BRPI0417072B1 - "use of interleucin-6 (il-6) antagonist". - Google Patents

Abstract

"agente preventivo para a vasculite". para fornecer um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite tal como poliarterite nodosa, a sindrome de aortite e uma vasculite que é associada com anormalidades imunológicas, dito agente compreendendo um antagonistas da interleucina-6 (il-6) como um ingrediente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE ANTAGONISTA DE INTERLEUCINA-6 (IL-6)'\ Campo Técnico A presente invenção refere-se a um novo agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite.

Antecedentes da Técnica Vasculite é uma das condições patológicas intratáveis comu-mente observada em doenças autoimunes, e muitos de seus casos são retrata rios aos métodos terapêuticos convencionaImente usados tais como esteróides e imunossupressores e, portanto, novos métodos terapêuticos têm sido procurados. Na síndrome de vasculite, a inflamação ocorre nas artérias de vários tamanhos, e febre, dor nos músculos e juntas, oclusão vascular, úlcera da pele, e mononeurite múltipla pode se desenvolver. A vasculite incluí síndromes de vasculite intratáveis tais como poliarterite nodosa e a síndrome de aortite. Lesões de poliarterite nodosa são caracterizadas por inflamações necróticas da média e da adventícia, e aortite geralmente desenvolve inflamações da íntima, da média e da adventícia. A aortite é também chamada arterite de Takayasu. A patologia da vasculite foi sugerida de estar associada com IL-6. Por exemplo, Noris et al. têm relatado que os níveis sanguíneos de IL-6 são aumentados nos pacientes com arterite de Takayasu no estágio ativo da patologia comparada com pessoas saudáveis normais (Circulation 1999 Jul 6; 100(1); 55-60), No entanto, este documento também relata que a concentração de soro de RANTES, uma das quimiocinas, é também intensificada. Noris et al. também sugerem a possibilidade de que estas citocinas sejam responsáveis pela lesões vasculíticas em pacientes com arterite de Takayasu.

Descrição da Invenção O documento, no entanto, não faz qualquer menção da possibilidade de que a arterite de Takayasu possa ser tratada pela inibição de IL-6. Assim, a presente invenção fornece um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite que compreende um antagonista de IL-6 como um ingrediente ativo.

Após intensiva e extensiva pesquisa, os presentes inventores têm demonstrado que a IL-6 é indispensável na patologia de vasculite e que um antagonista de IL-6 possui um efeito terapêutico para a vasculite. Mais surpreendentemente, no estudo pelos presentes inventores, quando a ligação de IL-6 ao seu receptor foi inibida por um anticorpo do receptor de IL-6, a IL-6 per se foi diminuída no sangue. Desta maneira, foi demonstrado que a terapia de inibição de IL-6 não apenas tem um efeito anti-inflamatório sobre a vasculite per se, mas também trata a vasculite per se mediante a atuação sobre o núcleo da vasculite.

Assim, a presente invenção fornece um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite, o dito agente compreendendo um antagonista de interleucina-6 (IL-6) como um ingrediente ativo. A presente invenção fornece um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite tendo resistência aos esteróides e/ou imunossu-pressores, o dito agente compreendendo um antagonista de interleucina-6 (IL-6) como um ingrediente ativo. A dita vasculite é por exemplo poliarterite nodosa, a síndrome de aortite, ou uma vasculite que é associada com anormalidades imunológi-cas. A síndrome de aortite é também denominada como arterite de Takaya-su. Como vasculite associada com as anormalidades imunológicas, por e-xemplo, pode ser mencionado a vasculite associada com reumatóide e vasculite associada com lúpus eritematoso sistêmico (SLE). O dito antagonista de IL-6 é, por exemplo, um anticorpo contra IL-6 ou um anticorpo contra o receptor de IL-6, preferivelmente um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6. Dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é mais preferivelmente um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano, por exemplo, anticorpo PM-1, ou um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo, por exemplo, anticorpo MR16-1. O dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é preferivelmente um anticorpo recombinan-te. O dito anticorpo contra o receptor de IL-6 pode ser um anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. Como aqui usado, o anticorpo mais preferível é um anticorpo PM-1 humanizado. A presente invenção pode também ter os seguintes aspectos: (1) O uso de antagonista de interleucina-6 (IL-6) para a fabricação de um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite, (2) O uso de antagonista de interleucina (IL-6) para a fabricação de um agente preventivo e/ou terapêutico para a vasculite tendo resistência a asteróides e/ou imunossupressores. (3) O uso de acordo com o (1) ou (2) acima em que a dita vasculite é poliarterite nodosa. (4) O uso de acordo com o (1) ou (2) acima em que a dita vasculite é síndrome de aortite. (5) O uso de acordo com o (1) ou (2) acima em que a dita vasculite é vasculite associada com anormalidades imunológicas. (6) O uso de acordo com qualquer um dos (1) a (5) acima em que o dito antagonista de IL-6 é um anticorpo contra o receptor de IL-6. (7) O uso de acordo com o (6) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6. (8) O uso de acordo com o (6) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano. (9) O uso de acordo com o (6) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo. (10) O uso de acordo com qualquer um dos (6) a (9) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo recombinante. (11) 0 uso de acordo com o (8) acima em que o dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano é anticorpo PM-1. (12) O uso de acordo com o (9) acima em que o dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo é anticorpo MR16-1. (13) O uso de acordo com qualquer um dos (6) a (12) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. (14) O uso de acordo com o (13) acima em que o dito anticorpo humanizado contra o receptor de IL-6 é um anticorpo PM-1 humanizado. (15) Um método de prevenir e/ou tratar vasculite que compreende a administração de um antagonista da interleucina-6 (IL-6). (16) Um método de prevenir e/ou tratar vasculite tendo resistência aos esteróides e/ou imunossupressores compreendendo a administração de um antagonista da interleucina-6 (IL-6). (17) O método de acordo com o (15) ou (16) acima em que a dita vasculite é poliarterite nodosa. (18) O método de acordo com o (15) ou (16) acima em que a dita vasculite é a síndrome de aortite. (19) O método de acordo com o (15) ou (16) acima em que a dita vasculite é vasculite associada com anormalidades imunológicas. (20) O método de acordo com qualquer um dos (15) a (19) a-cima em que o dito antagonista de iL-6 é um anticorpo contra o receptor de IL-6. (21) O método de acordo com o (20) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6. (22) O método de acordo com o (20) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano. (23) O método de acordo com o (20) acima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo. (24) O método de acordo com qualquer um dos (20) a (23) a-cima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo re-combinante. (25) O método de acordo com o (22) acima em que o dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano é anticorpo PM-1. (26) O método de acordo com o (23) acima em que o dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo é anticorpo MR1. (27) 0 método de acordo com qualquer um dos (20) a (26) a-cima em que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo qui-mérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano contra o receptor de IL-6. (28) O método de acordo com o (27) acima em que o dito anticorpo humanizado contra o receptor de IL-6 é um anticorpo PM-1 humanizado.

Breve Explicação dos Desenhos A Fig. 1 é uma fotografia que apresenta o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha superior indica a aorta ascendente e a flecha inferior indica a aorta descendente. A Fig. 2 é uma fotografia mostrando o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha indica o arco aórtico. A Fig. 3 é uma fotografia que apresenta o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha superior indica a aorta ascendente e a flecha inferior indica a aorta descendente. A Fig. 4 é uma fotografia que apresenta o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha superior indica a aorta ascendente e a flecha inferior indica a aorta descendente. A Fig. 5 é uma fotografia mostrando o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha indica o arco aórtico. A Fig. 6 é uma fotografia que apresenta o resultado de CT no tratamento da síndrome de vasculite com anticorpo de IL-6R humanizado, em que a flecha superior indica a aorta ascendente e a flecha inferior indica a aorta descendente.

Melhor Modo para a Realização da Invenção A IL-6 é uma citocina que é também chamada do fator 2 de estimulação da célula B (BSF2) ou interleucina β2. A IL-6 foi descoberta como um fator de diferenciação envolvido na ativação de células B-linfáticas (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). Depois disso, foi observada ser uma citocina multifuncional que influencia várias funções de células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54,1-78). A IL-6 foi relatada de induzira maturação das células T-linfáticas (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258). A IL-6 transmite sua atividade biológica através de dois tipos de proteínas nas células. Uma delas é o receptor de IL-6, uma proteína de ligação ao ligando com um peso molecular de cerca de 80 kD, a qual a IL-6 se liga (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-828). O receptor de IL-6 ocorre não apenas na forma ligada à membrana que penetra de lado a lado e é expresso na membrana celular, mas também como um receptor de IL-6 solúvel consistindo principalmente da região extracelular. A outra é uma proteína ligada à membrana gp130 tendo um peso molecular de cerca de 130 kD que está envolvida na transdução de sinal de ligação ao ligando. A IL-6 e o receptor de IL-6 formam o complexo de IL-6/receptor de IL-6 que, após a ligação com gp130, transmite sua atividade biológica à célula (Taga, T. et al,, Cell (1989) 58, 573-581).

