CN110036027A

CN110036027A - 新型t细胞受体及其免疫治疗应用

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Publication number: CN110036027A
Application number: CN201780075298.4A
Authority: CN
Inventors: 莉奥妮·阿尔滕; 塞巴斯蒂安·邦克; 多米尼克·莫勒; 克劳迪娅·瓦格纳
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2019-07-19
Also published as: AU2017373815C1; US10527623B2; JP2020511936A; US20200249233A1; TW201828977A; CA3045234A1; WO2018104478A1; US20180306789A1; CR20190276A; DE102016123859B3; KR20190086562A; US20180164315A1; US10725044B2; EP3551654A1; MX2019006727A; PE20191081A1; AU2017373815A1; AU2017373815B2; BR112019010699A2

Abstract

本发明涉及针对源自靶蛋白DDB1和CUL4相关因子4样2(DCAF4L2)的肿瘤相关抗原(TAA)的抗原识别构建体。本发明特别提出了对本发明TAA具有选择性和特异性的新型T细胞受体(TCR)类分子。本发明的TCR及其衍生的TAA结合片段可用于诊断、治疗和预防表达TAA的癌性疾病。还提出了编码本发明抗原识别构建体的核酸、包含这些核酸的载体、表达抗原识别构建体的重组细胞以及包含本发明化合物的药物组合物。

Description

新型T细胞受体及其免疫治疗应用

技术领域

本发明涉及针对源自靶蛋白DDB1和CUL4相关因子4样2(DCAF4L2)的肿瘤相关抗原(TAA)的抗原识别构建体。本发明特别提出了对本发明TAA具有选择性和特异性的新型T细胞受体(TCR)类分子。本发明的TCR及其衍生的TAA结合片段可用于诊断、治疗和预防表达TAA的癌性疾病。还提出了编码本发明抗原识别构建体的核酸、包含这些核酸的载体、表达抗原识别构建体的重组细胞、以及包含本发明化合物的药物组合物。

背景技术

基于T细胞的免疫治疗靶标代表作用于主要组织相容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。这些肿瘤相关抗原(TAA)可以是源自所有蛋白类型的肽，如酶、受体、转录因数等，他们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。

细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRiP)的氨基酸残基的主要组织相容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。

MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。肽和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征肿瘤相关抗原和相应T细胞受体在开发癌症免疫治疗(如：疫苗和细胞治疗)中非常重要。

在MHC I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗和细胞疗法)研发的起点。

大约90％的外周血T细胞表达由一个α多肽和一个β多肽组成的TCR。除了αβT细胞外，还有一小部分T细胞(约占总T细胞的5％)表现出由一个γ多肽和一个δ多肽组成的TCR。在被称为上皮内淋巴细胞(IEL)的淋巴细胞群内，发现γδT细胞在其肠道黏膜中丰度最高。启动γδT细胞的抗原性分子仍然鲜为人知。但是，γδT细胞不是MHC限制性细胞，似乎能够识别整个蛋白质，而不是要求肽在抗原提呈细胞上由MHC分子提呈，虽然有些识别MHC IB类分子。构成外周血中主要γδT细胞群的人Vγ9/Vδ2T细胞具有独特性，它们特异性地且快速地应答小非肽类微生物代谢物HMB-PP(一种异戊烯基焦磷酸盐前体)。

T细胞克隆的T细胞抗原受体的链各自由指定可变(V)、[多样性(D)]、连接(J)和恒定(C)结构域的独特组合构成。在每个T细胞克隆中，α和β链或δ和γ链的V、D和J结构域的组合以该T细胞克隆独特特征的方式参与抗原识别，并定义一个独特的结合位点(也被称为独特型T细胞克隆)。而C结构域不参与抗原结合。

TCR是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与介导信号转导的CD3复合体的不变蛋白质相关。TCR以αβ和γδ形式存在，其结构相似，但解剖位置非常不同，也可能功能也非常不同。天然异二聚体αβTCR和γδTCR的细胞外部分各自均由两个多肽组成，每个多肽都有一个膜近端恒定结构域和一个膜远端可变结构域。每个恒定和可变结构域都包括一个链内二硫键。可变结构域包含与抗体互补决定区(CDR)类似的高度多态性环。使用TCR基因疗法可克服目前的一些障碍。它可让患者自己的T细胞在短时间内具有所需的特异性并产生足够数量的T细胞，从而避免其耗尽。TCR将被转导至中央记忆T细胞或具有干细胞特征的T细胞中，这可确保转移时产生更好的持久性和功能。TCR工程化T细胞将透过化学疗法或照射被注入淋巴细胞减少的癌症患者，从而获得有效的植入，但抑制免疫抑制。

DCAF4L2基因编码DDB1和CUL4相关因子4样2。此蛋白的特定功能尚待阐明；不过DCAF4L2基因被证明与视盘形态和唇裂发育有关。Springelkamp H,et al.Meta-analysisof Genome-Wide Association Studies Identifies Novel Loci Associated WithOptic Disc Morphology.Genet Epidemiol.2015Mar；39(3):207-16.Beaty TH etal.Confirming genes influencing risk to cleft lip with/without cleft palatein a case-parent trio study.Hum Genet.2013Jul；132(7):771-81)。

虽然在开发用于癌症治疗的分子靶向药物方面取得了进展，但是，本领域仍然需要开发特异靶向高度特异于癌细胞的分子的抗癌新药。本发明说明书通过提供与所公开的TAA表位特异结合的衍生自DCAF4L2的TAA-表位的新型TCR、各自的重组TCR构建体、核酸、载体和宿主细胞，以及使用这些分子治疗癌症的方法来满足此需求。

发明内容

在第一方面，本发明的目标通过抗原识别构建体来解决，所述抗原识别构建体包含至少一个互补决定区(CDR)3，其与选自SEQ ID NO：3、9、15、21、27和33的氨基酸序列至少具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或优选为100％序列同一性。

根据本发明的抗原识别构建体识别并特异性识别本发明的表位，该表位包含SEQID NO:49的氨基酸序列“ILQDGQFLV”(单字母密码)或由其组成，在本文中称为“DCAF4L2-001”，或有时仅称为本发明的“肽”或“表位”。优选该肽与MHC结合时被识别。US2016-0280738A1(在本文全部并入)公开了DCAF4L2-001肽及其用途。

在一些实施方案中(也参见下文)，本发明的抗原识别构建体特异性结合TAA-肽-HLA分子复合体，其中所述TAA肽包含TAA变体或其药用盐或由TAA变体或其药用盐组成，所述变体与SEQ ID NO:49至少66％、优选至少77％、更优选至少88％同源(优选为至少77％或至少88％相同)，其中所述变体与HLA I类或II类分子结合和/或诱导与所述肽交叉反应的T细胞，其中所述肽不是基础的全长多肽。

附图说明

图1：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或在SEQ ID NO:1的1-9位有取代的多种DCAF4L2-001丙氨酸取代变体(SEQ ID NO:50-58)、或对照肽NYESO1-001(SEQ IDNO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R36P3F9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图2：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或在SEQ ID NO:1的1-9位有取代的多种DCAF4L2-001丙氨酸取代变体(SEQ ID NO:50-58)、或对照肽NYESO1-001(SEQ IDNO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R52P2G11的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图3：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或在SEQ ID NO:1的1-9位有取代的多种DCAF4L2-001丙氨酸取代变体(SEQ ID NO:50-58)、或对照肽NYESO1-001(SEQ IDNO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R53P2A9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图4：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或同源而不相关的肽GRB14-002肽(SEQ ID NO:59)、SNR-004(SEQ ID NO:60)、WRN-002(SEQ ID NO:61)、MUC-009(SEQ ID NO:62)、GSTA4-001(SEQ ID NO:63)、PFN1-001(SEQ ID NO:64)、VPS39-001(SEQ ID NO:65)、AHR-002(SEQ ID NO:66)、KCM-001(SEQ ID NO:67)或VPS51-001(SEQ ID NO:68)、或对照肽NYESO1-001(SEQ ID NO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R36P3F9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图5：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或同源而不相关的肽GRB14-002肽(SEQ ID NO:59)、SNR-004(SEQ ID NO:60)、WRN-002(SEQ ID NO:61)、MUC-009(SEQ ID NO:62)、GSTA4-001(SEQ ID NO:63)、PFN1-001(SEQ ID NO:64)、VPS39-001(SEQ ID NO:65)、AHR-002(SEQ ID NO:66)、KCM-001(SEQ ID NO:67)或VPS51-001(SEQ ID NO:68)、或对照肽NYESO1-001(SEQ ID NO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R52P2G11的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图6：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或同源而不相关的肽GRB14-002肽(SEQ ID NO:59)、SNR-004(SEQ ID NO:60)、WRN-002(SEQ ID NO:61)、MUC-009(SEQ ID NO:62)、GSTA4-001(SEQ ID NO:63)、PFN1-001(SEQ ID NO:64)、VPS39-001(SEQ ID NO:65)、AHR-002(SEQ ID NO:66)、KCM-001(SEQ ID NO:67)或VPS51-001(SEQ ID NO:68)、或对照肽NYESO1-001(SEQ ID NO:69)的T2靶细胞进行共同孵育后，经TCR R53P2A9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图7：分别经TCR R52P2G11和R53P2A9的α和β链RNA电穿孔的CD8+ T细胞的HLA-A*02/DCAF4L2-001四聚体或HLA-A*02/NYESO1-001四聚体染色。经与HLA-A*02/NYESO1-001复合体特异性结合的1G4TCR的RNA电穿孔的CD8+ T细胞和空白电穿孔的CD8+ T细胞作为对照。

