CN106480094A - 斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，包括依次进行的以下步骤：步骤1：从斜纹夜蛾克隆SCP‑2基因的cDNA；步骤2：把编码SCP‑2蛋白的cDNA克隆进入pcDNA5/FRT质粒，形成重组的pcDNA5/FRT‑SCP2质粒；步骤3：用该pcDNA5/FRT‑SCP2质粒转化大肠杆菌，经培养后获得转化的大肠杆菌；步骤4：从转化的大肠杆菌中提取重组的质粒DNA，并进行纯化；步骤5：用经过纯化的重组pcDNA5/FRT‑SCP2质粒DNA转染中国仓鼠卵巢细胞；步骤6：转染后的CHO细胞在含有抗生素hygromycinB的培养基中进行筛选及连续的继代培养即得。本发明的目的在于提供一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株及其制备方法和应用，该细胞株具有筛选精度高、操作简单、结果准确的优势。

Description

斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及农药筛选制剂领域，具体地说是一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
目前，化学农药的筛选主要有三种方法：1)生物测定法；2)小分子模拟对接分析法；3)细胞筛选法。生物测定法是直接把害虫幼虫置于含有待测化合物的人工培育基中进行筛选，若培养基中的化合物有毒性，则昆虫生长发育受到抑制，该化合物就有可能是杀虫剂的候选药物。这种方法是目前大多数化学农药的最有效的筛选方法。但是，这种方法培养基和劳动力成本高，周期长，占用地方大，难于大规模高通量地同时对成千上万的化合物进行筛选。小分子模拟对接分析是通过对靶标分子的分子结构进行分析，然后根据结构的相互作用寻找可能的抑制靶标分子的候选化合物。这种方法理论上有很强的针对性和很高的效率。但是，对靶标分子的结构分析有很高的要求，同时由于是分子理论计算分析，有太多的变化因素影响分析的结果，往往理论分析出来的候选化合物的实际效果并不理想。目前在农药筛选中，还很少有通过分子模拟方法成功筛选出来的有效杀虫剂。细胞筛选法是利用细胞作为筛选体系，很好地解决生物测定法和分子模拟法的弱点，能提高筛选的有效性。它利用细胞系统，可以建立高通量的筛选体系，在386孔的微孔板上培养细胞，然后每孔加入待测的不同化合物，即可以在短时间内通过高通量分析检测细胞对化合物的反应，从而确定化合物的毒性和杀虫效果，具有明显的高效，成本低，时效快的优点，是目前药物筛选的发展方向。
在昆虫中，胆固醇不仅是昆虫细胞膜的成分之一，也是蜕皮激素生物合成的前体(Gilbertetal.,2002)。由于昆虫体内缺少两种合成胆固醇所必需的关键性酶(鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶)，所以昆虫不能自主地从简单的前体从头合成胆固醇，而必须通过吸收植物甾醇，如β-谷甾醇和油菜甾醇等，将植物甾醇转化为胆固醇来满足生长、发育和繁殖的需要(Grieneisen,1994；Gilbert et al.,2002)。中肠是吸收和运转胆固醇的主要部位；固醇转运蛋白(Sterol carrier protein,SCP)是运输胆固醇及脂肪酸类酯最重要的转运蛋白。胆固醇通过中肠后被转运到血淋巴中，然后通过血淋巴中的脂蛋白被运送到前胸腺供蜕皮激素生物合成使用；或被运送到脂肪体以自由的胆固醇和胆固醇脂的形式储存起来(Zdobnov,et al.,2002)。干扰或阻断胆固醇的吸收、运输和转化，都会抑制昆虫的生长、发育和繁殖。
