CN110540593A

CN110540593A - 新型的抗cd3/抗cd20双特异性抗体

Info

Publication number: CN110540593A
Application number: CN201910456228.4A
Authority: CN
Inventors: 陈蕴颖; 梅芹; 王卓智; 李竞
Original assignee: Wuxi Zhikang Hongyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN110540593B

Abstract

提供了双特异性抗体，其包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点和特异性结合CD20的第二抗原结合位点。还提供了用于产生双特异性抗体的方法以及双特异性抗体的用途。

Description

新型的抗CD3/抗CD20双特异性抗体

优先权信息

本申请要求2018年5月29日提交的申请号为201810533611.0的中国发明专利申请的权益，该优先权申请通过引用完全并在本文中。

序列表

本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及抗CD3/抗CD20 双特异性抗体。

背景技术

CD20是在B-淋巴细胞表面上表达的活化的糖基化磷蛋白。用利妥昔单抗(一种1997年由FDA批准的嵌合抗CD20单克隆抗体(以下也称为“mAb”))进行的抗体疗法代表了过去30年中治疗淋巴增生性疾病的最重要进展之一。特别是在与各种化疗/放疗方案的组合中，利妥昔单抗明显改善了B细胞淋巴瘤和慢性淋巴瘤(CLL)患者的生存统计的各个方面(Chu TW,Zhang R,Yang J等人，A Two-Step Pretargeted Nanotherapy for CD20Crosslinking May Achieve Superior Anti-Lymphoma Efficacy toRituximab.Theranostics.2015 Apr 26；5(8):834-46)。

在过去的三十年中，人们在理解CD20的蛋白质结构和分子功能方面取得了相当大的进展，因此新一代的抗CD20治疗性抗体已经生成并被批准用于临床使用。Ofatumumab是完全人抗CD20治疗性抗体，其靶向比利妥昔单抗更接近细胞表面的不同CD20表位，导致比利妥昔单抗更慢的解离速率和更稳定的结合(Laurenti L,Innocenti I, Autore F等人，New developments in the management of chronic lymphocytic leukemia:role ofofatumumab.Onco Targets Ther.2016 Jan 20；9:421-9)。尽管如此，新一代抗CD20单克隆抗体在效力和安全性方面并未被证实明显优于利妥昔单抗。对于抗CD20mAb治疗，所有患有滤泡性淋巴瘤和CLL的患者和约一半患有侵袭性B细胞淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤)的患者仍会发生疾病再发或复发， (Lim SH,Beers SA,French RR等人，Anti-CD20monoclonal antibodies:historical and future perspectives.Haematologica.2010Jan；95(1):135-43)。因此，尚未得到满足的医疗需求是开发具有不同作用机制(MOA)的新的B细胞靶向治疗策略，例如双特异性抗体(也可称为“BsAb”)和嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗。

靶向CD3和在肿瘤细胞上表达的靶抗原的双特异性抗体可促进细胞毒性T细胞杀死肿瘤。通过批准blinatumomab(一种抗-CD3x CD19双特异性抗体)用于治疗复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)，这种MOA方法被证明是成功的(Sun LL,Ellerman D,Mathieu M等人，Anti-CD20/CD3 T cell-dependent bispecific antibody for thetreatment of B cell malignancies.Sci Transl Med.2015 May 13；7(287):287ra70；D.Nagorsen,P.Kufer,P.A.Baeuerle,R.Bargou, Blinatumomab:A historicalperspective.Pharmacol.Ther.136, 334–342(2012))，其中肿瘤细胞的内源性T细胞杀伤是可实现的，而不需要体外免疫细胞操作，从而提供优于细胞疗法的优点。与 binatumomab的MOA相似，我们已经产生了用于治疗表达CD20的 B细胞恶性肿瘤(例如CLL和NHL)的新型抗CD3xCD20双特异性抗体候选物。

我们的抗CD3xCD20双特异性抗体是采取避免形成同源二聚体的杵臼(knobs-into-holes)形式的人源化IgG4，，且与食蟹猴的CD3ε和CD20抗原具有交叉反应性，便于进行适当的临床前测试。此外，我们的双特异性抗体在体外和体内B细胞杀伤活性中表现出高效力和特异性，并具有生产可行性。

发明概述

广义而言，本发明涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本发明提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。本发明提供了针对 CD3和CD20的双特异性抗体。还提供了产生双特异性抗体的方法以及双特异性抗体的用途等。

以下实施方案被考虑并且是非限制性的：

在一些实施方案中，本公开提供双特异性抗体或其抗原结合部分，其由下述组成：特异性结合CD3的第一抗原结合位点和特异性结合 CD20的第二抗原结合位点，以及人IgG4Fc区，并且所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点各自通过铰链序列连接至所述人 IgG4Fc区，其中所述第一抗原结合位点为SEQ ID NO：1所示，所述第二抗原结合位点为SEQ ID NO：2所示，所述铰链序列为SEQ ID NO：5所示，所述人IgG4Fc区为SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分是杵臼形式。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分以1x10^-7M或更小的K_D结合细胞表面人CD20，如通过FACS测量的。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分以1×10^-8M或更小的K_D结合细胞表面人CD3，如通过FACS测量的。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分在靶细胞存在下诱导T细胞活化。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分有效调节B淋巴细胞的杀伤。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分例如在DSF测试、血清稳定性测试和碱胁迫测试中是稳定的。

在一些实施方案中，本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分与食蟹猴CD3和CD20抗原交叉反应。

在一些实施方案中，本公开提供分离的核酸分子，其包含编码本公开所述的双特异性抗体的核酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供一种载体，其包含本公开所述的分离的核酸分子。

在一些实施方案中，本公开提供一种宿主细胞，其包含本公开所述的载体。

在一些实施方案中，本公开提供一种药物组合物，其包含至少一种本公开所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开提供一种制备本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：

-在本公开所述的宿主细胞中表达本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞中分离双特异性抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，本公开提供一种调节受试者的免疫应答的方法，包括向受试者施用本公开所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，使得调节所述受试者中的免疫应答。

在一些实施方案中，在调节受试者的免疫应答的方法中，在靶细胞的存在下诱导T细胞活化。

在一些实施方案中，本公开提供一种治疗受试者的异常细胞生长的方法，其包括将有效量的本公开所述的抗体或其抗原结合部分或本公开所述的药物组合物施用至所述受试者。

在一些实施方案中，本公开提供一种用于抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包括将有效量的本公开所述的抗体或其抗原结合部分或本公开所述的药物组合物施用至所述受试者。

在一些实施方案中，所述细胞是白血病肿瘤细胞。

在一些实施方案中，本公开提供一种用于减少受试者的肿瘤细胞转移的方法，所述方法包括将有效量的本公开所述的抗体或其抗原结合部分或本公开所述的药物组合物施用至所述受试者。

在一些实施方案中，本公开提供一种治疗或预防受试者中包含增殖性病症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本公开所述的抗体或其抗原结合部分或本公开所述的药物组合物施用至所述受试者。

在一些实施方案中，所述增值性病症包括癌症。

在一些实施方案中，所述癌症包括B细胞癌症。

在一些实施方案中，所述癌症包括白血病和淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述癌症包括慢性淋巴瘤(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者的免疫应答的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗受试者中的异常细胞生长的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述细胞是白血病肿瘤细胞。

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于减少受试者中的肿瘤细胞转移的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开提供所述双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的诊断剂中的用途。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌包括B细胞癌症。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌包括白血病和淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌包括慢性淋巴瘤(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

在一些实施方案中，本公开提供用于治疗或诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病的试剂盒，其包含容器，所述容器包含至少一种本公开所述的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述癌症包括B细胞癌症。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。

