CN112210017A

CN112210017A - 一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法

Info

Publication number: CN112210017A
Application number: CN202011082184.2A
Authority: CN
Inventors: 陈君; 张萍; 张效威
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN112210017B

Abstract

本发明提供了一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法，属于细胞生物学技术领域。焦亡执行者融合蛋白，包括hGlucN‑GSDME融合蛋白和hGlucC‑GSDME融合蛋白。一组焦亡活性报告质粒，包括分别含上述两融合蛋白的编码序列的真核表达载体。所述融合蛋白或所述报告质粒在GSDME介导的细胞焦亡活性检测、制备检测GSDME介导的细胞焦亡活性的试剂或试剂盒或GSDME介导焦亡诱导剂或抑制剂筛选中的应用。本发明首次将荧光素酶片段互补分析技术应用于细胞焦亡活性检测中，对GSDME激活水解产物N‑GSDME的聚集进行检测，为研究细胞焦亡提供了新的技术方法。

Description

一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法。

背景技术

在细胞正常的生理代谢条件下，蛋白质是细胞活性和各种功能的执行者。通过一系列的相互作用，蛋白质参与细胞信号转导、增殖、分化、凋亡等各个生命过程。很多的蛋白质在行使功能时，往往需要首先形成聚合物或则与其它蛋白质们形成复合体。研究蛋白质的相互作用是明确蛋白质功能和作用机制的最为重要的环节之一。蛋白间的相互作用一般都具有一定的特异性，同时伴随蛋白质间的相互靠近和各种力(氢键和范德华力等)的作用。基于上述特点，目前已经发展了多种用于蛋白质间相互作用研究的方法。

体外水平的研究方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、GST融合蛋白pull-down技术、蛋白质微阵列技术(proteinmicroarray)等。体内(细胞、动物)水平的研究方法则主要包括酵母双杂交技术、荧光共振能量转移技术(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)和蛋白质片段互补分析(Protein fragment complementation assay,PCA)技术。与其它研究方法相比，PCA技术具有可定量化和高通量的特点，主要用于相互作用的蛋白质文库的构建、cDNA文库的构建、生物信号通路图的绘制、配体-受体相互作用研究以及对药物进行高通量筛选等。PCA是指将某个功能(报告)蛋白切成两段(如N端和C端)，分别与另外两种目标蛋白相连形成两个融合蛋白；在一个反应体系中，两个目标蛋白的相互作用使得两个功能蛋白质片段相互靠近，互补并重建功能蛋白质的活性；通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质间的相互作用。根据功能蛋白的两个片段互补融合成的报告蛋白的种类，目前常用的PCA体系可以分为以下几种：基于DHFR的PCA、基于β-lactamase的PCA、基于荧光蛋白的PCA又称为双分子荧光互补技术(Bi-molecular fluorescencecomplementation,BiFC)和基于荧光素酶的PCA。其中基于荧光素酶的PCA相比其它PCA具有高信噪比、可逆性、接近实时性的优点。

细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，其表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞发生焦亡时，质膜会出现破裂形成直径1～2nm的小孔，细胞渗透性肿胀，形成特征性囊泡，胞内物质(如炎性因子、乳酸脱氢酶)流出。据报道焦亡发生的内在机制多与Gasdermin家族蛋白的激活有关：静息条件下，Gasdermin家族的多种成员包括GSDMD、GSDME、GSDMA、GSDMA3等的C端通过与N端结合而抑制其活性功能。在焦亡发生过程中，Gasdermin家族成员激活后会形成C端和N端两个结构域，活化后形成的N端结构域可形成寡聚物，进而引起一系列焦亡反应，如焦亡执行者Gasdermin E(GSDME)活化形成N端结构域(N-GSDME)和C端结构域(C-GSDME)。

目前常用的焦亡活性检测方法是Western Blot法，该方法检测细胞GSDME和N-GSDME蛋白水平变化，针对GSDME的水解激活进行检测，对N-GSDME的聚集不能进行检测，同时该检测方法存在检测通量低、检测周期长的问题。若能检测N-GSDME间的相互作用，即可判断焦亡过程的发生，进而可用于焦亡诱导剂和抑制剂的筛选。目前还没有在细胞水平检测N-GSDME间聚集的报告基因技术方法报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法，解决了目前存在的检测通量低、检测周期长的问题，具有良好的应用价值。

本发明提供了一组焦亡执行者融合蛋白，包括hGlucN-GSDME融合蛋白和hGlucC-GSDME融合蛋白；

所述hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述hGlucN-GSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述hGlucC-GSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了一组焦亡活性报告质粒，包括分别含hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列和hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列的真核表达载体。

本发明提供了所述焦亡执行者融合蛋白或所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导的细胞焦亡活性检测中的应用。

本发明提供了所述焦亡执行者融合蛋白或所述焦亡活性报告质粒在制备检测GSDME介导的细胞焦亡活性的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了所述焦亡执行者融合蛋白或所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导焦亡诱导剂筛选或GSDME介导焦亡抑制剂筛选中的应用。

