CN1893979B - 血管炎治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了血管炎，例如结节性多发性动脉炎、主动脉炎综合征和伴随免疫异常的血管炎的预防和/或治疗剂，其含有白介素-6(IL-6)拮抗剂，例如针对IL-6受体(IL-6R)的抗体。

Description

血管炎治疗剂
技术领域
本发明涉及血管炎的新型预防和/或治疗剂。
背景技术
血管炎是自体免疫疾病中公认的难治性疾病中的一种，在用自过去以来一直使用的类固醇或免疫抑制剂的治疗中显示出抗性的例子很多，因此一直希望建立新的治疗方法。血管炎综合征在各种大小的动脉中产生炎症，产生发热和肌肉/关节的疼痛、血管闭塞和皮肤溃疡、多发性单神经炎。血管炎中包括结节性多发性动脉炎和主动脉炎综合征等难治性血管炎综合征。结节性多发性动脉炎的病变是由中膜和外膜的部分坏死性炎症所给予的特征，主动脉炎通常是主动脉的三层也就是内膜、中膜和外膜都呈现炎症。
主动脉炎，也称为高安动脉炎(Takayasu′s arteritis)。血管炎的病情中提示有IL-6的参与。例如，由Noris等人报道了，在病情处于活性期的高安动脉炎的患者中，血清中的IL-6浓度与正常人相比提高了(Circulation.1999Jul 6；100(1)：55-60)。然而，在同一文献中，报道了在处于同时期的患者中作为趋化因子的RANTES在血清中的浓度也升高了。此外，Noris等人还提示这些细胞因子在高安动脉炎的患者中有可能引起血管损伤(vasculitic lesion)。
发明内容
但是，文献中完全没有公开通过抑制IL-6有可能治疗高安动脉炎。因此，本发明提供了以IL-6的拮抗剂作为有效成分的动脉炎的预防和/或治疗剂。
本发明人进行了积极的研究，结果发现IL-6是血管炎的病理形成所不可缺少的，清楚了IL-6的拮抗剂具有血管炎治疗效果。更令人惊讶的是，通过本发明人的积极研究，发现在血管炎中通过IL-6受体抗体抑制IL-6与受体结合时，血中的IL-6本身减少。也就是，不仅清楚了IL-6抑制治疗对血管炎有抗炎症作用，而且清楚了其作用于血管炎的根本，治疗血管炎本身。
因此，本发明提供了由含有白介素-6(IL-6)的拮抗剂作为有效成分而构成的血管炎的预防和/或治疗剂。
本发明另外提供了对类固醇和/或免疫抑制剂耐药的血管炎的预防和/或治疗剂，由含有白介素-6(IL-6)的拮抗剂作为有效成分而构成。
上述血管炎是例如结节性多发性动脉炎、主动脉炎综合征和伴随免疫异常的血管炎。主动脉炎综合征也称为高安动脉炎。作为伴随免疫异常的血管炎，可以列举有，例如伴随风湿病的血管炎或伴随全身性红斑狼疮(SLE)的血管炎。
上述IL-6拮抗剂是例如针对IL-6的抗体或针对IL-6受体的抗体，优选是针对IL-6受体的单克隆抗体。上述针对IL-6受体的抗体，特别优选的是针对人IL-6受体的单克隆抗体，例如PM-1抗体，或者针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体，例如MR16-1抗体。上述针对IL-6受体的抗体，优选是重组抗体。
上述针对IL-6受体的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在本发明中，特别优选的抗体是人源化PM-1抗体。
此外，本发明还可以采取以下形态。
(1)白介素-6(IL-6)拮抗剂用于制备血管炎的预防和/或治疗剂的用途。
(2)白介素-6(IL-6)拮抗剂的用途，其用于制备对类固醇和/或免疫抑制剂耐药的血管炎的预防和/或治疗剂。
(3)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是结节性多发性动脉炎。
(4)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是主动脉炎综合征。
(5)上述(1)或(2)的用途，其中上述血管炎是伴随免疫异常的血管炎。
(6)上述(1)-(5)中任一项记载的用途，其中上述IL-6拮抗剂是针对IL-6受体的抗体。
(7)上述(6)的用途，其中上述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的单克隆抗体。
(8)上述(6)的用途，其中上述针对IL-6受体的抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
(9)上述(6)的用途，其中上述针对IL-6受体的抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
(10)上述(6)-(9)任一项的用途，其中上述针对IL-6受体的抗体是重组抗体。
(11)上述(8)的用途，其中上述针对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
(12)上述(9)的用途，其中上述针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
(13)上述(6)-(12)任一项的用途，其中上述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(14)上述(13)的用途，其中上述针对IL-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。
(15)血管炎的预防和/或治疗方法，其包括以白介素-6(IL-6)拮抗剂给药。
(16)对类固醇和/或免疫抑制剂耐药的血管炎的预防和/或治疗方法，其包括以白介素-6(IL-6)拮抗剂给药。
(17)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是结节性多发性动脉炎。
(18)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是主动脉炎综合征。
(19)上述(15)或(16)的方法，上述血管炎是伴随免疫异常的血管炎。
(20)上述15-19中任一项记载的方法，上述IL-6拮抗剂是针对IL-6受体的抗体。
(21)上述(20)的方法，上述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的单克隆抗体。
(22)上述(20)的方法，上述针对IL-6受体的抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
(23)上述(20)的方法，上述针对IL-6受体的抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
(24)上述(20)-(23)任一项的方法，上述针对IL-6受体的抗体是重组抗体。
(25)上述(22)的方法，上述针对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
(26)上述(23)的方法，上述针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
(27)上述(20)-(26)任一项的方法，上述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(28)上述(27)的方法，上述针对IL-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。
附图说明
图1是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。上部的箭头表示升主动脉，下部箭头表示降主动脉。
图2是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。箭头表示主动脉弓。
图3是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。上部的箭头表示升主动脉，下部箭头表示降主动脉。
图4是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。上部的箭头表示升主动脉，下部箭头表示降主动脉。
图5是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。箭头表示主动脉弓。
图6是表示在血管炎综合征的人源化IL-6R抗体疗法中，CT结果的图。上部的箭头表示升主动脉，下部箭头表示降主动脉。
具体实施方式
