KR20130132236A - 트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 항체-약물 결합체, 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)으로 연결된, 항체-약물 결합체, 상기 항체-약물 결합체를 포함하는 암 치료용 조성물, 상기 항체-약물 결합체를 이용하여 암을 치료하는 방법 및 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된 변이된 항체에 관한 것이다.

Description

트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체 및 이의 용도{Antibody-drug conjugate formed through transglutaminase and use thereof}
본 발명은 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 항체-약물 결합체, 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)으로 연결된, 항체-약물 결합체, 상기 항체-약물 결합체를 포함하는 암 치료용 조성물, 상기 항체-약물 결합체를 이용하여 암을 치료하는 방법 및; 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된 변이된 항체에 관한 것이다.
항체의 의약품적 효능은 세포 독성 물질이나 방사성 물질의 결합을 통해 증대될 수 있다. 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)는 항체에 세포 독성 약물을 결합시킨 것으로, 항체-약물 결합체를 이용하여 기존 항암 효과를 증대시키는 한편, 기존 항체에 저항력이 있는 암 세포에 적용시키기 위하여 연구가 활발히 이루어지고 있다. 현재 시장에 진입하거나 임상 또는 연구 단계에 있는 항체-약물 결합체는 천연형 항체 내의 라이신(lysine)이나 시스테인(cysteine)의 다수 부위에 화학적인 결합 방법을 이용하여 항체에 약물을 결합시키는 방법을 이용하고 있다. 이런 고전적인 화학적 방법을 통한 항체-약물 결합체의 경우, 그 형성에 있어서 조절이 어려우며, 각기 다른 특성을 보유한 이질성 면역혼합체가 생성된다는 문제점을 지닌다(K. J. Hamblett et al. Clin . Cancer Res . 2004, 10, 7063-7070).
이에 대해 위치특이적으로 약물을 결합시켜 동질성을 높인 면역혼합체를 제조하기 위하여 많은 노력이 있었으며, 이러한 노력 끝에 제넥텍(Genentech)사에서는 항체의 중쇄 또는 경쇄에 항체의 특정 아미노산을 시스테인으로 치환한 형태를 개발하였다(미국등록특허 제7521541호, Junutula JR et al. Nat Biotechnol . 2008. 26(8):925-32, Ben-Quan Shen et al. Nat Biotechnol . 2012, 30(2):184-9). 제넨텍사에서 개발한 면역혼합체의 경우, 2개의 시스테인이 삽입된 항체를 이용하여 2개의 세포독성물질을 원하는 위치에 결합시켜 동질성을 가지지만, 인위적으로 삽입한 시스테인의 티올(thiol) 잔기가 반응성을 가지도록 활성화시켜야하므로, 항체의 환원과정과 산화과정을 거쳐야 하는 다단계 접합 공정을 따라야 하는 문제점이 있다.
상기와 같이 화학적 방법을 이용하여 약물을 항체에 접합시킬 경우, 산화-환원 반응을 거침으로 인해 항체를 변형하는 방법이 되어 항체의 3차 구조나 기능면에서 약점을 가지게 된다. 상기와 같은 약점은 종종 비구별 및 항체의 접근가능 라이신(lysine)/시스테인(cysteine) 잔기 또는 아민 그룹(amine group)간의 불완전한 반응 등으로 나타나며, 불완전 또는 정의되지 않은 생산물을 종종 생산하기도 한다. 이러한 점에서, 항체의 성질 변화가 적으면서도 위치 특이적인 방식으로 변형할 수 있는 방법이 필요하다.
트랜스글루타미나아제(transglutaminase, TGase)는 글루타민(glutamine, Q) 잔기의 감마-카르복사미드 그룹과 라이신의 일차 입실론 아미노 그룹 간의 아실 트랜스퍼 반응을 촉매하는 효소이다. 상기와 같은 반응을 통해 형성된 결합을 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)이라고 하고, 이 결합은 프로테아제에 대해 내성을 가지는 등 상당히 안정한 결합으로 알려져 있다. 이러한 안정성때문에 트랜스글루타미나아제는 일반적으로 세포의 구조 성분을 연결시키는 데 사용된다. 트랜스글루타미나아제에 의한 글루타민 잔기의 인식은 상당히 엄격하며, 주로 단백질 내의 유동적인 부분에 있는 글루타민기를 인식하는 것으로 알려져 있다(Angelo Fontana et al, Advanced Drug Delivery Reviews 2008. 60. 13-28).
최근 체내 생활성 기간을 증대시키기 위하여 인간성장호르몬(hGH), 인간과립구콜로니자극인자(hC-GSF), 에리트로포이에틴(EPO) 등의 치료 단백질에 폴리에틸렌 글리콜화(페길화, PEGylation)를 시도하고 있다. 이와 같은 방법을 사용하여, 산화-환원에 의한 화학적 방법의 문제점을 대신하여 트랜스글루타미나아제 반응을 이용하여 위치 특이적 또는 선택적인 페길화를 진행하고 있다. 이러한 페길화 반응은 단백질 내부의 1개 이상의 글루타민기를 트랜스글루타미나아제가 인식하고 PEG에 아미노 그룹을 연결한 것을 아민 주개 기질로 하여 단백질과 PEG를 결합시키는 것이다(Anna Mero et al. Journal of Controlled Release. 2011. 154 27-34, Carlo Maullu et al. FEBS Journal. 2009. 276. 6741-6750, 미국등록공보 제6995245호).
단백질과 PEG와의 결합 외에도 단백질에 지질을 결합하기 위한 방법으로도 트랜스글루타미나아제를 이용하고 있다. 단백질에 지질을 결합시키기 위하여 기존에는 알려진 화학적 반응이나, EPL 매개나 솔타아제(sortase) 매개 효소 반응을 이용하였으나, 상기와 같은 방법들은 반응시간이 길고 수율이 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 그러나 트랜스글루타미나아제를 이용한 단백질-지질 결합체의 형성은 95% 이상의 결합 수율을 보였으며 기존의 방법에 비하여 시간을 단축시켰다(Hiroki Abe et al. Chem . Eur . J. 2011, 17, 14004-14008).
