JP2015143276A - Ｂｔｎｌ９タンパク質、核酸および抗体ならびにそれらの使用 - Google Patents

Ｂｔｎｌ９タンパク質、核酸および抗体ならびにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＢＴＮＬ９タンパク質、核酸および抗体ならびにそれらの使用の提供。
【解決手段】本発明は、新規のＢＴＮＬ９タンパク質（ヒトＢＴＮＬ９タンパク質の多量体、フラグメント、およびバリアントが含まれる）を提供する。さらに、ＢＴＮＬ９タンパク質に結合することができる抗体およびＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸を提供する。ＢＴＮＬ９タンパク質およびそのアゴニストまたはアンタゴニストの使用を記載する。本発明は、ブチロフィリン様タンパク質ならびにそのフラグメント、バリアント、および誘導体、かかるタンパク質をコードする核酸、これらのタンパク質に結合する抗体、ならびに、これらのタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。
【選択図】図８

Description

関連出願の引用
本願は、本明細書中に参考として援用される、２０１０年４月９日に出願された米国仮出願第６１／３２２，８００号の米国特許法第１１９条の下での優先権を主張する。
分野
本発明は、ブチロフィリン様タンパク質ならびにそのフラグメント、バリアント、および誘導体、かかるタンパク質をコードする核酸、これらのタンパク質に結合する抗体、ならびに、これらのタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。かかる分子を含む薬学的組成物およびかかる分子またはかかる分子を含む組成物の使用もまた意図する。
背景
免疫応答または炎症応答の調整は、種々の治療状況で有益であり得る。免疫応答または炎症応答の下方調整は、各種自己免疫疾患または炎症性疾患の処置で望ましい場合もある。任意の免疫応答の上方調整は、例えば、特定の抗原（例えば、ワクチン中に含まれる抗原または癌細胞もしくは線維性疾患を媒介する細胞上で優先的に発現する抗原）に対する応答を増幅するのに有益であり得る。したがって、免疫応答または炎症応答を調整することができる分子は、潜在的に種々の治療状況で治療的に有益である。本発明は、不適切なおよび／または異常な炎症および／または免疫応答によって特徴づけられる疾患の診断および処置のための治療薬を提供する。これらの薬剤のいくつかは免疫応答を刺激することができる。他の薬剤は、炎症応答および／または免疫応答を阻害することができる。
概要
本発明は、ＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸、およびＢＴＮＬ９タンパク質に結合する抗体を提供する。より具体的には、本明細書中に記載のＢＴＮＬ９タンパク質は、多量体タンパク質または融合タンパク質であり、これらは単離タンパク質および／または可溶性タンパク質であり得る。ＢＴＮＬ９タンパク質ならびにＢＴＮＬ９に結合するアンタゴニスト抗体およびアゴニスト抗体の使用も提供する。
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質であって、ここで、（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号１のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長であり、ここで、多量体が少なくとも三量体であり、ここで、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質を包含する。少し異なる実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質であって、ここで、（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長であり、ここで、上記多量体の分子量が、（ａ）の単量体ポリペプチドの分子量の約３倍よりも大きく、そして／または（ａ）の単量体ポリペプチドの分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍であり、ここで、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質を提供する。これらの実施形態のいずれかにおける多量体のＢＴＮＬ９タンパク質はまた、少なくとも三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体（ｏｃｔｏｍｅｒ）、九量体、十量体、および／またはより高次の多量体であり得る。このことは、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質が三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体（ｏｃｔｏｍｅｒ）、九量体、十量体、および／またはより高次の多量体であり得ることも意味する。多量体のＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２のアミノ酸３５、３６、３７、３８、３９、または４０〜２５３、２５４、２５５、２５６、または２５７由来のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、多量体ＢＮＴＬ９タンパク質は配列番号２のアミノ酸２５８〜２７７を含まず、いくつかの実施形態では、別のポリペプチド（例えば、抗体のＦｃ部分など）を含むことができる。かかるＦｃ部分は、（ｉ）天然の（ｎａｔｉｖｅ）ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列あるいは（ｉｉ）天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して単一のアミノ酸の１５個以下、１０個以下、または５個以下の挿入、欠失、または置換を有する天然のヒトＦｃ領域のものと実質的に類似するアミノ酸配列を含むことができる。天然のヒトＦｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプの天然のヒトＦｃであり得る。多量体のＢＴＮＬ９タンパク質は、ホモ四量体、ホモ五量体、ホモ六量体、ホモ七量体、ホモ八量体、ホモ九量体、ホモ十量体、より高次のホモ多量体、ヘテロ多量体、または種の混合物であり得る。かかる多量体のＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸ならびにこれらの核酸を含むベクターおよび上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も提供する。
別の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって、ここで、ＢＴＮＬ９融合タンパク質のアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、第１のポリペプチドおよび（ｂ）第２のポリペプチドであって、ここで、ＢＴＮＬ９融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、第２のポリペプチドを含む、ＢＴＮＬ９融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、単離タンパク質および／または可溶性タンパク質であり得る。第２のポリペプチドは、抗体のＦｃ部分であって、ここで、上記Ｆｃ部分が、天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるか実質的に類似し、天然のヒトＦｃ領域と比較して単一のアミノ酸の５個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の挿入、欠失、あるいは置換を含むアミノ酸配列を有する、抗体のＦｃ部分であり得る。天然のヒトＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭアイソタイプの天然のヒトＦｃ領域であり得る。ＢＴＮＬ９融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７を含むことができる。ＢＴＮＬ９融合タンパク質は、配列番号１８と実質的に類似するアミノ酸配列を含むことができ、ここで上記アミノ酸配列は配列番号１８と比較して単一のアミノ酸の５個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の挿入、欠失、または置換を含み、そして／あるいはＢＴＮＬ９融合タンパク質は配列番号１８を含むことができる。ＢＴＮＬ９融合タンパク質は、少なくとも三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体であり得る。ＢＴＮＬ９融合タンパク質はリンカーを含むことができる。かかるＢＴＮＬ９融合タンパク質は多量体であり得、ここで、上記多量体の分子量は、単量体ＢＴＮＬ９融合タンパク質の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍である。かかるＢＴＮＬ９融合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびに上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号２の４０〜１４０位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と比較して単一のアミノ酸の５個以下または１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含む可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質であって、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質はまた、配列番号２の１６０〜２４８位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸１６０〜２４８と比較して単一のアミノ酸の２０個以下、１５個以下、１０個以下、１０個以下、または５個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含まず、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質を提供する。可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と比較して単一のアミノ酸の５個以下の挿入、欠失、または置換を含むことができる。あるいは、別の態様では、可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は、少なくとも三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体であり得る。かかるＢＴＮＬ９タンパク質はまた、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、より高次の多量体、またはこれらの種の混合物であり得る。かかる可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は多量体であり得、ここで、上記多量体の分子量は、単量体可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍である。かかる可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は、別のポリペプチド（例えば、抗体のＦｃフラグメントおよび／またはリンカーなど）をさらに含むことができる。かかる可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびに上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も提供する。
あるいは、可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２の１６０〜２４８位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸１６０〜２４８と比較して単一のアミノ酸の２０個以下、１５個以下、１０個以下、または５個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含むことができ、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質はまた、配列番号２の４０〜１４０位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含まず、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。かかる可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は、少なくとも三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、またはより高次の多量体であり得る。かかるＢＴＮＬ９タンパク質は、別のポリペプチド（例えば、抗体のＦｃフラグメントおよび／またはリンカーなど）をさらに含むことができる。かかる可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質は多量体であり得、ここで、上記多量体の分子量は、単量体可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍である。かかるＢＴＮＬ９融合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびに上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も提供する。
さらなる実施形態では、核酸によってコードされるＢＴＮＬ９融合タンパク質であって、ここで上記核酸が、以下：（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド３３４、３３７、３４０、または３４３〜９９０、９９３、９９６、９９９、または１００２由来のヌクレオチド配列からなるか、（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）配列番号１の配列からなるポリヌクレオチドとハイブリッド形成せず、（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをインフレームで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで上記融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、ＢＴＮＬ９融合タンパク質を提供する。ＢＴＮＬ９融合タンパク質はリンカー配列を含むことができ、単離タンパク質および／または可溶性タンパク質であり得る。かかるＢＴＮＬ９融合タンパク質は多量体であり得、ここで、上記多量体の分子量は、単量体ＢＴＮＬ９融合タンパク質の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍である。かかるＢＴＮＬ９融合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびに上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も提供する。
上記または下記で論じる任意のＢＴＮＬ９タンパク質は単離されそして／または可溶性であり得、複数のＢＴＮＬ９タンパク質分子を含む多量体または凝集種を含むことができる。多量体または凝集体中に含まれる単量体ＢＴＮＬ９タンパク質種の分子量を、還元条件下でのゲル電気泳動または還元条件下で実施するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定することができる。多量体種または凝集種の分子量を、非還元条件下で行うゲル電気泳動またはＳＥＣによって測定することができる。いくつかの実施形態では、多量体または凝集体の分子量は、単量体種の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍である。かかる多量体または凝集体の単量体ＢＴＮＬ９タンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸３５、３６、３７、３８、３９、または４０〜２５３、２５４、２５５、２５６、または２５７由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで、（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、ポリペプチド、または（ｃ）配列番号２と比較して単一のアミノ酸の２０個以下、１５個以下、１０個以下、または５個以下の挿入、欠失、または置換を含むことができることを除いて配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のポリペプチドに類似する配列を有するポリペプチドを含む。
別の態様では、ＢＴＮＬ９タンパク質および別のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸であって、ここで上記核酸が、（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド３３４、３３７、３４０、または３４３〜９９０、９９３、９９６、９９９、または１００２由来のヌクレオチド配列からなるか、（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、および（ｂ）配列番号１の配列からなるポリヌクレオチドとハイブリッド形成せず、（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをインフレームで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで上記融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、核酸を提供する。これらの核酸を含むベクターならびに上記ベクターおよび／または上記核酸を含む宿主細胞も意図する。
本発明は、上記で論じた任意のＢＴＮＬ９タンパク質（多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、および可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質が含まれる）の作製方法であって、ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を上記核酸の発現に適切な条件下の培地中にて培養する工程、および細胞塊または培養培地から、発現したＢＴＮＬ９タンパク質を回収する工程を含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するための方法であって、治療有効用量の（１）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列を含む任意のＢＴＮＬ９タンパク質または（２）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の５個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを患者に投与する工程を含み、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法を提供する。本方法は、本方法の実施のための上記で論じた可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質の使用を含むことになる。自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または線維性疾患であり得る。
さらなる態様では、Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、（１）配列番号２のアミノ酸３５、３６、３７、３８、３９、または４０〜２５３、２５４、２５５、２５６、または２５７由来のアミノ酸配列を含む任意のＢＴＮＬ９タンパク質または（２）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の５個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントをＴ細胞に添加する工程を含み、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激された増殖Ｔ細胞を阻害することができる、方法を提供する。本方法は、Ｔ細胞の増殖を阻害するための上記で論じた可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質の使用を包含する。Ｔ細胞の増殖のこの阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。
別の実施形態は、治療有効用量の抗ＢＴＮＬ９抗体を患者に投与する工程を含む、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するための方法であって、ここで上記抗ＢＴＮＬ９抗体が上記で論じた可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質の１つ、および／または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質によってＴ細胞の増殖阻害を増大させ、ここで上記抗ＢＴＮＬ９抗体が配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合する、方法を含む。
別の実施形態は、本明細書中に記載のように自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するための方法であって、治療有効用量の抗ＢＴＮＬ９抗体を患者に投与する工程を含み、ここで上記抗ＢＴＮＬ９抗体が配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合することができる、方法を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＴＮＬ９抗体は、細胞表面ＢＴＮＬ９タンパク質に結合し、ＢＴＮＬ９のＢ３０．２ドメインを介して細胞内シグナル伝達カスケードを誘導することができる。
さらなる方法は、治療有効量の配列番号２のアミノ酸３５〜２５７からなるＢＴＮＬ９タンパク質に結合する抗体を癌患者に投与する工程を含む上記患者に対する処置を含む。癌は、例えば、急性または慢性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ性白血病、リンパ性リンパ腫または皮膚リンパ腫、癌腫、肉腫、胸腺腫、縦隔の新生物、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、各種皮膚癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆管新生物、小腸、結腸、または直腸の癌、腎臓または尿管の癌、睾丸癌、尿道または陰茎の癌、婦人科系腫瘍、卵巣癌、骨の肉腫、内分泌系の癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、および形質細胞新生物であり得る。抗体はアンタゴニスト抗体であり得る。
最後に、癌細胞上に高度に発現する抗原および配列番号２のアミノ酸３５〜２５７からなるタンパク質に結合するアンタゴニスト抗体を患者に投与する工程を含む、癌に対して患者にワクチン接種するための方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１） （ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質であって、
（ａ）および（ｂ）の該ポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長であり、
該多量体が少なくとも三量体であり、
該多量体のＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、
単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目２） （ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド
を含む単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質であって、
（ａ）および（ｂ）の該ポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長であり、
該多量体の分子量が、（ａ）のポリペプチドの分子量の約３倍よりも大きく、
該多量体のＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、
単離された可溶性で多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目３） （ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９５％同一である、項目１または２に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４） （ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９７％同一である、項目１または２に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目５） （ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列を含む、項目１または２に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目６） 配列番号２のアミノ酸２５８〜２７７を含まない、項目１から５のいずれか１項に記載の多量体のＢＮＴＬ９タンパク質。
（項目７） （ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドがそれぞれ別のポリペプチドを含む、項目１から６のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目８） 前記別のポリペプチドが抗体のＦｃ部分である、項目７に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目９）（ｉ）前記Ｆｃ部分が天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を含むか、
（ｉｉ）該Ｆｃ部分が該天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して単一のアミノ酸の１５個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む、
