KR20060132616A - 혈관염 치료제 - Google Patents

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Abstract

IL-6 안타고니스트인 예컨대 IL-6 수용체(IL-6R)에 대한 항체를 포함해서 이루어진, 예컨대 결절성 다발성 동맥염, 대동맥염 증후군이나 면역이상에 수반하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제의 제공.
모노크로널, 항체

Description

혈관염 치료제{REMEDY FOR ANGITIS}
본 발명은, 신규한 혈관염 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
혈관염은 자가면역질환(autoimmune diseases)에 공통으로 인정되는 난치성 병태의 하나로서, 종래부터 쓰이고 있는 스테로이드제나 면역억제제에 의한 치료에 대해 저항성을 나타낸 예도 많아, 새로운 치료법의 확립이 요망되고 있다. 혈관염 증후군은 여러 가지 사이즈의 동맥에 염증을 일으켜, 발열이나 근육 및 관절의 동통, 혈관폐색이나 피부궤양, 다발성 단신경염(mononeuritis multiplex)을 생기게 한다. 혈관염에는, 결절성 다발성 동맥염이나 대동맥염 증후군 등의 난치성 혈관염 증후군이 포함된다. 결절성 다발성 동맥염의 병변은 중막(中膜)과 외막의 부분적인 괴사성 염증으로 특징지을 수 있는바, 대동맥염은 통상적으로 대동맥의 3층 모두, 즉 내막, 중막, 외막이 모두 염증을 나타낸다.
대동맥염은, 고안동맥염(高安動脈炎)으로도 불린다. 혈관염의 병태에 IL-6의 관여가 시사되어 있다. 예컨대, 노리스 등(Noris et al.)에 의하면, 병태가 활성기에 있는 고안동맥염 환자에서는, 정상인과 비교해서 혈청 중의 IL-6 농도가 증가하고 있음이 보고되어 있다(Circulation. 1999 Jul 6;100(1):55~60). 그러나, 동 문헌에서는, 같은 시기에 있던 환자에서는, 케모카인(kemokine)의 일종인 RANTES의 혈청 중 농도도 높아져 있음이 보고되어 있다. 또, Noris 등은 이들 사이토카인(cytokine)이 고안동맥염 환자에서의 혈관손상(vasculitic lesion)을 일으키고 있을 가능성에 대해 시사하고 있다.
그러나, 문헌 중에는, IL-6의 저해에 의한 고안동맥염(Takayasu's arteritis)의 치료가능성에 대해서는 일체의 개시가 되어 있지 않다. 따라서, 본 발명은, IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 동맥염의 예방 및/치료제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명자들은 집중적이고 광범위한 연구를 한 결과, IL-6가 혈관염의 병태 형성에 불가결하고, IL-6 안타고니스트(antagonist)가 혈관염의 치료효과를 가진 것을 확인하였다. 그리고 놀랍게도, 본 발명자들의 연구에 의해, 혈관염에서 IL-6 수용체 항체에 의해 IL-6가 수용체에 결합되는 것이 저해되었던바, 혈중에서 IL-6 바로 그것이 감소된다는 것이 인정되었다. 즉, IL-6 저해치료는 혈관염에 대해 항염증작용을 가질 뿐만 아니라, 혈관염의 근본에 작용해서 혈관염 그것을 치료하는 것이 분명해졌다.
따라서, 본 발명은, 인터로이킨-6((interleukin-6; IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로 함유해서 이루어진 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.
본 발명은 또, IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유해서 이루어진, 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.
상기 혈관염은, 예컨대 결절성 다발성 동맥염, 대동맥염 증후군 또는 면역이상에 수반하는 혈관염이다. 대동맥염 증후군은, 고안동맥염으로도 불린다. 면역이상에 수반하는 혈관염으로, 예컨대 류머티즘에 수반하는 혈관염이나 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE)에 수반하는 혈관염을 들 수 있다.
상기 IL-6 안타고니스트는, 예컨대 IL-6에 대한 항체 또는 IL-6 수용체에 대한 항체로서, 바람직하기는 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체이다. 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는, 특히 바람직하기는, 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체(monoclonal antibody)인 예컨대 PM-l 항체이거나, 또는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 예컨대 MR16-1 항체이다. 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는, 바람직하기는 조환형(recombinant) 항체이다.
상기 IL-6 수용체에 대한 항체는, 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체일 수가 있다. 본 발명에서 특히 바람직한 항체는, 인간형화 PM-1 항체이다.
본 발명은 또, 아래의 형태를 취할 수가 있다.
(1) 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제조하기 위한 IL-6 안타고니스트의 용도.
(2) 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제조하기 위한 IL-6 안타고니스트의 용도.
(3) 상기 혈관염이 결절성 다발성 동맥염인, 상기(1) 또는 (2)에 기재된 용도.
(4) 상기 혈관염이 대동맥염 증후군인, 상기(1) 또는 (2)에 기재된 용도.
(5) 상기 혈관염이 면역이상에 수반하는 혈관염인, 상기(1) 또는 (2)에 기재된 용도.
(6) 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 상기(1) ~ (5)의 어느 것에 기재된 용도.
(7) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(6)에 기재된 용도.
(8) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(6)에 기재된 용도.
(9) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(6)에 기재된 용도.
(10) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 조환형 항체인, 상기(6) ~ (9)의 어느 것에 기재된 용도.
(11) 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 PM-1 항체인, 상기(8)에 기재된 용도.
(12) 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 MR16-1 항체인, 상기(9)에 기재된 용도.
(13) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인, 상기(6) ~ (12)의 어느 것에 기재된 용도.
(14) 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인, 상기(13)에 기재된 용도.
(15) IL-6 안타고니스트를 투여하는 것을 포함해서 이루어진, 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
(16) IL-6 안타고니스트를 투여하는 것을 포함해서 이루어진, 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
(17) 상기 혈관염이 결절성 다발성 동맥염인, 상기(15) 또는 (16)에 기재된 방법.
(18) 상기 혈관염이 대동맥염 증후군인, 상기(15) 또는 (16)에 기재된 방법.
(19) 상기 혈관염이 면역이상에 수반하는 혈관염인, 상기(15) 또는 (16)에 기재된 방법.
(20) 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인, 상기(15) ~ (19)의 어느 것에 기재된 방법.
(21) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(20)에 기재된 방법.
(22) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(20)에 기재된 방법.
(23) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인, 상기(20)에 기재된 방법.
(24) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 조환형 항체인, 상기(20) ~(23)의 어느 것에 기재된 방법.
(25) 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 PM-1 항체인, 상기( 22)에 기재된 방법.
(26) 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 MR16-1 항체인, 상기(23)에 기재된 방법.
(27) 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인, 상기(20) ~ (26)의 어느 것에 기재된 방법.
(28) 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인, 상기(27)에 기재된 방법.
도 1은, 혈관염증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 상부 화살표는 상행대동맥, 하부 화살표는 하행대동맥을 나타낸다.
도 2는, 혈관염 증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 화살표는 대동맥궁을 나타낸다.
도 3은, 혈관염 증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 상부 화살표는 상행대동맥, 하부 화살표는 하행대동맥을 나타낸다.
도 4는, 혈관염 증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 상부 화살표는 상행대동맥, 하부 화살표는 하행대동맥을 나타낸다.