PEG 또는 지질을 호르몬과 같은 단백질에 트랜스글루타미나아제를 이용하여 연결시키기 위한 시도는 많이 있었으나, 항체에 있어서는 트랜스글루타미나아제를 적용하기에 어려운 점이 있었다. 한 예로, 천연형 chCE7 항체와 리툭시맵(Rituximab)에는 많은 글루타민 잔기가 이미 존재하고 있음에도 불구하고, 박테리아 트랜스글루타미나아제를 이용하여 반응시켰을 때, 어떤 아민 주개 기질에 의해서도 변형이 일어나지 않았다. 이때, 항체 내부 글리코실화(glycosylation)를 제거하는 효소를 처리하는 경우 트랜스글루타미나아제에 의한 반응이 일어나는 결과에 비추어볼 때, 항체에 적용하는 데 있어서는 항체의 글리코실화 등이 트랜스글루타미나아제 반응을 일으키지않는 것에 관여하는 것으로 보인다(Simone Jeger et al. Angew . Chem . Int . Ed. 2010, 49, 9995-9997). 항체의 글리코실화와 같은 당화는 항체의 이펙터로서의 기능 및 약동학에 있어서 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 즉, 항체 내부의 당쇄 구조를 변경시키면 항체의 기능에 영향을 미치는 문제점을 가지게 된다. 따라서 항체의 생체 내에서의 기능에 요구되는 당쇄 구조를 손상시키지 않으면서도 항체와 약물을 트랜스글루타미나아제를 이용하여 연결시키는 구성에 대해서는 여전히 미지의 분야이다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 항체의 당쇄 구조를 변경시키지 않고도, 트랜스글루타미나아제를 이용하여 약물을 항체에 연결시킨 결합체를 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 항체에서 구조적으로 노출된 부위에 인위적으로 글루타민 잔기를 삽입하여 변이된 항체를 제조하고, 이에 자유 아민기를 가지는 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜, 특정 글루타민 잔기의 위치에 특이적으로 약물을 결합시키는 항체-약물 결합체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 항체-약물 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)으로 연결된, 항체-약물 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 항체-약물 결합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된 변이된 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 변이된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물, 또는 항체-약물 결합체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 항체-약물 결합체의 제조 방법은 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하며, 바람직하게는 (a) 글루타민을 포함하는 변이된 항체의 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 변이된 항체를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 변이된 항체를 자유 아민기를 포함하는 약물과 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "트랜스글루타미나아제(transglutaminase, TGase)"는 자유 아민기와 글루타민의 카복사아마이드(carboxamide)기 간에 공유결합을 형성하는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 트랜스글루타미나아제는 변이된 항체의 도입된 글루타민과 자유 아민기를 포함하는 약물의 아민기 간에 공유결합을 형성시키는 효소를 의미할 수 있으며, 상기 트랜스글루타미나아제를 이용하여 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물 간에 결합을 형성시켜, 항체-약물 결합체를 형성시킬 수 있다. 또한, 상기 트랜스글루타미나아제가 글루타민의 카복사아마이드와 라이신의 입실론 아민기 간에 공유결합을 형성하는 경우에는 아실 트랜스퍼 반응을 통하여 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)을 형성할 수 있다. 상기 트랜스글루타미나아제에는 본 발명의 변이된 항체에 존재하는 글루타민의 감마-카복사아마이드와 자유 아민기 간에 공유결합을 촉매시킬 수 있는 단백질은 제한없이 포함될 수 있으며, 그 예로 원핵생물, 세균 또는 포유생물로부터 유래한 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 박테리아에서 유래한 트랜스글루타미나아제를 이용하였다.
본 발명에서 용어, "항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate, ADC)"는 변이된 항체와 약물이 연결된 결합체를 의미하며, 면역접합체(immunoconjugate)로도 불릴 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 항체-약물 결합체는 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기을 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜 얻은 결합체일 수 있다. 상기 항체-약물 결합체에는 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합를 통하여 연결된 결합체 형태를 포함한다. 상기 이소펩타이드 결합은 프로테아제에 의해서도 쉽게 분해되지 않는 안정한 결합이므로, 이소펩타이드 결합을 포함하는 본 발명의 결합체는 혈류에 안정하여 약물이 항체에서 분리되는 것을 막아 타겟에 도착할 때까지 프로드럭(prodrug) 상태로 유지시켜 정상적인 조직에 영향을 최소화할 수 있다.
상기 항체-약물 결합체는 암 세포와 같은 특정 세포에 존재하는 항원을 인지하여 결합할 수 있는 항체에 약물을 결합함으로써, 항체가 결합하는 특정 세포에 약물을 전달시킬 수 있으므로, 이를 질병의 치료에 이용할 수 있다. 따라서, 상기 항체-약물 결합체가 암과 같은 특정 질병의 치료에 사용할 수 있는 약물과 그 질병에 특이적인 항원을 인지하는 항체가 결합한 형태인 경우, 암과 같은 질병의 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게는 상기 항체-약물 결합체의 항체는 치료용 항체로서, 치료효과 면에서 치료용 항체와 약물을 각각 사용하는 경우에 비하여 시너지 효과를 보일 수 있다.
또한, 상기 항체-약물 결합체는 항체에 글루타민을 도입한 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜 얻은 결합체일 수 있으며, 그 예로 IgG 형태의 항체에 글루타민을 도입한 변이된 항체와 mPEGamine을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜 얻은 결합체 또는 IgG 형태의 항체에 글루타민을 도입한 변이된 항체와 라이신 잔기를 포함하는 mcMMAF를 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜 얻은 결합체 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 상기 항체-약물 결합체는 약물을 변이된 항체의 특정 부위에 위치특이적으로 결합시킨 형태를 의미할 수 있다. 본 발명에서는 항체에 트랜스글루타미나아제와 특이적으로 반응하는 글루타민을 도입함을 통하여, 위치특이적으로 약물을 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체-약물 결합체는 항체의 항원 결합력에 영향을 미치지 않는 형태로 약물이 결합된 형태로 제조될 수 있으므로, 항체의 항원에 대한 결합력이 중요하게 작용하는 항체-약물 결합체를 이용한 질병의 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 항체에 글루타민을 도입한 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 반응시켜 얻을 수 있는 결합체의 형태의 예를 도 1에 모식도로 나타내었다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab' F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 천연형(wild type) 항체, 항체단편 및 상기 항체 또는 항체 단편의 라이신(lysine, K)과 같은 특정 아미노산이 제거된 유전공학적으로 변형된 형태도 포함하며, 특히, IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 또는 N 말단에 위치한 라이신이 제거된 형태를 포함한다. 상기 항체의 중쇄의 C 말단에 존재하는 마지막 라이신이 제거되지 않는 경우 약물과의 결합보다는 항체 중쇄 간의 결합이 우선적으로 나타날 수 있으므로, 항체의 중쇄의 C 말단에 존재하는 라이신을 제거하는 것이 변이된 항체의 제조 및; 제조된 변이된 항체를 이용한 항체-약물 결합체의 제조에 바람직하다. 이와 같은 라이신의 제거는 사용하는 항체 또는 항체 단편의 종류 및 그 서열을 확인하고 항체와 약물이 결합될 부위를 고려하여 당업계의 통상적인 기술을 이용하여 제거될 수 있다.
