TWI351967B - A preventive agent for vasculitis - Google Patents

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九、發明說明： 【發明所屬技彳标領域】 技術領域 本發明係關於一種血管炎之新穎預防及/或治療劑 C先前技術3 背景技術 在自體免疫疾病中，血管炎被公認為係難治性病態的 一種，即使採用迄今仍使用之類固醇劑及免疫抑制劑作治 療，顯示抵抗性之病例亦多，故現正待望著新穎治療方法 之媒立。血管炎症候群係於各種規模之動脈發生炎症，而 產生發燒、肌肉關節疼痛、血管阻塞、皮膚潰瘍及多發性 單神經炎沿_吨化）。血管炎包含結節性動脈 週炎〇?⑺arienib no如β)及主動脈炎症候群（蒙仙、 等難治性血管炎症候群。結節性動脈週炎之病變 係以中膜與外膜之局部壞死性炎症為特徵，而主動脈炎則 通常係主動脈三層全部（即内膜、中膜及外膜）呈現發炎。 主動脈炎亦稱為高安動脈炎。而血管炎之病態則暗示 著與IL-6相關。舉例來說，若據Noris et ai.之報告，其指出： 病態處於活性期之高安動脈炎患者與正常人相較下，血清 中之IL-6濃度增加（Circulation. 1999 Jul 6; 100(1): 55-60)。 然而，同文獻中亦指出，處於活性期之患者體内RANTES(趨 化素(chemokine)的一種)血清濃度提高。此外，N〇ds氏等暗 不了該等細胞激素引起高安動脈炎患者發生金管損傷 {vasculitic lesion)^^f 〇 1351967 10 15 20 【發明内容】 發明揭示 然而’該文獻完全未揭示到藉阻礙IL-6治療高安動脈 炎之可能性。因此，本發明提供一種以儿-6拮抗劑作有效 5 成分之動脈炎預防及治療劑。 經本案發明人精心研究之成果，發現IL_6係形成血管 炎病態所不可少者，IL-6拮抗劑具有治療血管炎之效果。 更令人訝異的是，透過本案發明人之研究，確認血管炎時 以IL-6受體抗體阻礙IL_6結合至受體，血液中之IL 6自身將 減>'。即，IL-6拮抗治療對血管炎不僅有抗炎症作用，而 係對血S义之根源作用而直接治療血管炎，此點已臻明確。 因此，本發明提供一種含介白素_6(IL 6)拮抗劑作有效 成分而構成之動脈炎預防及/或治療劑。 此外本發明亦提供一種含有介白素_6(K)括抗劑作 成刀而構成之對類固醇劑及/或免疫抑制劑具抵抗性 之血管炎的預防及/或治療劑。 前述血管炎可例示如結節性動脈週炎、主動脈炎症候 =或伴隨免疫異常之血管炎。主動脈炎症候群又稱為高安 氏人*伴1^免疫異常之血管炎則可例舉如伴隨風滿病 之血:炎及伴隨全身紅錄狼瘡之血管炎。 =私抗劑可例不如對抗IL-6之抗體或對抗il-6 IL6之^體且^為對抗IL_6受體之單株抗體。而對抗該 體特別宜為對抗人狐侧之單株抗體，如 心或為對抗小鼠IL·6受體之單株抗體，如MR16-1 6 抗體。且對抗該IL-6受體之抗體較宜為重級型抗體。 對抗該IL-6受體之抗體可為嵌合抗體、人類化抗體& 人類抗體。本發明中特別適宜之抗體則為人類化ΡΜ_ι^縣 々几sS ° 本發明另可採取下述型態。 (1) 一種介白素-6(IL-6)拮抗劑之用途，係用以製造血 管炎之預防及/或治療劑者β (2) -種介白素_6(IL_6)括抗劑之用途， 類固醇劑m疫抑制_抵抗性之血 治療劑者。 久丨（ 脈週(:。如前述⑴或(2)之用途’其中該血管炎為結節性動 症:。如前述卿)之用途.其中該血管炎為咖炎 (5)如前述⑴或⑺項之用途，其中該 疫異常之血管炎。 人為伴隨免 # ()如則述⑴〜⑶中之你―用途，其中該 對抗IL-6受體之抗體。 扰抗劑係 ()如Μ述⑹之用途’其中對抗該IL 6受體之 kIL-6受體之單株抗體。 凡體係對 ()如則述⑹之用途，其中 几 抗人飢喊體之單株抗體。 认體係對 途，其中對抗該Μ受體之抗體― J既儿-6欠體之單株抗體。 耵 (1〇)如前述⑹〜⑼中之你-用途，其中對抗該!“受 1351967 體之抗體係重組型抗體。 (11) 如前述(8)之用途，其中對抗該人類IL-6受體之單 株抗體係PM-1抗體。 (12) 如前述(9)項之用途，其中對抗該小鼠IL-6受體之 5 單株抗體係MR16-1抗體。 (13) 如前述(6)〜(12)中之任一用途，其中對抗該il-6受 體之抗體係對抗IL-6受體之嵌合抗體、人類化抗體或人類 抗體。 (14) 如前述（13)之用途，其中對抗該IL-6受體之人類化 10 抗體係人類化PM-1抗體。 (15) —種血管炎之預防及/或治療方法，係包含將介白 素-6(IL-6)拮抗劑投予需投藥之對象而成者。 (16) —種對類固醇劑及/或免疫抑制劑具抵抗性之血 管炎之預防及/或治療方法’係包含將介白素_6(IL_6)拮抗劑 15 4又予需投藥之對象而成者。 U7)如前述（15)或（16)之方法，其中該血管炎為結節性 動脈週炎。 (18) 如前述（15)或（16)之方法，其中該血管炎為主動脈 炎症候群。 20 /1rv、 (19) 如前述（15)或（16)之方法，其中該血管炎為伴隨免 疫異常之血管炎。 (20) 如前述（15)〜(19)中之任一方法，其中該比-6拮抗 劑係對抗IL-6受體之抗體。 (21) 如前述(20)之方法，其中對抗該IL_6受體之抗體係 8 1351967 另一種係與非配體結合性之信號傳達相關之分子量約 130kD的膜蛋白質gpl30。IL-6與IL-6受體將形成IL-6/IL-6 受體複合體，接著與gpl30結合，藉此傳達IL-6之生物活性 (Taga，T. et al·，Cell (1989) 58, 573-581)。 5 IL-6拮抗劑係阻礙IL-6之生物活性傳達之物質。迄今已 知有對抗IL-6之抗體(抗IL-6抗體）、對抗IL-6受體之抗體(抗 IL-6受體抗體）、對抗gpl30之抗體(抗gpl30抗體）、IL-6變異 體、IL-6或IL-6受體部分胜肽等。 關於抗IL-6受體抗體則已有數個報告(Novick, D. er al., 10 Hybridoma (1991) 10，137-146 ； Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12，621-630;國際專利申請案公開號 WO95-09873 ;法國專利申請案公開號FR2694767 ;及美國 專利號碼US521628)。已知其中之一係將小鼠抗體 PM-l(Hirata, Y. et al., J. Immounol. (1989) 143, 2900-2906) 15 之互補決定區（CDR ; complementarity determining region) 移植至人類抗體而獲得之人類化PM-1抗體（國際專利申請 案公開號W092-19579)。 前述IL-6拮抗劑宜為對抗IL-6受體之抗體，且更宜為對 抗人類IL-6受體之单株抗體，或對抗小氣IL-6受體之單株抗 20 體。而對抗該人類IL-6受體之單株抗體如可例示如PM-1抗 體’且對抗小鼠IL-6受體之單株抗體則可列舉如MR16-1抗 體。前述抗體宜為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，如 人類化PM-1抗體。 本發明所用之IL - 6拮抗劑僅需為可有效作為血管炎之 11 1351967 預防或治療軸活性成分者即可，*不論其㈣、種類或 形狀。 IL-6拮抗劑係遮蔽IL_6引起之信號傳達進而阻礙冚_6 之生物活丨生者^ IL-6拮抗劑宜為對IL 6、抗體及gpUO 5中任一者之結合具有阻礙作用的物質。IL-6拮抗劑可列舉 如抗IL-6抗體、抗IL_6受體抗體、抗gpl3〇抗體、比_6變異 體可浴性IL-6變異體或者il-6或IL-6受體的部分胜肽，以 及顯示與該等相同活性之低分子物質。 本發明使用之抗IL - 6抗體可使用習知手段而製得多株 10或單株抗體。本發明使用之抗IL-6抗體特別宜為來自哺乳 動物之單株抗體。來自哺乳動物之單株抗體有係產自融合 瘤者以及採基因工學手法而產自於宿主者，該宿主係藉著 含抗體基因之表現載體而轉形。使該抗體與IL_6結合，藉 此阻礙IL-6向IL-6受體結合，進而截斷IL-6向細胞内傳達生 15 物活性。 此種抗體可列舉如MH166(Matsuda, T. et al.，Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-955)及SK2抗體（Sato, K. et al.，第 21次日本免疫學會總會學術紀錄（1999) 21，166)等。 產生抗IL - 6抗體之融合瘤基本上可使用習知技術而如 20 下述般製作出。即，採用IL-6作致敏抗原，再使其依一般 免疫方法免疫，並使所得之免疫細胞依一般之細胞融合法 而與習知親細胞融合，再依一般之篩選法而可篩選出產生 單株抗體樣抗體之細胞。 具體來說，可如下述般製作抗IL-6抗體。例如，作為 12 1351967 取得抗體之致敏抗原而使用之人類IL-6係可藉著採用揭示 於Eur. J. Biochem (1987) 168，543-550，J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541 或Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688之 IL-6基因/胺基酸序列而製得。 5 將IL-6之基因序列插入習知之表現載體系中使適當之 宿主細胞轉形後，以習知方法從該宿主細胞或培養上清液 中純化目的之IL-6蛋白質，再將該純化IL-6蛋白質用作致敏 抗原即可。此外，亦可將IL-6蛋白質與其他蛋白質之融合 蛋白質用作致敏抗原。 10 本發明所用抗IL-6受體抗體可使用習知手段而製得多 株或單株抗體。本發明使用之抗IL-6受體抗體特別宜為來 自哺乳動物之單株抗體。來自哺乳動物之單株抗體有係產 自融合瘤者以及採基因工學手法而產自於宿主者，該宿主 係藉著含抗體基因之表現載體而轉形。該抗體係與IL-6結 15 合，藉此阻礙IL-6向IL-6受體結合，進而截斷IL-6向細胞内 傳達生物活性。 此種抗體可列舉如MR16-1抗體(Tamura, T. et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90，11924-11928)、PM-1 抗體 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) ' 20 AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體（國際專利 申請案公開號W092-19759)等。於該等之中，可列舉PM-1 抗體為特別合宜者。