本发明提供了一种基于荧光素酶片段互补分析技术的细胞焦亡活性检测方法，包括以下步骤：

将所述焦亡活性报告质粒共同转染到细胞，对细胞进行处理后弃去上清，收集细胞依次清洗、裂解，收集细胞裂解液检测Gaussia荧光素酶的活性，计算相对荧光素酶活性；

根据处理组与未处理组细胞的相对荧光素酶活性是否呈显著变化，判断细胞焦亡活性。

优选的，所述焦亡处理包括信号通路的刺激或待筛选物质的处理。

优选的，所述相对荧光素酶活性为单位体积的细胞裂解液中，Gaussia荧光素酶活性与总蛋白量的比值。

本发明提供的一组焦亡执行者融合蛋白，包括hGlucN-GSDME融合蛋白和hGlucC-GSDME融合蛋白。本发明将Gaussia荧光素酶N端(hGlucN)与焦亡执行者Gasdermin E(GSDME)连接形成融合蛋白hGlucN-GSDME，同时将Gaussia荧光素酶C端(hGlucC)与GSDME连接形成融合蛋白hGlucC-GSDME，两种融合蛋白通过在细胞中表达，当细胞中焦亡活性被激活时，caspase家族成员激活，两个融合蛋白的GSDME部分被caspase家族成员特异性水解形成N端结构域(N-GSDME)和C端结构域(C-GSDME)，释放的hGlucN-(N-GSDME)和hGlucC-(N-GSDME)由于缺乏C-GSDME的抑制可自发聚集，通过检测hGlucN与hGlucC互补形成的荧光素酶活性，反映细胞焦亡标志蛋白N-GSDME的聚集情况，实现检测细胞焦亡活性。

本发明提供了所述焦亡执行者融合蛋白或所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导的细胞焦亡活性检测中的应用。本发明将蛋白质片段互补分析技术和荧光素酶报告基因技术相结合检测细胞焦亡活性。本发明首次将荧光素酶片段互补分析技术应用于细胞焦亡活性检测中，建立了GSDME分子介导焦亡活性的检测方法，该方法可以对GSDME激活水解产物N-GSDME的聚集进行检测，为研究细胞焦亡提供了新的技术方法。该方法可用于细胞焦亡诱导剂和抑制剂的高通量筛选，解决了目前Western Blot法通量低、检测周期长的技术难题，具有良好的应用价值。实验表明，采用阳性化合物依托泊苷处理细胞，诱发细胞焦亡；依托泊苷可显著增加融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME共表达的相对荧光素酶活性，而依托泊苷不能增加单独融合蛋白hGlucN-GSDME表达的相对荧光素酶活性，依托泊苷也不能增加单独融合蛋白hGlucC-GSDME表达的相对荧光素酶活性，说明焦亡执行者融合蛋白可用于焦亡活性评价。

本发明提供了所述焦亡执行者融合蛋白或所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导焦亡诱导剂筛选中的应用。本发明将蛋白质片段互补分析技术和荧光素酶报告基因技术相结合筛选能引起细胞焦亡的诱导剂。焦亡诱导剂的筛选实验中，分别用丹参酮IIA(Tanshinone IIA)、丹参酮I(Tanshinone I)、隐丹参酮(Cyptotanshinone)、15,16-二氢丹参酮I(15,16-dihydrotanshinone I)、丹参新酮(Miltirone)和丹参二醇A(TanshindiolA)处理细胞，相对荧光素酶活性结果表明，与未加处理的对照组相比，除Tanshindiol A以外，其余五种丹参酮类化合物诱导产生的相对荧光素酶活性均超过了2倍；Tanshinone I和15,16-dihydrotanshinone I诱导产生的相对荧光素酶活性超过了4倍；Miltirone诱导诱导产生的相对荧光素酶活性超过了6倍，其活性高于阳性化合物依托泊苷(Etoposide)对照组，Tanshinone IIA、Cyptotanshinone产生的相对荧光素酶活性超过了2倍但低于4倍，实现焦亡诱导剂筛选。

附图说明

图1为融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME的氨基酸序列组成结构；图中示hGluc的两个互补片段：hGlucN和hGlucC；氨基酸序列方向为从N端到C端；

图2为Western Blot检测融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME在293T细胞中的共表达结果示意图，293T细胞共同转染焦亡活性报告质粒pcDNA3.1-hGlucN-GSDME和pcDNA3.1-hGlucC-GSDME，培养24h后收细胞裂解获得细胞总蛋白提取物，融合蛋白hGlucN-GSDME采用anti-Flag抗体进行检测，融合蛋白hGlucC-GSDME采用anti-HA抗体进行检测；

图3为融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME共表达的相对荧光素酶活性及阳性化合物依托泊苷处理的影响；

图4为丹参酮类化合物焦亡诱导剂筛选的结果。

具体实施方式

本发明提供了一组焦亡执行者融合蛋白，包括hGlucN-GSDME融合蛋白和hGlucC-GSDME融合蛋白，具体见图1；

所述hGlucN-GSDME融合蛋白为表位标签-柔性肽段1-hGlucN-柔性肽段2-GSDME；所述hGlucN的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示(KPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEMEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGI)；所述hGlucN的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示(aagcccaccgagaacaacgaagacttcaacatcgtggccgtggccagcaacttcgcgaccacggatctcgatgctgaccgcgggaagttgcccggcaagaagctgccgctggaggtgctcaaagagatggaagccaatgcccggaaagctggctgcaccaggggctgtctgatctgcctgtcccacatcaagtgcacgcccaagatgaagaagttcatcccaggacgctgccacacctacgaaggcgacaaagagtccgcacagggcggcata)。

所述hGlucC-GSDME融合蛋白为表位标签-柔性肽段1-hGlucC-柔性肽段2-GSDME；所述hGlucC的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示(EAIVDIPEIPGFKDLEPMEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGD)；