도 5는, 혈관염 증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 화살표는 대동맥궁을 나타낸다.
도 6은, 혈관염 증후군의 인간형화 IL-6R 항체요법에서의 CT의 결과를 나타낸 사진으로서, 상부 화살표는 상행대동맥, 하부 화살표는 하행대동맥을 나타낸다.
IL-6은 B 세포자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2로도 불리는 사이토카인이다. IL-6은, B-임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로 발견되었다(Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76). 그 후, 여러 가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인임이 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78). IL-6은, T-임파구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있다(Lotz, M. et al., J. Exp. Med.(1988) 167, 1253-1258).
IL-6은, 세포 상에서 2종의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 한 가지는, IL-6이 결합하는 분자량 약 80kD인 리간드결합성 단백질(ligand binding protein)의 IL-6 수용체이다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981, Yamasaki, K. et al., Science(1987) 241, 825-828). IL-6 수용체는, 세포막을 관통해서 세포막 상에 발현하는 막결합형(膜結合型) 외에, 주로 그 세포외 영역으로 된 가용성 IL-6 수용체로도 존재한다.
또 한가지는, 비(非)리간드결합성의 시그널전달과 관계되는 분자량 약 130kD의 막단백질 gp130이다. IL-6과 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성한 다음 gp130와 결합함으로써, IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달된다(Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581).
IL-6 안타고니스트는, IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 지금까지, IL-6에 대한 항체(항IL-6 항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항IL-6 수용체 항체), gp130에 대한 항체(항gp130 항체), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드 등이 알려져 있다.
항IL-6 수용체 항체에 관해서는 몇 가지가 보고되어 있다(Novick, D. et al., Hybridoma(1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma(1993) 12, 621-630, 국제특허출원공개번호 WO 95-09873, 프랑스 특허출원공개번호 FR 2694767, 미국특허번호 US51628). 그 한 가지인 마우스항체 PM-1(Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)의 상보성결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간항체에 이식함으로써 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허출원공개 번호 WO 92-19759).
상기 IL-6 안타고니스트는, 바람직하기는 IL-6 수용체에 대한 항체로서, 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체 또는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체이다. 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체로는 PM-1 항체가 예시될 수 있고, 또 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체로는 MR16-1항체를 들 수 있다. 상기의 항체는, 바람직하기는 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체로서, 예컨대 인간형화 PM-1 항체이다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트는, 혈관염의 예방 또는 치료제의 활성성분으로 유용한 것이라면 그 유래, 종류 및 형상을 묻지 않는다.
IL-6 안타고니스트는, IL-6에 의한 시그널 전달(signal transduction)을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 안타고니스트는, 바람직하기는 IL-6, IL-6 수용체 및 gp130 중 어떤 것과의 결합에 대한 저해작용을 가진 물질이다. IL-6 안타고니스트로는, 예컨대 항IL-6 항체, 항IL-6 수용체 항체, 항 gp130 항체, IL-6 개변체(改變體), 가용성 IL-6 수용체 개변체 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 마찬가지 활성을 나타내는 저분자물질을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항IL-6 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리크로널 또는 모노크로널 항체로서 얻을 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노크로널 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로널 항체로는, 하이브리도마에 산생하게 되는 것 및, 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 함유한 발현벡터로 형질변환한 숙주에 산생(産生)하게 되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로는, MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol.(1988) 18, 951-956)이나 SK2 항체(Sato, K. et al., 제21회 일본면역학회 총회, 학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.
항IL-6 항체 산생 하이브리도마는, 기본적으로는 공지의 기술을 사용하여 이하와 같이 해서 만들 수 있다. 즉, IL-6을 감작항원(感作抗原; sensitizing antigen)으로 사용해서, 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 친세포와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법으로 모노크로널 항체 산생 세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6 항체를 만들기는 다음과 같이 하면 된다. 예컨대, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6은, Eur. J. Biochem(1987) 168, 543- 550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, 또는 Agr. Biol. Chem.(1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노배열을 이용함으로써 얻어질 수 있다.
IL-6의 유전자배열을 공지의 발현벡터계(expression vector system)에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상청(培養上淸; culture supernatant) 중에서 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 단백질을 감작항원으로 쓰면 좋다. 또, IL-6 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리크로널 또는 모노크로널 항체로 해서 얻을 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노크로널 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로널 항체로는, 하이브리도마(hybridoma)에 산생하게 되는 것 및, 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 함유한 발현벡터로 형질변환한 숙주에 산생하게 되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써 IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달되는 것을 차단한다.
이와 같은 항체로는, MR16-1 항체(Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90, 11924-11928), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immuno1.(1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(국제특허출원공개 번호 WO92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 특히 바람직한 항체로는 PM-1 항체를 들 수 있다.
한편, PM-1 항체 산생 하이브리도마 세포주는 PM-1로서, 이는 일본국 독립행 정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키현 츠쿠바시 동1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에, 평성 원년 7월 12일에, FERM BP-2998로서 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다. 또, MR16-1 항체 산생 하이브리도마 세포주는, Rat-mouse hybridoma MR16-1로서, 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 동1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에, 평성 9년 3월 13일에, FERM BP-5875로서 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다.
항IL-6 수용체 모노크로널 항체 산생 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여 이하와 같이 해서 만들 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로 사용해서, 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어진 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 친세포와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법으로 모노크로널 항체 산생 세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6 수용체 항체를 만드는 데에는 다음과 같이 하면 된다. 예컨대, 항체 취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6 수용체는, 유럽 특허출원공개 번호 EP 325474에, 마우스 IL-6 수용체는 일본국 특허출원공개번호 일본국 특개평 3-155795에 개시된 IL-6 수용체 유전자/아미노산배열을 이용함으로써 얻어지게 된다.
IL-6 수용체 단백질은, 세포막 상에 발현되어 있는 것과 세포막으로부터 이탈해 있는 것(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676)의 2종류가 있다. 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합되어 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포 외 영역으로 구성되어 있고, 세포막 관통영역 또는 세 포막 관통영역과 세포 내 영역이 결손되어 있는 점에서 막결합형 IL-6 수용체와 차이가 난다. IL-6 수용체 단백질은, 본 발명에서 쓰이고 있는 항IL-6 수용체 항체를 만드는 감작항원으로 사용될 수 있는 한 어떤 IL-6 수용체를 사용하여도 좋다.
IL-6 수용체의 유전자배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는, 배양상청 중에서 목적하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로 쓰면 된다. 또, IL-6 수용체를 발현하고 있는 세포나 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.
인간 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 포함한 플라스미드 pIBIBSF2R을 함유하는 대장균(E. coli)은, 평성 원년(1989년) 1월 9일자로 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시동1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에, HB101-pIBIBSF2R로 해서, 수탁번호 FERM BP-2232로 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다.
본 발명에서 사용되는 항gp130 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리크로널 또는 모노크로널 항체로서 얻을 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 항gp130 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노크로널 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로널 항체로는, 하이브리도마에 산생하게 되는 것 및 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질변환한 숙주에 산생되는 것이 있다. 이 항체는 gp130과 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체의 gp130에의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달되는 것을 차단한다.
이와 같은 항체로는, AM64 항체(일본국 특개평 3-219894), 4B11 항체 및 2H4 항체(US 5571513) B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본국 특개평 8-291199) 등을 들 수 있다.