項目８に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１０） （ｉｉ）の前記Ｆｃ部分が、前記天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を有する、項目９に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１１） （ｉｉ）の前記Ｆｃ部分が、前記天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して単一のアミノ酸の５個以下の挿入、欠失、または置換を有する、項目１０に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１２） 前記Ｆｃ部分がヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる、項目８から１１のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１３） 前記天然のヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１４） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目９から１３のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１５） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ２アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目９から１３のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１６） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ４アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目９から１３のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１７） ホモ四量体であるかまたはより高次のホモ多量体である、項目１から１６のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１８） ホモ四量体より高次のホモ多量体である、項目１６に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目１９） ヘテロ多量体である、項目１から１６のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目２０） 前記多量体のＢＴＮＬ９タンパク質の分子量が、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む単量体ポリペプチドの分子量の少なくとも約８倍大きく、該単量体ポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、項目１から１９のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目２１） ＢＴＮＬ９融合タンパク質であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって、該ＢＴＮＬ９融合タンパク質のアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、第１のポリペプチド、および
（ｂ）第２のポリペプチド
を含み、
該ＢＴＮＬ９融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、ＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２２） 前記第２のポリペプチドが抗体のＦｃ部分である、項目２１に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２３） 前記Ｆｃ部分が、天然のヒトＦｃ領域と比較して単一のアミノ酸の１５個以下の挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２２に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２４） 前記Ｆｃ部分が天然のヒトＦｃ領域と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２２に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２５） 前記Ｆｃ部分が天然のヒトＦｃ領域と比較して単一のアミノ酸の５個以下の挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２２に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２６） 前記Ｆｃ部分がＦｃＲｎに結合することができる、項目２３から２５のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２７） 天然のヒトＦｃ領域を含む、項目２６に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２８） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目２３から２７のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目２９） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ２アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目２３から２７のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３０） 前記天然のヒトＦｃ領域がＩｇＧ４アイソタイプの天然のヒトＦｃ領域である、項目２３から２７のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３１） 前記第１のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９５％同一である、項目２１から３０のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３２） 前記第１のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸３５〜２５７を含む、項目３１に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３３） 配列番号１９と実質的に類似するアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、配列番号１９と比較して単一のアミノ酸の２０個以下の挿入、欠失、または置換を含む、項目２１から３２のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３４） 配列番号１９と比較して単一のアミノ酸の１５個以下の挿入、欠失、または置換を含む、項目３３に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３５） 配列番号１９と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含む、項目３４に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３６） 配列番号１９と比較して単一のアミノ酸の５個以下の挿入、欠失、または置換を含む、項目３５に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３７） 前記アミノ酸配列が配列番号１９を含む、項目３６に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３８） 前記ＢＴＮＬ９融合タンパク質は、該融合タンパク質の分子量が該融合タンパク質の単量体種の分子量の少なくとも約８倍であるように凝集している、項目２１から３７のいずれか１項に記載のＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目３９） 配列番号２の４０〜１４０位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含む可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質であって、
該ＢＴＮＬ９タンパク質はまた、配列番号２の１６０〜２４８位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸１６０〜２４８と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含まず、
該ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４０） 配列番号２の１６０〜２４８位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸１６０〜２４８と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含む可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質であって、
該ＢＴＮＬ９タンパク質はまた、配列番号２の４０〜１４０位にわたる配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸４０〜１４０と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含まず、
該ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４１） 核酸によってコードされるＢＴＮＬ９融合タンパク質であって、該核酸が、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド３３４〜１００２のヌクレオチド配列からなるか、または
（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のポリヌクレオチドとハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよび
（ｂ）配列番号１の配列からなるポリヌクレオチドとハイブリッド形成せず、（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをインフレームで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含み、
該融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、ＢＴＮＬ９融合タンパク質。
（項目４２） リンカー配列を含む、項目１から４１のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４３） 項目１、３から１６、１９から３７、および３９から４２のいずれか１項に記載の、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質であって、該タンパク質は、凝集した該タンパク質の分子量が該タンパク質の単量体種の分子量の約３倍よりも大きいように凝集している、項目１、３から１６、１９から３７、および３９から４２のいずれか１項に記載の、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４４） 項目４３に記載の、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質であって、該タンパク質は、凝集した該タンパク質の分子量が該タンパク質の単量体種の分子量の少なくとも約８倍であるように凝集している、項目４３に記載の、多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質。
（項目４５） 項目１から４４のいずれか１項に記載の多量体のＢＴＮＬ９タンパク質、ＢＴＮＬ９融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする単離された核酸。
（項目４６） ＢＴＮＬ９タンパク質および別のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸であって、該核酸が、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド３３４〜１００２のヌクレオチド配列からなるか、または
（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のポリヌクレオチドとハイブリッド形成する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号１の配列からなるポリヌクレオチドとハイブリッド形成せず、（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをインフレームで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含み、
該融合タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、核酸。
（項目４７） 項目４５または４６に記載の核酸を含むベクター。
（項目４８） 項目４５または４６に記載の核酸または項目４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目４９） ＢＴＮＬ９タンパク質の作製方法であって、
項目４８に記載の宿主細胞を前記核酸の発現に適切な条件下の培地中にて培養する工程、および
該細胞または培養培地から、発現したタンパク質を回収する工程
を含む、方法。
（項目５０） 自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者の処置方法であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の２０個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列
を含む治療有効用量のＢＴＮＬ９タンパク質を該患者に投与する工程を含み、
該ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目５１） 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、喘息、または線維性疾患からなる群から選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５２） 前記自己免疫疾患または炎症性疾患がクローン病である、項目５１に記載の方法。
（項目５３） 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が潰瘍性大腸炎である、項目５１に記載の方法。
（項目５４） 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が線維性疾患である、項目５１に記載の方法。
（項目５５） Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の２０個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列
を含むＢＴＮＬ９タンパク質を該Ｔ細胞に添加する工程を含み、
該ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目５６） 前記阻害がｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、項目５５に記載の方法。
（項目５７） 前記阻害がｉｎ ｖｉｖｏで起こる、項目５５に記載の方法。
（項目５８） 自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者の処置方法であって、治療有効用量の抗ＢＴＮＬ９抗体を該患者に投与する工程を含み、
該抗ＢＴＮＬ９抗体が配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列を含むＢＴＮＬ９タンパク質によってＴ細胞の増殖阻害を増大させ、
該抗ＢＴＮＬ９抗体が配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合する、方法。
（項目５９） 治療有効量の配列番号２のアミノ酸３５〜２５７からなるＢＴＮＬ９タンパク質に結合する抗体を癌患者に投与する工程を含む、癌患者の処置方法。
（項目６０） 前記癌が、急性または慢性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ性白血病、リンパ性リンパ腫または皮膚リンパ腫、癌腫、肉腫、胸腺腫、縦隔の新生物、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、各種皮膚癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆管新生物、小腸、結腸、または直腸の癌、腎臓または尿管の癌、睾丸癌、尿道または陰茎の癌、婦人科系腫瘍、卵巣癌、骨の肉腫、内分泌系の癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、および形質細胞新生物からなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１） 前記抗体がアンタゴニスト抗体である、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２） 癌に対して患者にワクチン接種するための方法であって、癌細胞に高度に発現する抗原および配列番号２のアミノ酸３５〜２５７からなるタンパク質に結合するアンタゴニスト抗体を該患者に投与する工程を含む、方法。
（項目６３） 自己免疫状態または炎症状態を有する患者を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者からＴ細胞を取り出す工程、
（ｂ）該Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体を含むタンパク質とＢＴＮＬ９タンパク質との組み合わせで刺激する工程であって、該ＢＴＮＬ９タンパク質が、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７とのアラインメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の２０個以下の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列
を含む、刺激する工程、
（ｃ）刺激されたＴ細胞を採取する工程、および
（ｄ）採取したＴ細胞を該患者に戻す工程
を含み、該ＢＴＮＬ９タンパク質が抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目６４） 前記ＢＴＮＬ９タンパク質が、（ｂ）（ｉｉｉ）のＢＴＮＬ９タンパク質であり、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の１０個以下の挿入、欠失、または置換を有する、項目６３に記載の方法。
（項目６５） 前記ＢＴＮＬ９タンパク質が、配列番号２のアミノ酸３５〜２５７の配列と比較して単一のアミノ酸の５個以下の挿入、欠失、または置換を有する、項目６４に記載の方法。
（項目６６） 前記ＢＴＮＬ９タンパク質が（ｂ）（ｉ）のＢＴＮＬ９タンパク質である、項目６３に記載の方法。
（項目６７） 前記自己免疫状態または炎症状態が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、喘息、または線維性疾患からなる群から選択される、項目６３から６６のいずれか１項に記載の方法。
ブチロフィリン様（ＢＴＮＬ）タンパク質ファミリーの一部であるヒトタンパク質のドメイン構造を図示している。各楕円または円は、タンパク質ドメインを示す。ドメインを以下のように示す：
Figure 2015143276
 、免疫グロブリン可変領域様（ＩｇＶ様）ドメイン；
Figure 2015143276
 、免疫グロブリン定常領域様（ＩｇＣ様）ドメイン；
Figure 2015143276
 、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン；
Figure 2015143276
 、膜貫通ドメイン；および
Figure 2015143276
 、Ｂ３０．２ドメイン。特定のドメイン構造を使用して同定されていない領域を横線で示す。
この図は、種々の初代ヒト免疫細胞に存在するＢＴＮＬ９ｍＲＮＡの相対量を示す。細胞を正常なヒトドナーのロイコパックまたは全血から単離し、ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＨＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０）へのハイブリッド形成によって評価した。縦軸は、ＲＯＳＥＴＴＡ ＲＥＳＯＬＶＥＲ（登録商標）を使用して生成したＢＴＮＬ９ｍＲＮＡ発現の強度値を示す。試験した種々の細胞型を、以下のようにｘ軸に沿って示す：１、末梢血単核細胞；２、ＣＤ３＋細胞；３、ＣＤ４＋細胞；４、ＣＤ８＋細胞；５、調節Ｔ細胞；６、ＣＤ１９＋細胞；７、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；８、ＮＫ−Ｔ細胞；９、単球；１０、マクロファージ；１１、好酸球；１２、好中球；１３、好塩基球；および１４、血小板。方法を実施例１に詳述している。 この図は、マイクロアレイ上のＢＴＮＬ９プローブへのハイブリッド形成によって決定した場合の種々の成人ヒト組織におけるＢＴＮＬ９ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す。ＢＴＮＬ９ｍＲＮＡ発現の強度値を縦軸上に示す。種々の組織を、以下のように横軸上に示す：１、副腎；２、膀胱；３、膀胱癌腫；４、骨髄；５、骨髄単核細胞；６、脳；７、乳房；８、結腸；９、結腸腺癌細胞；１０、正常な外見の結腸生検の辺縁部；１１、心臓；１２、過形成性前立腺；１３、非ホジキンリンパ腫患者由来の回腸；１４、正常な外見の回腸生検由来の辺縁部；１５、腎臓；１６、喉頭由来の扁平上皮癌腫細胞；１７、正常な外見の喉頭生検由来の辺縁部；１８、肝臓；１９、肺；２０、卵巣；２１、胎盤；２２、前立腺；２３、骨格筋；２４、皮膚；２５、小腸；２６、脾臓；２７、精巣；２８、胸腺；および２９、白色脂肪組織。方法を実施例１に記載している。 この図は、種々のタンパク質（以下：（１）
Figure 2015143276
 、１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ調製物由来のＦｃフラグメント；２）
Figure 2015143276
 、２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ調製物由来のＦｃフラグメント；３）
Figure 2015143276
 、０．５μｇ／ｍｌのヒトＢ７−２：Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）；４）
Figure 2015143276
 、５μｇ／ｍｌのマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ融合タンパク質；５）
Figure 2015143276
 、１０μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃ；および６）
Figure 2015143276
 、２μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃが含まれる）の存在下にて抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）抗体で活性化されたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖レベルを示す。レーン４〜６上のアスタリスクは、これらの結果がコントロールアッセイの結果よりも有意に低いことを示す。方法を実施例３に記載している。
この図は、種々のタンパク質：以下（（１）
Figure 2015143276
 、さらなるタンパク質なし；（２）
Figure 2015143276
 、１０μｇ／ｍｌのＴ細胞の増殖に影響を及ぼさないことが公知のＦｃ融合タンパク質（ｐ７．５−Ｆｃ）；（３）
Figure 2015143276
 、２．５μｇ／ｍｌのｐ７．５−Ｆｃ；（４）
Figure 2015143276
 、２０μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃ；（５）
Figure 2015143276
 、１０μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９−Ｆｃ；（６）
Figure 2015143276
 、５μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃ；（７）
Figure 2015143276
 、２．５μｇ／ｍｌのヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃ；および（８）
Figure 2015143276
 、１０μｇ／ｍｌのマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質が含まれる）の存在下にて抗ＣＤ３抗体で活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖レベルを示す。レーン４および８上のアスタリスクは、これらのデータがレーン２中に示したコントロールアッセイのデータと有意に異なることを示す。方法を実施例４に記載している。
図６Ａ〜６Ｅは、抗ＣＤ３抗体および種々のさらなるタンパク質の存在下または非存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による種々のサイトカインの産生レベルを示す。パネル６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および６Ｅは、示すようにそれぞれインターロイキン−２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１７、およびインターロイキン−１３のレベルを示す。パネル６Ａ〜６Ｅ中の棒グラフにおけるレーンは、以下：１）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用しない細胞；２）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用するがさらなるタンパク質を使用しない細胞；３）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＩｇＧの調製物を使用した細胞；４）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ｐ７．５−Ｆｃ融合タンパク質を使用した細胞；５）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびＨＢ１５−Ｆｃ融合タンパク質（Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさないことが公知）を使用した細胞；６）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質を使用した細胞；および７）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質を使用した細胞を含むアッセイに由来する。方法を実施例５に記載している。
図６Ａ〜６Ｅは、抗ＣＤ３抗体および種々のさらなるタンパク質の存在下または非存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による種々のサイトカインの産生レベルを示す。パネル６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および６Ｅは、示すようにそれぞれインターロイキン−２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１７、およびインターロイキン−１３のレベルを示す。パネル６Ａ〜６Ｅ中の棒グラフにおけるレーンは、以下：１）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用しない細胞；２）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用するがさらなるタンパク質を使用しない細胞；３）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＩｇＧの調製物を使用した細胞；４）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ｐ７．５−Ｆｃ融合タンパク質を使用した細胞；５）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびＨＢ１５−Ｆｃ融合タンパク質（Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさないことが公知）を使用した細胞；６）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質を使用した細胞；および７）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質を使用した細胞を含むアッセイに由来する。方法を実施例５に記載している。
