕ аЕдЕЕдасад ЕссдаасссЕ ЕаЕддадсад ЕЕЕдсааасс саЕдасааса дааЕаЕЕЕдс сасасаадЕд ЕаЕсЕЕсаса ЕЕааасадса сЕдЕссаЕда аЕаадсдадд ЕЕдадддасЕ ЕдддадаЕаЕ аЕддсЕЕЕЕс ЕсЕадддааа аддЕсасЕса дсасадЕдЕд дЕдадсссаа ааЕаддсдЕд сссЕддаЕаЕ ааЕааЕЕЕдд дадддссдсд аадддааЕЕЕ ссЕЕЕсааас сддсЕдЕЕЕс сЕддсссадд ссаЕссЕдсЕ аадаЕссдЕа сааЕаЕЕаЕд ЕаааЕсЕЕдЕ аадааЕдЕдЕ дЕЕдЕадсас сассасЕсад садЕсЕсЕдЕ дадассдЕаа сЕсЕЕдаЕсЕ ЕаЕаЕааадд дЕсадааЕЕЕ ЕЕдсссдсЕЕ ЕЕдЕдаЕдда асЕдддЕаад садааЕЕасс даааЕдЕссЕ ддсЕдасЕдд ЕЕддсасЕаЕ дЕдааЕсадо ЕЕаЕдадаЕд адасададдЕ аасададасс аддадасааЕ сЕдаддааад садЕсааЕсс ЕдссаааааЕ дЕЕЕЕсЕссс дддаЕЕЕсЕЕ дсассссдЕс сЕдсадсддс ЕдЕаЕЕдЕда ЕссдссддЕс даЕдасЕЕсс ддЕсадсасЕ Есадсаадас сЕсдаааддЕ аааасаадда адЕаасЕасс адаЕЕЕаЕдЕ ЕссассЕоаЕ аЕЕадсЕдЕЕ асааддЕсЕЕ адаЕааЕсЕд сЕссЕЕддаЕ ЕаЕсаасдаа ЕаЕадЕЕдда дЕасЕаЕссс сЕсЕЕдссдЕ асдаддадаЕ адЕдаааааЕ аааЕадасЕд садаЕаЕаЕд ЕЕЕдааасаа ЕасадассЕс ЕддааассаЕ саадЕЕссса сдаадасЕдЕ даЕддсЕдаа ааЕдЕсЕасЕ ЕддЕссЕЕаЕ адассЕддаЕ сЕЕддсЕссс сдаддсдаад аЕдааадсЕс Еасдддсадд ЕасЕЕсссаЕ ЕсдсЕдсадс дсддсЕдсЕЕ сЕЕдддаЕад адсассЕдсЕ ЕдЕЕддЕсЕс асЕссЕсссЕ ааЕдЕсаасЕ ЕсаЕЕЕаасс ЕЕдаЕадЕЕд сасадЕаЕда ааасЕдЕЕдд дадсдЕссад аадаасаЕЕЕ даЕдададад ааЕддаЕсЕЕ сЕЕдсЕсаЕЕ саЕЕаЕааас даЕддаассЕ дЕдсдсссад дсассадаад дЕадасаЕдЕ ЕЕсссадддд сссасЕЕЕЕд даадссЕдда Едддассадд сЕЕаЕдаЕда дсЕаЕдсада ссадаЕЕаЕЕ аЕЕЕЕЕЕЕда ЕдсЕЕЕсссс даассссссс ЕдсадсЕадд аЕсадЕссас аЕЕЕсЕЕЕЕс ддсссЕддсд сдсадааЕса дЕдададЕад аЕддссЕЕЕд асаЕЕддада сааЕЕсадаа ЕЕасЕдадаа дадаЕдадас ссЕЕаЕдсЕЕ асаЕдаЕдда адсЕдаЕЕдд ЕЕдсЕдЕааа асададЕдсс ЕсасЕдсада ЕаЕдсаадЕа сЕдЕЕасЕад сЕдсааЕЕЕс дЕдЕЕаЕЕад дддаддаада ЕдсЕадаадд аЕдсЕсЕЕдд ааЕссдЕасс аддаЕаЕдса аадааааЕад аЕдсададдс ЕЕЕдддааад аЕдаасдсаа сЕЕссЕссЕс
ЕаЕсдЕдааа 60 асадасаЕас 120 аЕссдсдадд 180 ЕссЕсЕсаЕс 240 дддададаад 300 ЕЕЕдсссЕсс 360 ддЕдсссЕдд 420 адаасддсЕа 480 ааЕсЕсЕсаЕ 540 ддадаааЕса 600 Ессссаадад 660 ЕддаасаЕас 720 ЕЕЕЕссассЕ 780 ааЕааЕсаЕЕ 840 ЕддаЕасада 900 ддсадсадса 960 ссдаддЕсда 1020 адЕдЕЕЕЕсс 1080 ЕЕЕдаЕддаа 1140 ЕддасдсаЕд 1200 ЕЕЕаадЕсЕс 1260 аддасЕддсЕ 1320 ссаЕсдадаЕ 1380 ЕдасЕЕЕдда 1440 ЕааЕдсадсс 1500 адсЕдЕдаас 1560 асЕааЕсЕаЕ 1620 ададЕассад 1680 ддЕЕсЕсдЕд 1740 ссЕддсадЕд 1800 ЕсддсЕЕасЕ 1860 ааасаааЕсЕ 1920 ссЕдЕсасаЕ 1980 аЕасаЕЕдаа 2040
- 132 014525 дасЕсЕаЕсс адсасассЕЕ дсасаадсЕс ассасаааса ЕасссадаЕд дЕсЕдсЕЕас даЕаадаасс адЕддсссад дсадЕадаад аЕЕссЕдаЕд адассЕасЕа ддсадсаадс аЕсааЕдсад сасадЕдЕЕа сааасаасса даддасассс дадсаасаад ссасЕадаад даЕдЕЕсЕЕд ададсасада аЕасадаЕад сдЕдЕдаааа дааЕсдсЕдд адсасЕдсЕд ддааЕдаасЕ ЕЕааасаЕдс дЕддаддаЕд даЕЕЕдЕддЕ ссдаЕссЕаЕ адддсаддсЕ аЕададаЕда аЕсаЕасЕда ЕдасЕаЕадд дааЕссссад ссасаддасЕ ааасаааЕсЕ адсЕдасада Есааддааад асссасЕдад саасЕддаса ЕЕсЕдссЕас дЕЕЕдссЕЕЕ асаааЕсааа садаассЕса асЕсссаЕдс асаЕадЕдас ддсЕдааЕаЕ сЕддссаЕда дЕддссдаас сасадддЕдЕ ддссЕааЕЕс дЕдадЕсаас сЕсссЕаЕЕс асЕдЕдаадЕ ЕЕЕассЕЕдс дЕсЕдЕдааа адаадаЕдЕЕ дддсЕсадаа адддаадсад сссассЕсЕЕ даддсаасда ЕдЕааЕЕЕсЕ садсаЕсдЕд ддааааааас сссЕдаааса сасдссаадЕ дсаЕассаса адаадасЕЕд сЕаЕдаЕдад садЕасЕадЕ дсаддасЕЕс ЕсадаЕсЕаЕ даасассааа сЕЕдааасаа ЕдЕддЕдаса Едссасаасс асаЕадддсс ЕааЕЕссадЕ ЕдааддЕдЕЕ ЕааЕЕссааЕ Ессаадсаса ЕсЕддаЕсЕЕ асаадаЕддс ЕсЕЕаадсдд саасааЕааЕ адааддаддс ЕдЕЕЕЕсаад Еассдддсдд ЕдсадассЕд ЕаЕдддЕдса садддЕдадс дЕдддаддЕЕ ЕЕссддааЕЕ аадааЕаЕЕЕ сдаааЕЕсаа адЕдЕсасса асЕддсаЕда ааЕдЕЕдсас дааассааса ааЕсЕсаЕдд ЕсЕадсЕЕдс асасадасЕд ссЕсЕсссса ааЕЕсаасаа дЕсдааасЕд дЕсассаЕда сааЕаЕдсса саадаааЕдЕ ссЕдаЕдадс сЕддаЕсдЕс аасаасааса дсадсадаЕс Есадссасаа аааЕсаддаЕ ЕддсдссссЕ ддсадЕааса асЕдсЕасаа ссЕаЕддадЕ ддЕдасадда ддсЕддссдс дЕссссЕссЕ садссЕсасс сааасаадад с ссЕсЕдадса ЕЕаасЕаЕда дссЕсЕссас сЕасЕаЕаЕс адЕсааЕЕдд адсЕадассс адсасЕсЕсЕ ЕЕЕасссасЕ саааЕддсса адсадсадаа аададссссд дадЕЕдссаа аЕддЕдЕддс аЕаддасадЕ ЕдсадааЕса аЕдадссЕЕЕ ЕЕдЕддасад дсааЕссаЕд сЕдддссаЕс аЕдЕссЕдда саддЕдаааа ссассЕдддЕ дддсадЕЕса ссаЕддЕдЕс даааЕЕаЕЕЕ дададсдЕса аЕддссЕсЕС аддссЕсссЕ ЕсЕЕссЕадЕ ЕдддсЕддад