所述GSDME的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示(FAKATRNFLREVDADGDLIAVSNLNDSDKLQLLSLVTKKKRFWCWQRPKYQFLSLTLGDVLIEDQFPSPVVVESDFVKYEGKFANHVSGTLETALGKVKLNLGGSSRVESQSSFGTLRKQEVDLQQLIRDSAERTINLRNPVLQQVLEGRNEVLCVLTQKITTMQKCVISEHMQVEEKCGGIVGIQTKTVQVSATEDGNVTKDSNVVLEIPAATTIAYGVIELYVKLDGQFEFCLLRGKQGGFENKKRIDSVYLDPLVFREFAFIDMPDAAHGISSQDGPLSVLKQATLLLERNFHPFAELPEPQQTALSDIFQAVLFDDELLMVLEPVCDDLVSGLSPTVAVLGELKPRQQQDLVAFLQLVGCSLQGGCPGPEDAGSKQLFMTAYFLVSALAEMPDSAAALLGTCCKLQIIPTLCHLLRALSDDGVSDLEDPTLTPLKDTERFGIVQRLFASADISLERLKSSVKAVILKDSKVFPLLLCITLNGLCALGREHS)。所述GSDME的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示(tttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagatgctgcgcatgggatatcttcccaggatggaccattaagtgttttaaagcaagcgaccctgctcctggagaggaatttccatccatttgcggagctgcctgagccacaacagacagctttgagtgacatcttccaggcggtcctatttgatgatgaactactcatggtcctggaaccagtgtgcgatgacctggtcagcggcctctcgcccacagtggcggtgctgggggagctgaagccccggcagcagcaggaccttgtggccttcctgcagctggtggggtgcagcttacagggtgggtgtccgggccccgaggatgcaggcagcaagcagctgtttatgacagcctacttcttggtcagtgccctcgcagaaatgccagatagcgcagcagctctgctgggcacttgctgcaaactccagatcattcccacactgtgccacttgcttcgtgctctgtctgatgatggagtatctgatcttgaagacccaaccttgactcccctgaaagatacagaaaggtttgggattgtgcagcgcttgtttgcctcagctgacattagtctggagagactgaagtcatctgtgaaagctgtcattctgaaggactctaaagtcttcccactgcttctttgtataaccctgaatggactctgtgctttaggcagagaacattcatga)

本发明采用人源化的Gaussia荧光素酶(humanized Gaussia Luciferase，hGluc)作为报告基因，基于蛋白质片段互补技术将hGluc分割成两个可互补的片段hGlucN和hGlucC，将两片段分别连接GSDME，形成融合蛋白。用于蛋白质片段互补技术的荧光素酶(luciferase)还包括有萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLuc)、Renillaluciferase(RLuc)、Gaussia luciferase(GLuc)等。因此，本发明提供的焦亡执行者融合蛋白的报告基因包括但不限于hGluc，也可以是其它荧光素酶报告基因。

在本发明中，所述hGlucN-GSDME融合蛋白中hGlucN通过柔性肽段2与GSDME的N端连接。hGlucN是包括荧光素酶hGluc第18位至第109位的氨基酸序列；所述hGlucN-GSDME融合蛋白中表位标签优选为表位标签Flag，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示(KDYKDDDDK)，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示(atggattacaaggatgacgacgataag)。所述柔性肽段1的氨基酸序列优选为SEQ ID No.11所示(GGGGSGGGS)，其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示(ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcg)。所述柔性肽段2的氨基酸序列优选为SEQ ID No.12所示(GGGGSGGGS)，其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示(ggcggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcg)。所述hGlucN-GSDME融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.1所示(MDYKDDDDKGGGGSGGGGSKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEMEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGGGGGSGGGGSFAKATRNFLREVDADGDLIAVSNLNDSDKLQLLSLVTKKKRFWCWQRPKYQFLSLTLGDVLIEDQFPSPVVVESDFVKYEGKFANHVSGTLETALGKVKLNLGGSSRVESQSSFGTLRKQEVDLQQLIRDSAERTINLRNPVLQQVLEGRNEVLCVLTQKITTMQKCVISEHMQVEEKCGGIVGIQTKTVQVSATEDGNVTKDSNVVLEIPAATTIAYGVIELYVKLDGQFEFCLLRGKQGGFENKKRIDSVYLDPLVFREFAFIDMPDAAHGISSQDGPLSVLKQATLLLERNFHPFAELPEPQQTALSDIFQAVLFDDELLMVLEPVCDDLVSGLSPTVAVLGELKPRQQQDLVAFLQLVGCSLQGGCPGPEDAGSKQLFMTAYFLVSALAEMPDSAAALLGTCCKLQIIPTLCHLLRALSDDGVSDLEDPTLTPLKDTERFGIVQRLFASADISLERLKSSVKAVILKDSKVFPLLLCITLNGLCALGREHS*)；所述hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示(atggattacaaggatgacgacgataagggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgaagcccaccgagaacaacgaagacttcaacatcgtggccgtggccagcaacttcgcgaccacggatctcgatgctgaccgcgggaagttgcccggcaagaagctgccgctggaggtgctcaaagagatggaagccaatgcccggaaagctggctgcaccaggggctgtctgatctgcctgtcccacatcaagtgcacgcccaagatgaagaagttcatcccaggacgctgccacacctacgaaggcgacaaagagtccgcacagggcggcataggcggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagatgctgcgcatgggatatcttcccaggatggaccattaagtgttttaaagcaagcgaccctgctcctggagaggaatttccatccatttgcggagctgcctgagccacaacagacagctttgagtgacatcttccaggcggtcctatttgatgatgaactactcatggtcctggaaccagtgtgcgatgacctggtcagcggcctctcgcccacagtggcggtgctgggggagctgaagccccggcagcagcaggaccttgtggccttcctgcagctggtggggtgcagcttacagggtgggtgtccgggccccgaggatgcaggcagcaagcagctgtttatgacagcctacttcttggtcagtgccctcgcagaaatgccagatagcgcagcagctctgctgggcacttgctgcaaactccagatcattcccacactgtgccacttgcttcgtgctctgtctgatgatggagtatctgatcttgaagacccaaccttgactcccctgaaagatacagaaaggtttgggattgtgcagcgcttgtttgcctcagctgacattagtctggagagactgaagtcatctgtgaaagctgtcattctgaaggactctaaagtcttcccactgcttctttgtataaccctgaatggactctgtgctttaggcagagaacattcatga)。