図６Ａ〜６Ｅは、抗ＣＤ３抗体および種々のさらなるタンパク質の存在下または非存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による種々のサイトカインの産生レベルを示す。パネル６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および６Ｅは、示すようにそれぞれインターロイキン−２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１７、およびインターロイキン−１３のレベルを示す。パネル６Ａ〜６Ｅ中の棒グラフにおけるレーンは、以下：１）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用しない細胞；２）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用するがさらなるタンパク質を使用しない細胞；３）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＩｇＧの調製物を使用した細胞；４）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ｐ７．５−Ｆｃ融合タンパク質を使用した細胞；５）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびＨＢ１５−Ｆｃ融合タンパク質（Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさないことが公知）を使用した細胞；６）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質を使用した細胞；および７）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体およびヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質を使用した細胞を含むアッセイに由来する。方法を実施例５に記載している。
この図は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の測定によって細胞死を測定するためのアッセイの結果を示す（実施例７に詳細に説明）。パネル７ＡはＬＤＨアッセイの結果を示し、パネル７Ｂは、同一の細胞で行った増殖アッセイの結果を示す。これらのアッセイにおける細胞はマウスＣＤ４＋Ｔ細胞である。パネル７Ａおよび７Ｂ中の種々のレーンは、活性化Ｔ細胞を使用したか使用しなかったアッセイおよび以下のさらなる成分（（１）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体を使用したＴ細胞；（２）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ヒトＩｇＧの調製物を使用したＴ細胞；（３）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＨＢ１５−Ｆｃを使用したＴ細胞；（４）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ｐ７．５−Ｆｃを使用したＴ細胞；（５）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃを使用したＴ細胞；（６）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＢＴＮＬ９．Ｆｃを使用したＴ細胞；および（７）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋マウスＢ７−１−Ｆｃを使用したＴ細胞）を使用したか使用しなかったアッセイの結果を示す。パネル７Ａでは、レーン（８）はＴ細胞を使用しなかった培地を使用して行ったＬＤＨアッセイ由来のデータを示し、レーン（９）はＴ細胞＋ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１００％細胞死を示すポジティブコントロールである）を使用して行ったアッセイ由来データを示す。
この図は、示すように正常なドナー由来の、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（Ｃｒｏｈｎｓ）を有するドナー由来の結腸組織におけるＢＴＮＬ９ｍＲＮＡの発現レベルを示す。各ポイントは１ドナー由来のデータを示す。アスタリスクによって示すように、正常組織と罹患組織との間の発現の相違はＵＣおよびクローン病組織の両方について統計的に有意であった。 この図は、ＳＥＣ精製によって生じるプール画分の検体のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析を示す。 この図は、以下に示すさらなるタンパク質を使用したか使用しなかった、抗ＣＤ３抗体に応答したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖レベルを示す：（１）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体のみを使用；（２）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＨＢ１５−Ｆｃを使用；（３）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ヒトＩｇＧの調製物を使用；（４）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ヒトＩｇＧの調製物由来のＦｃフラグメントを使用；（５）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃを使用；（６）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＢＴＮＬ９．Ｆｃ画分１を使用；（７）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＢＴＮＬ９．Ｆｃ画分２を使用；および（８）
Figure 2015143276
 、抗ＣＤ３抗体＋ＢＴＮＬ９．Ｆｃ画分３を使用。二重アスタリスクはコントロール値との有意差を示す。手順を実施例９に示している。
この図は、種々のさらなるタンパク質を使用したか使用しなかった、抗ＣＤ３抗体の存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖レベルを示す。レーンの模様は図１０のそれと同一である。手順を実施例９に記載している。 実施例１０で説明するように、この図は、ＤＡＰＩ（左）、抗ＢＴＮＬ９抗体（中央）、およびＣＤ３１（右）で染色したヒト脾臓組織を示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１：ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ_１５２５４７．４に開示の全長ヒトＢＴＮ
Ｌ９タンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号２：ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ_１５２５４７．４のヌクレオチド配列の翻
訳物であるヒトＢＴＮＬ９の全長アミノ酸配列。
配列番号３：ＩｇＫシグナル配列のアミノ酸配列。
配列番号４：ヒト成長ホルモンのシグナル配列のアミノ酸配列。
配列番号５：ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ_１７２７９３．２に開示の全長マウスＢＴ
ＮＬ９タンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号６：ＮＣＢＩリファレンス配列番号ＮＭ_１７２７９３．２に開示のヌクレオチ
ド配列の翻訳物であるマウスＢＴＮＬ９の全長アミノ酸配列。
配列番号７：ＮＣＢＩリファレンス配列ＢＣ０６２４５９．１によって開示の選択的スプライシングされたヒトＢＴＮＬ９ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列。
配列番号８：ＮＣＢＩリファレンス配列ＢＣ０６２４５９．１のヌクレオチド配列の翻訳物である選択的スプライシングされたヒトＢＴＮＬ９の全長アミノ酸配列。
配列番号９：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１０：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１１：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１２：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１３：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１４：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１５：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１６：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１７：リンカーのアミノ酸配列。
配列番号１８：ヒトＢＴＮＬ９の細胞外領域、リンカー、およびＦｃ領域を含む融合タンパク質（ＢＴＮＬ９．Ｆｃ）をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１９：ＢＴＮＬ９．Ｆｃのアミノ酸配列。
配列番号２０：マウスＢＴＮＬ２の細胞外領域およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むＢＴＮＬ２．Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２１：配列番号２０によってコードされたＢＴＮＬ２．Ｆｃのアミノ酸配列。
詳細な説明
本発明は、ＢＴＮＬ９タンパク質またはＢＴＮＬ９タンパク質のインヒビターもしくはアゴニスト（抗ＢＴＮＬ９抗体および／またはＢＴＮＬ９タンパク質のバリアント形態など）の使用を提供する。本発明は、ＢＴＮＬ９タンパク質（そのバリアントが含まれる）、かかるタンパク質の使用、および上記の全タンパク質をコードする核酸を提供する。ＢＴＮＬ９タンパク質は、Ｔ細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン産生を低下させることによってＴ細胞機能を変化させることができる。かかる効果により、Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患または炎症性疾患（とりわけ炎症性腸疾患および線維症など）を有効に処置することができる。ＢＴＮＬ９のインヒビターは、ＢＴＮＬ９がＴ細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン分泌を低下させるのを防止し、したがって、全体としてＴ細胞活性化を増大させるように機能することができる。かかる効果は、疾患（癌など）の処置またはワクチンの効力の増強に有用であり得る。ＢＴＮＬ９のアゴニストは、例えば、ＢＴＮＬ９タンパク質を発現するＢ細胞の活性化状態を変化させることによって免疫細胞機能を変化させることができる。
定義
「抗体」は、本明細書中で意味する場合、免疫グロブリンの重鎖可変領域および／または免疫グロブリンの軽鎖可変領域を含む。抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）、および第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）を含む全長四量体抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体など）であり得る。あるいは、抗体は、フラグメント（Ｆａｂフラグメントなど）または必要に応じて組換えフラグメント（ｓｃＦｖフラグメントなど）であり得る。単一の可変領域（ＶＨ領域またはＶＬ領域のいずれか）を含む単一ドメイン抗体も本明細書中で意味する抗体である。単一ドメイン抗体は、米国特許出願公開第２００６／００６２７８４号（単一ドメイン抗体を記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。さらに、種々の１価の形態（一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ドメイン抗体、および、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国特許第５，８３７，８２１号（その記載部分が本明細書中で参考として援用される）に記載の種々の形式が含まれる）および多価分子（Ｆ（ａｂ）２および、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国特許第５，８３７８２１号（その記載部分が本明細書中で参考として援用される）に記載の多価分子など）は、「抗体」の意味の範囲に包含される。
タンパク質の多量体種の分子量がタンパク質の単量体種の分子量の「少なくとも約」４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍であることを本明細書の複数の場所で言及している。これの意味するところは明白であるが、この句は具体的には単量体の約４，５、６倍などである種だけでなく、かかる種のより大きな種との組み合わせを含むことを意味する。同様に、多量体が「少なくとも」三量体、四量体などであることを複数の場所で言及している。この句は、具体的には、三量体、四量体などである種だけでなく、言及した種のより大きな種との組み合わせも含まれることを意味する。
「ＢＴＮＬ９タンパク質」には、本明細書中で意味する場合、全長ヒトＢＴＮＬ９タンパク質ならびにそのフラグメントおよび／またはバリアント（ＢＴＮＬ９遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアントによってコードされたタンパク質が含まれる）、ならびに組換えによって産生されたＢＴＮＬ９タンパク質（天然に存在するＢＴＮＬ９タンパク質と比較していくつかの配列変化を含み得る）が含まれる。
「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むが、抗体の定常領域を含まない一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはまた、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に種々の長さのリンカーを含むことができる。ｓｃＦｖを他のアミノ酸配列に融合することができるが、ｓｃＦｖと言及されるタンパク質部分は、好ましくはＶＨ領域、ＶＬ領域、および必要に応じてこれらの配列に連結するリンカー以外のいかなる相当量のアミノ酸配列も含まない。
抗体の「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」または「Ｆｃフラグメント」（本明細書中で同一と見なされる）は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含む重鎖フラグメントまたはかかるフラグメントのバリアントである。Ｆｃフラグメントは、ＣＨ１ドメインやＶＨドメインを含まない。例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１１０−１１，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。Ｆｃフラグメントは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＡアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または他のサブタイプが含まれる）のＦｃフラグメントであり得る。Ｆｃ領域のバリアントは、本明細書中で意味する場合、天然に存在するＦｃ領域と比較して単一のアミノ酸の１〜３０個（具体的には、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下などが含まれる）の挿入、欠失、または置換を含むことができる。天然に存在するか「天然の」Ｆｃ領域は、生きている生物中に天然に存在する配列を有する（例えば、ヒトまたはマウスのＦｃ領域）。したがって、「天然のヒト」Ｆｃ領域は、天然に存在するヒトＦｃ領域中に見いだされるアミノ酸配列を有する。機能に影響を及ぼすことなく変動が許容され得る位置に関するガイダンスを当該分野で見出すことができる。例えば、米国特許第５，８０７，７０６号および国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８９００４号（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）で同定されたアミノ酸残基の変更を使用して、ホモ二量体形成と比較してヘテロ二量体形成の促進に使用することができる。同様に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の結合を防止しないＦｃ領域への変更は、本明細書中で意味する場合にＦｃバリアントで起こり得る変更の範囲内に包含される。Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００など）を使用して約ｐＨ６で確認することができる。ヒトＦｃＲｎを、標準的な化学反応を使用してＣＭ５チップにカップリングすることができる。Ｆｃ含有タンパク質は移動相の一部であり得、応答をレゾナンスユニットで測定することができる。Ｆｃ領域の変更は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９７／３４６３１号（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。あるいは、例えば、種内および種間のＩｇＧ配列の比較により、高度保存アミノ酸を位置決定することができ、それにより、当業者にこれらのアミノ酸の変更が構造および／または機能に影響を及ぼし得ることを示唆することになる。ヒンジ、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域（共にＦｃ領域を形成する）の多数の配列アラインメントは、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）で利用可能である。他方では、種々のＩｇＧ間で変化するアミノ酸は、変動が機能に影響を及ぼすことなく許容される可能性がある部位である。同様に、他の所望の性質（エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性および／またはＣ１ｑ結合（補体結合を導く）が含まれる）の増減など）を有するＦｃバリアントは、Ｆｃバリアントの意味の範囲内に包含される。
用語「全長抗体」は、天然に存在する抗体と構造が類似する（すなわち、２つの全重鎖および２つの全軽鎖を含む）分子をいう。例えば、天然に存在する抗体の構造の論述については、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上掲またはＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１０９−３２，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。全長抗体の構造を記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。「全長抗体」のうちで、２つの完全な重鎖（しばしば、異常に長いＣＤＲ３領域を伴う）を含み、軽鎖を含まない天然に存在するヒトコブラクダ抗体と構造が類似する抗体も含まれる。Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ
ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−２６２９０。これらのヒトコブラクダ抗体の構造を記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。
「多量体」タンパク質（多量体のＢＴＮＬ９タンパク質など）は、１つを超えるポリペプチド鎖を含むタンパク質である。用語「多量体」は、「二量体」、「三量体」、または「四量体」などの用語を包含し、これらは、多量体がいくつのポリペプチド鎖を含むかを正確に特定している。「ホモ多量体」は２コピー以上の同一のポリペプチド鎖からなり、いかなる異なるポリペプチド鎖も含まない。同様に、例えば、「ホモ二量体」は２コピーの同一のポリペプチド鎖からなり、「ホモ三量体」は３コピーの同一のポリペプチド鎖などからなる。「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含む。ヘテロ多量体が３つ以上のポリペプチド鎖を有する場合、これらのうちのいくつかは、少なくとも１つがその他と異なる限り、相互に同一であり得る。タンパク質が「少なくとも三量体」であるという場合、それが三量体またはより高次の多量体であることを意味する。同様の意味が「少なくとも四量体」、「少なくとも五量体」などに帰することになる。
「Ｆａｂフラグメント」は、１つのＶＬ領域およびＣＬ領域を含む軽鎖ならびに１つのＶＨ領域および１つのＣＨ１領域を含む重鎖の一部を含む抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、ＣＨ２領域やＣＨ３領域を含まない。例えば、何のＦａｂフラグメントであるかの論述については、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１１０−１１ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。異なる種類のＦａｂフラグメントは、ヒンジ領域を含まないか、ヒンジ領域の一部を含むか、全ヒンジ領域を含み得る。
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、本明細書中で使用する場合、ｓｃＦｖのＦｃ領域との融合物である組換えタンパク質である。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４９：２４３−２５２；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５１：１２３−１３５；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：１−２０を参照のこと。
「組換え」タンパク質または抗体は、遺伝子工学のプロセスから生じるタンパク質または抗体である。用語「遺伝子工学」は、高レベルまたは低レベルで遺伝子を発現するか、遺伝子の変異体形態を発現する細胞を作製するために使用される組換えＤＮＡまたはＲＮＡ法をいう。換言すれば、細胞を、組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクトするか、形質転換するか、形質導入し、それにより、細胞による所望のポリペプチドの発現を変化させるように、変化させる。
可溶性分泌タンパク質および細胞表面に発現するタンパク質は、しばしば、Ｎ末端「シグナル配列」を含み、このシグナル配列は、真核細胞中の小胞体（ＥＲ）が結合した膜を介したタンパク質の挿入を媒介する疎水性配列である。Ｉ型膜貫通タンパク質はシグナル配列も含む。「シグナル配列」は、本明細書中で意味する場合、アミノ末端疎水性配列であり、この配列は、タンパク質の一部または全ての、ＥＲ膜を介したＥＲの内腔への挿入後に通常は酵素的に除去される。したがって、シグナル配列は分泌タンパク質または膜貫通タンパク質の前駆体形態の一部として存在し得るが、一般にタンパク質の成熟形態で欠いているということは当該技術分野で公知である。タンパク質がシグナル配列を含むという場合、タンパク質の前駆体形態はシグナル配列を含むが、タンパク質の成熟形態はシグナル配列を含まない可能性があるということを理解すべきである。シグナル配列は、切断部位に隣接し且つすぐ上流（−１位）の残基および−３位の別の残基（この酵素切断に重要である）を含む。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（１）：１−６；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５（シグナル配列およびこれを同定する方法を記載している部分が本明細書中で参考として援用される）。シグナル配列を、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（上掲）に記載のように同定することができる。哺乳動物宿主細胞で機能的なシグナルペプチドまたは配列の例には、以下が含まれる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０ ３６７ ５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナル配列；欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；ヒトＩｇＫのシグナル配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ；配列番号３である）；およびヒト成長ホルモンのシグナル配列（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ；配列番号４）。これらの参考文献の関連部分が、本明細書中で参考として援用される。多数の他のシグナル配列が当該分野で公知である。