항gp130 모노크로널 항체 산생 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여 이하와 같이 해서 만들 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로 사용하고서, 이를 통상적인 면역방법으로 면역하고, 얻어진 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 친세포와 융합시키고, 통상적인 스크리닝법으로 모노크로널 항체 산생 세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.
구체적으로는, 모노크로널 항체를 만드는 데에는 다음과 같이 하면 된다. 예컨대, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 gp130은, 유럽 특허출원공개번호 EP 411946에 개시된 gp130 유전자/아미노산 배열을 이용함으로써 얻어지게 된다.
gp130의 유전자배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상청 중에서 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제된 gp130 수용체 단백질을 감작항원으로 쓰면 좋다. 또, gp130을 발현하고 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로는 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직한바, 일반적으로는 설치류의 동물, 예컨대 마우스, 랫, 햄스터 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역하는 데에는 공지의 방법으로 실행하게 된다. 예컨 대, 일반적 방법으로서 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사를 함으로써 실행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)이나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석하여 현탁한 것을 소망에 따라 통상적인 아쥬반트(adjuvant), 예컨대 프로인트(Freund's) 완전 아쥬반트를 적당량 혼합하고, 유화시킨 후, 포유동물에 4~21일 마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수가 있다.
이와 같이 면역하여, 혈청 중에 소망하는 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포가 취출되어 세포융합에 붙여지게 된다. 세포융합에 붙여지는 바람직한 면역세포로는, 특히 비장세포를 들 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 다른 쪽 친세포(親細胞)로서의 포유동물의 미에로마 세포는, 이미 공지된 여러 가지 세포주, 예컨대 P3X63Ag8.653(Kearney, J. F. et al. J. Immunol.(1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et al., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978) 276, 269-270), F0(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 미에로마 세포(myeloma)의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법인 예컨대 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) 등에 준해서 실행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예컨대 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상적인 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 다시 소망에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가해서 사용할 수도 있다.
면역세포와 미에로마 세포와의 사용비율은, 예컨대 미에로마 세포에 대해 면역세포를 1~10 배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 이용하는 배양액으로서는, 예컨대 상기 미에로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이런 종류의 세포 배양에 쓰이고 있는 통상적인 배양액이 사용될 수 있고, 또 우태아(牛胎兒) 혈청(FCS) 등의 혈청보액(血淸補液)을 병용할 수도 있다.
세포융합은, 상기 면역세포와 미에로마 세포와의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고서, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예컨대 평균분자량 1000 ~ 6000 정도의 PEG 용액을 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성되게 된다. 계속해서, 적당한 배양액을 순서대로 첨가하고, 원심(遠心)분리로 상청을 제거하는 조작을 되풀이함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
당해 하이브리도마는, 통상적인 선택배양액인 예컨대 HAT 배양액(히포키산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유한 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 당해 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간인 통상 수 일~수 주간 계속한다. 그 다음, 통상적인 한계희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝이 실행된다.
또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간 임파구를 시험관 내(in vitro)에서 소망하는 항원단백질 또는 항원 발현세포로 감작하여, 감작 B 임파구를 인간 미에로마 세포인 예컨대 U266과 융합시켜, 소망하는 항원 또는 항원발현세포에의 결합활성을 가진 소망하는 인간항체를 얻을 수도 있다(일본국 특공평 1-59878 참조). 그리고, 인간항체 유전자의 레퍼토리를 가진 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원 또는 항원발현세포를 투여해서, 앞에서 설명한 방법에 따라 소망하는 인간 항체를 취득하여도 좋다(국제특허출원공개 번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).
이와 같이 해서 만들어지는 모노크로널 항체를 산생하는 하이브리도마는, 통상적인 배양액 중에서 계대배양(繼代培養)할 수가 있고, 또 액체질소 중에서 장기보존할 수 있게 된다.
당해 하이브리도마로부터 모노크로널 항체를 취득함에는, 당해 하이브리도마를 통상적인 방법에 따라 배양을 해서 그 배양상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이와 적합성이 있는 포유동물에 투여해서 증식시켜, 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는 데에 적합하고, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
예컨대, 항IL-6 수용체 항체 산생 하이브리도마를 만드는 데에는 일본국 특 개평 3-139293에 개시된 방법으로 실행할 수 있다. 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 동1정목 1번지 1 중앙 제6)에 평성 원년 7월 12일에 FERM BP-2998으로 해서 부다페스트조약에 기해 국제기탁 된 PM-1 항체 산생 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강 내에 주입하여 복수를 얻고, 이 복수로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법이나, 본 하이브리도마를 적당한 배지인 예컨대 10% 우태아 혈청, 5% BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim제) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL제), PFHM-II 배지(GIBCO-BRL 제) 등에서 배양하여, 그 배양상청으로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 실행할 수 있다.
본 발명에는, 모노크로널 항체로서, 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 조립을 해서, 이를 숙주에 도입하고, 유전자 조환기술을 이용해서 산생시킨 조환형 항체를 이용할 수가 있다(예컨대, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 산생하는 세포인 예컨대 하이브리도마로부터 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리(單離)한다. mRNA의 단리(isolation)는, 공지의 방법인 예컨대 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem.(1987) 162, 156-159) 등으로 전체 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia제) 등을 사용해서 mRNA를 조제한다. 또, Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia제)를 이용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수가 있다.
얻어진 mRNA으로부터 역전사효소(逆轉寫酵素)를 이용해서 항체의 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 이용해서 실행할 수 있다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 실행하는 데에는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR을 이용한 5'-RACE 법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Be lyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수가 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하여 벡터 DNA와 연결한다. 그리고, 이에 의해 조환벡터를 작성하고, 대장균 등에 도입해서 콜로니를 선택해서 소망하는 조환벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA의 염기배열을 공지의 방법인 예컨대 디옥시법으로 확인한다.
목적으로 하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이를 소망하는 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현벡터에 조립한다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를, 항체의 C 영역의 DNA를 포함한 발현벡터에 조립하여도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조함에는, 뒤에 설명되듯이 항체 유전자를 발현제어영역, 예컨대 인핸서, 프로모터의 제어 하에서 발현되도록 발현벡터에 조립한다. 다음, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킬 수가 있다.
본 발명에서는, 인간에 대한 이종항원성(異種抗原性)을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자조환형 항체, 예컨대 키메라(Chimeric) 항체, 인간형화(Humanized) 항체, 인간(human) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변항체는 기존의 방법을 이용해서 제조할 수 있다.
키메라 항체는, 상기와 같이 해서 얻은 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 인간항체의 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현벡터에 조립하여 숙주에 도입해서 산생시켜줌으로써 얻어지게 된다(유럽 특허출원공개번호 EP 125023, 국제특허출원공개 번호 WO 92-19759 참조). 이 기존의 방법을 이용해서, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수가 있다.
예컨대, 키메라 PM-1 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 V 영역을 코드하는 DNA를 포함한 플라스미드는 각각 pPM-k3 및 pPM-h1이라고 명명되고, 이의 플라스미드를 가진 대장균은 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(그레이트브리튼 및 북부아일랜드 연합왕국 스코틀랜드 애버딘 AB2 1RY 맥커드라이브 가 23)에, 1991년 2월 12일에 각각 NCIMB 40366 및 NCIMB 40362로 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다.