Um antagonista de IL-6 é uma substância que inibe a transdução da atividade biológica de IL-6. Como o antagonista de IL-6, foi conhecido até aqui o anticorpo direcionado contra a IL-6 (anticorpo anti-IL-6), anticorpo direcionado contra o receptor de IL-6 (anticorpo do receptor anti-IL-6), e anticorpo direcionado contra gp130 (anticorpo anti-gp130), IL-6 alterada, peptídeos parciais de IL-6 ou receptor de IL-6 e similares. O anticorpo do receptor anti-IL-6 foi descrito em vários relatórios (Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, Publicação de Patente Internacional WO 95-09873, Pedido de Patente Francesa FR 2694767, Patente dos Estados Unidos US 521628). Um anticorpo PM-1 humanizado foi conhecido em que era obtido pelo transplante da região de determinação complementar (CDR) de um deles, um anticorpo de camundongo PM-1 (Hirata, Y. et ai., J. Immuno-logy (1989) 143, 2900-2906), a um anticorpo humano (o Pedido de Patente Internacional WO 92-19759). O antagonista de IL-6 acima é preferivelmente um anticorpo contra o receptor de IL-6, preferivelmente um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano ou um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo. Como o anticorpo monoclonal acima contra o receptor de IL-6 humano, pode ser ilustrado o anticorpo PM-1, e como o anticorpo monoclonal acima contra o receptor de IL-6 de camundongo, pode ser ilustrado o anticorpo MR16-1. O anticorpo acima é preferivelmente um anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou um anticorpo humano, por exemplo, um anticorpo PM-1 humanizado.

Os antagonistas de IL-6 para uso na presente invenção podem ser de qualquer origem, qualquer espécie, e qualquer forma, contanto que eles sejam úteis como um ingrediente ativo para um efeito preventivo ou terapêutico para a vasculite.

Os antagonistas de IL-6 bloqueiam a transdução de sinal pela IL-6 e inibem a atividade biológica da IL-6. Os antagonistas de IL-6 são preferivelmente substâncias que possuem uma atividade de inibição de qualquer um de IL-6. receptor de IL-6 e gp130. Como os antagonistas de IL-6, pode ser mencionado, por exemplo, o anticorpo anti-IL-6, o anticorpo de receptor anti-IL-6, o anticorpo anti-gp130, IL-6 alterada, receptor de IL-6 solúvel anterada, um peptídeo parcial de IL-6 ou receptor de IL-6, e uma substância de peso molecular baixo tendo a mesma atividade como estes.

Os anticorpos anti-IL-6 para uso na presente invenção podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando um método conhecido. Como os anticorpos anti-IL-6 para uso na presente invenção, os anticorpos monoclonais de, em particular, uma origem de mamífero, são preferíveis. Os anticorpos monoclonais de uma origem de mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e anticorpo recombinante produzidos por um hospedeiro que foi transformado com um vetor de expressão con- tendo genes de anticorpo geneticamente planejados. Estes anticorpos, através da ligação à IL-6, bloqueiam a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6, e desse modo bloqueiam a transdução de sinal da atividade biológica de ÍL-6 na célula.

Exemplos de tais anticorpos incluem MH166 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) e anticorpo SK2 (Sato, K. et al., The 21 st Nihon Menekigakkai Soukai (General Meeting ot the Japan Immunoligy Society), Academic Record (1981) 21, 166) e similares.

Um hibridoma de produção de anticorpo anti-IL-6 pode ser basicamente construído usando um procedimento conhecido como descrito abaixo. Assim, a IL-6 pode ser usada como um antígeno de sensibilização e é imunizada no método convencional de imunização. As células imunes assim obtidas são fundidas com as células de origem conhecidas no processo de fusão celular convencional, e depois as células de produção de anticorpo monoclonal são peneiradas pelo método de peneiramento convencional para preparar o hibridoma desejado.

Especificamente, o anticorpo anti-IL-6 pode ser obtido da seguinte maneira. Por exemplo, uma IL-6 humana para uso como o antígeno de sensibilização para se obter o anticorpo pode ser obtida usando o gene de IL-6/seqüência de aminoácido apresentado em Eur. J. Biochem (1987), 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, ou Argic. Biol. (1990) 54, 2685-2688.

Assim que uma célula hospedeira adequada for transformada por inserir a sequência do gene de IL-6 em um sistema de vetor de expressão conhecido, a proteína IL-6 de interesse é purificada a partir da célula hospedeira ou do seu sobrenadante de cultura, e a proteína IL-6 purificada pode ser usada como o antígeno de sensibilização. Alternativamente, uma proteína de fusão da proteína IL-6 e uma outra proteína podem ser usadas como o antígeno de sensibilização.

Os anticorpos do receptor anti-IL-6 para uso na presente invenção podem ser obtidos como os anticorpos policlonais ou monoclonais usando um método conhecido. Como os anticorpos anti-IL-6 para uso na presente invenção, os anticorpos monoclonais de, em particular, uma origem de mamífero, são preferíveis. Os anticorpos monoclonais de uma origem de mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e aqueles produzidos por um hospedeiro que foi transformado com um vetor de expressão contendo genes de anticorpo geneticamente planejados. Os anticorpos, através da ligação ao receptor de IL-6, inibem a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6, e desse modo bloqueia a transdução da atividade biológica de IL-6 na célula.

Exemplos de tais anticorpos incluem o anticorpo MR16-1 (Ta-mura, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 11924-11928), anticorpo PM-1 (Hirata, et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), ou anticorpo AUK12-20, anticorpo AUK64-7 ou anticorpo AUK146-15 (Publicação da Patente Internacional WO 92-19759), e similares. Entre eles, o anticorpo PM-1 é o mais preferido.

Incidentalmente, a linhagem celular de hibridoma que produz o anticorpo PM-1 foi internacionalmente depositada sob as condições do Bu-dapest Treaty como PM-1 em 12 de julho de 1955 com o Patent Microorga-nism Depository of the National Institute of Industrial Science and Technology, at Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, as FERM BP-2998. A linhagem celular de hibridoma que produz o anticorpo MR16-1 foi internacionalmente depositada sob as condições do Budapest Treaty como MR16-1 em 13 de março de 1997 com o Patent Microorganism Depository of the National Institute of Industrial Science and Technology, at Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, as FERM BP-5875.

Os hibridomas que produzem o anticorpo monoclonal do receptor anti-IL-6 podem ser basicamente preparados usando um procedimento conhecido como descrito abaixo. Assim, o receptor de IL-6 é usado como um antígeno de sensibilização e é imunizado de acordo com o método convencional de imunização. As células imunes assim obtidas são fundidas com as células de origem conhecidas no processo de fusão celular convencional, e então as células de produção de anticorpo monoclonal podem ser penei- radas pelo método de peneiramento convencional para preparara o hibrido-ma desejado.

Especificamente, o anticorpo do receptor anti-IL-6 pode ser preparado da seguinte maneira. Por exemplo, o receptor de IL-6 humano usado como o antígeno de sensibilização para obter o anticorpo pode ser obtido usando a seqüência do gene do receptor de IL-6/seqüência de ami-noácido apresentada no Pedido de Patente Européia EP 325474, e o receptor de IL-6 de camundongo pode ser obtido usando o gene do receptor de IL-6 apresentado na Publicação de Patente Não examinada Japonesa (Kokai) 3-155795.

Existem dois tipos de proteínas do receptor de IL-6: receptor de IL-6 expresso sobre a membrana celular, e receptor de IL-6 separado da membrana celular (Receptor de IL-6 solúvel (Yasukawa et al.t J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Anticorpo do receptor de IL-6 solúvel é composto substancialmente da região extracelular do receptor de IL-6 ligado à membrana celular e, desse modo, é diferente do receptor de IL-6 ligado à membrana em que o primeiro carece da região de transmembrana ou tanto da região de transmembrana quanto da região intracelular. Como a proteína do receptor de IL-6, qualquer receptor ae il-d o», -______ possa ser usado um antígeno de sensibilização para a produção do anticorpo do receptor de IL-6 para uso na presente invenção.

Logo que a sequência do gene do receptor de IL-6 é inserida em um sistema de vetor de expressão conhecido para transformar uma célula hospedeira apropriada, a proteína do receptor de IL-6 desejada pode ser purificada a partir da célula hospedeira ou um sobrenadante de cultura desta usando um método conhecido, e a proteína do receptor de IL-6 purificada desta maneira purificada pode ser usada como o antígeno de sensibilização. Alternativamente, as células que expressam o receptor de IL-6 ou uma proteína de fusão da proteína do receptor de IL-6 e uma outra proteína podem ser usadas como o antígeno de sensibilização. E. coli que possui um plasmídeo plBIBSF2R contendo cDNA que codifica o receptor de IL-6 humano foi internacionalmente depositada sob as condições do Budapest Treaty como HB101-plBIBSF2R em 9 de janeiro de 1989 com o Patent Microorganism Depository of the National Insti-tute of Industrial Science and Technology, at Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, as FERM BP-2232.