「免疫グロブリン様」（Ｉｇ様）ドメインは、本明細書中で意味する場合、主にその三次構造によって区別される。例えば、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−２０；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ（１９８９），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１−６３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照のこと。しかし、可変および定常免疫グロブリン様ドメインは、その一次アミノ酸配列内の保存された位置に存在するわずかな高保存アミノ酸を含む。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと。可変領域ならびにＣＨ１およびＣＨ２定常領域中のかかる保存アミノ酸は、例えば、Ｈａｒｐａｚ ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８−３９ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５で詳細に論じられている。かかる保存残基を論じているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。適切なスペーシング中に生じるかかる高保存アミノ酸またはその保存的バリアントの存在は、ＩｇＣ様ドメインまたはＩｇＶ様ドメインの存在を示し得る。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一率を、コンピュータプログラムＧＡＰ（すなわち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５））を使用した配列情報の比較によって決定することができる。ＧＡＰプログラム用の好ましいデフォルトパラメータには、以下が含まれる：（１）ヌクレオチドについての単項比較行列（同一性についての値１および非同一性についての値０を含む）およびＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載のＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の重み付きアミノ酸比較行列または他の類似の比較行列のＧＣＧ実行；（２）アミノ酸配列についての各ギャップのペナルティ８および各ギャップ中の各シンボルの追加ペナルティ２またはヌクレオチド配列についての各ギャップのペナルティ５０および各ギャップ中の各シンボルの追加ペナルティ３；（３）エンドギャップのペナルティなし；および（４）ロングギャップの最大ペナルティなし。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列同一性を決定するための比較に関連して、「アラインメントウィンドウ」が、本明細書中に記載のパラメーターを使用したコンピュータプログラムＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５）によって別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと一部または全体が一致したポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分であることを意味する。例えば、２０アミノ酸のポリペプチドを相当により長いタンパク質とアラインメントし、最初の１０アミノ酸がより長いタンパク質と正確に一致する一方で、最後の１０アミノ酸がより長いタンパク質とまったく一致しない場合、アラインメントウィンドウは１０アミノ酸である。他方では、２０アミノ酸のポリペプチドの最初および最後のアミノ酸がより長いタンパク質と一致し、８個の他の一致がその間に点在する場合、アラインメントウィンドウは２０アミノ酸長である。しかし、本明細書中で意味する場合、少なくとも、例えば、２５アミノ酸または７５ヌクレオチドの同一または保存的に置換されたアミノ酸または同一のヌクレオチドを含まないいずれかのアラインメントした鎖中のロングストレッチは、アラインメントウィンドウのエンドポイントを構成する。配列比較のためのアラインメントウィンドウは、少なくとも約２５、５０、６０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２２５、３００、４００、４５０、５００、または６００アミノ酸長またはヌクレオチド長であり得る。
２つのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列は、上記のＧＡＰプログラムを使用して決定した場合にこれらが少なくとも９０％同一であり、且つ類似の生物学的活性を有する場合、「実質的に類似する」と見なされる。ＢＴＮＬ９の場合、２つの配列が実質的に類似するかどうかの決定で試験すべき生物学的活性は、抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞の増殖を阻害する能力である。
ＢＴＮＬファミリー
ＢＴＮＬ９は、そのドメイン構造に基づいて、ブチロフィリン様（ＢＴＮＬ）ファミリー内のタンパク質に属している。例えば、Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：４３−５２およびＡｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０−７５を参照のこと。ＢＴＮＬファミリー中のヒトタンパク質にはＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＥＲＭＡＰ、およびＭＯＧが含まれ、これらのタンパク質のドメイン構造を図１に図式的に示す。図１から明らかなように、ＢＴＮＬ２は、その細胞外領域中に４つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（２つのＩｇＶ様ドメインおよび２つのＩｇＣ様ドメイン）を有する唯一のファミリーのメンバーである。ＭＯＧおよびＥＲＭＡＰはそれぞれたった１つのＩｇ様ドメインを有する。ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＢＴＮＬ９はまた、明確にＩｇ様ドメインである一方の細胞外ドメインおよびＩｇ様ドメインのいくつかの特徴を欠くがＩｇ様ドメインであるためのほぼ正確なサイズである別のドメインを有する。全ＢＴＮＬファミリーメンバーは膜貫通ドメインを有する。ＢＴＮＬ２およびＭＯＧは短い細胞内領域を有するのに対して、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、およびＥＲＭＡＰは、Ｂ３０．２ドメインを含むより長い細胞内領域を有する。いくつかのタンパク質のＢ３０．２ドメインの変異は一定の疾患と関連しているにも関わらず、細胞内Ｂ３０．２の機能は未知である。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５：１６９６−１７０５（その関連する開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに、いくつかのＢ３０．２ドメインの結合パートナーが同定されている。例えば、Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２２４４４−２２４５６を参照のこと。
ＢＴＮＬ９と他のヒトＢＴＮＬファミリーメンバーとの配列同一性を、以下の表１に示す。
Figure 2015143276
図１に示すように、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＢＴＮＬ９は、類似のドメイン構造を有する。ＢＴＮＬ９タンパク質とＢＴＮＬ３タンパク質およびＢＴＮＬ８タンパク質との配列同一性は、他のＢＴＮＬタンパク質とのそれよりわずかに高い。ＢＴＮＬ３タンパク質およびＢＴＮＬ８タンパク質は、相互に６９％同一である。
配列同一性レベルを超えて、６つ全てのヒトＢＴＮＬ様タンパク質のアラインメントである以下の表２に示すようにＢＴＮＬタンパク質ファミリー内の一定の部位は高度に保存されている。上記アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。コンセンサスアミノ酸（複数可）が、上記アミノ酸が存在する上記アラインメントの部分にアミノ酸配列が及んでいる全タンパク質中に存在する場合、このアミノ酸を太字で示す。上記配列が上記アラインメントの部分に及んでいる１つを除く全タンパク質中にコンセンサスアミノ酸が存在する場合、このアミノ酸を通常のフォントで示す。ある部位が全ての場合において２つ以上のアミノ酸（それぞれ他方の保存的変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）である）のうちの１つを有する場合、これらのアミノ酸をその位置の下に太字のフォントで列挙する。ある部位が上記アラインメントのその部分に及んでいる１つを除く全配列中に２つ以上のアミノ酸（それぞれ他方の保存的変異である）のうちの１つを有する場合、これらのアミノ酸をその位置の下に通常のフォントで列挙する。表２中のアラインメントの上の番号付けは、配列番号２（ヒトＢＴＮＬ９の全長アミノ酸配列（配列番号２の３４位で終結するシグナル配列を含む）である）の番号付けである。
Figure 2015143276
Figure 2015143276
Figure 2015143276
当業者は、これらのタンパク質のうちのコンセンサス配列がこれらのタンパク質の構造または機能に重要であり得る特徴を反映すると認識するう。その多様な発現パターンを考慮すると、これらのタンパク質が同一の機能を持たない可能性があり、したがって、各タンパク質の機能に重要な全てのアミノ酸がファミリー内に保存されていそうにない。しかし、多数の保存アミノ酸は、勿論機能に必要な適切な構造を維持するために重要であり得る。多くの部位で相互の保存的変異である２つ以上のアミノ酸のうちの１つが、ＢＴＮＬファミリーの全てまたはほとんどのメンバーに存在する。当業者は、ＢＴＮＬ９のかかる保存的変異が機能に不利に影響しそうにないと理解することになる。例えば、配列番号２の５５位で（上記表２のアラインメントと同一の番号付けを有する）、ＢＴＮＬファミリーの種々のメンバーは、３つの異なる疎水性アミノ酸（アラニン（ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＥＲＭＡＰ）、イソロイシン（ＢＴＮＬ２）、またはバリン（ＢＴＮＬ９およびＭＯＧ））のうちの１つを有する。当業者は、ＢＴＮＬ９アミノ酸配列のこの位置でのバリンのアラニンまたはイソロイシンへの変化が機能に影響を与えていそうにないと理解することになる。ファミリー内で保存的変異が存在する部位全てを同様に考慮することになる。したがって、ＢＴＮＬ９タンパク質には、本明細書中で意味する場合、配列番号２を含むタンパク質またはそのフラグメントが含まれ、ここで、保存的変異がＢＴＮＬファミリーのメンバー間に存在する部位での保存的変異によって上記配列を変化させることができ、ここで、以下の実施例に記載した方法によって測定した場合に上記タンパク質がＴ細胞の増殖を阻害することができる。かかる部位には、配列番号２の４７、４９、５１、５３、５４、５５、５７、６１、６７、７２、７４、８２、８３、８５、８６、８７、８８、９１、９８、１００、１０１、１０６、１０７、１０８、１１６、１１７、１１９、１２０、１２３、１３１、１３５、１４７、１８４、２０９、２１１、２１５、２１７、２２１、２２５、２４４、２８８、２９１、３１２、３１６、３１７、３２３、３２４、３２７、３３０、３３１、３４３、３４９、３５２、３５７、３６０、３６５、３６８、３７０、３７１、３７３、３７４、３８３、３９２、３９３、３９５、３９８、４００、４０３、４１１、４１３、４１７、４２８、４３３、４３６、４４０、４４３、４４８、４４９、４５１、４６０、４６３、４６８、４７２、４７７、および４８５位が含まれる。さらに、機能に影響を及ぼすことなくＢＴＮＬ９内の他の部位の変異も許容することができる。例えば、かかる部位で機能的影響が起こりうるにもかかわらず、非保存位置での保存的置換は、機能に影響を及ぼしそうにない。
したがって、ＢＴＮＬ９タンパク質には、本明細書中で意味する場合、（１）天然に存在する多型または組換え的に導入されたアミノ酸変化を有し、（２）配列番号２および／または配列番号２のアミノ酸３５〜２５７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、（３）本明細書中に記載の方法によって測定した場合にＴ細胞の増殖を弱めるか、天然のＢＴＮＬ９のインヒビターとして作用する能力を保持するタンパク質が含まれる。いくつかのかかる多型は、ＢＴＮＬ９タンパク質がＴ細胞の増殖を阻害する能力を増強することができ、そして／またはＢＴＮＬ９タンパク質において、商業的産生プロセスでの産生をより容易にすることができる。他のかかる多型は、天然のＢＴＮＬ９のインヒビターを産生することができる。これらの多型は、ＢＴＮＬ９内の保存されていない部位（例えば、４１、４４、４５、４６、４８、５６、５８、６０位など）および表２に非保存性であることが示された任意の他の部位に存在し得る。
ＢＴＮＬタンパク質の発現パターンおよび生物学的機能は、ある場合にはいくらかの範囲まで調査されているが、他の場合では調査されていない。ＥＲＭＡＰは、赤血球表面に発現し、特定の生物学的機能を割り当てられていない。ＭＯＧはミエリン鞘の成分である。ＭＯＧに対する抗体がしばしば多発性硬化症患者で検出されるにもかかわらず、ＥＲＭＡＰおよびＭＯＧはいずれも免疫系で役割を果たすと考えられていない。ＢＴＮ１はＭＯＧと類似し（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、ＢＴＮ１は牛乳中に見出される。ヒトによる牛乳の消費によってヒトＭＯＧと交差反応するＢＴＮ１に対する抗体が産生され、それにより、自己免疫疾患（多発性硬化症など）を引き起こし得るという仮説が立てられている。Ｇｕｇｇｅｎｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６１−６８を参照のこと。ＢＴＮＬ２は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を阻害するが、Ｂ細胞増殖を阻害しないことが示されている。したがって、ＢＴＮＬ２は、Ｔ細胞媒介性事象の負の共調節因子として作用すると考えられる。例えば、米国特許第７，２４４，８２２号（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＢＴＮＬ２の多型は明らかにサルコイドーシスに関連しており、この疾患の開始もしくは媒介またはこの疾患への寄与もしくは応答のいずれかでＢＴＮＬ２が役割を果たし得ると示唆される。Ｖａｌｅｎｔｏｎｙｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
３７（４）：３５７−６４。種々のＢＴＮＬ２多型と潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、特発性封入体筋炎、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、類結核癩、および抗原特異的ＩｇＥ応答性との間のより仮説的な関連が導き出されている。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０−７５。ＢＴＮＬ３、８、および９は、いかなる特異的な生物学的機能も割り当てられていない。
種々の細胞型および組織における種々のＢＴＮＬタンパク質をコードするＲＮＡのレベルが報告されている。ＢＴＮＬ９ ＲＮＡは、脂肪組織、肺、胸腺、脾臓、および心臓で比較的高発現する。他のＢＴＮＬファミリーメンバーは異なる発現パターンを有し、１つを除いて全てにおいて、ＲＮＡ発現は、造血系細胞で検出されている。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０−７５。ＢＴＮＬ９発現について試験した免疫機能に関連する種々の細胞型のうち、ＢＴＮＬ９ ＲＮＡは主にＢ細胞に発現される。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０−７５。免疫機能に関与する細胞におけるＢＴＮＬ９ ＲＮＡ発現は、ＢＴＮＬ９が炎症応答の駆動または発赤後の応答の軽減のいずれかによって免疫機能で役割を果たし得ることが示唆される。
ＢＴＮＬ９タンパク質
本発明は、ＢＴＮＬ９の分泌性、可溶性バージョン、ならびに細胞表面に発現することができる膜貫通ドメインを含むバージョンを包含する。かかるタンパク質を単離することができる（すなわち、ＢＴＮＬ９タンパク質が調製物中に存在するタンパク質の少なくとも８０％または少なくとも９０％を構成する精製タンパク質調製物の一部であり得る）。本発明は、さらに、下記のＢＴＮＬ９核酸によってコードされるＢＴＮＬ９タンパク質を含む。ＢＴＮＬ９タンパク質は、本明細書中で意味する場合、配列番号２のアミノ酸配列、ならびにそのフラグメント、誘導体、およびバリアントを含むタンパク質（上記および下記で論じる融合タンパク質および多量体が含まれる）を包含する。配列番号２のアミノ酸配列は、１位から開始され、約２９位〜約３８位、必要に応じて３４位で終結するシグナル配列を含む。したがって、成熟ＢＴＮＬ９のアミノ酸配列は、配列番号２の約３０〜約３９位の位置から開始される。必要に応じて、ＢＴＮＬ９の成熟アミノ酸配列は、配列番号２の３５位から開始される。
ＢＴＮＬ９のシグナル配列の後に配列番号２の約４４位〜約１５０位にわたるＩｇ様ドメインが続く。その後の領域である配列番号２の約１５１位〜約２５７位はＢＴＮＬ２中のＩｇＣ様ドメインと整列する（ａｌｉｇｎ）が、ＩｇＣ１様ドメインで一般に認められる特徴的な配列特性のいくつかを欠く。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５；Ｐｅａｃｈ
ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３６）：２１１８１−２１１８７を参照のこと。ＢＴＮＬ９の膜貫通ドメインは、配列番号２の約２５８位から開始され、配列番号２の約２７７位で終結する。ＢＴＮＬ９の細胞内部分は、配列番号２の約２７８位から開始され、５３５位で終結する。細胞内領域は、配列番号２の約３２８位〜約４８６位にわたるＢ３０．２ドメインを含む。Ｂ３０．２ドメインは、およそ１７０アミノ酸の球状ドメインである。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．は、Ｂ３０．２ドメインについていくらか詳細に論じており、多数のＢ３０．２ドメインのアラインメントおよび上記アラインメントに由来するコンセンサス配列を提供している。Ｂ３０．２ドメインを示し（配列比較による）、Ｂ３０．２ドメインが何であるかを説明しているＨｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ． １５（１２）：１６９６−１７０５の部分が、本明細書中で参考として援用される。Ｂ３０．２ドメインはまた、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＥＲＭＡＰで見出されており、その全てが、本明細書中で論じるように、ブチロフィリン様ファミリーのメンバーのタンパク質である。約３２８〜４８６位の上記表２中のＢＴＮＬタンパク質のアラインメントは、Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（上掲）によってアラインメントされたＢ３０．２ドメインを含むタンパク質のより異なる集団の間で認められる相同性よりも確実に高い、高い程度の相同性を示す。
ＢＴＮＬ９タンパク質には、本明細書中で意味する場合、少なくとも２つのＢＴＮＬ９タンパク質を含むヘテロ多量体およびホモ多量体が含まれる。いくつかの実施形態では、生物学的に活性な多量体はホモ多量体であり得る。かかるホモ多量体のサイズを、非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィによって決定することができる。かかる多量体中に含まれる単量体ＢＴＮＬ９タンパク質のサイズを、還元条件下での多量体のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる。かかる条件は、ジスルフィド架橋を破壊し、非共有結合性相互作用（水素結合または電荷相互作用など）を妨害することが予想されることになる。したがって、ジスルフィド結合または非共有結合性相互作用によって相互に保持された多量体は、還元条件下で単量体に還元されることが予想されることになる。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なＢＴＮＬ９ホモ多量体のサイズは、単量体ＢＴＮＬ９タンパク質のサイズの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍であり得る。
ＢＴＮＬ９タンパク質には、本明細書中で意味する場合、全長ＢＴＮＬ９ｍＲＮＡのスプライスバリアントによってコードされたタンパク質も含まれる。ＢＴＮＬ９（配列番号１）をコードする全長ｃＤＮＡは、配列番号１中の以下の位置に存在する１１個のエキソンを含む：エキソン１、１〜２０８位；エキソン２、２０９〜３４０位；エキソン３、３４１〜６８５位；エキソン４、６８６〜９６７位；エキソン５、９６８〜１０８４位；エキソン６、１０８５〜１１１７位；エキソン７、１１１８〜１１３８位；エキソン８、１１３９〜１１５９位；エキソン９、１１６０〜１１８６位；エキソン１０、１１８７〜１２１３位；およびエキソン１１、１２１４〜３５００位。
コード配列は配列番号１の２３２〜１８３９位にわたり、最後の３つのヌクレオチドは終止コドンである。したがって、コード配列は第２のエキソン内から開始される。第２のエキソンの末端は、配列番号２の約３４位でＢＴＮＬ９のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列の末端をわずかに越えて伸びている。第３のエキソンは、配列番号２の約３７位〜約１５１位のアミノ酸（Ｉｇ様ドメインが含まれる）をコードする。第４のエキソンは、約１５２位〜約２４５位の配列番号２の部分（換言するとその後のドメインのほとんど）をコードし、ＩｇＣ１様ドメインのいくつかの特徴を有する。これにエキソン５〜１０が続き、これらは全て比較的短い。エキソン５は細胞外ドメインの残部＋膜貫通ドメイン（配列番号２の約２４６位〜約２８４位）をコードする。エキソン６〜１０は共に約４３個のアミノ酸（配列番号２の約２８５位〜約３２７位）をコードする。エキソン１１は、Ｂ３０．２ドメイン（配列番号２の約３２８位〜約４８６位にわたる）および上記タンパク質の残部（配列番号２の５３５位で終結）をコードする。
ＢＴＮＬ９タンパク質は、本明細書中で意味する場合、任意の１，２，３，４，５，６，７，８，または９個のエキソンを欠いているスプライスバリアントによってコードされ得る。例えば、ＢＴＮＬ９タンパク質は、エキソン３またはエキソン４を欠くスプライスバリアントによってコードされ得る。得られたＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２の約３７位〜約１５１位のＩｇ様ドメインを含むことができるが、配列番号２の約１５２位〜約２４５位のその後のドメインを含まない。あるいは、得られたＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２の約１５２位〜約２４５位のアミノ酸を含むことができるが、配列番号２の約３７位〜約１５１位のアミノ酸を含まない。エキソン１０および１１を欠くスプライスバリアント転写物によってコードされるＢＴＮＬ９タンパク質は配列番号２の約３１９〜５３５にわたるアミノ酸を欠くであろうが、これらのアミノ酸がエキソン９の後のイントロンによってコードされる他のアミノ酸に置き換えられる可能性がある。エキソン１０および１１を欠くかかるＢＴＮＬ９転写物はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＣ０６２４５９．１に報告されており、その配列を、配列番号７に示す。このスプライスバリアントは、イントロン中に見いだされる潜在的スプライス部位を利用するようである。配列番号８は、配列番号７によってコードされるアミノ酸配列である。他のＢＴＮＬ９タンパク質は、エキソン３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１、またはこれらのエキソンの任意の組み合わせを欠くスプライスバリアントによってコードされ得る。スプライスバリアントは、潜在的スプライス部位をさらに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２を含む全長膜貫通タンパク質の可溶性フラグメントまたはそのバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２の残基４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０から配列番号２の残基１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０までにわたる免疫グロブリン様ドメインを含むＢＴＮＬ９のフラグメントを含む。かかる実施形態は、配列番号２の残基１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０から配列番号２の残基２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、または２６０までにわたるその後のドメインを含んでも含まなくてもよい。さらなる実施形態では、ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２の残基１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０から配列番号２の残基２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、または２６０までにわたるフラグメントを含むことができる。かかる実施形態は、配列番号２の残基４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０から配列番号２の残基１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０までにわたる先行するドメインを含んでも含まなくてもよい。ＢＴＮＬ９タンパク質は、ＢＴＮＬ９の細胞外領域のほとんどまたは全てを含むフラグメントを含むことができる。かかるタンパク質は、配列番号２の残基３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０から配列番号２の残基２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、または２６０まで、必要に応じて、配列番号２の約残基３７から約残基２５７までにわたるアミノ酸配列を含むことができる。これら全てのフラグメントは、配列番号２に関する変異を含むことができ、以下に論じるように配列番号２に対して単一のアミノ酸の所定数の置換、挿入、または欠失を含むことができる。これらすべての実施形態は、抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。
本発明は、抗体の生成に有用なＢＴＮＬ９タンパク質のエピトープを包含し、このエピトープは、本明細書中で免疫原性フラグメントと呼ばれる。免疫原性フラグメントは、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸長であり、配列番号２由来の隣接アミノ酸を含むことができる。かかるエピトープは、スプライスジャンクションによってコードされるＢＴＮＬ９タンパク質領域におよぶことができ、このエピトープは、特異的スプライスバリアントによってコードされるタンパク質への特異的結合という利点を有し得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、ＢＴＮＬ９の細胞外領域（配列番号２のアミノ酸３５〜２５７位）内に存在する。エピトープは、配列番号２の約アミノ酸４４〜１５０位にわたる免疫グロブリン様ドメイン内または配列番号２の約アミノ酸１５１〜２５７位にわたるその後のドメイン内に存在し得る。
ＢＴＮＬ９タンパク質は、本明細書中で意味する場合、上記で論じた配列番号２または配列番号２のフラグメントの１つと比較して単一のアミノ酸の１つ以上の挿入、欠失、または置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ９タンパク質は、上記で論じた配列番号２または配列番号２のフラグメントの１つと比較して単一のアミノ酸の２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換、挿入、または欠失を含む。本発明の範囲内の全てのかかるＢＴＮＬ９タンパク質バリアントは、Ｔ細胞の増殖を低減させる能力を保持するか、本明細書中に記載の方法によってアッセイした場合に、変化しないＢＴＮＬ９タンパク質によるＴ細胞の増殖のこの低減についてのインヒビターとして作用することができる。
いくつかの実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であり得る。生物学的活性に影響を及ぼす可能性が低い保存的アミノ酸置換の例には、以下が含まれる：セリンに代えてアラニン、イソロイシンに代えてバリン、グルタミン酸に代えてアスパラギン酸、セリンに代えてトレオニン、グリシンに代えてアラニン、トレオニンに代えてアラニン、アスパラギンに代えてセリン、バリンに代えてアラニン、グリシンに代えてセリン、フェニルアラニンに代えてチロシン、プロリンに代えてアラニン、アルギニンに代えてリジン、アスパラギンに代えてアスパラギン酸、イソロイシンに代えてロイシン、バリンに代えてロイシン、グルタミン酸に代えてアラニン、グリシンに代えてアスパラギン酸、およびこれらの変更の逆。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに、あるグループ内の１つのアミノ酸の、同一グループ内の別のアミノ酸に代えての交換は保存的置換であり、グループは以下である：（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシン、およびフェニルアラニン；（２）ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、およびアスパラギン；（３）アスパラギン酸およびグルタミン酸；（４）セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびシステイン；および（５）グリシン、プロリン、およびアラニン。