본 발명에서 용어, "글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체"는 글루타민을 포함하도록 변이시킨 항체를 말하며, 그 예로 항체에 글루타민(glutamine, Q)을 치환(substitution) 또는 삽입(addition)하거나 글루타민을 포함하는 펩타이드를 부착시킨 형태를 포함한다. 상기 변이된 항체는, 바람직하게는 전장항체 또는 항체 단편에 글루타민을 포함하는 펩타이드를 부착시킨 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 글루타민을 치환시킨 형태의 변이된 항체는 글리코실화와 같은 당화에 관여하지 않은 잔기를 치환하여 제조된 것일 수 있으며, 이와 같은 변이된 항체는 항체의 당쇄 구조를 제거하지 않으면서도 약물을 결합시킬 수 있는 이점이 있다. 또한, 상기 글루타민을 포함하는 펩타이드를 항체에 연결하는 형태는 유전공학적으로 제작할 수 있으며, 바람직하게는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 또는 N 말단에 연결된 형태일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에 연결된 형태일 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 항체의 중쇄의 C 말단에 연결된 형태일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 글루타민을 포함하는 변이된 항체는 트랜스글루타미나아제의 기질로서 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 글루타민을 포함하는 변이된 항체는 바람직하게는 글리코실화(glycosylation)에 관여하는 아미노산을 글루타민으로 치환한 형태가 아닌, 글리코실화에 영향을 크게 미치지 않으면서 글루타민을 추가로 삽입 또는 치환하거나 글루타민을 포함하는 펩타이드를 부착하여 제조한 형태이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 글리코실화에 관여하는 아미노산을 글루타민으로 치환시킨 변이된 항체가 아닌, 항체 말단에 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있는 특정 글루타민을 도입한 변이된 항체를 제조하여, 이를 트랜스글루타미나아제의 존재 하에서 라이신을 포함하는 약물과 결합시켰다. 이와 같은 변이된 항체는 항체의 글리코실화와 같은 당화에는 거의 영향을 미치지 않으면서도 약물과 특이적으로 결합될 수 있는 이점을 지닌다. 본 발명의 일 실시예에서는, 글루타민을 포함하는 펩타이드를 IgG 항체의 중쇄의 C 말단에 연결한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하여, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 함께 CHO-S 세포에 형질도입하여 이를 발현시킴으로써, IgG 항체의 C 말단에 글루타민을 포함하는 펩타이드가 연결된 변이된 항체를 제작하였다(실시예 1 및 2).
본 발명에서 용어, "글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드"는 글루타민을 1개 이상 포함하는 펩타이드를 의미하며, 본 발명의 목적상 트랜스글루타미나아제에 의하여 라이신과 연결될 수 있는 글루타민을 포함하는 펩타이드라면 제한없이 포함된다. 상기 글루타민을 포함하는 펩타이드는 그 예로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 펩타이드 내의 글루타민은 다양한 위치에서 존재할 수 있으며, 상기 펩타이드는 1개 이상의 글루타민을 포함할 수 있다. 트랜스글루타미나아제는 단백질 내의 유동적인 부분에 위치한 글루타민을 인지하는 것으로 알려져 있으며(Angelo Fontana et al. Advanced Drug Delivery Reviews 2008. 60. 13-28), 상기 단백질 내의 유동적인 부분은 체인 유동성(chain flexibility)이 큰 단백질 내의 일부분으로서, 고정된 3차 구조를 가지지 않거나 또는 부분적인 언폴딩(unfolding)된 부분을 포함한다. 따라서 상기 글루타민을 포함하는 펩타이드는 글루타민이 고정된 3차 구조가 아닌 유동적인 부분에 위치한 것이라면, 아미노산 개수에 상관없이 상기 글루타민을 포함하는 펩타이드에 포함될 수 있다. 본 발명에서는 대표적으로 8개의 아미노산으로 구성되고, 글루타민이 말단 부위에 위치한 GGGSLLQG(서열번호 1), 4개의 아미노산으로 구성된 LLQG(서열번호 2), 11개의 아미노산으로 구성되고 글루타민이 중간 부분에 위치한 GGGGSLAQSHA(서열번호 3), 글루타민이 앞쪽에 위치한 GQGGGSLASHA(서열번호 4) 및 16개의 아미노산으로 구성된 NNDSTEYGLFQINNGI(서열번호 5)로 표시되는 펩타이드를 통하여 다양한 길이와 다양한 위치의 글루타민을 가진 펩타이드가 본 발명의 글루타민을 포함하는 펩타이드에 포함될 수 있음을 확인하였으므로, 글루타민의 위치 또는 펩타이드의 길이에 관계없이 본 발명의 펩타이드에 포함될 수 있음은 자명하다.
본 발명의 목적상 상기 글루타민을 포함하는 펩타이드는 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있는 글루타민을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드에 존재하는 글루타민의 카복사아마이드(carboxamide)는 트랜스글루타미나아제에 의하여 아민(amine)기와 연결될 수 있다. 또한, 상기 글루타민은 펩타이드의 말단 또는 중간 등 펩타이드의 어느 위치에 존재하더라도 트랜스글루타미나아제에 의해 자유 아민기를 지닌 분자와 연결될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 펩타이드의 중간 또는 끝부분에 위치하는 글루타민이 트랜스글루타미나아제에 의하여 mPEGamine과 연결되며, 항체-약물 결합체로서 효능을 나타냄을 확인하였다(도 2 내지 5).
본 발명에서 용어, "자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물"은 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있는 아민기를 지닌 약물을 의미하며, 보다 바람직하게는 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 트랜스글루타미나아제의 존재하에 연결될 수 있는 아민기를 포함하는 약물을 의미하며, 그 예로 글루타민을 포함하는 펩타이드가 항체에 연결된 형태의 변이된 항체와 트랜스글루타미나아제의 존재하에 연결될 수 있는, mPEGamine 또는 라이신을 포함하도록 제조된 mcMMAF(maleimidocaproyl-monomethylauristatin F)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 자유 아민기를 포함하는 약물은 본래 아민기를 지니는 것일 수도 있지만, 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있는 자유 아민기를 갖는 형태로 합성 또는 유전공학적으로 제작되는 것일 수 있으며, 그 예로 입실론 아민기 또는 라이신을 포함하도록 약물을 합성하는 방법으로 제작할 수 있다. 라이신을 포함하도록 약물을 합성하는 방법은 당업계에 사용되는 여러 방법이 이용될 수 있으며, 그 예로 말레이미드 기와 시스테인의 티올기(thiol group) 간의 결합을 이용하여 말레이미드 기를 가진 약물과, 시스테인 및 라이신 잔기를 포함하는 펩타이드를 티오에테르(thioether) 결합으로 연결시켜, 라이신을 포함하는 약물을 합성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 mcMMAF에 라이신을 포함하도록 하기 위하여, KGEGRGSGC(서열번호 6)의 서열을 가지는 펩타이드를 mcMMAF에 연결시켜, 자유 아민기를 포함하는 약물을 제조하였다.