Os anticorpos anti-gp130 para uso na presente invenção podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando um método conhecido. Como os anticorpos anti-gp130 para uso na presente invenção, os anticorpos monoclonais de, em particular, uma origem de mamífero, são preferíveis. Os anticorpos monoclonais de uma origem de mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e aqueles produzidos por um hospedeiro que foi transformado com um vetor de expressão contendo genes de anticorpo geneticamente planejados. Os anticorpos, através da ligação ao gp130, inibem a ligação do complexo de IL-6/receptor de IL-6 ao gp130, e desse modo bloqueiam a transdução da atividade biológica de IL-6 na célula.

Exemplos de tais anticorpos incluem anticorpo AM64 (Publicação de Patente não Examinada Japonesa (Kokai) 3-219894), anticorpo 4B11 e anticorpo 2H4 (US5571513), anticorpo B-S12 e anticorpo B-P8 (Publicação da Patente não Examinada Japonesa (Kokai) 8-291199).

Um hibridoma de produção de anticorpo anti-gp130 pode ser basicamente construído usando um procedimento conhecido como descrito abaixo. Assim, o gp130 pode ser usado como um antígeno de sensibilização e é imunizado no método convencionai de imunização. As células imunes assim obtidas são fundidas com as células de origem conhecidas no processo de fusão celular convencional, e depois os hibridomas de produção de anticorpo monoclonal são peneirados pelo método de peneiramento convencional para preparar o hibridoma desejado.

Especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser obtido da seguinte maneira. Por exemplo, o gp130 usado como o antígeno de sensibilização para a geração de anticorpo pode ser obtido usando a seqüência do gene de gp130/seqüência de aminoácido apresentada no Pedido de Patente Européia EP 411946.

Assim que uma célula hospedeira adequada é transformada por inserir a seqüência do gene de gp130 em um sistema de vetor de expressão conhecido, a proteína gp130 de interesse é purificada a partir da célula hospedeira ou do seu sobrenadante de cultura. A proteína do receptor de gp130 purificada pode ser usada como o antígeno de sensibilização. Alternativamente, uma proteína de fusão da proteína gp130 e uma outra proteína pode ser usada como o antígeno de sensibilização.

Embora os mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização não sejam especificamente limitados, eles são preferivelmente selecionados em consideração de sua compatibilidade com a célula de origem para uso na fusão celular. Eles geralmente incluem roedores tais como camundongos, ratos, hamsters e similares. A imunização dos animais com um antígeno de sensibilização é realizada usando um método conhecido. Um método geral, por exemplo, envolve a administração intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização no mamífero. Especificamente, um antígeno de sensibilização que foi diluído e colocado em suspensão em uma quantidade apropriada de salina tamponada de fosfato (PBS) ou soro fisiológico etc. é misturado, como desejado, com uma quantidade apropriada de um adjuvante comum, por exemplo, adjuvante completo de Freund. Após ser emulsificado, é preferivelmente administrado a um mamífero durante várias vezes a cada 4 a 21 dias. Alternativamente um portador adequado pode ser usado no momento da imunização do antígeno de sensibilização.

Após a imunização e a confirmação do aumento nos níveis de anticorpo desejados no soro, as células imunes são tomadas do mamífero e são submetidas à fusão celular. As células imunes preferidas a serem submetidas à fusão celular incluem, em particular, as células de baço.

As células do mieloma de mamífero como as outras células de origem que são fundidas com as células imunes acima mencionadas preferivelmente incluem várias linhagens celulares conhecidas tais como P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol. (1979) 123; 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81; 1- 7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6; 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8; 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276; 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Im-munol. Methods (1980) 35; 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148; 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277; 131-133) e similares. A fusão celular entre as células imunes acima e as células de mieloma pode ser essencialmente conduzida de acordo com um método conhecido tal como é descrito em Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73; 3-46) e similares.

Mais especificamente, a fusão celular acima é realizada em um caldo de nutrientes convencional na presença de, por exemplo, um acelerador da fusão celular. Como o acelerador da fusão celular, por exemplo, poli-etileno glicol (PEG), vírus Sendai (HVJ) e similares podem ser usados, e, além disso, um adjuvante tal como sulfóxido de dimetila etc. pode ser adicionado para intensificar a eficiência de fusão. A relação preferida das células imunes e das células de mieloma a serem usadas é, por exemplo, de 1 a 10 vezes mais células imunes do que as células de mieloma. Exemplos de meio de cultura a ser usado para a fusão celular acima incluem meio RPMI1640 e meio de cultura MEM adequados para o crescimento das linhagens celulares de mieloma, e o meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular, e além disso, um suplemento de soro tal como soro de bezerro fetal (FCS) pode ser adicionado.

Na fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e as células de mieloma são bem misturadas no líquido de cultura acima, a qual uma solução de PEG anteriormente aquecida para cerca de 37 °C, por exemplo, uma solução PEG com um peso molecular médio de cerca de 1000 a 6000, é adicionada em uma concentração de 30 a 60 % (p/v) e misturada para obter as células de fusão desejadas (hibrido-ma). Depois mediante a repetição da adição sequencial de um líquido de cultura adequado e centrifugação para remover o sobrenadante, os agentes de fusão celular etc. que são indesejáveis para o desenvolvimento do hibri-doma podem ser removidos. A dita hibridoma é selecionada mediante a cultura no meio de seleção convencional, por exemplo, o meio de cultura HAT (um líquido de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). A cultura no dito meio de cultura HAT continua geralmente por um período de tempo suficiente para efetuar a morte das células diferentes do hibridoma desejado (células de não fusão), geralmente vários dias a várias semanas. O método de diluição limitativa convencional é conduzido de modo que os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são peneirados e monoclonalmente clona-dos.

Além de obter o hibridoma acima mediante a imunização de um animal diferente de um ser humano com um antígeno, é também possível sensibilizar os linfócitos in vitro com um antígeno desejado ou células que expressam o antígeno desejado, e os linfócitos B sintetizados resultantes são fundidos com células do mieioma humano, por exemplo, U266, para obter o anticorpo humano desejado tendo a atividade de ligação ao antígeno desejado ou às células que expressam o antígeno desejado (ver a Publicação da Patente Pós-examinada Japonesa (Kokoku) n2 1-59878). Além disso, um animal transgênico tendo um repertório de todos os genes de anticorpo humanos pode ser imunizado com o antígeno ou as células que expressam o antígeno para se obter o anticorpo humano desejado no método descrito acima (ver a Publicação de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735). O hibridoma de produção do anticorpo monoclonal assim construído podem ser subcultivado no líquido de cultura convencional, ou pode ser armazenado por um período prolongado de tempo em nitrogênio líquido.

De modo a se obter os anticorpos monoclonais de dito hibridoma, um método pode ser usado em que a dita hibridoma é cultivada no método convencional e os anticorpos são obtidos como o sobrenadante, ou um método em que o hibridoma é administrado a, e desenvolvido em, um mamífero compatível com o dito hibridoma e os anticorpos são obtidos como o ascite. Ο primeiro método é adequado para obter anticorpos de pureza elevada, enquanto o último é adequado para uma produção em grande escala de anticorpos.

Por exemplo, um hibridoma que produz anticorpo do receptor anti-ll_-6 pode ser construído usando o método apresentado na Publicação de Patente Não examinada Japonesa (Kokai) 3-139293. Pode ser conduzido por um método em que o hibridoma de produção de anticorpo que foi internacionalmente depositado sob as condições do Budapest Treaty como FERM BP-2998 em 12 de julho de 1989 com o Patent Microorganism Depo-sitory of the National Institute of Industrial Science and Technology, at Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki pref., Japan, seja intraperito-nealmente injetado em camundongos BALB/c para obter o ascite do qual o anticorpo PM-1 é purificado, ou um método em que o dito hibridoma é cultivado em um meio de cultura adequado tal como o meio RPMI1640 contendo soro fetal bovino a 10 % e MB-Condimed H1 a 5 % (fabricado por Boehrin-ger Mannheim), o meio SFM de hibridoma (fabricado por GIBCO-BRL), o meio PFHM-II (fabricado por GIBCO-BRL) e similares, e o anticorpo PM-1 pode ser purificado a partir do sobrenadante.

Um anticorpo recombinante que foi produzido pela tecnologia de gene recombinante em que um gene de anticorpo foi clonado do hibridoma e integrado em um vetor adequado que foi depois introduzido em um hospedeiro pode ser usado na presente invenção como o anticorpo mono-clonal (ver, por exemplo, Borrebaeck C.A.K., e Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLINAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Especificamente, o mRNA que codifica a região variável (V) do anticorpo desejado é isolado das células de produção do anticorpo tais como um hibridoma. O isolamento de mRNA é conduzido pela preparação de RNA total usando, por exemplo, um método conhecido tal como o método i de ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Bio-chem. (1987) 162, 156-159), e depois o mRNA é purificado a partir do RNA total usando o kit de Purificação de mRNA (fabricado por Pharmacia) e similares. Alternativamente, o mRNA pode ser diretamente preparado usando o Quick Prep mRNA Purification Kit (fabricado por Pharmacia). O cDNA da região V do anticorpo pode ser sintetizado a partir do mRNA desta maneira obtido usando uma transcriptase reversa, o cDNA pode ser sintetizado usando o AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit e similares. Alternativamente, para a síntese e amplificação do cDNA, o 5’-Ampli FINDER RACE Kit (fabricado pela Clontech) e o método 5’-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleíc Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emprega reação da cadeia polimerase (PCR) pode ser usado. O fragmento de D NA desejado é purificado a partir do produto de PCR obtido e pode ser ligado ao DNA vetor. Além do mais, um vetor recombinante é construído deste e depois é introduzido em E. coli etc., do qual as colônias são selecionados para preparar o vetor recombinante desejado. A seqüência de base do DNA desejado pode ser confirmada por um método conhecido tal como o método de dideóxi.