IL-6是被称为B细胞刺激因子2(BSF2)或者干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与B淋巴细胞系细胞的活化相关的分化因子而被发现(Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76)，此后，清楚了其是对各种细胞的功能产生影响的多功能细胞因子(Akira，S.等人，Adv.inImmunology(1993)54，1-78)。据报道，IL-6诱导T淋巴细胞系细胞的成熟(Lotz，M.等人，J.Exp.med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在细胞上由两种蛋白质介导，传达它的生物学活性。一个是结合IL-6的分子量约为80kD的配体结合性蛋白-质IL-6受体(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828)。IL-6受体以通过贯通细胞膜在细胞膜上表达的膜结合型存在，除此之外还以主要由细胞外区域构成的可溶性IL-6受体型存在。
另一个是非配体结合性的信号转导中涉及的分子量约为130kD的膜蛋白质gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合物，接着通过与gp130结合，向细胞内传递IL-6的生物学活性(Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗剂是抑制IL-6生物学活性传递的物质。迄今为止，已知有针对IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、针对IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、针对gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。
有几个与抗IL-6受体抗体相关的报道(Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146，Huang，Y.W.等人，Hybridoma(1993)12，621～630，国际专利申请公开号WO 95-09873，法国专利申请公开号FR 2694767，美国专利号US 521628)。通过将其中之一的小鼠抗体PM-1抗体(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互补决定区域(CDR；complementarity determining region)移植到人抗体中获得的人源化PM-1抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)。
上述IL-6拮抗剂优选是针对IL-6受体的抗体，优选是针对人IL-6受体的单克隆抗体或针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。作为上述针对人IL-6受体的单克隆抗体可例示有PM-1抗体，或者作为针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体可举例有MR16-1抗体。上述抗体优选是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，例如人源化PM-1抗体。
本发明中使用的IL-6拮抗剂只要是可用作血管炎的预防或治疗剂的活性成分的成分即可，不追究其来源、种类和形状。
IL-6拮抗剂是阻断依赖于IL-6的信号转导，抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6拮抗剂优选是对IL-6、IL-6受体和gp130任一项的结合具有抑制作用的物质。作为IL-6拮抗剂，可以举例有例如抗IL-6受体抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6变异体、IL-6或IL-6受体的部分肽，以及与这些物质显示出相同活性的低分子物质。
本发明中使用的抗IL-6抗体，可以是使用公知的方法获得的多克隆抗体或单克隆抗体。作为本发明中使用的抗IL-6抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤所产生的单克隆抗体，以及通过基因工程方法以含有抗体基因的表达载体转化宿主产生的抗体。这种抗体通过与IL-6结合，抑制IL-6与IL-6受体的结合，从而阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
作为这种抗体，可以列举有MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)和SK2抗体(Sato，K.等人，第21届日本免疫学会总会，学术记录(1991)21，166)等。
基本上使用公知技术，按以下方式制备产生抗IL-6抗体的杂交瘤。即，使用IL-6作为致敏抗原，按照常规的免疫方法进行免疫，通过常规的细胞融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过用常规的筛选法筛选单克隆抗体产生细胞来进行制备。
具体地说，制备抗IL-6抗体时也可以按以下方式进行。例如，为获得抗体而用作致敏抗原的人IL-6可以通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550，J.Immunol.(1988)140，1534-1541，或Agr.Boil.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列获得。
在公知的表达载体中插入IL-6的基因序列，使之转化适当的宿主细胞后，从该宿主细胞中或从培养上清中用公知的方法纯化目的IL-6蛋白质，可以使用这种纯化的IL-6蛋白质作为致敏抗原。此外，也可以使用IL-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体，可以是使用公知的方法获得的多克隆抗体或单克隆抗体。作为本发明中使用的抗IL-6受体抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤所产生的单克隆抗体，以及通过基因工程方法以含有抗体基因的表达载体转化宿主产生的抗体。这种抗体通过与IL-6受体结合，抑制IL-6向IL-6受体的结合，从而阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
作为这种抗体，可以列举：MR16-1抗体(tamura，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中，作为特别优选的抗体可以列举PM-1抗体。
并且，产生PM-1抗体的杂交瘤细胞株，作为PM-1，根据布达佩斯条约，于1989年7月12日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，保藏号FERM BP-2998。此外，产生MR16-1抗体的杂交瘤细胞株，作为大鼠-小鼠杂交瘤MR16-1，根据布达佩斯条约，于1997年3月13日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，保藏号FERM BP-5875。
产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤，可以基本上使用公知技术，按以下方式制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原，按照常规的免疫方法进行免疫，通过常规的细胞融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过用常规的筛选法筛选单克隆抗体产生细胞来进行制备。
具体地说，制备抗IL-6受体抗体也可以按以下方式进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的人IL-6受体可以通过使用欧洲专利申请公开号EP 325474中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列获得，作为获得抗体的致敏抗原使用的小鼠IL-6受体可以通过使用日本特许出愿公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列获得。