본 발명에서 용어, "자유 아민기(free amine group)"는 트랜스글루타미나아제에 의해서 글루타민의 카복사아마이드와 아실 트랜스퍼 반응을 통하여 연결될 수 있는 작용기를 의미하며, 바람직하게는 라이신(lysine, K)에 존재하는 입실론 아민(ε-amine)을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약물"은 본 발명의 항체에 결합하여 치료 항체 자체의 치료 효율을 증가시킬 수 있거나, 항체의 혈중 내의 반감기를 증가시킬 수 있거나, 항체가 표적으로 하는 위치에 도달하여, 상기 표적 내의 암 등을 사멸시켜서 질병의 치료에 사용할 수 있는 물질을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 세포독성약물(cytotoxic drug), 독소(toxin) 또는 안정화제일 수 있다.
본 발명에서 용어, "세포독성약물"은 질병의 치료에 사용될 수 있는 약물을 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 세포독성약물은 트랜스글루타미나아제의 존재하에서 변이된 항체와 결합될 수 있는 약물일 수 있으며, 개체의 질병의 치료에 이용될 수 있는 약물을 의미할 수 있다. 상기 세포독성약물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제 또는 DNA 인터컬레이터(intercalator)일 수 있으며, 그 예로 메이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 칼리케아미신(calicheamicin), 피롤로벤조디아제피네스(pyrrolobenzodiazepines), 독소루비신(doxorubicin), 듀오카마이신(duocamycin), 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니드란(nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[nitrogen mustar(mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 시타라빈(cytarabine), 플루로우라실(flurouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 메토크렉세이트(methotrexate), 에토포시드(etoposide), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(alimta), 알트레타민(altretamine), 프로카바진(procarbazine), 탁솔(taxol), 탁소텔(taxotere), 토포테칸(topotecan) 또는 이리노테칸(irinotecan)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "독소(toxin)"는 생물체가 만들어내는 독성을 가지는 약물을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 독소는 변이된 항체와 결합하여 개체의 질병의 치료에 이용될 수 있는 독소를 의미할 수 있다. 상기 독소는 이에 제한되지는 않으나, 균체외 독소 또는 식물독소일 수 있다.
본 발명에서 용어, "안정화제"는 단백질에 결합하여 단백질의 생체 내 반감기를 증대시킬 수 있는 약물을 의미하며, 바람직하게는 항체 또는 변이된 항체에 결합하여 항체 또는 변이된 항체의 생체 내 반감기를 증대시킬 수 있는 약물을 의미하며, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(PEG, Polyethylene glycol) 또는 히알루론산을 의미할 수 있다. 상기 안정화제는 트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있도록 아민(amine)기를 지닌 형태일 수 있으며, 그 예로 mPEGamine일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 IgG 항체의 중쇄의 C 말단에 글루타민을 포함하는 4 내지 16개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 연결한 변이된 항체를 제작하여, 이를 트랜스글루타미나아제의 존재하에 자유 아민기를 지닌 mPEGamine 또는 mcMMAF와 반응시켜, IgG 항체에 mPEGamine 또는 mcMMAF이 연결된 항체-약물 결합체를 제조하였다(실시예 1 내지 5).
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 항체-약물 결합체를 제공한다. 상기 방법 및 항체-약물 결합체는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합으로 연결된, 항체-약물 결합체를 제공한다.
상기 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "이소펩타이드 결합(isopeptide bond)"은 라이신 곁사슬의 아민기(ε-아민기)와 글루타민이나 아스파라긴 곁사슬의 카르복실기(γ또는 β-카르복실기, 또는 카복사아마이드) 사이에 형성되는 펩티드결합을 의미하며, 바람직하게는 라이신 곁사슬의 아민기와 글루타민의 카르복실기 사이에 형성되는 펩티드 결합을 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 이소펩타이드 결합은 트랜스글루타미나아제에 의해 형성된 결합을 의미할 수 있다. 상기 이소펩타이드 결합은 프로테아제에 대한 내성을 가지는 안정한 결합으로, 개체의 혈액 내에서도 혈류에 안정하여 항체와 약물이 연결된 형태를 안정하게 유지시킬 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 항체-약물 결합체는 변이된 항체와 자유 아민기를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합을 통해 연결된 형태의 결합체일 수 있으며, 바람직하게는 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 자유 아민기를 포함하는 약물이 변이된 항체와 이소펩타이드 결합을 통하여 연결된 형태의 결합체일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체-약물 결합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항체, 약물 및 결합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "치료"란 상기 조성물의 투여로 상기 암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체-약물 결합체를 이용하여 선택적으로 사멸시킬 수 있는 암을 의미할 수 있으며, 상기 항체-약물 결합체를 이용하여 치료 가능한 암은 제한 없이 이에 포함될 수 있으며, 그 예로 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 또는 신경계의 암이 있으며, 구체적으로 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다. 본 발명의 항체-약물 결합체는 암의 치료에 이용되는 세포독성물질, 독소 또는 안정화제를 암의 치료에 사용할 수 있는 변이된 항체에 위치특이적으로 결합시킨 형태일 수 있으며, 이는 본래 항체의 항원인지에 영향을 주지 않으면서도 약물을 더하여 의약품적 효능을 보다 효과적으로 상승시킨 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 변이된 항체는 항체의 효과기(effector) 기능 및 약동학에 중요한 역할을 하는 글리코실화(glycosylation)와 같은 당화에 영향을 거의 주지 않는 형태를 포함하므로, 상기 변이된 항체에 약물을 결합시킨 항체-약물 결합체를 암 치료에 사용하는 경우, 기존 약물 또는 항체 단독으로 사용하는 것에 비하여 그 효과를 훨씬 더 증대시킬 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 암 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고
투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물을 효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 항-HER2 항체에 글루타민을 포함하는 펩타이드를 연결시킨, 항-HER2 항체의 변이체에 라이신을 포함하는 mcMMAF 약물을 트랜스글루타미나아제의 존재하에 결합시켜 항체-약물 결합체를 제조하였고(실시예 1, 2, 4 및 5), 상기 항체-약물 결합체가 HER2를 고발현하는 유방암 세포주에서 HER2 항원에 특이적으로 결합함으로써 우수한 항-증식 효과를 나타냄을 확인하였고(실시예6), 허셉틴 저항성이며, HER2를 고발현하는 JIMT-1 세포를 이식한 이식이종마우스를 이용하여 그 효과를 확인한 결과, 항-HER2 항체인 트라스투주맙에 비하여 현저히 우수한 종양 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 7).
또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된 변이된 항체를 제공한다.
상기 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 변이된 항체는 글루타민을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된 형태의 단백질을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 글루타민을 포함하는 펩타이드가 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 또는 N 말단에 융합된 단백질을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글루타민을 포함하는 펩타이드가 항체의 중쇄의 C 말단에 융합된 단백질을 의미할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 변이된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 변이된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 변이된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 변이된 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 변이된 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제
한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293T, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 CHO-S 세포를 숙주세포로 이용하였다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 변이된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물, 또는 항체-약물 결합체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항체-약물 결합체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 사용될 수 있는 담체, 암 및 투여는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 항체-약물 결합체를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 항체-약물 결합체는 자유 아민기를 포함하는 약물이 글루타민을 포함하는 변이된 항체에 위치특이적으로 결합된 결합체로서 동질성이 높으며, 화학적으로 약물과 항체를 결합시킨 형태에 비하여 화학적 반응을 적게 거치므로 변형된 형태가 적게 생산되는 이점을 지닌다.