Uma vez que o DNA que codifica a região V do anticorpo desejado foi obtido, pode ser iigado ao DNA que codifica a região constante (região C) do anticorpo desejado, que é depois integrado em um vetor de expressão. Alternativamente, o DNA que codifica a região V do anticorpo pode ser integrado em um vetor de expressão contendo o DNA que codifica a região C do anticorpo.

De modo a produzir o anticorpo para uso na presente invenção, o gene de anticorpo é integrado como descrito abaixo em um vetor de expressão de modo a ser expresso sob o controle da região reguladora de expressão, por exemplo, um intesificador e/ou um promotor. Subseqüente-mente, o vetor de expressão pode ser transformado em uma célula hospedeira e o anticorpo pode então ser nela expresso.

De acordo com a presente invenção, um anticorpo recombinante artificialmente alterado tal como o anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, e anticorpo humano pode ser usado para o propósito de diminuir a antigenecidade heteróloga contra seres humanos. Estes anticorpos alterados podem ser produzidos usando métodos conhecidos. O anticorpo quimérico pode ser obtido pela ligação do DNA assim obtido que codifica a região V do anticorpo com o DNA que codifica a região C do anticorpo humano, que é depois integrado em um vetor de expressão e introduzido em um hospedeiro para a produção do anticorpo nesse particular {ver Pedido de Patente Européia EP 125023, e Publicação de Patente Internacional WO 92-19759). Usando este método conhecido, o anticorpo quimérico útil para a presente invenção pode ser obtido.

Por exemplo, um plasmídeo que contém DNA que codifica a região V de cadeia L ou a região V de cadeia H do anticorpo PM-1 quimérico foi designado como pPM-k3 ou pPM-h1, respectivamente, e E. coli tendo o plasmídeo foi internacionalmente depositado sob as condições do Budapest Treaty como NCIMB 40366 e NCIMB 40362, respectivamente, em 12 de fevereiro de 1991 com a National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, United King-dom of Great Britain and Northern Ireland). O anticorpo humanizado, que é também chamado anticorpo humano remoldado, foi produzido mediante o transplante da região de determinação complementar (CDR) do anticorpo de um mamífero diferente de um ser humano, por exemplo, anticorpo de camundongo, na CDR de anticorpo humano. A tecnologia de DNA recombinante geral para a preparação de tais anticorpos é também conhecida (ver o Pedido de Patente Européia EP 125023 e Publicação de Patente Internacional WO 92-19759).

Especificamente, uma seqüência de DNA que foi designada para ligar a CDR de anticorpo de camundongo com a região estrutural (FR) de anticorpo humano é sintetizada a partir de vários oligonucleotídeos divididos tendo seções sobrepostas uma às outras nos seus terminais. O DNA assim obtido é ligado ao DNA que codifica a região C de anticorpo humano e depois é integrado em um vetor de expressão, que é introduzido em um hospedeiro para a produção de anticorpo (ver Pedido de Patente Européia EP 239400 e Publicação de Patente Internacional WO 92-19759).

Para a FR de anticorpo humano ligado através do CDR, a região de determinação complementar que forma um sítio de ligação ao antíge-no favorável é selecionada. Quando desejado, os aminoácidos na região estrutural da região variável do anticorpo podem ser substituídos de modo que a região de determinação complementar do anticorpo humano re-moldado pode formar um sítio de ligação do antígeno apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

Por exemplo, para o anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, a região C de anticorpo humano é usada. Como a região C de anticorpo humano, pode ser mencionado Oy, e Cy1, Ογ2, Oy3 e Cy4, por exemplo, podem ser usados. A região C de anticorpo humano pode ser modificada para melhorar a estabilidade do anticorpo ou a sua produção. O anticorpo quimérico consiste na região variável de anticorpo derivada de um mamífero diferente do ser humano e a região C derivada do anticorpo humano, ao passo que o anticorpo humanizado consiste da região de determinação complementar de anticorpo derivada de um mamífero diferente do ser humano e a região estrutural e a região C do anticorpo derivadas de anticorpo humano. Consequentemente, a sua antigenicidade no corpo humano foi reduzida de modo que eles são úteis como um anticorpo para uso na presente invenção.

Como uma modalidade preferida do anticorpo humanizado para uso na presente invenção, pode ser mencionado o anticorpos PM-1 humanizado (ver a Publicação de Patente Internacional WO 92-19759).

Além disso, como um método de obter anticorpo humano, uma tecnologia que emprega o garimpo com uma biblioteca de anticorpo humano é conhecida, além daquelas descritas acima. Por exemplo, a região variável de anticorpo humano é expressa sobre a superfície de um fago pelo método de apresentação fago como um anticorpo de cadeia única (scFv) para selecionar um fago que se liga ao antígeno. Mediante a análise do gene do fago i selecionado, a seqüência de DNA que codifica a região variável do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada. Assim que a seqüência de DNa do scFv que se liga ao antígeno for clarificada, é possível construir um vetor de expressão apropriado que contém a dita seqüência e depois obter um anticorpo humano. Estes métodos já são conhecidos e podem ser observados nos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 e WO 95/15388.

Os genes de anticorpo construídos como descrito acima podem ser expressos e obtidos em um método conhecido. No caso de células de mamífero, a expressão pode ser executada usando um vetor contendo um promotor útil comumente usado, o gene de anticorpo a ser expresso, DNA em que o sinal poli A foi operavelmente ligado em 3’ a jusante deste ou um vetor contendo dito o DNA. Exemplos do promotor/intensificador incluem próximo imediato citomegalovírus.

Adicionalmente, como o promotor/intensificador que pode ser usado para a expressão do anticorpo para uso na presente invenção, pode ser usado promotores/intensificadores virais tais como retrovírus, vírus poli-oma, adenovírus, e vírus símios 40 (SV40), e promotores/intensificadores derivados de células de mamífero tais como o fator de alongamento humano 1a (HEFIoc);

Por exemplo, a expressão pode ser facilmente executada pelo método de Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) i quando o promotor/intensificador SV40 for usado, ou pelo método de Mizu-shima et al. (Mizushima, S. e Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) quando o promotor/intensificador HEFIafor usado.

No caso de E. coli, a expressão pode ser conduzida por operavelmente ligar um promotor útil comumente usado, uma seqüência de sinal ' para a secreção de anticorpo, e o gene de anticorpo a ser expresso, seguido pela sua expressão. Como o promotor, por exemplo, pode ser mencionado o promotor lacZ e o promotor araB. O método de Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1098) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) pode ser usado quando o promotor lacz for usado, e o método de Bet-> ter et al. (Netter, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043) pode ser usado quando o promotor araB for usado.

Como a seqüência de sinal para a secreção de anticorpo, quando produzido no periplasma de E. coli, a seqüência de sinal pe1B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) pode ser usada. Após a separação do anticorpo produzido no periplasma, a estrutura do anticorpo é apropriadamente redobrada antes do uso (ver, por exemplo, WO 96/30394).

Como a origem de replicação, podem ser usados aqueles derivados de SV40, polioma vírus, adenovírus, papiloma vírus bovino (BPV) e outros mais. Além disso, para a amplificação do número de cópia genético no sistema de célula hospedeira, os vetores de expressão podem incluir como marcadores selecionáveis o gene aminoglicosídeo fosfotransferase i (ΑΡΗ), o gene timidina cinase (TK), o gene xantina guanina fosforibosil transferase de E. coli (Ecogpt), o gene diidrofolato reductase (dhfr) e similares.

Para a produção de anticorpo para uso na presente invenção, qualquer sistema de produção pode ser usado. O sistema de produção para > a preparação de anticorpo compreende o sistema de produção in vitro ou in vivo. Como o sistema de produção in vitro, pode ser mencionado um sistema de produção que emprega células eucarióticas e o sistema de produção que emprega células procarióticas.

Quando as células eucarióticas forem usadas, existem os sis-i temas de produção que empregam células de animal, células de planta ou células fúngicas. As células de animal conhecidas incluem (1) células de mamífero tais como células CHO, células COS, células de mieloma, células do rim de hamster filhote (BHK), células HeLa, e células Vero, (2) células de anfíbio tais como Xenopus oocytes, ou (3) células de inseto tais como sf9, i sf21 e Tn5. As células de planta conhecidas incluem, por exemplo, aquelas derivadas de Nicotiana tabacum, que podem ser submetidas à cultura de calosidade. As células fúngicas conhecidas incluem leveduras tais como o gênero Saccharomyces, mais especificamente Saccharomyces cereviceae, ou fungos filamentosos tais como o gênero Aspergillus, mais especificamen- > te Aspergillus niger.

