WO2005089802A1 - Il-６アンタゴニストを有効成分として含有する内耳障害治療剤 - Google Patents

Il-６アンタゴニストを有効成分として含有する内耳障害治療剤 Download PDF

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WO2005089802A1
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receptor
antibody
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inner ear
disorder
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PCT/JP2005/006202
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Masato Fujioka
Hirotaka James Okano
Kaoru Ogawa
Hideyuki Okano
Sho Kanzaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic and / or prophylactic agent for inner ear disorders.
  • the therapeutic and / or prophylactic agents of the present invention comprise interleukin-16 (IL-6) antagonist.
  • sensorineural hearing loss the one caused by inner ear (cochlear) or posterior labyrinth (eighth cranial nerve) is called sensorineural hearing loss.
  • sensorineural hearing loss There are various causes of sensorineural hearing loss, such as Meniere's disease, drug-induced inner ear disorders (inner ear disorders due to anticancer agents such as aminoglycosides, cisbratin), viral otitis media, suppurative otitis media, Fractures of the skull, acoustic nerve tumors. Sudden deafness, presbycusis, and noise impairment are also included in sensorineural deafness. Noise deafness can result from damage to the inner ear by loud noises such as chainsaws, internal combustion engines, heavy equipment, guns, and airplanes, and is associated with shooting, snowmobiles, air travel, and rock concerts.
  • the present invention seeks to provide a novel pharmaceutical preparation for treating and / or preventing inner ear disorders.
  • IL-6 is involved in the pathogenesis of sensorineural hearing loss, and that IL-6 antagonist has a therapeutic effect on sensorineural hearing loss. .
  • the present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for inner ear disorders containing IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the inner ear disorder is, for example, sensorineural deafness.
  • the sensorineural deafness may be caused by, for example, Meniere's disease, drug-induced inner ear disorder, viral otitis media, purulent otitis media, temporal bone fracture or auditory nerve tumor. Or sudden deafness, senile deafness or noise deafness.
  • the inner ear disorder is, for example, a vestibular disorder, which is, for example, a vestibular disorder caused by Meniere's disease, vestibular neuritis, or drug-induced inner ear disorder.
  • a vestibular disorder which is, for example, a vestibular disorder caused by Meniere's disease, vestibular neuritis, or drug-induced inner ear disorder.
  • the IL-6 antagonist is, for example, an antibody against the IL-6 receptor.
  • This IL-6 receptor antibody is, for example, a monoclonal antibody against IL-6 receptor, preferably a monoclonal antibody against human IL-6 receptor, or a monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor. It may be.
  • the monoclonal antibody against the human IL-6 receptor is, for example, a PM-1 antibody
  • the monoclonal antibody against the mouse IL-6 receptor is, for example, an MR16-1 antibody.
  • the antibody against the IL-6 receptor is preferably a recombinant antibody.
  • This recombinant antibody is, for example, a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • This humanized antibody is, for example, a humanized PM-1 antibody.
  • the present invention can also be described as follows.
  • the present invention can also be described as follows.
  • a method for treating and preventing or preventing inner ear disorders comprising administering IL-6 antagonist.
  • the antibody against the IL-6 receptor is used for the mouse IL-6 receptor.
  • FIG. 1 shows the results of Example 1, in which the anti-IL-6R humanized antibody (MR1 6-1) administration group of the present invention and mouse immunity were used in a mouse deafness model prepared at three different frequencies.
  • FIG. 9 is a graph showing the degree of decrease (dB) in hearing threshold for a glopurin G-administered control group.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing RT-PCR in Example 2, showing the time-dependent changes of various site proteins in the cochlea after acoustic loading of the SD rat.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR in Example 2 showing the time course of TNFa in the cochlea after acoustic loading of the SD rat.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR in Example 2 showing the time course of IL-6 in the cochlea after acoustic loading of the SD rat.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR in Example 2 showing the time course of IL-13 in the cochlea after acoustic loading of the SD rat.
  • Figure 6 shows the results of Example 2 in which the SD rat tissue after 6 hours of acoustic load was detected for IL-6 using an anti-mouse IL-6 antibody using Vectastein ABC kit. It is a drawing substitute photograph shown.
  • Figure 7 shows the results of Example 2 in which the SD rat tissue after 6 hours of acoustic load was detected using Vectaste in ABC kit to detect IL-6 using an anti-mouse IL-6 antibody. It is a drawing substitute photograph shown.
  • FIG. 8 shows that after the C57BL / 6J mouse was overloaded with 124dB loud noise for 2 hours, the MR16-1 of the present invention (anti-IL-6R humanized antibody prepared in Reference Example 4) or rat IgG (control) was used.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of measuring the expression of total STAT3, Erk, and Akt, and phosphorylated STAT3, Erk, and Akt in the inner ear organ of Corti after administration of E. coli.
  • the therapeutic agent of the present invention is effective in suppressing the progression of hearing loss in cochlear tissue disorders, ie, inner ear sensorineural hearing loss.
  • the therapeutic agent of the present invention is effective in suppressing hearing loss in a high-frequency range in sensorineural hearing loss.
  • Vestibular dysfunction is a disease that involves hair cell damage as well as sensorineural hearing loss.
  • the cochlea is impaired, and the cochlea and the vestibule control different sensations, but structurally both hair cells and supporting cells are wrapped in lymphatic fluid, similar tissue organization and physical The characteristics are responsible for the physiological function.
  • the therapeutic agent of the present invention is useful for treating inner ear disorders such as sensorineural hearing loss and vestibular disorders.
  • IL-6 is a site-powered insulin also called B-cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon-2.
  • BSF2 B-cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B-lymphocyte cells (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), and subsequently functions in various cells. It has been found that this is a multifunctional site-influencing factor that affects Adv. (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). I-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which I-6 binds (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-).
  • 981 Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-82
  • the IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly consisting of its extracellular region, in addition to a membrane-bound type expressed through the cell membrane and expressed on the cell membrane.
  • the other is a membrane protein gpl30 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signal transduction.
  • IL- 6 and IL-6 receptor IL- 6 / IL - form a 6 receptor complex, then Ri by the fact that bind g PL30, the biological activity of IL-6 is transmitted into cells that (Ta g a, T. et al ., Cell (198).
  • IL-6 antagonist is a substance that inhibits the transmission of IL-6 biological activity. So far, antibodies against IL-6 (anti-IL-6 antibody), antibodies against IL-6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibodies against gpl30 (anti-gpl30 antibody), IL-6 variants, IL-6 -6 or IL-6 receptor partial peptide is known. There are several reports on anti-IL-6 receptor antibodies (Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, YW et al., Hybridoma (1993) 12 , 621-630, International Patent Application Publication No. WO 95-09873, French Patent Application Publication No. FR 2694767, U.S. Patent No. US 5 21628).
  • the murine antibody PM_1 Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), CDR (complementarity de termining region)
  • CDR complementarity de termining region
  • a humanized PM-1 antibody obtained by inoculation into a human ⁇ JL body is known (International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • the IL-6 antagonist is preferably an antibody against IL-6 receptor, preferably a monoclonal antibody against human IL-6 receptor or a monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor.
  • the monoclonal antibody against the human IL-6 receptor is exemplified by PM-1 antibody
  • the monoclonal antibody against the mouse IL-6 receptor is exemplified by MR16-1 antibody.
  • the antibody is preferably a chimeric antibody, a humanized antibody or a humanized antibody, for example, a humanized PM-1 antibody.
  • a humanized antibody is a modified antibody, also referred to as a humanized antibody or a reshaped human antibody.
  • the IL-6 antagonist used in the present invention may be of any origin, type, and shape as long as it is useful for the treatment and / or prevention of inner ear disorders.
  • IL-6 antagonist is a substance that blocks signal transduction by I6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • IL-6 antagonist is preferably a substance having an inhibitory effect on the binding of any of IL-6, IL-6 receptor and gpl30.
  • the IL-6 antagonist include an anti-IL-6 antibody, an anti-IL-6 receptor antibody, an anti-gpl30 antibody, an IL-6 variant, a soluble IL-6 receptor variant, or IL-6 or Partial peptide of IL-6 receptor ⁇ And low-molecular substances exhibiting the same activity as these.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferred.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by genetic engineering techniques in hosts transformed with expression vectors containing the antibody gene. . By binding to I-6, this antibody inhibits the binding of I-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of IL-6 biological activity into cells.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan General Meeting of the Society of Immunology, Scientific Records (1991) 21, 166).
  • Anti-IL-6 antibody-producing hybridomas are basically produced using known techniques.
  • IL-6 is used as a sensitizing antigen, and immunized with IL-6 according to a conventional immunization method. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method.
  • an anti-IL-6 antibody may be prepared as follows.
  • human IL-6 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies is Eur. J
  • the target IL-6 protein is purified from the host cells or the culture supernatant by a known method, and the purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen. Further, a fusion protein of the IL-6 protein and another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing the antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to the IL-6 receptor, this antibody inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of the biological activity of IL-6 into cells.
  • Such antibodies include the MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928) and the PM-1 antibody (Hi rata , Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No.W092-19759).
  • a particularly preferred antibody is the PM-1 antibody.
  • the PM-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as PM-1 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Central No. 6). The first year (1989) was deposited internationally under the Pust Treaty on July 12, FERM BP-2998.
  • the MR16-1 antibody-producing hybridoma cell line is a rat-mouse hybridoma MR16-1, and is a registered trademark of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). 6) On March 13, 1997, the Budapest Treaty was referred to as FERM BP-5875. Deposited internationally under PT / JP2005 / 006202.
  • An anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, using the IL-6 receptor as a sensitizing antigen, immunizing the immunized cells according to the usual immunization method, fusing the obtained immune cells with a known parent cell by a normal cell fusion method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the usual screening method.
  • an anti-IL-6 receptor antibody may be prepared as follows.
  • human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies is described in European Patent Application Publication No. EP 325474, and mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579.
  • mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and released from the cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) ) 108, 673-676).
  • Soluble IL-6 receptor antibody consists essentially of the extracellular region of the IL-6 receptor bound to the cell membrane, and lacks the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. Is different from the membrane-bound IL-6 receptor.
  • the IL-6 receptor protein can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention, any IL-6 receptor may be used.
  • the desired IL-6 receptor protein is isolated from the host cell or the culture supernatant. Purification may be performed by a known method, and the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen. Cells expressing IL-6 receptor and fusion proteins of IL-6 receptor protein with other proteins May be used as a sensitizing antigen.
  • E. coli containing the plasmid pIBIBSF2R containing the cDNA encoding the human IL-6 receptor E. coli (E. coli) was published on January 9, 1989 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST).
  • HB101-P IB IBSF2R was deposited at the Patent Organism Depositary Center (Higashi 1-1-1 Higashi 1-Central, No. 6) under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-2232. RU
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing the antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody, by binding to gpl30, inhibits the binding of the 6ZIL-6 receptor complex to gpl30, blocking the transmission of IL-6 biological activity into cells.
  • Examples of such antibodies include the AM64 antibody (JP-A-3-219894), the 4B11 antibody and the 2H4 antibody (US 5571513), the B-S12 antibody and the B-P8 antibody (JP-A-8-291199), and the like. Is mentioned.
  • Anti g PL30 mono click polyclonal antibody production hybridoma can basically using known techniques, it can be prepared as follows. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen, and immunized according to a usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a normal screening is performed. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the method.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • gpl30 which is used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies, Obtained by using the gpl30 gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • g P 130 After the gene sequence of g P 130 is inserted into a known expression vector system suitable host cell is transformed, the host cells or, known methods g P 130 protein of interest from the culture supernatant
  • the purified gpl30 receptor protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein with another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Rodent animals for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphat e-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and then suspended.
  • a normal adjuvant such as Freund's complete, is used. It is preferable that an appropriate amount of adjuvant is mixed and emulsified, and then administered to a mammal several times every 4 to 21 days.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion particularly include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known in various cell lines, for example, P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550) , P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519) , MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, an RPMI1640 culture solution, a MEM culture solution, and other ordinary culture solutions used for this type of cell culture suitable for the growth of the myeloma cell line can be used. Yes, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared.
  • the cells are added at a concentration of 30 to 60% (w / v) and mixed to obtain the desired fused cells (c).
  • P2005 / 006202 Ibri dorma is formed.
  • a cell fusion agent or the like unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine). Culturing in the HAT culture medium is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually for several days to several weeks. Then, screening and cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen protein or an antigen-expressing cell to obtain a sensitized B lymphocyte.