ЕЕсЕаЕдЕсс 2100 асдасадсаа 2160 саасасааса 2220 ЕдадаЕдсса 2280 дссаассссЕ 2340 аааадаадЕЕ 2400 ЕааасадЕЕс 2460 саЕаааасЕЕ 2520 адсаЕдЕЕЕд 2580 ссЕЕсссаад 2640 дсЕааааЕЕЕ 2700 даЕдааЕаса 2760 аддЕадааас 2820 асЕаЕсЕддс 2880 дЕЕЕаЕЕддЕ' 2940 асЕдадасда 3000 дадддаасдд 3060 ЕЕсадаасаа 3120 ааадсссада 3180 ЕддсадсадЕ 3240 даЕсаадааа 3300 саЕсЕссасЕ 3360 ЕЕссаааЕсс 3420 ЕааадаЕаЕа 3480 ЕЕЕдсаЕсаЕ 3540 дсддсаадсЕ 3600 ссЕдадсссЕ 3660 сЕддддЕссс 3720 ссЕдадддЕд 3780 ссаадддааа 3840 3871
<210> 126
<211> 88
<212> РЕТ
<213> Ното
<400> 126
Суз Агд С1и Ьеи Н13 РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд
1 5 10 15
Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг (31и Ьеи Уа1 Суз Зег С1у αΐη Суз (31у Рго
20 25 30
А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не С1у Агд С1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго
35 40 45
Зег С1у Рго Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а (31п Агд
50 55 60
Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у 01у О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1
65 70 75 80
Агд Ьеи Уа1 А1а Зег 85 Суз Ьуз Суз
<210> 127 <211> 82 <212> РК.Т <213> Ното заргепз
- 133 014525 <400> 127
Суз Агд Рго Не Азп А1а Ткг Ьеи А1а Уа1 О1и Ьуз О1и О1у Суз Рго
1 5 10 15
Уа1 Суз Пе Ткг Уа1 Азп Ткг Ткг 11е Суз А1а 01у Туг Суз Рго Ткг
20 25 30
Мек Ткг Агд Уа1 Ьеи 01п (31у Уа1 Ьеи Рго А1а Ьеи Рго О1п Уа1 Уа1
35 40 45
Суз Азп Туг Агд Азр Уа1 Агд Рке О1и Зег Не Агд Ьеи Рго О1у Суз
50 55 60
Рго Агд О1у Уа1 Азп Рго Уа1 Уа1 Зег Туг А1а Уа1 А1а Ьеи Зег Суз
65 70 75 80
О1п Суз
<210> 128 <211> 82 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 128
Суз О1и Ьеи Ткг Азп Не Ткг Не
1 5
Рке Суз Не Зег Не Азп Ткг Ткг
20
Агд Азр Ьеи Уа1 Туг Ьуз Азр Рго
35 40
Суз Ткг Рке Ьуз (31и Ьеи Уа1 Туг
50 55
А1а Нхз Нхз А1а Азр Зег Ьеи Туг
65 70
Нхз Суз
А1а Не 01и Ьуз О1и О1и Суз 15 Агд
10
Тгр 25 Суз А1а <31у Туг Суз 30 Туг Ткг
А1а Агд Рго Ьуз Не 45 О1п Ьуз Ткг
О1и Ткг Уа1 Агд 60 Уа1 Рго С1у Суз
Ткг Туг Рго 75 Уа1 А1а Ткг 01 п Суз 80
<210> 129 <211> 84 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 129
Суз Не Рго Ткг О1и Туг Ткг Мек Нхз Не О1и Агд Агд 01и Суз А1а
1 5 10 15
Туг Суз Ьеи Ткг 11е Азп Ткг Ткг 11е Суз А1а О1у Туг Суз Мек Ткг
20 25 30
Агд·Азр Не Азп О1у Ьуз Ьеи Рке Ьеи Рго Ьуз Туг А1а Ьеи Зег С1п
35 40 45
Азр Уа1 Суз Ткг Туг Агд Азр Рке Не Туг Агд Ткг Уа1 С1и 11е Рго
50 55 60
О1у Суз Рго Ьеи Нхз Уа1 А1а Рго Туг Рке Зег Туг Рго Уа1 А1а Ьеи
65 70 75 80
Зег Суз Ьуз Суз
<210> 130 <211> 83
- 134 014525 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 130
Суз Азп Азр 11е ТЬг А1а Агд Ьеи <31п Туг Уа1 Ьуз Уа1 <31у Зег Суз
1 5 10 15
Ьуз Зег <31и Уа1 <3111 Уа1 Азр Не Нхз Туг Суз (31п <31у Ьуз Суз А1а
20 25 30
Зег Ьуз А1а Мер Туг Зег Не Азр Ые Азп Азр Уа1 (31п Азр (31п Суз
35 40 45
Зег Суз Суз Зег Рго ТЬг Агд ТЬг (31и Рго Мер (31п Уа1 А1а Ьеи Н1а
50 55 60
Суз ТЬг Азп О1у Зег Уа1 Уа1 Туг Нхз (31и Уа1 Ьеи Азп А1а Мер <Ии
65 70 75 80
Суз Ьуз Суз
<210> 131
<211> 80
<212> РКТ
<213> Ното : зархепз
<400> 131
Суз Зег ТЬг Уа1 Рго Уа1 ТЬг ТЬг С1и Уа1 Зег Туг А1а С1у Суз ТЬг
1 5 10 15
Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи Мер Азп ΗΪ3 Суз Зег 01у Зег Суз С1у ТЬг РЬе Уа1
20 25 30
МеР Туг Зег А1а Ьуз А1а е1п А1а Ьеи Азр Нхз Зег Суз Зег Суз Суз
35 40 45
Ьуз С1и <31и Ьуз ТЬг Зег 61п Агд (31и Уа1 Уа1 Ьеи Зег Суз Рго Азп
50 55 60
<31у (31у Зег Ьеи ТЬг Нхз ТЬг Туг ТЬг ΗΪ8 Ые С1и Зег Суз (31п Суз
65 70 75 80
<210> 132
<211> 80
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 132
Суз Агд ТЬг Уа1 Рго Рке Зег С1п ТЬг Не ТЬг Нхз 01и (Ну Суз (Ии
1 5 10 15
Ьуз ТЫ Уа1 Уа1 О1п Азп Азп Ьеи Суз РЬе О1у Ьуз Суз (Ну Зег Уа1
20 25 30
Нхз РЬе Рго С1у А1а А1а <31п Нхз Зег Нхз ТЬг Зег Суз Зег Нхз Суз
35 40 45
Ьеи Рго А1а Ьуз РЬе ТЬг ТЬг МеР Нхз Ьеи Рго Ьеи Азп Суз ТЬг (Ии
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Не Ьуз Уа1 Уа1 Мер Ьеи Уа1 (31и (Ии Суз С1п Суз
65 70 75 80
<210> 133 <211> 85 <212> РКТ