Quando as células procarióticas forem usadas, existem os sistemas de produção que empregam células bacterianas. As células bactéria- nas conhecidas incluem Escherichia coli (E. coli), e Bacillus subtilis.

Mediante a introdução, através da transformação, do gene do anticorpo desejado nestes células e a cultura das células transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. A cultura é conduzida nos métodos conhecidos. Por exemplo, como o líquido de cultura, DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM podem ser usados, e suplementos de soro tais como soro de bezerro fetal (FCS) podem ser usados em combinação. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos in vivo mediante a implantação de células em que o gene de anticorpo foi introduzido na cavidade abdominal de um animal e outros mais.

Como nos sistemas de produção in vivo, podem ser mencionados aqueles que empregam animais e aqueles que empregam plantas. Quando os animais forem usados, existem os sistemas de produção que empregam mamíferos e insetos.

Como mamíferos, cabras, porcos, ovelhas, camundongos e gado podem ser usados (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Também, como insetos, bichos-da-seda podem ser usados. Quando as plantas forem usadas, tabaco, por exemplo, pode ser usado.

Os genes de anticorpo são introduzidos nestes animais ou i plantas, e os anticorpos são produzidos em tais animais ou plantas, e recuperados. Por exemplo, um gene de anticorpo é inserido no centro da proteína que codifica o gene que é inerentemente produzido no leite tal como β caseína de cabra para preparar os genes de fusão. Os fragmentos de DNA contendo o gene de fusão em que o gene de anticorpo foi inserido são inje-i tados em um embrião de cabra, e o embrião é introduzido em uma cabra fêmea. O anticorpo desejado é obtido a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra que recebeu o embrião ou sua descendência. De modo a aumentar a quantidade de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser dados à cabra l transgênica quando apropriado (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Quando os bichos-da-seda forem usados, o baculovírus em que o gene de anticorpo desejado foi inserido é infectado no bicho-da-seda, e o anticorpo desejado pode ser obtido do fluido corporal do bicho-da-seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Além do mais, quando o tabaco for usado, o gene de anticorpo desejado é inserido em um vetor de expressão para plantas, por exemplo, pMON 530, e depois o vetor é introduzido em uma bactéria tal como Agrobcterium tumefaciens. A bactéria é depois infectada no tabaco tal como Nicotiana tabacum para obter o anticorpo desejado a partir das folhas do tabaco (Julian, K.-C. Ma, et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Quando o anticorpo for produzido em sistemas de produção in vitro ou in vivo, como descrito acima, o DNA que codifica a cadeia pesada (cadeia H) ou a cadeia leve (cadeia L) de anticorpo pode ser separadamente integrado em um vetor de expressão e os hospedeiros são transformados simultaneamente, ou o DNA que codifica a cadeia H e a cadeia L pode ser integrado em um vetor de expressão isolado, e o hospedeiro é transformado com este (ver a Publicação de Patente Internacional WO 94-11523).

Os anticorpos para uso na presente invenção podem ser fragmentos de anticorpo ou suas versões modificadas contato que eles sejam preferivelmente usados. Por exemplo, como fragmentos de anticorpos, podem ser mencionados Fab, F(ab’)2l Fv ou Fv de cadeia única (scFv) em que Fv’s de cadeia H e cadeia L foram ligados através de um articulador adequado.

Especificamente, os anticorpos são tratados com uma enzima, por exemplo, papaína e pepsina, para produzir fragmentos de anticorpo, ou genes que codificam estes fragmentos de anticorpo são construídos, e depois introduzidos em um vetor de expressão, que é expresso em uma célula de hospedeiro adequada (ver, por exemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods in Enzymo-logy (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzy-i mology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121,652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121,663-66; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137). O scFv pode ser obtido pela ligação da região V da cadeia H e a região V da cadeia L do anticorpo. No scFv, a região V da cadeia H e a região V da cadeia L são preferivelmente ligados através de um articulador, preferivelmente um articulador de peptídeo (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA (1988) 85, 5879-5883). A região V da cadeia H e a região V da cadeia L no scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. Como o articulador de peptídeo para ligar as regiões V, qualquer peptídeo de cadeia única compreendendo, por exemplo, 12-19 resíduos de aminoácido pode ser usado. O DNA que codifica o scFv pode ser obtido usando o DNA que codifica a cadeia H ou a região V de cadeia H do anticorpo acima e o DNA que codifica a cadeia L ou a região V de cadeia L do anticorpo acima como o padrão mediante a amplificação da parte do DNA que codifica a seqüência de aminoácido entre as seqüências acima pela técnica de PCR com o par preparador que especifica ambas de suas extremidades, e mediante outra amplificação da combinação de DNA que codifica o componente articulador de peptídeo e o par preparador que define que ambas as extremidades de dito DNA seja ligado à cadeia H e a cadeia L, respectivamente.

Logo que os DNAs que codificam scFv forem construídos, um i vetor de expressão contendo-os e um hospedeiro transformado com dito vetor de expressão podem ser obtidos pelos métodos convencionais, e o scFv pode ser obtido usando o hospedeiro resultante pelos métodos convencionais.

Estes fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por obter o seu gene em uma maneira similar àquela mencionada acima e por permiti-los de serem expressos em um hospedeiro. "Anticorpo" como aqui usado também abrange estes fragmentos de anticorpo.

Como anticorpos modificados, os anticorpos associados com várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG) podem ser usadas. "Anti-» corpo" como aqui usado também abrange estes anticorpos modificados. Estes anticorpos modificados podem ser obtidos mediante a modificação química dos anticorpos assim obtidos. Estes métodos já foram estabelecidos na técnica.

Os anticorpos produzidos e expressos como descrito acima podem ser separados do lado de dentro ou do lado de foram da célula hospedeira e depois podem ser purificados para homogeneidade. A separação e purificação podem ser executadas por cromatografia de afinidade. Como a coluna usada para tal cromatografia de afinidade, pode ser mencionado a coluna de Proteína A e a coluna de Proteína G. Exemplos dos portadores usados na coluna de Proteína A são Hyper D, POROS, Sepharose F. F. e similares. Alternativamente, os métodos para a separação e purificação convencionalmente usados para as proteínas podem ser usados sem qualquer limitação. A separação e purificação do anticorpo para uso na presente invenção podem ser executadas pela cromatografia de, quando apropriado, combinação diferente da cromatografia de afinidade acima mencionada, fil-tração, ultrafiltração, saturação de sal, diálise e similares. A cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtração de gel e similares. Estas cromatografias podem ser aplicadas em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Alternativamente, a H-PLC de fase reversa pode ser usada. A concentração de anticorpos obtidos acima pode ser determinada pela medição da absorvência ou pelo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e outros mais. Assim, quando a medição de absorvência for empregada, uma amostra é apropriadamente diluída com PBS (-) e depois a absorvência é medida em 280 nm, seguido pelo cálculo usando o coeficiente de absorção de 1,35 OD em 1 mg/ml. Quando o método de ELISA for u-sado, a medição é conduzida como se segue. Assim, 100 μΙ de IgG anti-humano de cabra (fabricado por TAG) diluído em 1 pg/ml em 0,1 M de tam-ponante de bicarbonato, pH 9,6, são adicionados a uma placa de 96 reservatórios (fabricado por Nunc), e é incubada durante a noite em 4 °C para imobilizar o anticorpo, Após bloqueio, 100 μΙ de cada de um anticorpo apropriadamente diluído da presente invenção ou uma amostra contendo o anticorpo, ou 100 μΙ de IgG humano (fabricado por CAPPEL) como o padrão são adicionados, e incubados em temperatura ambiente durante 1 hora.

Após lavagem, 100 μΙ de anticorpo de IgG anti-humano rotulado por fosfatase alcalina diluído 5000 vezes (fabricado por BIO SOURCE) são adicionados, e incubados em temperatura ambiente durante 1 hora. A-pós lavagem, a solução de substrato é adicionada e incubada, seguido pela medição da absorvência em 405 nm usando o MICROPLATE READER Mo-del 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular a concentração do anticorpo desejado. A IL-6 alterada para uso na presente invenção possui uma atividade de ligação ao receptor de IL-6 e não transmite a atividade biológica de IL-6. Assim, a IL-6 alterada, embora rivalize com a IL-6 com relação à ligação ao receptor de IL-6, não transmite a atividade biológica de IL-6, e desse modo bloqueia a transdução de sinal por IL-6. A IL-6 alterada pode ser construída através da introdução de mutação por substituir os resíduos de aminoácido da seqüência de aminoá-cido de IL-6. A IL-6, a fonte da IL-6 alterada, pode ser de qualquer origem, mas quando a antigenicidade for considerda, é preferivelmente IL-6 humana.