  • the sphere can be fused with a human myeloma cell, for example, U266, to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or an antigen-expressing cell (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • an antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having a human antibody gene repertoire to obtain a desired human antibody according to the method described above (International Patent Application Publication No. W093 / 12227, W092 / 03918, 094/02602, W094 / 25585, W096 / 34096, W096 / 33735).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a conventional method, and the culture supernatant is obtained.
  • the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma. To grow as ascites, etc.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the production of anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridomas can be performed by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-139293.
  • the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi, Chuo No.6, Tsukuba, Ibaraki Pref.) was founded as FERM BP-2998 on July 12, 1989.
  • a method for purifying PM-1 antibody from the ascites by injecting PM-1 antibody-producing hybridoma deposited internationally based on the Treaty Protocol into the abdominal cavity of BALB / c mice, and using this hybridoma culture areas, for example, 10 0 down 0 ⁇ shea calf serum, 5% BM-Condimed HI ( Boehringer Ltd. Mannheim) containing RPMI1640 medium, hybridoma SFM medium (GIBC made 0-BRL), PFHM- II medium (GIBCO-manufactured BRL ) And purifying the PM-1 antibody from the culture supernatant.
  • PM-1 antibody-producing hybridoma deposited internationally based on the Treaty Protocol into the abdominal cavity of BALB / c mice, and using this hybridoma culture areas, for example, 10 0 down 0 ⁇ shea calf serum, 5% BM-Condimed HI ( Boehringer Ltd. Mannheim) containing RPMI1640 medium, hybridoma SFM medium
  • a recombinant type obtained by cloning an antibody gene from a hybridoma as a monoclonal antibody, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique is used.
  • Antibodies can be used (see, eg, Borrebaeck AK and Larrick J.. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, for example, a hybridoma. Isolation of mRNA can be performed by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). You can.
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • the 5-RACE method using the 5, -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR can be used.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and a desired recombinant vector is prepared by selecting a colony.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described below.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter, as described below.
  • a host cell can be transformed with this expression vector to express an antibody.
  • artificial modification was carried out for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans.
  • Recombinant antibodies for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human f / i bodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the PT / JP2005 / 006202 chimeric antibody is obtained by linking the DNA encoding the antibody V region obtained as described above to the DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into the host.
  • a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • plasmids containing DNAs encoding the V regions of the L and H chains of the chimeric PM-1 antibody are named pPM-k3 and pPM-hi, respectively.
  • Industrial and Marine Bacteria Limited Feguson Building, Craibst one Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdom
  • NCIMB 40366 and NCIMB40362 respectively, internationally deposited under the Budapest Treaty. ing.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting the complementarity-determining regions (CDRs) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, into the complementarity-determining regions of a human antibody.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • the general recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a DNA sequence designed to link the mouse antibody CDR and the framework region (FR) of a human antibody was constructed using several DNA fragments with overlapping portions at the ends. It is synthesized from oligonucleotides by the PCR method. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the human antibody C region, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400, See International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • FR of human antibody linked via CDR has good complementarity determining region Those that form an antigen-binding site are selected. If necessary, amino acids in the framework region of the antibody variable region may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • a human antibody C region is used for a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, Co / 2, C ⁇ 3 or can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody is composed of the variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a C region derived from a human antibody. It is composed of a framework region and a C region derived from an antibody, and has reduced antigenicity in a human body. Therefore, it is useful as an antibody used in the present invention.
  • humanized antibody used in the present invention examples include a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO92-19759). '
  • a technique for obtaining a human antibody by Panjung using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • a DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector for the sequence.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • expression should be carried out using a useful and commonly used promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal functionally linked to its 3 'downstream, or a vector containing the same.
  • the promoter / enhancer includes human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • SV40 simian virus 40
  • a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a virus-driven motor / enhancement factor 1 (HEF1a), may be used.
  • HEF1a virus-driven motor / enhancement factor 1
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 242) 2-2427), when using the araB promoter, the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be used.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when producing E. coli periplasm. After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see, eg, W096 / 30394).
  • Vectors are selectable markers such as aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposinole transferase (Ecogpt) gene, and dihydrofolate.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • TK thymidine kinase
  • Epgpt Escherichia coli xanthinguanine phospholiposinole transferase
  • Dihydrofolate Any production system can be used for producing the antibody used in the present invention, which can contain a reductase (dhfr) gene and the like.
  • Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells, such as African omega oocytes, or (3) ) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known, which may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi, for example, Aspergillus, for example, Aspergillus niger. (Aspergillus niger).
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity of animals.
  • an in vivo production system a production system using animals and a production system using plants can be used.
  • animals there are production systems using mammals and insects.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced in the animals or plants and collected.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat casein, to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene containing the antibody gene is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • Transgenics born from goats that have received embryos The desired antibody is obtained from milk produced by the goat or its progeny. Hormones may be used in the transgenic goat as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat. (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702) ⁇
  • the silkworm is infected with a paculovirus into which the desired antibody gene has been introduced, and a desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592- 594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a pacteria such as Agrobacterium tumefa ciens.
  • the bacteria are infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K.-Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). ).
  • the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to prepare the host.
  • the host may be transformed by co-transformation or by incorporating DNA encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523). ).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab,) 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which an Fv of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme, for example, papine or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme for example, papine or pepsin
  • host cells To be expressed (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, AH Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseau, J. et al., Methods s in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, RE et al., TIBT ECH (1991) 9, 132-137).
  • an enzyme for example, papine or pepsin
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker that connects the V regions for example, any single-chain peptide consisting of residues 12 to 19 of amino acid is used.
  • the scFv-encoding DNA is a type of DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody.
  • the DNA portion encoding the desired amino acid sequence is amplified by a PCR method using primer pairs defining both ends, and then the DNA encoding the peptide linker portion and both ends are amplified. And amplified by combining primer pairs that are defined so as to be linked to H and L chains, respectively.
  • DNAs encoding scFv are prepared, an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • the scFv can be obtained according to a conventional method.
  • antibody fragments are obtained and expressed in the same manner as described above.
  • PT / JP2005 / 006202 and can be produced by the host.
  • the “antibody” in the present invention includes fragments of these antibodies.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • the “antibody” in the present invention includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be isolated from inside or outside a cell or from a host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography. Columns used for affinity chromatography include, for example, a protein A column and a protein G column. Carriers used for protein A column include, for example, Hyper D, POSS, Sepharose F.F., and the like. In addition, separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography other than affinity chromatography, a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like. Wear.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration and the like. These chromatographies can be applied to HPLC (High perfor- mance liquid chromatography).
  • reverse negativity HPLC reversephase HP LC
  • reversephase HPLC reversephase HPLC
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, when the absorbance is measured, PB JP2005 / 006202
  • the measurement can be performed as follows. That is, in addition to 0. 1M bicarbonate buffer (P H9. 6) 1 ⁇ g / ml turbocharger diluted formic anti human IgG (manufactured by TAG) 100 / i 1 to 96 plates (manufactured by Nunc) at, Incubate at 4 ° C to solidify the antibody. After blocking, add appropriately diluted sample containing the antibody or antibody used in the present invention or human IgG (CAPPEL) ⁇ 1 as a standard, and incubate at room temperature for 1 hour. I do.
  • the modified IL-6 used in the present invention is a substance that has an activity of binding to an IL-6 receptor and does not transmit a biological activity of IL-6. That is, the variant IL-6 competitively binds IL-6 to the IL-6 receptor, but does not transmit the biological activity of IL-6, and thus blocks signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 variant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • IL-6 which is the source of the IL-6 variant, may be of any origin, but is preferably human IL-6 in consideration of antigenicity and the like.
  • the amino acid sequence of IL-6 can be determined using a known molecular modeling program, for example, WHATIF (Vriend et al., J. MoI. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting their secondary structure and then assessing their effect on the overall amino acid residue being replaced.
  • the vector containing the nucleotide sequence encoding the human IL-6 gene is defined as type ⁇ ⁇ and subjected to the usual PCR method.
  • a gene encoding a modified IL-6 can be obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector if necessary, and an IL-6 variant can be obtained according to the above-mentioned recombinant antibody expression, production and purification methods.
  • I6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357. -1367, WO 96-18648, W096--17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has a binding activity with IL-6 receptor or IL-6, respectively, and has a biological activity of IL-6.
  • a substance that does not transmit activity That is, the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide binds to the IL-6 receptor or IL-6, and by capturing these, IL-6 binds to the IL-6 receptor. Inhibits specifically. As a result, since it does not transmit the biological activity of IL-6, it blocks signal transduction by IL-6.
  • the partial peptide of IL-6 or the partial receptor for IL-6 receptor is a part or all of the region involved in the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor.
  • Is a peptide consisting of the amino acid sequence of Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide specifies the region involved in the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor A part or all of the amino acid sequence can be prepared by a generally known method, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and the above-mentioned modification is performed.
  • Type antibody expression, production and purification 2005/006202 can be obtained according to the method.
  • a method generally used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method is used. be able to.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction of the peptide chain from the support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can be usually used in the Boc method
  • TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • the Boc method for example, the above-mentioned protective peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisol. Next, the protecting group is removed and the peptide is cleaved from the support to recover the peptide. By freeze-drying this, a crude peptide can be obtained.
  • the Fmoc method for example, a deprotection reaction and a cleavage reaction of a peptide chain from a support can be performed in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying to HPLC.
  • the elution may be carried out under optimal conditions using a water-acetonitrile solvent generally used for protein purification.
  • the image corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile PT / JP2005 / 006202 Separate the sample and freeze-dry it.
  • the peptide fraction thus purified is identified by mass spectrometry molecular weight analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • I-6 partial peptide and the IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098 and US Pat.
  • the IL-6 signal transduction inhibitory activity of the IL-6 antagonist used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma cell line (S6B45, KPMM2), a human T-lymphoma T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell line MH60.
  • anti-IL-6 receptor antibody was found to have a therapeutic effect on inner ear disorders, so that IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibodies were used to treat inner ear disorders. It was suggested that it was useful as an agent.
  • the treatment target in the present invention is a mammal.
  • the mammal to be treated is preferably human.
  • the therapeutic / prophylactic agent for inner ear disorders of the present invention may be administered orally or parenterally.
  • PT / JP2005 / 006202 Can be administered locally or locally.
  • intravenous injections such as infusions, intramuscular injections, intrathoracic injections, intraperitoneal injections, subcutaneous injections, suppositories, enemas, and oral enteric agents can be selected, depending on the age and condition of the patient.
  • the administration method can be appropriately selected.
  • the effective dose is selected from the range of O. Olmg to 100 mg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient can be selected.
  • a preferable dose and administration method is, for example, in the case of an anti-IL-6 receptor antibody, an effective dose is such that free antibody is present in the blood.
  • an effective dose is such that free antibody is present in the blood.
  • 0.5 mg power per month (4 weeks) per kg (4 weeks) 40 mg, preferably lmg to 20 mg, divided once to several times, for example, twice a week, once a week, once a week
  • Intravenous injections such as infusions and subcutaneous injections can be administered on an administration schedule of once a week, four weeks, etc.
  • the dosing schedule should be 2 times / week or 1 time / week to 1 time / 2 weeks, 1/3 weeks, 1/4 weeks, etc., while observing the condition and observing trends in blood test values. It is also possible to make adjustments, such as by extending the time.
  • the therapeutic and / or prophylactic agent for inner ear disorder of the present invention may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives depending on the administration route.
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, lipoxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylyl.
  • mice Four-week-old C57BL / 6J mice were subjected to audiometric measurement by auditory brainstem response (ABR) the day before acoustic loading. Before the measurement, anesthesia was given to a sufficient depth by intraperitoneal injection of xylazine (Xyladine) and ketamine (Ketamine), and additional anesthesia with ketamine was performed as needed during the measurement.
  • ABR auditory brainstem response
  • ABR auditory brainstem response
  • Plosive stimulus Generates 0.1 ms rise / fall time (cosine gate) and 1 ms flat segment, and amplitude is determined by sound generator and attention Rea: i-Time Processor and Programmable Att Specified by TJP2005 / 006202 enater (model: RP2.1 and PA5, Tucker-Davis Technologies FL / USA). The sound level was measured using a Sound Level Meter (model: LA-5111, Ono Sokki Yokohama / Japan). For recording, stainless steel needle electrodes were placed on top of the left and right ears and on the side of the cavity.
  • ABR waveforms were recorded for 12.8 ms at a sampling rate of 40,000 Hz using a 50-5000 Hz bandpass filter setting, and the waveforms from 256 stimuli at a frequency of 9 Hz were averaged.