재구성(reshaped) 인간항체로도 불리는, 인간형화 항체는, 인간 이외의 포유동물인, 예컨대 마우스항체의 상보성 결정영역(CDR)을 인간항체의 상보성 결정영역에 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자조환수법도 알려져 있다(유럽 특허출원공개번호 EP 125023, 국제특허출원공개 번호 WO 92-19759 참조).
구체적으로는, 마우스항체의 CDR과 인간항체의 프레임웍 영역(FR; framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 배열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 만 든 몇 개의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로부터 PCR법으로 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체의 C 영역을 코드하는 DNA와 연결한 다음 발현벡터에 조립하고, 이를 숙주(宿主)에 도입해서 산생시켜줌으로써 얻어지게 된다(유럽 특허출원공개번호 EP 239400, 국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조).
CDR을 매개로 연결되는 인간항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임웍 영역의 아미노산을 치환하여도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).
키메라 항체와 인간형화 항체에는 인간항체의 C 영역이 사용된다. 인간항체의 C 영역으로는 Cγ를 들 수 있는바, 예컨대, Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또, 항체 또는 그 산생의 안정성을 개선하기 위해 인간항체의 C 영역을 수식하여도 좋다.
키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 C 영역으로 이루어지고, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체 유래의 프레임웍 영역 및 C영역으로 이루어져, 인체 내에서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.
본 발명에 사용되는 인간형화 항체의 바람직한 구체적인 예로는, 인간형화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제특허출원공개 번호 WO 92-19759 참조).
또, 인간항체의 취득방법으로는 앞에서 설명한 방법 외에, 인간항체 라이브러리를 이용해서 팬닝(panning)에 의해 인간항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예컨대, 인간항체의 가변영역을 1본 사슬(single chain) 항체(scFv)로 해서 파지 디스플레이법으로 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합되는 파지(phage)를 선택할 수도 있다. 선택한 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합되는 인간항체의 가변영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수가 있다. 항원에 결합되는 scFv의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 적당한 발현벡터를 만들어 인간항체를 취득할 수가 있다. 이들 방법은 이미 널리 알려진 것으로, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다.
상기와 같이 구축된 항체유전자는, 공지의 방법으로 발현시켜 취득할 수가 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터(promoter), 발현되는 항체유전자, 그 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그를 포함한 벡터에 의해 발현시킬 수가 있다. 예컨대 프로모터/인핸서로는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수가 있다.
또, 기타 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로(retro) 바이러스, 폴리오머 바이러스, 아데노(adeno) 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV 40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 일롱게이션 팩터(elongation factor) 1α(HEF1α) 등의 포유류세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.
예컨대, SV 40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan 등의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature(1979) 277, 108-114), 또는 HEF1α 프로모터/ 인핸서를 사용하는 경우, Mizushima 등의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수가 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 배열, 발현시키는 항체유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수가 있다. 예컨대, 프로모터로는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수가 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, Ward 등의 방법(Ward, E. S. et al., Nature(1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, Better 등의 방법(Better, M. et al. Science(1988) 240, 1041-1043)에 따르면 좋다.
항체분비를 위한 시그널 배열로는, 대장균의 페리프라즘(periplasm)에 산생시키는 경우, pelB 시그널 배열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 좋다. 페리프라즘에 산생된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)해서 사용한다(예컨대 W096/30394를 참조).
복제기원으로는, SV 40, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 우(牛)파피로머 바이러스(BPV) 등에 유래한 것을 이용할 수가 있고, 또 숙주세포계에서 유전자복제 수의 증폭을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 포스포트란스페라제(APR) 유전자, 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스페라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수가 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 산생계를 사용할 수가 있 다. 항체 제조를 위한 산생계는, 시험관 내 및 생체 내(in vivo)의 산생계가 있다. 시험관 내의 산생계로는, 진핵세포를 사용하는 산생계나 원핵세포를 사용하는 산생계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포(眞菌細胞)를 이용하는 산생계가 있다. 동물세포로는, (1) 포유류 세포인 예컨대 CHO, COS, 미에로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양생류 세포인 예컨대 아프리카쓰메가엘 난모세포(Xenopus oocytes), 또는 (3) 곤충세포인 예컨대 sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로는 니코티아나 타파쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있는바, 이를 캘러스 배양하면 좋다. 진균세포로는, 효모인 예컨대 삭카로마이세스(Saccharomyces)속인 예컨대 삭카로마이세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예컨대 아스페르길루스속(Aspergillus)속인 예컨대 아스페르길루스니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 이용하는 산생계가 있다. 세균세포로는 대장균(E. coli)과 고초균이 알려져 있다.
이들 세포에, 목적으로 하는 항체유전자를 형질변환으로 도입해서, 형질변환된 세포를 시험관 내에서 배양함으로써 항체가 얻어지게 된다. 배양은 공지의 방법에 따라 실행한다. 예컨대, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM를 사용할 수가 있고, 우태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다. 또, 항체유전자를 도입한 세포를 동물의 복강(腹腔) 등에 옮김으로써, 생체 내에서 항체를 산생하여도 좋다.
한편, 생체 내의 산생계로는, 동물을 사용하는 산생계나 식물을 사용하는 산생계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 산생계 등이 있다.
포유류 동물로는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 이용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 곤충으로는 누에를 이용할 수가 있다. 식물을 사용하는 경우에는 예컨대 담배를 이용할 수가 있다.
이들 동물 또는 식물에 항체유전자를 도입해서, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 산생시켜 회수한다. 예컨대, 항체유전자를 염소 β 가제인과 같은 유즙 중에 고유하게 산생되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입해서 융합유전자로서 조제한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 포함한 DNA 단편(斷片)을 염소의 배(胚)에다 주입하고서, 이 배를 암염소에 도입한다. 배를 수용한 염소에서 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그 자손이 산생하는 유즙으로부터 소망하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉(transgenic) 염소에서 산생되는 소망하는 항체를 함유한 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 홀몬을 트랜스제닉 염소에 사용하여도 좋다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology(1994) 12, 699-702).
또, 누에를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 삽입한 버큐로바이러스(baculovirus)를 누에에 감염시켜, 이 누에의 체액으로부터 소망하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature(1985) 315, 592-594). 그리고, 담배를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 식물발현용 벡터인 예컨대 pMON 530에 삽입해서, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담 배, 예컨대 Nicotiana tabacum에 감염시켜, 이 담배의 잎으로부터 소망하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994) 24, 131-138).
앞에서 설명한 바와 같이 시험관 내 또는 생체 내의 산생계에서 항체를 산생하는 경우, 항체 중쇄(重鎖; H 사슬) 또는 경쇄(輕鎖; L 사슬)를 코드하는 DNA를 별도로 발현벡터에 조립해서 숙주를 동시에 형질변경시켜도 좋고, 또는 H 사슬 및 L 사슬을 코드하는 DNA를 단일의 발현벡터에 조립해서 숙주를 형질변경시켜도 좋다(국제특허출원공개 번호 WO 94-11523 참조).
본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적절히 사용될 수 있는 한 항체의 단편이나 그 수식물이어도 좋다. 예컨대, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H 사슬과 L 사슬의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글체인 Fv(scFv)를 들 수 있다.