此外，產生PM-1抗體融合瘤之細胞株係以PM-1為名而 基於布達佩斯條約於1989年7月12日以寄存編號FERM 13 1351967 BP-2998進行國際寄存在獨立行政法人產業技術综合研究 所專利生物寄存中心（茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第 6)。此外’產生MR16-1抗體之融合瘤細胞株則以Rat_m〇use . hybridomaMR16-l為名，而基於布達佩斯條約於1997年3月 5 13日以寄存編號FERM BP-5875進行國際寄存在獨立行政 法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心（茨城縣筑波 市東1丁目1番地1中央第6)。 產生抗IL-6受體單株抗體之融合瘤基本上可使用習知 技術而如下述般製作出。即’採用IL-6受體作致敏抗原， · 10使其依一般免疫方法免疫，並使所得之免疫細胞依一般之 細胞融合法而與習知親細胞融合，再依一般之筛選法而可 篩選出產生單株抗體樣抗體之細胞。 具體來說，可如下述般製作抗IL-6受體抗體。例如， . 作取得抗體之致敏抗原而使用之人類IL-6受體可藉著採用 15揭示於歐洲專利申請案公開號EP325474之IL-6受體基因/胺 基酸序列來製得；而小鼠IL-6受體則可使用揭示於日本專 利申請案公開號特開平3-155795之IL-6受體基因/胺基酸序 φ 列而製得。 IL4受體蛋白質分為二種，即表現在細胞膜上者以及 2〇自細胞膜脫離者（可溶性IL-6受體）(Yasukawa，K. et al. j ·

Biochem. (1990) 108, 673-676)。可溶性IL-6受體抗體係由結 合在細胞膜之IL-6受體的實質細胞外領域所構成，其缺損 有細胞膜貫通領域或者細胞膜貫通領域與細胞内領域，此 點則與膜結合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質僅需為於势 14 1351967 作本發明所用之抗IL-6受體抗體時可作致敏抗原用者即 可，而可使用任擇之IL-6受體。 將IL - 6受體之基因序列插入習知之表現載體系中使適 當之宿主細胞轉形後’以習知方法從該宿主細胞或培養上 5 清液中純化目的之IL-6受體蛋白質，再將該純化il-6受體蛋 白質用作致敏抗原即可。此外’亦可將表現IL_6受體之細 胞或IL-6受體蛋白質與其他蛋白質之融合蛋白質用作致敏 抗原。 包含有一含編碼人類IL-6受體之cDNA之質體 10 pIBIBSF2R的大腸菌（E. Coli)係以 HB101-pBIBSF2R為名， 而於1989年1月9日基於布達佩斯條以寄存號碼FERM BP-2232進行國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究 所專利生物寄存中心（茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第 6) 〇 15 本發明使用之抗gpl30抗體可使用習知手段而製得多 株或單株抗體。本發明使用之抗gpl30抗體特別宜為來自哺 乳動物之單株抗體。來自哺乳動物之單株抗體有係產自融 合瘤者以及採基因工學手法而產自於宿主者，該宿主係藉 著含抗體基因之表現載體而轉形。該抗體係與gP130結合， 20 藉此阻礙IL-6/IL-6受體複合體對gpl30結合，進而裁斷IL-6 向細胞内傳達生物活性。 此種抗體可列舉如AM64抗體（特開平3-219894)、4B11 抗體及2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體及B-P8抗體（特開 平 8-291199)等。 15 產生抗gpl30抗體之融合瘤基本上可使用習知技術而 如下述般製作出。即，採用gpl30作致敏抗原，再使其依一 般免疫方法免疫，並使所得之免疫細胞依一般之細胞融合 法而與習知親細胞融合，再依一般之篩選法而可篩選出產 生單株抗體樣抗體之細胞。 具體來說，可如下述般製作單株抗體。例如，作取得 抗體之致敏抗原而使用之gpl3〇係可藉著採用揭示於歐洲 專利申請案公開號EP411946之gpl30基因/胺基酸序列而製 得。 將gpl30之基因序列插入習知之表現載體系中使適當 之宿主細胞轉形後，以習知方法從該宿主細胞或培養上清 液中純化目的之gpl30蛋白質，再將該純化gpl3〇蛋白質用 作致敏抗原即可。此外’亦可將表現gpl3〇之細胞或gpl3〇 蛋白質與其他蛋白質之融合蛋白質用作致敏抗原。 以致敏抗原而免疫之哺乳動物並未受到特別限定，但 宜考慮與用於細胞融合之親細胞間之合適性而選擇之，一 般而言係使用嚅齒類動物，如小鼠、大鼠及砂、鼠等。 使致敏抗原於動物體内免疫時，可依習知方法進行 之。舉例言之，一般方法係將致敏抗原注射至哺乳動物之 腹腔内或皮下而進行者。具體來說，宜使以 PBS(Phosphate-Buffered Saline)及生理食鹽水等將致敏抗 原稀釋至適當量並懸濁者依需要而混合適量之一般佐劑 (如佛氏完全佐劑）’乳化後對哺乳動物每4〜21日投予數次。 此外，於免疫致敏抗原時可使用適當之载體。 1351967 如前述般免疫而確認血清中所須之抗體位準上升後， 自哺乳動物取出免疫細胞，再付諸細胞融合。較宜付諸細 胞融合之免疫細胞可特別列舉如脾細胞。