附图说明

图1A.T3U3-E4-1.uIgG4.SP的示意图。

图1B.纯化的T3U3-E4-1.uIgG4.SP的SDS-PAGE。

图1C.纯化的T3U3-E4-1.uIgG4.SP的分析型HPLC-SEC。

图1D.纯化的T3U3-E4-1.uIgG4.SP的MS分析。

图2A.通过FACS测量的双特异性抗体分别与Raji和Jurkat细胞上的细胞表面靶的结合。

图2B.通过FACS测定的双特异性抗体在同时双靶结合中的结合效应。通过FACS评估双特异性抗体与Raji和Jurket细胞的同时结合，其中将下列抗体加入到Raji和Jurkat细胞的1:1混合物中：a) 亲本抗CD3mAb和抗CD20mAb的混合物；b)BMK4；c) T3U3-E4-1.uIgG4.SP。FACS图的右上部分显示了代表双特异性抗体桥接Raji和Jurkat细胞的双阳性事件。d)双阳性事件的条形图表明 T3U3.E4-1.uIgG4.SP在同时双重靶向结合中比BMK4更有效。

图3.T3U3.E4-1.uIgG4.SP与食蟹猴细胞表面靶标的结合。

图4.通过FACS就CD25表达测量CD4+和CD8+T细胞的活化。由双特异性抗体介导的T细胞活化严格依赖于Raji细胞(的存在实心线和符号)并且是剂量响应方式。相反，在没有Raji细胞的情况下未观察到T细胞活化(虚线和空心符号)。。

图5A.用T3U3.E4-1.uIgG4.SP染色通过FACS检测不同B细胞系上的CD20表达水平。。

图5B.由钙黄绿素释放实验测定的双特异抗体介导的B淋巴瘤细胞系(Ramos，Raji和Namalwa)的细胞毒性实验。

图5C.基于FACS方法检测的双特异抗体介导的B淋巴瘤细胞系 (Raji和Namalwa)的细胞毒性实验。

图6A.双特异性抗体的DSF曲线(左：T3U3.E4-1.uIgG4.SP；右： BMK4)。

图6B.分析性HPLC-SEC检测在4℃或37℃孵育20小时后 T3U3.E4-1.uIgG4.SP的纯度。

图7.通过与靶细胞结合的FACS测量的人血清稳定性测试的结果。

图8.通过与靶细胞结合的FACS测量的碱胁迫测试结果。

图9A.双特异性抗体在预防性肿瘤模型中阻止Raji肿瘤生长的作用。

图9B.双特异性抗体在体内治疗性肿瘤模型中对肿瘤抑制的作用。 T3U3.E4-1.IgG4.SP在所有测试剂量，而BMK4仅在最高剂量下可诱导肿瘤生长抑制。0.05mg/kg的T3U3.E4-1.uIgG4.SP，0.5mg/kg的利妥昔单抗和5mg/kg的BMK4等效地明显抑制肿瘤生长。

图9C.双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP、利妥昔单抗BMK1和 BMK4在等摩尔剂量(＝0.5mg/kg)下抑制体内肿瘤生长和根除肿瘤的作用。

具体实施方式

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如 Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6^th ed.,W.B. Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人, Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc. (2002)；Harlow and Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y. (1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley, John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、 IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区 (VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda, Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，其可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology, Ch.7(Paul,W.,ed.,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。这样的DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA 文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)取得，或是可合成的。DNA可用化学或通过使用分子生物技术来测序和操作，例如，以将一或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、增加或删除氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段； (iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii) 由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)及鲨可变IgNAR结构域，也涵盖在文中所用的表达法“抗原结合片段”内。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或接头区域连接。铰链区可由至少2个(例如5,10,15,20,40,60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。

如本文所用的术语“CD3”是指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物如灵长类(例如人，猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))来源的分化簇3蛋白质。在哺乳动物中，CD3分子是六链多蛋白复合物，包括： CD3γ链，CD3δ链，两个CD3ε链，和CD3ζ链的同二聚体，其中CD3ζ链是CD3分子的胞内尾，并且CD3γ、CD3δ和CD3ε链都含有在T 细胞表面表达的细胞外结构域(ECD)。人CD3的示例性序列包括人 CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000724),人CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000723)和人CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000064)。非人CD3的示例性序列包括食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001270544),食蟹猴(猴)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001274617),食蟹猴(猴)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No. NP_001270839)；小鼠CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_031674),小鼠 CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_038515),小鼠CD3γ蛋白(NCBI Ref SeqNo.AAA37400)；褐家鼠(大鼠)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001101610)，褐家鼠(大鼠)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_037301)，褐家鼠(大鼠)CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_001071114)。在某些实施方案中，本文使用的CD3还可以是重组CD3，例如包括重组CD3ε蛋白，重组CD3δ蛋白和重组CD3γ蛋白，其可以任选表达为重组CD3复合物。重组CD3复合物可以在细胞表面表达，或者可以表达为不与细胞表面结合的可溶形式。

如文中所用，“结合CD3的抗体”或“抗-CD3抗体”包括特异性识别单个CD3亚单元(例如ε、δ、γ或ζ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别二个CD3亚单元的二聚体复合物(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ ζCD3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体及抗原结合片段可与可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3结合。可溶性CD3包括天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变体，例如，缺乏跨膜结构域或不与细胞膜缔合的单体和二聚体CD3构建体。

如文中所用，术语“细胞表面表达的CD3”，指一或多个CD3蛋白，其在体外或体内表达在细胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白暴露于细胞膜的胞外侧且易接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的 CD3”包括包含在细胞膜中的功能性T细胞受体环境内的CD3蛋白。术语“细胞表面表达的CD3”包括表达为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚体)的部分的CD3蛋白。术语“细胞表面表达的CD3”还包括在细胞表面上自我表达的，无其他 CD3链类型的CD3链(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。“细胞表面表达的CD3”可包括在正常表达CD3蛋白的细胞的表面上表达的CD3 蛋白或由其组成。备选地，“细胞表面表达的CD3”可包括在细胞表面上表达的CD3蛋白或由其组成，所述细胞通常不会在其表面上表达人 CD3但经人工工程化在其表面上表达CD3。如本文所用，术语“抗 CD3抗体”包括具有单一特异性的单价抗体以及包含结合CD3的第一抗原结合位点和结合第二(靶)抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其中抗CD3抗原结合位点包含本文所述的任何CDR序列。本文其他地方描述了抗CD3双特异性抗体的实例。术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。示例性的抗CD3抗体也描述于US2007/0280945A1；以及于2013年9月19日提交的PCT国际申请号PCT/US13/60511，其通过引用整体并入本文。

本文使用的术语“CD3epsilon”或“CD3ε”旨在包括任何形式的 CD3ε，例如1)天然未加工的CD3ε分子，“全长”CD3ε链或天然存在的CD3ε变体，包括例如，剪接变体或等位基因变体；2)由细胞中的处理产生的任何形式的CD3ε；或3)通过重组方法产生的CD3ε亚基的全长、片段(例如截短形式，胞外/跨膜结构域)或修饰形式(例如突变形式，糖基化/聚乙二醇化，Histag/免疫荧光融合形式)。

术语“抗CD3ε抗体”是指能够与CD3ε特异性结合的抗体。

如本文所用，术语“CD20”是指在B-淋巴细胞表面上表达的活化糖基化磷蛋白。人CD20蛋白具有GenBank登录号NP_690605.1中的氨基酸序列。

如本文所用，术语“抗CD20抗体”是指特异性结合CD20的抗体。“抗CD20抗体”可以包括具有单一特异性的单价抗体，例如Rituxan (利妥昔单抗)和双特异性抗体。示例性抗CD20抗体描述于美国专利No.7,879,984B2和PCT国际申请号PCT/US13/60511中，其在此通过引用并入本文。

如本文所用的术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“单价”是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是二价的。

如本文所用，“双特异性”抗体是指具有源自两种不同单克隆抗体的片段并能够结合两种不同表位的人工抗体。两个表位可以存在于相同的抗原上，或者它们可以存在于两种不同的抗原上。