在本发明中，在hGlucC-GSDME融合蛋白中，所述hGlucC通过柔性肽段2与GSDME的N端连接。hGlucC是包括荧光素酶hGluc第110位至第185位的氨基酸序列。所述hGlucC的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。所述hGlucC的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示(gaggcgatcgtcgacattcctgagattcctgggttcaaggacttggagcccatggagcagttcatcgcacaggtcgatctgtgtgtggactgcacaactggctgcctcaaagggcttgccaacgtgcagtgttctgacctgctcaagaagtggctgccgcaacgctgtgcgacctttgccagcaagatccagggccaggtggacaagatcaagggggccggtggtgac)。在hGlucC-GSDME融合蛋白中，所述表位标签优选为表位标签HA。所述表位标签HA的氨基酸序列优选为SEQ ID No.13所示(MYPYDVPDYA)，其核苷酸序列如SEQ ID No.18所示(atgtacccatacgatgttccagattacgct)。所述柔性肽段1的氨基酸序列优选为SEQ ID No.11所示(GGGGSGGGS)，所述柔性肽段2的氨基酸序列优选为SEQ ID No.12所示(GGGGSGGGS)。所述GSDME的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。所述hGlucC-GSDME融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示(MYPYDVPDYAGGGGSGGGGSEAIVDIPEIPGFKDLEPMEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGDGGGGSGGGGSFAKATRNFLREVDADGDLIAVSNLNDSDKLQLLSLVTKKKRFWCWQRPKYQFLSLTLGDVLIEDQFPSPVVVESDFVKYEGKFANHVSGTLETALGKVKLNLGGSSRVESQSSFGTLRKQEVDLQQLIRDSAERTINLRNPVLQQVLEGRNEVLCVLTQKITTMQKCVISEHMQVEEKCGGIVGIQTKTVQVSATEDGNVTKDSNVVLEIPAATTIAYGVIELYVKLDGQFEFCLLRGKQGGFENKKRIDSVYLDPLVFREFAFIDMPDAAHGISSQDGPLSVLKQATLLLERNFHPFAELPEPQQTALSDIFQAVLFDDELLMVLEPVCDDLVSGLSPTVAVLGELKPRQQQDLVAFLQLVGCSLQGGCPGPEDAGSKQLFMTAYFLVSALAEMPDSAAALLGTCCKLQIIPTLCHLLRALSDDGVSDLEDPTLTPLKDTERFGIVQRLFASADISLERLKSSVKAVILKDSKVFPLLLCITLNGLCALGREHS*)。所述hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示(atgtacccatacgatgttccagattacgctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcggaggcgatcgtcgacattcctgagattcctgggttcaaggacttggagcccatggagcagttcatcgcacaggtcgatctgtgtgtggactgcacaactggctgcctcaaagggcttgccaacgtgcagtgttctgacctgctcaagaagtggctgccgcaacgctgtgcgacctttgccagcaagatccagggccaggtggacaagatcaagggggccggtggtgacggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagatgctgcgcatgggatatcttcccaggatggaccattaagtgttttaaagcaagcgaccctgctcctggagaggaatttccatccatttgcggagctgcctgagccacaacagacagctttgagtgacatcttccaggcggtcctatttgatgatgaactactcatggtcctggaaccagtgtgcgatgacctggtcagcggcctctcgcccacagtggcggtgctgggggagctgaagccccggcagcagcaggaccttgtggccttcctgcagctggtggggtgcagcttacagggtgggtgtccgggccccgaggatgcaggcagcaagcagctgtttatgacagcctacttcttggtcagtgccctcgcagaaatgccagatagcgcagcagctctgctgggcacttgctgcaaactccagatcattcccacactgtgccacttgcttcgtgctctgtctgatgatggagtatctgatcttgaagacccaaccttgactcccctgaaagatacagaaaggtttgggattgtgcagcgcttgtttgcctcagctgacattagtctggagagactgaagtcatctgtgaaagctgtcattctgaaggactctaaagtcttcccactgcttctttgtataaccctgaatggactctgtgctttaggcagagaacattcatga)。

本发明对所述真核表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的真核表达载体即可，例如采用pcDNA3.1时，将hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列和hGlucC-GSDME融合蛋白单独插入pcDNA3.1中，形成pcDNA3.1-hGlucN-GSDME和pcDNA3.1-hGlucC-GSDME；或者所述表达载体可用具有内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)序列的双顺反子表达载体pIRES，也可用具有两个启动子的双基因真核表达载体。在本发明实施例中，所述真核表达载体为pcDNA3.1。hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列和hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列分别插入所述pcDNA3.1的HindIII和XhoI的酶切多克隆位点。