作為與前述免疫細胞融合之另一親細胞的哺乳動物骨 5 髓瘤細胞則可適當使用習知之各種細胞株，如 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550) ' P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81，1-7)、NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519) ' MPC-11 10 (Margulies. D. H. et al.，Cell (1976) 8，405-415)、SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270) > F0 (de St. Groth, S. F. et al” J. Immunol. Methods (1980) 35，1-21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) > R210 (Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277, 131-133)等。 15 基本上，前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合可依

習知方法，如米爾斯丁氏等人之方法（Kohler. G. and Milstein.，C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)來進行。 更具體言之，舉例來說，前述細胞融合係於細胞融合 促進劑存在下於一般之營養培養液中實施者。融合促進劑 2〇 可使用如聚乙二醇(PEG)及仙台病毒(HVJ)等，更可依所需 且為提向融合效率而添加使用二曱亞礙（dimethyl sulphoxide)等輔助劑。 舉例言之，免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例宜相對 於骨髓瘤細胞令免疫細胞為1〜10倍。用於前述細胞融合之 17 1351967 培養液可使用如對該骨髓瘤細胞株之增殖上較適宜之 RPMI164〇培養液、MEN培麵及其他用於培養此種細胞之 一般培養液，且更可併用牛胎兒血清(FCS)等血清輔液。 細胞融合係使預定量之前述免疫細胞與骨髓瘤細胞於 5該培養液中混合均勻，再以一般濃度(30〜60%(w/v))添加已 預先加溫至37°C程度之peg溶液（如平均分子量丨000_6000 程度之PEG溶液）並混合後，而形成目的之融合細胞（融合 瘤）。接著，依次添加適當之培養液，反覆作離心處理除去 上清液之操作，可藉此除去不利融合瘤生育之細胞融合劑 10 等。 該融合瘤可藉一般之選擇培養液，如HAT培養液(含次 黃嘌呤、胺蝶砖(aminopterin)及胸腺嘧啶(thymidine)之培養 液）進行培養而加以選擇。於該HAT培養液中之培養係持續 至目的融合瘤以外之細胞（非融合細胞）死滅所需充分時 15間，通常持續數日至數週之間。接著，實施一般之臨界稀 釋法’以進行用以產生目的抗體之融合瘤的篩檢及選殖。 再者，除使抗原於人類以外之動物免疫而獲得前述融 合瘤外，亦可使人類淋巴球以所需之抗原蛋白質或抗原表 現細胞於活體外致敏，再使致敏B淋巴球與人類骨髓瘤細胞 2〇 (如U266)融合，而製得對所欲抗原或抗原表現細胞具有結 合活性之所欲人類抗體（參照日本特公平1-59878)。更可對 具有人類抗體基因之所有存庫（repertory)的基因轉殖動物 投予抗原或抗原表現細胞，再依前述方法取得所需之人類 抗體（參照國際專利申請案公開號WO093/12227、 18 1351967 WO92/03918、W094/02602、W094/25585、WO96/34096 及W096/33735)。 用以產生如前述般製出之單株抗體的融合瘤可於一般 之培養液中進行繼代培養，亦可於液態氮中長期保存。 5 欲由該融合瘤取得單株抗體時，可採取如下方法：按 一般方法培養該融合瘤，再取得其培養上清液之方法；或 將融合瘤投予與其有適合性之哺乳動物使其增殖後，在取 得其腹水之方法等。前者之方法適於欲取得高純度抗體 時，而後者之方法則適於大量生產抗體。 10 舉例言之’製作可產生抗IL-6受體抗體之融合瘤時， 可按揭示於特開平3-139293之方法進行。可進行如下述方 法’即：將業已於1989年7月12日以寄存編號FERMBP-2998 進行國際寄存在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生 物寄存中心（茨城縣筑波市東1 丁目1番地i中央第6)的產生 15 PM·1抗體融合瘤注入BALB/c小鼠腹腔内而獲得腹水，再由 該腹水純化出PM-1抗體之方法；以及使該融合瘤於適當培 養基内培養，如含有10%牛胎兒血清及5%BM-Condimed Hl(Boehringer Mannheim製）之RPMI1640培養基、融合瘤 SFM培養基（GIBCO-BRL製）以及PFHM-II培養基 2〇 (GIBCO-BRL製）等，再由其培養上清液純化PM-1抗體之方 法。 本發明中，可自融合瘤選殖抗體基因並插入適當載體 後’再將其導入宿主，使用基因重組技術產生重組型抗體 以作為單株抗體（參照如Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. 19 1351967 W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBADIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。

具體言之，係由用以產生目的抗體之細胞（如融合瘤） 5 中離析出用以編碼抗體之可變（V)區的mRNA。mRNA之離 析可按習知方法如胍類超離心法(Chirgwin，J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法（Chmczynski， P. et al.，Anal. Biochem. (1987) 162，156-159)等調製出全 RNA，再使用 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等調製 10 mRNA。此外，可使用 QuickPrep mDNA Purification Kit (Pharmacia製）直接調製出mRNA。

使用逆轉錄酶而自所得mRNA合成出抗體V區之 cDNA。可使用 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等進行cDNA之合成。此外，欲進行 15 cDNA之合成及擴增時，可採用係使用5’-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 製）及PCR之5，-RACE法（Frohman，M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)。由所得PCR產物純化出目的DNA片段，並與載 20 體DNA連結。更藉此製出重組載體，再導入至大腸菌等並 選出菌落，而製出所需之重組載體。可藉習知方法(如雙去 氧法）而確認目的DNA之鹼基序列。 若能獲得可編碼目的抗體V區之DNA，則將其與用以 編碼所需抗體恆定區（C區）之DNA連結，再插入表現載體 20 1351967 中。此外，亦可將編碼抗體V區之DNA插入含有抗體C區 DNA之表現載體。 製造本發明所用抗體時，可如後述般將抗體基因插入 表現載體_，該表現載體於表現控制區（如加強子 5 (promoter)、啟動子（enhancer))之控制下將有表現？其次， 可藉該表現載體使宿主細胞轉形並使抗體表現。 本發明中’為達到使對人類之異種抗原性降低等目 的’可使用經人為改變之基因重組型抗體，如嵌合抗體 (chimeric antibody)、人類化抗體（Humanized antibody)及人 10 類(human)抗體等。該等改變抗體可使用已知之方法製造。

可將如前述般製得之編碼抗體V區的DNA與編碼人類 抗體C區之DNA連結，再將其插入表現載體並導入宿主體内 進行生產’而獲得嵌合抗體（參照歐洲專利申請案公開號EP 125023及國際專利申請案公開號w〇92-19759)。使用此種 15習知方法可製得對本發明有用之欲合抗體。 舉例言之’含有可編碼嵌合PM4抗體之L鍊及Η鍊v區 之DNA的質體各被命名為pPM_k3及pPM hl。而含有該等質 體之大腸菌則基於布達佩斯條約而於1991年2月12日各以 NCIMB40366及NCIMB40362為寄存號碼進行國際寄存在 20 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (大不列顛及北愛爾蘭聯合王國，蘇格蘭亞伯丁ab2 1RY馬克哈德生活大道23號）。 人類化抗體亦稱為重構(reshaped)人類抗體，係使人類 以外之哺乳動物（如小鼠）抗體之互補決定區（CDR)移植至 21 人類抗體之互補決定區而成者，其一般之基因重組手法亦 已為人所知（參照歐洲專利申請案公開號EP125023及國際 專利申請案公開號W092-19759)。 具體言之’利用PCr法而從製作成於末端部具有重疊 部分之數個寡核菩酸合成出一設計成小鼠抗體之CDR係與 人類抗體之骨架區（FR; frarnework-region)連結之DNA序 列。將所得DNA與編碼人類抗體c區之DNA連結，接著插 入表現載體中再導入宿主體内使其生產即可製得（參照歐 洲專利申請案公開號EP239400及國際專利申請案公開號 W092-19759)。 藉C D R而連結之人類抗體FR係選擇互補決定區可形成 良好之原結合部位者。亦可依需要而取代抗體可變區之 骨架區的胺基酸，以使重構人類抗體之互補決定區形成適 切之抗原結合部位（Sato，K. et al.，Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。 嵌合抗體、人類化抗體係使用人類抗體C區。人類抗體 C區可列舉如CY’舉例來說可使用Cyl 此外’為改善抗體或其生產之安定性，亦可將人類抗體c 區加以修飾。 嵌合抗體係由來自人類以外之哺乳類動物之抗體可變 區與來自人類抗體之C區所構成，而人類化抗體係由來自人 類以外之规類祕紐的互縣以與來自人類抗體之 骨架區及C區所構成，因於人類體内之抗原性較低，而作為 本發明治療劑之有效成份係甚為有用 1351967 本發明所用人類化抗體之較佳具體例可列舉如人類化 PM-1抗體（國際專利申請案公開號WO-19759)。