图8：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)的T2靶细胞在10μM至10pM的多个载肽浓度下共同孵育后，经TCR R52P2G11的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。供体1(TCR A-0006)显示于左侧Y轴上，供体2(TCR A-0007)显示于右侧Y轴上。

图9：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)的T2靶细胞在10μM至10pM的多个载肽浓度下共同孵育后，经TCR R53P2A9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。供体1(TCR A-0006)显示于左侧Y轴上，供体2(TCR A-0007)显示于右侧Y轴上。

图10：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)的T2靶细胞在10μM至10pM的多个载肽浓度下共同孵育后，经TCR R36P3F9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+T细胞的IFN-γ释放。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图11：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或在SEQ ID NO:1的1-9位有取代的多种DCAF4L2-001苏氨酸取代变体(SEQ ID NO:70-78)、或对照肽NYESO1-001(SEQ IDNO:69)的T2靶细胞进行共同培养后，经TCR R52P2G11的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+ T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图12：在与载有DCAF4L2-001肽(SEQ ID NO:49)、或在SEQ ID NO:1的1-9位有取代的多种DCAF4L2-001苏氨酸取代变体(SEQ ID NO:70-78)、或对照肽NYESO1-001(SEQ IDNO:69)的T2靶细胞进行共同培养后，经TCR R53P2A9的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+ T细胞的IFN-γ释放。用源自两个不同健康供体的CD8+T细胞获得IFN-γ释放数据。单独的RNA电穿孔的CD8+ T细胞或其与未加载的靶细胞的共孵育作为对照。

图13：在用含有TCR R52P2G11或R53P2A9的α和β链的不同构建体进行慢病毒转导后对T细胞的肿瘤生长(A、B、C、D)和IFN-γ释放(E、F)的影响，以评估在表达DCAF4L2的A375细胞中内源性地处理和提呈的DCAF4L2-001的TCR介导识别(B、D、F)。靶标阴性A375细胞作为对照(A、C、E)。数据来自2个供体：141540(A、B、E、F)和105(C、D、E、F)。

具体实施方式

用于本文时，当在本文中用于两个或更多个核酸或蛋白质/多肽序列背景下任何地方时，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列相同或具有(即，至少具有)特定百分比的氨基酸残基或核苷酸，所述氨基酸残基或核苷酸透过使用序列比较演算法测量或人工比对和目视检查相同(即，在指定区域中，当在比较视窗或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，优选为在全长序列中，具有或至少具有约60％同一性，优选具有或至少具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％同一性，更优选具有或至少具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)(例如参见NCBI网站)。在一项特定的实施方案中，例如，当将本发明的抗原识别构建体的蛋白质或核酸序列与另一种蛋白质/基因进行比较时，同一性百分比可透过Human Olfactory Data Explorer(例如，https://genome.weizmann.ac.il/cgi-bin/horde/blastHorde.pl)支持的Blast搜索来确定；特别是用于确定氨基酸同一性时，使用含有以下参数的BLASTP 2.2.28+搜索：矩阵：BLOSUM62；空位罚分：存在：11，扩展：1；相邻词语阈值：11；多重命中窗口：40。

在本发明的背景下，应当理解的是，被称为“包括”本发明某些特征的任何实施方案应被理解为在一些更优选的实施方案中纳入由本发明非常相同特征“组成”或“基本上组成”的更加严格的描述。

在另一个附加或替代实施方案中，抗原识别构建体还可包含CDR1和/或CDR2结构域序列。在可变结构域内，CDR1和CDR2位于多肽链的可变(V)区域，CDR3包括一部分V区域、全部多样性(D)区域和连接(J)区域。CDR3是最可变的，是负责特异性和选择性识别抗原的主要CDR。CDR1和CDR2序列可能选自人可变链等位基因的CDR序列。

天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。每个链都包括可变、连接和恒定区域，β链通常还包括可变区和连接区之间的短多样性区域，但是该多样性区域常被视为连接区域的一部分。每个可变区都包括嵌入在框架序列中的三个CDR(互补决定区)，其中一个是称为CDR3的高度可变区。存在几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，由其框架、CDR1和CDR2序列及部分定义的CDR3序列区分。Vα类型透过唯一的TRAV号在IMGT命名中提及，Vβ类型透过唯一的TRBV号被提及。关于免疫球蛋白抗体和TCR基因的更多信息，参见Lefranc MP等人(Nucleic Acids Res.2015Jan；43(Databaseissue):D413-22；and http://www.imgt.org/)。

因此，在一个附加或替代实施方案中，本发明的抗原识别构建体包含如下文表1中所数的CDR1、CDR2和CDR3序列组合，其与CDR3序列一起显示相应的可变链等位基因。因此，优选的是本发明的抗原识别构建体，其包含至少一个、优选为全部三个CDR序列CDR1、CDR2和CDR3。优选情况是，本发明的抗原识别构建体包含本文公开的本发明的单个TCR可变区的各CDR1至CDR3(参见下文表1和实施例章节)。

本文所用术语“特异性”或“抗原特异性”或“特异性针对”给定抗原系指当所述抗原由HLA，优选为HLA A2提呈时，抗原识别构建体可与所述抗原特异性结合，优选为TAA抗原，更优选为具有高亲合力的抗原。例如，作为抗原识别构建体的TCR可视为对TAA具有“抗原特异性”，条件是在与使用低浓度TAA抗原，例如下文提出的TAA表位和抗原(例如，约10-11mol/l、10-10mol/l、10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l)脉冲处理的靶细胞共培养时，表达TCR的TAA接触的T细胞分泌至少约200pg/ml或以上(例如，250pg/ml或以上、300pg/ml或以上、400pg/ml或以上、500pg/ml或以上、600pg/ml或以上、700pg/ml或以上、1000pg/ml或以上、2,000pg/ml或以上、2,500pg/ml或以上、5,000pg/ml或以上)的干扰素γ(IFN-γ)。替代或附加情况是，如果表达TCR的T细胞在与低浓度TAA抗原脉冲的靶细胞共培养时分泌至少两倍于IFN-γ未转染背景水准的IFN-γ，则认为TCR对TAA具有“抗原特异性”。如上所述的这种“特异性”可用ELISA进行分析。

在本发明的一个替代或附加实施方案中，抗原识别构建体选择性地与TAA衍生的抗原性肽结合；优选其中TAA抗原性肽为具有SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的蛋白质表位或肽或其变体，其中所述变体氨基酸缺失、添加、插入或取代不超过三个、优选为两个、最优选为不超过一个氨基酸位置。抗原识别构建体可选择性地与TAA肽DCAF4L2-001_A1至A9(如SEQ ID NO:50至58所示)和DCAF4L2-001_T1至T9(如SEQ ID NO:70至78所示)的修饰版本(变体)结合。相比之下，抗原识别构建体不与DCAF4L2-001具有相似序列的肽(如SEQ IDNO:59至68所示)结合。

术语“选择性”或“选择性识别/结合”被理解为是指抗原识别构建体(如TCR或抗体)的性质，选择性地识别或结合至优选仅一个特异性表位，优选为与另一个表位没有或基本上没有交叉反应。优选情况为，术语“选择性”或“选择性识别/结合”是指抗原识别构建体(例如TCR)选择性地识别或结合优选仅一个特异性表位，且优选为与另一个表位没有或基本上没有交叉反应，其中所述表位对于一种蛋白质是独特的，使得抗原识别构建体对另一种表位和另一种蛋白质没有或基本上没有交叉反应性。

根据本发明的抗原识别构建体优选为选自抗体或其衍生物或片段、或T细胞受体(TCR)或其衍生物或片段。本发明的抗体或TCR的衍生物或片段应优选为可保留母体分子的抗原结合/识别能力，特别是其如上所述的特异性和/或选择性。此类结合功能可以透过如本文所定义的CDR3区的存在来保留。

在本发明的一实施方案中，本发明的TCR能够以主要组织相容性复合体(MHC)I类依赖性方式识别TAA抗原。本文使用的“MHC I类依赖性方式”系指在MHC I类分子的背景中在结合TAA抗原时TCR引起免疫应答。MHC I类分子可以是本领域已知的任何MHC I类分子，例如HLA-A分子。在本发明的一项优先实施方案中，MHC I类分子为HLA-A2分子。

本发明提供单链抗原识别构建体和双链识别构建体。

在一实施方案中，该TCRα可变结构域具有至少一个与表1所示TCRα结构域相关的突变；和/或该TCRβ可变结构域具有至少一个与表1所示TCRβ结构域相关的突变。在一实施方案中，TCRα可变结构域和/或TCRβ可变结构域中包含至少一个突变的TCR对于TAA肽HLA分子复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少是包含未突变TCRα结构域和/或未突变TCRβ可变结构域的TCR的两倍。

