JP2019528794A - Fgf21応答性レポーター遺伝子細胞株 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)キメラ転写因子をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種DNA結合ドメインに融合したElk−1のトランス活性化ドメインを含む、第2の異種ポリヌクレオチド;及び
(iii)チロシンキナーゼFGFR1c及びベータ−Klothoタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
(i)試験試料を提供する工程、
(ii)前記試験試料を本発明に従う細胞株に接触させる工程、
(iii)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法を提供する。
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が本発明に従う細胞株を含む、工程、
(iii)前記第1の細胞試料を前記試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第1の細胞試料の細胞における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定し、前記第2の細胞試料の細胞における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1及び第2の細胞試料中の前記レポーター活性の間の比を提供する工程であって、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法に関する。
本発明の態様の説明において、明確化のために特定の用語を使用する。しかしながら、本発明は、そのように選択した特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様の目的を達成するために同様に作用する全ての技術的均等物を含むと理解される。
ベクター
「ベクター」又は「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるDNA分子を指す。4つの主要な種類のベクターはプラスミド、バクテリオファージ及び他のウイルス、コスミド、並びに人工染色体である。ベクター自体は、一般的に、インサート(異種核酸配列、導入遺伝子)及びベクターの「骨格」として働くより大きな配列からなるDNA配列である。遺伝情報を宿主に移入するベクターの目的は、典型的には標的細胞においてインサートを単離、増殖、又は発現させることである。発現ベクター(発現構築物)と呼ばれるベクターは、標的細胞中での異種配列の発現に特異的に適合されており、一般的に、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本発明の態様で利用するベクターの選択は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターの具体的な用途に依存する。
「作動可能に結合する」という用語は、遺伝子又はオープンリーディングフレーム等の機能単位の一部である各要素の結合を指す。したがって、プロモーターを、ポリペプチドをコードする核酸配列(オープンリーディングフレーム、ORF)に作動可能に結合することによって、2つの要素は機能単位の一部−遺伝子となる。核酸配列への発現制御配列(プロモーター)の結合により、プロモーターによって導かれる核酸配列の転写が可能になる。ポリペプチドをコードする2つの異種核酸配列を作動可能に結合させることによって、その配列は、機能単位の一部−異種核酸配列によってコードされる(encoding)アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとなる。2つのアミノ酸配列を作動可能に結合させることにより、その配列は,同じ機能単位の一部−ポリペプチドとなる。2つの異種アミノ酸配列を作動可能に結合することにより、ハイブリッド(融合)ポリペプチドが生成される。
(i)下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)キメラ転写因子をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が、前記シス作用調節配列に結合可能である異種DNA結合ドメインに融合したElk−1のトランス活性化ドメインを含む、第2の異種ポリヌクレオチド;及び
(iii)チロシンキナーゼFGFR1c及びベータ−Klothoタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
(i)試験試料を提供する工程、
(ii)前記試験試料を特許請求の範囲の先行する請求項(the preceding claims)のいずれか一項に記載の細胞株に接触させる工程、
(iii)前記細胞株における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法を提供する。
(iv)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1のレポータータンパク質及び第2のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む。
(i)含有(comprising)試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が特許請求の範囲の先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞株を含む、工程、
(iii)第1の細胞試料を試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)第1の細胞試料の細胞における第1のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第2の細胞試料の細胞における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1及び第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供する工程であって、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法に関する。
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が特許請求の範囲の先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞株を含み、前記細胞株が第2のレポータータンパク質を発現する、工程、
(iii)第1の細胞試料を、試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)第2の細胞試料を、FGF21に接触させる工程、
(iv)第1の細胞試料の細胞における第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第2の細胞試料の細胞における第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1の細胞試料における第1及び第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第1の比を提供し、第2の細胞試料における第1及び第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第2の比を提供する工程、
(vi)工程(v)の第1の比及び第2の比の間の第3の比を提供する工程であって、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む。
(i)下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)キメラ転写因子をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種DNA結合ドメインに融合したElk−1のトランス活性化ドメインを含む、第2の異種ポリヌクレオチド;及び
(iii)チロシンキナーゼFGFR1c及びベータ−Klothoタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
(i)試験試料を提供する工程、
(ii)前記試験試料を、先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株に接触させる工程、
(iii)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法。
(iv)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1のレポータータンパク質及び第2のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む、項目14に記載の方法。
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が、先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株を含む、工程、
(iii)第1の細胞試料を、試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)第1の細胞試料の細胞における第1のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第2の細胞試料の細胞における第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1及び第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供し、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株を含み、前記細胞株が第2のレポータータンパク質を発現する、工程、
(iii)第1の細胞試料を、試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)第1の細胞試料の細胞における第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第2の細胞試料の細胞における第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1の細胞試料における第1と第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第1の比を提供し、第2の細胞試料における第1と第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第2の比を提供する工程、
(vi)工程(v)の第1の比及び第2の比の間の第3の比を提供し、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる工程、
を含む、方法。
ヒト胎児腎臓細胞株HEK293(ATCC(登録商標)CRL−1573)を、FuGENE HDトランスフェクション試薬(Promegaカタログ番号E2311)を使用して、図1に示すように、Gal4 DNA結合ドメイン(nt1からnt390)に融合したElk−1のトランス活性化ドメイン(nt919からnt1275)からなるキメラ転写因子によって調節されるホタルルシフェラーゼ(FL)レポーター遺伝子構築物を用いて連続的に同時トランスフェクトした。Gal4 DNA結合ドメインは哺乳動物細胞には存在しないので、キメラ転写因子のみが、FLレポーター遺伝子の転写を調節するgal4の上流活性化配列(UAS)に結合する。細胞をさらに、FGF21誘導性FL活性を正規化するのに使用される構成的プロモーターの制御下で、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子、並びに最適化合成ベータ−Klotho遺伝子及びFGFR1c受容体鎖で同時トランスフェクトした(図2)。最適化合成ベータ−Klotho遺伝子は、天然の遺伝子と79%の相同性を示す(図3)。最適化合成ベータ−Klotho遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号1に示す。安定なクローンを単離し、漸増濃度のヒトFGF21の存在下でFGF21応答性について特性決定し、次にサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性決定し、そして増殖させた。これにより、天然ベータ−Klotho遺伝子でトランスフェクトした細胞株と比較して、感受性が強められたFGF21応答性細胞株が得られた。したがって、得られたレポーター遺伝子細胞株は、漸増濃度のヒトFGF21で処理した場合に、約3.0ng/mlのEC50であり、感受性が強いことが見出された(図4)。正常なドナーからのヒト血清は、1/10の最終希釈で、漸増濃度のヒトFGF21を用いた処理に対する細胞の応答に有意に影響しなかった(図4)。
WY、S.、&Leung、P.S.、Med.Res.Rev.;4:672−705、2016
Kliewer S.A、Mangelsdorf D.J.Am.J.Clin.Nutr.91:254−257、2010
Fisher、F.M.ら、Diabetes、59:2781−2789.