- 135 014525 <213> Ното зархепз <400> 133
Суз Ьуз ТЬг 01п Рго Ьеи Ьуз О1п ТЬг 11е Нхз 01и О1и 01у Суз Азп
1 5 10 15
Зег Агд ТЬг 11е 11е Азп Агд РЬе Суз Туг 01у О1п Суз Азп Зег РЬе
20 25 30
Туг Не Рго Агд Нхз 11е Агд Ьуз О1и С1и О1у Зег РЬе 01 п Зег Суз
35 40 45
Зег РЬе Суз Ьуз Рго Ьуз Ьуз РЬе ТЫ ТЫ МеЕ МеЕ Уа1 ТЫ Ьеи Азп
50 55 60
Суз Рго О1и Ьеи О1п Рго Рго ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Агд Уа! ТЬг Агд Уа1
65 70 75 80
Ьуз С1п Суз Агд Суз
85
<210> 134 <211> 86 <212> РНТ <213> Ното зархепз <400> 134
Суз О1и А1а Ьуз Азп 11е ТЫ О1п
1 5
А1а Ьуз Зег 11е О1п Азп Агд А1а
20
Зег Уа1 Рго Азп ТЫ РЬе Рго О1п
35 40
Азр Зег Суз МеЕ Рго А1а О1п Зег
50 55
Суз Рго О1у Нхз О1и О1и Уа1 Рго
65 70
11е Ьеи Нхз Суз Зег Суз
85
Не Уа1 О1у Нхз Зег О1у Суз 15 О1и
10
Суз 25 Ьеи О1у С1п Суз РЬе 30 Зег Туг
Зег ТЫ О1и Зег Ьеи 45 Уа1 Нхз Суз
МеЕ Тгр 01и Пе 60 Уа1 ТЬг Ьеи 01и
Агд Уа1 Азр 75 Ьуз Ьеи Уа1 О1и Ьуз 80
<210> 135 <211> 70 <212> РКТ <213> Ното зархез <400> 135
Суз 11е Агд ТЬг Рго Ьуз Не Зег
1 5
О1у Суз ТЬг Зег МеЕ Ьуз ТЫ Туг
20
ты Азр О1у Агд Суз Суз ТЫ Рго
35 40
С1и РЬе Ьуз Суз Рго Азр 01у О1и
50 55
Не Ьуз ТЬг Суз А1а Суз
65 70
Ьуз Рго 10 11е Ьуз РЬе О1и Ьеи 15 Зег
Агд 25 А1а Ьуз РЬе Суз О1у 30 Уа1 Суз
Нхз Агд ТЬг ТЬг ТЬг 45 Ьеи Рго Уа1
Уа1 МеЕ Ьуз Ьуз 60 Азп МеЕ МеЕ РЬе
<210> 136 <211> 70
- 136 014525 <212> ΡΚΤ <213> Ното зариепз <400> 136
Суз Ьеи Агд ТЫ Ьуз Ьуз Зег Ьеи Ьуз А1а 11е Низ Ьеи О1п РЬе Ьуз
1 5 10 15
Азп Суз ТЫ Зег Ьеи Низ ТЫ Туг Ьуз Рго Агд РЬе Суз б1у Уа1 Суз
20 25 30
Зег Азр О1у Агд Суз Суз ТЫ Рго Низ Азп ТЫ Ьуз ТЫ 11е <31п А1а
35 40 45
01и РЬе О1п Суз Зег Рго 01у (31п 11е Уа1 Ьуз Ьуз Рго Уа1 МеЕ Уа1
50 55 60
11е 01у ТЬг Суз ТЫ Суз
65 70
<210> 137 <211> 70 <212> ΡΕ.Τ <213 > Ното зариепз
<400> 137
Суз Зег Ьуз ТЬг Ьуз Ьуз Зег Рго О1и Рго νβΐ Агд РЬе ТЬг Туг А1а
1 5 10 15
01у Суз Ьеи Зег Уа1 Ьуз Ьуз Туг Агд Рго Ьуз Туг Суз 01у Зег Суз
20 25 30
Уа1 Азр 01у Агд Суз Суз ТЫ Рго 01п Ьеи ТЬг Агд ТЬг Уа1 Ьуз МеЕ
35 40 45
Агд РЬе Агд Суз 01и Азр 01у 01и ТЬг РЬе Зег Ьуз Азп Уа1 МеЕ МеЕ
50 55 60
11е С1п Зег Суз Ьуз Суз
65 70
<210> 138 <211> 205 <212> ΡΚΤ <213> Ното зариепз
<400> 138
01п Низ Туг Ьеи Низ 11е Агд Рго А1а Рго Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи
1 5 10 15
Уа1 Азр Ьеи 11е 01и Низ Рго Азр Рго 11е РЬе Азр Рго Ьуз 31 и Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Азп 01и ТЫ Ьеи Ьеи Агд Зег Ьеи Ьеи 01у О1у Низ Туг Азр
35 40 45
Рго О1у РЬе МеЕ А1а ТЬг Зег Рго Рго О1и Азр Агд Рго О1у О1у 01у
50 55 60
01у С1у А1а А1а О1у О1у А1а 01и Азр Ьеи А1а О1и Ьеи Азр 01п Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Агд 01п Агд Рго Зег О1у А1а МеЕ Рго Зег О1и 11е Ьуз 01у Ьеи
85 90 95
01и РЬе Зег 01и О1у Ьеи А1а е1п 01у Ьуз Ьуз О1п Агд Ьеи Зег Ьуз
100 105 110
Ьуз Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи О1п МеЕ Тгр Ьеи Тгр Зег С1п ТЬг РЬе Суз
115 120 125
Рго Уа1 Ьеи Туг А1а Тгр Азп Азр Ьеи О1у Зег Агд РЬе Тгр Рго Агд
- 137 014525
130 135 140
Туг Уа1 Ьуз Уа1 С1у Зег Суз РЬе Зег Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго
145 150 155 160
С1и 01у Мер Уа1 Суз Ьуз Рго Зег Ьуз Зег Уа1 ΗΪ3 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
165 170 175
Агд Тгр Агд Суз О1п Агд Агд С1у С1у 01п Агд Суз 01у Тгр 11е Рго
180 185 190
11е (31η Туг Рго 11е Не Зег О1и Суз Ьуз Суз Зег Суз
195 200 205
<210> 139 <211> 197 <212> РЕТ <213> Са11из да11из
<400> 139
01п Н13 Туг Ьеи ΗΪ3 Не Агд Рго А1а РГО Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи
1 5 10 15
Уа1 Азр Ьеи Ые С1и Н1з Рго Азр Рго 11е РЬе Азр Рго Ьуз С1и Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Азп О1и ТЬг Ьеи Ьеи Агд Зег Ьеи Мер О1у (31у ΗΪ3 РЬе Азр
35 40 45
Рго Азп РЬе Мер А1а Мер Зег Ьеи Рго (31и Азр Агд Ьеи (31у Уа1 Азр
50 55 60
Азр Ьеи А1а С1и Ьеи Азр Ьеи Ьеи Ьеи Агд (Э1п Агд Рго Зег О1у А1а
65 70 75 80
Мер Рго О1у О1и Не Ьуз <31у Ьеи 01и РЬе Туг Азр (31у Ьеи (31п Рго
85 90 95
01у Ьуз Ьуз Н13 Агд Ьеи Зег Ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи С1п Мер