도 1은, 변형된 단일 클론 항체와 약물을 결합시킨 항체-약물 결합체를 나타내는 모식도이다. 여기서 Q는 글루타민을 나타내는 것이다.
도 2는, 글루타민을 포함하는 IgG 항체에 mPEGamine(1KDa)을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase, TGase) 존재하에서 반응시킨 후, 이를 전기영동하여 쿠마시 블루 염색(coomassie blue staining)한 SDS-PAGE 결과이다. 도 2에서 (A)는 글루타민을 도입하지 않은 천연형 IgG 항체(항-Her2 항체)와의 반응 결과(레인 1), 글루타민을 도입하지 않은 천연형 IgG 항체(항-Her2 항체)와 mPEGamine 간의 반응결과(레인 2), 글루타민을 도입하지 않은 천연형 IgG 항체(항-Her2 항체), mPEG amine을 TGase의 존재하에 반응시킨 결과(레인 3)를 나타내는 것이다. 도 2의 (B)는 글루타민을 포함하도록 변형된 항체인 T-KM1과 mPEGamine간의 반응결과(레인 4), T-KM1과 TGase와의 반응 결과(레인 5), T-KM1, mPEGamine 및 TGase와의 반응 결과(레인 6)를 나타낸다. 레인 6에서 항체의 중쇄(HC, Heavy chain)에 PEG가 부착되어, 밴드가 레인 4 및 5에 비하여 높은 위치에 존재함을 알 수 있다. 도 2의 (C)는 글루타민을 포함하도록 변형된 항체인 T-KM2과 mPEGamine간의 반응결과(레인 7), T-KM2과 TGase와의 반응 결과(레인 8), T-KM2, mPEGamine 및 TGase와의 반응 결과(레인 9), T-KM3과 mPEGamine간의 반응결과(레인 10), T-KM3과 TGase와의 반응 결과(레인 11), T-KM3, mPEGamine 및 TGase와의 반응 결과(레인 12)를 나타낸 SDS-PAGE 결과이다. 도 2의 (D)는 글루타민을 포함하도록 변형된 항체인 T-KM4와 TGase와의 반응 결과(레인 13), T-KM4와 mPEGamine간의 반응결과(레인 14), T-KM4, mPEGamine 및 TGase와의 반응 결과(레인 15), T-KM10과 TGase와의 반응 결과(레인 16), T-KM10과 mPEGamine간의 반응결과(레인 17), T-KM10, mPEGamine 및 TGase와의 반응 결과(레인 18)를 나타낸 SDS-PAGE 결과이다. 상기 도에서 HC는 항체의 중쇄(Heavy chain), LC는 경쇄(light chain), TGase는 트랜스글루타미나아제를 의미하며, HC-PEG(1K)는 항체의 중쇄에 PEG가 결합된 것을 나타낸다.
도 3은, 제조한 항체-약물 결합체를 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석한 그래프이다. 이는 HIC(hydrophobicity interaction column)을 이용하여 분석한 것으로, (B)에서 보는 바와 같이 약물이 결합하지 않은 형태(Antibody), 약물이 하나 결합한 형태(Ab-MMAF (1)), 약물이 두 개 결합한 형태(Ab-MMAF (2))가 각기 다른 피크로 분리되어 나타났다. (A)는 항체 단독을 HPLC 분석한 것으로, 제조한 항체-약물 결합체를 분석할 때 약물이 결합하지 않은 형태를 구분하기 위하여 대조군으로 사용한 것이다.
도 4는, 항 세포증식 실험법(anti-proliferation assay)을 수행한 것으로, 유방암 세포주에 항체-약물 결합체를 처리하여 살아있는 세포를 퍼센트로 나타낸 그래프이다. (A)는 BT474 세포주, (B)는 JIMT-1 세포주, (C)는 MCF7 세포주에서 항-HER2 항체 또는 본 발명의 항체-약물 결합체를 처리한 결과를 나타낸 것이다. T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF, T-KM3-MMAF는 글루타미나아제를 이용하여 T-KM1, T-KM2, T-KM3에 세포 독성 약물인 MMAF를 각각 결합시킨 항체-약물 결합체이다.
도 5는, JIMT-1 세포주를 이용하여 이종이식 마우스에서 본 발명의 항체-약물 결합체의 효능시험을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 글루타민( glutamine )을 포함하는 변이된 항- Her2 항체의 발현 벡터 제조
트랜스글루타미나아제와 반응할 수 있는 글루타민을 포함하는 변이된 항체를 제조하기 위하여, 항-Her2 항체를 이용하였다.
항-Her2 항체의 중쇄 아미노산 서열의 C 말단 마지막에 존재하는 라이신을 빼고, 글루타민을 포함하는 펩타이드인 GGGSLLQG(서열번호 1), LLQG(서열번호 2), GGGGSLAQSHA(서열번호 3), GQGGGSLASHA(서열번호 4), 또는 NNDSTEYGLFQINNGI(서열번호 5)의 아미노산 서열을 연결시켜 아미노산 서열을 변형하였다. GGGSLLQG(서열번호 1)를 포함하는 중쇄를 가지는 항체를 T-KM1으로, LLQG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄를 가지는 항체를 T-KM2로, GGGGSLAQSHA(서열번호 3)를 포함하는 중쇄를 가지는 항체를 T-KM3으로, GQGGGSLASHA(서열번호 4)을 포함하는 중쇄를 가지는 항체를 T-KM10으로, NNDSTEYGLFQINNGI(서열번호 5)를 포함하는 중쇄를 가지는 항체를 T-KM4로 명명하였다.
그 다음, 상기의 글루타민을 포함하는 펩타이드가 연결된, 변형된 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제작하였다.
PCR을 수행하기 위해 하기와 같은 프라이머를 주문제작하여 사용하였다. 이때, 주형 DNA는 항-Her2 항체의 중쇄 부분을 발현하는 벡터를 사용하였다. T-KM1의 중쇄를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 사용한 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 8로 표시하였으며(표 1), T-KM2의 중쇄를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 사용한 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 9로 표시하였다(표 2). PCR을 통하여 증폭된 단편을 BsrGI 및 NotI으로 자른 후, BsrGI 및 NotI으로 자른 항-Her2 항체 중쇄 부분 발현벡터에 삽입하였다.