术语“双特异性抗原结合分子”是指包含至少第一抗原结合结构域(在本文中也称为第一抗原结合位点)和第二抗原结合结构域(在本文中也称为第二抗原结合位点)的蛋白质、多肽或分子复合物。在一些实施方案中，“双特异性抗原结合分子”是“双特异性抗体”。双特异性抗体内的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR，其单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地特异性结合特定抗原。在本发明的上下文中，第一抗原结合位点特异性结合第一抗原(例如 CD3)，并且第二抗原结合位点特异性结合第二不同抗原(例如CD20)。

术语“抗CD3/抗CD20抗体”，“抗CD3/抗CD20双特异性抗体”，“抗CD3和CD20抗体”，“抗CD3×CD20双特异性抗体”，“CD3×CD20 抗体”在本文中可互换使用，其是指特异性结合CD3和CD20的双特异性抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的抗体。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体。

如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从对另一物种的免疫球蛋白基因是而言转基因的动物分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体，或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如系统。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有 1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，和甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D的抗体。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，术语“竞争结合”是指两种抗体在与其结合靶标结合上的相互作用。如果第一抗体与其同源表位的结合在第二抗体存在时与在不存在第二抗体时第一抗体的结合相比可检测地降低，则第一抗体与第二抗体竞争结合。在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合可以但不一定也可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位的结合的情况下，无论是相同、更大还是更小程度地，抗体均被称为彼此“交叉竞争”结合它们各自的表位。

如本文所用，“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(例如人CD3/CD20和人抗CD3/CD20双特异性抗体)的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol. 66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子 (例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然发生变化，或者物质与天然分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD3/CD20蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除CD3/CD20蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人CD3/CD20蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的CD3/CD20蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体 (PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙 (如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”) 来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在 Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York: Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress； Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G., 1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J., eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988, SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook 等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al, 1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人CD3/CD20 基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例和U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人 (1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal. Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort 仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的EpicsC和来自 Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达 FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC) 和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998) 公开的动物模型中评估。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗CD3/CD20相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

双特异性抗体及其抗原结合片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段具有针对CD3例如CD3ε的第一特异性，并且具有针对CD20的第二特异性。

根据某些示例性实施方案，本发明包括双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点和特异性结合 CD20的第二抗原结合位点。这样的抗体在本文中可被称为例如“抗 -CD3/抗-CD20”或“抗-CD3xCD20”或“CD3xCD20”双特异性分子，或其他类似术语。

本发明的抗体以高亲和力结合人CD3。本发明的抗体与CD3的结合可以使用本领域中良好建立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达CD3蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人CD3的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达CD3的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然CD3的抗CD3-刺激的CD4⁺活化的T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA或FACS 分析，例如使用重组CD3蛋白。例如，本发明的抗体以5×10^-7M或更低的K_D结合人CD3，以2×10^-7M或更低的K_D结合人CD3，以1×10^-7 M或更低的K_D结合人CD3，5×10^-8M或更低的K_D结合人CD3，以 2×10^-8M或更低的K_D结合人CD3，以1×10^-8M或更低的K_D结合人 CD3，5×10^-9M或更低的K_D结合人CD3，4×10^-9M或更低的K_D结合人CD3，5×10^-9M或更低的K_D结合人CD3，以2×10^-9M或更低的 K_D结合人CD3，以1×10^-9M或更低的K_D结合人CD3，5×10^-10M或更低的K_D结合人CD3，以1×10^-10M或更低的K_D结合人CD3。

本发明的抗体以高亲和力结合人CD20。本发明的抗体与CD20 的结合可以使用本领域中良好建立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达CD20蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人CD20的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达CD20的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然CD20的抗CD20-刺激的CD4⁺活化的 T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA或 FACS分析，例如使用重组CD20蛋白。例如，本发明的抗体以5×10^-7 M或更低的K_D结合人CD20，以2×10^-7M或更低的K_D结合人CD20，以1×10^-7M或更低的K_D结合人CD20，5×10^-8M或更低的K_D结合人 CD20，以2×10^-8M或更低的K_D结合人CD20，以1×10^-8M或更低的K_D结合人CD20，5×10^-9M或更低的K_D结合人CD20，4×10^-9M或更低的K_D结合人CD20，5×10^-9M或更低的K_D结合人CD20，以2×10^-9 M或更低的K_D结合人CD20，以1×10^-9M或更低的K_D结合人CD20， 5×10^-10M或更低的K_D结合人CD20，以1×10^-10M或更低的K_D结合人CD20。

与CD3特异性结合的第一个抗原结合位点

在一个实施方案中，第一抗原结合位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，在本发明中也称为“抗CD3臂”。在一个实施方案中，编码所述“抗CD3臂”的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。如本领域公知的，“抗CD3臂”包含重链可变区和轻链可变区，并且重链可变区和轻链可变区各自包含CDR(互补决定区)1、CDR2和CDR3。

与CD20特异性结合的第二抗原结合位点

在一个实施方案中，第二抗原结合位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，在本发明中也称为“抗CD20臂”。在一个实施方案中，编码所述“抗CD20臂”的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。如本领域公知的，“抗CD20臂”包含重链可变区和轻链可变区，并且重链可变区和轻链可变区各自包含CDR(互补决定区)1、CDR2和 CDR3。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5^th Ed.),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987, PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3^rd Ed.,Wily-VCH Ver4-1BB GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann andDubel,eds.,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc., Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由 Department of Biochemistry&Molecular BiologyUniversity College London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue): D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB 的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Ver4-1BB,Heidelberg,ISBN-13: 978-3540413547,也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat 的Abysis数据库网站获得。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和 W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol. 48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从 http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序 (版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul 等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用 BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST 和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他实施方案中，CDR氨基酸序列可以是与上述相应序列中所包含的具体的CDR氨基酸序列至少90％，91％，92％，93％，94％， 95％，96％，97％，98％或99％相同。在其他实施方案中，可变区的氨基酸序列可以与上述相应序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR包含不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/ 多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸 (例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell 等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng. 12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以直接或间接彼此连接。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以通过接头彼此连接。在具体实施方案中，接头是肽接头。

在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此直接或间接连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子(即双特异性ScFv)，其进一步结合至Fc区。或者，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自连接到单独的Fc 区。本发明的双特异性抗原结合分子可包含两个Fc区，每个Fc区分别是单独的抗体重链的一部分。第一和第二Fc区可以具有相同的序列，除了在CH3结构域中具有旨在促进或易于纯化异二聚体(即双特异性)分子的突变之外。

本发明的双特异性抗体的Fc区可以是人Fc区。本发明的双特异性抗体的Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3 或IgG4。在该方法的一个实施方案中，所述第一和所述第二抗体的 Fc区都是IgG1同种型。在该方法的一个实施方案中，所述第一和所述第二抗体的Fc区都是IgG4同种型。在另一个实施方案中，所述抗体的Fc区之一是IgG1同种型而另一个是IgG4同种型。在后一个实施方案中，所得到的双特异性抗体包含IgG1的Fc区和IgG4的Fc 区，因此就效应子功能的激活而言可具有令人感兴趣的中间特性。

在本发明的双特异性抗体的背景下，与指定的Fc区嵌合形式相比，Fc区可以包含一个或多个氨基酸改变(例如，插入，缺失或取代)，而不改变所需的功能性。例如，本发明包括在Fc区中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，其导致在Fc和FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减弱)的修饰的Fc区。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如人IgG4Fc区的氨基酸序列的位置228处的丝氨酸(“S”)至脯氨酸(“P”)的突变。

双特异性抗体的产生

本文提供的双特异性抗体和抗原结合片段可以用本领域已知的任何合适的方法制备。在常规方法中，可以在宿主细胞中共表达具有不同抗原特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对，从而以重组方式产生双特异性抗体(参见例如Milstein和Cuello，Nature，305：537(1983))，随后通过亲和层析进行纯化。

还可以使用重组方法，其中编码两种特异性的抗体重链可变结构域的序列分别与免疫球蛋白恒定结构域序列融合，然后插入到表达载体中，该载体与轻链序列的表达载体共转染至用于重组表达双特异性抗体的合适宿主细胞(参见例如WO94/04690；Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986))。类似地，也可以重组构建scFv 二聚体并从宿主细胞表达scFv二聚体(参见例如Gruber等， J.Immunol.152：5368(1994))。