IL-6受体蛋白质有在细胞膜上表达的和从细胞膜脱离的(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人，J.Biochem(1990)108，673-676)这两种类型。可溶性IL-6受体抗体是由与细胞膜结合的IL-6受体的实质性细胞外区域构成的，在缺少跨细胞膜区域或跨细胞膜区域和细胞内区域这一点上，与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白质，只要可作为制备本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原使用，可以使用任何IL-6受体。
在公知的表达载体系统中插入IL-6受体的基因序列，使之转化适当的宿主细胞后，从该宿主细胞中或从培养上清中用公知的方法纯化目的IL-6受体蛋白质，可以使用这种纯化的IL-6受体蛋白质作为致敏抗原。此外，也可以使用IL-6受体蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原。
含有带有编码人IL-6受体的cDNA的质粒pIBIBSF2R的大肠杆菌(E.coli)，作为HB101-pIBIBSF2R，根据布达佩斯条约，于1989年1月9日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，保藏号FERM BP-2232。
本发明中使用的抗gp130抗体可以是使用公知的方法获得的多克隆抗体或单克隆抗体。作为本发明中使用的抗gp130抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤所产生的单克隆抗体，以及通过基因工程方法以含有抗体基因的表达载体转化宿主产生的抗体。这种抗体通过与gp130结合，抑制IL-6/IL-6受体复合物与gp130的结合，从而阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
作为这种抗体，可以列举有AM64抗体(特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US 5571513)、B-S12抗体和B-P8抗体(特开平8-291199)等。
产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤，可以基本上使用公知技术，按以下方式制备。即，使用gp130作为致敏抗原，按照常规的免疫方法以其免疫，通过常规的细胞融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过用常规的筛选法筛选单克隆抗体产生细胞来进行制备。
具体地说，可以按以下方式制备单克隆抗体。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的gp130可以通过使用欧洲专利申请公开号EP411946中公开的gp130基因/氨基酸序列获得。
在公知的表达载体中插入gp130的基因序列，使之转化适当的宿主细胞后，从该宿主细胞中或从培养上清中用公知的方法纯化目的gp130蛋白质，可以使用这种纯化的gp130受体蛋白质作为致敏抗原。此外，也可以使用表达gp130的细胞或gp130蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原。
作为经致敏抗原免疫的哺乳动物，没有特别的限定，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性进行选择，一般而言使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
以致敏抗原免疫动物时，按照公知的方法进行。例如，作为一般的方法，通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原来进行。具体地说，用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等适量稀释致敏抗原，根据需要将悬浮液与常规的佐剂例如弗氏完全佐剂适量混合，乳化后，优选以每4～21天对哺乳动物给药数次。此外，致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
按这种方式免疫，在确认出血清中期望的抗体水平上升后，从哺乳动物中取出免疫细胞，以用于细胞融合。作为用于细胞融合的优选的免疫细胞，可以列举有特别是脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的其它的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，可以适当使用已经公知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人，J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.，Eur.J.Immnol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.等人，J.Immnol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可以基本按照公知的方法进行，例如Milstein等人的方法(Kohler.G and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等。
更为具体的是，上述细胞融合，可以在例如存在细胞融合促进剂的常规的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而也可以根据需要，为了提高融合效率而添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，优选例如免疫细胞是骨髓瘤细胞的1～10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如上述骨髓瘤细胞株的增殖中最适的RPMI1640培养液、MEM培养液，此外还有可在这种细胞培养中使用的常规的培养液，进而还可以与胎牛血清(FCS)等血清添加液并用。
进行细胞融合时，可通过在上述培养液中充分混合所定量的上述免疫细胞与骨髓瘤细胞，通常以30～60％(w/v)的浓度添加预先加热到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，通过混合，以形成目的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐次添加适当的培养液，通过反复离心除去上清的操作可以除去对杂交瘤生长不利的细胞融合剂等。
通过在常规的选择培养基例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养来选择出该杂交瘤。连续进行足够时间的在该HAT培养液中的培养以使作为目的的杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)死亡，通常连续培养数日～数周。接着，实施常规的极限稀释法，筛选和克隆产生目的抗体的杂交瘤。
此外，对人以外的动物免疫抗原获得上述杂交瘤之外，在体外以期望的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏人淋巴细胞，使致敏的B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，也可以获得与期望的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的期望的人抗体(参照特公平1-59878)。进而，对携带有人抗体基因文库的转基因动物给予抗原或抗原表达细胞，按照上述方法也可以获得期望的抗原(参见国际专利申请公开号WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中传代培养，此外还可以在液氮中长期保存。
为了从该杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用按照常规方法培养该杂交瘤来获得其培养上清的方法，或者将杂交瘤给予到与其相适应的哺乳动物中使杂交瘤增殖，获得其腹水的方法等方法。前一种方法适于获得高纯度的抗体，另一方面，后一种方法适于抗体的大量生产。