100 105 110
Тгр Ьеи Тгр Зег С1п ТЬг РЬе Суз Рго Уа1 Ьеи Туг ТЬг Тгр Азп Азр
115 120 125
Ьеи 01у Зег Агд РЬе Тгр Рго Агд Туг Уа1 Ьуз Уа1 С1у Зег Суз Туг
130 135 140
Зег Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго О1и <31у Мер Уа1 Суз Ьуз Рго А1а
145 150 155 160
Ьуз Зег Уа1 ΗΪ3 Ьеи ТЬг Не Ьеи Агд Тгр Агд Суз <31п Агд Агд С1у
165 170 175
(31у С1п Агд Суз ТЬг Тгр 11е Рго 11е 01п Туг Рго 11е 11е А1а О1и
180 185 190
Суз Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> 140 <211> 196 <212> РЕТ <213 > Хепориз 1ηβνί3 <400> 140
αΐη ηϊ3 1 Туг Ьеи Н1з 5 11е Агд Рго
Уа1 Азр Ьеи Не 20 С1и ΗΪ3 Рго Азр
Азр Ьеи Азп 35 01и ТЬг Ьеи Ьеи Агд 40
А1а Рго 10 Зег С1и Азп Ьеи Рго 15 Ьеи
Рго 25 Не Туг Азр Рго Ьуз 30 С1и Ьуз
ТЬг Ьеи Мер Уа1 б1у 45 Н1з РЬе Азр
- 138 014525
Рго Азп РЬе МеЕ А1а ТЬг 11е Ьеи Рго 61и 61и Агд Ьеи 61у Уа1 61и
50 55 60
Азр Ьеи О1у 61и Ьеи Азр Ьеи Ьеи Ьеи Агд 61п Ьуз Рго Зег 61у А1а
65 70 75 80
МеЕ Рго А1а 61и 11е Ьуз 61у Ьеи 61и РЬе Туг 61и 61у Ьеи. 61 п Зег
85 90 95
ьуз Ьуз Н1з Агд Ьеи Зег Ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи 61п МеЕ Тгр
100 105 110
Ьеи Тгр Зег С1п ТЬг РЬе Суз Рго Уа1 Ьеи Туг ТЬг Тгр Азп Азр Ьеи
115 120 125
О1у ТЬг Агд РЬе Тгр Рго Агд Туг Уа1 Ьуз Уа1 61 у Зег Суз Туг Зег
130 135 14 0
Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго 61и О1у МеЕ Уа1 Суз Ьуз А1а А1а Ьуз
145 150 155 160
Зег МеЕ ΗΪ3 Ьеи ТЬг Не Ьеи Агд Тгр Агд Суз 61п Агд Агд Уа1 О1п
165 170 175
61п Ьуз Суз А1а Тгр 11е ТЬг Не 61п Туг Рго Уа1 11е Зег 61и Суз
180 185 190
Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> 141 <211> 195 <212> РЕТ <213 > Так1£иди гиЪгхрез <400> 141
61п Рго Туг Туг Ьеи Ьеи Агд Рго
1 5
Уа1 61и Ьеи Ьуз 20 61и Азр Рго 61у
Азр Ьеи Азп 35 61и ТЬг 61 и Ьеи Ьуз 40
Агд РЬе 50 Ьеи Звх Уа1 Ьеи Рго 55 Рго
Азр 65 61и Ьеи Азр Азр РЬе 70 Азр А1а
Ьуз 61и 11е Агд А1а 85 Уа1 Азр РЬе
ΗΪ3 Ьуз Рго Зег 100 Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз
А1а Туг Зег 115 РЬе Суз Рго Ьеи А1а 120
Агд РЬе 130 Тгр Рго Агд РЬе Уа1 135 Агд
Зег 145 Суз Зег Уа1 Рго 61и 150 61у МеЕ
ΗΪ3 Ьеи ТЬг 11е Ьеи 165 Агд Тгр Агд
Ьуз Суз А1а Тгр 180 Не Рго МеЕ 61п
Суз Зег Суз
195
Не Рго 10 Зег Азр Зег Ьеи Рго 15 11е
Рго 25 Уа1 РЬе Азр Рго Ьуз 30 61и Агд
Зег Уа1 Ьеи 61у Азр 45 РЬе Азр Зег
А1а С1и Азр 61у 60 Н13 А1а 61 у Азп
61п Агд Тгр 75 61у 61у А1а Ьеи Рго 80
Азр А1а 90 Рго 61п Ьеи 61у Ьуз 95 Ьуз
Агд 105 Агд Ьеи 61п 61п Тгр 110 Ьеи Тгр
Н13 А1а Тгр ТЬг Азр 125 Ьеи 61у Зег
А1а 61у Зег Суз 14 0 Ьеи Зег Ьуз Агд
ТЬг Суз Ьуз 155 Рго А1а ТЬг Зег ТЬг 160
Суз 7а1 170 61п Агд Ьуз Уа1 61у 175 Ьеи
Туг 185 Рго Уа1 11е ТЬг Азр 190 Суз Ьуз
<210> 142
- 139 014525 <211> 196 <212> ΡΚΤ <213> Ьапио гегио <400> 142
СЬп Низ Туг Туг Ьеи Ьеи Агд Рго Не Рго Зег Азр Зег Ьеи Рго 1Ье
1 5 10 15
УаЬ СЬи Ьеи Ьуз СЬи Азр Рго Азр Рго УаЬ Ьеи Азр Рго Ьуз 01 и Агд
20 25 30
Азр Ьеи Азп СЬи ТЬг СЬи Ьеи Агд АЬа Не Ьеи СЬу Зег Н1з РЬе СЬи
35 40 45
О1п Азп РЬе Мек Зег 11е Азп Рго Рго СЬи Азр Ьуз Низ АЬа О1у СЬп
50 55 60
Азр СЬи Ьеи Азп СЬи Зег СЬи Ьеи Мек Ьуз СЬп Агд Рго Азп СЬу Не
65 70 75 80
Мек Рго Ьуз С1и Не Ьуз АЬа Мек СЬи РЬе Азр Не СЬп Низ СЬу Ьуз
85 90 95
Ьуз Низ Ьуз Рго Зег ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд Агд Ьеи СЬп Ьеи Тгр Ьеи
100 105 110
Тгр Зег Туг ТЬг РЬе Суз Рго УаЬ УаЬ Нйз ТЬг Тгр СЬп Азр Ьеи СЬу
115 120 125
Азп Агд РЬе Тгр Рго Агд Туг Ьеи Ьуз УаЬ СЬу Зег Суз Туг Азп Ьуз
130 135 140
Агд Зег Суз Зег УаЬ РГО СЬи СЬу Мек УаЬ Суз Ьуз Рго Рго Ьуз Зег
145 150 155 160
Зег Н13 Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Агд Тгр Агд Суз УаЬ СЬп Агд Ьуз СЬу СЬу
165 170 175
Ьеи Ьуз Суз А1а Тгр Не Рго УаЬ СЬп Туг Рго УаЬ Не Зег СЬи Суз
180 185 190
Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> 143 <211> 18Θ <212> ΡΚΤ <213> Миз тизсиЬиз <400> 143
01η СЬу Тгр 01η АЬа РЬе Агд 1 5
Ьеи 01у О1и Туг Рго 01и Рго
Агд АЬа О1и Азп О1у О1у Агд
СЬу УаЬ Зег 01и Туг Зег Суз
55
ТЬг Азр СЬу Рго Суз Агд Зег 65 70
Зег О1у СЬп Суз 01у Рго А1а