在本发明中，一组焦亡活性报告质粒的构建方法，优选包括采用常规分子生物学技术将两端带有酶切位点的hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列和hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列分别克隆入真核表达载体中。

在本发明中，所述焦亡执行者融合蛋白的制备方法，优选将所述焦亡活性报告质粒共转染细胞，使hGlucN-GSDME融合蛋白和hGlucC-GSDME融合蛋白在细胞中表达。本发明对所述细胞的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞种类即可，例如293T细胞。所述转染优选包括瞬时转染或稳定转染。

在本发明中，所述转染优选包括瞬时转染或稳定转染。本发明对所述细胞的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞种类即可，例如293T细胞。所述处理优选包括信号通路的刺激或待筛选物质的处理。所述信号通路的刺激包括活性小分子和活性大分子等，可应用于细胞焦亡生物学活性研究。

在本发明中，所述清洗时，优选采用PBS溶液进行。所述裂解优选采用裂解剂。所述相对荧光素酶活性优选为单位体积的细胞裂解液中，Gaussia荧光素酶活性与总蛋白量的比值。

在本发明中，以相对荧光素酶活性反映细胞焦亡的活性，与未处理对照组相比，处理组细胞的相对荧光素酶活性是否呈显著变化，判断细胞焦亡活性；若发生显著变化，判断发生细胞焦亡；反之，则未发生细胞焦亡。

在本发明中，所述GSDME介导焦亡诱导剂筛选时，判断诱导剂能引起焦亡的方法如下：

待筛选物质单独处理时，当待筛选物质浓度或处理时间增加，相对荧光素酶活性也增加，则判断该物质具有焦亡诱导活性。

GSDME介导焦亡抑制剂筛选时，判断抑制剂能抑制焦亡活性的方法如下：

将已知焦亡诱导剂和待筛选抑制剂共处理，当待筛选抑制剂浓度或处理时间增加，相对荧光素酶活性与已知焦亡诱导剂单独处理组比较降低，则判断该物质具有焦亡抑制活性。

下面结合实施例对本发明提供的一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

焦亡活性报告质粒的构建方法

设计融合蛋白hGlucN-GSDME(见图1)，该融合蛋白包含表位标签、柔性肽段1、hGlucN、柔性肽段2和GSDME，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。设计融合蛋白hGlucC-GSDME包含表位标签、柔性肽段1、hGlucC、柔性肽段2和GSDME，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，对应的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。依据SEQ ID NO:2合成hGlucN-GSDME基因编码序列，并在序列两端分别加上HindIII和Xho I限制性酶切位点，利用这两个酶切位点将合成的序列克隆入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点，获得焦亡活性报告质粒pcDNA3.1-hGlucN-GSDME。根据SEQ ID NO:4合成hGlucC-GSDME基因编码序列，并在序列两端分别加上Hind III和Xho I限制性酶切位点，利用这两个酶切位点将合成的序列克隆入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点，获得焦亡活性报告质粒pcDNA3.1-hGlucC-GSDME。

将pcDNA3.1-hGlucN-GSDME和pcDNA3.1-hGlucC-GSDME共同转染293T细胞，经常规细胞培养后，采用WesternBlot方法检测细胞中两种融合蛋白的表达情况，以GAPDH为对照蛋白。

融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME在293T细胞中的表达结果如图2所示。质粒pcDNA3.1-hGlucN-GSDME能够表达融合蛋白hGlucN-GSDME，能被anti-Flag抗体特异性检测到目标条带，质粒pcDNA3.1-hGlucC-GSDME能够表达融合蛋白hGlucC-GSDME，能被anti-HA抗体特异性检测到目标条带，两种融合蛋白均能被anti-GSDME抗体检测到目标条带，目标条带分子量大小符合预期，说明所构建的质粒能够表达目标融合蛋白。

实施例2

焦亡活性检测方法的建立

按照7000cells/100μL/孔的铺板方法将293T细胞接种至96孔板中，贴壁培养24h后进行后续操作。将构建的焦亡活性报告质粒pcDNA3.1-hGlucN-GSDME和pcDNA3.1-hGlucC-GSDME按照1:1的比例进行混合，根据需要转染的孔数，按照200ng/孔的质粒用量，取上述混合质粒，并按照25μL/孔的添加体积，准确量取Opti-MEM对质粒进行稀释。根据质粒的量，按照2倍质粒的量准确量取Lipofectamine 2000，并用相同体积Opti-MEM进行稀释。稀释好的质粒和转染试剂稀释液按照1:1的比例进行混合，轻轻混匀后，置于室温条件下，避光15min。然后取上述质粒和转染试剂的混合液按50μL/孔的添加量加入各孔，细胞转染后24h可以进行后续的实验操作。按150μM浓度加入阳性化合物依托泊苷(Etoposide)对转染的细胞处理24h，处理结束后弃去上清，利用PBS清洗细胞一次，每孔加入100μL细胞裂解液，待裂解结束后取20μL裂解液以腔肠素(coelenterazine)为底物进行荧光素酶活性检测，同时取20μL裂解液采用BCA法检测蛋白浓度，计算每孔样品相对荧光素酶活性。同时设置单独融合蛋白表达的对照。

图3为融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME共表达的相对荧光素酶活性及阳性化合物依托泊苷处理的影响。结果表明，依托泊苷不能增加单独融合蛋白hGlucN-GSDME表达的相对荧光素酶活性，依托泊苷也不能增加单独融合蛋白hGlucC-GSDME表达的相对荧光素酶活性，但依托泊苷可显著增加融合蛋白hGlucN-GSDME和融合蛋白hGlucC-GSDME共表达的相对荧光素酶活性，说明所建的方法可用于焦亡活性评价。