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备可以通过特开平3-139293中公开的方法进行。可以向BALB/c小鼠的腹腔内注入产生PM-1抗体的杂交瘤，所述杂交瘤根据布达佩斯条约，于1989年7月12日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，保藏号为FERM BP-2998，以此获得腹水，从腹水中纯化出PM-1抗体的方法，或者在适当的培养基例如含有10％胎牛血清，5％BM-Condimed H1(Boehr inger Mannheim制造)的RPMI1640培养基，杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制造)等中培养该杂交瘤，从其培养上清中纯化PM-1抗体的方法。
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤中克隆抗体基因，重组到适当的载体中，将其导入到宿主中，用基因重组技术产生的重组抗体(例如：参见Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom BYMACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体地说，从产生目的抗体的细胞例如杂交瘤中分离编码抗体可变(V)区域的mRNA。对于mRNA的分离，可通过公知的方法例如胍超速离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P，et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)制备mRNA。此外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)可以直接制备mRNA。
用逆转录酶从获得的mRNA中合成抗体V区域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶First-Strand cDNA合成试剂盒等进行。此外，进行cDNA的合成和扩增时可以使用采用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制造)和使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。从获得的PCR产物中纯化出目的DNA片段，与载体DNA连接。进而，由其制备出重组载体，导入到大肠杆菌等中，选择出克隆，制备期望的重组载体。通过公知的方法例如脱氧法确认目的DNA的碱基序列。
如果获得了编码目的抗体的V区域的DNA，将其与编码期望的抗体的恒定区域(C区域)的DNA连接，将其重组到表达载体中。或者，也可以在含有抗体C区域的DNA的表达载体中重组编码抗体V区域的DNA。
在制备本发明中使用的抗体时，可以向基于表达控制区域例如增强子、启动子的控制下可表达的表达载体中重组入下述抗体基因。接着，通过以该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
在本发明中，可以使用以降低对人的异种抗原性为目的的人为改良的基因重组抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人(human)抗体。可以使用已知的方法制备这些改良抗体。
嵌合抗体可以通过以下方法获得：将上述获得的编码抗体V区域的DNA与编码人抗体C区域的DNA连接，将其整合到表达载体中导入到宿主中使之产生(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 92-19759)。使用这种已知的方法，可以获得用于本发明中的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合PM-1抗体的L链和H链的V区域的DNA的质粒分别命名为pPM-k3和pPM-h1，带有这种质粒的大肠杆菌根据布达佩斯条约，于1991年2月12日国际保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(National Collections of Industrial and MarineBacteria Limited)(大不列颠及北爱尔兰联合王国，苏格兰，阿伯丁，AB2，1RY 23st.Machar Drive)中，保藏号分别为NCIMB40366和NCIMB40362。
人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区域(CDR)移植到人抗体的互补性决定区域而构成的抗体，其常规基因重组方法是已知的(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 92-19759)。
具体地说，是由制备成在末端带有重叠部分这样的多个核苷酸中通过PCR法合成按将小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区域(FR；framework region)连接这样设计的DNA序列。通过将获得的DNA与编码人抗体C区域的DNA连接，接着重组入表达载体中，将其导入宿主使之产生，从而获得所述抗体(参照欧洲专利申请公开号EP239400，国际专利申请公开号WO 92-19759)。
由CDR连接的人抗体的FR，可选择互补性决定区域形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，为了使重构人抗体的互补性决定区域形成适当的抗原结合部位，也可以取代抗体的可变区域的框架区域的氨基酸(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体、人源化抗体中可以使用人抗体C区域。作为人抗体C区域，可以列举有Cγ，例如可以使用Cγ1，Cγ2，Cγ3或Cγ4。此外，为了改善抗体或其生产的稳定性，也可以修饰人抗体C区域。
由于嵌合抗体由人以外的哺乳动物来源的抗体的可变区域和人抗体来源的C区域构成，人源化抗体由人以外的哺乳动物来源的抗体的互补性决定区域和人抗体来源的框架区域以及C区域构成，降低了在人体内的抗原性，因此可用作本发明中使用的抗体。
作为本发明中使用的人源化抗体的优选的具体例子，可以举例有人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。
此外，作为人抗体的获得方法除了上述方法之外，已知还有使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，还可以通过噬菌体展示法使人抗体的可变区域在噬菌体表面表达为单链抗体(scFv)，选择与抗原结合的噬菌体。如果分析选择出的噬菌体的基因，就可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区域的DNA序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以将该序列重组到适当的表达载体中，获得人抗体。这些方法是已经公知的，可以参照WO 92/01047，WO92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
通过公知的方法使按上述方式构建的抗体基因表达，可以获得抗体。哺乳类细胞的情况下，通过功能性结合了常规使用的启动子、要表达的抗体基因、其3’侧下游poly A信号的DNA或含有该DNA的载体可以使之表达。例如，作为启动子/增强子，可以列举有人巨细胞病毒早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate earlypromotor/enhancer)。
此外，作为本发明中使用的抗体表达中可以使用的其它启动子/增强子，可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒的启动子/增强子或人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳动物来源的启动子/增强子。
例如，使用SV 40启动子/增强子时，如果按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人，Nature(1979)277，108-114)或者使用HEF1α启动子/增强子时如果按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地实施。