  • ABR waveforms were recorded at 5-dB SPL intervals below the highest amplitude until the waveform became invisible.
  • the frequency of the sound given for the threshold measurement was 3 kHz, 4 kHz, 12 kHz and 20 kHz, and the hearing threshold of each was measured.
  • Acoustic loading device (using the masking noise of the RI0N audio meter AA67N as a sound wave generator, amplified by SONY SRP-P150, F0STEX D-1405 as an amplifier, and then enclosed in a closed space with a speaker of about 12 cm in diameter.
  • the mouse was placed in a 3 cm-high cage made of metal mesh and placed 1 cm below the speaker. The cages were radially sectioned by wire mesh of similar properties, while four mice were placed in separate rooms.
  • the condition was set in advance so that a sound pressure of 124 ⁇ ldb was applied in the acoustic load device (measured multiple times during a 2-hour load by CASELA CE-231). I did a sound load.
  • the sound used was Octave band noise of 4 kHz SPL.
  • a thermometer was placed in the acoustic device to measure the temperature before and after the acoustic load.
  • the animals were divided into two groups, A and B, and rat IgG 2 mg / body or MR16-1 (anti-IL-6R humanized antibody prepared in Reference Example 4) 2 mg / body was administered in each group. Dosing should be a blind test, and subjects should be administered in each group until the hearing measurement in (4) is completed. Did not clarify the contents.
  • the difference between the hearing obtained in (4) and the hearing before treatment obtained in (1) of each individual was taken, and the degree of decrease in hearing threshold (dB) was calculated.
  • the average hearing threshold decrease (dB) was calculated for each frequency in each of the MR 16-1 administration group and the control group.
  • the above (4) was excluded because one animal died during the anesthesia and the hearing measurement became impossible.
  • the temperature inside the acoustic loader was 25 ° C before loading and 27 ° C after loading. The results are shown in Table 1 below and FIG.
  • the hearing loss was suppressed at 12 kHz and 20 kHz, as the distance from the site where the loud sound was applied and the tissue damage was directly affected, as compared with the control group.
  • the IL-6 receptor antibody has an effect on the tissue damage of the cochlea, that is, the spatial suppression of hearing loss in inner ear sensorineural hearing loss, or the effect of IL-6 receptor antibody on high-frequency hearing loss in sensorineural hearing loss. It is considered to have an effect on suppression.
  • Example 2 Inflammatory cytokine development in the cochlea after acoustic trauma a.
  • a hearing loss model was prepared in the same manner as in Example 1. Temporal bones were removed from each rat immediately, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 3 days, 5 days, 7 days, and 28 days after the acoustic load. The cochlea was isolated and the expression of various inflammatory cytokines was measured by the RT-PCR method while keeping the lymph fluid in the cochlea from leaking. The result is shown in figure 2. As can be seen from Fig. 2, expression of TNF, IL-1a, IL-1, IL-1 receptor antagonist (IL-1RA), and IL-6 was increased in the cochlea of the acoustic trauma model. . On the other hand, expression of IL-12p40 and GM-CSF was not observed.
  • immunohistochemical staining was performed on frozen sections using tissues 6 hours after acoustic loading. SD rats were used for animals, and the same method as in Example 1 was used. A hearing loss model was created, and decapitation was performed 6 hours after the noise load. The temporal bone was immediately removed, fixed with 4% paraformaldehyde for 6 hours, and decalcified with 0.5 mol / 1 EDTA solution. The sample was rapidly frozen using liquid nitrogen and cryostated. (CM3000, Leica) and cryosections were obtained by cutting to a thickness of 7 m. Immunohistochemical staining was performed on this section. Vectas te in ABCkit was used for staining, and the color was developed using a DAB solution.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a C57BL / 6J mouse was overloaded with 124 dB of loud noise for 2 hours, and immediately thereafter, intraperitoneally administered with MR16-1-2 mg / body or rat IgG 2 mg / body. Eight hours after the administration of the antibody, the temporal bone was excised, the inner ears were excised from both sides, and the organ of Corti was dissected, divided into the first rotation (apex) and the second rotation (basal), and each was collected from the left and right. I matched. The expression of total STAT3, Erk, and Akt and the expression of STAT3, Erk, and Akt were measured by Western blotting. Fig. 8 shows the results. As can be seen from FIG.
  • Example 2 Based on these results and the results of Example 2, the mechanism of action of the suppression of hearing loss by intraperitoneal administration of MR16-1 shown in Example 1 is based on the IL-6 signal expressed in the cochlea early after acoustic trauma. It is thought that the suppression effect of MR16-1 contributed.
  • Yamasaki et al. Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, PT / JP2005 / 006202
  • a soluble IL-6 receptor was prepared by PCR using a plasmid pBSF2R.236 containing a cDNA encoding the IL-6 receptor.
  • the plasmid pBSF2R.236 was digested with the restriction enzyme SphI to obtain an IL-6 receptor cDNA, which was inserted into mpl8 (Amersham).
  • the synthetic oligo primer designed so as to introduce a stop codon into the IL-6 receptor cDNA the IL-6 receptor was synthesized by the PCR method using the Invitro Mutagenesis System (Amersham). Mutations were introduced into the body cDNA. By this procedure, a stop codon was introduced at the position of amino acid 345, and c orchid A encoding a soluble IL-6 receptor was obtained.
  • soluble IL-6 receptor cDNA In order to express the soluble IL-6 receptor cDNA in CH0 cells, it was ligated with plasmid pSV (Pharmacia) to obtain plasmid pSVL344. Soluble IL-6 receptor cDNA cut with Hind Ill-Sal I was inserted into plasmid pECEdhfr containing dhfr cDNA to obtain CH0 cell expression plasmid pECEdhfr344.
  • the selected CH0 cells were screened by limiting dilution to obtain a single CH0 cell clone.
  • This CH0 cell clone was amplified with methotrexate at a concentration of 20 nM to 200 nM to obtain a human soluble IL-6 receptor-producing CH0 cell line 5E27.
  • the CH0 cell line 5E27 was cultured in Iscope modified Dulbecco's medium (IMDM, Gibco) containing 5% FBS. The culture supernatant was collected, and the concentration of soluble IL-6 receptor in the culture supernatant was measured by ELISA. That As a result, it was confirmed that soluble IL-6 receptor was present in the culture supernatant.
  • IMDM Iscope modified Dulbecco's medium
  • mice were immunized with lO g of recombinant I-6 (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (198 8) 17, 41) together with Freund's complete adjuvant, and anti-IL-6 was added to the serum. This was continued weekly until antibodies could be detected.
  • Immune cells were excised from local lymph nodes and fused with Myeoma cell line P3U1 using Polyethylene Dalicol 1500. Hybridomas are selected according to the method of Oi et al. Using HAT culture solution (Selective Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Co., i> an Francisco, 35 ⁇ , 1980) to produce anti-human IL-6 antibody Established Hypri-Dorma.
  • the hybridoma producing anti-human IL-6 antibody was subjected to IL-6 binding assay as follows. That is, a 96-well microporous microphone-mouth plate (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) made of flexible polyvinyl chloride was put in a 0.1 M carbonate-hydrogen carbonate buffer (pH 9.6) in 100 ⁇ l of jaw. The cells were coated with anti-mouse Ig (10 ⁇ l / ml, Malvern, PA, manufactured by Cooper Biomedical, Inc.) at 4 ° C. The plates were then treated for 2 hours at room temperature with 100 ⁇ l of PBS containing 1% psi serum albumin (BSA).
  • BSA psi serum albumin
  • the cells were treated with a glass filter, and the cells were processed with an automatic / pester (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). Egret anti-IL-6 antibody was used as a control.
  • the MH166 antibody inhibited 3H-thymidine uptake of MH60.BSF2 cells induced by IL-6 in a dose-dependent manner. This demonstrated that the MH166 antibody neutralized the activity of IL-6.
  • Sepharose 4B in which the anti-IL-6 receptor antibody MT18 prepared by the method of Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) was activated with CNBr. Fine Chemicals, Piscat away, NJ) and the IL-6 receptor (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828) was purified.
  • the human myeloma cell line U266 was purified from ImM p-paraaminophene-noremetansulfonyl fluorenolide hydrochloride containing 1% digitonin (Wako Chemicals), 10 mM triethanolamine (pH 7.8) and 0.15 M NaCl. (Digitonin buffer) and mixed with MT18 antibody conjugated to Sepharose 4B beads. Thereafter, the beads were washed six times with digitonin buffer to obtain partially purified IL-6 receptor for immunization.
  • mice were immunized four times every 10 days with the above partially purified IL-6 receptor obtained from 3 ⁇ 10 9 U266 cells, and thereafter, a hybridoma was prepared by a conventional method.
  • the binding activity of the hybridoma culture supernatant from the growth positive well to the IL-6 receptor was examined by the following method. 5 ⁇ 10 7 U266 cells were labeled with 35 S-methionine (2.5 mCi) and solubilized with the above digitonin buffer.
  • the solubilized U266 cells were mixed with 0.04 ml of MT18 antibody conjugated to Sepharose 4B beads, then washed six times with digitonin buffer, and added to 0.25 ml of digitonin buffer (pH 3.4). More 35 S-methionine-labeled IL-6 receptor was eluted and neutralized with 0.025 ml of 1 M Tris (pH 7.4).
  • the inhibitory activity of the antibody produced by Hypridoma PM-1 on the binding of IL-6 to the human IL-6 receptor was examined using the human myeloma cell line U266.
  • Human recombinant I-6 was prepared from E. coli (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41-45) and Bolton-Hunter reagent (New Engl and Nuclear, Boston, MA). ) I Ri 125 and I-labeled in (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981).
  • Hypridoma PM-1 inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor.
  • Monoclonal antibodies against mouse IL-6 receptor were prepared by the method described in Saito, T. et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.
  • Mouse soluble IL-6 receptor-producing CH0 cells are cultured in IMDM medium containing 10% FCS, and the anti-mouse IL-6 receptor antibody RS12 (see Saito, T. et al above) from the culture supernatant
  • the mouse soluble IL-6 receptor was purified using an affinity column immobilized on Affigel 10 gel (Biorad).
  • mice 50 ⁇ g of the obtained mouse soluble IL-6 receptor was mixed with Freund's complete adjuvant and injected into the abdomen of Wistarrat. Two weeks later, the mice were boosted with Freund's incomplete adjuvant. On day 45, rat spleen cells were collected, and 2 ⁇ 10 8 cells were treated with 1 ⁇ 10 7 mouse myeloma Itoda vesicle P3U1 and 50% PEG1500 (manufactured by Boehringer Mannheim) in the usual manner. After cell fusion, hybridomas were screened in HAT medium.