实施例3

焦亡活性检测方法应用于焦亡诱导剂的筛选

利用建立的焦亡活性检测方法，对6种丹参酮类成分的焦亡诱导作用进行评价。对焦亡活性报告质粒pcDNA3.1-hGlucN-GSDME和pcDNA3.1-hGlucC-GSDME按照实施例2的方法共同转染293T细胞，转染后的293T细胞分别用40μM丹参酮IIA(Tanshinone IIA)、5μM丹参酮I(Tanshinone I)、20μM隐丹参酮(Cyptotanshinone)、2.5μM 15,16-二氢丹参酮I(15,16-dihydrotanshinone I)、40μM丹参新酮(Miltirone)和40μM丹参二醇A(TanshindiolA)处理，分别在处理1h、3h、6h、9h和12h测定荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性。

各处理组细胞的相对荧光素酶活性结果如图4所示，与未加处理的对照组相比，六种丹参酮类处理的结果，除TanshindiolA以外，其余五种丹参酮类化合物诱导产生的相对荧光素酶活性均超过了2倍，其中Tanshinone I和15,16-dihydrotanshinone I诱导产生的相对荧光素酶活性超过了4倍；Miltirone诱导产生的相对荧光素酶活性超过了6倍，其活性高于阳性化合物依托泊苷(Etoposide)对照组，Tanshinone IIA、Cyptotanshinone产生的相对荧光素酶活性超过了2倍但低于4倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一组焦亡执行者融合蛋白和基于荧光素酶片段互补分析技术的焦亡活性检测方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala

20 25 30

Val Ala Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys

35 40 45

Leu Pro Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala

50 55 60

Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser

65 70 75 80

His Ile Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys

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100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ala Lys Ala Thr Arg Asn

115 120 125

Phe Leu Arg Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Leu Ile Ala Val Ser Asn

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Leu Asn Asp Ser Asp Lys Leu Gln Leu Leu Ser Leu Val Thr Lys Lys

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Lys Arg Phe Trp Cys Trp Gln Arg Pro Lys Tyr Gln Phe Leu Ser Leu

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Thr Leu Gly Asp Val Leu Ile Glu Asp Gln Phe Pro Ser Pro Val Val

180 185 190

Val Glu Ser Asp Phe Val Lys Tyr Glu Gly Lys Phe Ala Asn His Val

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Ser Gly Thr Leu Glu Thr Ala Leu Gly Lys Val Lys Leu Asn Leu Gly

210 215 220

Gly Ser Ser Arg Val Glu Ser Gln Ser Ser Phe Gly Thr Leu Arg Lys

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Gln Glu Val Asp Leu Gln Gln Leu Ile Arg Asp Ser Ala Glu Arg Thr

245 250 255

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275 280 285

Val Ile Ser Glu His Met Gln Val Glu Glu Lys Cys Gly Gly Ile Val

290 295 300

Gly Ile Gln Thr Lys Thr Val Gln Val Ser Ala Thr Glu Asp Gly Asn

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Val Thr Lys Asp Ser Asn Val Val Leu Glu Ile Pro Ala Ala Thr Thr

325 330 335

Ile Ala Tyr Gly Val Ile Glu Leu Tyr Val Lys Leu Asp Gly Gln Phe

340 345 350

Glu Phe Cys Leu Leu Arg Gly Lys Gln Gly Gly Phe Glu Asn Lys Lys

355 360 365

Arg Ile Asp Ser Val Tyr Leu Asp Pro Leu Val Phe Arg Glu Phe Ala

370 375 380

Phe Ile Asp Met Pro Asp Ala Ala His Gly Ile Ser Ser Gln Asp Gly

385 390 395 400

Pro Leu Ser Val Leu Lys Gln Ala Thr Leu Leu Leu Glu Arg Asn Phe

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His Pro Phe Ala Glu Leu Pro Glu Pro Gln Gln Thr Ala Leu Ser Asp

420 425 430

Ile Phe Gln Ala Val Leu Phe Asp Asp Glu Leu Leu Met Val Leu Glu

435 440 445

Pro Val Cys Asp Asp Leu Val Ser Gly Leu Ser Pro Thr Val Ala Val

450 455 460

Leu Gly Glu Leu Lys Pro Arg Gln Gln Gln Asp Leu Val Ala Phe Leu

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Gln Leu Val Gly Cys Ser Leu Gln Gly Gly Cys Pro Gly Pro Glu Asp

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Leu Ala Glu Met Pro Asp Ser Ala Ala Ala Leu Leu Gly Thr Cys Cys

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Asp Asp Gly Val Ser Asp Leu Glu Asp Pro Thr Leu Thr Pro Leu Lys

545 550 555 560

Asp Thr Glu Arg Phe Gly Ile Val Gln Arg Leu Phe Ala Ser Ala Asp

565 570 575

Ile Ser Leu Glu Arg Leu Lys Ser Ser Val Lys Ala Val Ile Leu Lys

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Asp Ser Lys Val Phe Pro Leu Leu Leu Cys Ile Thr Leu Asn Gly Leu

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<210> 2

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gagatggaag ccaatgcccg gaaagctggc tgcaccaggg gctgtctgat ctgcctgtcc 240

cacatcaagt gcacgcccaa gatgaagaag ttcatcccag gacgctgcca cacctacgaa 300

ggcgacaaag agtccgcaca gggcggcata ggcggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360