Especificamente, a estrutura secundária de IL-6 é prognosticada usando um programa de modelagem molecular conhecida da seqüência de aminoácido, por exemplo, WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphica (1990), 8, 52-56), e os efeitos globais sobre o resíduo de aminoácido a ser substituído são avaliados. Após um resíduo de aminoácido apropriado ter sido determinado, a mutação é introduzida para efetuar a substituição de aminoácido pelo comumente usado método de reação de cadeia polimerase (PCR) usando um vetor contendo a seqüência de base que codifica o gene IL-6 humano como um padrão, desse modo para obter um gene que codifica uma IL-6 alterada. Este é depois integrado, como desejado, em um vetor de expressão apropriado, do qual a IL-6 alterada pode ser obtida de acordo i com os métodos de expressão, produção e purificação do dito anticorpo re-combinante.

Exemplos específicos da IL-6 alterada são apresentados em Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, e Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, e WO 96-17869. O peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial receptor de IL-6 para uso na presente invenção possui a atividade de ligação ao receptor de IL-6 ou IL-6 respectívamente, e não transmite a atividade biológica de IL- 6. Assim, o peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial do receptor de IL-6 especificamente inibe a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6 mediante a ligação ao receptor de IL-6 ou IL-6, respectivamente, e desse modo capturando-o. Como um restutado, eles não transmitem a atividade biológica de IL-6, e assim bloqueiam a transdução de sinal de IL-6. O peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial do receptor de IL-6 é um peptídeo que compreende alguma ou toda a seqüência de amino-ácido da região envolvida na ligação ao IL-6 e receptor de IL-6 na seqüência de aminoácido de IL-6 ou receptor de IL-6. Um tal peptídeo geralmente compreende de 10 a 80, preferivelmente de 20 a 50, mais preferivelmente de 20 a 40 resíduos de aminoácido. O peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial do receptor de IL-6 pode ser construído mediante a especificação da região envolvida na ligação ao IL-6 e receptor de IL-6 na seqüência de aminoácido de IL-6 ou receptor de IL-6, e mediante a produção de uma parte ou toda a seqüência de aminoácido por um método convencional tal como uma tecnologia de engenharia genética ou um método de síntese do peptídeo.

De modo a preparar o peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial do receptor de IL-6 por uma tecnologia de engenharia genética, a seqüência de DNA que codifica o peptídeo desejado é integrada em um vetor de expressão, do qual o peptídeo pode ser obtido pelos métodos de expressão, produção e purificação de dito anticorpo recombinante. A preparação do peptídeo parcial de IL-6 ou do peptídeo parcial do receptor de IL-6 pelo método de síntese de peptídeo pode ser efetuada usando um método comumente usado na síntese de peptídeo tal como a síntese de fase sólida ou a síntese de fase líquida.

Especificamente o método descrito em Zoku-lyakuhin no Kai- hatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peputido Gou-sei (Peptide Synthesis), edited by Haruakí Yajima, Hirokawa Shoten, 1991, pode ser usado. O método de síntese de fase sólida usado inclui, por exemplo, uma reação em que um aminoácido que corresponde ao C-terminal do peptídeo a ser sintetizado é acoplado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos, e depois um aminoácido em que o grupo de oi-amino ou um grupo funcional de cadeia lateral foi protegido com um grupo de proteção apropriado é condensado neste aminoácido em um momento a partir da direção C-terminal até N-terminal, e uma reação em que o dito grupo de proteção do grupo de α-amino do aminoácido ou do peptídeo acoplado à resina é eliminado são alternadamente repetidos para prolongar a cadeia de peptídeo. Os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida são divididos no método Boc e o método Fmoc dependendo do tipo de grupo de proteção a ser usado.

Depois que a síntese do peptídeo desejado está completa, uma reação de desproteção e uma reação para a divagem da cadeia de peptídeo a partir do suporte é realizada. Para a divagem da cadeia de peptídeo, fluoreto de hidrogênio ou ácido trifluorometano sulfônico no método Boc e TFA no método Boc são geralmente usados. No método Boc, por e-xemplo, a resina de peptídeo acima é tratada com fluoreto de hidrogênio na presença de anisol. Subseqüentemente, o grupo de proteção é eliminado e o peptídeo é recuperado mediante a divagem do suporte. Mediante a sua liofilização, um peptídeo bruto pode ser obtido. Por outro lado, no método Fmoc, a reação de desproteção e a reação de divagem do peptídeo do suporte podem ser executadas em TFA, por exemplo, de certo modo o procedimento similar à acima. O peptídeo bruto assim obtido pode ser aplicado ao HPLC para a sua separação e purificação. Sua eluição pode ser realizada em um sistema solvente de água-acetonitrila que é comumente usado para a purificação da proteína sob uma condição ideal. A fração correspondente ao pico do perfil da cromatografia obtida é coletada e liofilizada. A fração de peptídeo assim purificada é identificada por submetê-la à análise de peso mole- cular pela análise espectroscópica de massa, a análise da composição de aminoácido, ou a análise da seqüência de aminoácido, e outras mais.

Exemplos específicos do peptídeo parcial de IL-6 ou o peptideo parcial do receptor de IL-6 são apresentados na Publicação da Patente Não Examinada Japonesa (Kokai) 2-188600, Publicação da Patente Não Examinada Japonesa (Kokai) 7-324097, Publicação da Patente Não Examinada Japonesa (Kokai) 8-311098, e Publicação da Patente dos Estados Unidos US 5210075. A atividade do antagonista de IL-6 para uso na presente invenção do bloqueio da transdução de sinal de IL-6 pode ser avaliada usando um método convencionalmente conhecido. Especificamente, a linhagem celular de mieloma humano dependente de IL-6 (S6B45, KPMM2), linhagem celular de T-linfoma de Lennert humano KT3, ou célula dependente da IL-6 MH60.BSF2 é cultivada, a qual a IL-6 é adicionada, e a atividade pode ser avaliada utilizando a incorporação de 3H-timidina na célula dependente de IL-6 na coexistência do antagonista de IL-6.

Alternativamente, U266, uma célula de expressão do receptor de IL-6, pode ser cultivada, a qual IL-6 125l-rotulada é adicionada e um antagonista de IL-6 é adicionado ao mesmo tempo, e depois a IL-6 125l-rotulada ligada à célula de expressão do receptor de IL-6 é determinada. No sistema de ensaio acima, um grupo de controle negativo não contendo nenhum antagonista de IL-6, além do grupo em que um antagonista do receptor de IL-6 está presente, é levantado, e os resultados obtidos para eles são comparados para avaliar a atividade de inibição da IL-6 do antagonista do receptor de IL-6.

Como descrito no Exemplo abaixo, o anticorpo do receptor de IL-6 apresentou um efeito terapêutico de vasculite, sugerindo que os antagonistas de IL-6 tais como o anticorpo do receptor anti-IL-6 são eficazes como um agente terapêutico para a vasculite. O indivíduo a ser tratado na presente invenção é mamífero. O mamífero objeto a ser tratado é preferivelmente humano.

Os agentes preventivos ou terapêuticos da presente invenção podem ser administrados, ou oral ou parenteralmente, sistêmica ou localmente. Por exemplo, injeção intravenosa tal como infusão por gotejamento, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção sub cutânea, supositó-rios, lavagem intestinal, coprimidos de revestimento entérico orais, e similares podem ser selecionados, e o método de administração pode ser escolhido, como apropriado, dependendo da idade e das condições do paciente. A dosagem eficaz é escolhida a partir da faixa de 0,01 mg a 100 mg per kg de peso corporal per administração. Alternativamente, a dosagem na faixa de 1 a 20 mg, preferivelmente de 2 a 8 mg per paciente pode ser escolhida.

As dosagens preferidas e métodos preferidos de administração são tais que, no caso de anticorpo do receptor anti-IL-6, as quatidades em que o anticorpo livre está presente no sangue são dosagens eficazes. Nos exemplos específicos, 1 mg a 20 mg per kg de peso corporal, preferivelmente 2 mg a 8 mg, per mês (4 semanas) são administrados em uma a várias doses, por exemplo, duas vezes per semana, uma vez per semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas, e assim por diante por injeção intravenosa tal como a infusão por getejamento e injeção subcu-tânea. O plano de administração pode ser ajustado mediante a observação das condições doentias e níveis de sangue de testes de laboratório, por e-xemplo, prolongando o intervalo de administração de duas vezes por semana ou uma vez por semana a uma vez per duas semanas, uma vez per três semanas, uma vez por quatro semanas, e assim por diante.

Os agentes preventivos ou terapêuticos para a vasculite da presente invenção podem conter portadores ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis dependendo da via de administração. Exemplos de tais portadores ou aditivos incluem água, um solvente orgânico farmaceuticamente aceitável, colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, um polímero de carbo-xivinila, carboximetilcelulose sódio, poliacrílico sódio, alginato de sódio, pec-tina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, gelatina, ágar, diglicerina, propileno glicol, polietileno glicol, Vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose, um tensoativo farmaceuticamente aceitável e outros mais.

Os aditivos usados são escolhidos, mas não limitados a eles, dos acima ou suas combinações dependendo da forma de dosagem.

Exemplos A presente invenção agora será explicada com maiores detalhes com referência aos exemplos de trabalho e exemplos de referência. Deve ser observado, no entanto, que a presente invenção não é limitada por eles em qualquer maneira.