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Abstract

IL-6アンタゴニスト、好ましくは抗IL-6R抗体を有効成分として含有する内耳障害治療および／または予防剤。

Description

IL - 6アンタゴニス トを有効成分として含有する内耳障害治療剤
技術分野
本発明は、 内耳障害に対する治療およびノまたは予防剤に関する 。 本発明の治療および/また明は予防剤は、 イ ンターロイキン一 6 ( IL-6) アンタゴニス トを含んで成る。 書
背景技術
難聴のうち、 内耳性 （蝸牛性） あるいは後迷路性 （第 8脳神経性 ) によって生じるものを感音難聴と呼ぶ。 感音難聴の原因としては 種々のものがあり、 例えばメニエール病、 薬物性内耳障害 （ァミ ノ グリ コシド系、 シスブラチンなどの抗癌剤による内耳障害） 、 ウイ ルス性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折、 聴神経腫瘍が挙げられ る。 また、 突発性難聴、 老人性難聴、 騒音難聰も感音難聴に含まれ る。 騒音難聴は、 チェーンソー、 内燃機関、 重機、 銃、 飛行機など 大きい騷音を発するものによって内耳が障害される結果起こ り、 射 撃、 スノ ーモービル、 飛行機旅行、 ロ ックコンサー トなどが関連付 けられる。
感音難聴の原因は種々のものが考えられているが、 内耳の急性免 疫反応が永続的な聴力低下 （hearing loss) を引き起こすことが知 られてレヽる (Satoh H et al. , Laryngoscope. 2002 Sep； 112(9)： 16 27-34) 。 KLH (keyhole limpet hemocyanin)の内耳またはクモ膜下 への注入によって引き起こされた蝸牛における免疫反応では、 TNF- aおよび IL - 1 ]3が発現しており、 TNF-ひが蝸牛の疾患の増悪を引き 起こしていること、 および TNF -ひ阻害剤によ り聴力低下を部分的に おさえられることが報告されている （同文献） 。 しかしながら、 こ れまで感音難聴への IL-6の寄与については全く報告されていない。
非特許文献 1 Satoh H et al .， Laryngoscope. 2002 Sep ; 112 ( 9 ) : 1627-34
発明の開示
本発明は、 内耳障害治療および または予防のための新規な医薬 製剤を提供しよう とするものである。
本発明者らは鋭意研究の結果、 IL- 6が感音難聴の病態形成に関与 しており 、 IL-6アンタゴ-ス トが感音難聴の治療効果を有すること を明ら力、にした。
従って、 本発明は、 IL- 6アンタゴ-ス トを有効成分として含有す る内耳障害治療および Zまたは予防剤を提供する。
前記内耳障害は、 例えば感音難聴であり、 この感音難聴は、 例え ばメニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィルス性内耳炎、 化膿性内耳 炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因する感音難聴であり、 或い は突発性難聴、 老人性難聰または騒音難聴である。
或いは、 前記内耳障害は、 例えば前庭障害であり、 この前庭障害 は、 例えば、 メニエール病、 前庭神経炎または薬物性内耳障害に起 因する前庭障害である。
前記 IL- 6アンタゴニス トは、 例えば IL- 6受容体に対する抗体であ る。 この IL- 6受容体抗体は、 例えば IL- 6受容体に対するモノ ク ロ一 ナル抗体であり 、 好ましく はヒ ト IL-6受容体に対するモノクローナ ル抗体、 或いはマウス IL-6受容体に対するモノクローナル抗体であ つてもよい。 前記ヒ ト IL-6受容体に対するモノクローナル抗体は、 例えば PM-1抗体であり、 前記マウス IL- 6受容体に対するモノク ロー ナル抗体は、 例えば MR16-1抗体である。 前記 IL- 6受容体に対する抗体は、 好ましくは組換え型抗体である 。 この組換え型抗体は、 例えば、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体または ヒ ト抗体である。 このヒ ト型化抗体は、 例えばヒ ト型化 PM-1抗体で ある。
本発明はまた、 次のよ うに記载することが出来る。
[ I ] 内耳障害治療および Zまたは予防剤の製造のための IL- 6ァ ンタゴニス トの使用。
[ 2 ] 前記内耳障害が、 感音難聴である、 [ 1 ] に記載の使用。
[ 3 ] 前記感音難聴が、 メ ニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィル ス性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因す る感音難聴である、 [ 2 ] に記載の使用。
[ 4] 感音難聴が、 突発性難聴、 老人性難聴または騒音難聴であ る、 [ 2 ] に記載の使用。
[ 5 ] 前記内耳障害が、 前庭障害である、 [ 1 ] に記載の使用。
[ 6 ] 前記前庭障害が、 メニエール病、 前庭神経炎または薬物性 内耳障害に起因する前庭障害である、 [ 5 ] に記載の使用。
[ 7 ] 前記 IL- 6アンタ ゴニス トが、 IL-6受容体に対する抗体であ る、 [ 1 ] ~ [ 6 ] のいずれかに記載の使用。
[ 8 ] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である、 [ 7 ] に記載の使用。
[ 9 ] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 ヒ ト IL-6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 [ 8 ] に記載の使用。
[10] 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 マウス IL-6受容体に対す るモノ ク ローナル抗体である、 [ 8 ] に記載の使用。
[II] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 耝換え型抗体である、 [ 7 ] 〜 [10] のいずれかに記載の使用。
[12] 前記ヒ ト IL - 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 PM - 1 抗体である、 [ 9 ] に記載の使用。
[13] 前記マウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 MR 16-1抗体である、 [10] に記載の使用。
[14] 前記 IL - 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 [ 7 ] 〜 [13] のい ずれかに記載の使用。
[15] 前記 IL-6受容体に対するヒ ト型化抗体が、 ヒ ト型化 PM- 1抗 体である、 [14] に記載の使用。
本発明はまた、 下記の如く記载することが出来る。
[ 1 ] IL- 6アンタゴニス トを投与することを含んで成る、 内耳障 害治療および Zまたは予防方法。
[ 2 ] 前記内耳障害が、 感音難聴である、 [ 1 ] に記載の方法。
[ 3 ] 前記感音難聴が、 メニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィル ス性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因す る感音難聴である、 [ 2 ] に記载方法。
[ 4 ] 感音難聴が、 突発性難聴、 老人性難聴または騒音難聴であ る、 [ 2 ] に記載の方法。
[ 5 ] 前記内耳障害が、 前庭障害である、 [ 1 ] に記載の方法。
[ 6 ] 前記前庭障害が、 メニエール病、 前庭神経炎または薬物性 内耳障害に起因する前庭障害である、 [ 5 ] の記載の方法。
[ 7 ] 前記 IL- 6アンタゴニス トが、 IL- 6受容体に対する抗体であ る、 [ 1 ] 〜 [ 6 ] のいずれかに記載の方法。
[ 8 ] 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である、 [ 7 ] に記載の方法。
[ 9 ] 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 ヒ ト IL- 6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 [ 8 ] に記載の方法。
[10] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 マウス IL- 6受容体に対す るモノ ク ローナル抗体である、 [ 8 ] に記載の方法。
[ 11] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 耝換え型抗体である、 [ 7 ] 〜 [ 10] のいずれかに記載の方法。
[ 12] 前記ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 PM-1 抗体である、 [ 9 ] に記載の方法。
[ 13] 前記マウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 MR 16-1抗体である、 [ 10] に記載の方法。
[ 14] 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 [ 7 ] 〜 [ 13] のい ずれかに記載の方法。
[ 15] 前記 IL- 6受容体に対するヒ ト型化抗体が、 ヒ ト型化 PM - 1抗 体である、 [ 14] に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1の結果を示し、 3種類の周波数によ り作製した マウスの難聴モデルにおける、 本発明の抗 IL- 6Rヒ ト型化抗体 （MR1 6-1) 投与群およびマウス免疫グロプリ ン G投与対照群について、 聴力閾値の低下度 （dB) を示すグラフである。
図 2は、 SDラッ トに音響負荷を行なった後の蝸牛における、 各種 のサイ トカイ ンの経時的変化を示す、 実施例 2における RT- PCRを表 す電気泳動図である。
図 3は、 SDラッ トに音響負荷を行なった後の蝸牛における、 TNF aの経時的変化を示す、 実施例 2における定量的 RT- PCRの結果を表 すグラフである。
図 4は、 SDラッ トに音響負荷を行なった後の蝸牛における、 IL - 6 の経時的変化を示す、 実施例 2における定量的 RT-PCRの結果を表す グラフである。 図 5は、 SDラッ トに音響負荷を行なった後の蝸牛における、 IL- 1 3 の経時的変化を示す、 実施例 2における定量的 RT- PCRの結果を表 すグラフである。
図 6は、 実施例 2において、 音響負荷 6時間後の SDラッ トの組織 を、 Vec tas t ein ABC ki tによ り、 抗マウス IL- 6抗体を用いて IL- 6を 検出した結果を示す図面代用写真である。
図 7は、 実施例 2において、 音響負荷 6時間後の SDラッ トの組織 を、 Ve ctas t e in ABC ki tによ り、 抗マウス IL- 6抗体を用いて IL-6を 検出した結果を示す図面代用写真である。
図 8は、 C57BL/6Jマゥスに 124dBの過大音を 2時間負荷した後、 本発明の MR16- 1 (参考例 4で調製した抗 IL- 6Rヒ ト型化抗体） 又は ラッ ト IgG (対照） を投与した後の内耳コルチ器における、 to tal S TAT3、 Erk及び Akt、 並びにリ ン酸化 STAT3、 Erk及び Aktの発現を測 定した結果を示す電気泳動図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の治療剤は、 蝸牛の組織障害、 すなわち内耳性の感音難聴 における聴力低下の進行抑制に効果を有する。 特に、 本発明の治療 剤は、 感音難聴における高音域の聴力低下の抑制に効果を有する。 感音難聴と同じく有毛細胞の障害が関与する疾患と しては前庭障害 が挙げられる。 感音難聴では蝸牛が障害され、 蝸牛と前庭は異なる 感覚を司ってはいるものの、 構造上はどちらも有毛細胞、 支持細胞 がリ ンパ液につつまれ、 類似の組織構築とその物理的特性によって 、 生理的機能を担っている。 すなわち、 有毛細胞が感知するものが 音による揺れか、 加速度による リ ンパの動きかの違いで異なる感覚 を同様の機構で感知する仕組みとなっている。 蝸牛および前庭のい ずれも有毛細胞の障害が機能低下につながり、 薬剤に対する感受性 は極似している。 したがって、 本発明の治療剤は感音難聴、 前庭障 害などの内耳障害の治療に有用である。
IL - 6は B細胞刺激因子 2 (BSF2) あるいはイ ンターフェロ ン 2 とも呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL-6は、 B リ ンパ球系細胞の 活性化に関与する分化因子として発見され （Hirano, T. et al. ,Na ture (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を 及ぼす多機能サイ ト力イ ンであることが明らかになった （Akira, S . et al. , Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78) 。 Iい 6は、 T リ ンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （Lotz, M. et al. , J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258) 。
IL- 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 Iい 6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白 質の IL- 6受容体である （Taga, T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 1 66， 967-981, Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 241, 825 - 82
8)。 IL- 6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型 の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体としても存 在する。
もう一つは、 非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 IL- 6と IL-6受容体は IL- 6/IL - 6受 容体複合体を形成し、 次いで gpl30 と結合することによ り、 IL-6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga， T. et al. , Cell (198
9) 58, 573-581) 。
IL-6アンタゴニス トは、 IL- 6の生物学的活性の伝達を阻害する物 質である。 これまでに、 IL- 6に対する抗体 （抗 IL-6抗体） 、 IL-6受 容体に対する抗体 （抗 IL-6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gpl30 抗体） 、 IL- 6改変体、 IL- 6又は IL- 6受容体部分ペプチド等が 知られている。 抗 IL-6受容体抗体に関しては、 いくつかの報告がある （Novi ck , D. et al .， Hybr idoma ( 1991 ) 10 , 137 - 146 、 Huang , Y. W. et al .， Hybr idoma ( 1993 ) 12， 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95- 09873 、 フランス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM_1 ( Hirata , Y. et al .， J . Immuno l . ( 1989) 143， 2900-2906) の相捕性決定領域 （CDR ; com pl ementar i ty de termining regi on ) ヒ ト ^JL体へ 植するこ とに よ り得られたヒ ト型化 PM-1抗体が知られている （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 ) 。
前記 IL- 6アンタゴニス トは、 好ましくは IL- 6受容体に対する抗体 であり、 好ましくはヒ ト IL - 6受容体に対するモノクローナル抗体又 はマウス IL- 6受容体に対するモノク ローナル抗体である。 上記ヒ ト IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体としては PM- 1抗体が例示さ れ、 またマウス IL - 6受容体に対するモノクローナル抗体としては MR 16 - 1抗体が挙げられる。 前記の抗体は、 好ましく は、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体であり、 例えばヒ ト型化 PM - 1抗体であ る。 ヒ ト型化抗体は、 ヒ ト化抗体または再構成 （reshaped) ヒ ト抗 体とも称される改変抗体である。
本発明で使用される IL - 6アンタゴニス トは、 内耳障害の治療およ び/または予防のために有用なものであれば、 その由来、 種類およ び形状を問わない。
IL-6アンタゴニス トは、 Iい 6によるシグナル伝達を遮断し、 IL - 6 の生物学的活性を阻害する物質である。 IL- 6アンタゴニス トは、 好 ましく は IL-6、 IL- 6受容体及び gpl30 のいずれかの結合に対する阻 害作用を有する物質である。 IL-6アンタゴニス ト と しては、 例えば 抗 IL- 6抗体、 抗 IL-6受容体抗体、 抗 gpl30 抗体、 IL- 6改変体、 可溶 性 IL- 6受容体改変体あるいは IL- 6又は IL- 6受容体の部分べプチ ドぉ よび、 これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗 IL-6抗体は、 公知の手段を用いてポリ クロ ーナル又はモノク 口ーナル抗体と して得ることができる。 本発明で 使用される抗 IL-6抗体として、 特に哺乳動物由来のモノ ク ローナル 抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と しては、 ハ イブリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法によ り抗 体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生されるもの がある。 この抗体は Iい 6と結合するこ とによ り、 Iい 6の IL - 6受容体 への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断す る。
このよ うな抗体と しては、 MH166 (Matsuda, T. et al. , Eur. J. Immunol. (1988) 18， 951-956) や SK2 抗体 （Sato, K. et al. , 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（1991) 21， 166) 等が挙げら れる。
抗 IL- 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用し
、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 IL-6を感作抗原と して 使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リ 一二ング法によ り、 モノ ク ローナルな抗体産生細胞をスク リ一ユングすることによって作製できる。
具体的には、 抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用されるヒ ト IL - 6は、 Eur. J
. Biochem (1987) 168， 543 - 550 、 J. Immunol. (1988) 140， 153
4-1541 、 あるいは Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688 に開 示された IL-6遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる
IL - 6の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目 的の IL- 6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL- 6蛋白質を感作 抗原として用いればよい。 また、 IL - 6蛋白質と他の蛋白質との融合 蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。
本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ クローナル又はモノ ク 口ーナル抗体と して得るこ とができる。 本 発明で使用される抗 IL-6受容体抗体と して、 特に哺乳動物由来のモ ノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノク 口ーナル抗体 と しては、 ハイプリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産 生されるものがある。 この抗体は IL - 6受容体と結合することによ り 、 IL-6の IL- 6受容体への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細胞 内への伝達を遮断する。
このよ うな抗体と しては、 MR16-1抗体 ( Tamura , T. et al . Pro c . Nat l . Acad. Sc i . USA ( 1993 ) 90， 11924-11928 )、 PM- 1抗体 （Hi rata , Y. et al . , J. Immuno l . ( 1989 ) 143， 2900-2906) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64-7 抗体あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 )などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好まし い抗体と して PM - 1抗体が挙げられる。
なお、 PM- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM- 1と して、 独立 行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つく ば市東 1丁目 1番 1 中央第 6 ) に、 平成元年 （1989年） 7月 12日に 、 FERM BP- 2998と してプダぺス ト条約に基づき国際寄託されている 。 また、 MR16-1 抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 Rat- mouse hy br idoma MR16-1と して、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生 物寄託センター （茨城県つくば市東 1丁目 1番 1 中央第 6 ) に、 平 成 9年 （1997年） 3月 13日に、 FERM BP- 5875と してブダぺス ト条約 P T/JP2005/006202 に基づき国際寄託されている。