T-KM1 중쇄 발현 벡터 제조를 위해 필요한 프라이머 이름 및 그 서열
이름 서열 서열번호
BsrGI-201A for CCC AGG TGT ACA CCC TGC CC 서열번호 7
No K TG1 rev CGA GCG GCC GCT CAG CCC TGC AGC AGG GAG CCG CCG CCG CCG GGG GAC AGG GAC AG 서열번호 8
T-KM2 중쇄 발현 벡터 제조를 위해 필요한 프라이머 이름 및 그 서열
이름 서열 서열번호
BsrGI-201A for CCC AGG TGT ACA CCC TGC CC 서열번호 7
No K LLQG rev CGA GCG GCC GCT CAG CCC TGC AGC AGG CCG GGG GAC AGG GAC AG 서열번호 9
T-KM3의 중쇄를 발현하는 벡터 제조를 위하여, 하기 표 3에 표시한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 주형 DNA로는 항-Her2 항체의 중쇄 부분을 발현하는 벡터를 사용하였다. 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 10으로 표시하였다. PCR을 통하여 증폭된 단편을 BsrGI, NotI으로 자른후, 이를 BsrGI 및 NotI으로 자른 항-Her2 중쇄 부분을 발현하는 벡터에 삽입하였다. 상기와 같은 방법으로 제조된 벡터를 TG3로 명명하였다.
TG3 벡터를 주형 DNA로 하여 다시 PCR을 수행하였다. 사용한 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 11으로 표시하였다. TG3 벡터를 BsrGI 및 BamHI으로 다시 자른 후, TG3 벡터를 주형으로 하여 얻은 PCR 생산물을 BsrGI, BamHI으로 잘라 삽입하였다. 이렇게 하여 T-KM3의 중쇄를 발현할 수 있는 벡터를 제작하였다.
T-KM3 중쇄 발현 벡터 제조를 위해 필요한 프라이머 이름 및 그 서열
이름 서열 서열번호
BsrGI-201A for CCC AGG TGT ACA CCC TGC CC 서열번호 7
TG-QSHA_rev TTT GCG GCC GCT CAG GCG TGG GAC TGG GCC AGG GAT CCG CCG CCG CCC TTG CCG GGG GAC AGG GA 서열번호 10
No K BamHI rev TTT GGA TCC GCC GCC GCC GCC GGG GGA CAG GGA CAG 서열번호 11
또한, T-KM4 및 T-KM10의 중쇄를 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, 주형 DNA로 항-Her2 항체의 중쇄 부분을 발현하는 벡터를 사용하여 PCR을 수행하였다.
T-KM4의 중쇄를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 사용한 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 12로 표시하였으며(표 4), T-KM10의 중쇄를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 사용한 정방향 프라이머는 서열번호 7로, 역방향 프라이머는 서열번호 13으로 표시하였다(표 5). PCR을 통하여 증폭된 단편을 BsrGI 및 NotI으로 자른 후, BsrGI 및 NotI으로 자른 항-Her2 항체 중쇄 부분 발현벡터에 삽입하였다.
T-KM4 중쇄 발현 벡터 제조를 위해 필요한 프라이머 이름 및 그 서열
이름 서열 서열번호
BsrGI-201A for CCC AGG TGT ACA CCC TGC CC 서열번호 7
T-KM4 rev TCG AGC GGC CGC TCA GAT GCC GTT GTT GAT CTG GAA CAG GCC GTA CTC GGT GGA GTC GTT GTT GCC GGG GGA CAG GGA CAG 서열번호 12
T-KM10 중쇄 발현 벡터 제조를 위해 필요한 프라이머 이름 및 그 서열
이름 서열 서열번호
BsrGI-201A for CCC AGG TGT ACA CCC TGC CC 서열번호 7
T-KM10 rev AAA GCG GCC GCT CAG GCG TGG GAG GCC AGG GAT CCG CCG CCC TGG CCG CCG GGG GAC AGG GAC AG 서열번호 13
항-Her2 항체의 경쇄를 발현하는 벡터는 변형 없이 그대로, 3종의 항체 생산 모두에 공통으로 사용하였다.
실시예 2: 글루타민( glutamine )을 포함하는 변이된 항- Her2 항체 및 항- Her2 천연형 항체의 제조
T-KM1, T-KM2, T-KM3, T-KM4 및 T-KM10 항체 각각의 중쇄를 발현하는 벡터 및 경쇄를 발현하는 벡터를 CHO-S 세포에 PEI(Polyethylenimine)를 이용하여 형질도입(transfection)하였다. 이에 대한 대조군으로 글루타민을 포함하지 않은 항-Her2 천연형 항체를 사용하여, 상기 천연형 항체의 중쇄를 발현하는 벡터 및 경쇄를 발현하는 벡터를 CHO-S 세포에 PEI를 이용하여 형질도입하였다. 형질도입 후, 4일간 배양한 다음, 발현된 T-KM1, T-KM2, T-KM3, T-KM4, T-KM10 및 항-Her2 천연형 항체를 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼(Hitrap MabSelect Sure, 5 mL, GE healthcare)으로 정제하여 제조하였다.
실시예 3: 트랜스글루타미나아제 ( Transglutaminase ) 반응을 이용한 변이된 항- Her2 항체- PEG 결합체의 제조
상기 실시예에서 제작한 본 발명의 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체들이 실제로 트랜스글루타미나아제 반응 기작을 통하여 기질과 결합할 수 있는지를 확인하기 위하여, 우선 기질로서 자유 아민기(free amine group)를 가지는 mPEGamine(mexoxy PEG-NH2)을 사용하여 트랜스글루타미나아제 반응을 진행하였다. 트랜스글루타미나아제 반응 기작을 통해 mPEGamine의 아민기가 글루타민 잔기에 결합할 수 있음은 알려져 있으므로(Anna Mero et al. Journal of Controlled Release. 2011. 154 27-34, Carlo Maullu et al. FEBS Journal. 2009. 276. 6741-6750), 기질로서 mPEGamine을 사용하였다.
글루타민을 포함하지 않은 항-Her2 천연형 항체, T-KM1, T-KM2 또는 T-KM3 항체를 1mg/ml, 기질 mPEGamine(Laysan Bio, 미국) 400μM, 미생물 트랜스글루타미나아제(zedira, 독일) 1U/ml이 되도록 PBS(phosphate buffered saline, pH8.0)에 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양한 물질을 환원 조건으로 4 내지 12 퍼센트 Nu-PAGE(인비트로젠, 미국) 젤에 로딩하였다. 상기 젤은 코마시 블루 염색법(coomassie blue staining)으로 염색한 다음, 결과를 확인하였다. 또한, T-KM4 또는 T-KM10 항체를 이용하여 상기와 같은 실험을 동일하게 수행하였다.