另’取得人類抗體之方法除前述方法外，亦已知有使 用人類抗體庫而藉淘篩（Panning)取得人類抗體之技術。舉 5 例言之，亦可藉噬菌體呈現法使人類抗體之可變區作為單 鍊抗體(scFv)而表現在噬菌體表面，再選擇出與抗原結合之 噬菌體。若解析選出之噬菌體的基因，則可決定出用以編 碼與抗原結合之人類抗體可變區的DNA序列。若可使與抗 原結合之scFv之DNA序列明確，則可製作出插入有該序列 10 之適當表現載體，進而取得人類抗體。該等方法業已為習 知方法，可參考W092/01047、WO92/2079卜 WO93/06213、 W093/11236、W093/19172、WO95/01438及W095/15388。 如前述般構築之抗體基因可依習知方法使其表現後而 取得。為哺乳類細胞時，可藉常用之有效啟動子、被表現 15 之抗體基因以及使聚A信號機能性地於其3,側下游結合的

DNA或包含該DNA之載體而表現。舉例言之，啟動子/加強 子可列舉如人類巨細胞病毒早期起動子（human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer) ° 此外，其他可使用在本發明所用之抗體表現的啟動子/ 20 加強子則可使用如反轉錄病毒、多瘤病毒(Polyoma Virus)、 腺病毒、猿猴濾過性病毒4〇(Simian Virus 40, SV40)等之病 毒啟動子/加強子，以及人類延長因子la(human elongation factor Ια，HEFla)等來自哺乳類細胞之啟動子/加強子。 舉例言之，於使用SV40啟動子/加強子時採用Mulligan 23 1351967 氏等之方法(Nature (1979) 277, 108)，或於使用HEFla啟動 子/加強子時採用Mizushima氏等之方法(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)則可容易地實施之。 於係大腸菌時，可使常用之有效啟動子、用以分泌抗 5 體之信號序列及欲使其表現之抗體基因機能性地結合進而 使其表現。舉例言之，啟動子可列舉如lacZ啟動子及areB 啟動子。使用lacZ啟動子時，可依Ward氏等之方法(Nature (1098) 341, 544-546; FAS EB J. (1992) 6, 2422-2427)、使用 areB啟動子時，則可依Better氏等之方法(Science (1988) 240, 10 1041-1043)。 用以分泌抗體之信號序列於係產自大腸菌之細胞周質 (periplasm)時可使用 pelB 信號序列（Lei, S_ P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)。使產自細胞周質之抗體分離 後，將抗體之結構適當地再疊合(refold)後加以使用（舉例言 15 之，參照WO96/30394)。 複製起源可使用來自多瘤病毒、腺病毒及牛乳頭瘤病 毒(BPV)等者。為使基因複製數於宿主細胞系令擴增，表現 載體更可含有胺基葡萄糖苷轉移酶(ΑΡΗ)基因、胸腺嘧。定激 酶（ΤΚ)基因、大腸桿菌次黃嗓吟鳥。票吟填Ribosyl轉移酶 2〇 (Ecogpt)基因及二氫葉酸還原gi(dhfr)基因等，以作為選擇 標記。 為製造本發明中所用抗體，可使用任意之產生系。用 以製造抗體之產生系有in vitro及in vivo之產生系。in vitro 之產生系可列舉如使用真核細胞之產生系及使用原核細胞 24 1351967 之產生系。 使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞、真菌 細胞之產生系。動物細胞已知有：（1)哺乳類細胞，如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero ; 5 (2)兩棲類細胞，如非洲爪蟾卵細胞；或（3)昆蟲細胞，如Sf9、

sf21、Tn5等。植物細胞則已知有來自於草（Nicotiana tabacum)之細胞，將其作胼胝培養即可。真菌細胞則已知 有：酵母，如酵母（saccharomyces)属，例如釀酒酵母 (saccharomyces serevisiae);及，絲狀菌，如麴菌屬 10 (Aspergillus)，例如黑麴菌（Asperillus niger)等。 使用原核細胞時，則有使用細菌細胞之產生系。細菌 細胞已知有大腸桿菌（E. coli)及枯草菌。 可使目的抗體基因藉轉形而導入該等細胞中，並使業 經轉形之細胞以in vitro培養而製得抗體。可依習知方法進 15 行培養。舉例言之，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM 作為培養液，亦可併用牛胎兒血清（FCS)等企清辅液。此 外，亦可將導入有抗體基因之細胞移至動物之腹腔等，藉 此以in vivo方式產生抗體。 另一方面，in vivo之產生系可列舉如使用動物之產生 20 系及使用植物之產生系。使用動物時’則有使用哺乳類動 物或昆蟲之產生系。 哺乳類動物可使用山羊、豬、雉雞、小鼠及牛等（Vicki

Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993)。此 外’昆蟲則可使用如蠶等。使用植物時，舉例來說可使用 25 1351967 菸草等。 將抗體基因導入該等動物或植物，使動物或植物體内 產生抗體後回收之。舉例來說，將抗體基因插入可編碼山 苹β酪蛋白等原本就產生於乳汁中之蛋白質的基因中，而調 5製出融合基因。再將含有已插入抗體基因之融合基因的 DNA片段注入山羊胚胎後，將該胚胎導入雌山羊。可由接 受胚胎之山羊生產之基因轉殖山羊或其子孫所產生之乳汁 獲得所需抗體。為使基因轉殖山羊產生之含所需抗體的乳 汁量增加，亦可對基因轉殖山羊使用適當之激素(Ebert，κ 10 M. et al·，Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。 另外’於使用蠶的情況下，可使蠶感染插入有目的抗 體基因之桿狀病毒(baculovirus)，再由該蠶之體液取得所需 抗體（Susumu，M. et al·，Nature (1985) 315, 592-594)。另， 於使用菸草時，將目的抗體基因插入植物表現用載體，如 15 PMON530 ’ 再將該載體導入如 Agrobacterinm tumefaciens 般之桿菌。再使於草（如Nicotianatabacum)感染該桿菌，而 能自該菸草之葉取得所需抗體(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138)。 如前述般以in vitro或in vivo之產生系來產生抗體時， 20 亦可將編碼抗體重鍊(Η鍊）或輕鍊(L鍊）之DNA分別組入表 現載體後使宿主同時轉形，或者亦可將編碼Η鍊及L鍊之 DNA組入單一表現載體，再使宿主轉形（參照國際專利申請 案公開號W094/11523)。 本發明所用抗體僅需為適宜使用在本發明者即可，而 26 1351967 可為抗體片段或其修飾物。舉例言之’抗體片段可列舉如 Fab、F(ab，)2、Fv或以適當連結體連結Η鍊與L鍊而成之單 鍊Fv(scFv)。 具體言之，可藉酶(如木瓜酶、胃蛋白酶)處理抗體而產 5 生抗體片段，或建構可编碼該等抗體片段之基因，將其導 入表現載體後使其於適當之宿主細胞中表現（參照如匚〇,厘· S. et al„ J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178,