抗 IL- 6受容体モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的 には公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 IL- 6受容体を感作抗原と して使用して、 これを通常の免疫方法にし たがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公 知の親細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法によ り、 モノ ク ロ —ナルな抗体産生細胞をスク リ一二ングすることによつて作製でき る。
具体的には、 抗 I L- 6受容体抗体を作製するには次のよ うにすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用されるヒ ト IL - 6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス IL- 6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795号公報に開示された IL-6受容体 遺伝子/ァミノ酸配列を用いることによって得られる。
IL - 6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現しているものと細胞膜よ り 離脱しているもの （可溶性 IL- 6受容体） （Yasukawa , K. e t al .， J . B i ochem. ( 1990 ) 108 , 673-676) との二種類がある。 可溶性 IL - 6 受容体抗体は細胞膜に結合している IL- 6受容体の実質的に細胞外領 域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と 細胞内領域が欠損している点で膜結合型 IL- 6受容体と異なっている 。 IL-6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作 製の感作抗原として使用されう る限り、 いずれの IL - 6受容体を使用 してもよレ、。
IL - 6受容体の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中 から目的の IL- 6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL-6 受容体蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 IL-6受容体を 発現している細胞や IL - 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質 を感作抗原と して用いてもよい。
ヒ ト IL- 6受容体をコードする cDNAを含むプラスミ ド p IBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. co l i ) は、 平成元年 （1989年） 1月 9 日付で独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つ くば市東 1丁目 1番 1 中央第 6 ) に、 HB101- P IB IBSF2R として、 受 託番号 FERM BP-2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて レ、る。
本発明で使用される抗 gpl30 抗体は、 公知の手段を用いてポリ ク ローナル又はモノ ク ローナル抗体と して得ることができる。 本発明 で使用される抗 gpl30 抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノクロー ナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノク口ーナル抗体と しては 、 ハイプリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法によ り抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生される ものがある。 この抗体は gpl30 と結合することによ り、 Iい 6Z IL- 6 受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する。
このよ うな抗体と しては、 AM64抗体 （特開平 3- 219894号公報）、 4 B11抗体および 2H4抗体 （US 5571513) B-S12抗体および B-P8抗体 （ 特開平 8- 291199号公報） などが挙げられる。
抗 gpl30モノ ク ローナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 基本的には 公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 gpl3 0 を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細 胞と融合させ、 通常のスク リーニング法によ り、 モノ ク ローナル抗 体産生細胞をスク リーニングすることによつて作製できる。
具体的には、 モノ ク ロ ーナル抗体を作製するには次のようにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30 遺伝子/アミ ノ酸配列を用いることによつて得られる。
gP130 の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から 目的の gP130 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 gpl30 受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や gpl30 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ましく、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は 、 皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S ( Pho sphat e-Buffered Sa l ine ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望によ り通常のアジュパント、 例えば、 フロイ ント完全アジュパントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎 に数回投与するのが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用することができる。
このよ う に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ましい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミエ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8. 6 53 ( Kearney , J. F. e t al . J. Immno l . ( 1979 ) 123， 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 ( Current Topics in Microbiology and Immunolog y (1978) 81， 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J . Immunol. (1976) 6， 511-519 ) 、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al.， Cell (1976) 8， 405-415 ) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276, 269-270 ) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et a 1.， J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge ， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131 - 133 ) 等が適宜使用される。 前記免疫細胞とミエ口一マ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミノレスティンらの方法 （Kohler. G. and Milstein, 、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3 - 46) 等に準じて行う ことが できる。
よ り具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポリエチレングリ コール (PEG ) 、 センダイ ウィルス (HVJ ) 等 が使用され、 更に所望によ り融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1〜 10倍とするのが好ましい。 前記細胞融 合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖 に好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 (FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよく混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000〜6000 程度の PEG 溶液を通常、 30〜60 % (w/v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハ P2005/006202 イブリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し 、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによ りハイプリ ドー マの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 アミノブテリ ンおよびチミジンを含む培養液） で培養することによ り選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リー ニングおよびクローニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in vi t r oで所望の抗原蛋白質又は抗原発現 細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ トミエローマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所 望のヒ ト抗体を得るこ ともできる （特公平 1 - 59878 参照） 。 さ らに 、 ヒ ト抗体遺伝子のレパー ト リーを有する トランスジエニック動物 に抗原又は抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗 体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93/12227 、 W0 92/ 03918 、 0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/3373 5 参照） 。
このようにして作製されるモノク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL- 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3 - 139293に開示された方法により行う ことができる。 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 1 中央第 6) に、 平成元年 （1989年） 7 月 12日に、 FERM B P-2998としてブタぺス ト条約に基づき国際寄託された PM-1抗体産生 ハイブリ ドーマを BALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、 この 腹水から PM-1抗体を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培 地、 例えば、 100ン0ゥシ胎児血清、 5 %BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RPMI1640培地、 ハイブリ ドーマ SFM 培地 （GIBC 0-BRL 製） 、 PFHM- II 培地 （GIBCO- BRL 製） 等で培養し、 その培養 上清から PM-1抗体を精製する方法で行う ことができる。
本発明には、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いることができる （例えば、 Borrebaeck A. K. and Larric k J. . THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えばハイプリ ド 一マから、 抗体の可変 （V ) 領域をコードする mRNAを単離する。 mR NAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin ， J. M. et al. , Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al.， Anal. Biochem. (1987)162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purificati on Kit (Pharmacia 製） を用いることによ り mRNAを直接調製するこ とができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う ことができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5，- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） お よび PCR を用レヽた 5 RACE 法 (Frohman, M. A. et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998-9002； Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用することが できる。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベタ ター DNA と連結する。 さらに、 これよ り組換えベクターを作成し、 大腸菌等に導入してコ口ニーを選択して所望の組換えべクターを調 製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキ シ法によ り確認する。
目的とする抗体の V 領域をコ ー ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 又は、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を 、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク ターによ り宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型ィ匕 (Humanized) 抗体、 ヒ ト (human) f/i体を 使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。 P T/JP2005/006202 キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコードする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコードする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメラ抗体を得 ることができる。
例えば、 キメラ PM- 1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコー ドする DNA を含むプラスミ ドは、 各々 pPM-k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラスミ ドを有する大腸菌は、 National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limited (Ferguson Building, Craibst one Estate , Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdom) に 、 1991年 2 月 12日に、 各々 NCIMB 40366 及び NCIMB40362としてブダ ぺス ト条約に基づき国際寄託されている。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR)をヒ ト 抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子 組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国 際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR とヒ ト抗体のフレームワーク領域 (FR; framework region) を連結するよ うに設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラップする部分を有するよ うに作製した数個のォ リ ゴヌクレオチドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結されるヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のアミ ノ酸を置換してもよい
( Sat o , K. e t al . , Canc er Res. ( 1993 ) 53 , 851-856) 。
キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域と しては、 C γが挙げられ、 例えば、 C γ 1、 C o/ 2、 C γ 3又は を使用することができる。 また、 抗体又はその産生の 安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒ ト抗体 由来の C 領域からな-り、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域とヒ ト抗体由来のフレームワーク領域および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性が低下しているため、 本発 明に使用される抗体と して有用である。
本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ましい具体例と しては、 ヒ ト型化 PM-1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 '
また、 ヒ ト抗体の取得方法と しては先に述べた方法のほか、 ヒ ト 抗体ライブラリーを用いて、 パンユングにによ り ヒ ト抗体を取得す る技術も知られている。 例えば、 ヒ ト抗体の可変領域を一本鎖抗体 ( s cFv) としてファージディスプレイ法によ り ファージの表面に発 現させ、 抗原に結合するファージを選択することもできる。 選択さ れたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合するヒ ト抗体の可 変領域をコ一ドする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合 する s cFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列をを適当な発現べ クタ一を作製し、 ヒ ト抗体を取得することができる。 これらの方法 は既に衆知であり、 W0 92/01047 , W0 92/20791 , W0 93/06213 , W0 93/11236 , W0 93/19172 , W0 95/01438 , W0 95/15388を参考にする ことができる。