生物学的機能に影響を及ぼすことなくＢＴＮＬ９のどのアミノ酸を変化させることができるのかということについてのガイダンスを、以下に示すヒトＢＴＮＬ９アミノ酸配列（上のライン、小文字、配列番号２）のマウスＢＴＮＬ９アミノ酸配列（下のライン、大文字、配列番号６）との以下のアラインメントによって示す。太字で示した残基は、ＩｇＶ様ドメイン（配列番号２の残基３７〜１５０）またはＩｇＣ１様ドメイン（配列番号２の残基１５１〜２５７）、またはその保存的バリアントに特徴的な残基である。Ｈａｒｐａｚ ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８−５３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５；Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３６）：２１１８１−２１１８７（その全てが、本明細書中で参考として援用される）。
Figure 2015143276
これらの配列（すなわち、表３に示すヒトおよびマウスアミノ酸配列）は、約７１％同一である。興味深いことに、ＢＴＮＬ９の第２の細胞外ドメイン（配列番号２の約１５１〜２５７位）および細胞内ドメインのほとんど（配列番号２の約３０６〜５３５位）の配列は、第１のＩｇ様細胞外ドメインの配列よりもマウス配列とヒト配列の間でより高く保存されている。当業者は、進化において構造は配列よりも保存されるので、非保存残基が保存残基よりもＢＴＮＬ９タンパク質の全体的な三次構造の決定で役割を果たす可能性が低いことを認識する。Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−２０。本明細書中で使用する場合、「非保存残基」は、表３におけるようにヒトおよびマウスＢＴＮＬ９タンパク質配列を比較した場合に保存されていないＢＴＮＬ９タンパク質内のアミノ酸である。非保存アミノ酸はまた、ＢＴＮＬ９機能で直接的な役割を果たす可能性が低い。例えば、表３中に示した配列番号２の残基５０、５４、６２、６３、および多くの他の残基は同一でなく、類似もしていない。したがって、当業者は、同一でなく、類似もしない残基の変更は、同一または類似する残基の変更よりもＢＴＮＬ９タンパク質機能に影響を及ぼす可能性が低いことを理解することになる。さらに、保存的置換（本明細書中に記載）は、非保存的置換よりもタンパク質機能に影響を及ぼす可能性が低い。他方では、保存残基（例えば、配列番号２の残基４３、４４、４７、４８、および４９など）（具体的には、Ｉｇ様ドメイン中で保存されている残基（配列番号２の残基５２、５５、および５７など））の置換または欠失は、生物学的機能を損なう可能性が一層多くある。当業者はまた、プログラム（例えば、ＤＡＬＩ（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：１２３−３８）など）によって予測されるＢＴＮＬ９タンパク質の三次構造を実質的に無効にする（ｕｐｓｅｔ）置換も機能を損ねる可能性があることを認識する。したがって、当該技術では、機能に影響を及ぼすことなく変更が行えるものに関する注目すべきガイダンスを提供している。ＢＴＮＬ９タンパク質の全てのバリアントおよび誘導体は、本明細書中で意味する場合、抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるか、ＢＴＮＬ９タンパク質の非変異バージョンが増殖を阻害する能力を阻害することができる。
ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得、ここで、アラインメントウィンドウは少なくとも５０、６０、７５、８０、９０、または１００アミノ酸長であり、ここで上記ＢＴＮＬ９タンパク質は抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。上記で論じられるように、マウス配列および他のヒトＢＴＮＬファミリーメンバーとの配列ミスマッチは、機能に影響を及ぼすことなく改変することができる配列番号２の配列中の位置を当業者に手引きすることができる。いくつかの実施形態では、挿入、欠失、または置換は、ヒトＢＴＮＬ９とマウスＢＴＮＬ９との間で保存されない残基またはその残基付近で起こり得る。いくつかの実施形態では、これらの変更は、配列番号２の以下の残基の１つ以上（欠失または置換の場合）またはその残基付近（挿入の場合）で起こる：３９、４５、４６、５０、５４、６０、６２〜６５、６９、７９、８０、８９、９１〜９５、９８、９９、１０５〜１０９、１１３、１１７、１１９、１２１、１２２、１３０、１３６、１４５、１５３、１６５〜１６７、１７３、１７４、１８８、１９５、１９８、２０２、２０３、２０７、２１９、２２２、２２７、２２８、２３２、２３５、２４０、２５１、２５２、２５４、および２５７。あるいは、ＢＴＮＬ９タンパク質は、配列番号２と比較して１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、８個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、または３０個以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含むことができる。上記のタンパク質は、抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができる限り、本明細書中で意味するＢＴＮＬ９タンパク質である。
ＢＴＮＬ９タンパク質を、種々の程度にグリコシル化してよいか、しなくても良い。例として、本発明のＢＴＮＬ９タンパク質は、１つ以上のＮ結合またはＯ結合グリコシル化部位を、配列番号２を含むタンパク質中に既に見いだされる部位に加えて、含むことができる。配列番号２は、１０２、１３９、２２４、４６４、および５１６位に、５つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含む。当業者は、配列Ａｓｎ Ｘｘｘ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘｘｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）の一部であるアスパラギン残基がＮ−グリカン付加部位として役立ち得ることに気付くことになる。さらに、Ｏ結合グリコシル化部位として役立ち得る多数のセリン残基およびトレオニン残基が存在する。グリコシル化は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるか、生物学的活性を変化させることができる。得られたタンパク質がＴ細胞の増殖を阻害することができる限り、ＢＴＮＬ９タンパク質のバリアントには、配列番号２中に存在するよりも１，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０個多いＮ結合および／またはＯ結合グリコシル化部位を含むタンパク質も含まれる。バリアントＢＴＮＬ９タンパク質には、これらが抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるか、またはこれらが、上記増殖を阻害するＢＴＮＬ９タンパク質の非変異バージョンの能力を阻害することができる限り、配列番号２中に存在するよりも１，２，３，４、または５個少ないＮ結合および／またはＯ結合グリコシル化部位を有するタンパク質も含まれる。
ＢＴＮＬ９タンパク質は、本明細書中で意味する場合、配列番号２のバリアントおよび／またはフラグメント（上記で説明したように）であるアミノ酸配列を含むことができる少なくとも１つのＢＴＮＬ９ポリペプチドおよび少なくとも１つの他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む融合タンパク質であり得る。他の部分は、ＢＴＮＬ９タンパク質以外のポリペプチドであり得る。他の部分はまた、非タンパク質部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分または細胞傷害性部分、細胞増殖抑制性部分、発光部分、および／または放射性部分など）であり得る。
ＰＥＧの結合により、少なくともいくつかのタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加することが示されている。さらに、細胞傷害性部分、細胞増殖抑制性部分、発光部分、および／または放射性部分は、診断または治療目的のために（例えば、抗体を結合することができる細胞を位置決定するか、その増殖を阻害するか、死滅させるため）抗体に融合されている。同様に、かかる部分に融合したＢＴＮＬ９タンパク質を使用して、ＢＴＮＬ９が結合することができる細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／または免疫応答に関与する他の細胞など）を位置決定するか、その増殖を阻害するか、死滅させることができる。かかる細胞傷害性部分、細胞増殖抑制性部分、発光部分、および／または放射性部分の中には、例えば、メイタンシン誘導体（ＤＭ１など）、エンテロトキシン（ブドウ球菌性エンテロトキシンなど）、ヨウ素同位体（ヨウ素１２５など）、テクネチウム同位体（Ｔｃ−９９ｍなど）、シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８など）、リボゾーム不活化タンパク質（ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン、またはサポリン−Ｓ６など）、およびカリケアマイシン（商標マイロターグ（商標）（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）として販売されている製品の一部である細胞傷害性物質）がある。
ＢＴＮＬ９以外の種々のポリペプチドを、種々の目的（例えば、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増大させるため、タンパク質の同定、単離および／または精製を容易にするため、タンパク質活性を増大させるため、およびタンパク質のオリゴマー化を促進するためなど）のためにＢＴＮＬ９ポリペプチドに融合することができる。
多数のポリペプチドは、これらのポリペプチドがその一部として存在する組換え融合タンパク質の同定および／または精製を容易にすることができる。例には、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはＨＡＴ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（固定化金属イオンに高親和性を有する非隣接ヒスチジン残基の天然に存在する配列である）が含まれる。これらのポリペプチドを含むＢＴＮＬ９タンパク質を、例えば、固定化ニッケルまたはＴＡＬＯＮ（商標）樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（固定化コバルトイオンを含む）を使用したアフィニティクロマトグラフィによって精製することができる。例えば、Ｋｎｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７（２６）：１５３５８−１５３６６を参照のこと。ポリアルギニンを含むポリペプチドにより、イオン交換クロマトグラフィによって効率的に精製することが可能となる。他の有用なポリペプチドには、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４に記載の抗原性識別ペプチドが含まれる。１つのかかるペプチドは、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドである。このペプチドは、抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合し、それにより、発現した組換え融合タンパク質を迅速にアッセイし、容易に精製することが可能なエピトープを提供する。４Ｅ１１と呼ばれるマウスハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載のように、特定の２価の金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＨＢ ９２５９で寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含むポリペプチド精製試薬を回収するための親和性試薬として使用することができる。他の適切なタンパク質タグおよび親和性試薬は以下である：１）ＧＳＴ−Ｂｉｎｄ（商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の、固定化グルタチオンに対する親和性を利用する）に記載のもの；２）Ｔ７−ＴＡＧ（登録商標）アフィニティ精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｔ７遺伝子１０タンパク質のアミノ末端の１１アミノ酸の、モノクローナル抗体に対する親和性を利用する）に記載のもの；または３）ＳＴＲＥＰ−ＴＡＧ（登録商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ストレプトアビジンの工学的に作製された形態の、タンパク質タグに対する親和性を利用する）に記載のもの。上記タンパク質タグのいくつかおよびその他のものは、Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ（１９９０），ＴＩＢＴＥＣＨ ８：８８−９３，Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．２３９−２６６，Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９１），およびＢｒｅｗｅｒ ａｎｄ Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．９１−１１１，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（ｅｄｓ．），Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）に記載されている。タンパク質タグを記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。さらに、２つ以上の上記タグの融合物（例えば、ＦＬＡＧタグとポリヒスチジンタグとの融合物など）を、本発明のＢＴＮＬ９タンパク質に融合することができる。
ＢＴＮＬ９以外のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、他の種の固有の利点（例えば、二量体、三量体、またはより高次の多量体を形成する性質、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増大、および／または生物学的活性の増大など）を有し得る。「より高次の多量体」は、例えば、「二量体」と併せて使用する場合、２つを超えるポリペプチド鎖を含む多量体を意味する。「三量体またはより高次の多量体」のような句で使用する場合、より高次の多量体は、３つを超えるポリペプチド鎖を含む。したがって、より高次の多量体は、比較される多量体よりも多数のポリペプチド鎖を有する多量体である。融合タンパク質の調製技術は公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９９／３１２４１号およびＣｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（２００１）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：１２３−１３３）に記載されている。例として、抗体（必要に応じて、ＩｇＧ抗体）のＦｃ領域を含むポリペプチドまたは実質的に類似するタンパク質を、ＢＴＮＬ９ポリペプチドまたはそのフラグメントに融合することができる。抗体のＦｃ領域は、抗体由来のヒンジのほとんどまたは全部＋ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチドまたはこれらと実質的に類似する免疫グロブリンドメインである。論考については、Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２１２−２１３（１９８９）を参照のこと。Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃなど）であり得る。Ｆｃフラグメントは、天然のヒトまたは動物のＦｃフラグメントであり得る。二量体化を促進するＦｃ領域の短縮形態（すなわち、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインのいくつかの部分を欠く形態）も使用することができる。抗体および他の免疫グロブリンアイソタイプの他の部分を使用することができる。抗体のＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質は、二量体またはより高次の多量体を形成する可能性がある。抗体由来タンパク質の種々の部分を含む融合タンパク質は、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．（（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−３９），Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７−７０），Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ（ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１（１９９２）），Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（（１９９４），ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１）ならびに米国特許第５，４５７，０３５号および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１０１５１（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、変化したＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較してＦｃ受容体に対して低い親和性を有するという利点を有し得る。かかる組換え融合タンパク質が結合する細胞の、免疫エフェクター細胞による溶解を減少させることができるので、これは有利であり得る。かかるＦｃ領域の変更は、米国特許第５，４５７，０３５号および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１０１５１号（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。以下の実施例２は、ヒトＢＴＮＬ９の細胞外領域およびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質の産生を記載している。
ＢＴＮＬ９タンパク質を含む組換え融合タンパク質は、ロイシンジッパーを含むポリペプチドを含むことができる。公知のロイシンジッパー配列の中には、二量体化を促進する配列および三量体化を促進する配列がある。例えば、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９−６４（その関連する部分が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ロイシンジッパーは、しばしば他のアミノ酸が散在した４つまたは５つのロイシン残基を伴う反復性の７アミノ酸繰り返しを含む。ロイシンジッパーの使用および調製は、当該分野で周知である。
ＢＴＮＬ９融合タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーを含むことができる。一般に、ペプチドリンカーは、複数のポリペプチドが連結して多量体を形成し、タンパク質の連結部分の所望の機能に必要な可撓性または強剛性を与えるのに役立つ一続きのアミノ酸である。典型的には、ペプチドリンカーは、約１アミノ酸長と３０アミノ酸長との間である。ペプチドリンカーの例には、−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−、ＧＧＧＧＳ（配列番号９）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１１）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１５）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）が含まれるが、これらに限定されない。連結部分は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−８３（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９８９−９５（１９９３）、Ｎｅｗｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５４５−５３（１９９６）、および米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されている。これらの参考文献の関連部分（すなわち、リンカー記載部分）が、本明細書中で参考として援用される。
組換えＢＴＮＬ９融合タンパク質は、その正常なシグナル配列を欠き、その代わりにそれを異なるシグナル配列で置き換えたＢＴＮＬ９タンパク質を含むことができる。シグナル配列の選択は、組換えタンパク質が産生される宿主細胞の型に依存し、異なるシグナル配列を天然のシグナル配列で置き換えることができる。哺乳動物宿主細胞で機能的なシグナル配列の例には、以下が含まれる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；ヒトＩｇＫのシグナル配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ；配列番号３である）；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０ ３６７ ５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；および欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。これらのシグナル配列を記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。
ＢＴＮＬ９核酸
本発明は、本明細書中に記載のＢＴＮＬ９タンパク質（配列番号２のアミノ酸配列ならびにそのフラグメントおよび／またはバリアントを含むタンパク質が含まれる）をコードする単離された核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる）を包含する。これらの核酸は、とりわけ、組換えタンパク質の産生および組織サンプル中のＢＴＮＬ９核酸の存在の検出（例えば、診断での使用のため）に有用である。かかる核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。核酸は、ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする中断されていない読み取り枠を含むことができる。本発明の核酸分子には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方のＤＮＡおよびＲＮＡならびに対応する相補配列が含まれる。「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。化学合成された核酸（オリゴヌクレオチドなど）またはテンプレートから酵素的に合成された核酸（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物またはｃＤＮＡなど）の場合、かかるプロセスに起因する核酸が単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、個別のフラグメントの形態またはより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子をいう。
さらに、本発明は、（１）当該分野で周知の多数の方法（例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリッド形成、アレイへのハイブリッド形成など）によるＢＴＮＬ９核酸検出のためのプローブとして、（２）ＢＴＮＬ９核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして、または（３）例えば、アンチセンス核酸（ペプチド核酸が含まれる）、リボザイム、三重らせん形成分子、または干渉ＲＮＡでの発現阻害によるＢＴＮＬ９核酸発現を調節するための手段としての役割を果たし得る、ＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸のフラグメントを包含する。これらの任意のＲＮＡをコードするＤＮＡはまた、本明細書中で意味するＢＴＮＬ９核酸である。ＰＣＲプライマーは、ＢＴＮＬ９核酸配列に加えて、増幅された核酸の使用を容易にする他の配列（制限酵素切断部位など）を含むことができる。ＰＣＲは、以下の参考文献に記載されている：Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）。以下に説明されているように、ＰＣＲはＢＴＮＬ９ｍＲＮＡの過剰発現または過小発現を検出するために有用であり得、ＰＣＲプライマーをＢＮＴＬ９遺伝子の種々の部分から取ることができ、異なるスプライスバリアントを識別するために選択することもできる。アンチセンスＲＮＡ（およびこれをコードするＤＮＡ）、ＤＮＡ、または合成ヌクレオチドおよび発現を調節するためのその使用は当該分野で周知であり、例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８４），Ｃｅｌｌ ３６（４）：１００７−１５；Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１１）：３４５−５２；Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（６）：２３０９−１８；Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（２０）：７４４８−５１；Ｚｏｎ（１９８８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５（９）：５３９−４９；Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０（７）：２４３１−３５；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１４）：５７４９−６３；Ｇａｍｂａｒｉ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７（１７）：１８３９−６２；およびＬｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（３）：６４８−５２に記載されている。核酸を使用した遺伝子発現の調整技術を記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。同様に、干渉ＲＮＡ（およびこれをコードするＤＮＡ）および選択した遺伝子の発現を阻害するためのその使用は当該分野で周知であり、例えば、Ｆｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．７：３１−５７；Ｂｏｓｈｅｒ ａｎｄ Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ（２０００），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：Ｅ３１−Ｅ３６に記載されている。これらの参考文献の関連部分が、本明細書中で参考として援用される。さらに、例えば、Ｌｅｗｉｎ ａｎｄ Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ（２００１），Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７（５）：２２１−２８；Ｍｅｎｋｅ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ（１９９７），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１）：１７−３３；Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：２９３−３０１；Ｓｉｏｕｄ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１（５）：５７５−８８；およびＳａｎｔｉａｇｏ ａｎｄ Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７９（１２）：６９５−７０６に記載のように、リボザイムまたはＤＮＡザイムは特異的ＲＮＡの切断を目的とすることができ、それにより、遺伝子発現の阻害に使用することができる。これらの遺伝子発現調整方法を記載しているこれらの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。ＢＴＮＬ９発現を調節することができる核酸は、ＢＴＮＬ９機能のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ研究でまたは治療薬（必要に応じて、遺伝子療法薬）としての使用を見出すことができる。