在另一种方法中，可以通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。连接的抗体在铰链区被还原成4个半抗体(即单体)，然后再氧化形成异二聚体(Kostelny 等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。

两个抗原结合结构域也可以缀合或交联以形成双特异性抗体或抗原结合片段。例如，一种抗体可以与生物素偶联，而另一种抗体与抗生物素蛋白偶联，并且生物素和抗生物素蛋白之间的强关联将两种抗体复合在一起形成双特异性抗体(参见例如美国专利号4,676,980 B2； WO 91/00360，WO 92/00373和EP 03089)。又例如，两种抗体或抗原结合片段可以通过本领域已知的常规方法交联，例如，美国专利号 4,676,980 B2。

双特异性抗原结合片段可以由双特异性抗体产生，例如通过蛋白水解切割或通过化学连接。例如，可以制备抗体的抗原结合片段(例如Fab⁵)并将其转化为Fab'-硫醇衍生物，然后与另一种具有不同抗原特异性的经转化的Fab⁵衍生物混合并反应以形成双特异性抗原结合片段(参见例如Brennan等，Science，229：81(1985))。

在某些实施方案中，双特异性抗体或抗原结合片段可以在界面处工程化，从而可以形成杵臼结合以促进两个不同抗原结合位点的异源二聚化。如本文所用的“杵臼”是指两个多肽(例如CH3结构域)之间的相互作用，其中一个多肽由于存在具有大侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸或色氨酸)而具有突起(即“杵”)，并且另一个多肽具有其中存在小侧链氨基酸残基(例如丙氨酸或苏氨酸)的空腔(即“臼”)，并且突起可定位在空腔中以促进两个多肽形成异二聚体或复合体。本领域已知产生具有杵臼形式的多肽的方法，例如，美国专利 5,731,168B2。

编码本发明抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的双特异性抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的双特异性抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列的载体。在另一个实施方案中，表达载体进一步包含编码双特异性抗体例如人源化双特异性抗体的轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区的核苷酸序列。

在本发明的情况下载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非- 染色体和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，CD20或CD3抗体- 编码核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(描述于例如Sykes和Johnston,Nat Biotech 17,355-59(1997))、紧密核酸载体(描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体例如pBR322,pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最小尺寸的核酸载体(描述于例如Schakowskiet al.,Mol Ther 3,793-800(2001))或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaP04-沉淀的构建体(描述于例如 WO200046147,Benvenisty和Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986),Wigler et al.,Cell 14,725(1978)和Coraro和Pearson,SomaticCell Genetics 7,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一个实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达CD20抗体和/ 或CD3抗体。这样的载体的实例包括表达载体，例如BlueScript (Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264, 5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等)。表达载体还可或备选地是适合在酵母系统中表达的载体。可使用合适在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel et al., ed.Current Protocols in MolecularBiology,GreenePublishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant etal.,Methods inEnzymol 153,516-544(1987))。

表达载体还可或备选地是适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，包含谷氨酰胺合成酶作为可选择标记的载体，例如描述于 Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中的载体。

核酸和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述序列可将多肽，例如新生的多肽链靶向周质空间或细胞培养基。这样的序列是本领域已知的，和包括分泌前导或信号肽。

表达载体可包含任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件或与其缔合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV,SV40,SL3-3，MMTV和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、在大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为可选择标记的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，例如CMV IE。

在一个实施方案中，CD20和/或CD3抗体-编码表达载体可通过病毒载体位于和/或递送至宿主细胞或宿主动物。

在一个方面，本发明涉及包含本文所述的载体的宿主细胞。

因此，本发明还涉及重组的真核或原核宿主细胞，其产生本发明的双特异性抗体，例如转染瘤。

CD20-特异性抗体可在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体，或本文定义的本发明的双特异性抗体。CD3-特异性抗体可同样地在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体或本文定义的本发明的双特异性抗体。

宿主细胞的实例包括酵母、细菌、植物和哺乳动物细胞，例如CHO, CHO-S,HEK，HEK293,HEK-293F,Expi293F,PER.C6或NS0细胞或淋巴细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞可包含稳定整合至细胞基因组的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本发明提供包含非整合核酸、例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞，其包含上文指定的第一和第二核酸构建体。

在其它方面，本发明涉及转基因非-人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生本发明的双特异性抗体。

在其它方面，本发明涉及杂交瘤，其产生用于本文定义的本发明的双特异性抗体的抗体。在其它方面，本发明涉及转基因非-人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生用于双特异性抗体的抗体或本发明的双特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及表达载体，其包含

(i)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第一结合位点的重链序列；

(ii)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第一结合位点的轻链序列；

(iii)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第二结合位点的重链序列；

(iv)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第二结合位点的轻链序列；

(v)(i)中所示的核酸和(ii)中所示的核酸；

(vi)(iii)中所示的核酸和(iv)中所示的核酸；

(vii)(i)、(ii)、(iii)和(iv)中所示的核酸。

在一个方面，本发明涉及产生根据本文公开的任一个实施方案的双特异性抗体的方法，包括培养本文公开的宿主细胞，其包含本文公开的表达本文公开的双特异性抗体的一种或多于一种表达载体，和从培养基纯化所述抗体。

在一个方面，本发明涉及包含上文定义的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。

药物组合物

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗CD3/抗CD20抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸， EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/ 或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水载体，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载体如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg 体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为至少约 100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约 10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml， 40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml， 400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括2mg/ml，3mg/ml， 4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml， 16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或 100mg/ml。

本发明的应用

在一些方面，本发明提供了治疗受试者病症的方法，其包括向需要治疗的患者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。例如，这种疾病是一种癌症。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及CD3和/或CD20的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是否是原发性的或继发性的。这些癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤，纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨样软骨瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤 (尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如结肠癌，平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞白血病(急性淋巴细胞性白血病)，急性骨髓性 (髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生，前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，宫颈癌(宫颈肿瘤)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，阴道癌，输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在具体的实施方案中，癌症是结肠癌。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于B细胞癌，包括B 细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中间级别扩散性NHL；免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非切割细胞NHL；大块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，B细胞增殖性病症和Meigs'综合征，更具体的例子包括但不限于复发或难治性NHL，前线低级别NHL，III/IV级NHL，化疗耐受性NHL，前体Bly成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和 /或淋巴浆细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-MALT淋巴瘤，淋巴结边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或复发的NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级别免疫母细胞NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级别小非裂解性细胞NHL，庞大疾病NHL，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿和/或塞扎里综合征，皮肤(皮肤)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的实例进一步包括但不限于B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的未分裂细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)， c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)， d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤和/或j)何杰金氏病。

在一些其他实施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎，红斑狼疮和类风湿性关节炎。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如变应性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌 (例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii) 蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA 酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如 TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣 (cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR 和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线， UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2 周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

药物包装和试剂盒

还提供了包含包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

本文公开的示例性抗体是人源化抗CD3/抗CD20双特异性抗体，被命名为“T3U3.E4-1.IgG4.SP”。双特异性抗体具有两个抗原结合位点，一个特异性结合CD3，另一个特异性结合CD20。与CD3特异性结合的抗原结合部位也称为“抗CD3臂”，与CD20特异性结合的抗原结合部位也称为“抗CD20臂”。

需要说明的是，在双特异性抗体“T3U3.E4-1.IgG4.SP”中，“抗CD3 臂”(SEQ IDNO：1)和“抗CD20臂”(SEQ ID NO：2)各自通过铰链序列(SEQ ID NO：5)连接至人IgG4Fc区(SEQ ID NO：6)，其中人IgG4具有S228P突变，该突变位于铰链序列(SEQ ID NO：5) 中。

表A

SEQ ID NO.	描述
		1	“抗CD3臂”的全长氨基酸序列
2	“抗CD20臂”的全长氨基酸序列
		3	编码“抗CD3臂”的核苷酸序列
4	编码“抗CD20臂”的核苷酸序列
		5	接头的序列(“铰链序列”)
6	人IgG4Fc区