胆固醇又称胆甾醇，是细胞膜的重要组分之一，是细胞生理活动所必需的。在哺乳动物中，胆固醇合成部位除脑组织及成熟红细胞外，几乎在全身各组织内都可合成，但肝脏是主要的合成场所。胆固醇在体内的运输主要包括血液中的运输和细胞内的运输。参与胆固醇血液运输的血浆脂蛋白主要有低密度脂蛋白与高密度脂蛋白，以及乳糜微滴和极低密度脂蛋白。外源胆固醇可以通过自由扩散进入细胞，但是简单的自由扩散不能满足细胞对胆固醇的需要(Frolovetal.,1996)。因此，胆固醇的胞内运输，主要通过蛋白质介导和泡囊转运两种方式进行(Atshavesetal.,2000)。蛋白介导的运输速度比泡囊运输要快得多，因此，固醇转运蛋白在胆固醇运输过程中起着最为重要的作用。
固醇转运蛋白(SCP)由SCP-2家族蛋白组成，其主要成员包括SCP-2，SCP-x，17-β-羟基固醇脱氢酶IV(17-hydroxysteroid dehydrogenase TypeIV),类SCP-2蛋白(SCP2-like protein),metallo-β-lactomase和stomatin等(Gallegos,et al.,2001)。SCP-2是主要的蛋白，首先从小鼠的肝脏中被分离纯化，它能够激活胆固醇水化酶的活性从而改变细胞膜内外胆固醇的浓度；而且在体外组织培养系统中，该蛋白的表达能影响胆固醇的运输(Osumi,et al.,1980)，因此被认为是胆固醇代谢途径中的重要载体蛋白。此后，在其他哺乳类动物、鸟类、线虫，植物和昆虫等物种中也相继发现了SCP-2基因家族的多个蛋白。
SCP-x基因是SCP-2基因家族中最常见和最有代表性的基因。在包括人、大鼠和小鼠等哺乳类动物中，SCP-x基因是一个融合基因。人类SCP-x基因编码一个由547个氨基酸组成的58kDa的融合蛋白,包括N端1-404位氨基酸组成的48kDa的3-氧酰-辅酶A硫解酶(3-oxoacyl-CoAthiolase，SCPx-t)和C端425-547位123个氨基酸组成的13kDa的SCP-2蛋白。
在酵母、线虫、果蝇和埃及伊蚊中，SCPx-t和SCP-2蛋白并不是由融合基因SCPx编码，而是由两个不同的SCPx和SCP-2或类SCP-2基因分别编码的(Pfeifer,et al.,1993；Lan和Wessely,2004；Vyazunova,et al.,2007)。而对鳞翅目昆虫家蚕(Gong,et al.,2006)和棉贪夜蛾(S.littoralis)(Takeuchi,et al.,2004)SCP基因研究发现,SCPx基因也是编码一个融合蛋白，而且基因的结构和mRNA的类型在进化关系上更接近于哺乳类动物而不是双翅目的果蝇和埃及伊蚊。
人类SCP-x基因含有两个启动子。一个存在于第1个外显子上游，含有可能的SP1、AP1和AP2结合位点，雌激素反应元件(ERE)位点，GFI-B反应元件(NBRE)，和金属反应元件(MRE)；在第11个内含子中存在第2个启动子，含有可能的AP1和AP2结合位点，2个NFkB结合位点，3个ERE位点和1个MRE元件。因此，SCP-x基因的转录可能可以发生在不同的起始位点：第1个启动子控制了整个SCP-x基因的表达，产生SCP-x mRNA；而第2个启动子控制了SCP-2区域的表达,产生SCP-2mRNA(Ohba,et al.,1995)。研究表明，SCP-x的启动子活性具有宿主组织和细胞特异性，并在不同发育阶段受激素和磷脂类药物的调节，而且两个启动子是独立受到调节的(Roughan,et al.,1992)。在脊椎动物中，SCP-x mRNA大部分分布在肝脏，其他组织中很少表达；而SCP-2则是在除了肝脏和肾脏之外的其他组织中分布较多。