구체적으로는, 항체를 효소인 예컨대 파파인(papain), 펩신으로 처리해서 항체 단편을 생성하거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하여, 이를 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예컨대, Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137 참조).
scFv는, 항체의 H 사슬의 V 영역과 L 사슬의 V 영역을 연결함으로써 얻어지 게 된다. 이 scFv에서, H 사슬의 V 영역과 L 사슬의 V 영역은 링커, 바람직하기는 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A.(1988) 85, 5879-5883). scFv에서의 H 사슬의 V 영역 및 L 사슬의 V 영역은, 상기 항체로서 기재된 것 중 어떤 것에서 유래한 것이어도 좋다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예컨대 아미노산 12-19 잔기(殘基)로 된 임의의 1본 사슬(single-chain) 펩티드가 쓰이고 있다.
scFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H 사슬 또는 H 사슬의 V 영역을 코드하는 DNA 및 L 사슬 또는 L 사슬의 V 영역을 코드하는 DNA를 주조해서 몰드로 하고, 그들 배열 중의 소망하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양단을 규정하는 프라이머 1쌍을 이용해서 PCR법으로 증폭한 다음, 다시 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양단을 각각 H 사슬, L 사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍(primer pair)을 조합해서 증폭함으로써 얻어지게 된다.
또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 만들어지면, 그들을 함유하는 발현벡터 및 당해 발현벡터에 의해 형질변환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수가 있고, 또 그 숙주를 이용해서 통상적인 방법에 따라 scFv를 얻을 수가 있다.
이들 항체의 단편은, 상기와 마찬가지로 해서 그 유전자를 취득하고 발현시켜 숙주에 의해 산생시킬 수 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체의 단편(斷片)도 포함된다.
항체의 수식물(修飾物)로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합된 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체 수식물 도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻는 데에는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수가 있다. 이들 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.
상기와 같이 산생, 발현된 항체는, 세포 내외, 숙주로부터 분리되어 균일에 이르기까지 정제할 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 어피니티 크로마토그래피에 의해 실행할 수 있다. 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)에 이용되는 컬럼(column)으로는, 예컨대 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 들 수 있다. 프로틴 A 컬럼에 이용하는 담체로서, 예컨대 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 좋은바, 어떤 한정이 되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 어피니티 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 여과, 한외 여과(限外濾過), 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합시키면 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수가 있다. 크로마토그래피로는, 예컨대 이온교환 크로마토그래피, 소수(疎水) 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또, 역상(逆相) HPLC(reverse phase HPLC)를 이용하여도 좋다.
상기에서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 ELISA 등으로 실행될 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당하게 희석한 후 280nm의 흡광도를 측정해서, 1mg/ml를 1.35 OD로 해서 산출한다. 또, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수가 있다. 즉, 0.1M 중탄산 완충액(pH9.6)에서 1㎍/ml로 희석한 염소 항인간 IgG(TAG제) 100㎕를 96구멍 플레이트(Nunc제)에 가해 4℃에 서 하룻밤 인큐베이션해서 항체를 고상화(固相化)한다. 블로킹을 한 후, 적절히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유한 샘플 또는 표품(標品)으로서 인간 IgG(CAPPEL제) 100㎕를 가해, 실온에서 1시간 인큐베이트한다.
세정 후, 5000배 희석한 알카리 포스패타제 표지 항인간 IgG(BIO SOURCE 제) 100㎕을 가하여 실온에서 1시간 인큐베이트한다. 세정 후, 기질용액을 가해 인큐베이트한 후, MICHOPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제)을 이용해서 405nm에서의 흡광도를 측정하여 목적하는 항체의 농도를 산출한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 개변체는, IL-6 수용체와의 결합활성을 갖고, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대해 IL-6과 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에 IL-6에 의한 시그널전달을 차단하게 된다.
IL-6 개변체는, IL-6의 아미노산배열의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변이를 도입해서 만들어진다. IL-6 개변체의 기초로 되는 IL-6은 그 유래를 묻지 않으나, 항원성 등을 고려하면 바람직하기는 인간 IL-6이다.
구체적으로는, IL-6의 아미노산배열을 공지의 분자모델링 프로그램인 예컨대 WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics(1990) 8, 52-56)를 이용해서 그 2차 구조를 예측하고, 또 치환되는 아미노산 잔기의 전체에 미치는 영향을 평가함으로써 실행된다. 적절한 치환아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드하는 염기배열을 포함한 벡터를 몰드로 해서, 통상 실행되는 PCR 법으로 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어지게 된다. 이 를 필요에 따라 적당한 발현벡터에의 조립과, 상기 조환형 항체의 발현, 산생 및 정제방법에 준해서 IL-6 개변체를 얻을 수가 있다.
IL-6 개변체의 구체적인 예로는, Brakenhoff et al., J. Biol. Chem.(1994) 269, 86-93 및 Savino et al., EMBO J.(1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, W096-17869에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6과의 결합활성을 갖고, 또 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합되어 이들을 포착함으로써 IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단하게 된다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산배열에서 IL-6과 IL-6 수용체와의 결합과 관계되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산배열(amino acid sequence)로 이루어진 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는 통상 10 ~ 80개, 바람직하기는 20 ~ 50개, 보다 더 바람직하기는 20 ~ 40개의 아미노산 잔기로 이루어진다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산배열에서 IL-6과 IL-6 수용체와의 결합에 관계되는 영역을 특정하여, 그 일부 또는 전부의 아미노산배열을 통상적으로 알려진 방법인 예컨대 유전자공학적 수법 또는 펩티드합성법으로 만들 수가 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 유전자공학적 수법으로 만드는 데에는, 소망하는 펩티드를 코드하는 DNA 배열을 발현벡터에 조립하고, 상기 조환형 항체의 발현, 산생 및 정제방법에 준해서 얻을 수가 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 펩티드합성법으로 만드는 데에는, 펩티드합성에서 통상 쓰이고 있는 방법인 예컨대 고상(固相)합성법 또는 액상합성법을 이용할 수가 있다.
구체적으로는, (속)의약품의 개발 제14권 펩티드합성, 야지마 하루아키 감수, 일본국 히로가와(廣川)서당 1991년판에 기재된 방법에 준해서 실시하면 좋다. 고상합성법으로는, 예컨대 유기용매에 불용성인 지지체에 합성하려고 하는 펩티드의 C 말단(C-terminal)에 대응하는 아미노산을 결합시켜, α-아미노기 및 측쇄(側쇄) 관능기를 적절한 보호기로 보호한 아미노산을 C 말단으로부터 N 말단 방향의 순서로 1아미노산씩 축합시키는 반응과 수지상에 결합된 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 당해 보호기를 이탈시키는 반응을 교대로 되풀이함으로써, 펩티드 사슬을 신장시키는 방법이 쓰이고 있다. 고상펩티드 합성법은, 쓰이는 보호기의 종류에 따라 Boc법과 Fmoc법으로 대별된다.