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料和基准抗体的制备

1.材料的制备

表1中提供了实施例中使用的市售材料的信息。

表1

2.基准抗体的产生

在实施例中将两种基准抗体BMK1和BMK4用作参照抗体。

BMK1是基于美国专利申请US 20140004037 A1的克隆C2B8的序列产生抗人CD20基准抗体(利妥昔单抗)。BMK4是根据专利 WO 2017112762A1中的序列合成抗CD3×CD20参照双特异性抗体(REGN1979)。BMK1和BMK4由Expi293细胞表达并随后使用蛋白A色谱纯化。

实施例2

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP的产生

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP是基于杵臼 (knobs-into-holes)形式(S.Atwell,J.B.Ridgway,J.A.Wells,P. Carter,Stable heterodimers from remodelingthe domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary.J.Mol.Biol.270,26–35 (1997)和C.Spiess,M.Merchant,A.Huang,D.G.Yansura,J.M. Scheer等人,Bispecific antibodies with natural architecture produced byco-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.Nat.Biotechnol.31,753–758(2013))的人IgG4亚型的双特异抗体。双特异性抗体T3U3-E4-1.uIgG4.SP的示意图如图1A所示。在 T3U3-E4-1.uIgG4.SP中，“抗CD3臂”(SEQ ID NO：1)和“抗CD20 臂”(SEQ ID NO：2)各自通过铰链序列(SEQ ID NO：5)连接至人IgG4Fc区片段序列(SEQ ID NO：6)，其中人IgG4具有S228P 突变，该突变位于铰链序列(SEQ ID NO：5)中，其在下文中被命名为“人IgG4(S228P)”及“uIgG4.SP”。双特异性抗体中的抗CD3 抗体序列通过杂交瘤技术、由人CD3ε和CD3δ细胞外结构域(ECD) 蛋白免疫小鼠产生。CD3序列的产生在PCT申请号PCT/CN2017/102622中描述。

双特异性抗体中的抗CD20序列来自于PCT公开号WO 2010083365A1的克隆2F2(Ofatumumab)的序列。抗-CD20和抗-CD3 臂各自以VL-CL-(G₄S)₁₂-VH-CH1的单链Fab形式(scFab)构建，然后通过铰链序列(SEQ ID NO：5)连接至人IgG4(S228P)CH2 和CH3的恒定区。抗CD20臂和CD3臂通过杵臼形式组装(杵臼形式详见文献S.Atwell,J.B.Ridgway,J.A.Wells,P.Carter,Stable heterodimers from remodeling the domain interfaceof a homodimer using a phage display library.J.Mol.Biol.270,26–35(1997)和C.Spiess,M.Merchant,A.Huang,D.G.Yansura,J.M.Scheer等人, Bispecific antibodieswith natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing twodistinct half-antibodies.Nat.Biotechnol.31, 753–758(2013)中描述)。

分别将两个臂的基因(抗CD20臂的SEQ ID NO：4；抗CD3臂的SEQ ID NO：3)克隆到经过修饰的pcDNA3.3表达载体中，并通过使用ExpiFectamine293转染试剂盒(Invitrogen-A14524)共转染到 Expi293细胞(Invitrogen-A14527)中。细胞在Expi293表达培养基(Invitrogen-A1435101)中，于含有8％CO₂的37℃培养箱中，在以 135rpm旋转的轨道振荡器平台上中进行培养。培养上清先后使用蛋白A柱(GE Healthcare，17543802)和SEC柱(GEHealthcare， 28990944)进行蛋白质纯化。纯化的蛋白通过UV-Vis分光光度计 (NanoDrop2000，Thermo Scientific)测量蛋白质浓度。通过 SDS-PAGE(图1B)和分析型HPLC-SEC(图1C)估计蛋白质纯度，并通过质谱分析确认(图1D)。

结果：

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP的纯度通过分析型分子排阻色谱(SEC)和SDS-PAGE表征来确认。在非还原性SDS-PAGE上，纯化的双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP显现为分子量(MW)大小为150KD的单一条带。在还原性SDS-PAGE上，双特异性抗体 T3U3.E4-1.uIgG4.SP显现为75KD的单一条带(图1B)。在分析型HPLC-SEC中，双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP显示为纯度高于 98％的单峰(图1C)。同时，纯化的双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP 在质谱检测中未检测到同源二聚体和多聚体(图1D)。

表2提供了在瞬转生产中双特异性抗体T3U3-E4-1.uIgG4.SP的蛋白产量和纯度的总结。

表2

从图1B、1C和1D以及表2可以看出，双特异性抗体 T3U3-E4-1.uIgG4.SP的瞬转表达纯化的纯度高(高于98％，通过 SEC-HPLC测量)，且没有可检测水平的同二聚体和多聚体。

实施例3

抗体表征-体外表征

3.1.细胞系和原代细胞分离

使用在完全培养基(补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml 链霉素的RPMI1640)中培养以下细胞系：Jurkat(CD3⁺/CD20^-细胞)； Raji，Ramos，Namalwa(CD20⁺/CD3^-细胞)。

人或食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)从健康供体的肝素化静脉血通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare 17-1440-03)密度离心新鲜分离获得。原代人B细胞通过EasySep试剂盒(Stemcell-19053) 从新鲜人PBMC中分离纯化；CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞分别通过 EasySep试剂盒Stemcell-19053和Stemcell-19052分离纯化。

3.2.双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与靶细胞的结合

通过流式细胞术确定双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与靶细胞的结合。简言之，将1×10⁵/孔的靶细胞(CD3⁺/CD20^-细胞或 CD20⁺/CD3^-细胞)与连续稀释的双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP 或人IgG4对照抗体在4℃下孵育60分钟。孵育后，用冷的1％BSA/1×PBS洗涤细胞两次，然后加入PE偶联的山羊抗人IgG Fc抗体(Jackson-109-115-098)，并在4℃孵育30分钟。洗涤两次后，使用FACS Canto II仪(BD Biosciences)测量染色细胞的MFI。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)使用四参数非线性回归分析测定细胞结合的EC50值。

为了测试双特异性抗体与表达CD3和CD20的细胞同时结合的效力，用50nM钙黄绿素-AM(Invitrogen-C3099)和20nM FarRed (Invitrogen-C34572)分别标记1×10⁶/mlRaji细胞和1×10⁶/ml Jurkat 细胞。用冷1％BSA/1XPBS洗涤后，将标记的Raji和Jurkat细胞重悬并以1：1的比例混合至终浓度为1×10⁶/ml。将1x10⁵/孔的混合细胞铺板，然后加入20nM测试双特异性抗体。在4℃孵育60分钟后，通过FACS分析钙黄绿素-AM和FarRed双重染色细胞的百分比。

结果：

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与细胞表面CD3或CD20的结合分别使用Jurkat细胞和Raji细胞通过FACS来测量(图2A)。 T3U3.E4-1.uIgG4.SP与Raji细胞的结合优于BMK4，并且与Jurkat 细胞的结合EC50与BMK4相当(表3)。

表3.双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与细胞表面靶的FACS 结合EC50。

通过FACS评估双特异性抗体与Raji和Jurket细胞的同时结合效力。钙黄绿素-AM标记的Raji细胞和FarRed标记的Jurkat细胞以1:1的比例混合，然后与20nM测试双特异性抗体一起孵育，如图 2B所示。代表双特异性抗体桥接Raji和Jurkat细胞的钙黄绿素-AM 和FarRed双阳性事件显示在FACS散点图的右上部分(图2B，a-c)。双重阳性事件百分比的条形图表明双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP在桥联靶细胞结合中优于BMK4(图2B，d)。