本说明书的TCRα链可能进一步包含TCRα跨膜结构域和/或TCRα细胞内结构域。本说明书的TCRβ链可能进一步包含TCRβ跨膜结构域和/或TCRβ细胞内结构域。

本发明特别提出一种作为抗原识别构建体或其片段或衍生物的TCR。TCR优选为人TCR，其被理解为由人TCR基因座产生，因此包含人TCR序列。此外，本发明TCR的特征在于它源自人，并且特异性地识别本发明的TAA抗原。

本发明的另一项实施方案另外提供上述抗原识别构建体，其诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素(IFN)γ水准增加。

本发明的TCR可以为单链α或β，或γ和δ分子，或为由α和β链或γ和δ链两者组成的双链构建体。

本发明的抗原识别构建体可能包含TCRα或γ链；和/或TCRβ或δ链；其中所述TCRα或γ链包含与选自SEQ ID No.3、15和27的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和/或其中所述TCRβ或δ链包含与选自SEQ ID No.9、21和33的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。

最优选地，在一些另外的实施方案中，其中本披露是指包含本文公开的TCR链的任何一个、两个或全部CDR1至CDR3区的抗原识别构建体(参见表1)，此类抗原识别构建体可能为优选，其包含本发明相应的CDR序列，其不超过三个、两个、优选为仅一个修饰的氨基酸残基。修饰的氨基酸残基可能选自氨基酸插入、缺失或取代基。最为优先的情况是三个、两个、优选为仅一个修饰的氨基酸残基为相应CDR序列的第一个或最后一个氨基酸残基。如果修饰是取代，则在一些实施方案中优选取代为保守的氨基酸取代。

如果本发明的抗原识别构建体由至少两个氨基酸链(如双链TCR或其抗原结合片段)组成，则抗原识别构建体可能包含根据SEQ ID NO:3的第一个多肽链氨基酸序列和根据SEQ ID NO:9的第二个多肽链氨基酸序列；或根据SEQ ID NO:15的第一个多肽链氨基酸序列和根据SEQ ID NO:21的第二个多肽链氨基酸序列；或根据SEQ ID NO:27的第一个多肽链氨基酸序列和根据SEQ ID NO:33的第二个多肽链氨基酸序列。上述任一双链TCR或其抗原结合片段均是本发明的优选TCR。在一些实施方案中，本发明双链TCR的CDR3可能突变。如上所述的SEQ ID NO:9至28的CDR3序列突变优选包括取代、缺失、添加或插入不超过3个、优选为2个、最优选为不超过1个氨基酸残基。在一些实施方案中，第一个多肽链可能是TCRα或γ链，第二个多肽链可能是TCRβ或δ链。优选为αβ或γδTCR的组合。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段由TCRα和TCRβ链或γ和δ链组成。此类双链TCR包括在每个链可变区内，并且各可变区包含一个CDR1、一个CDR2和一个CDR3序列。TCR包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10(R36P3F9)或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22(R52P2G11)或SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:34(R53P2A9)可变链氨基酸序列中所包含的CDR1至CDR3序列。

本发明的一些实施方案涉及由TCRα和TCRβ链组成的TCR或其片段，其中所述TCR包含与选自分别根据SEQ ID NO:4和10或16和22或28和34的α和β链的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或优选为100％序列同一性的可变区序列。

本发明的TCR可以进一步包含源自任何合适物种的恒定区，如任何哺乳动物，例如：人、大鼠、猴、兔、驴或小鼠。在本发明的一项实施方案中，本发明的TCR进一步包含人恒定区。在一些优选实施方案中，本发明TCR的恒定区可例如透过引入异源序列、优选为小鼠序列来稍加修饰，这可能增加TCR的表达和稳定性。

本发明的一些实施方案涉及由TCRα和TCRβ链组成的TCR或其片段，其中所述TCR包含与选自分别根据SEQ ID NO:5和11或17和23或29和35的α和β链的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或优选为100％序列同一性的恒定区域。

本发明的TCRα或γ链还可能包含与选自SEQ ID No.1、13和25的氨基酸具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1和/或与选自SEQ ID No.2、14和26的氨基酸具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2。

根据本发明，TCRβ或δ链还可能包含与选自SEQ ID No.7、19和31的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1和/或与选自SEQ ID No.8、20和32的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2。

在一项进一步的实施方案中，抗原识别构建体可能包含TCR的结合片段，并且其中所述结合片段包含CDR1至CDR3，其或可选自具有SEQ ID No.1、2、3或7、8、9或13、14、15或19、20、21或25、26、27或31、32、33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

在本发明的进一步实施方案中，本文其他地方所述的抗原识别构建体是由至少一个TCRα和一个TCRβ链序列组成的TCR或其片段，其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:7至9的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID NO:13至15的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:19至21的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID NO:25至27的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:31至33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

在本发明的进一步实施方案中，前文所述的抗原识别构建体是由至少一个TCRα和一个TCRβ链序列组成的TCR或其片段，其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变区序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID No.16的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID No.22的氨基酸序列的可变区序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID No.28的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID No.34的氨基酸序列的可变区序列。

在本发明的进一步实施方案中，前文所述的抗原识别构建体是TCR或其片段，其还包含与选自SEQ ID No.5、11、17、23、29和35的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的TCR恒定区；优选地，其中TCR由至少一个TCRα和一个TCRβ链序列组成，其中TCRα链序列包含与SEQ ID No.5、17和29的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的恒定区。

此外，所披露的是前文所述的抗原识别构建体，其包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。本发明还提出了TCR，其包含与SEQ ID No.18的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ ID No.24的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。在进一步的实施方案中，本发明提出的抗原识别构建体为TCR并且包含与SEQ ID No.30的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ IDNo.36的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。

本文所用的术语“鼠”或“人”在提及抗原识别构建体或TCR时，或本文所述的TCR的任何组分(例如，互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区，α链和/或β链)是指分别源自小鼠或人未经排列的TCR基因座的TCR(或其组分)。

在本发明的一项实施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR链包含来自多物种的序列。优选情况为，本发明的TCR可包含α链，其包含α链的人可变区和例如鼠TCRα链的鼠恒定区。

在一项实施方案中，本发明的TCR是由根据上述实施方案的人可变区和人恒定区组成的人TCR。

在一些实施方案中，抗原识别构建体被鼠源化或人源化。当将来自外来物种的氨基酸序列引入本发明的构建体时，使用这些术语。鼠源化可能透过鼠类对应物取代人TCRα和TCRβ恒定区，或者可能将必需的鼠(氨基酸)残基引入介导增强功能效应的序列中。在人源化序列中，鼠序列透过引入人对应物或残基而被修饰。

为了避免TCR链错配，可修饰本发明的TCR。术语“错配”应涉及本发明的TCRα/γ或β/δ转基因的TCR链与内源性TCRα/γ或β/δ链之间的不正确配对，并导致转基因TCRαβ/γδ异二聚体细胞表面表达稀释，这降低了修饰T细胞的功能性亲合力。优选地，根据IMGT编号的TCR可变结构域中第44位的Q被本发明TCR的一条或两条链中的另一个氨基酸取代。取代优选地选自R、D、E、K、I、W和V组成的组。

本发明的TCR可能为单链TCR(scTCR)。scTCR可包含第一TCR链(例如，α链)的可变区的多肽和整个(全长)第二TCR链(例如，β链)的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任选地包含一个或多个将两个或多个多肽连接在一起的接头。例如，接头可以是肽，其将两个单链连接在一起，如本文所述。还提供了本发明的scTCR，其与人细胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。

本发明的抗原识别构建体还可能以包含至少两个scTCR分子的多聚复合体形式提供，其中所述scTCR分子各自与至少一种生物素部分或其他相互连接的分子/接头融合，并且其中所述scTCR透过生物素—链霉亲和素相互作用相互连接，以形成所述多聚体复合体。本领域已知的用于产生多聚体TCR的类似方法也是可能的并且包括在本披露资料中。还提出了更高级的多聚体复合体，其包含本发明两种以上的scTCR。

为了本发明的目的，TCR是具有至少一个TCRα或γ和/或TCRβ或δ可变结构域的部分。通常，它们包括TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域，或者TCRγ可变结构域和TCRδ可变结构域两者。它们可能为αβ/γδ异源二聚体，也可能为单链形式。为了用于过继疗法，αβ或γδ异二聚体TCR可能例如被转染为具有细胞质和跨膜结构域的全长链。如果需要，相应恒定结构域残基之间可能存在引入的二硫键。

在一项优选的实施方案中，抗原识别构建体为人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是一种TCR，其包含超过50％的相应人TCR序列。优选情况为，只有少部分TCR序列为人工来源或源自其他物种。然而，众所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定结构域含有鼠源序列是有利的。因此，特别优选的是根据本发明的TCR，其在其恒定结构域的细胞外部分含有鼠序列。

因此，又为优选的是本发明的抗原识别构建体能够以人白细胞抗原(HLA)依赖性方式、优选以HLA-A02依赖性方式识别其抗原。在本发明的上下文中，术语“HLA依赖性方式”系指抗原识别构建体仅在抗原肽由所述HLA提呈的情况下才与抗原结合。