476-496 1 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in 10 Enzymology (1989) 178, 476-496 ； Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66 ； Bird, R. E. et al.，TIBTECH (1991) 9, 132-137)。

scFv可由連結抗體之H鍊V區與L鍊V區而製得。該scFv 15中，Η鍊V區與L鍊V區係藉連結體（宜為胜肽連結體）而連結 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。scFv之H鍊V區及L鍊V區可係來自前述抗體中 之任擇者。舉例來說’連結V區之胜肽連結體可使用由胺基 酸12-19殘基所構成之任意單鍊胜肽。 20 編碼ScFv之DNA可如下述般獲得，即：將編碼前述抗 體之Η鍊或Η鍊V區的DNA以及編碼前述抗體之L鍊或[鍊v 區的DNA作為模板’再使編碼該等序列中之所欲胺基酸序 列的DNA部分使用規定其兩端之引子對而藉取法擴增， 接著更將編碼胜肽連結體部分之DNA與將其兩端規定成各 27 別與Η鍊、L鍊連結的引子對加㈣合並進行擴増。 此外，一旦製作出編碼scFv之 I::™及藉該表現載體而轉= 了依弋法使用該宿主來製得scFv。 並二=Γ可如同前述者般取得其基因，使其表現 =而生產。本發明中所稱「抗體」亦包含該等抗體 亦可使用業已與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合 體作抗體修錦物。本發明中所稱「抗體」亦包含該&二 欲製得此種抗體修飾物時，亦可藉對所得抗體施 加化子^飾而製得。且鱗方法業已確讀此-領域中。 如i述版產生、表現之抗體可自細胞内外、宿主分離 而純化至均質為止。本發明所用抗體之分離、純化可藉親 和層析法(Affinity chromat〇graphy)進行。於親和層析法中 使用之管柱可列舉如蛋白A管柱及蛋白G管柱等。蛋白A管 柱採用之載體可列舉如Hyper D，p〇R〇s，^沖虹〇此F F 等。此外，僅須使用一般蛋白質所用之分離、純化方法即 可’並未受到任何限制。 例如’可適當選出前述親和層析法外之其他層析法、 過遽、器、超過渡法、鹽析法、透析法等並加以組合，而分 離、純化本發明所用抗體。層析法可列舉如離子交換層析 法、疏水層析法及凝膠過濾法等。該等層析法可應用於 HPLC(High performance liquid chromatography)。此外，亦 可使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。 1351967 以前述方法獲得之抗體的濃度測定可藉吸光度測定或 ELISA等進行。即’藉測定吸光度進行時，可以PBS(_)適當 稀釋後測定280nm之吸光度，再令img/ml為1.350D而算 出。此外’以ELIS A進彳亍時’可如下述般測定之。即，將 5 以〇. 1Μ之重碳酸緩衝液（PH9.6)稀釋至1 ng/ml之山羊抗人 類IgG(TAG製）100μ1加至96井皿(Nunc)，再於4°C下培養一 夜’使抗體固態化。阻斷後，添加經適度稀釋之本發明所 用抗體或含抗體樣本或者作為標準品之人類IgG(CAPPEL 製）10μ1，於室溫下培養1小時。 10 洗淨後，加入1〇〇μ1經稀釋5000倍之鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase)標記抗人類IgG(BIOSOURE製），於室 溫下培養1小時。洗淨後，加入基質溶液培養後，使用 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad製），測定 405nm之吸光度以算出目的抗體之濃度。 15 本發明所用IL - 6變異體係具有與IL - 6受體之結合活性 且不傳達IL-6之生物活性者。意即，il-6變異體將與IL-6對 IL-6受體作競合性結合，但卻不傳達IL-6之生物活性，故可 截斷IL-6之信號傳達。 可由取代IL-6之胺基酸序列的胺基酸殘基來導入變 20 異，進而製作出IL-6變異體。並不論IL-6變異體之基礎IL-6 的來源，但若慮及抗原性等，則宜為人類IL-6。 具體言之，IL-6之胺基酸序列可使用習知之分子塑模 程式（Molecular Modeling program)如 WHATIF(Vriend et al.， J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56)來預測其二次結構，更評 29 1351967 估對被取代之胺基酸殘基的整體所造成之影響。決定適當 之取代胺基酸殘基後，再以含有編碼人類IL-6基因之鹼基 序列的載體為模板，以一般進行之PCR法使胺基酸被取代 而導入變異’進而取得編碼IL-6變異體之基因。依需要而 5 將其插入適當之表現載體，並依前述重組型抗體之表現、 產生及純化方法而製得IL-6變異體。 IL-6變異體之具體例以揭示於Brakenhoff et al·, J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93、Savino et al·，EMBO J. (1994) 13, 1357-1367、W096-18648及W096-17869。 10 本發明所用之IL-6部分胜肽或IL-6受體部分胜肽為各 自具有與IL-6受體或IL-6之結合活性且不傳達IL-6之生物 活性的物質。即，IL-6部分胜肽或IL-6受體部分胜肽將與 IL-6受體或IL-6結合，藉著捕捉該等而專一性地阻礙IL-6對 IL-6受體結合。結果，因IL_6之生物活性無法傳達而截斷 15 IL-6之信號傳達。 IL-6部分胜肽或IL-6受體部分胜肽係一種由胺基酸序 列所構成之胜肽’該等胺基酸序列係IL-6或IL-6受體之胺基 酸序列中與IL-6與IL-6受體結合相關之部份或全部區域所 構成者。此種胜肽通常由1〇~8〇(宜20~50，更宜20~40)個胺 2〇 基酸殘基構成。 IL-6部分胜肽或IL-6受體部分胜肽可如下述般製出， 即：特定出IL-6或IL-6受體之胺基酸序列中與IL-6與IL-6受 體結合相關之領域，再使其部分或全部之胺基酸序列按一 般習知方法(如基因工學手法或胜肽合成法）。 30 1351967 欲以基因工學手法製作IL-6部分胜肽或IL-6受體部分 胜肽時’可將表現出編碼所需胜肽之DNA序列插入表現載 體’並按前述重組型抗體之表現、產生及純化方法而製得。 而欲以胜肽合成法製作IL-6部分胜肽或IL-6受體部分 5 胜肽時’則可採用胜肽合成慣用之方法，如固相合成法或 液相合成法。 具體言之，可按「續醫藥品之開發第14卷胜肽之合 成，監修矢島治明，廣川書店1991年」所載方法進行。固 相合成法可使用下述者，即：使與欲合成之胜肽c端對應之 10胺基酸與不溶於有機溶劑之支持體結合，再使已藉適當保 護基保護α-胺基及側鍊官能基的胺基酸交互進行以下反 應，即，依C端至Ν端之方向順序使胺基酸一個個縮合之反 應以及使結合至樹脂上之胺基酸或胜肽之α_胺基的前述保 護基脫離之反應。固相胜肽合成法係依所用保護機之種類 而大致分為Boc法及Fmoc法。 如前述般合成出目的胜肽後，進行脫保護反應及自胜 肽鍊支持體之切斷反應。與胜肽鍊之切斷反應中，藉b〇c 法時一般可使用氟化氰或三氟甲磺酸，而藉—法時一般 而δ可使用TFA。藉Boc法時，舉例言之可於氣化氛中使前 20述保護胜肽樹脂於茵香畴在下進行處理。接著，進行保 護基脫離及自支持體切斷，再回收胜狀。將其冷殊乾燥後 製得粗製胜肽。另-方面，藉Fm〇c法時，舉例來說可於徽 中進行與前述者相同之操作，已進行脫保護反應及自胜肽 鍊支持體切斷之反應。 31 所得粗製胜狀可應用HPLC而進行分離純化。於其溶出 時，僅需使用-般用於純化蛋白質之水乙腈系溶劑並於最 適條件下進行即可。再分取相當於所得層析圖譜之峰值部 刀的分液，並將其冷康乾燥。對如前述般純化之胜肽分液 5以質譜分析儀進行分子量解析，並進行胺基酸組成分析及 胺基酸序列解析等，以藉此進行鑑定。 IL-6部分胜肽及IL-6f體部分胜肽之具體例已揭示於 曰本特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098 及美國專利公報US5210075。 10 本發明所用IL-6拮抗劑之IL-6信號傳達阻礙活性可藉 一般使用之方法加以評估。具體言之，可培養IL 6依賴性 人類骨髓瘤株(S6B45，KPMM2) '人類連内特氏τ淋巴瘤細 胞株KT3或IL-6依賴性細胞MH60.BSF2，再對其添加IL_6， 並同時使IL-6拮抗劑共存，藉此測定IL_6依賴性細胞之3h_ 15 胸腺哪咬攝入值。 此外’培養IL-6受體表現細胞之U266 ,添加125ι標記 IL-6，同時加入il-6拮抗劑，藉此測定業已與IL_6受體表現 細胞結合之1251標記IL-6。於前述分析系中，除存有山_6拮 抗劑之群組外，並置入不含IL-6拮抗劑之陰性控制群，再 2〇比較兩者所得結果’即可評估IL-6拮抗劑之il-6阻礙活性。 如後述之實施例所示般’抗IL-6受體抗體已確認其血 管炎之治療效果，因此，暗示著抗IL_6受體抗體等之IL_6 拮抗劑可有效作為血管炎之治療劑。 本發明之治療對象為哺乳動物。而治療對象之哺乳動 32 1351967 物中’以人類為宜。 本發明之血管炎之預防或治療劑可經口或非經0投 藥’也可全身或局部性投藥。舉例言之，可選擇點滴等之 靜脈注射、肌肉注射、胸腔注射、腹腔注射、皮下注射、 5肛門栓劑、灌腸、經口性腸溶劑等，並可依患者年齡及症 狀而適當選擇投藥方法。有效投藥量係一次内每lkg體重可 在0.01〜lOOmg範圍内選擇。或者可選擇每一患者uomg(更 宜2-8mg)之投藥量。 較佳投藥量及投藥方法，如於係抗IL-6受體抗體時， 10血液中存有游離抗體程度之量即為有效投藥量，而具體例 可列舉如下述般之投藥方法，即：每1KG體重1個月 週）lmg~20mg(較宜2mg~8mg)分1次至數次投藥，舉例言 之，以2次/週、1次/週、1次/2週、丨次/4週等之投藥週期進 行點滴等靜脈注射或皮下注射。亦可一面觀察病狀及血液 15檢測值之動向，將投藥週期由2次/週或1次/週逐漸延長如丄 次/2週、1次/3週、1次/4週等。 本發明之血管炎之預防或治療劑可依投藥通路而同時 含有藥學上可允許之載體及添加物。此種載體或添加物之 例可列舉如水、藥理上可容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚 20乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、 褐藻酸鈉、水溶性糊精、羧基曱基澱粉鈉、果膠、甲基纖 維素、乙基纖維素、咕嘲(xanthane)膠、阿拉伯膠、路蛋白、 明膠、洋菜、二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、 硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白（HSA)、甘露糖醇、山梨 33 但不僅限於 擔醇、乳糖及允許作為醫藥添加物之W㈣。所用六 力0物可依劑型而由前述者中適當選出或組八， + 前述者。 實施例 本發 以下，藉實施例及參考例以具體說明本發明 明並不受到其等之限制。 例1.臨床試驗 10 15 以對習知治療法具抵抗性之難治性血管炎症候群（ 節性動脈職、主動脈炎症候群)患者為對象，藉人類似 IL~6受體抗體進行治療。於大阪大學_醫院先進醫療^ 查會之許可下，對2病例患者使用係人類化抗IL 6受體抗旁 之人類化PM-i抗體(MRA)。令終端(endp〇int)為採用核^ 振攝影(MRI)及電腦斷層攝影法(CT)之影像評估改善、皮z 症狀改善、c反應性蛋白（CRP)等炎症標識之改善、q〇l(变 痛、關節痛、倦怠感）之改善。此外，進行末梢血球、一身 生化學、止血機能、IL-6、可溶性IL_6、血中人類化抗IL_ 义體抗體浪度、腫瘤壞死因子α(丁Νρα)、介白素^(几化） 及血管内皮增殖因子（VEGF)之評估。