大肠杆菌的情况下，通过功能性结合常规使用的启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因可以使之表达。例如，作为启动子，可以列举有lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人，FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用araB启动子时可以按照Better等人的方法(Better，M.等人，Science(1988)240，1041-1043)。
作为用于抗体分泌的信号序列，使之在大肠杆菌的周质产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分离在周质产生的抗体后，适当重新折叠(refold)抗体的结构，进行使用(例如，参照WO 96/30394)。
作为复制起点，可以使用源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的复制起点，进一步为了扩增宿主细胞系中基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷磷酰基转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
可以使用任意的生产系统用来制备本发明中使用的抗体。用于抗体制备的生产系统有体外和体内的生产系统。作为体外的生产系统，可以列举有使用真核细胞的生产系统和使用原核细胞的生产系统。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的生产系统。作为动物细胞，已知有(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等，(2)两栖类细胞，例如瓜蟾卵亲本细胞，或(3)昆虫细胞，例如sf9，sf21，Tn5等。作为植物细胞，已知有来源于烟草(Nicotiana tabacum)的的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有酵母例如酵母(Saccharomyces)属，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，丝状菌，例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
通过转化向这些细胞中导入目的抗体基因，通过在体外培养经转化的细胞可以获得抗体。按照公知的方法进行培养。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以与胎牛血清(FCS)等血清添加液并用。此外，也可以通过将导入抗体基因的细胞转移到动物的腹腔中，在体内产生抗体。
另一方面，作为体内的生产系统，可以列举使用动物的生产系统和使用植物的生产系统。使用动物时有使用哺乳类动物、使用昆虫的生产系统等。
作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。此外，作为昆虫可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。
在这些动物或植物中导入抗体基因，使之在动物或植物的体内产生抗体，回收抗体。例如在编码山羊β酪蛋白这样的乳汁中固有产生的蛋白质的基因中插入抗体基因制备为融合基因。在山羊的胚胎中注射含有插入有抗体基因的融合基因的DNA片段，将该胚胎导入到雌性山羊中。从由接纳胚胎的山羊产生的转基因山羊或其子孙产生的乳汁中获得期望抗体。为了增加由转基因山羊产生的含有期望抗体的乳汁量，也可以在转基因山羊中使用适当的激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
此外，在使用蚕时，使插入有目的抗体基因的杆状病毒感染蚕，从该蚕的体液中获得期望的抗体(Maeda，S.等人，Nature(1985)315，592-594)。进而，使用烟草时，用于在植物中表达的载体例如pMON530中插入目的抗体基因，将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)这样的杆菌中。使该杆菌感染烟草例如Nicotiana tabacum，从该烟草的叶中获得期望的抗体(Julian，K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述在体外或体内的生产系统中生产抗体时，也可以在表达载体中分别插入编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA，使其同时转化宿主，或者也可以在单一表达载体中插入编码H链和L链的DNA，使其转化宿主(参照国际专利申请公开号WO 94-11523)。
本发明中使用的抗体，只要是本发明中可以适宜地使用的，可以是抗体的片段或其修饰物。例如，作为抗体的片段，可以列举有Fab、F(ab’)2、Fv或以适当的连接子连接的H链和L链的FV的单链Fv(scFv)。
具体地说，以酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体，使之产生抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体后，使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976.Better，M&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methodsin Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等人，MethodsinEnzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过连接抗体的H链V区域和L链V区域可以获得scFv。在这种scFv中，H链V区域与L链V区域由连接子优选由肽连接子介导连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。在scFv中的H链V区域和L链V区域也可以是来源于上述记载的抗体的任一种。作为连接V区域的连接子，可以使用例如由12-19个氨基酸残基构成的任意单链肽。
编码scFv的DNA可以通过以下方式获得：以编码上述抗体的H链或H链的V区域的DNA以及编码上述抗体的L链或L链的V区域的DNA作为模板，通过PCR法用指定其两端的引物对，对这些序列中编码期望的氨基酸序列的DNA部分进行扩增，接着，进而扩增编码肽连接子部分的DNA，并且通过组合一对指定为使编码肽连接子部分的DNA的两端分别与H链、L链连接的引物进行扩增。
此外，如果一旦制备编码scFv的DNA，就可以按照常规方法获得含有这些DNA的表达载体，以及由该载体转化的宿主。此外，使用其宿主按照常规方法可以获得scFv。
这些抗体的片段，可以以与上述方法相同的方式获得其基因，使之表达，由宿主产生。本发明中所称“抗体”中还包括这些抗体的片段。
作为抗体的修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中所称“抗体”中还包括这些抗体的修饰物。为了获得这样的抗体修饰物，可以通过对所得抗体实施化学修饰，由此获得。这些方法是在本领域内已经建立的方法。
按上述这样产生、表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离，纯化可以通过亲合层析进行。作为亲合层析中使用的柱，可以列举有例如蛋白质A柱、蛋白质G柱。作为蛋白质A柱中使用的载体，可以列举有例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外只要使用常规的蛋白质中使用的分离纯化方法即可，没有任何限定。
例如，如果对上述亲合层析之外的层析，过滤，超滤，盐析，透析等进行适当选择，组合，可以分离纯化出本发明中使用的抗体。作为层析，可以列举有例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析可以适用于HPLC(高效液相色谱)。此外，也可以使用反相HPLC(反相高效液相色谱)。