Exemplo de preparação 1 Método: Pacientes com síndrome de vasculite intratável (poliarterite no-dosa, a síndrome de aortite) refratária à terapia convencional foram submetidos ao tratamento com anticorpo do receptor anti-IL-6 humanizado. Sob a permissão pelo Advanced Medicai Treatment Committee of the Osaka Uni-versity Hospital, dois pacientes receberam anticorpo PM-1 humanizado (MRA) que é um anticorpo do receptor anti-IL-6. O ponto final foi a melhora na avaliação das imagens pela formação de imagem de ressonância magnética (MRI) e tomografia computadorizada (CT), melhora nas condições da pele, melhora nos marcadores inflamatórios tais como a proteína C reativa (CRP), e melhora na QOL (dor, artralgia, mal-estar). Também, contagens de célula sanguínea periférica, bioquímica geral, função homostática, IL-6, receptor de IL-6 solúvel, a concentração de anticorpo do receptor de anti-IL-6 humanizado no sangue, fator α da necrose tumoral (TNFa), interleucina-1b (IL-6), e fator do crescimento epidérmico vascular (VEGF) foram avaliados. Resultado: Caso 1: Uma fêmea de 19 anos de idade, Diagnosticada como tendo a síndrome de aortite em 1996. Tinha uma complicação de colite ulcerativa. Prednisolona (PSL) 60 mg/dia foi iniciada. Mesmo o uso combinado de ci-closporina não pode reduzir a PSL para 20 mg/dia ou mais baixo. Em 1998, em resposta à agravação, ciclofosfammida 150 mg/dia foi usada além da terapia de pulsação de prednisolona de metila (mPSL), mas não pode ser reduzido para 30 mg/dia ou mais baixo. Betametasona 1 mg/dia foi adicio- nado, e depois leucoforese foi executado durante sete vezes, mas sem efeito. Em 2000 e depois, a terapia de pulsação de mPSL foi intermitentemente usada, e azatioprina 100 mg/dia, micofenolato de mofetila 2 g/dia, e meto-trexato 17,5 mg/semana foram usados em combinação, mas sem efeito.

Como mostrado nas figuras 1-6, a CT revelou a hipertrofia pro-minente da parede do vaso sanguíneo na aorta ascendente, na trifurcação do arco aórtico e na aorta descendente. Estenose foi observada na artéria subclavia (1t. SCA), Inflamação severa foi observada com CRP 12,6 mg/dl, e devido a uma dor no tórax persistente severa, uma redução no peso cor-i poral de 5 kg per mês, e ataque de inconsciência ocorreram, a infusão por gotejamento de MRA 200 mg/semana foi usada. Cerca de duas semanas mais tarde, a CPR tornou-se negativa. Um mês mais tarde, a dor no tórax melhorou, e como visto nas figuras de 1 a 6, melhora na hipertrofia da parede do vaso sangüíneo na aorta ascendente, na trifurcação do arco aórtico e > na aorta descendente, e aumento do lúmen dos vasos sangüíneos foram observados e, além disso, o fluxo sangüíneo na artéria carótida melhorou. Da mesma forma a hemoglobina fecal tornou-se negativa, e os sintomas de colite ulcerativa desapareceram. Durante a terapia de MRA, os níveis sangüíneos de TNFa aumentou, mas sem qualquer agravamento nos sintomas. ) Melhora na hipertrofia da parede da aorta e aumento do lúmen dos vasos sangüíneos foram mantidos mesmo no período de dois anos após a terapia de MRA. A arterite de Takayasu é também chamada como a doença sem pulso, e neste paciente igualmente o pulso não pode ser sentido, mas após o tratamento a pulsação das artérias do rádio e do cúbito pode ser sentida i no pulso. Devido a um uso prolongado de MRA, os níveis sangüíneos de IL-6 diminuíram de 1720 pg/ml a 100 pg/ml, Caso 2: Um macho de 42 anos de idade. Em 1986, arterite nodosa (o tipo na pele) desenvolveu, e a despeito dos tratamentos com PSL, azatiopu-I rina, colcicina e anticoagulantes, a remissão e agravamento reperiram. Em 1995 e após, ciclofosfammida foi usada em combinação com a terapia de pulsação mPSL, mas sem efeito. A partir de 1997, a administração de bolo de azatiopurina, ciclofosfamida e γ-globulina foi iniciada, e a partir de 2000, a terapia de pulsação de ciclofosfamida e leucoforese foram iniciadas, mas sem efeito. Enxerto na pele foi executado sobre a úlcera da pele devido à vasculite, mas sem efeito, e devido ao agravamento, remoção da fíbula direita e amputação B-K foram executadas. A vasculite necrótica ainda se a-gravou, e a úlcera no limbo inferior foi se ampliando. Após o tratamento de partida com um anticorpo do receptor anti-IL-6 humanizado 200 mg/semana, febre e eritema da pele e dores musculares que foram anteriormente observados melhoraram. Contudo a remoção da coxa direita não pode ser evita-i da, as contagens de leucócitos normalizaram com a IL-6 reduzida no sangue, e nenhum agravamento na úlcera da pele foi observado depois disso. Debate: Visto que MRA era eficaz para pacientes com vasculite intratável que não pode ser controlada pelos tratamentos convencionais, foi suge-- rido que o tratamento de inibição de IL-6 pode fornecer um novo método de tratamento para a vasculite. Isto significa que a IL-6 é indispensável para o estabelecimento da patologia de vasculite. Além disso, como a redução de IL-6 per se foi observada em todos os casos, demonstrou-se que o tratamento de inibição da IL-6 não apenas possui um efeito anti-inflamatório, i mas atua na natureza essencial da vasculite.

Exemplo de Referência 1. Preoaracão do receptor de IL-6 solúvel humano O receptor de IL-6 solúvel foi preparado pelo método de PCR usando um plasmídeo pBSF2R.236 contendo cDNA que codifica o receptor de IL-6 obtido de acordo com o método de Yamasaki et al., (Yamasaki, K. et l al., Science (1988) 241, 825-828). O plsmídeo pBSF2R.236 foi digerido com uma enzima de restrição Sph I para obter o cDNA do receptor de IL-6, que foi depois inserido em mp18 (fabricado por Amersham). Usando um oligo-preparador sintético designado para introduzir um códon de parada dentro do cDNA do receptor de IL-6, uma mutação foi introduzida dentro do cDNA ) do receptor de IL-6 pelo método de PCR usando o Sistema de Mutagênese in vitro (fabricado por Amersham). O procedimento resultou na introdução de um códon de parada no aminoácido na posição 345, e deu o cDNA que co- difica o receptor de IL-6 solúvel.

De modo a expressar o cDNA do receptor de IL-6 solúvel nas células de CHO, ele foi ligado ao plasmídeo pSV (fabricado por Pharmacia) para obter o plasmídeo pSVL344. O cDNA do receptor de IL-6 solúvel que foi clivado com Hind lll-Sal I foi inserido no plasmídeo pECEdhfr contendo o cDNA de dhfr para obter o plasmídeo pECEdhfr344 que pode ser expresso nas células de CHO.

Dez pg de plasmídeo pECEdhfr344 foram transfectados para uma linhagem celular dhfr-CHO DXB-11 (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77, 4216-4220) pelo método de precipitação de fosfato de cálcio (Chen C. et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). As células de CHO transfectadas foram cultivadas durante 3 semanas em um meio de seleção a MEM livre de nucleosídeo contendo 1 mM glutamina, 10 % FCS dialisado, 100 U/ml de penicilina, e 100 pg/ml de estreptomicina.

As células de CHO selecionadas foram peneiradas pelo método de diluição limitativa para obter um clone de célula de CHO único. O clone de célula de CHO foi amplificado em 20 nM - 2090 nM de metotrexato (MTX) para obter uma linhagem celular de CHO 5E27 que produz o receptor de IL-6 solúvel humano. A linhagem celular de CHO 5E27 foi cultivada em um meio Iscov-modified Dulbecco's (IMDM, fabricado por Gibco) contendo FBS a 5 %. O sobrenadante da cultura foi coletado e a concentração do re-ceptor de IL-6 solúvel no sobrenadante de cultura foi determinada por ELISA. O resultado confirmou que o receptor de IL-6 solúvel está presente no sobrenadante da cultura.

Exemolo de referência 2. Preparação do anticorpo de IL-6 humano Dez pg da IL-6 recombinante (Hirano et al. Immunol. Lett., (1988) 17, 41) foram imunizados em camundongos BALB/c juntamente com adjuvante completo de Freund, e isto foi repetido a cada semana até que o anticorpo anti-IL-6 pudesse ser detectado no soro. As células imunes foram extraídas do nódulo da linfa local e foram depois fundidas com uma linhagem celular de mieloma P301 usando polietileno glicol 1500. Os hibridomas foram selecionados de acordo com o método de Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980) que emprega o meio HAT, e um hibridoma que produz anticorpo de IL-6 anti-humano foi estabelecido. O hibridoma que produz o anticorpo de IL-6 anti-humano foi submetido ao ensaio de ligação de IL-6 como se segue. Assim, uma placa de microtítulo de 96 cavidades produzida de polivinila flexível (fabricada por Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) foi revestida com 100 μΙ de an-ticamundongo de cabra Ig (10 μΙ/ml, fabricado por Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) durante a noite em 4 °C. Subsequentemente, a placa foi tratada com 100 μΙ de PBS contendo albumina de soro bovino a 1 % (BSA) em temperatura ambiente durante 2 horas.