이와 같이 해서 목적으로 하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 한다. 펩티드 사슬과의 절단반응에는, Boc법으로는 불화수소 또는 트리플루오로 메탄술폰산을, 또 Fmoc 법으로는 TFA를 통상적으로 이용할 수 있다. Boc법으로는, 예컨대 불화수소 중에서 상기 보호펩티드수지를 아니솔 존재 하에서 처리한다. 다음, 보호기의 이탈과 지지체로부터의 절단을 해서 펩티드를 회수한다. 이를 동결건조함으로써 조(crude) 펩티드가 얻어진다. 한편, Fmoc법으로는, 예컨대 TFA 중에서 상기와 마찬가지 조작으로 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 실행할 수 있다.
얻어진 조 펩티드는 HPLC에 적용함으로써 분리, 정제할 수가 있다. 그 용출에 있어, 단백질의 정제에 통상 쓰이고 있는 물-아세트니트릴계 용매를 사용해서 최적조건 하에서 실시하면 좋다. 얻어진 크로마토그래피의 프로파일의 피크에 해당하는 화분(畵分; fraction)을 분취(分取)하여, 이를 동결건조한다. 이와 같이 해서 정제한 펩티드 화분(畵分)에 대해, 메스 스펙트럼 분석에 의한 분자량 해석, 아미노산조성 분석, 또는 아미노산배열 해석 등에 의해 동정(同定)한다.
IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체적인 예는, 일본국 특개평 2-188600, 일본국 특개평 7-324097, 일본국 특개평 8-311098 및 미국 특허 공보 US 5210075에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트의 IL-6 시그널 전달저해 활성은, 통상 쓰이고 있는 방법으로 평가할 수가 있다. 구체적으로는, IL-6 의존성 인간 골수종주(S6B45, KPMM2), 인간 렌넬트(Lennert's) T 임파종 세포주 KT3, 또는 IL-6 의존성 세포 MH60.BSF2를 배양하여, 여기에 IL-6을 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 공존시켜줌으로써 IL-6 의존성 세포의 3H-티미딘 취입을 측정하면 된다.
또, IL-6 수용체 발현세포인 U266을 배양하고, 125I 표지 IL-6을 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 가함으로써, IL-6 수용체 발현세포에 결합된 125I 표지 IL-6을 측정한다. 상기 분석 시스템(assay system)에서, IL-6 안타고니스트를 존재시키는 군(群)에 더해 IL-6 안타고니스트를 포함하지 않은 음성 대조군(negative control group)을 놓고서 양자에서 얻어진 결과를 비교하면, IL-6 안타고니스트의 IL-6 저해 활성을 평가할 수가 있다.
뒤에 설명되는 실시예에 도시된 것과 같이, 항IL-6 수용체 항체에 의해 혈관염의 치료효과가 인정된 점에서, 항IL-6 수용체 항체 등의 IL-6 안타고니스트는 혈관염의 치료제로서 유용하다는 것이 시사되어 있다.
본 발명에서의 치료대상은 포유동물이다. 치료대상인 포유동물은 인간이 바람직하다.
본 발명의 혈관염의 예방 또는 치료제는, 경구적으로 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수가 있다. 예컨대, 점적(点滴) 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 좌약, 주장(注腸), 경구성 장용제(腸溶劑) 등을 선택할 수가 있는바, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수가 있다. 유효투여량은, 1회에 대해 체중 1kg 당 0.01mg ~ 100mg의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1mg~20mg, 바람직하기는 2mg~8mg의 투여량을 선택할 수 있다.
바람직한 투여량과 투여방법은, 예컨대 항IL-6 리셉터 항체의 경우에는, 혈중에 프리 항체(free antibody)가 존재할 정도의 량이 유효투여량인바, 구체적인 예로는, 체중 1kg 당 1개월(4주간)에 1mg~20mg, 바람직하기는 2mg~8mg를 1회~수회로 나누어, 예컨대 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여 스케쥴로 점적 등의 정맥내 주사, 피하 주사 등의 방법으로 투여하는 방법 등이다. 투여 스케쥴은, 병상의 관찰 및 혈액검사치의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주로부터 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여간격을 늘려가는 등 조정할 수도 있다.
본 발명의 혈관염의 예방 또는 치료제는, 투여경로에 따라 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유한 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서는 물, 의약적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸 스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 크산탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아린산, 인간혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형에 대응해서 상기 중에서 적절히 또는 조합시켜 선택하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예 및 참고예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는바, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 임상시험
방법 :
종래의 치료법으로 저항성의 난치성 혈관염 증후군(결절성 다발성 동맥염, 대동맥염 증후군) 환자를 대상으로 인간화 항IL-6 수용체 항체에 의한 치료를 실행하였다. 오사카대학 부속병원 선진의료심사회의 허가 하에 2예의 환자에 인간화 항 IL-6 수용체 항체인 인간형화 PM-1 항체(MRA)를 사용하였다. 엔드 포인트는, 자기공명화상(MRI) 및 컴퓨터 단층촬영법(CT)을 이용한 화상평가의 개선, 피부증상의 개선, C 반응성 단백(CRP) 등 염증 마커의 개선, QOL(동통, 관절통, 권태감)의 개선으로 하였다. 또, 말초혈구, 일반 생화학, 지혈기능, IL-6, 가용성 IL-6 수용체, 혈중 인간화 항IL-6 수용체 항체농도, 종양괴사인자α(TNFα), 인터로이킨 -1b(IL-1b) 및 혈관내피 증식인자(VEGF)의 평가를 실행하였다.
결과 :
증례( 症例 ) 1.
19세 여성. 평성 8년에 대동맥염 증후군으로 진단되었다. 궤양성 대장염의 합병이 있음. 프레드니소론(PSL) 60mg/일 개시. 시클로스포린(cyclospolin)을 병용하여도 PSL 20mg/일 이하로 감량되지 않음. 평성 10년, 악화에 대해 메틸프레드니소론(mPSL) 펄스요법에 더해 시클로포스파미드 150mg/일을 병용하여도 PSL 30mg 이하로의 감량은 곤란. 베타메타손 1mg/일을 추가하고, 이후 7회에 걸쳐 백혈구제거요법을 실행하여도 무효. 평성 12년 이후, mPSL 펄스요법을 간헐적으로 사용함과 더불어, 아자티오프린(azathioprine) 100mg/일, 미코페놀산 모페틸(mycophenolate mofetil) 2g/일, 메토트렉세이트(methotrexate) 17.5mg/주의 병용도 효과가 없었다.
도 1~6에 도시된 것과 같이, CT에서 상행대동맥, 대동맥궁 3분기, 하행대동맥에 매우 분명한 혈관벽의 비후(肥厚)가 보였다. 좌쇄골하동맥(1t. SCA)에 협착이 인정되었다. CRP12.6mg/dl와 강한 염증이 인정되고, 강한 지속성 흉통, 1개월에 5kg의 체중감소, 의식소실발작을 일으켰기 때문에, MRA 200mg/주를 점적 정맥주사를 사용하였다. 약 2주 후에는 CRP가 음성화. 1개월 후에는 흉통의 개선에 더해, 도 1~6에 도시된 것과 같이, CT 상에서 상행대동맥, 대동맥궁 3분기, 하행대동맥의 혈관벽에서의 비후의 개선 및 혈관 내강의 확대가 보이고, 또 경동맥의 혈류의 개선이 인정되었다. 또, 대변의 헤모글로빈도 음성화되고, 궤양성 대장염의 증상도 없어졌다. MRA치료 중에 혈중 TNFα의 증가가 인정되었지만, 증상의 악화는 인정되지 않았다. 대동맥 벽의 비후의 개선 및 혈관내강의 확대는, MRA 치료 후 2년 경과 시점에서도 유지되고 있었다. 고안동맥염(高安動脈炎)은 다른 이름으로 맥박 없는 병으로도 불리는바, 이 환자에서도 당초는 요골·척골동맥에서 맥을 잡을 수가 없었으나, 치료에 의해 요골·척골 동맥의 박동이 손목에서 촉감할 수 있게 되었다. 또, MRA의 장기 사용에 따라 혈중 IL-6은 1720pg/ml으로부터 100 pg/ml 이하로 저하되었다.