3.3.通过FACS测量的双特异性抗体的亲和力

双特异性抗体与细胞表面CD20或CD3的结合亲和力分别用 Ramos和Jurkat细胞系通过流式细胞术测定。细胞用PBS洗涤并以 1x 10⁶个细胞/ml重悬于1％BSA/1XPBS中。将50μl细胞悬液加入到 96孔U形板(Corning，USA)的每个孔中。然后将平板以1500rpm 离心4分钟并弃去上清液。将在1％BSA/PBS中的100μl/孔的双特异性抗体的系列稀释液加入平板中。在4℃孵育1小时后，将细胞以 1500rpm离心4分钟。用100μl/孔的FITC标记的山羊抗人IgG Fc (Jackson，目录号109-095-098，批号111430)重悬各细胞沉淀。在 4℃孵育30分钟后，将细胞用1％BSA/PBS洗涤一次并重悬于100μl/ 孔的1％BSA/1XPBS中用于流式细胞术分析(BD，CantoII，USA)。通过FACS分析评估并通过GraphPad Prism 5中的线性回归曲线计算B_max和K_D。K_D值＝游离IgG*(B_max-结合的IgG)/结合的IgG。基于FITC Beads QuantityEquation(QuantumTM MESF试剂盒，Bangs Laboratories)计算结合的IgG和游离IgG。

结果：

表4显示了通过FACS测量的双特异性抗体对细胞表面靶的亲和力。T3U3.E4-1.uIgG4.SP对Ramos细胞上CD20和Jurkat细胞上CD3 的KD值优于BMK4。

表4.通过FACS测量的双特异性抗体对细胞表面靶的亲和力

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与食蟹猴PBMC中的CD3阴性细胞和阳性细胞的结合用FACS进行了测试。结果显示双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP结合细胞表面上的食蟹猴靶标并与抗体剂量相关(图3)。

3.4.T细胞活化测定

为了测定双特异性抗体活化T细胞的效力，采用了流式细胞术测量了T细胞的CD25表达。新鲜分离的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分别作为效应细胞进行了实验。简而言之，在以1x10⁴个Raji细胞/孔的存在或不存在的条件下，将5x10⁴个效应细胞加入含有连续稀释的双特异性抗体或hIgG4同种型对照抗体的完全培养基中，在37℃孵育 24小时。孵育后，将细胞用1％BSA/1XDPBS洗涤两次，然后用以下抗人抗体组(FITC标记的抗人CD4(BD Pharmingen-550628)； PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8(BD Pharmingen-560662)和APC标记的抗人CD25(BDPharmingen-555434))在4℃染色30分钟。通过FACS分析T细胞的CD25的表达。通过使用Prism四参数非线性回归分析测定T细胞活化的EC50。

结果：

通过FACS就CD25表达测量CD4⁺和CD8⁺T细胞的活化。由双特异性抗体介导的T细胞活化只能在Raji细胞存在的条件下观察到 (图4：实心线和符号)。相比之下，在不存在Raji细胞的情况下双特异性抗体不能诱导T细胞活化(图4：虚线和空心符号)。由双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP和BMK4介导的T细胞活化的EC50 值显示在表5中。这些结果表明T3U3.E4-1.uIgG4.SP介导的T细胞活化严格依赖于靶Raji细胞的存在，并且比BMK4更有效。

表5.在Raji细胞存在下由双特异性抗体介导的T细胞活化的 EC50

3.5.体外细胞毒性测定

钙黄绿素释放测定法(图5B)和FACS测量法(图5C)用于测定双特异抗体介导的CD8⁺T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤效力的。

对于钙黄绿素释放测定，新鲜分离的CD8⁺T细胞在含有50IU/ml 重组人IL-2的完全培养基中培养过夜。第二天，用1μM钙黄绿素-AM (Invitrogen-C3099)在37℃在测定缓冲液(不含酚红的RPMI 1640 培养基+10％FBS)中将1×10⁶个细胞/ml Raji、Ramos和NAMALWA细胞分别标记30分钟。将5x10³个细胞/孔的钙黄绿素标记的靶细胞铺在含有CD8⁺T细胞(效应CD8⁺T细胞/靶细胞比＝5：1)和连续稀释的测试抗体的完全培养基中。在37℃孵育2小时后，将平板离心并将上清液转移至半透明黑色透光底板(Greiner-655090)中，用于通过EnVision(PerkinElmer)进行的荧光分析。使用以下等式计算百分比细胞毒性：％细胞毒性＝(F_S-F_SR)/(F_MR-F_SR)*100％。F_S是从测试孔的钙黄绿素释放；F_SR是自发的钙黄绿素释放；F_MR是来自由 Triton-X100裂解的细胞的最大钙黄绿素释放。结果表示为来自重复三孔的％特异性裂解的平均值±标准误差。

对于基于FACS的细胞毒性测定，将新分离的人CD8⁺T细胞在含有50IU/ml重组人IL-2的完全培养基中培养过夜。在第二天，将 Raji和NAMALWA(1×10⁶个细胞/ml)分别用在20nM Far-Red (Invitrogen-C34572)在37℃下标记30分钟，然后用测定缓冲液(无酚红的RPMI 1640培养基+10％FBS)洗涤2次。将FAR-RED标记的靶细胞(2x10⁴/孔)铺在含有效应CD8⁺T细胞(效应/靶细胞比例＝ 5:1)和连续稀释的测试抗体的完全培养基中。在37℃孵育4小时后，加入碘化丙啶(PI)(Invitrogen-P3566)并在室温下孵育15分钟，然后通过流式细胞术分析。使用以下等式计算细胞毒性百分比：细胞毒性％＝FAR-RED⁺PI⁺/(FAR-RED⁺PI⁺+FAR-RED⁺PI^-)*100％。使用 Prism四参数非线性回归分析确定体外细胞毒性的EC₅₀值。

结果：

通过钙黄绿素释放细胞毒性测定(图5B)和基于FACS的细胞毒性测定(图5C)来测试由双特异性抗体介导的杀伤B淋巴瘤细胞系的细胞毒性。图5A显示三种人B淋巴瘤细胞系表达不同水平的细胞表面CD20，用T3U3.E4-1.uIgG4.SP和PE缀合的山羊抗人IgG Fc抗体(Jackson-109-115-098)检测，通过FACS测量。NAMALWA细胞的CD20表达水平明显低于Romas和Raji细胞(图5A)。图5C 和5B显示由双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP介导的细胞毒性呈剂量依赖性方式，且细胞毒性效力随细胞表面CD20表达水平成比例增加。具体而言，如图5B所示，在由Envision测量的两小时钙黄绿素释放测定法中，双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP比BMK4在介导三种不同B淋巴瘤细胞系的细胞杀伤上更有效。此外，如图5C所示，在基于FACS的细胞毒性测定中，双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP 比BMK4在介导两种不同B淋巴瘤细胞系的细胞毒性上更有效。

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP和BMK4的细胞毒性EC50 值总结在表6和表7中。结果表明双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP 比BMK4在体外细胞毒性测定中更有效。

表6.由Envision测量的钙黄绿素释放测定法中三种B淋巴瘤细胞系的双特异性抗体介导的细胞毒性的EC50。

表7.在基于FACS的细胞毒性测定中双特异性抗体介导的两种B 淋巴瘤细胞系的细胞毒性的EC50。

3.6.DSF分析和热稳定性测试

7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)用于进行 DSF测定。简而言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPRO Orange 溶液(Invitrogen)混合并加入到96孔板(Biosystems)中。以2℃/ 分钟的速率将平板从26℃加热至95℃，并收集得到的荧光数据。计算相对于不同温度的荧光变化的负导数，并将最大值定义为解链温度 T_h。如果蛋白质具有多个解折叠转变，则报告前两个T_h，命名为T_h1和T_h2。T_h1被解释为解链温度T_m以便于不同蛋白质之间的比较。数据收集和T_h计算由其操作软件自动进行。一旦软件报告了不同温度的负导数图，图中曲线从转变前基线开始下降的点可以粗略估计为起始温度T_on。

结果：

双特异性抗体的热稳定性通过DSF测试来测试，其中 T3U3.E4-1.uIgG4.SP和BMK4的T_on、T_h1和T_h2在正常范围内并且 DSF曲线正常(图6A)。T3U3.E4-1.uIgG4.SP的T_h1为64.4℃，优于BMK4(57.6℃)(表8)。