以上获得的抗体的浓度可通过吸光度的测定或者ELISA等方法来测定。即，当以吸光度的测定来测定抗体浓度时，将样品用PBS(-)适当地稀释，然后测定280nm的吸光度，以1mg/ml相当于1.35OD计算出浓度。此外，当使用ELISA进行浓度测定时，按以下方法进行测定。即，将100μl经0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)加至96孔板(Nunc制造)中，4℃温育过夜以固定抗体。封闭后，每孔加入100μl适当稀释的本发明的抗体或包含抗体的样品，或100μl作为标准品的人IgG(CAPPEL制造)，室温下温育1小时。
洗涤后，加入稀释了5000倍的经碱性磷酸酯酶标记的抗人IgG(BIO SOURCE制造)100μl，在室温下温育1小时。洗涤后，加入底物溶液温育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制造)测定405nm的吸光度，算出目的抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变异体，具有和IL-6受体的结合活性、且为不传递IL-6的生物学活性的物质。即，虽然IL-6变异体与IL-6竞争对IL-6受体的结合，但是由于不传递IL-6的生物学活性，故阻断了IL-6的信号转导。
IL-6变异体是通过取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基、引入变异而制备的。虽然不考虑作为IL-6变异体原料的IL-6的来源，但是若考虑到抗原性等，优选IL-6。
具体地说，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52～56)来预测其二次结构，通过进一步评价被取代的氨基酸残基对总体的影响来进行选择。确定适当的取代氨基酸残基后、以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，按照通常使用的PCR法引入变异使氨基酸被取代，可以得到编码IL-6变异体的基因。按照需要，将其整合入适当的表达载体中，按照上述重组抗体的表达、产生及纯化方法可以得到IL-6变异体。
作为IL-6变异体的具体实例，在Br akenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86～93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357～1367、WO 96-18648、WO 96-17869中已有公开。
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，分别具有与IL-6受体或IL-6的结合活性，且为不传递IL-6生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合，通过捕捉它们可特异地阻断IL-6与IL-6受体的结合。其结果表明，由于不传递IL-6的生物学活性，因此阻断了依赖于IL-6的信号转导。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是由在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关区域的一部分或全部的氨基酸序列组成的肽。这种肽通常由10～80、优选为20～50、更优选为20～40个氨基酸残基组成。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，可通过特别指定在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关的区域，将其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法来制备。
通过基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可将编码期望的肽的DNA序列整合入表达载体中，按照上述重组抗体的表达、产生及纯化方法来得到。
通过肽合成法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以使用在肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体地说，也可以按照续医药品的开发，第14卷，肽合成，监修矢岛治明，广川书店，1991年的方法进行。作为固相合成法，可以使用使与要合成的肽的C末端对应的氨基酸与例如在有机溶剂中不溶性的支持体结合，通过交互重复进行将用适当的保护基团保护了α-氨基及侧链官能团的氨基酸按从C末端到N末端方向的顺序逐一缩合氨基酸的反应、和使树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基的保护基团脱离的反应，使肽链延长的方法。固相肽合成法根据使用的保护基团种类，可大致分为Boc法和Fmoc法。
这样合成目的肽后，进行脱保护反应以及将肽链从支持体切下的反应。与肽链的切下反应中，在Boc法中通常可以使用氟化氢或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氢中，在苯甲醚存在的情况下处理上述保护肽树脂。然后，进行保护基团的脱离与从支持体的切下、回收肽。通过将其冻结干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以进行与上述相同的操作，进行脱保护反应以及从支持体切下肽链的反应。
得到的粗肽，通过应用于HPLC，可以进行分离、纯化。洗脱时，可以使用在蛋白质的纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂在最适条件下进行。分别取得相当于所得色谱法的曲线峰的级分、将其冷冻干燥。对于这样纯化的肽级分、通过根据质谱分析的分子量解析、氨基酸组成分析、或氨基酸序列解析等来鉴定。
IL-6部分肽及IL-6受体部分肽的具体实例，在特开平2-188600、特开平7-324097、特开平8-311098及美国专利公报US 5210075中公开。
本发明中使用的IL-6拮抗剂的IL-6信号转导抑制活性，可以用通常使用的方法评价。具体地说，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)，人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同时使IL-6拮抗剂共存，由此可以测定IL-6依赖性细胞的3H-胸苷的摄取。
另外，培养IL-6受体表达细胞U266、加入125I标记的IL-6，同时加入IL-6拮抗剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记的IL-6。在上述分析体系中，如果除了使IL-6拮抗剂存在的组以外、还设置不含IL-6拮抗剂的阴性对照组，可以比较两者得到的结果评价IL-6拮抗剂的IL-6抑制活性。
如下述实施例所示，由于确认了由抗IL-6受体抗体产生的对血管炎的治疗效果，故而提示抗IL-6受体抗体等IL-6拮抗剂可用作血管炎的治疗剂。
本发明中的治疗对象为哺乳动物。作为治疗对象的哺乳动物优选为人。
本发明的血管炎的预防或治疗剂可以口服或非口服地在全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。有效给药量，每次在每1kg体重0.01mg～100mg的范围内选择。或者，也可以选择给每个患者1～20mg、优选2～8mg的给药量。
优选的给药量、给药方法，在例如在抗IL-6受体抗体的情况下，以血中存在游离抗体的程度的量为有效给药量，作为具体的实例，体重每1kg为1个月(4周间)中给药1mg～20mg，优选2～8mg，分1次或多次给药，例如按2次/周，1次/周，1次/2周，1次/4周等给药方案用点滴等静脉内注射、皮下注射等方法给药的方法等。给药方案也可以一边观察症状和血液检察值的趋势，一边从2次/周或1次/周调整成1次/2周，1次/3周，1次/4周这样延长给药间隔。
本发明的血管炎的预防或治疗剂，也可以同时含有依照给药途径而在药学上所允许的载体或添加物。作为这种载体及添加物的例子，可以列举有水、药学上所允许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为允许的药品添加物的表面活性剂等。使用的添加物，按照剂型可以从上述中适宜选择或组合使用，但不限于这些。
实施例