УаЬ Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп
100
Агд Туг Агд АЬа СЬп. Агд УаЬ
115
Рго Агд Зег Агд Ьуз УаЬ Агд
130135
Азп Азр А1а ТЬг О1и УаЬ 11е 10
Рго Рго СЬи Азп Азп СЬп ТЬг
2530
Рго Рго Низ Низ Рго Туг Азр
4045
Агд СЬи Ьеи Низ Туг ТЬг Агд
АЬа Ьуз Рго УаЬ ТЬг С1и Ьеи
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп АЬа 11е 90
О1у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е
105 110
СЬп Ьеи Ьеи Суз Рго СЬу СЬу
120 125
Ьеи УаЬ АЬа Зег Суз Ьуз Суз
140
Рго СЬу
Мек Азп
А1а. Ъуз
РЬе Ьеи
УаЬ Суз
СЬу Агд
Рго Азр
АЬа АЬа
Ьуз Агд
Ьеи ТЬг Агд РЬе 145 Низ Азп СЬп Зег СЬи Ьеи Ьуз Азр РЬе СЬу Рго СЬи 160
150 155
ТЬг АЬа Агд Рго СЬп Ьуз СЬу Агд Ьуз Рго Агд Рго СЬу АЬа Агд СЬу
165 170 175
А1а Ьуз А1а Азп СЬп А1а СЬи Ьеи СЬи Азп АЬа Туг
180 185
- 140 -

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 86-111 ЗЕО ΙΌ N0: 46, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  2. 2. Антитело по п.1, которое специфически связывается с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 86-111 ЗЕО ΙΌ N0: 46, и является способным к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  3. 3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 86-105 ЗЕО ΙΌ N0: 46, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  4. 4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 96-111 ЗЕО ΙΌ N0: 46, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  5. 5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 93-110 ЗЕО ΙΌ N0: 46, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  6. 6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются по меньшей мере с четырьмя последовательными аминокислотами пептида склеростина, содержащего ЗЕО ΙΌ N0: 98, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  7. 7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с пептидом склеростина, содержащим ЗЕО ΙΌ N0: 98, с аффиностью Κϋ, равной или меньшей чем 10-6 М, и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  8. 8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 1-56 ЗЕО ΙΌ N0: 46.
  9. 9. Антитело по п.8, где антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью пептида склеростина, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 47-56 и 92.
  10. 10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 111-142 ЗЕО ΙΌ N0: 46.
  11. 11. Антитело по п.10, где антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью пептида склеростина, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 66-69 и 94.
  12. 12. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 86-111 ЗЕО ΙΌ N0: 46.
  13. 13. Антитело по п.12, которое специфически связывается с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 86-111 ЗЕО ΙΌ N0: 46.
  14. 14. Антитело по п.12, где антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 74, 75 и 98.
  15. 15. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом пептида склеростина, включающим аминокислоты 147-190 ЗЕО ΙΌ N0: 46.
  16. 16. Антитело по п.15, где антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 78-81 и 96.
  17. 17. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 46-56, 66-69, 74, 75, 78-81, 92, 94, 96 и 98.
  18. 18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.8-17, способные к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего.
  19. 19. Антитело по любому из пп.1-18, которое является моноклональным антителом.
  20. 20. Антитело по п.19, где моноклональное антитело является антителом человека, гуманизированным антителом или химерным антителом.
  21. 21. Антитело по п.20, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Е(аЬ')2, ЕаЬ', ЕаЬ, Εά и Εν.
  22. 22. Антитело по любому из пп.1-18, которое включает одноцепочечное антитело.
  23. 23. Антитело по любому из пп.1-18, где антитело содержит по меньшей мере одну тяжелую и по меньшей мере одну легкую цепи.
  24. 24. Гибридомная клетка, продуцирующая антитело по п.23.
    - 141 014525
  25. 25. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-23.