환원 조건으로 젤에 항체를 로딩한 경우, 항체의 경쇄와 중쇄가 각 50KDa 과 25KDa 근처에서 분리되어 나타나게 되며, mPEGamine(1K)가 항체의 중쇄 또는 경쇄에 결합하게 되면 중쇄 및 경쇄의 본래의 젤 상의 밴드 위치에서 밴드가 위로 올라가게 되므로, 상기와 같은 현상을 확인함을 통하여 본 발명의 변이된 항체의 트랜스글루타미나아제와의 반응성을 확인할 수 있다.
그 결과, 먼저 글루타민을 포함하지 않은 항-Her2 천연형 항체의 경우, 항-Her2 천연형 항체, mPEGamine 및 트랜스글루타미나아제를 모두 넣어준 경우에도 중쇄 및 경쇄의 밴드의 위치가 변하지 않았으므로, 항-Her2 천연형 항체의 경우, PEG와 결합하지 않았음을 나타내었다(도 2 (A)의 3번 레인).
천연형 항체에 글루타민을 포함하는 펩타이드를 연결한 변이된 항체 T-KM1, T-KM2, T-KM3, T-KM4 및 T-KM10의 경우, 항체 중쇄의 말단에 글루타민을 포함하고 있으므로, mPEGamine과 트랜스글루타미나아제를 모두 넣어 반응을 진행시켰을 때 항체 중쇄의 밴드의 위치가 올라간 결과를 보여주었다(도 2 (B), (C) 및 (D)의 6, 9, 12, 15 및 18번 레인). 이는 PEG가 항체의 중쇄에 결합하여 분자량이 증가했음을 나타내는 것이다.
또한, 경쇄의 경우 밴드 위치에 변화를 나타내지 않았으므로, 이러한 결과는 글루타민을 인위적으로 도입한 중쇄의 경우에만 mPEGamine과 결합을 특이적으로 형성함을 나타내었다(도 2 (B), (C), (D)).
이러한 결과는 트랜스글루타미나아제가 인위적으로 도입한 글루타민을 가지는 항체와 라이신의 입실론 아민기와 유사한 아민기를 포함하는 기질인 mPEG Amine을 효과적으로 결합시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 4: 세포 독성 약물의 합성
트랜스글루타미나아제 반응을 이용하여 항체-세포 독성 약물 결합체를 제조하기 위하여, 우선 라이신 또는 라이신 유도체를 포함하는 세포 독성 약물을 합성하였다.
이에 대표적인 세포 독성 약물로서, mcMMAF(maleimidocaproyl-monomethyl auristatin F)을 사용하여, mcMMAF에 라이신을 포함하도록 하기 위하여 KGEGRGSGC(서열번호 6)과 연결시켰으며, 구체적으로 mcMMAF의 말레이미드 기(Maleimide group)와 시스테인(cysteine) 간의 결합을 이용하여 mcMMAF 및 서열번호 6의 펩타이드를 서로 연결시켰다.
실시예 5: 트랜스글루타미나아제 반응을 이용한 항체- 세포독성약물의 결합체의 제조
글루타민을 포함하는 변이된 항체인 T-KM1, 2 또는 3; 미생물 트랜스글루타미나아제(zedira, 독일); 및 실시예 4에서 제조한 세포 독성 약물을 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 6시간 배양하였고, 이 혼합물을 HPLC(high performance liquid chromatography)로 항체에 약물이 결합한 정도를 확인하였으며, 구체적으로 Butyl NRP(4.6*35, TSKgel) 컬럼으로 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3 A는 항체 단독을 HPLC로 분석한 것으로서, 본 발명에서 제조된 항체-약물 결합체 분석시 약물이 결합하지 않은 형태를 구분하기 위한 대조군의 실험 결과를 나타내는 것이다. 도 3 B는 상기 변이된 항체와 약물을 트랜스글루타미나아제 존재하에 반응시킨 항체 혼합물을 분석한 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 변이된 항체와 약물이 트랜스글루타미나아제 존재하에 항체-약물 결합체를 형성한 결과를 나타내었다. 또한, 항체에 약물이 하나 결합한 형태(Ab-MMAF(1)으로 표기)와 두 개 결합한 형태(Ab-MMAF(2)로 표기)를 나타내어, 이 분석 방법을 통하여 항체-약물 결합체의 약물 결합 개수를 측정할 수 있음을 시사하였다.
실시예 6: 항체- 세포독성약물 결합체의 항-증식( anti - proliferation ) 분석법
제조한 항체-세포독성약물 결합체의 인 비트로(in vitro) 효능을 확인하기 위하여, BT474, MCF7 및 JIMT-1 세포주를 이용하여 항-증식 어세이(anti-proliferation assay)를 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 각 세포를 배양하여 BT474 세포는 1x105세포/㎖, MCF7 및 JIMT-1 세포는 2x104세포/㎖로 현탁하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 로딩하였다. 그 다음, 세포 배양기에서 3시간 배양 후, 웰당 다양한 농도 구간의 항체 또는 항체-약물 결합체를 각각 100㎕씩 넣고 세포 배양기에서 5일간 배양하였다. 이때 사용한 항체는 항-Her2 항체였고, 항체-약물 결합체는 상기 실시예에 개시한 방법으로 트랜스글루타미나아제를 이용하여 결합시킨, T-KM1, T-KM2 또는 T-KM3에 약물 (MMAF)를 결합시킨 형태였다. 알라마 블루(인비트로젠, 미국)를 각 웰에 25㎕씩 처리한 다음, 호일에 싸서 세포 배양기에 6시간 처리하였고, 스펙트라맥스 제미닉스를 이용하여 530nm에서 형광강도를 측정하였다. 이렇게 측정한 형광 값은 세포 생장 정도를 나타내는 것으로, 이 형광 값을 바탕으로 하여 살아있는 세포의 퍼센트를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Her2가 고발현되어 있는 BT474 세포주에서 항-Her2 항체(Trastuzumab)를 1㎍/㎖로 처리하였을 때 65% 이상의 세포가 생장하고 있는 결과를 나타낸 것에 반하여, 본 발명의 항체-약물 결합체인 T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF, T-KM3-MMAF를 처리한 경우에는 세포의 생장이 현저하게 저하되어 약 20%의 생장율을 나타내었다(도 4 (A)). 또한, Her2가 고발현되지만 허셉틴 저항성을 가진 세포주로 알려진 JIMT-1 세포주에 항-HER2 항체 또는 본 발명의 항-HER2 항체-약물 결합체를 처리하여 세포 생장율을 확인하였고, 그 결과 항-Her2 항체를 처리하였을 때 세포의 증식 억제 없이 세포가 정상적으로 생장하고 있지만, 본 발명의 대표적인 항체-약물 결합체인 T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF 및 T-KM3-MMAF의 세 가지 결합체를 각각 처리한 경우 3 가지 모두 65 내지 70%의 세포 생장율을 나타내었다(도 4(B)). 음성 대조군으로 사용한 Her2 발현이 낮은 MCF-7 세포주에서는 항 Her2 항체뿐 아니라 본 발명의 대표적인 결합체인 T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF, T-KM3-MMAF를 처리한 경우 모두 세포 생장에 억제 효과가 없는 결과를 나타내었다(도 4 (C)).