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gcagtatcaa atctgaatga ctctgataag ttacagcttc taagtctggt gacaaaaaag 480

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gagggcaagt ttgcaaacca cgtgagtgga accctggaga ctgcactggg gaaggtcaag 660

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caggaggtgg atttgcagca gctcatcaga gactctgccg agagaacaat aaatctgaga 780

aaccctgtgc tccagcaggt gctggaagga aggaatgagg tcctgtgcgt tttgacacag 840

aagatcacga cgatgcagaa gtgtgtgatc tctgagcaca tgcaggtcga ggagaagtgt 900

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gtcaccaagg actccaacgt ggtgctggag atcccagctg ccaccaccat tgcctacggt 1020

gtcattgagt tatacgtgaa actggacggc cagttcgagt tctgccttct ccgagggaag 1080

caaggtggct tcgagaacaa gaagagaatt gactctgtct acctggaccc cctggtcttt 1140

cgagagtttg cattcataga catgccagat gctgcgcatg ggatatcttc ccaggatgga 1200

ccattaagtg ttttaaagca agcgaccctg ctcctggaga ggaatttcca tccatttgcg 1260

gagctgcctg agccacaaca gacagctttg agtgacatct tccaggcggt cctatttgat 1320

gatgaactac tcatggtcct ggaaccagtg tgcgatgacc tggtcagcgg cctctcgccc 1380

acagtggcgg tgctggggga gctgaagccc cggcagcagc aggaccttgt ggccttcctg 1440

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<210> 3

<211> 601

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ala Lys Ala Thr Arg

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115 120 125

Asn Leu Asn Asp Ser Asp Lys Leu Gln Leu Leu Ser Leu Val Thr Lys

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Lys Lys Arg Phe Trp Cys Trp Gln Arg Pro Lys Tyr Gln Phe Leu Ser

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Leu Thr Leu Gly Asp Val Leu Ile Glu Asp Gln Phe Pro Ser Pro Val

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<210> 4

<211> 1806

<212> DNA

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<400> 4

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tcatga 1806

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 6

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaggcgatcg tcgacattcc tgagattcct gggttcaagg acttggagcc catggagcag 60

ttcatcgcac aggtcgatct gtgtgtggac tgcacaactg gctgcctcaa agggcttgcc 120

aacgtgcagt gttctgacct gctcaagaag tggctgccgc aacgctgtgc gacctttgcc 180

agcaagatcc agggccaggt ggacaagatc aagggggccg gtggtgac 228

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Phe Ala Lys Ala Thr Arg Asn Phe Leu Arg Glu Val Asp Ala Asp Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ile Ala Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser Asp Lys Leu Gln Leu

20 25 30

Leu Ser Leu Val Thr Lys Lys Lys Arg Phe Trp Cys Trp Gln Arg Pro

35 40 45

Lys Tyr Gln Phe Leu Ser Leu Thr Leu Gly Asp Val Leu Ile Glu Asp

50 55 60

Gln Phe Pro Ser Pro Val Val Val Glu Ser Asp Phe Val Lys Tyr Glu

65 70 75 80

Gly Lys Phe Ala Asn His Val Ser Gly Thr Leu Glu Thr Ala Leu Gly

85 90 95

Lys Val Lys Leu Asn Leu Gly Gly Ser Ser Arg Val Glu Ser Gln Ser

100 105 110

Ser Phe Gly Thr Leu Arg Lys Gln Glu Val Asp Leu Gln Gln Leu Ile

115 120 125

Arg Asp Ser Ala Glu Arg Thr Ile Asn Leu Arg Asn Pro Val Leu Gln

130 135 140

Gln Val Leu Glu Gly Arg Asn Glu Val Leu Cys Val Leu Thr Gln Lys

145 150 155 160

Ile Thr Thr Met Gln Lys Cys Val Ile Ser Glu His Met Gln Val Glu

165 170 175

Glu Lys Cys Gly Gly Ile Val Gly Ile Gln Thr Lys Thr Val Gln Val

180 185 190

Ser Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Thr Lys Asp Ser Asn Val Val Leu

195 200 205

Glu Ile Pro Ala Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Gly Val Ile Glu Leu Tyr