在一项实施方案中，根据本发明的抗原识别构建体优选为诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素(IFN)γ水准增加。

本发明还提出了包含本文所述的任何TCR(或其功能变体)的功能部分的多肽，例如，选自实施例部分和表1中所述R36P3F9、R52P2G11和R53P2A9中的任何一种TCR。本文所用的术语“多肽”包括寡肽，并且系指透过一个或多个肽键连接的氨基酸的单链。关于本发明的多肽，功能部分可以是包含TCR(或其功能变体)连续氨基酸的任何部分，其中部分条件是功能部分与TAA抗原衍生肽DCAF4L2-001(SEQ ID NO:49，以及SEQ ID NO:50至58中的变体)特异性结合。当使用与TCR(或其功能变体)相关时，术语“功能部分”系指本发明TCR(或其功能变体)的任何部分或片段，其中该部分或片段保留TCR(或其功能变体)的生物活性，其为母体TCR或其亲代功能变体的一部分。功能部分包括，例如，保留与TAA抗原特异性结合的能力(以HLA依赖性方式)或以与母体TCR(或其功能变体)相似程度、相同程度或更高程度检测、治疗或预防癌症的TCR(或其功能变体)的那些部分。关于母体TCR(或其功能变体)，功能部分可以包括，例如，约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多母体TCR可变序列(或其功能变体)。

功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或两个末端包含额外的氨基酸，其中在母体TCR或其功能变体的氨基酸序列中未发现额外的氨基酸。理想的情况是，额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，特异性结合TAA抗原；和/或具有检测癌症、治疗或预防癌症等能力。更理想的是，与母体TCR或其功能变体的生物学活性相比，额外的氨基酸增强了生物学活性。

多肽可包含本发明TCR的α和β链的一个或两个功能部分或其功能变体，例如包含本发明TCR的α和/或β链可变区的CDR1、CDR2和(优选)CDR3之一或其功能变体的功能部分。在本发明的一项实施方案中，多肽可包含功能部分，其包含SEQ ID NO:3、9、15、21、27和33的氨基酸序列(本发明TCR可变区的CDR3)或其组合。在本发明的一项实施方案中，本发明的多肽可包括例如本发明TCR的可变区或其功能变体，其包含上述CDR区的组合。在这一点来说，多肽可包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28和34中的任一个氨基酸序列(本发明TCR的α或β链的可变区)。

在一些情况下，本发明的构建体可能包含一个或两个多肽链，其包含根据SEQ IDNO:1至36(CDR序列，恒定和可变区和全长序列)中任一项的一个序列或其功能片段，并且进一步包含其他氨基酸序列，例如，编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白质可以是融合蛋白。就此而言，本发明还提供了包含本文所述的至少一种本发明的多肽与至少一种其他多肽的融合蛋白。其他的多肽可以作为融合蛋白的单独多肽存在，或者可以作为与本文所述的本发明多肽之一框架(串联)表达的多肽存在。其他多肽可包括任何肽或蛋白质分子或其部分，包括但不限于免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等)。

融合蛋白可以包含本发明多肽的一个或多个拷贝和/或另一个多肽的一个或多个拷贝。例如，融合蛋白可包含本发明多肽和/或另一多肽的1、2、3、4、5个或更多个拷贝。制备融合蛋白的合适方法是本领域已知的，并且包括例如重组方法。在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR(及其功能部分和功能变体)、多肽和蛋白质可以表达为单一蛋白，其包含连接α链和β链和连接γ链和δ链的连接肽。就此而言，本发明的TCR(及其功能变体和功能部分)、多肽和蛋白质包含本发明TCR可变区的氨基酸序列，并且可能进一步包含接头肽。接头肽可以有利地促进宿主细胞中重组TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽和/或蛋白质的表达。接头肽可包含任何合适的氨基酸序列。单链TCR构建体的接头序列是本领域公知的。此类单链构建体可进一步包含一个或两个恒定结构域序列。在透过宿主细胞表达包括接头肽的构建体后，接头肽也可能被裂解，导致α和β链以及γ和δ链分离。

如上所述，本发明TCR的结合功能可能在抗体框架中提供。例如，本发明TCR的CDR序列，可能包括额外的3个、2个或1个N和/或C末端框架残基，可以直接接枝到抗体可变重/轻链序列中。本文中使用了各种语法形式的术语“抗体”，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点或互补位的分子。此类分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。本发明还提出了与本文所述的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合部分。抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任何同种型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)中分离和/或纯化的抗体。或者，抗体可以是基因工程化抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体或聚合体形式。

术语“抗体”包括但不限于基因工程化或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如胞内抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体(例如由“CDR移植”产生)、抗体片段和异源偶联抗体(例如双特异性抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体等)。术语“抗体”包括半胱氨酸双链抗体和微型抗体。因此，本文提供的关于“抗体”或“抗体样构建体”的每个实施方案也被视为双特异性抗体、双链抗体、scFv片段、嵌合抗体受体(CAR)构建体，双链抗体和/或微型抗体，除非另有明确表示。如本文所公开的，术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，所述多肽能够非共价、可逆地并以特异性方式结合相应的抗原，优选为本发明的TAA。示例性抗体结构单元包括四聚体。在一些实施方案中，全长抗体可由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”和一个“重”链(透过二硫键连接)。抗体结构和同种型是本领域技术人员所熟知的(例如，Janeway's Immunobiology,9th edition,2016所述)。

公认的哺乳动物免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因(关于免疫球蛋白基因的更多信息，参见 Lefranc M-P et al,Nucleic Acids Res.2015Jan；43(Database issue):D413-22；andhttp://www.imgt.org)。对于全长链，轻链被分为κ或λ类。对于全长链，重链分为γ、μ、α、δ或ε类，其又分别定义免疫球蛋白类别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每个链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的这些区域。用于本发明时，“抗体”包括抗体及其片段的所有变体。因此，在该概念的范围内，为具有相同、基本上相同或相似结合特异性的全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'和这些片段的多聚体形式(例如，F(ab')2)。在一些实施方案中，抗体与本发明的肽TAA特异性结合。根据本发明的优选抗原识别构建体包括抗体重链，优选为其可变结构域，或其抗原结合片段和/或抗体轻链，优选为其可变结构域，或其抗原结合片段。类似地，二硫键稳定的可变区片段(dsFv)可以透过重组DNA技术制备，但本发明的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。此外，抗体或其抗原结合部分可以被修饰为包括可检测的标记，例如放射性同位素、萤光团(例如，异硫氰酸萤光素(FITC)，藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。在某些情况下，与SEQ ID No:3、9、15、21、27和33中提供的CDR3序列相比，TCR CDR3序列可以略加修饰，但优选不超过3个氨基酸残基，优选为仅两个，最优选为仅一个氨基酸位置。优选地，抗体包含该CDR3，优选为该组合中所有的CDR1至CDR3区，如表1中本发明的TCR所示，在每种情况下与这些序列相比，独立地可选地具有不多于三个或两个、优选为一个氨基酸取代、插入和/或缺失基。

制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于例如，Kohlerand Milstein,Eur.J.Immunol,5,51 1-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988),and C.A.Janeway et al.(eds.),Immunobiology,8Ed.,Garland Publishing,New York,NY(201 1)一文中。或者，其他方法，例如EBV杂交瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984),和Roder et al,Methods Enzymol,121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见例如，Huse et al.,Science,246,1275-81(1989))都是本领域已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述于例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公开号2002/0197266中。

本发明的一些实施方案也涉及作为可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用于本文时，术语可溶性“T细胞受体”系指天然TCR的异二聚体截短变体，其包含TCRα链和β链的细胞外部分，例如，透过二硫键连接，但是其缺乏天然蛋白质的跨膜和胞质结构域。术语可溶性“T细胞受体α链和可溶性T细胞受体β链序列”系指缺乏跨膜和胞质结构域的TCRα链和β链序列。可溶性TCRα链和β链的序列(氨基酸或核酸)可以与天然TCR中的相应序列相同，或者与相应的天然TCR序列相比，可以包含变体可溶性TCRα链和β链序列。本文所用的术语可溶性“T细胞受体”包括具有变体或非变体可溶性TCRα链和β链序列的可溶性TCR。这些变异可以在可溶性TCRα链和β链序列的可变区或恒定区中，并且可以包括但不限于氨基酸缺失、插入、取代突变以及不改变氨基酸序列的核酸序列改变。在任何情况下本发明的可溶性TCR都保留其母体分子的结合功能。

上述问题透过编码本发明抗原识别构建体的核酸或任何上述蛋白质或多肽构建体得以进一步解决。核酸优选为(a)具有编码根据本发明的抗原识别构建体的链；(b)具有与(a)中的链互补的链；或(c)具有在严格条件下与如(a)或(b)所述的分子杂交的链。严格条件是本领域技术人员已知的，具体来自Sambrook等人的“Molecular Cloning”一文。除此之外，核酸任选具有进一步的序列，其是表达对应于蛋白质的核酸序列所必需的，特别是用于在哺乳动物/人细胞中表达。使用的核酸可包含于适于允许在细胞中表达对应于该肽的核酸序列的载体中。然而，核酸也可用于转化抗原呈递细胞，其可能不限于经典的抗原呈递细胞，例如树突状细胞，这样，使得他们本身在其细胞表面上产生相应的蛋白质。