  26. 26. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела по п.19.
  27. 27. Нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела по п.19.
  28. 28. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.25-27.
  29. 29. Клетка-хозяин, которая способна экспрессировать антитело по любому из пп.1-23, которая содержит нуклеиновую кислоту по любому из пп.25-27 или вектор по п.28.
  30. 30. Способ получения антитела, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п.29 и выделение продуцируемого ею антитела.
  31. 31. Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.123 и фармацевтически приемлемый носитель.
  32. 32. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-23 для производства медикамента для увеличения содержания минеральных веществ в кости или плотности кости.
  33. 33. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-23 для производства медикамента для лечения состояний, выбранных из группы, состоящей из ахондроплазии, ключично-черепного дизостоза, энхондроматоза, фиброзной дисплазии, болезни Гоше, гипофосфатемического рахита, синдрома Марфана, множественных костно-хрящевых экзостозов, нейрофиброматоза, несовершенного остеогенеза, остеопетроза, остеопороза, остеопойкилоза, остеопении, склеротических повреждений, переломов, периодонтальных заболеваний, псевдоартроза, связанной с нарушениями роста или развития кости дисплазии и пирогенного остеомиелита.
EA200600037A 2003-06-16 2004-06-15 Антитела к склеростину и способы их применения EA014525B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/463,190 US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2003-06-16 Compositions and methods for increasing bone mineralization
PCT/US2004/018910 WO2005003158A2 (en) 2003-06-16 2004-06-15 Compositions and methods for increasing bone mineralization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600037A1 EA200600037A1 (ru) 2006-06-30
EA014525B1 true EA014525B1 (ru) 2010-12-30

Family

ID=33563705

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600037A EA014525B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитела к склеростину и способы их применения
EA201001528A EA022991B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитело к склеростину и его применение

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001528A EA022991B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Антитело к склеростину и его применение

Country Status (25)

Country Link
US (3) US20040009535A1 (ru)
EP (3) EP2341071A1 (ru)
JP (2) JP4818107B2 (ru)
KR (1) KR101221147B1 (ru)
CN (2) CN103319596A (ru)
AU (1) AU2004253870B2 (ru)
BR (1) BRPI0411535A (ru)
CA (1) CA2529578C (ru)
CY (1) CY1114701T1 (ru)
DK (1) DK1638999T3 (ru)
EA (2) EA014525B1 (ru)
ES (1) ES2428767T3 (ru)
HK (1) HK1088907A1 (ru)
HR (1) HRP20131014T1 (ru)
IL (2) IL172599A (ru)
ME (2) ME00023B (ru)
NO (1) NO20060235L (ru)
NZ (1) NZ544617A (ru)
PL (1) PL1638999T3 (ru)
PT (1) PT1638999E (ru)
RS (1) RS52769B (ru)
SG (1) SG185824A1 (ru)
SI (1) SI1638999T1 (ru)
WO (1) WO2005003158A2 (ru)
ZA (1) ZA200600384B (ru)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
EP1721979B1 (en) 1998-11-27 2010-09-15 Ucb, S.A. Compositions and methods for increasing bone mineralisation
US7332276B2 (en) * 2002-03-01 2008-02-19 Celltech R&D, Inc. Methods to increase or decrease bone density
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US20040023356A1 (en) 2002-06-14 2004-02-05 Robb Krumlauf Wise/Sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
CN1835974A (zh) 2003-06-16 2006-09-20 细胞技术研究与发展公司 对硬化素特异的抗体和用于增加骨矿化的方法
US8637506B2 (en) * 2003-09-22 2014-01-28 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8367822B2 (en) * 2003-09-22 2013-02-05 Enzo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US20100041599A1 (en) * 2006-11-14 2010-02-18 Dakai Liu Compositions and methods for bone formation, bone remodeling and toxin protection
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US9052324B2 (en) 2004-05-19 2015-06-09 Enzo Biochem, Inc. Compounds and assays for controlling Wnt activity
US8343922B2 (en) * 2004-05-19 2013-01-01 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for the stimulation or enhancement of bone formation and the self-renewal of cells
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
US20100183695A1 (en) 2004-05-27 2010-07-22 John Knopf Cerberus/coco derivatives and uses thereof
EP1771470B1 (en) 2004-07-23 2013-06-26 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US7998500B2 (en) * 2005-08-04 2011-08-16 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
US7901710B2 (en) * 2005-08-04 2011-03-08 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US8202546B2 (en) * 2005-08-04 2012-06-19 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US8263137B2 (en) * 2005-08-04 2012-09-11 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
CN103432568A (zh) 2005-11-23 2013-12-11 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
WO2007124486A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Childrens Hospital Los Angeles Bmp4 inhibitors
US20100036091A1 (en) * 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
EP2460828A3 (en) * 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
EP2099471A2 (en) 2006-12-08 2009-09-16 Acceleron Pharma, Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
DK3345607T3 (da) 2006-12-29 2022-11-21 Ossifi Mab Llc Fremgangsmåder til ændring af knoglevækst ved indgivelse af sost- eller wise-antagonist eller -agonist
EP2599495A1 (en) 2007-02-01 2013-06-05 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Treating or Preventing Breast Cancer
TW201627320A (zh) 2007-02-02 2016-08-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CA2677605C (en) 2007-02-09 2016-01-19 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
PL2131860T3 (pl) 2007-03-20 2014-05-30 Lilly Co Eli Przeciwciała przeciwko sklerostynie
US8133553B2 (en) 2007-06-18 2012-03-13 Zimmer, Inc. Process for forming a ceramic layer
US8309521B2 (en) 2007-06-19 2012-11-13 Zimmer, Inc. Spacer with a coating thereon for use with an implant device
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
WO2009038745A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
US8608049B2 (en) 2007-10-10 2013-12-17 Zimmer, Inc. Method for bonding a tantalum structure to a cobalt-alloy substrate
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
CA2707400A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Amgen Inc. Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies
WO2009110215A1 (ja) * 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
EP2320896A4 (en) * 2008-07-03 2012-08-29 Osteogenex Inc VINPOCETINE AND EBURNAMONINE DERIVATIVES FOR THE PROMOTION OF BONE GROWTH
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
LT2340031T (lt) 2008-08-14 2019-08-12 Acceleron Pharma Inc. Gdf gaudyklės, skirtos naudoti anemijos gydymui
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
AU2010211438B2 (en) * 2009-02-06 2016-04-14 Academisch Ziekenhuis Maastricht Truncated cystine-knot proteins
ES2575695T3 (es) * 2009-03-30 2016-06-30 Acceleron Pharma Inc. Antagonistas de BMP-ALK3 y sus usos para estimular el crecimiento óseo
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
US8178488B2 (en) 2009-06-08 2012-05-15 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
CN102656187A (zh) 2009-06-12 2012-09-05 阿塞勒隆制药公司 截短的actriib-fc融合蛋白
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
AU2011239935A1 (en) 2010-04-16 2012-11-08 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
AU2011250920B2 (en) 2010-05-14 2015-05-21 Amgen Inc. High concentration antibody formulations
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
LT3111954T (lt) 2010-11-05 2019-07-10 Novartis Ag Ankilozuojančio spondilito gydymo būdai, naudojant anti-il-17 antikūnus
CA2817008A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
JP2014509588A (ja) 2011-03-01 2014-04-21 アムジエン・インコーポレーテツド 二特異性結合剤
CN103517920B (zh) 2011-03-25 2018-04-17 安进公司 抗硬化蛋白(sclerostin)抗体晶体及其制剂
FR2974061B1 (fr) 2011-04-13 2013-06-07 Michelin Soc Tech Procede et dispositif de comptage du nombre d'atterrissages d'un pneumatique d'un aeronef
EP3404041B1 (en) 2011-04-19 2020-07-22 Amgen Inc. Method for treating osteoporosis
JP2014515759A (ja) 2011-04-29 2014-07-03 ノバルティス アーゲー 扁平上皮がんを治療する方法関連出願
US8895254B2 (en) * 2011-07-19 2014-11-25 University Health Network Biomarkers for ankylosing spondylitis
LT2739311T (lt) 2011-08-04 2018-06-11 Amgen Inc. Kaulų tarpų defektų gydymo būdas
EP3453711B1 (en) 2011-09-02 2021-08-18 The Regents of the University of California Llp2a- bisphosphonate conjugates for osteoporosis treatment
MX354270B (es) 2011-12-28 2018-02-21 Amgen Inc Uso de un anticuerpo antiesclerostina en el tratamiento de la pérdida ósea alveolar. .