20 結果： 病例1.

19歲女性。於1996年被診斷為主動脈炎症候群。合併 有潰瘍性大腸炎。一開始投予副腎皮質激素(prednis〇1〇ne， PSL)60mg/曰。即使併用環孢靈（cycl〇sp〇dne)亦無法使pSL 34 1351967 減量至20mg/日以下。1998年，針對病情惡化，除另增醣皮 質固醇(methylprednisolone，mPLS)脈衝療法外，亦併用環孢 靈150mg/曰’如此亦無法使psL減量至30mg/曰以下。即使 追加倍他米松（Betamethasone)lmg/日，以後經7次再進行白 5血球除去療法亦無效。2000年以後，除間歇性使用11^1^脈 衝療法外，併用硫唑嘌呤(Azathioprine)lOOmg/日、霉酚酸 酯（Mycophenolate Mofetil)2g/ 日及胺甲基葉酸 (Methotrexate)17.5mg/週亦無成效。 如第1~6圖所示’於CT上可見升主動脈、主動脈弓三 10 分支及降主動脈均可見顯著之血管壁肥厚。確認左鎖骨下 動脈（It. SCA)狹窄。CRP12.6mg/dl而認定為強烈發炎，且 因發生強烈之持續性胸痛、於1個月内體重減少5公斤以及 意識消失發作，而使用MRA200mg/週(採點滴靜脈注射）。 約2週後CRP陰性化。1個月後除胸痛改善外，並如第圖 15所示’於CT上可見升主動脈、主動脈弓三分支及降主動脈 之血管壁肥厚改善以及血管内腔擴大，且更確認頸動脈之 企流改善。此外，便中血紅素亦陰性化，潰瘍性大腸炎之 症狀亦消失。於MRA治療期間，雖血液中TNFa增加，但未 見症狀惡化。即使於MRA治療後滿2年之時間點，亦維持大 20 動脈壁肥厚之改善及血管内腔擴大。高安動脈炎另稱無脈 病，該患者當初亦無法於橈動脈(Radial artery)及尺動脈 (Ulnar artery)取得脈動，但透過治療，已可於手腕上觸及橈 動脈及尺動脈之脈搏。此外，因長期使用MRA，血中IL-6 由 l720pg/ml降至 l〇〇pg/ml。 35 1351967 病例2. 42歲男性。於1986年結節性動脈炎（皮膚型）發病，即使 以PSL、硫唾嘌呤、秋水仙素（c〇lchidne)及抗凝固劑進行治 療亦僅反覆發生緩解與惡化。於1997年以後，即便以mPLS 5脈衝療法且併用環磷醯胺(Cyclophosphamide)亦無效果。自 1999年後進行疏唾嗓吟、環鱗酿胺及丙種球蛋白（Garnina Globulin)大量療法無效，而自2〇〇2年起進行環磷醯胺脈衝 療法及白血球除去療法亦無效。對因血管炎引起之皮膚潰 瘍進行植皮亦無效果，因惡化而切除右腓骨，更施行膝下 10切除。之後壞死性血管炎惡化，下肢潰瘍亦有擴大傾向。 以人類化抗IL-6受體抗體2〇〇mg/週開始進行治療後，在此 之前所固有的發熱及皮膚紅斑、肌肉痛等現象改善。雖無 法避免進行右大腿部之截斷，但伴隨血中IL_6降低，白血 球數量趨於正常，之後亦未有皮膚潰瘍之惡化。 15 考察： 因MRA對以習知治療方法不可能控制之難治性血管炎 患者有效’而顯示出IL-6拮抗治療可能成為血管炎之新治 療法。其表示IL-6對血管炎之病態形成係不可或缺者。此 外’因任一病例於治療過程中均可見扎_6降低，而明確地 20得知1L-6拮抗治療並不僅只有抗發炎作用，而係對血管炎 之根源作用。 參考例1.人類可溶性IL-6受體之镅 使用按 Yamasaki 氏等的方法（Yamasaki, K. et al·, Science (1988) 241，825-828)而製得之含有編碼IL-6受體之 36 1351967

cDNA的質體pBSF2R.236，而以PCR法製作可溶性IL-6受 體。以限制酶SphI消化質體pBSF2R.236，而獲得IL-6受體 cDNA ’再將其插入mpl8(Amersham製）。使用係設計成將 終止密碼子（Stop Codon)導入IL-6受體cDNA之合成寡引 5 子’而藉體外突變形成系統（in-vitro mutagenesis system)(Amersham製）並以PCR法將變異導入IL-6受體 cDNA。可藉此操作而使終止密碼子導入胺基酸345之位 置，進而製得編碼可溶性IL-6受體之cDNA。 為使可溶性IL-6受體cDNA於CHO細胞内表現，使其與 10 質體Psv(Pharmacia製）連結，而製得質體pSVL344。將業已 藉Hind Ill-Sal I切斷之可溶性IL-6受體cDNA插入含dhfr之 cDNA的質體pECEdhfr中，而製得CHO細胞表現質體 pECEdhfr344。