在一些实施方案中，抗原识别构建体的多肽可以由核酸编码并在体内或体外表达。因此，在一些实施方案中，提出了编码抗原识别构建体的核酸。在一些实施方案中，核酸编码本发明抗原识别构建体的一个部分或单体(例如：本发明TCR的两条链之一)，和/或另一个核酸编码本发明抗原识别构建体的另一部分或单体(例如：TCR的两条链中的另一条)。在一些实施方案中，核酸编码两个或更多个抗原识别构建体多肽链，例如，至少2个TCR链。编码多个抗原识别构建体链的核酸可以包括至少两个链序列之间的核酸切割位元点，可以编码两个或更多个链序列之间的转录或翻译起始位点，和/或可以编码两个或更多个抗原识别构建体链之间的蛋白水解靶位点。

本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，通常是指可以为单链或双链、合成或从自然资源中获得(例如，分离和/或纯化)的DNA或RNA聚合物，其可含有天然、非天然的或改变的核苷酸，并且可含有天然、非天然的或改变的核苷酸间连接子，例如氨基磷酸酯连接子或磷硫代磷酸酯连接子，而非未修饰寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。

优选地，本发明的核酸为重组核酸。本文所用的术语“重组”系指(i)透过将天然或合成核酸区段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而构建在活细胞外部的分子，或(ii)从复制上述(i)中所述内容而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制，也可以是体内复制。核酸可包含编码本文所述的任何TCR、多肽或蛋白质或功能部分或其功能变体的任何核苷酸序列。

此外，本发明提出了包含如上所述的本发明核酸的载体。理想情况是，载体为表达载体或重组表达载体。术语“重组表达载体”在本发明背景下系指允许在合适宿主细胞中表达mRNA、蛋白质或多肽的核酸构建体。本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者兼有的载体，例如质粒和病毒。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。重组表达载体包括调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其特异于宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型，其中载体将被引入其中并且在其中可以进行本发明核酸的表达。此外，本发明的载体可能包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主。重组表达载体可包含与编码本发明构建体的核苷酸序列或者与编码本发明构建体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列在操作上可连接的天然或规范性启动子。启动子的选择包括例如强、弱、诱导型、组织特异性和开发特异性启动子。启动子可以是非病毒启动子，也可以是病毒启动子。本发明的重组表达载体可以被设计用于暂态表达、稳定表达或两者的表达。此外，重组表达载体可以用于组成型表达或诱导型表达。

本发明还涉及包含根据本发明的抗原识别构建体的宿主细胞。具体地，本发明的宿主细胞包含如上所述的核酸或载体。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，也可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养细胞或原代细胞，即直接从生物体(例如人)分离。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞(即，在悬浮液中生长的细胞)。为了产生重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来自任何类型的组织，可以是任何发育阶段的细胞，但是宿主细胞优选为外周血白细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞为T细胞。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如，原代T细胞或来自培养T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获得自哺乳动物的T细胞，优选为来自人类患者的T细胞或T细胞前体。如果获得自哺乳动物，T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或液体。T细胞还可以是富集或纯化的。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是任何发育阶段的，包括但不限于CD4阳性和/或CD8阳性、CD4阳性辅助T细胞，例如，Th1和Th2细胞、CD8-阳性T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞等。优选地，T细胞为CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。

优选地，本发明的宿主细胞为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞，例如CD4阳性或CD8阳性T细胞。宿主细胞更优选为对表达TAA的肿瘤细胞特异性的肿瘤反应性T细胞。

本发明的目的还透过制备TAA特异性抗原识别构建体或TAA特异性抗原识别构建体表达细胞系的方法来解决，包括

a)提出合适的宿主细胞，

b)提出一种基因构建体，其包含编码根据本发明公开的抗原识别构建体的编码序列，

c)引入所述合适的宿主细胞、所述基因构建体，和

d)由所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。

所述方法可能进一步包括在所述合适宿主细胞上进行细胞表面呈递所述抗原识别构建体的步骤。

在其他优选的实施方案中，所述基因构建体是包含与所述编码序列可操作地连接的启动子序列的表达构建体。

优选地，所述抗原识别构建体来源于哺乳动物，优选来源于人。用于本发明方法的优选合适宿主细胞为哺乳动物细胞，诸如人细胞，特别是人T淋巴细胞。用于本发明的T细胞在上文中进行了详细描述。

本发明还包括实施方案，其中所述抗原识别构建体为修饰的TCR，其中所述修饰是加入功能结构域，诸如标记物或治疗活性物质。此外，包括具有可选结构域的TCR，诸如可选膜锚定结构域而不是内源性跨膜区。

理想情况是，用于将基因构建体引入所述合适宿主细胞的转染系统为逆转录病毒载体系统。此类系统是本领域技术人员所熟知的。

本发明还包括在一项实施方案中，从细胞中分离和纯化抗原识别构建体的另外的方法步骤，以及任选地在T细胞中重构经翻译的抗原识别构建体片段。

本发明的另一方面提出了透过产生T细胞受体(TCR)的方法获得的或可获得的T细胞，其中T细胞受体(TCR)对于肿瘤细胞具有特异性并且具有如上所述的高亲合力。此类T细胞取决于本发明方法中使用的宿主细胞，例如人或非人T细胞，优选为人TCR。

本文中在多肽(例如：抗原识别构建体(其实例可以是抗体))背景下使用的术语“分离”是指从蛋白质或多肽或其他污染物纯化的多肽，未经纯化会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途。根据本发明的抗原识别构建体可以是重组、合成或修饰(非天然)抗原结合构建体。本文中在多核酸或细胞背景下使用的术语“分离”是指从DNA、RNA、蛋白或多肽或其他污染物(例如其他细胞)纯化的核酸或细胞，未经纯化会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途，或者是指重组、合成或修饰(非天然)核酸。在此背景中，“重组”蛋白/多肽或核酸是使用重组技术制备的。产生重组核酸和蛋白的方法和技术是本领域熟知的。

本发明的另一方面涉及本文公开的用于药物中的抗原识别构建体、核酸、载体、药物组合物和/或宿主细胞。在一项优选实施方案中在药物中的用途包括在诊断、预防和/或治疗诸如恶性或良性肿瘤疾病等肿瘤疾病中的用途。肿瘤疾病为，例如，在所述肿瘤疾病的癌细胞或肿瘤细胞中以表达TAA为特征的肿瘤疾病。

关于根据本公开资料的抗原识别构建体和由其衍生的、与其相关的或编码所述构建体的其他材料的上述医疗应用，待治疗和/或诊断的疾病可以为任何增殖性疾病，优选为其特征在于表达本发明的TAA或TAA表位序列，例如，所述疾病可以为任何癌症，包括以下癌症中任一种：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠类癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。特别优选的癌症为TAA阳性(即DCAF4L2-001-肽提呈)癌症，优选包括胃肠癌和胃癌。

本发明的构建体、蛋白质、TCR抗体、多肽和核酸特别用于免疫治疗，优选用于过继性T细胞治疗。本发明化合物的给药可以，例如，涉及将本发明的T细胞输注入所述患者体内。优选地，此类T细胞为患者的自体T细胞，并且用本发明的核酸或抗原识别构建体在体外转导。

本发明的抗原识别构建体、TCR、多肽、蛋白质(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以下统称为“本发明的TCR材料”，可以配制成组合物，诸如药物组合物。就此而言，本发明提出了一种药物组合物，其包含本文所述的任意抗原识别构建体、TCR、多肽、蛋白质、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以及药用载体、赋形剂和/或稳定剂。含有任何本发明TCR材料的本发明药物组合物可包含多于一种本发明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或两种或更多种不同的TCR(包括功能部分及其功能变体)。或者，药物组合物可包含与另一种药物活性剂或药物组合的本发明TCR材料，诸如，化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。优选地，载体为药用载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于所考虑的本发明的特定TCR材料的任意载体。这些药用载体是本领域技术人员所熟知的，并且是公众容易获得的。优选情况是，药用载体是在使用条件下无有害副作用或毒性的一种载体。

因此，本还提出了一种药物组合物，其包含本文所述的本发明的任何产品和本发明的任何TCR材料，特别是任何蛋白质、核酸或宿主细胞。在一项优选的实施方案中，药物组合物用于免疫治疗，优选为继代细胞治疗。

优选地，本发明的TCR材料透过注射施用，如，静脉内施用。当本发明的TCR材料为表达本发明TCR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射的细胞药用载体可能包括任何等渗载体，例如，生理盐水(水中含有约0.90％w/v的NaCl、水中含有约300mOsm/L NaCl、或每升水中含有约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、水中含约5％葡萄糖或林格氏乳酸盐。在一项实施方案中，药用载体用人血清白蛋白补充。

为了本发明的目的，施用本发明TCR材料的数量或剂量(例如，当本发明TCR材料为一个或多个细胞时的细胞数量)可能在合理时间框架内在受试者或动物中足以影响治疗或预防反应。例如，本发明TCR材料的剂量应该自施用起约2个小时或更长时间(例如，12至24小时)或更多小时的期间内与癌症抗原结合或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间可能更长。剂量将由本发明特定TCR材料的疗效和动物(例如，人)的状况以及待治疗动物(例如，人)的体重决定。