증례 2.
42세 남성. 소화 61년에 결절성 동맥염(피부형)이 발병해서, PSL, 아자티오퓨린, 콜히친, 항응고제로 치료를 실행하여도 관해(寬解)·악화를 되풀이함. 평성 7년 이후는 mPSL 펄스요법에 더해 시클로포스파미드의 병용도 효과 없고, 평성 9년부터, 아자티오퓨린, 시클로포스파미드, γ-글로불린 대량요법, 평성 12년부터 시클로포스파미드 펄스요법, 백혈구제거요법을 실행하여도 무효. 혈관염에 기한 피부궤양에 대해 피부이식을 실행하여도 효과가 없고, 악화에 의해 우배골 절제 또는 슬하 절제를 시행. 또한 괴사성 혈관염이 악화되고, 하지의 궤양도 확대경향이었 다. 인간화 항 IL-6 수용체 항체 200mg/주에 의한 치료를 개시한 후, 그때까지 인정되고 있던 발열이나 피부의 홍반, 근육통의 개선이 인정되었다. 오른쪽 대퇴부에서의 절단을 피할 수 없게 되었지만, 혈중 IL-6의 저하에 수반해서 백혈구의 수도 정상화되고, 그 후는 피부궤양의 악화가 인정되지 않았다.
고찰 :
종래의 치료에서는 콘트롤할 수 없었던 난치성 혈관염 환자에 대해 MRA가 유효하다는 점에서, IL-6 저해치료는 혈관염의 새로운 치료법으로 될 수 있음이 나타났다. 이는 IL-6이 혈관염의 병태 형성에 불가결하다는 것을 나타내었다. 또, 어느 증례에서도 치료경과 중에 IL-6 그것의 저하가 인정되고 있기 때문에, IL-6 저해치료는 단지 항염작용이 아니라 혈관염의 근본에 작용하고 있음이 분명해졌다.
참고예 1. 인간 가용성 IL -6 수용체의 조제
야마자키 등의 방법(Yamasaki, K. et al., Science(1988) 241, 825-828)에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 포함한 플라스미드 pBSF2R.236을 이용해서, PCR 법으로 가용성 IL-6 수용체를 작성하였다. 플라스미드 pBSF2R.236을 제한효소 Sph I로 소화시켜 IL-6 수용체 cDNA를 얻고, 이를 mp18(Amersham 제)에 삽입하였다. IL-6 수용체 cDNA에 스톱코돈을 도입하도록 디자인한 합성 올리고프라이머를 이용해서, 시험관내 뮤타 제네시스시스템(Amersham 제)에 의해, PCR 법으로 IL-6 수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의해 스톱코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되어, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.
가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO 세포에서 발현하기 위해, 플라스미드 pSV(Pharmacia 제)와 연결시켜 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 포함한 플라스미드 pECEdhfr에 Hind III-Sal I로 절단한 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 삽입해서, CHO 세포발현 플라스미드 pECEdhfr344를 얻었다.
10㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포주 DXB-11(Urlaub, G. et aI., Proc Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4216-4220)에 칼슘포스페이트 침강법(Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol.(1987) 7, 2745-2751)으로 트랜스펙트하였다. 트랜스펙트한 CHO 세포를 1mM 글루타민, 10% 투석 FCS, 100 U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 포함한 뉴클레오시드 불포함 α MEM 선택배양액에서 3주간 배양하였다.
선택된 CHO 세포를 한계희석법으로 스크리닝하여, 단일의 CH0 세포 클론을 얻었다. 이 CHO 세포 클론을 20nM~200nM 농도의 메토트랙세이트로 증폭시켜, 인간 가용성 IL-6 수용체 산생 CHO 세포주 5E27을 얻었다. CHO 세포주 5E27을 5% FBS를 포함한 이스코브 개변 덜베코 배양액(IMDM, Gibco 제)에서 배양하였다. 배양상청을 회수하여, 배양상청 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA에서 측정하였다. 그 결과, 배양상청 중에는 가용성 IL-6 수용체가 존재하는 것이 확인되었다.
참고예 2. 항인간 IL -6 항체의 조제
10㎍의 조환형 IL-6(Hirano, T. et al., Immunol. Lett.(1988) 17, 41)을 프로인트 완전 아쥬반트와 함께 BALB/c 마우스를 면역하고, 혈청 중에 항IL-6 항체가 검출되기까지 1주간 마다 이를 계속하였다. 국부의 림프절로부터 면역세포를 적출하여, 폴리에틸렌글리콜 1500을 이용해서 미에로마 세포주 P3U1과 융합시켰다. 하 이브리도마를 HAT 배양액을 이용하는 등의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and C0., San Francisco, 351, 1980)에 따라 선택해서, 항인간 IL-6 항체를 산생하는 하이브리도마를 수립하였다.
항인간 IL-6 항체를 산생하는 하이브리도마는 아래와 같이 해서 IL-6 결합 분석을 행했다. 즉, 유연한 폴리비닐제의 96구멍 마이크로 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc. 제, Alexandria, VA)를 0.1M의 carbonate-hydrogen carbonate 완충액(pH 9.6) 중에서 100㎕의 염소 항마우스 Ig(10㎕/ml, Cooper Biomedical, Inc 제 Malvern, PA)에 의해 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음, 플레이트를 100㎕의 1% 우혈청 알부민(BSA)을 포함한 PBS에 의해 실온에서 2시간 처리하였다.
이를 PBS로 세정한 후, 100㎕의 하이브리도마 배양상청을 각 구멍(well)에 가해, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정하여, 2000cpm/0.5ng/well로 되도록 125I 표지 조환형 IL-6을 각 구멍에 첨가하고, 세정한 후 각 구멍의 방사활성을 감마카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216 하이브리도마 클론 중 32의 하이브리도마 클론이 IL-6 결합 분석에 양성이었다. 이들 클론 중에서 최종적으로 안정된 MH166.BSF2가 얻어졌다. 당해 하이브리도마가 산생하는 항IL-6 항체 MH166은 IgG1κ의 아류형을 갖는다.
이어, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH60.BSF2를 이용해서 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화활성을 조사하였다. MH60.BSF2 세포 를 1×104/200㎕/구멍으로 되도록 분주(分株)하고, 이에 MH166 항체를 함유한 샘플을 가해 48시간 배양하고, 0.5μCi/구멍의 3H 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)을 가한 후, 다시 6시간 배양을 계속하였다. 세포를 글라스 필터 페이퍼 상에 놓고, 자동 하베스터(Labo Mash Science C0., Tokyo, Japan)에서 처리하였다. 대조군으로는 토끼 항IL-6 항체를 이용하였다.