Após lavagem em PBS, 100 μΙ do sobrenadante de cultura de hibridoma foram adicionados a cada cavidade, e depois incubados durante a noite em 4 °C. A placa foi lavada, IL-6 recombinante 125l-rotulada foi adicionada a cada cavidade em uma concentração de 2000 cpm/0,5 ng/reservatório, e depois a radioatividade de cada cavidade após lavagem foi determinada por um contador gama (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). De 216 clones de hibridoma, 32 foram positivos no ensaio de ligação a IL-6. Destes clones, MH166.BSF2 estável foi finalmente obtido. O anticorpo anti-IL-6 MH166 produzido pelo dito hibridoma tinha um subtipo de lgG1 k.

Então, o clone de hibridoma de camundongo dependente da IL-6 MH60.BSF2 foi usado para examinar uma atividade de neutralização com respeito ao crescimento do hibridoma pelo anticorpo MH166. As células de MH60.BSF2 foram dispensadas em 1 x 104/200 μΙ/cavidade, e as amostras contendo o anticorpo MH166 foram adicionados a estas, cultivadas durante 48 horas, 0,5 pCi/cavidade de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA) foi adicionado, e o cultivo continuou por mais 6 horas. As células foram colocadas em um papel de filtro de vidro e foram tratadas pela colhei-• tadeira automática (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). Como o controle, anticorpo anti-IL-6 de coelho foi usado.

Como um resultado, o anticorpo MH166 inibiu, em uma maneira dependente da dose, a incorporação de 3H-timidina de células MH60.BSF2 induzidas por IL-6. Isto revelou que o anticorpo MH165 neutraliza a atividade de IL-6.

Exemplo de Referência 3. Preparação de anticorpo do receptor anti-IL-6 humano O anticorpo do receptor anti-IL-6 MT18 preparado pelo método de Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol., (1989) 143, 2900-2906) foi ligado à CNBr-activated Sepharose 4B ativada (fabricado por Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) de acordo com o regime ligado, e o receptor de IL-6 (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828) foi purificado. Uma linhagem celular de mieloma humano U266 foi solubilizada com 1 mM clori-drato de fluoreto p-para-aminofenila metano sulfonil (fabricado por Wako Chemicals) (tampão de digitonina) contendo 1 % de digitonina (fabricado por Wako Chemicals), 10 mM trietanolamina (pH 7,8) e 0,15 M NaCI, e misturada com anticorpo MT 18 ligado a glóbulos de Spharose 4B. Depois, os glóbulos foram lavados seis vezes com o tampão de digitonina para preparar o receptor de IL-6 parcialmente purificado a ser usado para a imunização.

Camundongos BALB/c foram imunizados quatro vezes a cada dez dias com o receptor de IL-6 parcialmente purificado acima obtido de 3 x 109 U266 células, e depois um hibridoma foi preparado usando um método padrão. O sobrenadante da cultura de hibridoma da cavidade positivo de crescimento foi testado com relação àa sua atividade de ligação ao receptor de IL-6 de acordo com o método descrito abaixo. 5 x 107 células U266 foram rotuladas com 35S-metionina (2,5 mCi) e foram solubilizadas com o tampo-nante de digitonina acima. As células U266 solubilizadas foram misturadas com um volume de 0,04 ml de anticorpo MT18 ligado aos glóbulos de Sepharose 4B, e depois foram lavadas seis vezes com tamponante de digitonina. O receptor de IL-6 rotulado por 35S-metionina foi eluído com 0,25 ml do tamponante de digitonina (pH 3,4) e foi neutralizado em 0,025 ml de 1M Tris (pH 7,4). 0,05 ml do sobrenadante de cultura do hibridoma foi misturado com 0,01 ml de Protein G Sepharose (fabricado por Pharmacia). Após lava- gem, a Sepharose foi incubada com 0,005 ml de solução de receptor de IL-6 35S-rotulado preparada como descrito acima. O imunoprecipitado foi analisado por SDS-PAGE para investigar o sobrenadante de cultura de hibrido-ma que reage com o receptor de IL-6. Como um resultado, o clone de hibri-doma positivo por reação PM-1 (FERM BP-2998) foi estabelecido. O anticorpo produzido a partir do hibridoma PM-1 tinha um subtipo de IgGlK. A atividade inibidora de ligação de IL-6 do anticorpo produzido pelo hibridoma PM-1 ao receptor de IL-6 humano foi estudada usando a linhagem celular de mieloma humano U266. Uma IL-6 recombinante humana foi preparada a partir de E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett., (1988) 17, 41-45), e foi rotulada com 125l usando o reagente Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. etal., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981). 4 x 105 U266 células foram cultivadas com o sobrenadante de cultura de 70 % (v/v) de hibridoma PM-1 juntamente com 14.000 cpm de IL-6 125l-rotulada durante uma hora. Setenta μΙ da amostra foram colocados em camadas em 300 μΙ de FCS em um tubo de polietileno de microcentrífuga de 400 μΙ. O resultado revelou que o anticorpo produzido pelo hibridoma PM-1 inibe a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6.

Exemolo de referência 4. Preparação de anticorpo do receptor anti-IL-6 de camundonqo Um anticorpo monoclonal direcionado contra o receptor de IL-6 de camundongo foi preparado de acordo com o método descrito em Saito, etal., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.

As células de CHO que produzem receptor de IL-6 solúvel de camundongo foram cultivadas no líquido de cultura IMDM contendo 10 % de FCS. A partir do sobrenadante da cultura, receptor de IL-6 solúvel de camundongo foi purificado usando uma coluna de afinidade em que o anticorpo do receptor de IL-6 anticamundongo RS12 (ver Saito, et al., supra) foi fixado em gel Affigel 10 (fabricado por Biorad). O receptor de IL-6 solúvel de camundongo (50 pg) assim obtido foi misturado com adjuvante completo de Freund, que foi depois injetado no abdome de ratos Wistar. A partir de 2 semanas após a administração, os animais foram apoiados com adjuvante incompleto de Freund. No dia 45, células de baço de rato foram colhidas, e cerca de 2 x 108 células destas foram fundidas com 1 x 107 células de mieloma de camundongo P3U1 u-sando um PEG1500 a 50 % (fabricado por Boehringer Mannheim) de acordo com o método convencional, e depois foram peneiradas pelo meio de cultura HAT.

Após o sobrenadante de cultura de hibridoma ter sido adicionado à placa revestida com anticorpo IgG anti-rato de coelho (fabricado por Cappel), o receptor de IL-6 solúvel de camundongo foi reagido. Subseqüen-temente, usando anticorpo do receptor de IL-6 anticamundongo de coelho e IgG anticoelho de cabra rotulado por fosfatase alcalina, hibridomas que produzem anticorpo direcionado contra o receptor de IL-6 solúvel por camundongo foram peneirados por ELISA. Logo que a produção de anticorpo foi confirmada, os clones de hibridoma foram subpeneirados duas vezes para obter um clone de hibridoma isolado. O clone foi designado como MR16-1. A atividade de neutralização do anticorpo produzido pelo hibridoma na transdução de sinal de IL-6 de camundongo foi examinada mediante a incorporação de 3H-timidina usando células MH60.BSF2 (Matsuda, T. et alM J. Immunol. (1988) 18, 951-956). A uma placa de 96 cavidades, células MH60.BSF2 foram preparadas em 1 x 104 células/200 μΙ/cavidade. Às placas foram adicionados 10 pg/ml de anticorpo de IL-6 e MR16-1 de camundongo ou anticorpo de RS12 em 12,3 a 1000 ng/ml, e depois foram cultivadas em 37 °C e 5 % de C02 durante 44 horas, e depois 1 pCi/cavidade de 3H-timidina foi adicionado. Após 4 horas, a incorporação de 3H-timidina foi medida. Como um resultado, o anticorpo de MR16-1 suprimiu a incorporação de 3H-timidina pelas células MH60.BSF2.

Assim, foi demonstrado que o anticorpo produzido pelo hibridoma MR16-1 (FERM BP-5875) inibe a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Uso de antagonista de interleucina-6 (IL-6), caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um agente terapêutico para a vasculite, em que o antagonista de IL-6 é um anticorpo contra receptor de IL-6.

2. Uso de antagonista de interleucina (IL-6), caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um agente terapêutico para a vasculite tendo resistência a esteroides e/ou imunossupressores, em que o antagonista de IL-6 é um anticorpo contra receptor de IL-6.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita vasculite é poliarterite nodosa.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita vasculite é síndrome de aortite.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita vasculite é vasculite associada com anormalidades imunológicas.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camundongo.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo recombinante.

10. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 humano é anticorpo PM-1 secretado por linhagem celular de hibridoma depositada como FERM BP-2998.

11. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 de camun-dongo é anticorpo MR16-1 secretado por linhagem celular de hibridoma depositada como FERM BP-5875.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humanizado contra o receptor de IL-6 é um anticorpo PM-1 humanizado.