预期本发明的药物组合物、抗原识别构建体、TCR(包括其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群可用于癌症或TAA阳性癌前病变的治疗或预防方法。本发明的TCR(及其功能变体)被认为可与本发明的TAA特异性结合，使得TCR(或本发明相关多肽或蛋白质及其功能变体)由细胞(如T细胞)表达或在细胞上表达时能够介导针对表达本发明TAA的靶细胞的免疫应答，优选为经由MHC I或II在所述靶细胞的表面上提呈TAA肽。就此而言，本发明提出了哺乳动物中病症(特别是癌症)的治疗或预防方法，包括向哺乳动物施用任何药物组合物、抗原识别构建体，特别是TCR(及其功能变体)、多肽或本文所述的蛋白质、任何核酸或重组表达载体，其包含编码本文所述的任何TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质的核苷酸序列或包含核酸或重组载体的任何宿主细胞或细胞群，该重组载体编码本文所述的本发明的任何构建体(及其功能变体)、多肽或蛋白质，用量为有效治疗或预防哺乳动物中病症的量，其中所述病症为癌症，如表达本发明TAA的癌症。

可用于本发明的药用载体或稀释剂的实例包括诸如SPGA、碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)等稳定剂，诸如白蛋白或酪蛋白等蛋白质，诸如牛血清或脱脂牛奶和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)等含蛋白制剂。

本文中所用的术语“治疗”和“预防”以及源自这些术语的词语并不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，而本领域普通技术人员认识到具有潜在的益处或治疗效果。就此而言，本发明的方法可为哺乳动物的病症提供任何治疗或预防水准的任意量。此外，本发明方法提出的治疗或预防可包括待治疗或预防病症(例如，癌症)的一种或多种病症或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤消退。此外，为了本文之目的，“预防”可以包括推迟疾病或其症状或病症的发作。

本发明还涉及一种治疗癌症的方法，其包括与至少一种化学治疗剂和/或放射治疗组合施用本说明书的TCR、核酸或宿主细胞。

本发明的另一方面进一步涉及在(生物)样本(例如从受试者或患者获得的样本)中检测TAA蛋白或MHC与TAA蛋白(TAA的蛋白表位)的复合体的一种方法，包括使样本与特异性结合所述TAA肽或TAA肽/MHC复合体的抗原识别构建体接触，并检测所述抗原识别构建体和所述TAA肽之间或与TAA肽/MHC复合体之间的结合情况。在一些实施方案中，抗原识别构建体是根据本文所述发明的TCR或抗体或类似构建体，或优选为抗原识别构建体。在一些实施方案中，(生物)样本为肿瘤或癌症样本(如：本文别处所述的那些样本中的一种)，例如，包含肿瘤或癌细胞的样本。

还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

a)从所述受试者中分离细胞；

b)用编码本发明的抗原识别构建体的至少一种载体转化细胞以产生转化的细胞；

c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和

d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

a)从健康供体中分离细胞；

b)用编码本发明的抗原识别构建体的一种载体转化细胞以产生转化的细胞；

c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和

d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

还提出的是在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其中说明书中的TCR、说明书中的核酸、说明书中的表达载体、说明书中的宿主细胞或说明书中的药物组合物至少施用两次，间隔至少24小时。

还提出的是在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其中说明书中的TCR、说明书中的核酸、说明书中的表达载体、说明书中的宿主细胞或说明书中的药物组合物在数天、数周或数月的期间内施用予受试者。

还提出的是在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其中说明书中的TCR、说明书中的核酸、说明书中的表达载体、说明书中的宿主细胞或说明书中的药物组合物透过局部输注施用。优选地，局部输注由输注泵和/或导管系统施用。更优选地，所述局部输注为注入实体肿瘤、供应实体肿瘤的血管和/或实体肿瘤周围区域。

还提出的是在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其中说明书中的TCR、说明书中的核酸、说明书中的表达载体、说明书中的宿主细胞或说明书中的药物组合物以每剂大约10⁴至大约10¹⁰个细胞的剂量施用。

还提出了一种检测生物样本中癌症的方法，包括：

a)使生物样本与本说明书的抗原识别构建体(如TCT)接触；

b)检测抗原识别构建体(如TCT)与生物样本的结合情况。

在一些实施方案中，检测癌症的方法在体外、体内或原位进行。

还提出了检测哺乳动物中有无病症的方法。该方法包括(i)将包含哺乳动物一种或多种细胞的样本接触本发明的任何TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分或本文所述的药物组合物，从而形成复合体，并包括检测复合体，其中所述复合体的检测提示哺乳动物中是否存在病症，其中所述病症为癌症，诸如表达TAA的恶性疾病。

关于检测哺乳动物疾病的本发明方法，细胞样本可以是包含全细胞、其裂解物或全部细胞裂解物的一部分的样本，例如核或细胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分。

为了本发明的检测方法之目的，所述接触可以在哺乳动物体外或体内进行。优选情况是，接触在体外进行。

此外，复合体的检测可以透过本领域已知的任何方式进行。例如，本文所述的本发明抗原识别构建体(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或TCR或其抗原结合部分可以用检测到的标记(诸如，放射性同位素、萤光团(例如，异硫氰酸萤光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)进行标记。

为了本发明方法之目的，其中施用宿主细胞或细胞群，所述细胞可以是与哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选情况是，细胞为哺乳动物自体细胞。

关于本发明TCR材料的上述医疗用途，待治疗和/或诊断的癌症可以为任何癌症，包括以下癌症中任一种：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠类癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。特别优选的癌症为TAA阳性癌症，诸如，结肠癌、直肠癌、胃肠癌或胃癌。

总体上，本发明提出了患有肿瘤或肿瘤疾病的受试者的治疗方法，其包括施用本发明公开的抗原识别构建体、核酸、载体、药物组合物和/或宿主细胞。优选地，所述受试者为需要这种治疗的受试者。优选实施方案中的受试者为患有TAA阳性的肿瘤或肿瘤疾病的哺乳动物受试者，优选为人类患者。

鉴于本文的公开内容，将理解本发明还涉及以下项目：

第1项：一种抗原识别构建体，其包含至少一个互补决定区(CDR)3，其与选自SEQID No 3、9、15、21、27和33的氨基酸序列至少具有50％的序列同一性。

第2项：根据第1项的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体能够特异性地和/或选择性地与本发明抗原肽的TAA结合。

第3项：根据第1或2项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体为一种抗体或其衍生物或片段、或一种T细胞受体(TCR)或其衍生物或片段。

第4项：根据第1至3项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体与提呈TAA抗原肽的人白细胞抗原(HLA)结合，其中所述HLA任选为A2型。

第5项：根据第1至4项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体特异性地和/或选择性地结合包括选自SEQ ID NO:49、50至57的氨基酸序列或由其组成的表位。

第6项：根据第1至5项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体为α/β-TCR，或其片段或衍生物，或所述构建体为γ/δ-TCR，或其片段或衍生物。

第7项：根据第1至6项中任一项所述的抗原识别构建体，其特征在于，所述构建体是人源并特异性地和/或选择性地识别TAA抗原肽。

第8项：根据第1至7项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体能够在受试者中诱导免疫应答，任选其中所述免疫应答的特征在于干扰素(IFN)γ水准增加。

第9项：根据第1至8项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCRα或γ链；和/或TCRβ或δ链；其中所述TCRα或γ链包含与选自SEQ ID No.3、15和27的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和/或其中所述TCRβ或δ链包含与选自SEQ ID No.9、21和33的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。

第10项：根据第9项中所述的抗原识别构建体，其中TCRα或γ链还可能包含与选自SEQ ID No.1、13和25的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1和/或与选自SEQ ID No.2、14和26的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2。

第11项：根据第9或10项中所述的抗原识别构建体，其中TCRβ或γ链还可能包含与选自SEQ ID No.1、19和31的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1和/或与选自SEQ ID No.2、20和32的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2。

第12项：根据第1至11项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与选自SEQ IDNo.4、10、16、22、28和34的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的TCR可变链区。

第13项：根据第1至12项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体被人源化、嵌合化和/或鼠源化。

第14项：根据第1至13项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCR的结合片段，并且其中所述结合片段包含CDR1至CDR3，其任选选自具有SEQ ID No.1、2、3或7、8、9或13、14、15或19、20、21或25、26、27或31、32、33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

第15项：根据第1至14项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是由至少一个TCRα和一个TCRβ链序列组成的TCR或其片段，其中所述TCRα链序列包含具有SEQ IDNO:1至3的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:7至9的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID NO:13至15的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:19至21的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID NO:25至27的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:31至33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

第16项：根据第1至15项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是包含至少一个TCRα和一个TCRβ链序列的TCR或其片段，其中所述TCRα链序列包含具有SEQ IDNo.4的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变区序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID No.16的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID No.22的氨基酸序列的可变区序列；或其中所述TCRα链序列包含具有SEQ ID No.28的氨基酸序列的可变区序列，并且其中所述TCRβ链序列包含具有SEQ ID No.34的氨基酸序列的可变区序列。