前記のよ うに構築した抗体遺伝子は、 公知の方法によ り発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターによ り発 現させることができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一として は、 ヒ トサイ トメガロウィルス前期プロモーター/ェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer ノ 挙げることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ 一ター ェ ンノヽンサ一と して、 レ ト ロ ウイノレス 、 ポリオ一マウイノレ ス、 アデノ ゥイ ノレス、 シミアンウィルス 40 (SV 40)等のウィルスプ 口モーター/ェン ヽンサーゃヒ トェロ ンゲーシヨ ンファクター 1 (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェンハンサーを 用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 (Mulligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 1 08 - 114)、 また、 HEFla 口モーターノエンハンサーを使用する場合 、 Mizushima らの方法 (Mizushima , S. and Nagata , S. Nucleic A cids Res. (1990) 18, 5322 ) に従えば容易に実施することができ る。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプ口モー ター、 araBプロモーターを挙げるこ とができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward， E. S. et al.， Nature (19 89) 341, 544-546； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 242 2-2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （B etter, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ レ、。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169， 4379-4383) を使用すればよい。 ペリプラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォール ド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィル ス、 ゥシパピローマウィルス （BPV)等の由来のものを用いるこ とが でき、 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べク タ一は選択マーカーと して、 アミ ノ グリ コシ ドホスホ トランスフエ ラーゼ （APH ) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キ サンチングァニンホスホリ ポシノレ トランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺 伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in V ivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を 用いる産生系がある。 動物細胞としては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば 、 CH0 、 COS 、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa、 Veroなど、 （2) 両生類細胞、 例えば、 アフリカッメガエル卵母細胞 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 などが知られ ている。 植物細胞と しては、 ニコチアナ · タパクム （Nicotiana ta bacum)由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミセス （Saccharomyce s)属、 例えばサッカロ ミセス · セレビシェ (Saccharomyces cerevi siae) 、 糸状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergillus)属、 例え ばァスぺノレギノレス · 二ガー (Aspergillus niger ) などカ 失口られて いる。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli)、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによ り抗体が得ら れる。 培養は.、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すこ とによ り、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が拳げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを 用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lications, 1993)。 また、 昆虫と しては、 カイ コを用いることがで きる。 植物を使用する場合、 例えばタパコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、 動物又は植物の体 内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ カゼ イ ンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子 の途中に揷入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が揷入さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる トランスジェニッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁か.ら所望の抗体を得る。 トラン スジ ニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用しても よレヽ。 （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699-70 2 ) ο
また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を揷入したパキュ ロウィルスをカイコに感染させ、 このカイコの体液より所望の抗体 を得る (Maeda, S. et al.， Nature (1985) 315, 592 - 594) 。 さら に、 タパコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター 、 例えば pMON 530に挿入し、 このベクターを Agrobacterium tumefa ciens のようなパクテリ アに導入する。 このバクテリアをタバコ、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉よ り所望の抗 体を得る (Julian, K. - Ma et al.， Eur. J. Immunol. (1994) 2 4, 131-138) 。
上述のように in vitro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H 鎖） 又は軽鎖 （L 鎖） をコー ドする DNA を別々 に発現べクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現べクターに 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し ては、 Fab、 F(ab，）2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリ ンカ一で連結 させたシングルチエイン Fv (scFv) が挙げられる。
具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝 子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で 発現させる （例えば、 Co， M. S. et al.， J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymolog y (1989) 178, 476-496 、 Plueckthun, A. & Skerra， A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、 Lamoyi, E. , Methods in E nzymology (1989) 121， 652-663 、 Rousseau , J. et al. , Method s in Enzymology (1989) 121, 663 - 66、 Bird, R. E. et al. , TIBT ECH (1991) 9, 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結することによ り得 られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカ一、 好ましくは、 ペプチドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S . et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ペプチドリ ンカ一と しては、 例えばァミノ酸 12 - 19 残基からなる任 意の一本鎖ぺプチドが用いられる。
scFvをコードする DNA は、 前記抗体の H 鎖又は、 H 鎖 V 領域をコ 一 ドする DNA 、 および L 鎖又は、 L 鎖 V 領域をコ一ドする DNA を铸 型と し、 それらの配列のうちの所望のアミ ノ酸配列をコー ドする DN A 部分を、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法によ り 増幅し、 次いで、 さらにペプチドリ ンカ一部分をコー ドする DNA お よびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるように規定するプライ マー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコ一ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現べクター、 および該発現べクターにより形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 P T/JP2005/006202 させ、 宿主によ り産生させることができる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリ コール （PEG )等の各種分 子と結合した抗体を使用することもできる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような抗体修飾物を得 るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ること ができる。 これらの方法はこの分野においてすでに確立されている 前記のよ うに産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ二ティークロマ トグラフィーにより行う ことがで きる。 ァフィ二ティークロマ トグラフィーに用いるカラムと しては 、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイン G カラムが挙げられる 。 プロテイン A 力ラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0 0S 、 Sepharo s e F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定され るものではない。
例えば、 上記ァフィ二ティークロマ トグラフィー以外のクロマ ト グラフィー、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組 み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製することがで きる。 ク ロマ トグラフィーとしては、 例えば、 イオン交換ク ロマ ト グラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これらのクロマ 卜グラフィーは HPLC ( Hi gh per formanc e l iqui d ch romatography) に適用し得る。 また、 逆ネ目 HPLC ( r ever s e phas e HP LC) を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は EL I SA 等によ り行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB JP2005/006202
S ( - )で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/inl を 1. 35 0D として算出する。 また、 ELISA による場合は以下のように測 定することができる。 すなわち、 0. 1M重炭酸緩衝液 （PH9. 6 ) で 1 μ g /mlに希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG製） 100 /i 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固 相化する。 ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト I gG ( CAPPEL 製） ΙΟΟ μ 1 を添加し、 室温にて 1時間ィンキュベーショ ンする。
洗浄後、 5000倍希釈したアルカリ フォスファターゼ標識抗ヒ ト I g G (BIO SOURCE製） 100 μ 1 を加え、 室温にて 1時間インキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MI CR0P LATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405im での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用される IL- 6改変体は、 IL- 6受容体との結合活性を有 し、 且つ IL- 6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL - 6 改変体は IL- 6受容体に対し IL- 6と競合的に結合するが、 IL-6の生物 学的活性を伝達しないため、 IL- 6によるシグナル伝達を遮断する。
IL - 6改変体は、 IL- 6のァミノ酸配列のァミ ノ酸残基を置換するこ とにより変異を導入して作製される。 IL - 6改変体のもと となる IL - 6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ましくはヒ ト IL-6である。
具体的には、 IL-6のァミ ノ酸配列を公知の分子モデリ ングプログ ラム、 たとえば、 WHATIF (Vr iend et al . , J. Mo l . Graphics ( 199 0 ) 8 , 52-56 ) を用いてその二次構造を予測し、 さらに置換される アミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。 適切な置換アミ ノ酸残基を決定した後、 ヒ ト IL-6遺伝子をコードす る塩基配列を含むべクターを铸型と して、 通常行われる PCR 法によ りアミ ノ酸が置換されるように変異を導入することによ り、 IL-6改 変体をコー ドする遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて IL- 6改変体を得ることができる。
Iい 6改変体の具体例と しては、 Brakenhoff et al . , J. Bio l. Ch em. ( 1994 ) 269， 86 - 93 、 及び Savino et al.， EMBO J. ( 1994) 13 ， 1357-1367 、 WO 96-18648 、 W096— 17869 ίこ開示されて ヽる。
本発明で使用される IL-6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 各々 IL- 6受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、 且つ IL- 6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL-6部分ペプチド 又は IL-6受容体部分べプチドは IL- 6受容体又は IL- 6に結合し、 これ らを捕捉することにより IL - 6の IL-6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 IL- 6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によ るシグナル伝達を遮断する。
IL-6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドは、 IL-6又は IL - 6 受容体のアミノ酸配列において IL- 6と IL- 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のァミノ酸配列からなるペプチドである。 この ようなペプチドは、 通常 10〜80、 好ましくは 20〜50、 より好ましく は 20〜40個のァミ ノ酸残基からなる。
IL - 6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドは、 IL- 6又は IL - 6 受容体のアミノ酸配列において、 IL-6と IL- 6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる 方法、 例えば遺伝子工学的手法又はべプチド合成法によ り作製する ことができる。
IL - 6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分ぺプチドを遺伝子工学的手 法によ り作製するには、 所望のペプチ ドをコー ドする DNA 配列を発 現ベクターに組み込み、 前記耝換え型抗体の発現、 産生及び精製方 2005/006202 法に準じて得ることができる。
IL-6部分べプチド又は IL-6受容体部分べプチ ドをぺプチド合成法 により作製するには、 ペプチド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、 続医薬品の開発第 14卷ペプチド合成 監修矢島治明 廣川書店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法とし ては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しよう とするべ プチドの C 末端に対応するアミ ノ酸を結合させ、 α - アミノ基及び 側鎖官能基を適切な保護基で保護したァミ ノ酸を C 末端から Ν 末端 方向の順番に 1 アミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したァ ミノ酸又はペプチドの アミノ基の該保護基を脱離させる反応を 交互に繰り返すことにより、 ペプチド鎖を伸長させる方法が用いら れる。 固相ペプチド合成法は、 用いられる保護基の種類により Boc 法と Fmoc法に大別される。
このよ うにして目的とするペプチドを合成した後、 脱保護反応及 びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応をする。 ペプチド鎖との切断 反応には、 Boc 法ではフッ化水素又はト リ フルォロメタンスルホン 酸を、 又 Fmoc法では TFA を通常用いることができる。 Boc 法では、 例えばフッ化水素中で上記保護べプチ ド樹脂をァニソール存在下で 処理する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチ ド を回収する。 これを凍結乾燥することによ り、 粗ペプチドが得られ る。 一方、 Fmoc法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護 反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行う ことができる。
得られた粗ペプチ ドは、 HPLCに適用することにより分離、 精製す ることができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水- ァセ トニ ト リル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。 得られたク ロマ トグラフィ一のプロファイルのピークに該当する画 P T/JP2005/006202 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このよ うにして精製したぺプチ ド画分について、 マススペク トル分析による分子量解析、 アミ ノ酸 組成分析、 又はアミ ノ酸配列解析等によ り同定する。
Iい 6部分べプチド及び IL- 6受容体部分べプチドの具体例は、 特開 平 2- 188600、 特開平 7-324097、 特開平 8- 311098及び米国特許公報 US 5210075に開示されている。
本発明で使用される IL - 6アンタゴニス トの IL- 6シグナル伝達阻害 活性は、 通常用いられる方法により評価することができる。 具体的 には、 IL- 6依存性ヒ ト骨髄腫株 （S6B45 , KPMM2) 、 ヒ トレンネル ト T リ ンパ腫細胞株 KT3 、 あるいは IL- 6依存性細胞 MH60. BSF2 を培養 し、 これに IL- 6を添加し、 同時に IL- 6アンタゴニス トを共存させる ことにより IL- 6依存性細胞の 3 H-チミジン取込みを測定すればよい また、 IL-6受容体発現細胞である U266を培養し、 1 2 5 1 標識 IL - 6 を添加し、 同時に IL- 6アンタゴニス トを加えることにより、 IL-6受 容体発現細胞に結合した 1 2 5 1 標識 IL- 6を測定する。 上記アツセィ 系において、 IL-6ァンタゴニス トを存在させる群に加え IL- 6ァンタ ゴニス トを含まない陰性コント口ール群をおき、 両者で得られた結 果を比較すれば IL- 6ァンタゴニス トの IL- 6阻害活性を評価すること ができる。
後述の実施例に示されるように、 抗 IL- 6受容体抗体により、 内耳 障害の治療効果が認められたことから、 抗 IL-6受容体抗体等の IL - 6 アンタゴニス トは内耳障害の治療剤と して有用であることが示唆さ れた。
本発明における治療対象は哺乳動物である。 治療対象の哺乳動物 は、 好ましく はヒ トである。
本発明の内耳障害治療/予防剤は、 経口的にまたは非経口的に全 P T/JP2005/006202 身あるいは局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの静 脈内注射、 筋肉内注射、 胸腔内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐薬 、 注腸、 経口性腸溶剤などを選択することができ、 患者の年齢、 症 状によ り適宜投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一 回につき体重 1 kgあたり O. Olmg から lOOmgの範囲で選ばれる。 ある いは、 患者あたり l〜1000mg 、 好ましく は 5〜50mgの投与量を選ぶ ことができる。
好ましい投与量、 投与方法は、 たとえば抗 IL- 6レセプター抗体の 場合には、 血中にフリ一の抗体が存在する程度の量が有効投与量で あり、,. 具体的な例と しては、 体重 1 kg.あたり 1 ヶ月 （ 4週間） に 0. 5mg力 ら 40mg、 好ましくは lmgから 20mgを 1回から数回に分けて、 例 えば 2回/週、 1回 週、 1 回 Z 2週、 1回 / 4週などの投与スケ ジュールで点滴などの静脈内注射、 皮下注射などの方法で、 投与す る方法などである。 投与スケジュールは、 病状の観察および血液検 査値の動向を観察しながら 2回/週あるいは 1回/週から 1回ノ 2 週、 1回 / 3週、 1回 / 4週のように投与間隔を延ばしていくなど 調整することも可能である。
本発明の内耳障害の治療および Zまたは予防剤は、 投与経路次第 で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい 。 このような担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容され る有機溶媒、 コラーゲン、 ポリ ビュルアルコール、 ポリ ビュルピロ リ ドン、 力ルポキシビ二ルポリ マー、 カルボキシメチルセルロース ナト リ ウム、 ポリ アク リル酸ナト リ ウム、 アルギン酸ナト リ ウム、 水溶性デキス トラン、 カルボキシメチルスターチナト リ ウム、 ぺク チン、 メチノレセノレロース、 ェチゾレセノレロース、 キサンタンガム、 ァ ラビアゴム、 カゼイ ン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリセリ ン、 プロ ピレ ングリ コール、 ポリエチレングリ コーノレ、 ワセリ ン、 パラフィ ン、 2 ステアリルアルコール、 ステアリ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （HSA ) 、 マンニ トール、 ソルビトール、 ラク トース、 医薬添加物と して 許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤 型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、 これ らに限定されるものではない。 実施例
以下、 実施例および参考例によ り本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1.