本発明はまた、配列番号１の配列を含む核酸もしくはそのフラグメントまたは中ストリンジェンシー条件下、必要に応じて高ストリンジェンシー条件下で配列番号１のヌクレオチド配列（全長ＢＴＮＬ９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である）を含む核酸とハイブリッド形成する核酸（ここで、上記核酸は抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるタンパク質をコードする）を含む。ハイブリッド形成技術は当該分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１，（１９８９））およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４（１９９５））（その関連部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。フィルターハイブリッド形成のための中ストリンジェンシー条件には、約５０％ホルムアミド、約４２℃〜５５℃の温度での６×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成および約６０℃の０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。高ストリンジェンシー条件を、上記の通りだがおよそ６８℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を使用したハイブリッド形成条件と定義する。ハイブリッド形成および洗浄バッファーにおけるＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２６ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）を、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに使用することができ、洗浄（必要に応じて、少なくとも２回の洗浄）を、ハイブリッド形成完了後に１５分間行う。
当業者に公知であり、且つ以下にさらに記載のように（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲を参照のこと）、洗浄温度および洗浄塩濃度を、必要に応じて、ハイブリッド形成反応および二重鎖の安定性の基準となる基本原理の適用によって所望のストリンジェンシーが達成されるように調整することができるということを理解すべきである。公知の配列の核酸をハイブリッド形成する場合、ハイブリッドの長さを、核酸配列のアラインメント（例えば、ＧＡＰを使用）および最適な配列相補性領域（単数または複数）の同定によって決定することができる。５０塩基対長未満と予測されるハイブリッドのためのハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くするべきであり、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長超のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０[Ｎａ＋]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、[Ｎａ＋]はハイブリッド形成バッファー中のナトリウムイオン濃度である）。かかる各ハイブリッド形成核酸は、少なくとも１５ヌクレオチド（または少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも１００ヌクレオチド）である長さを有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲。
ＢＴＮＬ９核酸には、以下のポリヌクレオチドを含む核酸が含まれる：（１）配列番号１の全てまたは配列番号１のフラグメント（ここで、上記フラグメントはＴ細胞の増殖を阻害することができるＢＴＮＬ９タンパク質をコードする）；（２）配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．７％同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（ここで、アラインメントウィンドウが少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、または１２００ヌクレオチド長であり、上記配列が抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるＢＴＮＬ９タンパク質をコードする）；（３）本発明のＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸を検出もしくは増幅するために、またはＢＴＮＬ９ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を調節するために有用な配列番号１のフラグメントまたは実質的に類似する配列；（４）配列番号１と比較して単一のヌクレオチドの１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、６個以下、８個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、または３０個以下の変更を含むポリヌクレオチド（ここで、変更は、単一のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換であり得、ここで上記ポリヌクレオチドは、抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるＢＴＮＬ９タンパク質をコードすることができるか、またはかかるタンパク質のアンタゴニストとして役立ち得る）；および（５）本明細書中に記載のＢＴＮＬ９タンパク質（ヒトＢＴＮＬ９タンパク質のフラグメント、誘導体、およびバリアントが含まれる）をコードするポリヌクレオチド。
ＢＴＮＬ９タンパク質の作製方法
ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体（または抗イディオタイプ抗体）を下記のように作製することができる。ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体をコードする核酸を、本明細書中に記載のように、ベクターに導入することができ、このベクターを宿主細胞に導入することができる。ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体をコードする核酸を含むベクターおよび宿主細胞は、本発明に包含される。ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体を発現することができるような条件下で培養することができる。次いで、発現したＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体を、上記細胞を培養した培地または上記細胞から得て、当該分野で公知の多数の適切な任意の手段によって精製することができる。さらに、ＢＴＮＬ９タンパク質産生のための遺伝子工学的方法には、公知の方法に従った無細胞発現系での、細胞宿主での、組織での、および動物モデルでのポリヌクレオチド分子の発現が含まれる。
ベクターには、宿主での増殖のための選択マーカーおよび複製起点を含むことができる。ベクターは、さらに、適切な転写調節配列または翻訳調節配列（ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体をコードする核酸に作動可能に連結された哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子由来の調節配列など）を含むことができる。かかる調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、および転写および翻訳を調節する適切な配列が含まれる。調節配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列が抗ＢＴＮＬ９抗体またはＢＴＮＬ９タンパク質をコードする配列の転写を指示する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＢＴＮＬ９核酸配列に作動可能に連結されている。ＢＴＮＬ９タンパク質が融合タンパク質である場合、融合タンパク質の一部（例えば、シグナル配列）をコードする核酸配列がベクターの一部であり得、抗ＢＴＮＬ９抗体またはＢＴＮＬ９タンパク質をコードする核酸を、付加シグナル配列＋抗ＢＴＮＬ９抗体またはＢＴＮＬ９タンパク質を含むタンパク質がベクターによってコードされるようにベクターに挿入することができる。
ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体の発現に適切な宿主細胞には、原核生物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および高等真核生物細胞が含まれる。ベクター中の調節配列を、宿主細胞中で作動可能なように選択する。適切な原核生物宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属の細菌、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーが含まれる。原核生物細胞（例えば、大腸菌）での発現について、ＢＴＮＬ９タンパク質または抗ＢＴＮＬ９抗体をコードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは、組換えポリペプチドの発現を容易にするためのＮ末端メチオニン残基を含む。Ｎ末端メチオニンを、必要に応じて、発現したポリペプチドから切断することができる。適切な酵母宿主細胞には、属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、およびＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属が含まれる）由来の細胞が含まれる。好ましい酵母宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。昆虫宿主細胞での発現に適切な系は、例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓによる概説（（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７）（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。適切な哺乳動物宿主細胞には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１），Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９５８），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ６０：１２７５−１２８１）、ＣＶ−１（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７０），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５：２１−２７）、ヒト腎臓由来の２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））カタログ番号ＣＲＬ−１０８５２（商標））、およびヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２）が含まれる。本段落中で言及した参考文献の関連部分が、本明細書中で参考として援用される。
細胞宿主で用いるための発現ベクターは、一般に、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。かかる遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、栄養要求性を与えるタンパク質をコードする。広範な種々のかかるベクターを、市販の供給源から容易に入手可能である。例には、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴベクターおよびｐＰＲＯＥＸベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択マーカー遺伝子を含む。酵母および大腸菌の両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと呼ばれる）も使用することができる。酵母ベクターの上記特徴に加えて、シャトルベクターは、大腸菌における複製および選択のための配列も含む。ＢＴＮＬ９または抗体をコードするヌクレオチド配列の５’末端に酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含めることによって、酵母宿主中で発現された標的ポリペプチドを直接分泌させることができる。Ｂｒａｋｅ（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：２６９−２８０。
哺乳動物宿主細胞での使用に適切な発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１−２８３２）、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。哺乳動物宿主細胞で用いるための発現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写調節配列および翻訳調節配列を含むことができる。ＢＴＮＬ９
ＲＮＡを発現するために使用することができる一般的に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター配列およびエンハンサー配列が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターを構築するための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５−９４１）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８−７７１）、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６号、およびＷＯ９１／１８９８２号に開示されている。これらの参考文献の関連部分が、本明細書中で参考として援用される。
ＢＴＮＬ９抗体
本明細書中に記載のＢＴＮＬ９タンパク質に特異的に結合する抗体、抗ＢＴＮＬ９抗体に結合する抗イディオタイプ抗体、およびこれらの抗体の使用は、本発明によって包含される。抗ＢＴＮＬ９抗体は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメント（配列番号２のアミノ酸３５〜２５７など）からなるポリペプチドに結合することができる。本明細書中で使用する場合、第１の抗体によるＢＴＮＬ９タンパク質上のエピトープの特異的結合とは、第１の抗体と競合する別の抗体によって、第１の抗体がＢＴＮＬ９タンパク質から移動させられることができるが、第１の抗体と結合を競合しない他の抗ＢＴＮＬ９抗体によって置き換えることができないことを意味する。多数の競合的結合アッセイが当該分野で公知である。
典型的には、抗体の結合の競合を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイによって評価することができる。目的の全抗体をビオチン化する。ビオチン化抗体を、抗体が結合する抗原を発現することが公知の細胞と組み合わせる。ビオチン化抗体が予想されるように細胞に結合する場合、蛍光強度のシフトが認められるはずである。同一の抗体の非標識バージョンとの細胞のプレインキュベーションにより、認められた蛍光のシフトが完全に消失するはずである。異なる非標識抗体とのプレインキュベーションにより、蛍光シフトが完全または部分的に消失し得るか、影響がない。後者の場合、非標識抗体が標識抗体と競合しないと結論付けられることになる。前者の場合、抗体は結合を競合し、本明細書中で意味する場合、蛍光シフトの消失が完全であったか部分的であったかどうかに依存して、エピトープが完全または部分的に重複すると結論付けられることになる。意図する抗体の中には、任意の特異的に提供された抗ＢＴＮＬ９抗体と完全または部分的に競合する抗体がある。
さらに、ＢＴＮＬ９タンパク質の存在下または非存在下での抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞の活性化に及ぼすＢＴＮＬ９抗体の影響により、抗体の機能的性質に関するさらなる有用な情報を得ることができる。本発明は、それぞれがＢＴＮＬ９の特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体およびこれらと結合を競合するモノクローナル抗体を含む。
ＢＴＮＬ９タンパク質上のエピトープは、隣接アミノ酸を含むことができ、ＢＴＮＬ９タンパク質の折り畳みによって近位になる非隣接アミノ酸も含むことができる。エピトープを、当該分野で公知の方法（タンパク質フラグメントまたはペプチドライブラリーの使用、アラニンスキャニング、エピトープ抽出、エピトープ切り出し、またはＸ線結晶学が含まれる）によって同定することができる。例えば、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（１２）：２２０８−１６；Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１７（１１−１２）：９３７−４４；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２（４）：９２１−２７；Ｏｂｕｎｇｕ ｅｔ ａｔ．（２００９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：７２５１−６０を参照のこと。これらの参考文献の関連部分（すなわち、エピトープマッピング法を記載している部分）が、本明細書中で参考として援用される。
抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、当該分野で周知の方法によって産生することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）；Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：２１９７；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術について記載）；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５）（ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術について記載）；．Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１６２−６４，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）（これらの参考文献の関連部分が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明のＢＴＮＬ９タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本明細書中で意図される。かかるハイブリドーマ系を従来の技術によって産生し同定することができる。本発明の抗体を産生するハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。さらに、抗ＢＴＮＬ９抗体を、他の培養細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）、またはＷＩ３８細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および細菌細胞（例えば、大腸菌が含まれる）が含まれる）中で産生することができる。かかる抗体を、抗体をコードする核酸＋これらの核酸を発現させることを可能にするための核酸を所望の宿主細胞に導入することによって産生することができる。次いで、抗体を、これらの核酸が導入された細胞を培養することによって産生することができる。モノクローナル抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤが含まれる）およびその任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４など）のモノクローナル抗体であり得る。
抗ＢＴＮＬ９抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む全長四量体抗体（ほとんどの哺乳動物種で見出されるものなど）であり得る。あるいは、抗ＢＴＮＬ９抗体は、１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、１つ以上の定常領域様ドメインも含む一本鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３）、二量体抗体または多価抗体（例えば、Ｌａｎｔｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：２００１−０５；Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１（５）：８４５−５５を参照のこと）、四量体抗体（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ ＩＩ，Ｃｈ．３，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１）を参照のこと）、キメラ抗体（Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ
Ｓｏｕｒｉａｕ，上掲；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−４６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−５５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−５４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−７０）、非ヒトトランスジェニック哺乳動物中で産生されたか（例えば、米国特許第６，１５０，５８４号に記載）もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（米国特許出願公開第２００２／００５８０３３号）による完全なヒト抗体、またはヒト化抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，上掲）であり得る。さらに、抗体を、変化した性質（例えば、それに結合するエピトープに対するより高い親和性など）を有する抗体を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択スキームによって「成熟」させることができる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−１９；Ｐｉｎｉ ａｎｄ Ｂｒａｃｃｉ（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１（２）：１５５−６９；Ｅｌｌｍａｒｋ
ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９（５−６）：３４９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１（１）：４９−５６；Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１；Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，上掲；Ａｄａｍｓ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｒ（１９９９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１−２）：２４９−６０；Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｐｌａｃｅｎｔａ ２１ Ｓｕｐｐｌ．Ａ：Ｓ１０６−１２を参照のこと。あるいは、本発明のＢＴＮＬ９タンパク質に特異的に結合することができる抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）など）も、本明細書中で抗ＢＴＮＬ９抗体として意味するものに包含される。ＦａｂおよびＦｖフラグメントの論考については、Ｋｕｂｙ，上掲，ｐｐ．１０９−１１２およびＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，上掲を参照のこと。本発明はまた、ＢＴＮＬ９タンパク質に特異的に結合する抗体に特異的に結合し、ＢＴＮＬ９タンパク質の効果を模倣する抗イディオタイプ抗体を包含する。かかる抗イディオタイプ抗体は、ＢＴＮＬ９タンパク質と同一の用途が見出される。抗イディオタイプ抗体を生成するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，上掲，３７１−７２を参照のこと。本発明のＢＴＮＬ９タンパク質および別のタンパク質に特異的に結合することができる種々の組換えおよび非組み換えの二重特異性抗体も意図される。種々の二重特異性抗体およびそれらを作製するための方法は、例えば、米国特許第４，４７４，８９３号、同第６，０６０，２８５号、および同第６，１０６，８３３号に記載されている。