第17项：根据第1至16项中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是TCR或其片段，其还包含与选自SEQ ID No.5、11、17、23、29和35的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80、90％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的TCR恒定区；优选地，其中TCR由至少一个TCRα和一个TCRβ链序列组成，其中TCRα链序列包含与SEQ ID No.5、17和29的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的恒定区。

第18项：根据第1至17项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。

第19项：根据第1至17项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQ ID No.18的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ ID No.24的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。

第20项：根据第1至17项中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQ ID No.30的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第一个TCR链，以及与SEQ ID No.36的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的第二个TCR链。

第21项：一种核酸，其编码根据第1至20项中任一项的抗原识别构建体。

第22项：一种载体，其包含根据第21项所述的核酸。

第23项：一种宿主细胞，其包含根据第1至20项中任一项所述的抗原识别构建体或根据第21项所述的核酸或根据第22项所述的载体。

第24项：根据第23项所述的宿主细胞，其中所述细胞为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，更优选为CD4或CD8阳性T细胞。

第25项：一种药物组合物，其包含根据第1至20项中任一项所述的抗原识别构建体，或根据第21项所述的核酸，或根据第22项所述的载体，或根据第23或24项所述的宿主细胞，以及药用载体、稳定剂和/或赋形剂。

第26项：根据第1至20项中任一项所述的抗原识别构建体，或根据第21项所述的核酸，或根据第22项所述的载体，或根据第23或24项所述的宿主细胞，或根据第25项用于药物的药物组合物。

第27项：抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物根据第26项所述的用途，在诊断、预防和/或治疗增殖性疾病的用途，其中所述疾病包括恶性或良性肿瘤疾病。

第28项：抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物根据第27项所述的用途，其中所述肿瘤疾病的特征在于TAA在肿瘤疾病的肿瘤细胞中表达。

第29项：抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物根据第26至28项中任一项所述的用途，其中所述在药物中的用途是在免疫治疗中的用途，任选地包含过继细胞转移，其中所述免疫治疗包括过继自体或异源T细胞治疗。

第30项：一种制备表达细胞系的TAA特异性抗原识别构建体的方法，包括

a.提出合适的宿主细胞，

b.提出一种遗传构建体，其包含编码根据第1至20项中任一项所述的抗原识别构建体的编码序列，

c.引入所述合适的宿主细胞、所述遗传构建体，

d.由所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。

第31项：根据第30项所述的方法，还包括所述抗原识别构建体的细胞表面提呈。

第32项：根据第30或31项所述的方法，其中所述遗传构建体是包含与所述编码序列可操作地连接的启动子序列的表达构建体。

第33项：根据第30至32项中任一项所述的方法，其中所述抗原识别构建体为哺乳动物来源，优选为人来源。

第34项：根据第30至33项中任一项所述的方法，其中所述合适的宿主细胞为哺乳动物细胞，其任选地选自人细胞或人T淋巴细胞。

第35项：根据第30至34项中任一项所述的方法，其中所述抗原识别构建体为修饰的TCR，其中所述修饰包括添加包含标记的功能结构域或包含膜锚定结构域的可选结构域。

第36项：根据第35项所述的方法，其中所述抗原识别构建体为α/βTCR、γ/δTCR或单链TCR(scTCR)。

第37项：根据第30至36项中任一项所述的方法，其中所述遗传构建体透过逆转录病毒转染被导入所述合适的宿主细胞。

第38项：根据第30至37项中任一项所述的方法，进一步包括从合适的宿主细胞分离和纯化所述抗原识别构建体，或在T细胞中重构所述抗原识别构建体。

第39项：一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用以上项中任一项所述的TCR、核酸或表达载体、宿主细胞和/或药物组合物。

第40项：第39项中的方法，其中所述TCR在宿主细胞的表面上表达。

第41项：第40项中的方法，其中所述宿主细胞选自T细胞或T细胞祖细胞组成的组。

第42项：第41项中的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是自体细胞。

第43项：第42项中的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是同种异体细胞。

第44项：第43项中的方法，其中TCR与治疗活性剂共轭。

第45项：第44项中的方法，其中治疗活性剂选自由放射性核素、化学治疗剂和毒素组成的组。

第46项：第39至45项中任一项所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，或其组合。

第47项：第39至46任一项中所述的方法，进一步包括对所述受试者施用至少一种化学治疗剂。

第48项：第46至47任一项中所述的方法，进一步包括对所述受试者施用放射治疗。

第49项：一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

a)从所述受试者中分离细胞；

b)用编码以上任一项中所述的TCR的一个载体转化细胞以产生转化细胞；

c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；

以及

d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

第50项：第49项中的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。

第51项：一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

a)从健康供体中分离细胞；

c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；

以及

d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

第52项：第51项中的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。

在以下实施例中将对本发明进一步进行说明，参照随附图表和序列，但是不仅限于此。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。在图和序列中：

表1：本发明的TCR序列

表2：本发明的肽序列和相关序列

实施例

背景

从健康供体的T细胞中分离并扩增三种DCAF4L2-001特异性TCR(R36P3F9、R52P2G11和R53P2A9，参见表1，各自编码肿瘤特异性TCRα和TCRβ链)。根据之前描述的方法(Walter et al.,2003J Immunol.,Nov 15；171(10):4974-8)体外刺激来自健康供体的细胞，靶标特异性细胞使用HLA-A*02多聚体进行单细胞分选，并用于之后的TCR分离。例如根据Green和Sambrook所著的分子克隆实验室手册第四版所述的标准方法通过5'RACE分离TCR序列。对TCR R36P3F9、R52P2G11和R53P2A9的α和β可变区进行测序，并通过基因合成产生表达构建体用于进一步的功能表征。R36P3F9来自HLA-A*02阳性供体，R52P2G11和R53P2A9来自HLA-A*02阴性供体(同种反应性环境)。

相关TCR通过转导，例如通过mRNA电穿孔或慢病毒转导，在人T细胞中表达。对于慢病毒转导，将PBMC解冻并静置过夜，然后使用固化的抗体进行活化。使用编码DCAF4L2特异性TCR的慢病毒载体转导活化细胞，并在细胞因子的情况下扩增。收集T细胞并通过离心浓缩，然后冷冻保存。

在与不同靶细胞(例如载有不同肽的T2细胞)共培养后，评估T细胞的IFN-γ释放情况。表达TCR R52P2G11和R53P2A9的CD8+ T细胞的疗效通过，例如，与未做改动的A375细胞相比，使用DCAF4L2转导的A375肿瘤细胞系作为靶细胞进行T细胞活化研究(IFN-γ释放)或杀伤测定来确定。

实施例1:T细胞受体R36P3F9

TCR R36P3F9(SEQ ID NO:1-12)限于提呈HLA-A*02的DCAF4L2-001(参见图4)。

R36P3F9特异性地识别DCAF4L2-001，因为再表达该TCR的人原代CD8+ T细胞在与载有DCAF4L2-001肽或DCAF4L2-001的丙氨酸取代变体的HLA-A*02+靶细胞共同孵育时释放IFN-γ(图1)。TCR R36P3F9确实可特异性地识别DCAF4L2-001，而非与DCAF4L2-001显示出高度序列相似性的不同肽(图4)。NYESO1-001肽用作阴性对照。

R36P3F9的靶向肽滴定分析(图10)显示EC50在3.6nM的范围内。

实施例2:T细胞受体R52P2G11

TCR R52P2G11(SEQ ID NO:13-24)限于提呈HLA-A*02的DCAF4L2-001(参见图5)。

R52P2G11特异性地识别DCAF4L2-001，因为再表达该TCR的人原代CD8+ T细胞在与载有DCAF4L2-001肽或DCAF4L2-001的丙氨酸和苏氨酸取代变体的HLA-A*02+靶细胞共同孵育时释放IFNγ(图2和11)。TCR R52P2G11确实可特异性地识别DCAF4L2-001，而非与DCAF4L2-001显示出高度序列相似性的不同肽(图5)。NYESO1-001肽用作阴性对照。

R52P2G11的再表达引起HLA-A*02/DCAF4L2-001四聚体在人原代CD8+ T细胞中选择性结合，而非HLA-A*02/NYESO1-001四聚体(图7)。NYESO1-001特异性TCR 1G4的再表达和空白对照表达用作对照。

R52P2G11的靶向肽滴定分析(图8)显示EC50在～8.5nM的范围内。

R52P2G11在人原代CD8+ T细胞中的再表达引起DCAF4L2转导的A375肿瘤细胞系的选择性识别，而非未做改动的A375细胞(图13)。使用未转导的T细胞作为对照。与表达HLA-A*02和DCAF4L2-001的细胞系共培养时的T细胞活化反映了TCR R52P2G11对内源性提呈的靶pHLA的识别(图13)。

实施例3:T细胞受体R53P2A9

TCR R53P2A9(SEQ ID NO:25-36)限于提呈HLA-A*02的DCAF4L2-001(参见上面图6)。

R53P2A9特异性地识别DCAF4L2-001，因为再表达该TCR的人原代CD8+ T细胞在与载有DCAF4L2-001肽或DCAF4L2-001的丙氨酸和苏氨酸取代变体的HLA-A*02+靶细胞共同培养时释放IFN-γ(图3和12)。TCR R53P2A9确实可特异性地识别DCAF4L2-001，而非与DCAF4L2-001显示出高度序列相似性的不同肽(图6)。NYESO1-001肽用作阴性对照。