表8.双特异性抗体的热稳定性。

Ab	PI	T<sub>on</sub>(℃)	T<sub>h1</sub>(℃)	T<sub>h2</sub>(℃)
					T3U3.E4-1.uIgG4.SP	8.00	47	64.4	73.7
BMK4(REGN1979)	7.65	45	57.6	72.6

此外，抗体样品分别在4℃和37℃孵育20小时进行双特异性抗体的热稳定性测试。孵育后，取出测试抗体样品并进行SEC-HPLC分析以检测主峰纯度(单体含量)。

结果：

孵育后，双特异性抗体T3U3.E4-1.IgG4.SP的稳定性通过分析性 HPLC-SEC测试，结果显示高纯度并且没有聚合物和降解物产生(图 6B)。

这些结果表明双特异性抗体T3U3.E4-1.IgG4.SP在热稳定性测试中是稳定的。

3.7.血清稳定性测试

将新鲜收集的人血在不含抗凝剂的聚苯乙烯管中在室温下孵育 30分钟。血液以4000rpm离心10分钟后收集血清。将抗体与血清混合以确保血清含量>95％。将混合的样品分别在37℃孵育0天、1天、 4天、7天和14天。在指定的时间点，将样品在液氮中快速冷冻并在 -80℃下储存直至分析。通过FACS分析连续稀释的样品与Raji和 Jurkat细胞的细胞结合。使用Prism四参数非线性回归来分析细胞结合。

结果：

在每个孵育时间段后，将双特异性抗体与靶细胞的结合活性与新解冻的双特异性抗体的结合活性(第0天)进行比较。如图7所示，在人血清中孵育后，双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与Ramos和 Jurkat细胞的结合保持正常。这些结果表明T3U3.E4-1.uIgG4.SP在人血清中保持稳定至少14天。

3.8.碱性条件压力测试

使用微量离心脱盐柱(7K MWCO，Thermo Fisher，目录号： Pierce-89889)将测试抗体缓冲液交换到碱性缓冲液(20mM Tris， 150mM NaCl，pH8.5)中。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop 2000， Thermo Scientific)检测抗体的浓度。然后将抗体在37℃孵育5天。测试样品或正常储存的抗体样品用于检测与靶细胞的结合亲和力，以评估测试抗体在碱性条件中的稳定性。

结果：

双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP在37℃碱性条件孵育5天。将孵育后的双特异性抗体与新鲜融化的双特异性抗体比较与靶细胞的结合能力。如图8所示，与未处理的抗体相比，孵育后的双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与Ramos和Jurkat细胞的结合曲线是正常的，表明双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP在碱性测试条件中是稳定的。

3.9.非特异性结合

通过ELISA和FACS分别测试抗体与多个不相关的蛋白和细胞非特异性结合。非特异性结合ELISA在96孔高结合板(Nunc-Immuno Plate，Thermo Scientific)中进行。在4℃下用2μg/mL的各种抗原包被板过夜。用2％BSA-PBS封闭后，将10μg/ml测试抗体加入平板并孵育2小时。随后将板与二抗-山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl)再孵育1小时。通过加入TMB过氧化物酶底物检测HRP信号，使并用 2M HCl在12分钟后停止反应。使用酶标仪(MolecularDevice)读取450nm处的吸光度。所有孵育步骤均在室温下进行。在两步之间用 PBST(0.05％Tween20-PBS)洗涤平板。流式细胞仪用于检测抗体对各种细胞系的非特异性结合。简而言之，将活细胞以1500rpm离心4 分钟，然后重悬于合适体积的1％BSA/1×PBS至1x10⁶个细胞/ml的浓度。将100μl细胞悬液加入96孔U形板的每个孔中。离心后，将细胞用100μl/孔的稀释的在1％BSA/1×PBS中的10μg/ml的测试抗体重悬。在4℃下孵育1小时后，将细胞用1％BSA/1×PBS洗涤两次，然后与5μg/ml山羊抗人IgG Fc-PE(Jackson，109-115-098和126973) 在4℃孵育30分钟。洗涤两次后，将细胞重悬于100μl/孔的1％ BSA/1×PBS中，并在黑暗中保持在4℃直至FACS分析(BD Canto II)。

结果：

在测试中没有观察到双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP的非特异性结合，如表9A和9B所示。

表9A.通过ELISA对双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP进行非特异性结合测试。

*特异性结合

表9B.通过FACS对双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP进行非特异性结合测试。

*特异性结合

实施例4.动物实验

体内抗肿瘤药效实验

6-8周龄的雌性NOG小鼠(Beijing Vital River Laboratory Animal TechnologyCo.,LTD)用于该实验。Raji肿瘤细胞(ATCC CCL-86TM)在10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基中，在37℃5％二氧化碳培养箱中培养。肿瘤细胞每周按常规继代培养两次。收获处于指数生长期的细胞并计数用于肿瘤接种。通过使用Ficoll-PaquePlus按照制造商的说明从单一健康供体的肝素全血中分离人PBMC。

对于预防模型，将Raji细胞(2.0×10⁶)与新鲜分离的PBMC (3.0×10⁶)或体外活化的PBMC(2.0×10⁶)一起皮下植入NOG小鼠，并在接种当天开始抗体注射，之后每周两次，共三周静脉注射抗体。体外活化的PBMC通过OKT3抗体刺激新鲜的PBMC制备。表10A 描述了模型分组信息。

对于治疗模型，使用预先混合的Raji肿瘤细胞(2.0×10⁶)和新鲜分离的PBMC(3.0×10⁶)在右上侧腹处皮下共同接种每只NOG小鼠。当平均肿瘤体积达到约74mm³时，将动物随机分组并接受第一次抗体注射。此后将小鼠用抗体每周两次静脉注射3周。模型分组信息在表10B中描述。

所有与动物处理、护理和研究有关的程序都是根据由药明康德实验动物护理和使用委员会(IACUC)批准的准则，遵循实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的指导进行的。对于所有肿瘤研究，对小鼠称重，并使用卡尺一周两次测量肿瘤生长。肿瘤体积被估计为1/2 (长×宽²)。

表10A.预防模型的小组信息

组	N<sup>a</sup>	Raji细胞	PBMC	抗体	剂量<sup>b</sup>
						1	8	2.0 x 10<sup>6</sup>	新鲜的,3 x 10<sup>6</sup>	人IgG4对照	2mg/kg
2	8	2.0 x 10<sup>6</sup>	新鲜的,3 x 10<sup>6</sup>	BMK4	1.5mg/kg
						3	8	2.0 x 10<sup>6</sup>	新鲜的,3 x 10<sup>6</sup>	T3U3.E4-1.uIgG4.SP	1.5mg/kg
4	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	活化的,2 x 10<sup>6</sup>	人IgG4对照	1.5mg/kg
						5	5	2.0 x 10<sup>6</sup>	活化的,2 x 10<sup>6</sup>	T3U3.E4-1.uIgG4.SP	1.5mg/kg

表10B.治疗模型的小组信息

组	N<sup>a</sup>	Raji细胞	新鲜PBMC	抗体	剂量<sup>b</sup>
						1	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	人IgG4对照	5mg/kg
2	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	BMK4	5mg/kg
						3	7	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	BMK4	0.5mg/kg
4	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	BMK4	0.05mg/kg
						5	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	T3U3.E4-1.uIgG4.SP	5mg/kg
6	7	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	T3U3.E4-1.uIgG4.SP	0.5mg/kg
						7	7	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	T3U3.E4-1.uIgG4.SP	0.05mg/kg
8	6	2.0 x 10<sup>6</sup>	3 x 10<sup>6</sup>	BMK1	0.5mg/kg

a：每组动物的数量；

b：每只小鼠接受剂量体积：10ml/kg。

结果：

在预防模型中，于肿瘤接种当天(第0天)即开始注射抗体，结果显示双特异性抗体T3U3.E4-1.IgG4.SP和BMK4完全预防肿瘤生长(图9A)，IgG对照组肿瘤正常生长。