実験方法
( 1 ) 音響負荷前マウスの聴力測定-
4週令 C57BL/6Jマウス に対し、 音響負荷前日に聴性脳幹反応 （A BR) による聴力測定を行った。 測定前にはキシラジン （Xyladine) およびケタミ ン （Ketamine) の腹腔内注射により十分な深度の麻酔 を施し、 測定中必要に応じてケタミ ンによる追加麻酔を施行した。
(聴性脳幹反応） 上記のノィズ条件でノィズ誘発難聴の程度を知 るため、 聴性脳幹反応 （ABR) の閾値シフ トを試験した。 ABRの測定 は、 PowerLab system 、モテノレ ： PowerLob2/20， ADInstruments Cast leHill Australia) の Scopeソフ ト ウェア一の waveform storing及 び stimulus controlを用いて行い、 EEGの記録は細胞外増幅器 Digit al Biomap system (モデノレ ： BAL—l, Tucker-Davis rechnologies F L/USA) を用いて行った。 音刺激は、 マウスの外耳道に挿入された カプラー型ス ピーカー （モデノレ ： ESlspc, BioResearch Center 名 古屋 /日本） により発生させた。 破裂音刺激 0.1ms昇/降時間 （コサ インゲート） 及び 1 ms平坦セグメントを発生させ、 そして振幅は音 発生器及びアテンショ ン Rea:i - Time Processor及び Programable Att TJP2005/006202 enater (モデル ： RP2.1 and PA5 , Tucker-Davis Technologies FL/U SA) により特定した。 音レベルの測定は Sound Level Meter (モデ ル ： LA- 5111， Ono Sokki 横浜/日本） を用いて行った。 記録のため 、 ステンレス製針状電極を、 左耳及び右耳の頂部及び空洞側部に設 置した。 一般に、 ABR波形は、 50-5000 Hzパン ドパスフィルターセ ッティグを用いて 40,000Hzのサンプリ ング速度で 12.8msの間記録し 、 9 Hzの周波数における 256刺激からの波形を平均化した。 ABR波形 は最高振幅から下 5— dB SPL間隔で、 波形が視覚できなくなるまで 記録した。 閾値測定のために与えた音の周波数は 4 kHz、 12kHzお よび 20 kHzの 3種類と し、 各々の聴力閾値を測定した。
( 2 ) 難聴モデルの作成
音響負荷装置 （音波発生器と して RI0Nオーディオメ ト リ AA67Nの マスキングノイズを用い、 増幅器と して SONY SRP-P150, F0STEX D-1405によって増幅したのちに、 径約 12cmのスピーカーで密閉空間 内に負荷する装置） 内に、 スピーカー直下 1 cmに静置した金属メ ッ シュ製の高さ 3 cmの檻にマウスを入れた。 檻は同様の性状の金網に よつて放射状に区分けし、 同時に 4匹のマウスを別個の部屋に入れ た。 次に音響負荷装置内に 124±ldbの音圧がかかるようにあらかじ め設定 （CASELA社 CEい 231によ り 2時間の負荷中に複数回測定） し ておいた条件で、 2時間強大音負荷をした。 音響は 4 k HzSPLの Octa ve band noiseを用いた。 また、 音響装置内に温度計を置き、 音響 負荷前後の温度を測定した。
( 3 ) 薬剤投与
上記 （ 2 ) の後、 動物を Aおよび Bの 2群にわけ、 すみやかにラ ッ ト IgG 2mg/bodyまたは MR16- 1 (参考例 4で調製した抗 IL- 6R人型 化抗体） 2mg/bodyを各々の群で投与した。 投与に関しては、 盲験試 験と し、 （ 4) の聴力測定を終えるまで験者には各群における投与 内容を明らかにしなかった。
( 4 ) 聴力閾値測定
上記 （ 1 ) と同様の要領で、 音響負荷および薬物投与から一週間 後に聴力測定を行った。 測定後のマウスは十分な麻酔深度を確認し た後、 断頭し側頭骨を摘出し、 固定後、 組織学的考察用に保存した
( 5 ) 結果の解析
各々の個体の上記 （ 4 ) で得られた聴力と、 上記 （ 1 ) で得られ た処置前の聴力の差を取り、 聴力閾値低下度 （dB) を算出した。 MR 16-1投与群と対照群各々で各周波数別に平均聴力閾値低下 （dB) を 算出した。
結果
前記（ 4 )の麻酔の際に 1匹死亡し聴力測定が不可能となったため 、 除外した。 聴力閾値度が得られた数は MR16-1群で n=4、 I gG投与群 で n=2であった。 また、 音響負荷器内の温度は、 負荷前で 25°C、 負 荷後で 27°Cであった。 結果を、 下記の表 1、 および図 1 に示す。
表 1
Figure imgf000034_0001
音響外傷は音圧という物理的外力であり、 当実験で用いたモデル は蝸牛の物理的組織障害モデルであると考えられる。 当実験では 4 kHzの周波数を中心と した過大音を負荷している。 蝸牛において音 を知覚するセンサーは周波数に応じて空間的に分布しており、 （to notrop i c) 、 コントロール群での聴力低下が 4 kHzに大きく、 そこ から離れて高音域になるにつれて小さくなるのは、 4 kHzの領域に 過大音を負荷したためにこの領域に近いほど組織障害が大きいこと によるからと説明できる。
他方、 IL- 6レセプター抗体投与群では、 12kHz、 20kHzと、 過大音 を負荷され組織障害を直接受けた部位から離れるほど、 コン ト ロ ー ル群と比べ聴力低下が抑制されている。 以上よ り IL-6レセプター抗 体は蝸牛の組織障害、 すなわち内耳性の感音難聴における聴力低下 の空間的な進行抑制に効果を有するか、 もしく は感音難聴における 高音域の聴力低下の抑制に効果を有すると考えられる。
実施例 2. 音響外傷後の蝸牛における炎症性サイ トカインの発 a.
3〜 4週齢 SDラッ ト を用いて実施例 1 と同様の方法によ り難聴 モデルを作製した。 音響負荷直後、 3時間後、 6時間後、 1 2時間 後、 2 4時間後、 3 日後、 5 日後、 7 日後、 2 8 日後に、 各々のラ ッ トから側頭骨を摘出した。 蝸牛内のリ ンパ液を漏出しないように 保ちながら、 蝸牛のみを摘出し、 各種炎症性サイ トカインの発現を RT- PCR法によ り測定した。 結果を図 2に示す。 図 2から分かるよ う に、 音響外傷モデルの蝸牛では TNFひ 、 IL-1 a , IL- 1 、 IL-1レセ プターアンタゴニス ト （IL-1RA) 、 IL-6の発現が上昇していた。 一 方、 IL- 12p40および GM-CSFの発現は認められなかった。
次に、 定量的 RT- PCR法によ り TNFひ 、 Iい 6、 IL- 1 発現の経時的 変化を測定した。 定量的 RT- PCRは、 内在性コン ト ロール（reference gene) と して 18SrRNAを使用し、 Δ Δ Ct法によ り結果を解析した。 結果を図 3〜図 5に示す。 図 3〜図 5から分かるよう、 音響外傷後 2 4時間未満の早期に発現量のピークを示す TNFo; ,IL-l j8 ，IL- 6の 発現を認めた。
また、 音響負荷後 6時間の組織を用い、 凍結切片にて免疫組織染 色を行った。 動物には SDラッ トを用い、 実施例 1 と同様の方法によ り難聴モデルを作成、 騒音負荷後 6時間後に断頭した。 すみやかに 側頭骨を摘出し、 4% パラホルムアルデヒ ドで 6時間固定、 0. 5mo l/ 1EDTA液にて脱灰することで得た検体を、 液体窒素を用いて急速凍 結させ、 クライオスタツ ト（CM3000 , Le ica社）を用いて 7 m厚に切る ことで凍結切片を得た。 この切片において免疫組織染色を施行した 。 染色には Vectas t e in ABCki tを使用し、 DAB溶液を用いて発色させ た。 染色のコント ロールと して、 1次抗体を加えずに行った染色を 採用した。 結果を図 6〜図 7に示す。 図 6〜図 7から分かるよ う、 音響負荷 6時間後の蝸牛では、 蝸牛外側壁とコルチ器直下の基底膜 に IL- 6の発現が示された。
実施例 3 . IL- 6ァンタゴニス トの全身投与による薬効確認
実施例 1 と同様に、 C57BL/6Jマウス に 124dBの過大音を 2時間 負荷し、 直後に MR16- 1 2mg/bodyまたはラッ ト I gG 2mg/bodyを腹腔 内投与した。 抗体を投与してから 8時間後に側頭骨を摘出し、 両側 内耳を摘出してコルチ器を剖出し、 第 1回転 （apex) 、 第 2回転 （ basal) に分け、 各々を左右から回収して合わせた。 Wes t ern blot 法により、 to tal STAT3、 Erk、 Aktおよびジ ン酸ィ匕 STAT3、 Erk、 Akt の発現を測定した。 結果を図 8に示す。 図 8から分かるように、 対 照群に強く認められるリ ン酸化 STAT3、 リ ン酸化 Erk、 リ ン酸化 Akt のシグナルが、 MR16 - 1投与群では抑制された。 この結果から、 全身 投与された MR16 - 1が蝸牛内で薬効を発現することが確認された。
この結果と実施例 2の結果に基づき、 実施例 1 に示した MR16-1腹 腔内投与による聴力低下の抑制の作用機序に、 音響外傷後早期に蝸 牛内で発現する IL- 6シグナルの MR16-1による抑制効果が寄与してい ると考えられる。
参考例 1 . ヒ ト可溶性 IL-6受容体の調製
Yamasakiらの方法 (Yamasaki , K. et al . , Sc i ence ( 1988 ) 241 , P T/JP2005/006202
825-828) に従い得られた IL-6受容体をコ一ドする cDNAを含むブラ スミ ド pBSF2R.236を用いて、 PCR 法により可溶性 IL-6受容体を作成 した。 プラスミ ド pBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 IL- 6受 容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に挿入した。 IL-6受容体 cDNAにス トップコ ドンを導入するようにデザイ ンした合成オリ ゴプ ライマーを用いて、 イ ンビト ロ ミ ュータジエネシスシステム （Amer sham製） により、 PCR 法で IL- 6受容体 cDNAに変異を導入した。 この 操作によりス ト ップコ ドンがアミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 IL- 6受容体をコ一ドする c蘭 Aが得られた。
可溶性 IL- 6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラスミ ド pSV (Pharmacia製） と連結させ、 プラスミ ド pSVL344 を得た。 dhfr の cDNAを含むプラスミ ド pECEdhfrに Hind Ill-Sal Iで切断した可溶 性 IL-6受容体 cDNAを揷入し、 CH0 細胞発現プラスミ ド pECEdhfr344 を得た。
10 μ gのプラスミ ド pECEdhfr344 を dhfr-CHO細胞株 DXB— 11 (Urla ub， G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216-42 20) へカルシウムフォスフェイ ト沈降法 （Chen, C. et al. , Mol. Cell. Biol. (1987) 7， 2745-2751 ) によ り、 トランスフエタ ト し た。 トランスフエタ トした CH0 細胞を ImM グルタミン、 10% 透析 FC S 、 100U/ml のペニシリ ンおよび 100 Ai g/ml のス ト レプ トマイシ ンを含むヌクレオシ ド不含 α MEM 選択培養液で 3 週間培養した。 選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リーニングし、 単一の CH 0 細胞クローンを得た。 この CH0 細胞クローンを 20nM〜 200nM の濃 度のメ ト ト レキセー 卜で増幅し、 ヒ ト可溶性 IL- 6受容体産生 CH0 細 胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイスコープ改変ダ ルべコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回収し、 培養上清中の可溶性 IL-6受容体の濃度を ELISA にて測定した。 その 結果、 培養上清中には可溶性 IL-6受容体が存在することが確認され た。
参考例 2. 抗ヒ ト IL-6抗体の調製
lO g の組換型 Iい 6 (Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (198 8) 17, 41 ) をフロイント完全アジュパントとともに BALB/cマウス を免疫し、 血清中に抗 IL- 6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを 続けた。 局部のリ ンパ節から免疫細胞を摘出し、 ポリエチレンダリ コール 1500を用いてミエ口一マ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイブリ ドーマを HAT 培養液を用いる 0iらの方法 （Selective Methods in C ellular Immunology , W. H. Freeman and Co.,, i>an Francisco , 35丄， 1980 ) に従って選択し、 抗ヒ ト IL- 6抗体を産生するハイプリ ドー マを樹立した。
抗ヒ ト IL-6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のようにして I L- 6結合アツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポリ ビニル製の 9 6穴マイク口プレー 卜 (Dynatech Laboratories , inc. 製， Alexand ria, VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩衝液 (pH 9.6 ) 中で 100 μ 1 のャギ抗マウス Ig (10 μ 1 /ml, Cooper Biomedical , Inc製 Malvern, PA) により 4 °Cでー晚コー ト した。 次いで、 プ レー トを 100 μ 1 の 1 %ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS に より室温で 2 時間処理した。
これを PBS で洗浄した後、 100 μ 1 のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにてー晚インキュベートした。 プレートを洗浄し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるように 1251 標識耝換型 Iい 6を各穴 へ添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター （Beckma n Gamma 9000， Beckman Instruments , Fullerton, CA) で測定した 。 216 ハイブリ ドーマクローンのうち 32のノヽイブリ ドーマクローン が IL- 6結合ァッセィにより陽性であった。 これらのクローンのなか で最終的に安定な MH166. BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが産生 する抗 IL- 6抗体 MH166 は IgGl κのサブタイプを有する。
ついで、 IL- 6依存性マウスハイブリ ドーマクローン ΜΗ60. BSF2 を 用いて MH166 抗体によるハイプリ ドーマの増殖に関する中和活性を 調べた。 MH60.BSF2 細胞を 1 X 104 /200 μ 1 /穴となるように分注 し、 これに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 0.5 Ci/ 穴の 3H チミジン (New England Nuclear , Boston, MA ) を 加えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフィルターぺー 一上こおき、 自動/ヽーベスター (Labo Mash Science Co. , Tokyo , Japan ) で処理した。 コントロールとしてゥサギ抗 IL- 6抗体を用 レ、た。