使l〇pg之質體pECEdhfr344對dhfr-CHO細胞株 15 DXB-ll(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)藉磷酸鈣沉降法(Chen, C. et al.，Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751)而轉染。將轉染之CHO細胞置於 含ImM麩胺酸(Glutamine)、10%透析FCS ' 100U/ml盤尼西 林及lOOpg/ml鏈黴素且不含核苷酸的αΜΕΝ選擇培養液中 20 培養3週。 以臨界稀釋法篩選被擇出之CHO細胞而獲得單一CHO 細胞選殖株。再以20ηΜ〜200ηΜ濃度之胺甲基葉酸 (Methotrexate)擴增，而製得產生人類可溶性il-6受體之 CHO細胞株5E27。以含之伊思考普氏改變杜爾貝科 37 1351967 培養液(IMDM ’ Gibco製）培養CH〇細胞株5E27。回收培養 上清液，並以ELISA測定抗體上清液中之可溶性IL_6受體濃 度。結果’確認培養上清液中存有可溶性IL-6受體。 春者例2.抗人類IL-6抗體之調贺 5 將 1〇吨重組型 IL-6(Hirano, T. et al.，Immunol. Lett.

(1988) 17, 41)與佛氏完全佐劑一起使BAlb/c小鼠免疫，每 週持續至血清中可檢測出抗IL-6抗體為止。自局部淋巴結 摘出免疫細胞’並使用聚乙二醇1500與骨髓瘤細胞株P3U1 融合’並依使用HAT培養液之〇i氏方法（Selective Methods 10 in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)選擇融合瘤，而建立用以產生抗人類 IL-6抗體之融合瘤。

產生抗人類IL-6抗體之融合瘤自如下述般進行IL-6結 合分析法。即，於柔軟之聚乙烯製96井微滴定盤(Dynatech 15 Laboratories, Inc.製，Alexandria, Va)置於 0.1M 之 carbonate-hydrogen carbonate緩衝液（ρΗ9·6)中藉 1〇〇μ1 之山 羊抗小鼠Ιβ(10μ1/πι1, Cooper Biomedical, Inc製Malvern, PA) 於4°C下覆蓋(coat)—晚。接著，以ΙΟΟμΙ之含1%牛血清白蛋 白（BSΑ)的PBS而於室溫下處理微滴定盤2小時。 20 將其以PBS洗淨後，將ΙΟΟμΙ之融合瘤培養上清液加入 各井中，並以4°C培養一晚。洗淨微滴定盤後，將1251標記 重組型IL-6添加至各井，成為2000cpm/0.5ng/well，再以γ 計數器（Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)測定洗淨後之各井放射活性。於216個融合瘤 38 1351967 選殖株中，32個融合瘤選殖株因IL-6結合分析法而呈陽 性。於該等選殖株中，獲得最終呈安定之MH166.BSF2。該 融合瘤產生之抗IL-6抗體MH166具有IgGlK5之亞型。

接著，使用IL-6依賴性小鼠融合瘤選殖株 5 MH60.BSF2，調查與MH166抗體引起之融合瘤增殖相關的 中和活性。將MH60.BSF2細胞進行分注而成為1χ104/200μ1/ 井，於其中加入含ΜΗ166之樣本，培養48小時加入0.5pCi/ 井之3H胸腺嘧啶後，更持續培養6小時。將細胞置於玻璃過 漉紙上，再以自動收成機（Labo Mash Science Co.，Tokyo, 10 Japan)處理。對照組則使用兔抗IL-6抗體。 結果，MH166抗體係隨容量而阻礙被IL-6誘導之 MH60.BSF2細胞的3H胸腺°密。定攝入。而此可知，MH-166 抗體可中和IL-6之活性。 參考例3.抗人類IL-6受體抗體之調製 15 使以 Hirata 氏之方法（Hirata, Y. et al.，J. Immounol. (1989) 143, 2900-2906)製出之抗IL-6受體抗體MT18與藉 CNBr而活性化之璦脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals製， Piscataway, NJ)依其所附說明結合，而純化出IL-6受體 (Yamasaki, K· et al.，Science (1988) 241，825-828)。再以含 20 有 1% Digitonine (Wako Chemicals 製）、10mM 三乙醇胺 (pH7.8)及0.15M NaCl之ImM p-對胺基苯基甲磺醯基氟化 氫氣化物(Wako Chemicals製）(Digitonine緩衝液)使其可溶 化，再與業已與瓊脂糖4B小珠結合的MT18抗體混合。之 後，將小珠以Digitonine緩衝液洗淨6次，令其為用以免疫 39 1351967 之部分純化IL-6受體。 以從3x 109個U266細胞獲得之前述部分純化IL-6受 體’使BALB/c小鼠每隔10日免疫4次，之後依定法作成融 合瘤。以下述方法調查取自成長陽性井之融合瘤培養上清 5 液對IL-6受體之結合活性。以35S-甲硫胺酸(2.5mCi)標記5x

107個U266細胞，再以前述Digitonine緩衝液使其可溶化。 將業經可溶化之U266細胞與業已與瓊脂糖4B小珠結合的 MT18抗體混合後，以Digitonine緩衝液洗淨6次，再以0.25ml 之Digitonine緩衝液（pH3.4)使35S-甲硫胺酸（2.5mCi)標記 10 IL-6受體流出，並以0.025ml之1M Tris (ρΗ7·4)使其中和。

將0.05ml之融合瘤培養上清液與0.01ml之Protein G填 脂糖(Phramacia製）混合。洗淨後，使瓊脂糖與前述調製出 之0.05ml的35S標記IL-6受體溶液一起培養。以SDS-PAGE分 析免疫沉降物質，並調查與IL-6受體反應之融合瘤培養上 15 清液。結果，建立了陽性反應融合瘤選殖株PM-1(FERM BP-2998)。自融合瘤PM-1產生之抗體係具有IgGlK之亞型。 使用人類骨髓瘤細胞株U266調查融合瘤PM-1所產生 之抗體對人類IL-6受體之IL-6結合阻礙活性。以大腸菌調製 出人類重組型 IL-6(Hirano，T. et al·，Immunol. Lett. (1988) 20 17，41-45)，並以波爾頓亨特試劑（New England Nuclear，