以下，通过实施例及参考例对本发明进行具体说明，但本发明并不局限于这些例子。
实施例1：临床试验
方法：
以对以往的治疗方法耐药的难治性的血管炎综合征(结节性多发性动脉炎、主动脉炎综合征)患者为对象，通过人源化抗IL-6受体抗体进行治疗。在大阪大学附属医院先进医疗审查会的许可下，对两例患者使用人源化的抗IL-6受体抗体-人源化PM-1抗体(MRA)。以用核磁共振成像(MRI)和计算机断层摄影术(CT)的成像评价的改善、皮肤症状的改善、C反应性蛋白(CRP)等炎症标记的改善、QQL(疼痛、关节痛、倦怠感)的改善作为终点。此外，进行了对外周血细胞常规生物化学、止血功能、IL-6、可溶性IL-6受体、血中人源化抗IL-6受体抗体浓度、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1b(IL-1b)和血管内皮生长因子(VEGF)的评价。
结果：
病例1
19岁女性。1996年被诊断为主动脉炎综合征。并发溃疡性结肠炎。开始以60mg/天氢化强的松(PSL)疗法。即使与环孢菌素合用，PSL也不能减量至20mg/天以下。1998年，针对恶化除了甲基氢化强的松疗法(mPSL)之外还合用了环磷酰胺150mg/天，即使如此PSL也难以减少至30mg以下。追加1mg/天的倍他米松，之后继续进行7次白细胞去除疗法也无效。2000年以后，即使在间歇使用mPSL脉冲疗法的同时，还合用100mg/天硫唑嘌呤，2g/天麦考酚酸酯，17.5mg/周氨甲喋呤，仍然无效。
如图1～6所示，用CT发现了在升主动脉、主动脉弓3个分支，降主动脉中有显著的血管壁肥大。在左锁骨下动脉(1t.SCA)中注意到了狭窄。CRP为12.6mg/dl，确认为强炎症，由于产生强持续性胸痛，1个月中体重减少5kg，发生意识丧失，因此使用点滴静脉注入MRA200mg/周。约2周后CRP转为阴性。1个月后胸痛有所改善，除此之外，如图1～6所示，用CT发现了在升主动脉、主动脉弓3个分支，降主动脉中肥大有所改善并且血管内腔扩大，进而还确定了颈动脉血流的改善。此外，粪便血红蛋白也转为阴性，溃疡性大肠炎的症状也消失。MRA治疗中确认出了血中TNFα的增加，但是没有发现症状的恶化。即使在MRA治疗后经过两年时间都维持了主动脉壁的肥大的改善和血管内腔的扩大。高安动脉炎别名也称为无脉病，即使这种患者中最初在桡骨/尺骨动脉中无法诊到脉，但是通过治疗后用指尖就可以触摸到桡骨/尺骨动脉的搏动。此外，通过长期使用MRA，血中IL-6由1720pg/ml降至100pg/ml以下。
病例2
42岁男性。1986年结节性动脉炎(皮肤炎)发病，即使以PSL、硫唑嘌呤、秋水仙素、抗凝血剂进行治疗，症状反复缓解、恶化。自1995年以来，即使在mPSL脉冲疗法之外还合用环磷酰胺150mg/天也没有效果，自1997年以来，即使进行硫唑嘌呤、环磷酰胺、γ-球蛋白大剂量疗法也无效，自2000年以来即使进行环磷酰胺脉冲疗法，白细胞去除疗法也无效。对由于血管炎而产生的皮肤溃疡进行植皮也无效果，由于恶化而切除右侧腓骨，还施行了膝下切除。坏死性血管炎进一步恶化，下肢的溃疡也有扩大趋势。以200mg/周用人源化抗IL-6受体抗体开始治疗后，发现原本已经确认的发热和皮肤的红斑、肌肉痛有所改善。不得已进行了右大腿部位的切除，不过伴随血中IL-6的降低，白细胞数也趋于正常，之后也没有发现皮肤溃疡恶化。
思考：
由于MRA对以往的治疗中不可能控制的难治性血管炎患者有效，因此显示出IL-6抑制治疗可以成为血管炎的新型治疗方法。这显示IL-6是血管炎病理形成所不可缺少的。此外，由于任一病例中都发现在治疗过程中IL-6本身降低，因此清楚了IL-6抑制治疗不仅有抗炎症作用，而且作用于血管炎本身。
参考例1：人可溶性IL-6受体的制备
按照Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)获得的含有编码IL-6受体的cDNA的质粒pBSF2R.236，通过PCR法制备可溶性IL-6受体。用限制酶Sph I消化质粒pBSF2R.236，得到IL-6受体cDNA、将其插入mp18(Amersham制造)中。使用设计为以便在IL-6受体cDNA中导入终止密码子的合成寡引物，通过体外突变形成系统(Amersham制造)、用PCR法在IL-6受体cDNA中导入突变。通过该操作终止密码子被导入氨基酸345的位置，可得到编码可溶性IL-6受体的cDNA。
为了在CHO细胞中表达可溶性IL-6受体，使其与质粒pSV(Pharmacia制造)连接，得到质粒pSVL 344。在含有dhfr的cDNA的质粒pECEdhfr中插入用Hind III-SalI切下的可溶性IL-6受体cDNA，得到CHO细胞表达质粒pECEdhfr344。
通过磷酸钙沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745～2751)向dhfr-CHO细胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216～4220)转染10μg的质粒pECEdhfr344。将转染的CHO细胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的不含核苷的αMEM选择培养液培养3周。
被选择的CHO细胞用极限稀释法筛选，得到单一的CHO细胞克隆。用20nM～200nM浓度的氨甲喋呤扩增该CHO细胞克隆，得到产生人可溶性IL-6受体的CHO细胞株5E27。用含有5％FBS的Iscov改良Dulbecco’s培养基(IMDM、Gibco制造)培养CHO细胞株5E27。回收培养上清液，用ELISA测定培养上清液中的可溶性IL-6受体的浓度。其结果表明，可以确认在培养上清液中存在可溶性IL-6受体。
参考例2.抗IL-6抗体的制备
用10μg的重组型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐剂一起免疫BALB/c小鼠，每周连续进行免疫至血清中能检出抗IL-6抗体为止。从局部淋巴节中取出免疫细胞，用聚乙二醇1500使其与骨髓瘤细胞株P3U1融合。按照使用HAT培养液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)选择杂交瘤，建立产生抗人IL-6抗体的杂交瘤。
产生抗人IL-6抗体的杂交瘤如下所示进行IL-6结合分析。即，将柔软的聚乙烯制的96孔板(Dynatech Laboratories，Inc制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氢盐-碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制，Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，将板用含有l00μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下处理2小时。
将其用PBS洗涤后，在各孔中加入100μl的杂交瘤培养上清液、在4℃下温育一夜。洗涤该板后、在各孔中加入125I标记的重组型IL-6使其达到2000cpm/0.5ng/孔，洗涤后用γ计数器(Beckman Gamma9000，Beckman Instruments，Fullerton，CA)测定各孔的放射活性。通过IL-6结合分析，在216个杂交瘤克隆中有32个杂交瘤克隆为阳性。在这些克隆中可得到最终稳定的MH166.BSF2。该杂交瘤产生的抗IL-6抗体MH 166具有IgG1κ型的亚型。
然后，使用IL-6依赖性小鼠杂交瘤克隆MH60.BSF2研究与MH166抗体导致的杂交瘤增殖相关的中和活性。将MH60.BSF2细胞分别注入小孔中达到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗体的试样，培养48小时，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，再连续培养6小时。将细胞放置在玻璃滤纸上，用自动采集机(Labo Mash Science Co.，Tokyo，Japan)处理。作为对照使用兔抗IL-6抗体。
其结果，MH166抗体剂量依赖性地抑制由IL-6诱导的MH60.BSF2细胞的3H胸苷的摄取。由此可知，MH166抗体具有中和IL-6的活性。
参考例3.抗人IL-6受体抗体的制备