즉, 상기 결과는 본 발명의 대표적인 결합체인 T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF, T-KM3-MMAF가 항원에 특이적으로 결합하여 세포 독성을 일으키는 것을 나타내는 것으로, 이는 본 발명의 트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체(T-KM1-MMAF, T-KM2-MMAF, T-KM3-MMAF)가 항원에 특이적으로 결합함으로써 그 효능을 나타내고 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7 : 항체-약물 결합체를 이용한 동물 효력 시험
트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 본 발명의 항체-약물 결합체의 in vivo 효능을 확인하기 위하여 JIMT-1 세포주를 이식한 이식 이종마우스 시험을 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 이를 위하여 실시예 5에 개시한 방법으로 항체-약물 결합체를 제조하였다. 구체적으로, 글루타민을 포함하는 변이된 항체, 미생물 트랜스글루타미나아제(zedira, 독일) 및 세포 독성 약물을 혼합하였고, 이를 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼(Hitrap MabSelect Sure, 5 mL, GE healthcare)으로 정제하여 항체-약물 결합체 및 소량의 항체를 수득하였다.
Balb/C nu/nu 마우스에 한 마리당 JIMT-1 세포주 1X107개의 세포를 복강 투여하였고, 종양크기가 200mm2 이상인 시점에 비히클(Vehicle), 항-Her2 항체 (Trastuzumab, 5mg/kg) 또는 본 발명의 항체-약물 결합체인 T-KM1-MMAF(5mg/kg), T-KM3-MMAF(5mg/kg)를 주 2회 정맥 투여하였다. 그 다음, 주2회씩 종양 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 비히클(vehicle) 및 항-Her2 항체를 처리한 경우에는 허셉틴 저항성을 가진 JIMT-1 세포가 이식되어 생긴 종양이 계속적으로 생장하는 결과를 나타낸 반면, 본 발명의 결합체인 T-KM3-MMAF를 처리한 군은 처리시점과 비교하여 현저하게 종양의 크기가 줄어든 결과를 나타내었다. T-KM1-MMAF를 처리한 군 또한 종양의 생장이 억제된 결과를 나타내었다.
상기와 같은 결과는 단순한 항체 그 자체보다, 약물이 결합된 형태인 본 발명의 트랜스글루타미나아제를 이용한 제조 방법으로 제조된 항체-약물 결합체가 우수한 인 비보 효능을 지님을 시사하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Antibody-drug conjugate formed through transglutaminase and use thereof <130> PA120955KR <150> KR 10-2012-0055644 <151> 2012-05-24 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a glutamine residue <400> 1 Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a glutamine residue <400> 2 Leu Leu Gln Gly 1 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a glutamine residue <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gln Ser His Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a glutamine residue <400> 4 Gly Gln Gly Gly Gly Ser Leu Ala Ser His Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a glutamine residue <400> 5 Asn Asn Asp Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Gly Ile 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide comprising a lysine residue <400> 6 Lys Gly Glu Gly Arg Gly Ser Gly Cys 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BsrGI-201A for <400> 7 cccaggtgta caccctgccc 20 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No K TG1 rev <400> 8 cgagcggccg ctcagccctg cagcagggag ccgccgccgc cgggggacag ggacag 56 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No K LLQG rev <400> 9 cgagcggccg ctcagccctg cagcaggccg ggggacaggg acag 44 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TG-QSHA_rev <400> 10 tttgcggccg ctcaggcgtg ggactgggcc agggatccgc cgccgccctt gccgggggac 60 aggga 65 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No K BamHI rev <400> 11 tttggatccg ccgccgccgc cgggggacag ggacag 36 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-KM4 rev <400> 12 tcgagcggcc gctcagatgc cgttgttgat ctggaacagg ccgtactcgg tggagtcgtt 60 gttgccgggg gacagggaca g 81 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-KM10 rev <400> 13 aaagcggccg ctcaggcgtg ggaggccagg gatccgccgc cctggccgcc gggggacagg 60 gacag 65

Claims (25)

  1. 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물을 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 또는 경쇄의 C 말단의 라이신(lysine) 아미노산이 제거된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체는 항체에 글루타민(glutamine)이 치환(substitution) 또는 삽입(addition)되거나, 항체와 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드가 연결된 형태인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 고정된 3차 구조가 아닌 유동적인 부분에 글루타민(glutamine)이 위치한 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 또는 N 말단에 연결된 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물은 세포독성 약물(cytotoxic drug), 독소(toxin) 및 안정화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포독성 약물(cytotoxic drug)은 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제 및 DNA 인터컬레이터(DNA intercalators)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 세포독성 약물(cytotoxic drug)은 메이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 칼리케아미신(calicheamicin), 피롤로벤조디아제피네스(pyrrolobenzodiazepines), 독소루비신 (doxorubicin), 듀오카마이신(duocamycin), 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니드란(nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[nitrogen mustar(mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 시타라빈(cytarabine), 플루로우라실(flurouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 메토크렉세이트(methotrexate), 에토포시드(etoposide), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(alimta), 알트레타민(altretamine), 프로카바진(procarbazine), 탁솔(taxol), 탁소텔(taxotere), 토포테칸(topotecan) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 독소(toxin)는 균체외 독소 또는 식물독소인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 안정화제는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 히알루론산인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물은 입실론 아민기 또는 라이신을 포함하도록 제조된 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 자유 아민기를 포함하는 약물은 약물의 말레이미드(maleimide)기와 시스테인(cysteine)을 포함하는 펩타이드 간의 티오에테르(thioether) 결합으로 제조된 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 자유 아민기를 포함하는 약물은 서열번호 6의 펩타이드가 결합된 형태인 것인 방법.
  16. 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체와 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물이 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)으로 연결된, 항체-약물 결합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 변이된 항체는 항체에 글루타민(glutamine)이 치환(substitution) 또는 삽입(addition)되거나, 항체와 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드가 연결된 형태인 것인 항체-약물 결합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 고정된 3차 구조가 아닌 유동적인 부분에 글루타민(glutamine)이 위치한 것을 특징으로 하는 것인 항체-약물 결합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체-약물 결합체.
  20. 제16항에 있어서, 상기 자유 아민기(free amine group)를 포함하는 약물은 세포독성 약물(cytotoxic drug), 독소(toxin) 및 안정화제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체-약물 결합체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체-약물 결합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  22. 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드 및 항체가 연결된, 변이된 항체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 글루타민(glutamine)을 포함하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 변이된 항체.
  24. 제22항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것인, 변이된 항체.

  25. 제22항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에 위치한 라이신(lysine)이 제거된 것인, 변이된 항체.
KR1020120154955A 2012-05-24 2012-12-27 트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체 및 이의 용도 KR20130132236A (ko)

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