抗ＢＴＮＬ９抗体は、多量体抗体（２つの完全な重鎖および２つの完全な軽鎖を含む全長四量体二重特異性抗体または、例えば、１つの重鎖＋１つの軽鎖＋１つのＦｃ領域を含む多量体１価抗体が含まれる）であり得る。かかる多量体抗体は、ヘテロ二量体の形成を容易にするそれらのＦｃ領域に特定の変異を含み得る。かかる抗体および変異は、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国特許出願公開第２００７／０１０５１９９号（かかる抗体および変異を記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。かかる抗体中のＦｃ領域は、天然のヒト配列または他の種由来の天然の配列を有することができる。あるいはまたはさらに、かかる抗体のＦｃ領域は、種々のＦｃ受容体のＦｃ領域に対する親和性の増加または減少によってエフェクター機能が増加または減少する、Ｆｃ領域の変異を含むことができる。いくつかのかかるＦｃの変化は、米国特許第５，４５７，０３５号および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１０１５１号（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）に論じられている。
抗体は、米国特許出願公開第２００４／０５８８２０号（これらの単一ドメイン抗体を記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載のように、抗体の別の部分に必要に応じて融合した単一の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを含むことができる。
ラクダおよびラマで見出されているいくつかの天然に存在する抗体は、２つの重鎖からなる二量体であり、軽鎖を含まない。Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０（これらの抗体の構造を記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）。この構造を有する抗ＢＴＮＬ９抗体は、本発明の抗ＢＴＮＬ９抗体に含まれる。
抗ＢＴＮＬ９抗体は、種々の活性および用途を有し得る。抗ＢＴＮＬ９抗体は、例えば、Ｔ細胞の増殖のＢＴＮＬ９依存性阻害の遮断または拮抗（本明細書中の実施例に記載の方法によってアッセイすることができる）によってＢＴＮＬ９の生物学的機能を遮断または阻害するアンタゴニスト抗体であり得る。抗体はまた、ＢＴＮＬ９の対構造物に結合してＢＴＮＬ９結合を模倣し、それによりＴ細胞の活性化または増殖を阻害するアゴニスト抗体であり得る。かかるアゴニスト抗体はまた、抗ＢＴＮＬ９抗体に結合し、ＢＴＮＬ９対構造物にも結合してＢＴＮＬ９の活性を模倣する（すなわち、本明細書中に記載のようにＴ細胞の増殖を阻害する）抗イディオタイプ抗体であり得る。かかる抗体を、ＢＴＮＬ９タンパク質と同一の用途のために使用することができる。抗ＢＴＮＬ９抗体は、例えば、おそらく細胞表面の他のタンパク質と組み合わせたＢＴＮＬ９タンパク質の安定化または破壊によってアゴニスト性であるかまたはアンタゴニスト性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）であり得る。例えば、アゴニスト抗体は、例えば、Ｂ細胞または他の細胞型の細胞表面でのＢＴＮＬ９の膜貫通形態の安定化またはＢＴＮＬ９タンパク質の他のＢＴＮＬ９タンパク質または異なるタンパク質との相互作用の安定化によってＢＴＮＬ９の活性を増強させることができる。さらに、アンタゴニスト抗体は、例えば、Ｂ細胞または他の細胞型の表面でのＢＴＮＬ９の膜貫通形態の不安定化または複数のＢＴＮＬ９分子間の相互作用またはＢＴＮＬ９の他のタンパク質との相互作用の不安定化によってＢＴＮＬ９活性を阻害することができる。アゴニスト抗ＢＮＴＬ９抗体はまた、ＢＴＮＬ９の膜貫通形態に結合し、それにより、ＢＴＮＬ９を発現する細胞に生物学的シグナルを伝達することができる。アンタゴニスト抗ＢＴＮＬ９抗体を使用して、免疫応答を増強することができる。それ故、アンタゴニスト抗ＢＮＴＬ９抗体は、例えば、ワクチン（例えば、癌特異的抗原に対する応答を誘導するためのワクチン）の使用を見出すことができる。
本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの本発明のＢＴＮＬ９タンパク質の存在を検出するためのアッセイで使用することもできる。抗体を、イムノアフィニティクロマトグラフィによる本発明のＢＴＮＬ９タンパク質の精製で使用することもできる。
ＢＴＮＬ９ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト
アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体に加えて、ＢＴＮＬ９タンパク質に特異的に結合することができる他の抗体関連分子（アフィボディ（Ｒｏｅｎｎｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１（１−２）：１９９−２１１（アフィボディを記載している部分が、本明細書中で参考として援用される））およびＢＴＮＬ９に特異的に結合してＢＴＮＬ９タンパク質の生物学的活性を阻害する国際特許出願公開第ＷＯ００／２４７８２号（これらのペプチドを記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載の生物学的に活性なペプチドなど）が本発明に包含される。さらに、ＢＴＮＬ９アンタゴニストには、ＢＴＮＬ９タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現を調整するのに有用な上記核酸（例えば、干渉ＲＮＡ（またはこれをコードするＤＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡなど）が含まれる。
アンタゴニストには、さらに、ＢＴＮＬ９またはその受容体に結合するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで選択されたアミノ酸配列を含み、必要に応じて、ＢＴＮＬ９およびその受容体の相互作用を干渉することができるタンパク質が含まれる。あるいは、かかるタンパク質は、ＢＴＮＬ９の生物学的機能を促進または模倣するＢＴＮＬ９アゴニストであり得る。ＢＴＮＬ９またはその受容体に結合するタンパク質を、ＢＴＮＬ９のその受容体との相互作用を妨害する能力についてスクリーニングすることができるか、あるいは、かかるタンパク質が直接得られるように選択をデザインすることができる。
タンパク質を、多数の方法（例えば、ファージディスプレイまたは細菌表面のディスプレイなど）によって選択することができる。例えば、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８９），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｌｕｚｚａｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９−８３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３（４）：３６６−３７２を参照のこと。これらの方法では、結合ドメインのライブラリーの各メンバーを各ファージ粒子または細菌細胞上にディスプレイすることができ、選択した条件下で目的のタンパク質に結合する細菌またはファージを選択することができる。選択した結合ドメインをコードする核酸を、選択したファージまたは細菌の成長およびこれらからの核酸の単離によって得ることができる。
あるいは、タンパク質を、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択することができる。例えば、潜在的な結合ドメインのライブラリー中の各ポリペプチドを、ポリペプチドをコードする核酸に結合させることができ、選択した条件下で目的のタンパク質に結合する核酸を選択することができる。ポリペプチドをこのポリペプチドをコードする核酸に結合させるので、その後の操作（増幅、クローニング、または有効な結合ドメインをコードする核酸の配列決定など）が容易である。かかる選択のための種々のスキームが当該分野で公知であり、そのスキームには、抗体−リボゾーム−ｍＲＮＡ粒子、リボゾームディスプレイ、共有結合性ＲＮＡ−ペプチド融合、または共有結合性ＤＮＡ−ＲＮＡ−ペプチド融合が含まれる。Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５（２４）：５１３２−５１３４；Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２；Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０２；Ｌｏｈｓｅ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．４（２）：１９８−２０４；Ｋｕｒｚ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１８）：Ｅ８３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１８：２６８−９３；Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４（２）：４０５−０８；米国特許第６，２６１，８０４号；国際特許出願公開第ＷＯ００／３２８２３号；およびＷＯ００／３４７８４号。どのようにしてかかる選択を行うことができるかを記載しているこれらの刊行物の一部が、本明細書中で参考として援用される。かかるタンパク質を、アンタゴニストまたはアゴニストであるように選択することができる。
治療用途
ＢＴＮＬ９．Ｆｃ融合タンパク質が活性化Ｔ細胞の増殖を阻害することができることを本明細書中で証明する。ＢＴＮＬ９はまた、活性化Ｔ細胞によるサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＩＬ−１７など）の産生を阻害する。ＢＴＮＬ９がＢ細胞に結合することができ、わずかな程度Ｔ細胞に結合することができることを蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によってさらに証明する。これらの知見は、ＢＴＮＬ９またはＢＴＮＬ９経路をアゴナイズする能力を有する分子がＴ細胞によって媒介される自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための治療薬として有用であり得ることを示す。かかる疾患には、例えば、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシス、および線維性疾患（アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変、強皮症、腎臓移植線維症、および肺線維症が含まれる）が含まれる。
ＢＴＮＬ９がＴ細胞への頑強な結合を示すことなくＴ細胞に影響を及ぼすという事実（以下の実施例で示すように）を、１つを超える方法で説明することができる。Ｔ細胞表面でのＢＴＮＬ９とその対構造物との相互作用が低親和性または一過性の結合相互作用であり得る。あるいは、Ｔ細胞への結合について試験するために本発明者らが使用したＢＴＮＬ９−Ｆｃ二量体分子は、Ｔ細胞に強固に結合するための正確な多量体でなくてよい。
ＢＴＮＬ９経路を遮断または阻害する分子は、腫瘍学の環境での用途を見出すことができる。ＢＴＮＬ９またはその受容体のいずれかに結合し、これらの分子の相互作用を遮断または阻害することができる抗体を、癌を処置するための治療薬として使用することができる。上記ＢＴＮＬ９の他のアンタゴニストも使用することができる。ＢＴＮＬ９経路遮断薬で処置することができる種々の癌のうちのいくつかには、多数の他の癌のうちで、急性または慢性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ性白血病、リンパ性リンパ腫または皮膚リンパ腫、癌腫、肉腫、胸腺腫、縦隔の新生物、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、各種皮膚癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆管新生物、小腸、結腸、または直腸の癌、腎臓または尿管の癌、睾丸癌、尿道または陰茎の癌、婦人科系腫瘍、卵巣癌、骨の肉腫、内分泌系の癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、および形質細胞新生物が含まれる。
上記の通り、ＢＴＮＬ９アンタゴニストはまた、ワクチンをより有効にするための薬剤としての用途を見出すこともできる。ＢＴＮＬ９を、任意の抗原に対する応答を誘導するためにワクチンと共に使用することができる。これらの抗原の中には、癌細胞（上記癌由来の細胞など）上で高発現する抗原がある。これらの癌抗原の中には、以下のヒトタンパク質がある：ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼ、ＣＥＡ、ＭＬＡＮＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、サバイビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、ＥＰＨＡ２、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、黒色腫アポトーシスインヒビター（ＭＬ−ＩＡＰ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＲＧ、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）、ペアードボックス３（ＰＡＸ３）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＣ、ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）、ＴＲＰ−２、ＧＤ３ガングリオシド、フコシルＧＭ１、メソテリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、テトラネクチン（ＴＮ）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１（具体的には、切断点を含むペプチド）、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２前駆体（ＯＹ−ＴＥＳ−１）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、ＬＣＫ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても公知）、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ−１、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、レグマイン、ＴＩＥ２、前立腺関連遺伝子４タンパク質（ＰＡＧＥ−４）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、プロタミン２（ＭＡＤ−ＣＴ−１としても公知）、グロムリン（ＦＡＰとしても公知）、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＸ２、ＳＳＸ５、Ｆｏｓ関連抗原１、ＣＤ２０、インテグリンαｖβ３、５Ｔ４腫瘍胎児性抗原、ＣＡＩＸ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ−２としても公知）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ１としても公知）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３としても公知）、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ５５、ＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても公知）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても公知）、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＭＨＣ ＩＩ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−６、シアリルルイスＹ、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬ６、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１としても公知）、ＣＤ４、ＣＤ７３、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６としても公知）、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知）、ＰＤＧＦＲβ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、多くの他の名称のうちで、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２としても公知）。癌抗原にはまた、ヒトヘルペスウイルス４タンパク質ＬＭＰ２、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、ならびにグリコセラミドグロボＨ（Ｇｉｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（６）：３２７０−３２７５（グロボＨを記載している部分が、本明細書中で参考として援用される）に記載）、α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブユニット、α４β７インテグリン、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が含まれる。
本明細書中に言及した任意の疾患の「処置」は、疾患の少なくとも１つの症状の緩和、疾患の重症度の軽減、またはより重篤な症状（幾つかの場合には、疾患を伴うか少なくとも１つの他の疾患をもたらし得る）への疾患の進行の遅延もしくは防止を包含する。処置は、疾患が完全に治癒することを意味する必要はない。有用な治療薬は、疾患の重症度の軽減、疾患またはその処置に関連する１つ以上の症状の重症度の軽減、または処置した状態に続いていくらかの頻度で起こり得るより重篤な症状またはより重篤な疾患の発症の遅延のみを必要とする。例えば、疾患が炎症性腸疾患である場合、治療薬は、腸内の個別の炎症部位数、腸の総罹患範囲を軽減し、痛みおよび／または腫脹を軽減し、症状（下痢、便秘、または嘔吐など）を軽減し、そして／または腸の穿孔を防止することができる。患者の状態を、標準的技術（バリウム注腸または高位浣腸法後に行うＸ線、内視鏡検査、結腸鏡検査、および／または生検など）によって評価することができる。適切な手順は、患者の状態および症状に応じて変化する。
疾患を処置するために使用される薬物の「治療有効量」は、疾患の重症度を軽減するか、疾患またはその処置に関連する１つ以上の症状の重症度を軽減するか、処置した状態に続いていくらかの頻度で起こり得るより重篤な症状またはより重篤な疾患の発症を遅延させることができる量である。
本発明は、炎症性疾患（全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシスなど）、線維性疾患（アテローム性動脈硬化症、肝硬変、強皮症、全身性エリテマトーデス、および肺線維症が含まれる）の処置方法を包含する。かかる処置は、治療有効量のＢＴＮＬ９タンパク質またはＢＴＮＬ９またはその受容体に結合するアゴニスト抗体を、特定の障害の重症度または障害に原因する症状の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続的改善を誘導するか、または、いくつかもしくは全ての場合における処置した状態に続くより重篤な疾患の発症を遅延または防止するのに十分な時間使用する工程を含む。したがって、本発明の処置を、一般的に使用される問題の障害の他の処置の前、後、または間に使用することができるか、または他の処置を使用せずに使用することができる。例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を、一般に、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、またはコルチコステロイドを使用して処置する。したがって、これらの処置を、本発明の処置の前、間、または後に使用することができる。
同様に、癌は、しばしば、化学療法薬を使用して処置され、かかる薬剤を、ＢＴＮＬ９アンタゴニスト治療薬（本明細書中に記載の抗ＢＴＮＬ９抗体など）と共に使用することができる。化学療法薬には、例えば、当該分野で公知の多数の治療薬のうち、以下の治療薬が含まれる：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メチルロムスチン、ストレプトゾトシン、ｃｉｓ−ジアミンジ−クロロ白金、アジリジニルベンゾ−キノン、およびチオテパ）；無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン塩酸塩、イフォスファミド、クロラムブシル、およびメクロレタミンＨＣｌ）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））；抗新生物性抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、マイトマイシン Ｃ、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、およびブレオマイシン）；植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ＶＰ−１６、およびＶＭ−２６）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート（ロイコボリン含有または非含有）、５−フルオロウラシル（ロイコボリン含有または非含有）、５−フルオロデオキシウリジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォルマイシン、ゲムシタビン、およびフルダラビン）；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）；ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびミトザントロン。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９３）（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
自己免疫状態または炎症状態については、Ｔ細胞を、例えば、アフェレーシスによって患者から取り出し、Ｔ細胞が調節表現型または阻害表現型に到達するように、ＢＴＮＬ９（必要に応じて、ＢＴＮＬ９＋他のタンパク質）を使用してｅｘ ｖｉｖｏで刺激することができる。次いで、Ｔ細胞を患者に戻すことができる。調節表現型または阻害表現型に到達するようにＴ細胞を刺激するために、Ｔ細胞を、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２の存在下で、ヒトＴ細胞アゴニスト抗ＣＤ３抗体、ｒＢＴＮＬ９．Ｆｃ、およびｒＢ７−１．ＦｃまたはｒＢ７−２．Ｆｃでコーティングした表面の存在下（例えば、ビーズを使用するかまたはマイクロタイタープレートウェル中で）インキュベートすることができる。あるいは、表面を、ｒＢＴＮＬ９またはＢＴＮＬ９．Ｆｃ＋アゴニスト抗ＣＤ３抗体を含有するタンパク質の組み合わせまたはこれらのタンパク質のみを含有する組み合わせでコーティングすることができる。１つの実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ３抗体、ｒＢＴＮＬ９．Ｆｃ、およびｒＢ７−１．ＦｃまたはｒＢ７−２．Ｆｃは、例えば、分子量比が２：１０：２．５であり得る。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２は、適切な濃度（例えば、ＴＧＦ−βについては約０．０５〜５ｎｇ／ｍｌまたは約０．０９または０．１ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２については約０．５〜１０ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌなど）であり得る。これにより、Ｔ細胞が阻害性または調節性になるようにプログラムすることができる。Ｔ細胞を、かかる状況で例えば３〜７日間インキュベートし、次いで採取し、同一の患者に戻すことができる。必要に応じて、Ｔ細胞を、約３，４，５，６または７日間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を休ませ（すなわち、Ｔ細胞受容体や共起刺激性刺激剤を使用することなく例えばＩＬ−２の存在下で培養し）、次いで、上記で説明するようにさらに約１回〜４回再刺激することもできる。かかるレジメを使用して処置可能な自己免疫状態または炎症状態には、例えば、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシス、および線維性疾患（アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変、強皮症、腎臓移植線維症、および肺線維症が含まれる）が含まれる。
任意の上記治療薬を、組成物の形態（すなわち、１つ以上のさらなる成分（生理学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または希釈剤など）を含む）で投与することができる。例えば、組成物は、本明細書中に記載の可溶性ＢＴＮＬ９タンパク質＋バッファー、抗酸化剤（アスコルビン酸など）、低分子量ポリペプチド（１０アミノ酸未満のポリペプチドなど）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストリンなど）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、グルタチオン、および／または他の安定剤、賦形剤、および／または防腐剤を含むことができる。組成物を、液体または凍結乾燥物として処方することができる。薬学的処方物で使用することができる成分のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８０）（その関連部分が本明細書中で参考として援用される）中に示されている。
上記治療分子を含む組成物を、任意の適切な手段（非経口、局所、経口、鼻、膣、直腸、または肺（吸入による）投与が含まれるが、これらに限定されない）によって投与することができる。注射する場合、組成物（複数可）を、ボーラス注射または連続注入によって関節内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下に投与することができる。経皮送達および埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）、皮膚パッチ、または坐剤からの徐放としての局所投与（すなわち、疾患部位における）が意図される。吸入による送達には、例えば、鼻腔吸入または経口吸入、噴霧器の使用、およびエアロゾル形態での吸入などが含まれる。体腔に挿入された坐剤を介した投与を、例えば、選択した体腔中への固体形態の組成物を挿入し、その組成物を溶解させることによって達成することができる。他の代替法には、点眼薬、経口用調製物（丸薬、ロゼンジ、シロップ、およびチューインガムなど）、および局所用調製物（ローション、ゲル、スプレー、および軟膏など）が含まれる。ほとんどの場合、ポリペプチドである治療分子を、局所投与するか、注射または吸入によって投与することができる。
上記治療分子を、処置される状態の処置に有効であり得る任意の投薬量、頻度、および期間で投与することができる。投薬量は、治療分子の分子の性質および処置される障害の性質に依存する。所望の結果を達成するのに必要な限り、処置を継続することができる。処置の周期は、処置の期間を通して持続してもしなくてもよい。例えば、処置を、最初に１週間間隔で行い、その後に隔週で行うことができる。数日、数週間、数ヶ月、または数年の期間の処置が本発明に包含される。処置を中断し、その後に再開することができる。最初の処置後に維持用量を投与することができる。