EP2869844B2 (en) 2012-07-05 2023-06-21 UCB Pharma S.A. Treatment for bone diseases
KR20210091358A (ko) 2012-11-02 2021-07-21 셀진 코포레이션 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
DK2976359T4 (da) * 2013-03-20 2022-06-13 Genzyme Corp Fremgangsmåder til behandling af osteogenesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
MX2016016531A (es) 2014-06-13 2017-04-25 Acceleron Pharma Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de las ulceras.
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
HUE062189T2 (hu) 2014-12-03 2023-09-28 Celgene Corp Aktivin-ACTRII-antagonisták és alkalmazások mielodiszpláziás szindróma kezelésére
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
CN110214021A (zh) 2016-08-08 2019-09-06 安进公司 使用抗硬化蛋白抗体改善结缔组织附着的方法
EP3478719B1 (en) 2016-12-21 2021-01-20 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
RU2651091C1 (ru) * 2016-12-22 2018-04-18 Федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) Способ диагностики остеомиелита у детей
WO2019154410A1 (zh) * 2018-02-12 2019-08-15 翼高生物科技有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途
AU2019243595A1 (en) 2018-03-30 2020-09-17 Amgen Inc. C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
AU2019316575A1 (en) 2018-08-10 2021-03-04 Amgen Inc. Method of preparing an antibody pharmaceutical formulation
AU2020331282A1 (en) 2019-08-12 2022-03-31 Amgen Inc. Anti-sclerostin antibody formulations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2001092308A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
WO2003106657A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US751929A (en) 1904-02-09 Ash-pan
US793398A (en) 1905-03-24 1905-06-27 Herschel A Schermerhorn Fastening for wagon eng-gates.
US4018884A (en) 1975-06-26 1977-04-19 Hoffmann-La Roche Inc. Fluorogenic materials and labeling techniques
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4359535A (en) 1979-10-01 1982-11-16 George Pieczenik Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences
US4528266A (en) 1979-10-01 1985-07-09 George Pieczenik Method of inserting unique DNA sequences into DNA vectors
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4427115A (en) 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58117537A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Toray Ind Inc 感光性樹脂組成物
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
EP0198015B2 (en) 1984-10-02 1995-07-19 Biogen, Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
US5272254A (en) 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
US4801542A (en) 1984-10-12 1989-01-31 Zymogenetics, Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
SG64329A1 (en) 1984-11-16 1999-04-27 American Cyanamid Co Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4897255A (en) 1985-01-14 1990-01-30 Neorx Corporation Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4744981A (en) 1985-10-17 1988-05-17 Neorx Corporation Trichothecene antibody conjugates
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
DE3854823T2 (de) 1987-05-01 1996-05-23 Stratagene Inc Mutagenesetest durch Verwendung von nicht menschlichen Lebewesen, die Test-DNS-Sequenzen enthalten
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8723661D0 (en) 1987-10-08 1987-11-11 British Bio Technology Synthetic gene
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
EP0313874B1 (en) 1987-10-30 1994-04-13 American Cyanamid Company Disulfur analogs of LL-E33288 antitumor agents
US5254678A (en) 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
EP0329184A3 (en) 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US4988496A (en) 1988-05-31 1991-01-29 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5221778A (en) 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
CA1340288C (en) 1988-09-02 1998-12-29 Robert Charles Ladner Generation and selection of novel binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
GB8903022D0 (en) 1989-02-10 1989-03-30 Celltech Ltd Chemical compounds
US5175383A (en) 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
ES2084698T5 (es) 1989-05-04 2005-03-01 Southern Research Institute Procedimiento de encapsulacion.
GB8914543D0 (en) 1989-06-23 1989-08-09 Parker David Chemical compounds
AU648261B2 (en) 1989-08-18 1994-04-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5359051A (en) 1990-01-11 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Compounds useful in the synthesis of nucleic acids capable of cleaning RNA
SG46445A1 (en) 1990-01-26 1998-02-20 Immunomedics Inc Vaccines against cancer and infectious diseases
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
ES2217250T3 (es) 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
AU662304B2 (en) 1990-10-22 1995-08-31 Fox Chase Cancer Center DNA construct for providing RNA therapy
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
DE4135543A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes core-streptavidin
US5203975A (en) 1991-10-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for cathodic electrodeposition of a clear coating over a conductive paint layer
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
ES2102007T3 (es) 1992-01-23 1997-07-16 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de fragmentos de anticuerpo monomeras y dimeras.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0578515A3 (en) 1992-05-26 1995-05-10 Bristol Myers Squibb Co Humanized monoclonal antibodies.