그 결과, MH166 항체는 IL-6에 의해 유도되는 MH60.BSF2 세포의 3H 티미딘의 취입을 용량의존적으로 저해하였다. 이에 의해, MH166 항체는 IL-6의 활성을 중화하는 것이 분명해졌다.
참고예 3. 항인간 IL -6 수용체 항체의 조제
히라타 등의 방법(Hirata, Y. et al. J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906)에 의해 작성한 항IL-6 수용체 항체 MT18을 CNBr에 의해 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals 제, Piscataway, NJ)와 첨부의 처방에 따라 결합시켜 IL-6 수용체(Yamasaki, K. et al., Science(1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 미에로마 세포주 U266을 1% 디지토닌(Wako Chemicals 제), 10mM 트리에타놀아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유한 1mM p-파라-아미노페닐 메탄술포닐플루오라이드 하이드로클로라이드(Wako Chemicals 제; 디지토닌 완충액)으로 가용화해서, 세파로스 4B 비즈와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 그 후, 비즈를 디지토닌 완충액으로 6회 세정하여, 면역하기 위한 부분정제 IL-6 수용체로 하였다.
BALB/c 마우스를 3×l09개의 U266 세포로부터 얻은 상기 부분정제 IL-6 수용체로 10일마다 4회 면역하고, 그 후 통상적인 방법으로 하이브리도마를 작성하였다. 성장 양성구멍으로부터의 하이브리도마 배양상청을 아래의 방법으로 IL-6 수용체에의 결합활성을 조사하였다. 5×107개의 U266 세포를 35S-메티오닌(2.5 mCi)로 표지하고, 상기 디지토닌 완충액으로 가용화하였다. 가용화한 U266 세포를 0.04 ml 용량의 세파로스 4B 비즈와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후 디지토닌 완충액으로 6회 세정하고, 0.25ml의 디지토닌 완충액(pH3.4)으로 35S-메티오닌표지 IL-6 수용체를 유출시켜, 0.025ml의 1M Tris(pH 7.4)로 중화하였다.
0.05ml의 하이브리도마 배양상청을 0.01ml의 Protein G 세파로스(Phramacia 제)와 혼합하였다. 세정한 후, 세파로스를 앞에서 조제한 0.005ml의 35S표지 IL-6 수용체 용액과 함께 인큐베이트하였다. 용액침강물질을 SDS-PAGE에서 분석하고, IL-6 수용체와 반응하는 하이브리도마 배양상청을 조사하였다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-1(FERM BP-2998)을 수립하였다. 하이브리도마 PM-1로부터 산생되는 항체는 IgG1κ의 아류형을 갖는다.
하이브리도마 PM-1이 산생하는 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 결합저해 활성을 인간 미에로마 세포주 U266을 이용해서 조사하였다. 인간 조환형 IL-6을 대장균으로부터 조제하고(Hirano, T. et al., Immunol Lett. (1988) 17, 41-45), 볼튼-헌터시약(New England Nuclear, Boston, MA)에 의해 125I 표지를 하였 다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981).
4×105개의 U266 세포를 1시간, 70% (v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양상청 및 14000cpm의 125I 표지 IL-6과 함께 배양하였다. 70㎕의 샘플을 400㎕의 마이크로퓨지 폴리에틸렌튜브에 300㎕의 FCS 상에 중층하고, 원심을 한 후, 세포상의 방사활성을 측정하였다.
그 결과, 하이브리도마 PM-1이 산생하는 항체는, IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 분명하게 되었다.
참고예 4. 항마우스 IL -6 수용체 항체의 조제
사이토(Saito), T. et al., J. Immunol.(1991) 147, 168-173에 기재된 방법으로, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체를 조제하였다.
마우스 가용성 IL-6 수용체를 산생하는 CHO 세포를 10%FCS를 포함한 IMDM 배양액에서 배양하고, 그 배양상청으로부터 항마우스 IL-6 수용체 항체 RS12(상기 Saito, T. et al 참조)를 Affigel 10겔(Biorad 제)에 고정한 어피니티 컬럼을 이용해서 마우스 가용성 IL-6 수용체를 정제하였다.
얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체 50㎍을 프로인트 완전 아쥬반트와 혼합하여, 위스타 랫(Wistar rat)의 복부에 주사하였다. 2주간 후부터는 프로인트 불완전 아쥬반트에서 추가면역하였다. 45일째에 랫 비장세포를 채취하여, 2×l08개를 1×107개의 마우스 미에로마 세포 P3U1과 50%의 PEG1500(Boehringer Mannheim 제)를 갖 고서 통상적인 방법으로 세포융합시킨 후, HAT 배지에서 하이브리도마를 스크리닝하였다.
토끼 항랫 IgG 항체(Cappel 제)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양상청을 가한 후, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 반응시켰다. 다음, 토끼 항마우스 IL-6 수용체 항체 및 알칼리 포스페타제 표지 양 항토끼 IgG에 의한 ELISA법으로 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 항체의 산생이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브 스크리닝을 실행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1이라 이름 붙였다.
이 하이브리도마가 산생하는 항체의 마우스 IL-6의 정보전달에서의 중화활성을 MH60.BSF2 세포(Matsuda, T. et al., J. Immunol(1988) 18, 951-956)를 이용한 3H 티미딘의 취입으로 조사하였다. 96 웰 플레이트에 MH60.BSF2 세포를 1×104개/200㎕/well로 되도록 조제하였다. 이 플레이트에 10pg/ml의 마우스 IL-6과 MR 16-1 항체 또는 RS12 항체를 12.3~1000ng/ml을 가해 37℃, 5% C02에서 44시간 배양한 후, 1μCi/well의 3H 티미딘을 가하였다. 4시간 후에 3H 티미딘의 취입을 측정하였다. 그 결과 MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의 3H 티미딘 취입을 억제하였다.
따라서, 하이브리도마 MR16-1(FERM BP-5875)이 산생하는 항체는, IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 분명해졌다.

Claims (42)

  1. IL-6(인터로이킨-6) 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  2. IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항성을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈관염이 결절성 다발성 동맥염인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈관염이 대동맥염 증후군인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈관염이 면역이상에 수반하는 혈관염인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  9. 제6항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 조환형 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  11. 제8항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  12. 제9항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으 로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료제.
  15. 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제조하기 의한 IL-6 안타고니스트의 용도.
  16. 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항성을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료제를 제조하기 위한 IL-6 안타고니스트의 용도.
  17. 제15항 또는 16항에 있어서, 상기 혈관염이 결절성 다발성 동맥염인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 혈관염이 대동맥염 증후군인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 혈관염이 면역이상에 수반하는 혈관염인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트가 IL- 6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  22. 제20항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  23. 제20항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 조환형 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  25. 제22항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  26. 제23항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 IL-6 안타고니스트의 용도.
  29. IL-6 안타고니스트를, 투여를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함해서 이루어진 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  30. IL-6 안타고니스트를, 투여를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함해서 이루어진, 스테로이드제 및/또는 면역억제제에 저항성을 가진 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 혈관염이 결절성 다발성 동맥염인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 혈관염이 대동맥염 증후군인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 혈관염이 면역이상에 수반하는 혈관염인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 조환형 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로널 항체가 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 혈관염의 예방 및/또는 치료방법.
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