Boston, MA)進行丨25I標記（Taga, T. et al·，J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981)。 使4x 1 〇5個U266細胞與70%(v/v)之融合瘤PM-1培養上 清液以及14000cpm之125I標記IL-6 —起培養1小時。使70μ1 40 1351967 之樣本於400μ1之微量離心聚乙稀管（micr〇fUge polyethylene tube)中疊層在300μ1的pcs上，並於離心後測定 細胞上的放射活性。 結果’可明顯看出融合瘤ΡΜ-1產生之抗體係阻礙IL-6 5 對IL-6受體之結合。 參考例4 ·__抗小鼠IL-6夸體抗體之調贺 藉 s己載於 Saito，T. et al·，J. Immunol. (1991) 147, 168-173之方法’調製出對抗小鼠IL_6受體之單株抗體。 將產生小鼠可溶性IL-6受體之CHO細胞置於含 10 l〇%FCS之IMDM培養液中培養，再使用業將抗小鼠IL_6受 體抗體RS12(參照前述Saito，T. et al)固定於Affigel 10gel(B iorad製）之親和層析管柱，而由前述培養上清液純化 出小鼠可溶性IL-6受體。 使所得小鼠可溶性IL-6受體5(^g與佛氏完全佐劑混合 15 後’注射到大白鼠(Wistar rat)腹部。於2週後開始以佛氏不 完全佐劑進行追加免疫◊於第45日採取大鼠脾臟細胞，並 使用2xl08個大鼠脾臟細胞與ΐχΐ〇7個小鼠骨髓瘤細胞ρ3υι 及 50% PEG1500(Boehringer Mannheim製）依定法進行細胞 融合後，於HAT培養基中篩選融合瘤。 2〇 於覆有兔抗大鼠IgG抗體(Cappel製）之孤中加入融合瘤 培養上清液後，使小鼠可溶性IL-6受體反應。接著，以係 採用兔抗小鼠IL-6受體抗體及鹼性磷酸酶標記雉雞抗兔 IgG之ELISA法’而篩選出一用以產生對抗小鼠可溶性ι[_6 夂體之抗體的融合瘤。已確認有抗體產生之融合瘤選殖株 41 1351967 則進行2次的次篩選(subscreening)，而取得單一的融合瘤選 . 殖株。將該選殖株命名為MR16-1。 使用 MH60.BSF2細胞（Matsuda，T· et al., J. Immunol. (1998) 18, 951-956)之3H-胸腺嘧啶攝入值，藉以調查該融合 5 瘤所產生抗體於小鼠IL-6資訊傳達中之中和活性。使 MH60.BSF2細胞於96井皿中製為1χ1〇4個/2〇〇μ1/井。再於該 皿中加入10pg/ml的小鼠IL-6與12.3〜1000ng/ml的MR16-1抗 體或RS12抗體，並以37°C、5%C02培養44小時後，加入 WCi/well的3H-胸腺嘧啶。於4小時後測定3H-胸腺嘧啶之攝 鲁 10 入值。結果，MR16-1抗體抑制了 MH60.BSF2細胞的3H-胸 腺嘧。定攝入。 因此，可明顯看出融合瘤MR16-1(FERM BP-5875)所產 生之抗體將阻礙IL-6對IL-6受體之結合。 t圖式簡單說明3 5 第1圖係一照片，顯示血管炎症候群採人類化儿-611抗 體療法之CT結果’上方箭號表示升主動脈，下方箭號表示 降主動脈。 弟2圖係一照片，顯示血管炎症候群採人類化IL-6R抗 體之CT結果，箭號表示主動脈弓。 2〇 第3圖係一照片，顯示顯示血管炎症候群採人類化 I乙6R_^體療法之CT結果，上方箭號表示升主動脈，下方箭 號表示降主動脈。 第4圖係一照片，顯示顯示血管炎症候群採人類化 IL-6R抗體療法之CT結果，上方箭號表示升主動脈，下方箭 42 1351967 號表示降主動脈。 第5圖係一照片，顯示血管炎症候群採人類化IL-6R抗 體之CT結果，箭號表示主動脈弓。 第6圖係一照片，顯示血管炎症候群採人類化IL-6R抗 5 體療法之CT結果，上方箭號表示升主動脈，下方箭號表示 降主動脈。 【主要元件符號說明】

(無）

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Claims (1)

1351967 第93139137號專利申請案申請專利範圍修正本 十、申請專利範圍： 1. 一種血管炎之預防或治療劑，係含有對抗介白素-6(IL-6) 受體之抗體以作為有效成分者。 2. —種對類固醇劑及/或免疫抑制劑具抵抗性之血管炎的 預防或治療劑，係含有對抗介白素-6(IL-6)受體之抗體 以作為有效成分者。 3. 如申請專利範圍第1項之預防或治療劑，其中該血管炎 為結節性動脈週炎(per/arien·沿woi/osiz)。 10 4. 如申請專利範圍第2項之預防或治療劑，其中該血管炎 為結節性動脈週炎。 5. 如申請專利範圍第1項之預防或治療劑，其中該血管炎 為主動脈炎症候群（β〇γ份以。 6. 如申請專利範圍第2項之預防或治療劑，其中該血管炎 為主動脈炎症候群。 15 7. 如申請專利範圍第1項之預防或治療劑，其中該血管炎 係伴隨免疫異常之血管炎。 8. 如申請專利範圍第2項之預防或治療劑，其中該血管炎 係伴隨免疫異常之血管炎。 20 降印(更)正. 9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之預防或治療劑，其 中對抗該IL-6受體之抗體係對抗IL-6受體之單株抗體。 10. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之預防或治療劑，其 中對抗該IL-6受體之抗體係對抗人類IL-6受體之單株抗 體。 11. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之預防或治療劑，其 44 1351967 第93139137號專利申請案申請專利範圍修正本修正日期：100.3.15 中對抗該IL-6受體之抗體係對抗小鼠IL-6受體之單株抗 體。 12.如申請專利範圍第1至8項中任一項之預防或治療劑，其 中對抗該IL-6受體之抗體係重組型抗體。 5 13.如申請專利範圍第9項之預防或治療劑，其中對抗該 IL-6受體之抗體係重組型抗體。 14. 如申請專利範圍第10項之預防或治療劑，其中對抗該 IL-6受體之抗體係重組型抗體。 15. 如申請專利範圍第11項之預防或治療劑，其中對抗該 10 IL-6受體之抗體係重組型抗體。 16. 如申請專利範圍第10項之預防或治療劑，其中對抗該人 類IL-6受體之單株抗體係PM-1抗體。 17. 如申請專利範圍第11項之預防或治療劑，其中對抗該小 鼠IL-6受體之單株抗體係MR16-1抗體。 15 18.如申請專利範圍第1或2項之預防或治療劑，其中對抗該 IL-6受體之抗體係對抗IL-6受體之嵌合抗體、人類化抗 體或人類抗體。 19.如申請專利範圍第18項之預防或治療劑，其中對抗該 IL-6受體之人類化抗體係人類化PM-1抗體。 20 20. —種對抗介白素-6(IL-6)受體之抗體之用途，係用以製 造血管炎之預防或治療劑者。 21· —種對抗介白素-6(IL-6)受體之抗體之用途，係用以製 造對類固醇劑及/或免疫抑制劑具抵抗性之血管炎的預 防或治療劑者。 45 1351967 第93139137號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100.3.15 22. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該血管炎為結節性 動脈週炎。 23. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該血管炎為結節性 動脈週炎。 5 24.如申請專利範圍第20項之用途，其中該血管炎為主動脈 炎症候群。 25. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該血管炎為主動脈 炎症候群。 26. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該血管炎為伴隨免 10 疫異常之血管炎。 27. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該血管炎為伴隨免 疫異常之血管炎。 28. 如申請專利範圍第20至27項中任一項之用途，其中對抗 該IL-6受體之抗體係對抗IL-6受體之單株抗體。 15 29.如申請專利範圍第20至27項中任一項之用途，其中對抗 該IL-6受體之抗體係對抗人類IL-6受體之單株抗體。 30. 如申請專利範圍第20至27項中任一項之用途，其中對抗 該IL-6受體之抗體係對抗小鼠IL-6受體之單株抗體。 31. 如申請專利範圍第20至27項中任一項之用途，其中對抗 20 該IL-6受體之抗體係重組型抗體。 32. 如申請專利範圍第28項之用途，其中對抗該IL-6受體之 抗體係重組型抗體。 33. 如申請專利範圍第29項之用途，其中對抗該IL-6受體之 抗體係重組型抗體》 46 1351967 第93139137號專利申請案申請專利範圍修正本修正曰期·· 100.3.15 34. 如申請專利範圍第30項之用途，其中對抗該IL-6受體之 抗體係重組型抗體。 35. 如申請專利範圍第29項之用途，其中對抗該人類IL-6 受體之單株抗體係PM-1抗體。 5 36.如申請專利範圍第30項之用途，其中對抗該小鼠IL-6受 體之單株抗體係MR16-1抗體。 37.如申請專利範圍第20或21項中任一項之用途，其中對抗 該IL-6受體之抗體係對抗IL-6受體之嵌合抗體、人類化 抗體或人類抗體。 10 38.如申請專利範圍第37項之用途，其中對抗該IL-6受體之 人類化抗體係人類化PM-1抗體。 47