WO1993024631A1 (en) 1992-05-29 1993-12-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company PRODUCTION OF STREPTAVIDIN FROM $i(BACILLUS SUBTILIS)
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
JPH09507741A (ja) 1992-06-10 1997-08-12 アメリカ合衆国 ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5928647A (en) 1993-01-11 1999-07-27 Dana-Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic T lymphocyte responses
IL108719A0 (en) 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
NZ267838A (en) 1993-06-07 1997-12-19 Genentech Inc Preparation of an hiv gp 120 subunit vaccine involving determining a neutralising epitope in the v2 and/or c4 domains
WO1995002566A1 (en) 1993-07-16 1995-01-26 Ontogen Corporation Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
WO1995004277A1 (en) 1993-08-03 1995-02-09 Sphinx Pharmaceuticals Corporation A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
EP0733103B1 (en) 1993-11-09 2004-03-03 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
AU1068295A (en) 1993-12-09 1995-06-27 Novartis Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
DE69406806D1 (de) 1993-12-15 1997-12-18 Combichem Inc Kombinatorische Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Verwendung
EP0734398B1 (en) 1993-12-15 2002-02-27 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
AU690656B2 (en) 1994-03-11 1998-04-30 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
EP0756628B1 (en) 1994-04-29 2007-11-14 Curis, Inc. Morphogenic protein-specific cell surface receptors and uses therefor
JPH10500112A (ja) 1994-05-06 1998-01-06 ファーマコピーア，インコーポレイテッド 組合せ ジヒドロベンゾピラン ライブラリー
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
CA2220912A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Gregg A. Hastings Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
NZ332566A (en) 1996-05-22 2000-08-25 Novopharm Biotech Inc Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
WO1998046588A2 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
WO1998056915A2 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
WO1999006554A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN MUSCLE AND OTHER MESODERMAL TISSUES
US6815201B2 (en) 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
EP1054689B1 (en) 1998-02-12 2003-09-10 Immune Complex, Corporation Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives
US6544485B1 (en) 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
MXPA01007895A (es) 1999-02-03 2003-07-21 Biosante Pharmaceuticals Inc Particulas terapeuticas de fosfato de calcio, metodos de manufactura y usos.
JP2003501087A (ja) 1999-06-09 2003-01-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の治療のための組成物と方法
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
AR029814A1 (es) 2000-03-02 2003-07-16 Amgen Inc Moleculas emparentadas con chordin 2 y usos de las mismas
US20040132021A1 (en) 2000-06-19 2004-07-08 Wendy Balemans Osteolevin gene polymorphisms
AU2002216610A1 (en) 2000-09-01 2002-04-02 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
FR2838379B1 (fr) 2002-04-12 2005-06-24 Valeo Climatisation Dispositif de purification de l'air de l'habitacle d'un vehicule automobile
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
DE10255152A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Von Langen Ursula Lang Schadstoffsauger
US20040141875A1 (en) 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
CN1835974A (zh) * 2003-06-16 2006-09-20 细胞技术研究与发展公司 对硬化素特异的抗体和用于增加骨矿化的方法
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
PL2131860T3 (pl) * 2007-03-20 2014-05-30 Lilly Co Eli Przeciwciała przeciwko sklerostynie
AR068767A1 (es) * 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US6495736B1 (en) * 1998-11-27 2002-12-17 Darwin Discovery, Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2001092308A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
WO2003106657A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALEMANS W. ET AL.: "INCREASED BONE DENSITY IN SCLEROSTEOSIS IS DUE TO THE DEFICIENCY OFA NOVEL SECRETED PROTEIN (SOST)", HUMAN MOLECULAR GENETICS, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 10, no. 5, 2001, pages 537-543, XP001058218, ISSN: 0964-6906, the whole document *
BRUNKOW M.E. ET AL.: "BONE DYSPLASIA SCLEROSTEOSIS RESULTS FROM LOSS OF THE SOST GENE PRODUCT, A NOVEL CYSTINE KNON-CONTAINING PROTEIN", AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS, CHICAGO, IL, US, vol. 68, no. 3, 2001, pages 577-589, XP001052847, ISSN: 0002-9297, figure 6 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100151524A1 (en) 2010-06-17
NO20060235L (no) 2006-03-14
EP1638999A2 (en) 2006-03-29
JP2011246482A (ja) 2011-12-08
RS52769B (sr) 2013-10-31
CA2529578A1 (en) 2005-01-13
EA201001528A1 (ru) 2011-06-30
WO2005003158A3 (en) 2005-05-26
US20060233801A1 (en) 2006-10-19
PL1638999T3 (pl) 2014-04-30
IL172599A0 (en) 2006-04-10
EA200600037A1 (ru) 2006-06-30
CN1835968B (zh) 2013-01-30
EP2338906A1 (en) 2011-06-29
NZ544617A (en) 2009-11-27
JP4818107B2 (ja) 2011-11-16
KR20060064568A (ko) 2006-06-13
CN1835968A (zh) 2006-09-20
SI1638999T1 (sl) 2013-12-31
MEP3108A (xx) 2010-02-10
IL172599A (en) 2016-05-31
HK1088907A1 (en) 2006-11-17
JP2008505843A (ja) 2008-02-28
EP1638999B1 (en) 2013-07-24
KR101221147B1 (ko) 2013-01-10
CY1114701T1 (el) 2016-10-05
EA022991B1 (ru) 2016-04-29
PT1638999E (pt) 2013-09-03
ES2428767T3 (es) 2013-11-11
US7985834B2 (en) 2011-07-26
ZA200600384B (en) 2008-10-29
CA2529578C (en) 2014-11-18
DK1638999T3 (da) 2013-10-14
SG185824A1 (en) 2012-12-28
WO2005003158A2 (en) 2005-01-13
AU2004253870B2 (en) 2011-11-10
EP2341071A1 (en) 2011-07-06
HRP20131014T1 (hr) 2013-12-20
IL222756A0 (en) 2012-12-31
US7578999B2 (en) 2009-08-25
CN103319596A (zh) 2013-09-25
BRPI0411535A (pt) 2006-08-01
US20040009535A1 (en) 2004-01-15
AU2004253870A1 (en) 2005-01-13
ME00023B (me) 2010-06-10
RS20050932A (en) 2008-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014525B1 (ru) Антитела к склеростину и способы их применения
EA015166B1 (ru) Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
AU2016201712B2 (en) ActRIIb antagonists and dosing and uses thereof
ES2272093T5 (es) Composiciones y métodos para incrementar la mineralización de la substancia ósea
JP2021054839A (ja) シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
US20060252724A1 (en) Method and composition for modulating bone growth
CN101641373B (zh) Dkk-1的特异性抗体
JP2022048160A (ja) Ｂｍｐ－ａｌｋ３アンタゴニストおよび骨成長促進のためのその使用
JP2021097697A (ja) フォリスタチン関連融合タンパク質およびその使用
JP6096826B2 (ja) Ｎｐｐ１融合タンパク質
JP2016041733A (ja) アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
CN110036025A (zh) 变体ActRIIB蛋白及其用途
JPH06508031A (ja) ヘレグリンの構造、生産および用途
EA014112B1 (ru) Моноклональное антитело к миостатину и способы его применения
EA015589B1 (ru) Антитела против миостатина и их применение
EA011449B1 (ru) Моноклональное антитело человека к cd40 и способы его применения
JP2009517051A5 (ru)
EP1370287A2 (en) Method and composition for modulating bone growth
WO2008150025A1 (ja) 新しい骨量増加薬
CN102282165A (zh) Gdnf剪接变体及其用途
JP2002332300A (ja) 抗ｓｅｍｐ１抗体、その製法及び使用
US20050239094A1 (en) Compositions and methods for inducing and regulating bone formation
AU2016202691B2 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
MXPA05013796A (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
AU2012200748A1 (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ MD