投薬量を、ミリグラム／キログラム体重（ｍｇ／ｋｇ）としてか、皮膚表面積１平方メートルあたりミリグラム（ｍｇ／ｍ２）としてか、身長や体重と無関係の固定用量として計り取ることができる。これらは、当該分野で標準的な投薬単位である。ヒトの皮膚表面積を、標準式を使用して身長および体重から計算する。例えば、ＢＴＮＬ９またはその受容体に結合する治療用ＢＴＮＬ９タンパク質または抗体を、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。あるいは、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの用量を投与することができる。あるいは、約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇの用量を投与することができる。
本発明を、具体的な実施例を参照して以下に記載する。これらの実施例は、本発明を制限することを決して意味しない。この開示の目的について、本発明に対し種々の変更や改変を行なうことができ、これらは十分に本発明の範囲内であることが理解される。当業者に容易に示唆を与える多くのの他の変更を行なうことができ、これらの変更は、本明細書中に開示され、添付の特許請求の範囲に定義されるとおり、本発明の精神の範囲内に包含される。
実施例
実施例１：ヒト免疫細胞および成体ヒト組織におけるヒトＢＴＮＬ９タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現
初代ヒト免疫細胞および種々の組織でのヒトＢＴＮＬ９をコードするｍＲＮＡの発現に関する情報を収集するために、以下の実験を行った。
初代免疫細胞を、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からの種々の商業的に利用可能な選択方法によって全血またはロイコパックから単離した。例えば、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）ヒトＴ細胞富化キットをＣＤ４＋Ｔ細胞富化キット（共にＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ由来）と組み合わせて使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した一方で、単球をＭｉｌｔｅｎｙｉ単球単離キットＩＩを使用して単離した。かかる市販の試薬を使用したかかる細胞分離は、当該分野で日常的である。マクロファージを、ネガティブ選択した単球の７日間のｅｘ ｖｉｖｏ成熟によって得た。各単離細胞集団を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析して、単離細胞集団が予想される細胞表面タンパク質を発現しているかどうかを決定した。ＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＨＧ−Ｕ１３３３ Ｐｌｕｓ ２．０）によって単離および評価した。ヒトＢＴＮＬ９転写物検出のためのデータ正規化および分析を、ＲＯＳＥＴＴＡ ＲＥＳＯＬＶＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。これらの分析結果を図２に示す。試験した種々の細胞型のうちで、その細胞表面にＣＤ１９を発現した細胞（図２のレーン６）（すなわち、Ｂ細胞）が、もっとも大量のＢＴＮＬ９を発現した。
成体ヒト組織におけるヒトＢＴＮＬ９発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したマイクロアレイ分析によって評価した。この分析結果を図３に示す。これらのデータは、ヒトＢＴＮＬ９が多数の異なる組織において広範に発現することを示す。組織のうちで最高のＢＴＮＬ９ｍＲＮＡ発現を示す組織は、以下の身体構造物由来の組織があった：副腎（図３中のレーン１）、結腸（図３中のレーン９）、心臓（図３中のレーン１１）、肺（図３中のレーン１９）、脾臓（図３中のレーン２６）、胸腺（図３中のレーン２８）、および白色脂肪組織（図３中のレーン２９）。
実施例２：ヒトＢＴＮＬ９．ＦｃおよびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃの調製
以下は、ヒトＢＴＮＬ９の細胞外領域およびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質をどのようにして作製したかを記載している。リンカー＋ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントに融合したヒトＢＴＮＬ９の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含む適切なベクターを構築した。配列番号１８はこのｃＤＮＡの配列を提供し、配列番号１９はこのｃＤＮＡによってコードされるＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を提供する。Ｃｏｓ ＰＫＢ細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＢＴＮＬ９．Ｆｃ哺乳動物発現構築物でトランスフェクトし、０．５％低Ｉｇ血清を含む完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。これらの方法は、Ｅｔｔｅｈａｄｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＩＮＡＳＥ ＢＡ ＥＮＨＡＮＣＥＳ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＩＮ ＴＲＡＮＳＩＥＮＴ ＳＹＳＴＥＭＳ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｔａｒｇｅｔ ｔｏ Ｍａｒｋｅｔ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １７ｔｈ ＥＳＡＣＴ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｔｙｌｏｅｓａｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ，Ｊｕｎｅ １０−１４，２００１，Ｖｏｌ．１，Ｌｉｎｄｎｅｒ−Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３１−３５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００１に詳述されている。組換えタンパク質の作製方法を記載しているこの参考文献の部分が、本明細書中で参考として援用される。トランスフェクション７日後、上清を採取し、ＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質をプロテインＡカラムクロマトグラフィ（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）ＳｕＲｅ ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。
マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質を、本質的に米国特許第７，２４４，８２２号に記載のように作製した。この構築物をＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃと呼ぶ。このタンパク質は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に融合したマウスＢＴＮＬ２タンパク質の細胞外領域を含む。この構築を記載している米国特許第７，２４４，８２２号の部分が、本明細書中で参考として援用される。マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質をコードする核酸配列およびＢＴＮＬ２．Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、米国特許第７，２４４，８２２号の配列番号２０および２１に報告されている。
実施例３：マウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に及ぼすヒトＢＴＮＬ９：Ｆｃ融合タンパク質の影響を決定するために以下の実験を行った。
実験あたり少なくとも５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した脾臓から調製した単一細胞の脾細胞懸濁物を使用して、マウスＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ＣＤ４＋ネガティブ選択キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ＦＡＣＳ分析によって評価したところ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は９０％超であった。組織培養処理マイクロタイタープレートを、種々の濃度の抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ ２Ｃ１１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）および１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含むＰＢＳにて４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳで洗浄し、指定量の表示のＦｃ融合タンパク質にて室温で４時間コーティングした。ウェルを再度ＰＢＳで洗浄し、次いで１〜２×１０５個の精製ＣＤ４＋脾細胞／ウェルを添加した。７２時間培養の最後の６時間での３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）の取り込みによってＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を決定した。ヒトＩｇＧ調製物由来のＦｃフラグメントを、ネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとして、マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ（以前にＴ細胞の増殖の阻害を示していた）およびヒトＢ７−２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）（Ｔ細胞の公知の陽性共刺激因子）も含めた。
結果を図４に示す。図４中のレーン１および２は、それぞれ１０μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ調製物由来のＦｃフラグメントを含むネガティブコントロールアッセイを示す。レーン３は、ヒトＢ７−２−Ｆｃタンパク質を含むポジティブコントロールアッセイ由来の結果を示す。レーン４は、マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ（陰性共刺激分子）を含むアッセイ由来の結果を示す。レーン５および６は、それぞれヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃの１０μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌを含むアッセイ由来の結果を示す。これらのデータによってマウスＴ細胞の増殖に及ぼすヒトＢ７−２−Ｆｃの刺激効果およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃの阻害効果が確認され、ヒトＢＴＮＬ９．ＦｃがマウスＴ細胞の増殖を阻害することができることを示す。
実施例４：ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に及ぼすヒトＢＴＮＬ９：Ｆｃ融合タンパク質の影響を決定するために以下の実験を行った。
ヒトＴ細胞を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１３０−０９１−１５５）を使用してヒト末梢血単核細胞から精製し、９０％を超えるＣＤ４＋細胞を含む細胞集団を得た。マウスＣＤ４＋増殖アッセイと同様に、組織培養処理マイクロタイタープレートを、種々の濃度の抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）および１０μｇ／ｍｌ ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含むＰＢＳにて４℃で一晩プレコーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳで洗浄し、指定量の表示のＦｃ融合タンパク質にて室温で４時間コーティングした。ウェルを再度ＰＢＳで洗浄し、次いで１〜２×１０５個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞／ウェルを添加した。７２時間培養の最後の６時間での３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）の取り込みによってＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を決定した。ヒトＣＤ４＋細胞に結合せず、且つＴ細胞の増殖への影響は知られていないので、Ｆｃタンパク質ｐ７．５Ｆｃを、ネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとしてマウスＢＴＮＬ２−Ｆｃを含めた。抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）のみに曝露した細胞もさらなるコントロールとして含めた。
結果を図５に示す。レーン１は、抗ＣＤ３抗体を含み、且つさらなるタンパク質を添加しなかったアッセイの結果を示す。レーン２および３は、抗ＣＤ３抗体＋ネガティブコントロールタンパク質ｐ７．５−Ｆｃをそれぞれ１０μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの濃度で含むアッセイの結果を示す。レーン４〜７は、抗ＣＤ３抗体＋ヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃをそれぞれ２０、１０、５、および２．５μｇ／ｍｌの濃度で含むアッセイの結果を示す。レーン８は、抗ＣＤ３抗体およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃを１０μｇ／ｍｌの濃度で含むアッセイの結果を示す。これらのデータは、ヒトＢＴＮＬ９．Ｆｃが濃度依存性様式でヒトＴ細胞の増殖を阻害することを示す。
実施例５：活性化ヒトＴ細胞によるサイトカインの産生
標準的な抗ＣＤ３増殖アッセイでは、上記のように、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＢＴＮＬ９．Ｆｃ（Ｔ細胞の増殖を阻害することが以前に示されている濃度で）または種々の他のＦｃ含有タンパク質を使用するか使用しないで、抗ＣＤ３抗体で刺激した。刺激７２時間後、１００μｌの上清を各条件から採取した。次いで、上清を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄから販売されている複数のサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＩＬ１β）を同時に検出するためのカスタマイズされた市販のキットを使用してサイトカインレベルについてアッセイした。かかるキットアッセイは、原理上はＥＬＩＳＡアッセイに類似しているが、複合検出テクノロジーを使用している。
図６Ａ〜６Ｅは、検出した、インターロイキン−２（図６Ａ）、腫瘍壊死因子−α（図６Ｂ）、インターフェロン−γ（図６Ｃ）、インターロイキン−１７（図６Ｄ）、およびインターロイキン−１３（図６Ｅ）のレベルを示す。全パネル中のレーン１〜７は、以下の成分を含むアッセイの結果を示す：（１）、抗ＣＤ３抗体またはいかなるさらなるタンパク質を使用しない細胞；（２）、抗ＣＤ３抗体のみを使用した細胞；（３）〜（５）、抗ＣＤ３抗体＋ヒトＩｇＧ、ｐ７．５−Ｆｃ、またはＨＢ１５−Ｆｃの各調製物を使用した細胞；（６）抗ＣＤ３抗体およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃを使用した細胞；および（７）抗ＣＤ３抗体およびＢＴＮＬ９．Ｆｃを使用した細胞。マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃと同様に、ＢＴＮＬ９．Ｆｃは、抗ＣＤ３抗体による刺激に応答したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン−１７、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子−α、およびインターフェロン−γの発現を阻害したが、インターロイキン−１３の発現を阻害しなかった。
実施例６：細胞結合研究
特異的細胞型ＢＴＮＬ９が何に結合するかを決定するために以下の実験を行った。マウス脾細胞の単一細胞懸濁物を生成し、次いで、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（２Ｃ１１−マウス；ＯＫＴ３−ヒト）、コンカナバリン（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ）Ａ（Ｃｏｎ Ａ）、または細菌リポ多糖（ＬＰＳ）で４８時間活性化した。コントロールとして非刺激細胞も含めた。非刺激細胞および刺激細胞を、ｈｕＢＴＮＬ９．ＦｃまたはコントロールＦｃ含有タンパク質を使用して氷上で６０分間染色した。洗浄後、結合したＦｃタンパク質を、ＦＡＣＳを使用してフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。さらに、これらの染色された細胞をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化ＣＤ３またはＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で同時染色して、混合細胞集団中のＴ細胞およびＢ細胞をそれぞれ特異的に同定した。サンプルを固定し、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
得られたデータは、ＢＴＮＬ９．ＦｃがＬＰＳで刺激したマウスＢ細胞に結合するが、非刺激マウスＢ細胞に結合しないことを示した。データは示していない。さらなるデータは、ＢＴＮＬ９．Ｆｃが刺激したマウスＴ細胞に結合するがそれはわずか限られた程度であり、非刺激マウスＴ細胞には検出可能に結合しないことを示した。これは、ＢＴＮＬ９のＴ細胞との相互作用が一過性および／または低親和性であり、したがって、本発明者らのＦＡＣＳアッセイの検出レベル未満であることを示し得る。
実施例７：ヒトＴ細胞の増殖の阻害は細胞死に起因しない
ＢＴＮＬ９．Ｆｃによる活性化ヒトＴ細胞の増殖の阻害が細胞死に起因するかどうかを決定するために以下の実験を行った。ＢＴＮＬ９．Ｆｃまたはコントロールタンパク質の存在下または非存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体による刺激後の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を検出するためのアッセイを使用して、細胞傷害性を検出した。ＬＤＨは、原形質膜の損傷および細胞死の際に上清に放出される安定な細胞質酵素である。ＬＤＨを、製造者の指示（ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従った７２時間の刺激後の比色反応によって検出した。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞を、細胞死による最大ＬＤＨ放出のポジティブコントロールとして使用した。同一の実験用アッセイウェルを使用して、細胞増殖阻害およびＬＤＨ放出を検出した。
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれＬＤＨアッセイおよび増殖アッセイの結果を示す。図７Ａおよび７Ｂの各レーン中に示したサンプルは、上記のこれらの図の簡単な説明中に詳述している。これらのデータは、ＢＴＮＬ２．ＦｃおよびＢＴＮＬ９．Ｆｃのいずれも抗ＣＤ３で刺激したＴ細胞の増殖の阻害に十分な濃度で細胞傷害性の影響を及ぼさないことを示す。したがって、これらのデータは、これらのタンパク質による細胞増殖の阻害が細胞死を伴わないことを示唆している。
実施例８：炎症性腸疾患患者由来の結腸組織中でのＢＴＮＬ９の高発現
ＢＴＮＬ９が正常な結腸組織と比較して炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）を罹患しているドナー由来の結腸組織中で過剰発現または過小発現するかどうかを決定するために以下の実験を行った。炎症性腸疾患を罹患していないドナーおよび潰瘍性大腸炎またはクローン病のいずれかを罹患しているドナー由来の結腸組織におけるヒトＢＴＮＬ９発現を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＢＴＮＬ９ｍＲＮＡ発現の検出量を、ハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）の発現に対して正規化した。ｃＤＮＡを生成するために、罹患組織または正常組織由来のＤＮアーゼ処理した（ＤＮＡ−ｆｒｅｅ，Ａｍｂｉｏｎ）総ＲＮＡ２０ｎｇを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して逆転写した。このｃＤＮＡを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）およびｈｕＢＴＮＬ９プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入；プローブセットＨｓ_００５３７３２０_ｍ１）を使用した定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間、次いで以下の温度レジメで４０サイクル：９５℃で１５秒間、その後に６０℃で１分間。各ＰＣＲ反応を、研究に含まれる各生物サンプルについて三連で行った。
結果を図８に示す。図８上の各点は、１人のドナー由来のデータを示す。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（Ｃｒｏｈｎｓ）のいずれかを罹患しているドナー由来の外科的に摘出した結腸組織における全ヒトＢＴＮＬ９ｍＲＮＡ発現は、炎症性腸疾患を罹患していないドナー由来の結腸組織におけるより高かった。正常組織と罹患組織との間の発現の相違は、ＵＣ組織およびＣｒｏｈｎｓ組織の両方について統計的に有意であった。これらのデータは、ＢＴＮＬ９ｍＲＮＡが潰瘍性大腸炎またはクローン病（２つの最も一般的な炎症性腸疾患）のいずれかを罹患しているドナーにおいて正常を超えるレベルで発現することを示す。これらの知見は、ＢＴＮＬ９がこれらの疾患に対する応答を媒介することにおいて役割を果たす可能性を示唆している。
実施例９：ＢＴＮＬ９の凝集の状態がＴ細胞の増殖に対するＢＴＮＬ９の阻害に及ぼす影響
本実験の目的は、ＢＴＮＬ９．Ｆｃの凝集の状態がＴ細胞の増殖を阻害するその能力で役割を果たすかどうかを決定することであった。様々な凝集の状態にあるＢＴＮＬ９．Ｆｃの精製画分を以下のように得た。ＢＴＮＬ９．Ｆｃを発現する哺乳動物細胞の培養上清から得たＢＴＮＬ９．Ｆｃを、プロテインＡクロマトグラフィによって精製した。より具体的には、ＢＴＮＬ９．Ｆｃを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中のプロテインＡカラムにロードした。カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した。ＢＴＮＬ９．Ｆｃタンパク質を５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ３．５）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を使用して中性ｐＨまで滴定した。ＢＴＮＬ９．Ｆｃを、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、３．８９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）にて実施したサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってさらに精製した。各々の個別画分を分析ＳＥＣによって分析し、次いで、保存のために３つの画分にプールした。プールした画分を濃縮し、５０μＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで処方し、分析ＳＥＣによって分析し、その結果を図９に示す。
プール画分１は、分析ＳＥＣで分子量が約９５８，０００ダルトンの単一ピークを示した。したがって、画分１は、ほとんど完全に高凝集した種を含んでいた。プール画分２は、２つのサイズクラスの分子のおよそ５０：５０混合物を含んでいた。この２つの主要ピークは分析ＳＥＣにおいて分子量が約９０３，０００ダルトンおよび５３１，０００ダルトンであった。したがって、画分２は、高凝集種と中程度のサイズの凝集種との混合物を含んでいた。画分３の８０％超が、より小さな種からなっていた。画分３の主要ＳＥＣピークは、見かけ上の分子量が約１９７，０００ダルトンであった。還元条件下で泳動したポリアクリルアミドゲルで決定したＢＴＮＬ９．Ｆｃのサイズがおよそ６５，０００ダルトンであるので、この種は二量体または大きくとも三量体であり得る。データは示していない。このサイズは、一部グリコシル化されたＢＴＮＬ９．Ｆｃ単量体の予想される分子量におよそ相当する。画分２中の約５３１，０００ダルトンの種は、それが単量体のサイズの約８倍であるので、八量体を含み得る。画分２および３中に存在する９００，０００ダルトン超の種は、より高次の多量体（おそらく、１４量体）である。
ＢＴＮＬ９．Ｆｃのこれらの精製画分を、上記のように行ったマウスおよびヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のアッセイで使用した。これらの実験の結果を図１０（マウスＴ細胞）および１１（ヒトＴ細胞）に示す。結果は、ＢＴＮＬ９．Ｆｃ画分１および２がマウスおよびヒトＴ細胞の増殖の両方において統計的に有意な阻害（コントロールとの比較）を示したことを示す。画分１は両アッセイにおいて画分２よりいくらか有効であったが、この相違における統計的有意性は決定されなかった。他方では、ＢＴＮＬ９．Ｆｃ画分３はマウスおよびヒトＴ細胞の増殖のいずれの阻害も示さなかった。したがって、これらのデータは、より高次の凝集体がより小さな種（二量体または三量体など）よりもＴ細胞の増殖の阻害に有効であることを示す。画分３中の主要な種を二量体として暫定的に同定したことに基づいて、これらのデータは、Ｔ細胞の増殖の阻害には少なくとも三量体のＢＴＮＬ９．Ｆｃが必要であるが、より高次の多量体（少なくとも四量体または五量体など）が必要であり得ることを示す。これらのデータの別の見解は、ＢＴＮＬ９タンパク質の単量体種の少なくとも約８倍の分子量の種がＴ細胞の増殖を有効に阻害することができるのに対して、ＢＴＮＬ９タンパク質の単量体種の分子量の約３倍の種が阻害できないことである。
実施例１０：脾臓中の毛細血管内皮中のＢＴＮＬ９の局在
ＢＴＮＬ９が脾臓中の血管組織で発現されるかどうかを決定するために以下の実験を行った。凍結ヒト脾臓組織を、７５％アセトン／２５％エタノールを使用して固定し、ヒトＢＴＮＬ９およびヒトＣＤ３１に特異的な抗体と組み合わせて染色した。ＣＤ３１は、血管内皮上に優先的に発現する。インキュベーションおよび洗浄後、二次抗体を、免疫蛍光による検出のために組織に添加した。最終洗浄後、切片をＤＡＰＩで染色し、画像処理した。ＢＴＮＬ９およびＣＤ３１染色の共局在は、脾臓における毛細血管内皮でのＢＴＮＬ９発現を実証する。脾臓はまた、より弱く染色されるＢＴＮＬ９＋／ＣＤ３１−細胞を含む。したがって、これらの結果は、ＢＴＮＬ９が脾臓における血管組織および非血管組織の両方に発現することを示す。

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  1. 明細書に記載された発明。
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