在治疗模型中，在Raji细胞已经生长成瘤以后，小鼠每周两次接受抗体注射，每组小鼠接受不同剂量(0.05mg/kg或0.5mg/kg或 5mg/kg)的抗体注射，注射共持续3周。结果显示，双特异性抗体 T3U3.E4-1.IgG4.SP可以在所有测试剂量下抑制肿瘤生长，相反， BMK4仅在最高剂量5mg/kg时才抑制肿瘤。此外，0.05mg/kg的双特异性抗体T3U3.E4-1.IgG4.SP显示出与0.5mg/kg的BMK1(利妥昔单抗)和5mg/kg的BMK4同样有效的明显抑制肿瘤生长的效果(图 9B)。

此外，如图9C和表11所示，当在等摩尔剂量(＝0.5mg/kg)下比较抗体药效时，双特异性抗体T3U3.E4-1.uIgG4.SP与BMK1(利妥昔单抗)和BMK4相比表现出最有效的抑制肿瘤生长和根除肿瘤的效力。

表11.在等摩尔剂量下抑制体内肿瘤生长的抗体药效的比较。

综上所述，这些结果证明T3U3.E4-1.uIgG4.SP的体内抗肿瘤活性是非常有效的。

本领域技术人员可以认识和理解本专利描述，在不脱离其本质或基本特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，其他变化应该被理解为在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 无锡智康弘义生物科技有限公司

<120> 新型的抗CD3/抗CD20双特异性抗体

<130> IDC196036

<150> CN201810533611.0

<151> 2018-05-29

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> “抗CD3臂”的全长氨基酸序列

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln

85 90 95

Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

275 280 285

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

290 295 300

Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro

305 310 315 320

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn

325 330 335

Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp

340 345 350

Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu

355 360 365

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr

370 375 380

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

385 390 395 400

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

405 410 415

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

420 425 430

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

435 440 445

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

450 455 460

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

465 470 475 480

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

485 490 495

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

500 505 510

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

515 520 525

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

530 535 540

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

545 550 555 560

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

565 570 575

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

580 585 590

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

595 600 605

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

610 615 620

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

625 630 635 640

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

645 650 655

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

660 665 670

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

675 680 685

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

690 695 700

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

705 710 715 720

Leu Ser Leu Gly Lys

725

<210> 2

<211> 723

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> “抗CD20臂” 的全长氨基酸序列

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

275 280 285

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

290 295 300

Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp

325 330 335

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser

340 345 350

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

370 375 380

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

405 410 415

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

420 425 430

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

435 440 445

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

450 455 460

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

465 470 475 480

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

485 490 495

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

500 505 510

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

515 520 525

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

530 535 540

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

545 550 555 560

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

565 570 575

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

580 585 590

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

595 600 605

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

610 615 620

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

625 630 635 640

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

645 650 655

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

660 665 670

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val

675 680 685

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

690 695 700

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

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Leu Gly Lys

<210> 3

<211> 2175

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码“抗CD3臂”的核苷酸序列

<400> 3

gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60

atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120

tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180

cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240

attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300

cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtggc 660

ggaggcggca gcggcggagg gggatccgga ggcggcggga gcggcggcgg agggagcgga 720

ggaggcgggt ccggaggcgg cgggagtgga ggaggagggt ccggcggcgg agggagcgga 780

ggaggaggga gcggcggggg cgggtctgga ggaggcgggt ccggaggagg cgggtcacag 840

gtgcagcttg tgcagtctgg ggcagaagtg aagaagcctg ggtctagtgt caaggtgtca 900

tgcaaggcta gcgggttcgc ctttactgac tactacatcc actgggtgcg gcaggctccc 960

ggacaagggt tggagtggat gggatggatc tccccaggca atgtcaacac aaagtacaac 1020

gagaacttca aaggccgcgt caccattacc gccgacaaga gcacctccac agcctacatg 1080

gagctgtcca gcctcagaag cgaggacact gccgtctact actgtgccag ggatgggtac 1140

tccctgtatt actttgatta ctggggccag ggcacactgg tgacagtgag ctccgcgtcg 1200

accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 1260

gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 1320

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 1380

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 1440

tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 1500

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 1560

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 1620

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 1680

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 1740

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1800

gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1860

ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatgccagg aggagatgac caagaaccag 1920

gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1980

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 2040

tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 2100

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 2160

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<210> 4

<211> 2169

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码“抗CD20臂”的核苷酸序列

<400> 4

gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60

ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120

gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180

cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300

gggacacgcc tggagattaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggcggagg cggcagcggc 660

ggagggggat ccggaggcgg cgggagcggc ggcggaggga gcggaggagg cgggtccgga 720

ggcggcggga gtggaggagg agggtccggc ggcggaggga gcggaggagg agggagcggc 780

gggggcgggt ctggaggagg cgggtccgga ggaggcgggt cagaggtgca attggtggag 840

agcggaggag ggctcgtgca gcctggaaga tctcttaggc tgagttgcgc tgcatctggg 900

ttcacattca acgactacgc catgcactgg gtgaggcagg ctcccggcaa agggctggaa 960

tgggtgtcaa ctatctcctg gaactccggc agcatcggct acgccgatag cgtcaagggc 1020

cggtttacaa tttcccgcga taacgccaag aagtccctgt acctgcagat gaacagcctg 1080

cgggccgagg atactgccct ctactactgt gccaaggaca ttcagtacgg gaattactat 1140

tacgggatgg acgtctgggg ccaggggacc accgtgacag tcagctccgc gtcgaccaag 1200

ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 1260

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 1320

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 1380

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 1440

gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 1500

ccatgcccac catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 1560

ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 1620

gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 1680

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1740

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1800

aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1860

gagccacagg tgtgcaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1920

ctgagctgcg cggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1980

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 2040

ttcctcgtta gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 2100

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 2160

ctgggtaaa 2169

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头的序列(“铰链序列”)

<400> 5

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG4 Fc区片段

<400> 6

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

Claims

1.双特异性抗体或其抗原结合部分，其由下述组成：特异性结合CD3的第一抗原结合位点和特异性结合CD20的第二抗原结合位点，以及人IgG4 Fc区，并且所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点各自通过铰链序列连接至所述人IgG4 Fc区，其中所述第一抗原结合位点为SEQ ID NO：1所示，所述第二抗原结合位点为SEQ ID NO：2所示，所述铰链序列为SEQ ID NO：5所示，所述人IgG4 Fc区为SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分是杵臼形式。

3.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。

4.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分以1x10^-7M或更小的K_D结合细胞表面人CD20，如通过FACS测量的。

5.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分以1×10^-8M或更小的K_D结合细胞表面人CD3，如通过FACS测量的。

6.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分在靶细胞存在下诱导T细胞活化。

7.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分有效调节B淋巴细胞的杀伤。

8.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分例如在DSF测试、血清稳定性测试和碱胁迫测试中是稳定的。

9.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分与食蟹猴CD3和CD20抗原交叉反应。

10.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体的核酸序列。

11.一种载体，其包含权利要求10的分离的核酸分子。

12.一种宿主细胞，其包含权利要求11的载体。

13.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-9中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

14.一种制备权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：

-在权利要求12的宿主细胞中表达权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞中分离双特异性抗体或其抗原结合部分。

15.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者的免疫应答的药物中的用途。

16.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗受试者中的异常细胞生长的药物中的用途。

17.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的药物中的用途。

18.权利要求16或17的用途，其中所述细胞是白血病肿瘤细胞。

19.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于减少受试者中的肿瘤细胞转移的药物中的用途。

20.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的药物中的用途。

21.权利要求1-9中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的诊断剂中的用途。

22.前述权利要求中任一项所定义的用途，其中所述肿瘤或癌包括B细胞癌症，例如慢性淋巴瘤(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

23.用于治疗或诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病的试剂盒，其包含容器，所述容器包含至少一种如权利要求1-9中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分。