R53P2A9的再表达引起HLA-A*02/DCAF4L2-001四聚体在人原代CD8+ T细胞中的选择性结合，而非HLA-A*02/NYESO1-001四聚体(图7)。NYESO1-001特异性TCR1G4的再表达和空白表达作为对照。

R53P2A9的靶向肽滴定分析(图9)显示EC50在～11.8nM的范围内。

R53P2A9在人原代CD8+ T细胞中的再表达引起DCAF4L2转导的A375肿瘤细胞系的选择性识别，而非未做改动的A375细胞(图13)。使用未转导的T细胞作为对照。与表达HLA-A*02和DCAF4L2-001的细胞系共孵育时的T细胞活化反映了TCR R53P2A9对内源性处理的靶pHLA的识别(图13)。

序列表

<110> 伊玛提克斯生物技术有限公司

<120> 新型T细胞受体及其免疫治疗应用

<130> I33000WO

<150> DE 102016123859.7

<151> 2016-12-08

<150> US 62/431,580

<151> 2016-12-08

<160> 78

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Pro

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<213> 智人(Homo sapiens)

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Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Cys Ala Ser Ser Ser Thr Ser Gly Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gln Tyr

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Phe

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Ser Ser Thr Ser Gly Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> 智人(Homo sapiens)

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Ser Ser Leu Gly Ser Pro Asp Gly Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp

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20 25 30

Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser

35 40 45

Glu Ser Asp Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln

50 55 60

Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr

65 70 75 80

Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Tyr Asn Ser Tyr Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val His Pro

130 135

<210> 29

<211> 141

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 29

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 30

<211> 279

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu

1 5 10 15

Glu Phe Ser Met Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser

20 25 30

Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser

35 40 45

Glu Ser Asp Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln

50 55 60

Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr

65 70 75 80

Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Tyr Asn Ser Tyr Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp

130 135 140

Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val

145 150 155 160

Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys

165 170 175

Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser

180 185 190

Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp

195 200 205

Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr

210 215 220

Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys

225 230 235 240

Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile

245 250 255

Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met

260 265 270

Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

275

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 31

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1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 32

Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu

1 5

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

Cys Ala Ser Ser Leu Asp Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 34

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Asp Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Thr

130

<210> 35

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 36

<211> 310

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Asp Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

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<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

Asp Ser Ala Ile Tyr Asn

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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1

<210> 39

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe

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<210> 40

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp

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Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val

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Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala

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50 55 60

Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg

65 70 75 80

Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile

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100 105 110

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115 120 125

Leu Ile Val His Pro

130

<210> 41

<211> 141

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 42

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val

20 25 30

Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala

35 40 45

Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr

50 55 60

Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg

65 70 75 80

Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile

85 90 95

Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg

100 105 110

Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser

115 120 125

Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

145 150 155 160

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

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180 185 190

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

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210 215 220

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

225 230 235 240

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp

260 265 270

Ser Ser

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

Met Asn His Glu Tyr

1 5

<210> 44

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

Ser Val Gly Ala Gly Ile

1 5

<210> 45

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 45

Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe

1 5 10

<210> 46

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 46

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu

20 25 30

Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His

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Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu

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Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro

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Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg

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Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg

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Leu Thr Val Leu

130

<210> 47

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 47

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 48

<211> 311

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu

20 25 30

Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His

35 40 45

Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg

85 90 95

Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg

115 120 125

Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

130 135 140

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr

145 150 155 160

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser

165 170 175

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

180 185 190

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu

195 200 205

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

210 215 220

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

225 230 235 240

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

245 250 255

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln

260 265 270

Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala

275 280 285

Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val

290 295 300

Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 50

Ala Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 51

Ile Ala Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 52

Ile Leu Ala Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 53

Ile Leu Gln Ala Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 54

Ile Leu Gln Asp Ala Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 55

Ile Leu Gln Asp Gly Ala Phe Leu Val

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 56

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Ala Leu Val

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 57

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Ala Val

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 58

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ala

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 59

Gly Leu Val Asp Gly Val Phe Leu Val

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 60

Ile Leu Gln Asp Gly Arg Ile Phe Ile

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 61

Ile Leu Gln Asp Leu Gln Pro Phe Leu

1 5

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 62

Ile Leu Gln Glu Gly Thr Phe Lys Ala

1 5

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 63

Lys Leu Gln Asp Gly Asn His Leu Leu

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 64

Leu Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ser Met

1 5

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 65

Leu Leu Gln Asp Lys Gln Phe Glu Leu

1 5

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 66

Asn Leu Gln Glu Gly Glu Phe Leu Leu

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 67

Thr Leu Gln Asn Ser Gln Phe Leu Leu

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 68

Thr Leu Thr Asp Glu Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 69

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 70

Thr Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 71

Ile Thr Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 72

Ile Leu Thr Asp Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 73

Ile Leu Gln Thr Gly Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 74

Ile Leu Gln Asp Thr Gln Phe Leu Val

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 75

Ile Leu Gln Asp Gly Thr Phe Leu Val

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 76

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Thr Leu Val

1 5

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 77

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Thr Val

1 5

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 78

Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Thr

1 5

Claims

1.一种抗原识别构建体，其包含至少一个互补决定区(CDR)3，其与选自SEQ ID No.:3、9、15、21、27和33的氨基酸序列具有至少50％序列同一性。

2.根据权利要求1所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体能够特异性地和/或选择性地与包含选自SEQ ID NO.:49、50至57的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO.:49、50至57的氨基酸序列构成的表位结合。

3.根据权利要求1或2所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体是抗体或其衍生物或片段、或是T细胞受体(TCR)或其衍生物或片段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCRα或γ链；和/或TCRβ或δ链；其中所述TCRα或γ链包含与选自SEQ ID No.:3、15和27的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR3，和/或其中所述TCRβ或δ链包含与选自SEQ ID No.:9、21和33的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR3。

5.根据权利要求4所述的抗原识别构建体，其中所述TCRα或γ链还包含与选自SEQ IDNo.:1、13和25的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR1；和/或与选自SEQ ID No.:2、14和26的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR2。

6.根据权利要求4或5所述的抗原识别构建体，其中所述TCRβ或δ链还包含与选自SEQID No.:7、19和31的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR1；和/或与选自SEQ IDNo.:8、20和32的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的CDR2。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与选自SEQ ID No.:4、10、16、22、28和34的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的TCR可变链区。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCR的结合片段，且其中所述结合片段包含CDR1至CDR3，该CDR1至CDR3任选地选自含有SEQ ID No.:1、2、3或7、8、9或13、14、15或19、20、21或25、26、27或31、32、33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

9.一种核酸或包含该核酸的载体，其中所述核酸编码权利要求1至8中任一项所述的抗原识别构建体。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求9所述的核酸或载体，优选为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，更优选为CD4+或CD8+T细胞，更优选为作为γ/δT细胞的T细胞。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求9所述的核酸或载体、或权利要求10所述的宿主细胞，以及药用载体、稳定剂和/或赋形剂。

12.权利要求1至8中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求9所述的核酸、或权利要求10所述的载体、或权利要求11所述的宿主细胞、或权利要求12所述的药物组合物在药物中的用途，优选在诊断、预防和/或治疗增殖性疾病特别是癌症中的用途，其中癌症优选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌或其组合。

13.一种在生物样本中检测癌症的方法，包括：

a)使生物样本与权利要求3至8中任一项所述的TCR接触，以及

b)检测TCR与生物样本的结合情况。

14.根据权利要求13所述的方法，其中TCR包含可检测标记物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中可检测标记物选自放射性核素、萤光团和生物素。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述检测在体外、体内或原位进行。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌、或其组合。

18.根据权利要求3至8中任一项所述的抗原识别构建体，其为TCR，其中所述TCR是可溶性TCR。

19.根据权利要求3至8中任一项所述的抗原识别构建体，其是TCR，其中α链包含与SEQID NO.:4的氨基酸序列至少95％相同的TCRα可变结构域；β链包含与SEQ ID NO.:10至少95％相同的TCRβ可变结构域，其中TCR与TAA-肽-MHC分子复合体特异性结合。

20.根据权利要求3至8中任一项所述的抗原识别构建体，其是TCR，其在α链中相对于SEQ ID NO.:4具有至少一个突变，和/或在β链中相对于SEQ ID NO.:10具有至少一个突变，并且其中该TCR对TAA肽-HLA分子复合体的结合亲和力和/或结合半衰期是未突变TCR对同一肽的结合亲和力和/或结合半衰期的至少两倍。

21.根据权利要求3至8中任一项所述的抗原识别构建体，其是TCR，其在α链中相对于SEQ ID NO.:4具有至少一个突变，和/或在β链中相对于SEQ ID NO.:10具有至少一个突变，并且其中与未突变的TCR相比，该TCR具有修饰的糖基化。

22.一种TCR，其包含选自SEQ ID NO.:4的α链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个至少一个α链互补决定区(CDR)，和/或选自SEQ ID NO.:10的β链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个β链互补决定区(CDR)，并且其中该TCR与TAA肽-MHC分子复合体特异性结合。