その結果、 MH166 抗体は IL-6により誘導される MH60.BSF2 細胞の 3H チミジンの取込みを容量依存的に阻害した。 このことよ り、 MH 166 抗体は IL - 6の活性を中和することが明らかとなった。
参考例 3. 抗ヒ ト Iい 6受容体抗体の調製
Hirataらの方法 （Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 ) により作成した抗 IL- 6受容体抗体 MT18を CNBrにより活 性ィ匕させたセファ ロース 4B (Pharmacia Fine Chemicals製， Piscat away, NJ) と添付の処方にしたがって結合させ、 IL- 6受容体 （Yama saki, K. et al.， Science (1988) 241, 825-828) を精製した。 ヒ ト ミエローマ細胞株 U266を 1%ジギトニン （Wako Chemicals製） ， 10 mMト リエタノールァミ ン （pH 7.8) および 0.15M NaClを含む ImM p- パラアミ ノ フエ -ノレメ タ ンスルフォニルフノレオライ ドハイ ドロ ク ロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギトニン緩衝液） で可溶化し、 セフ ァロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合した。 その後、 ビー ズをジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫するための部分精製 IL - 6 受容体と した。 BALB/cマウスを 3 X109 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL-6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL- 6受容体への結合活性を調べた。 5 ラ 107 個の U266細胞を 35S 一メチォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギトニン緩衝液で可. 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセファ口ース 4Bビー ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギトニン緩衝液 （pH3.4 ) によ り 35 S —メチ ォニン標識 IL- 6受容体を流出させ、 0.025ml の 1M Tris (pH 7.4) で中和した。
0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セファロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セファロースを上 記で調製した 0.005ml の35 S 標識 IL - 6受容体溶液と ともにイ ンキュ ペー ト した。 免疫沈降物質を SDS- PAGEで分析し、 IL- 6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ドーマク ローン pM—1 (FERM BP— 2998)を樹立した。 ハイプリ ドー マ PM - 1から産生される抗体は、 IgGl Kのサブタイプを有する。
ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL-6受容体に対する I L-6の結合阻害活性をヒ ト ミエローマ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組換型 Iい 6を大腸菌よ り調製し （Hirano, T. et al.， Immunol . Lett. (1988) 17, 41-45) 、 ボルトン一ハンター試薬 （New Engl and Nuclear, Boston, MA ) によ り 125 I標識した （Taga， T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 ) 。
4 X105 個の U266細胞を 1 時間、 70% (v/v ) のハイブリ ドーマ PM - 1の培養上清および 14000cpmの 125 I標識 IL - 6と ともに培養した 。 70 μ 1 のサンプルを 400μ 1 のマイクロフュージポリ エチレンチ ユープに 300 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活性 P T/JP2005/006202 を測定した。
その結果、 ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体は、 IL- 6の IL- 6受 容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
参考例 4 . 抗マウス IL- 6受容体抗体の調製
Sai t o , T. et al . , J. Immunol . ( 1991 ) 147 , 168-173 に記載の 方法によ り、 マウス IL-6受容体に対するモノク口一ナル抗体を調製 した。
マウス可溶性 IL- 6受容体を産生する CH0 細胞を 10%FCSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清から抗マウス IL- 6受容体抗体 RS12 ( 上記 Sai to , T. et al 参照） を Affige l 10ゲル （Biorad製） に固定 したァフィ二ティーカラムを用いてマウス可溶性 IL-6受容体を精製 した。
得られたマウス可溶性 IL- 6受容体 50 μ gをフロイ ント完全アジュ パンドと混合し、 ウィスターラッ トの腹部に注射した。 2 週間後か らはフロイ ント不完全アジュパン ドで追加免疫した。 45日 目にラ ッ ト脾臓細胞を採取し、 2 X 108 個を 1 X 107 個のマウスミエローマ 糸田胞 P3U1と 50% の PEG1500 (Boehr inger Mannhe im 製） をもち ヽて 常法によ り細胞融合させた後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リーニングした。
ゥサギ抗ラッ ト I gG 抗体 （Cappe l製） をコートしたプレー トにハ ィプリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウス可溶性 IL-6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL- 6受容体抗体およびアルカリ フ ォスファターゼ標識ヒッジ抗ゥサギ I gG による ELISA 法によ りマウ ス可溶性 IL- 6受容体に対する抗体を産生するハイプリ ドーマをスク リーエングした。 抗体の産生が確認されたハイプリ ドーマク ローン は 2 回のサブスク リーニングを行い、 単一のハイプリ ドーマクロー ンを得た。 このク ローンを MR16- 1と名付けた。 2005/006202 このハイプリ ドーマが産生する抗体のマウス IL- 6の情報伝達にお ける中和活性を画 0. BSF2 細胞 (Matsuda, T. et al. , J. Immunol . (1988) 18， 951-956) を用いた 3H チミジンの取込みで調べた。 96ゥエルプレートに MH60.BSF2 細胞を 1 ラ 104 個/ 200 μ 1 /ゥエル となるよ うに調製した。 このプレートに 10pg/ml のマウス IL-6と MR 16 - 1抗体又は RS12抗体を 12.3〜1000ng/ml 加えて 37°C、 5%C02 で 44 時間培養した後、 l Ci/ ゥエルの 3H チミジンを加えた。 4 時間 後に 3H チミジンの取込みを測定した。 その結果 MR16- 1抗体は MH60 . BSF2 細胞の 3H チミジン取込みを抑制した。
したがって、 ハイブリ ドーマ MR16-1 (FERM BP- 5875)力 S産生する 抗体は、 IL - 6の IL-6受容体に対する結合を阻害することが明らかと なった。

Claims

1 . IL-6アンタゴニス トを有効成分として含有する内耳障害治療 および/または予防剤。
2 . 前記内耳障害が、 感音難聴である、 請求項 1に記載の治療お よび zまたは予防剤。 請
3 . 前記感音難聴が、 メニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィルス 性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因する の
感音難聴である、 請求項 2に記載の治療および/または予防剤。
4 . 感音難聴が、 突発性難聴、 老人性難聴または騷'音難聴である 囲
、 請求項 2に記載の治療およびノまたは予防剤。
5 . 前記内耳障害が、 前庭障害である、 請求項 1に記載の治療お よび/または予防剤。
6 . 前記前庭障害が、 メ ニエール病、 前庭神経炎または薬物性内 耳障害に起因する前庭障害である、 請求項 5に記載の治療および Z または予防剤。
7 . 前記 IL- 6アンタゴニス トが、 IL- 6受容体に対する抗体である 、 請求項 1 〜 6のいずれか 1項に記載の治療および/または予防剤
8 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するモノク ローナル抗体である、 請求項 7に記載の治療および Zまたは予防剤
9 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 ヒ ト IL-6受容体に対するモ ノクローナル抗体である、 請求項 8に記載の治療および/または予 防剤。'
1 0 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 マウス IL-6受容体に対す るモノク ローナル抗体である、 請求項 8に記載の治療および/また は予防剤。
1 1 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 組換え型抗体である、 請 求項 7〜10のいずれか 1項に記載の治療および/または予防剤。
1 2 . 前記ヒ ト IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体が、 PM- 1 抗体である、 請求項 9に記載の治療および/または予防剤。
1 3 . 前記マウス IL-6受容体に対するモノク ローナル抗体が、 MR 16-1抗体である、 請求項 10に記載の治療および/または予防剤。
1 4 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 7〜13のいず れか 1項に記載の治療および Zまたは予防剤。
1 5 . 前記 IL- 6受容体に対するヒ ト型化抗体が、 ヒ ト型化 PM-1抗 体である、 請求項 14に記載の治療および/または予防剤。
1 6 . 内耳障害治療および Zまたは予防剤の製造のための IL- 6ァ ンタゴニス トの使用。
1 7 . 前記内耳障害が、 感音難聴である、 請求項 16に記載の使用
1 8 . 前記感音難聴が、 メニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィル ス性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因す る感音難聴である、 請求項 17に記載の使用。
1 9 . 感音難聴が、 突発性難聴、 老人性難聴または騒音難聴であ る、 請求項 17に記載の使用。
2 0 . 前記内耳障害が、 前庭障害である、 請求項 16に記載の使用
2 1 . 前記前庭障害が、 メニエール病、 前庭神経炎または薬物性 内耳障害に起因する前庭障害である、 請求項 20に記載の使用。
2 2 . 前記 IL- 6アンタゴニス トが、 IL- 6受容体に対する抗体であ る、 請求項 16〜21のいずれか 1項に記載の使用。
2 3 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するモノ クローナル抗体である、 請求項 22に記載の使用。
2 4 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が、 ヒ ト IL- 6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 請求項 23に記載の使用。
2 5 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 マウス IL- 6受容体に対す るモノ ク ローナル抗体である、 請求項 23に記載の使用。
2 6 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 組換え型抗体である、 請 求項 22〜25のいずれか 1項に記載の使用。
2 7 . 前記ヒ ト I L-6受容体に対するモノクローナル抗体が、 PM - 1 抗体である、 請求項 24に記載の使用。
.
2 8 . 前記マウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 MR 16-1抗体である、 請求項 25に記載の使用。
2 9 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 22〜28のいず れか 1項に記載の使用。
3 0 . 前記 Iい 6受容体に対するヒ ト型化抗体が、 ヒ ト型化 PM-1抗 体である、 請求項 29に記載の使用。
3 1 . IL-6ァンタ ゴニス トを対象に投与することを含んで成る内 耳障害治療および zまたは予防方法。
3 2 . 前記内耳障害が、 感音難聴である、 請求項 31に記載の治療 および/または予防方法。
3 3 . 前記感音難聴が、 メニエール病、 薬物性内耳障害、 ウィル ス性内耳炎、 化膿性内耳炎、 側頭骨骨折または聴神経腫瘍に起因す る感音難聴である、 請求項 32に記載の治療および/または予防方法
3 4 . 感音難聴が、 突発性難聴、 老人性難聴または騒音難聴であ る、 請求項 32に記載の治療およびノまたは予防方法。
3 5 . 前記内耳障害が、 前庭障害である、 請求項 31に記載の治療 および/または予防方法。
3 6 . 前記前庭障害が、 メニエール病、 前庭神経炎または薬物性 内耳障害に起因する前庭障害である、 請求項 35に記載の治療および /または予防方法。
3 7 . 前記 IL- 6アンタゴニス トが、 IL-6受容体に対する抗体であ る、 請求項 31〜36のいずれか 1項に記載の治療および/または予防 方法。
3 8 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するモノ クローナル抗体である、 請求項 37に記載の治療およ'び/または予防 方法。
3 9 . 前記 IL - 6受容体に対する抗体が、 ヒ ト IL- 6受容体に対する モノクローナル抗体である、 請求項 38に記載の治療および Zまたは 予防方法。
4 0 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 マウス IL-6受容体に対す るモノクローナル抗体である、 請求項 38に記載の治療およびノまた は予防方法。
4 1 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 組換え型抗体である、 請 求項 37〜40のいずれか 1項に記載の治療および Zまたは予防方法。
4 2 . 前記ヒ ト IL - 6受容体に対するモノク ローナル抗体が、 PM- 1 抗体である、 請求項 39に記載の治療および Zまたは予防方法。
4 3 . 前記マウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が、 MR 16-1抗体である、 請求項 40に記載の治療および/または予防方法。
4 4 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体が、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 37〜43のいず れか 1項に記載の治療および Zまたは予防方法。
4 5 . 前記 IL- 6受容体に対するヒ ト型化抗体が、 ヒ ト型化 PM-1抗 体である、 請求項 44に記載の治療および/または予防方法。
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