使按Hirata等人的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900～2906)制备的抗IL-6受体抗体MT18与通过CNBr活化的琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制造，Piscataway，NJ)按照附上的配方结合，纯化IL-6受体(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)。将人骨髓瘤细胞株U266用含有1％毛地黄皂苷(WakoChemicals制造)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M  NaCl的1mM对氨基苯基甲磺酰氟盐酸盐(Wako Chemicals制造)(毛地黄皂苷缓冲液)溶解，和与琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合。然后，将该珠用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次，作为用于免疫的部分纯化IL-6受体。
用由3×109个U266细胞得到的上述部分纯化IL-6受体每隔10天免疫BALB/c小鼠1次，共4次，然后用常规方法制备杂交瘤。用下述方法研究来自阳性孔的杂交瘤培养上清液对IL-6受体的结合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)标记的5×107个U266细胞，用上述毛地黄皂苷缓冲液使之溶解。将溶解的U266细胞和0.04ml容量的与琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合，然后，用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次，使用0.25ml毛地黄皂苷缓冲液(pH3.4)使35S-蛋氨酸标记的的IL-6受体洗脱，用0.025ml的1M Tris(pH7.4)中和。
将0.05ml的杂交瘤培养上清液和0.01ml的蛋白质GSepharose(Phramacia制造)混合。洗涤后，将Sepharose和上述制备的0.005ml35S标记的IL-6受体溶液一起温育。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物，研究与IL-6受体反应的杂交瘤培养上清液。其结果确立了反应阳性杂交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。产生于杂交瘤PM-1的抗体具有IgG1κ型的亚型。
用人骨髓瘤细胞株U266研究杂交瘤PM-1产生的抗体对于IL-6受体的IL-6的结合抑制活性。由大肠杆菌制备人重组型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41～45)、用Bolton-Hunter试剂(New Engl and Nuclear，Boston，MA)进行125I标记(Taga，T.etal.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981)。
将4×105个U266细胞与70％(v/v)杂交瘤PM-1的培养上清液和14000cpm的125I标记的IL-6一起培养1小时。将70μl样品铺到400μl的聚乙烯微量离心管中的300μl的FCS上，离心后，测定细胞上的放射活性。
结果表明，杂交瘤PM-1产生的抗体抑制IL-6与IL-6受体的结合。
参考例4.抗小鼠IL-6受体抗体的制备
通过Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168～173记载的方法，制备针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
在含有10％FCS的IMDM培养液中培养产生小鼠可溶性IL-6受体的CHO细胞，从其培养上清液使用将抗小鼠IL-6受体抗体RS12(参照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝胶(Biorad制造)的亲合层析柱纯化小鼠可溶性IL-6受体。
将得到的小鼠可溶性IL-6受体50μg与弗氏完全佐剂混合，注射到Wistar大鼠的腹部。2周后开始用弗氏不完全佐剂追加免疫。第45天采集大鼠脾脏细胞，使2×108个脾脏细胞按照常规方法与1×107个小鼠骨髓瘤细胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制造)细胞融合后，在HAT培养基中筛选杂交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗体(Cappel制造)的板上加入杂交瘤培养上清液后，使小鼠可溶性IL-6受体反应。然后，通过使用兔抗小鼠IL-6受体抗体和碱性磷酸酯酶标记的的绵羊抗兔IgG的ELISA法筛选可产生针小可溶性IL-6受体抗体的杂交瘤。对已确认产生抗体的杂交瘤克隆进行2次亚筛选，得到单一的杂交瘤克隆。此克隆被命名为MR16-1。
以MH60.BSF2细胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951～956)用3H胸苷的摄取研究该杂交瘤产生的抗体在小鼠IL-6的信息传递中的中和活性。在96孔板上制备MH60.BSF2细胞至1×104个/200μl/孔。在该板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR 16-1抗体或RS12抗体12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培养44小时后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小时后测定3H胸苷的摄取。结果表明，MR16-1抗体抑制MH60.BSF2细胞的3H胸苷摄取。
因此表明，杂交瘤MR16-1(FERM BP-5875)产生的抗体，能阻碍IL-6与IL-6抗体的结合。

Claims (15)

1.白介素-6(IL-6)拮抗剂用于制备血管炎的治疗剂的用途，其中所述IL-6拮抗剂是通过与IL-6受体结合，抑制IL-6向IL-6受体的结合的抗体。
2.白介素-6(IL-6)拮抗剂的用途，其用于制备对类固醇和/或免疫抑制剂耐药的血管炎的治疗剂，其中所述IL-6拮抗剂是通过与IL-6受体结合，抑制IL-6向IL-6受体的结合的抗体。
3.权利要求1或2的用途，其中所述血管炎是结节性多发性动脉炎。
4.权利要求1或2的用途，其中所述血管炎是主动脉炎综合征。
5.权利要求1或2的用途，其中所述血管炎是伴随免疫异常的血管炎。
6.权利要求1的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的单克隆抗体。
7.权利要求1的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
8.权利要求1的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
9.权利要求6～8任一项的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是重组抗体。
10.权利要求7的用途，其中所述针对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
11.权利要求8的用途，其中所述针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
12.权利要求6～8、10～11任一项的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
13.权利要求9的用途，其中所述针对IL-6受体的抗体是针对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
14.权利要求12的用途，其中所述针对IL-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。
15.权利要求13的用途，其中所述针对IL-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。
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