Wang Y、Sun Z、Ageing Research Reviews8:43−51、2009
Wang H.ら、Cancer Res.57:1750−1757、1997
Claims (22)
- 以下を含む哺乳動物細胞株:
(i)下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第1の異種ポリヌクレオチド、
(ii)キメラ転写因子をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種DNA結合ドメインに融合したElk−1のトランス活性化ドメインを含む、第2の異種ポリヌクレオチド、及び
(iii)チロシンキナーゼFGFR1c及びベータ−Klothoタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。 - 前記DNA結合ドメインが哺乳動物細胞には存在しない、請求項1に記載の哺乳動物細胞株。
- 前記異種DNA結合ドメイン及びその同族シス作用調節配列が酵母又は細菌起源である、請求項1又は2のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
- 前記シス作用調節配列が上流活性化配列(UAS)であり、かつ前記異種DNA結合ドメインが前記上流活性化配列に結合可能であるDNA結合ドメインである、請求項1から3のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
- 前記シス作用調節配列がガラクトース応答性上流活性化配列(UASG)であり、かつ前記異種DNA結合ドメインが前記DNA結合ドメインガラクトース応答性転写因子GAL4(GAL4DB)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記シス作用調節配列がLexAのDNA結合部位であり、かつ前記異種DNA結合ドメインがリプレッサーLexAタンパク質のDNA結合ドメインである、請求項1から5のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記細胞が、ベータ−Klothoタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドを含み、それから前記ベータ−Klothoタンパク質が発現される、請求項1から6のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- ベータ−Klothoタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームが、前記細胞における発現についてコドン最適化されている、請求項1から7のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
- 前記オープンリーディングフレームが、配列番号1に記載の配列、又は配列番号1に対して少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号1に対して79%の配列同一性、例えば配列番号1に対して85%の配列同一性、例えば配列番号1に対して90%の配列同一性、例えば配列番号1に対して95%の配列同一性、例えば配列番号1に対して97%の配列同一性、例えば配列番号1に対して98%の配列同一性、例えば配列番号1に対して99%の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる、請求項1から8のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
- 前記オープンリーディングフレームが、配列番号1に記載の配列を含むか又はそれからなる、請求項1から9のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
- 前記第1のレポータータンパク質が酵素である、請求項1から10のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記第1のレポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項1から11のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記細胞が第2のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項1から12のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記第2のレポータータンパク質が構成的プロモーターから発現される、請求項1から13のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記細胞株が、HEK293、Jurkat、K652及びU937からなる群から選択される、請求項1から14のいずれかに記載の細胞株。
- 前記細胞株がHEK293である、請求項1から15のいずれかに記載の細胞株。
- 試験試料中のFGF21活性を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
(i)試験試料を提供する工程、
(ii)前記試験試料を、請求項1から16のいずれか一項に記載の細胞株に接触させる工程、
(iii)前記細胞株における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、を含む、方法。 - FGF21活性の検出及び任意選択的な定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞株が第2のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
(iv)前記細胞株における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)前記第1のレポータータンパク質及び前記第2のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む、請求項17から18のいずれかに記載の方法。 - 試験試料中に存在するFGF21に対する中和抗体を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項1から19のいずれか一項に記載の細胞株を含む、工程、
(iii)前記第1の細胞試料を前記試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第1の細胞試料の細胞における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第2の細胞試料の細胞における前記第1のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)第1及び第2の細胞試料における前記レポーター活性の間の比を提供する工程であって、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。 - FGF21に対する中和抗体の検出及び任意選択的な定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項20記載の方法。
- 請求項20から21のいずれかに記載の試験試料中に存在するFGF21に対する抗体を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
(i)含有試験試料を提供する工程、
(ii)第1及び第2の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項1から21のいずれか一項に記載の細胞株を含み、前記細胞株が第2のレポータータンパク質を発現する、工程、
(iii)前記第1の細胞試料を前記試験試料に、続いてFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第2の細胞試料をFGF21に接触させる工程、
(iv)前記第1の細胞試料の細胞における前記第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第2の細胞試料の細胞における前記第1及び第2のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
(v)前記第1の細胞試料における前記第1及び第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第1の比を提供し、前記第2の細胞試料における前記第1及び第2のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第2の比を提供する工程、
(vi)工程(v)の第1の比及び第2の比の間の第3の比を提供する工程であって、1未満の比(第1/第2)が前記試料中のFGF21に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
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