210 215 220

Val Lys Leu Asp Gly Gln Phe Glu Phe Cys Leu Leu Arg Gly Lys Gln

225 230 235 240

Gly Gly Phe Glu Asn Lys Lys Arg Ile Asp Ser Val Tyr Leu Asp Pro

245 250 255

Leu Val Phe Arg Glu Phe Ala Phe Ile Asp Met Pro Asp Ala Ala His

260 265 270

Gly Ile Ser Ser Gln Asp Gly Pro Leu Ser Val Leu Lys Gln Ala Thr

275 280 285

Leu Leu Leu Glu Arg Asn Phe His Pro Phe Ala Glu Leu Pro Glu Pro

290 295 300

Gln Gln Thr Ala Leu Ser Asp Ile Phe Gln Ala Val Leu Phe Asp Asp

305 310 315 320

Glu Leu Leu Met Val Leu Glu Pro Val Cys Asp Asp Leu Val Ser Gly

325 330 335

Leu Ser Pro Thr Val Ala Val Leu Gly Glu Leu Lys Pro Arg Gln Gln

340 345 350

Gln Asp Leu Val Ala Phe Leu Gln Leu Val Gly Cys Ser Leu Gln Gly

355 360 365

Gly Cys Pro Gly Pro Glu Asp Ala Gly Ser Lys Gln Leu Phe Met Thr

370 375 380

Ala Tyr Phe Leu Val Ser Ala Leu Ala Glu Met Pro Asp Ser Ala Ala

385 390 395 400

Ala Leu Leu Gly Thr Cys Cys Lys Leu Gln Ile Ile Pro Thr Leu Cys

405 410 415

His Leu Leu Arg Ala Leu Ser Asp Asp Gly Val Ser Asp Leu Glu Asp

420 425 430

Pro Thr Leu Thr Pro Leu Lys Asp Thr Glu Arg Phe Gly Ile Val Gln

435 440 445

Arg Leu Phe Ala Ser Ala Asp Ile Ser Leu Glu Arg Leu Lys Ser Ser

450 455 460

Val Lys Ala Val Ile Leu Lys Asp Ser Lys Val Phe Pro Leu Leu Leu

465 470 475 480

Cys Ile Thr Leu Asn Gly Leu Cys Ala Leu Gly Arg Glu His Ser

485 490 495

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttgccaaag caaccaggaa ttttcttaga gaagttgatg ctgatggtga cctgattgca 60

gtatcaaatc tgaatgactc tgataagtta cagcttctaa gtctggtgac aaaaaagaag 120

agattctggt gctggcagag acccaagtac cagtttttat ccctcaccct tggcgatgta 180

ctcatagaag accaatttcc gagtccagtg gtcgtggagt cggactttgt gaaatacgag 240

ggcaagtttg caaaccacgt gagtggaacc ctggagactg cactggggaa ggtcaagctg 300

aacctggggg gcagcagccg cgtagagagc cagtcttcat ttggaaccct gaggaagcag 360

gaggtggatt tgcagcagct catcagagac tctgccgaga gaacaataaa tctgagaaac 420

cctgtgctcc agcaggtgct ggaaggaagg aatgaggtcc tgtgcgtttt gacacagaag 480

atcacgacga tgcagaagtg tgtgatctct gagcacatgc aggtcgagga gaagtgtggt 540

ggcatcgtgg gcatccagac caagacggtg caggtgtcag cgacggagga tgggaatgtc 600

accaaggact ccaacgtggt gctggagatc ccagctgcca ccaccattgc ctacggtgtc 660

attgagttat acgtgaaact ggacggccag ttcgagttct gccttctccg agggaagcaa 720

ggtggcttcg agaacaagaa gagaattgac tctgtctacc tggaccccct ggtctttcga 780

gagtttgcat tcatagacat gccagatgct gcgcatggga tatcttccca ggatggacca 840

ttaagtgttt taaagcaagc gaccctgctc ctggagagga atttccatcc atttgcggag 900

ctgcctgagc cacaacagac agctttgagt gacatcttcc aggcggtcct atttgatgat 960

gaactactca tggtcctgga accagtgtgc gatgacctgg tcagcggcct ctcgcccaca 1020

gtggcggtgc tgggggagct gaagccccgg cagcagcagg accttgtggc cttcctgcag 1080

ctggtggggt gcagcttaca gggtgggtgt ccgggccccg aggatgcagg cagcaagcag 1140

ctgtttatga cagcctactt cttggtcagt gccctcgcag aaatgccaga tagcgcagca 1200

gctctgctgg gcacttgctg caaactccag atcattccca cactgtgcca cttgcttcgt 1260

gctctgtctg atgatggagt atctgatctt gaagacccaa ccttgactcc cctgaaagat 1320

acagaaaggt ttgggattgt gcagcgcttg tttgcctcag ctgacattag tctggagaga 1380

ctgaagtcat ctgtgaaagc tgtcattctg aaggactcta aagtcttccc actgcttctt 1440

tgtataaccc tgaatggact ctgtgcttta ggcagagaac attcatga 1488

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggattaca aggatgacga cgataag 27

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg 30

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcg 33

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgtacccat acgatgttcc agattacgct 30

Claims

1.一组焦亡执行者融合蛋白，其特征在于，包括hGlucN-GSDME融合蛋白和hGlucC-GSDME融合蛋白；

所述hGlucN-GSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述hGlucC-GSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述焦亡执行者融合蛋白，其特征在于，所述hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.一组焦亡活性报告质粒，其特征在于，包括分别含hGlucN-GSDME融合蛋白的编码序列和hGlucC-GSDME融合蛋白的编码序列的真核表达载体。

4.权利要求1或2所述焦亡执行者融合蛋白或权利要求3所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导的细胞焦亡活性检测中的应用。

5.权利要求1或2所述焦亡执行者融合蛋白或权利要求3所述焦亡活性报告质粒在制备检测GSDME介导的细胞焦亡活性的试剂或试剂盒中的应用。

6.权利要求1或2所述焦亡执行者融合蛋白或权利要求3所述焦亡活性报告质粒在GSDME介导焦亡诱导剂筛选或GSDME介导焦亡抑制剂筛选中的应用。

7.一种基于荧光素酶片段互补分析技术的细胞焦亡活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求3所述焦亡活性报告质粒共同转染到细胞，对细胞进行处理后弃去上清，收集细胞依次清洗、裂解，收集细胞裂解液检测Gaussia荧光素酶的活性，计算相对荧光素酶活性；

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述处理包括信号通路的刺激或待筛选物质的处理。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述相对荧光素酶活性为单位体积的细胞裂解液中，Gaussia荧光素酶活性与总蛋白量的比值。