在果蝇和埃及伊蚊中，SCP-x基因只有一个启动子产生SCP-x的mRNA，不生成SCP-2的mRNA。但在这些昆虫中，除了SCP-x基因外，基因组中还有仅编码SCP-2小分子蛋白的基因，也就是说SCP-2蛋白是由另外的SCP-2或类SCP-2基因编码产生的(Vyazunova,et al.,2007；Vyazunova and Lan,2008)。而在鳞翅目昆虫与脊椎动物相似，SCP-x也是一个融合基因，编码产生融合的SCP-x蛋白，并最终剪切产生SCPx-t和SCP-2两个蛋白。例如，棉铃虫和家蚕的SCP-x基因在mRNA水平转录产生SCP-x和SCP-2两个mRNA，经翻译和剪切产生SCPx-t和SCP-2两个蛋白。目前，在鳞翅目昆虫中还没有发现仅单独编码SCP-2蛋白的基因。因此，鳞翅目昆虫SCP-x基因的表达控制更接近于哺乳动物而不是形态相近的双翅目昆虫。但是，鳞翅目昆虫中这两个启动子是如何分别启动SCP-x和SCP-2基因的不同转录本表达以及蛋白翻译后如何剪切还不清楚(Vyazunova,et al.,2007；Vyazunova and Lan,2008)。
SCP-2蛋白可结合如胆固醇，胆固醇衍生物，脂肪酸，脂酰辅酶A和磷脂等化合物。SCP-2蛋白与脂肪酸的结合亲和力可以通过荧光取代实验来检查。顺式荧光18C四烯酸和反式18C四烯酸分别是不饱和支链脂肪酸和饱和直链脂肪酸的类似物,可以与SCP-2蛋白结合。通过不断增加非荧光标记的底物脂肪酸浓度，以竞争性地抑制蛋白与荧光标记物的结合，从而可检查SCP-2对于不饱和脂肪酸的亲和力。人类成熟的13kDa SCP-2蛋白有一个脂肪酸结合位点，对14-16C和24C脂肪酸的亲和力很高，而且它对支链饱和脂肪酸(如植烷酸，降植烷酸)和支链异戊烯基焦磷酸酯(如二甲基苯胺焦磷酸，法尼基焦磷酸，牛龙牛儿焦磷酸和牛龙牛儿牛龙牛儿焦磷酸)亲和力也较直链饱和脂肪酸高(Frolov,et al.,1997；Dansen,et al.,1999)。一般来说，13kDa SCP-2对于脂肪酸的亲和力大小的顺序为：多不饱和长链异戊烯基焦磷酸﹥单不饱和，饱和，短链异戊烯基焦磷酸﹥支链异戊间二烯﹥支链叶绿醇衍生物。
SCP-2蛋白与胆固醇的结合可以通过直接胆固醇结合方法和荧光取代间接竞争性结合方法进行研究。利用直接结合和间接竞争性结合方法证明SCP-2有一个固醇结合位点。但NMR实验证明，SCP-2有2个底物结合位点，这2个位点都可以结合脂肪酸和脂酰辅酶A，但是只有其中的1个可以结合胆固醇。
人SCP-2蛋白对不饱和脂酰辅酶A的亲和力要高于对脂肪酸的亲和力(Dansen,etal.,1999)。但埃及伊蚊AeSCP-2对于胆固醇的亲和力远大于脂肪酸和脂酰辅酶A(Krebsandet al.,2003)。荧光底物结合实验显示，成熟的SCP-2有1个脂酰辅酶A结合位点，但NMR实验却显示有2个脂酰辅酶A结合位点(Stolowich,et al.,1999)。
有研究证明，SCP-2蛋白也有2个磷脂结合位点，但是这2个磷脂结合位点与脂肪酸，脂酰辅酶A和胆固醇的结合位点是不是一样还有待研究(Avdulov,et al.,1999)。竞争性结合实验表明，SCP-2蛋白与磷脂底物结合的亲和力顺序为：磷酸卵磷脂﹥磷脂酰肌醇﹥磷脂酰肌醇磷酸﹥磷脂酰肌醇二磷酸。
胆固醇和脂类跨膜转运的机制可能有以下几种：(1)胆固醇的自发转运。由于胆固醇不溶于水，而且不易从膜上脱落下来，所以这个过程是很慢的。(2)可溶性SCP-2蛋白结合已从膜上脱落下来的胆固醇，有效地转运胆固醇到受体膜上。透析实验也说明增加供体膜上的SCP-2可以有效的增加胆固醇的转运。(3)SCP-2蛋白靠N端兼性α-螺旋外侧正电荷的氨基酸结合到阴离子磷脂膜上，另外存在的胆固醇结合位点转运膜上胆固醇到达受体膜中。(4)SCP-2蛋白结合膜上胆固醇，然后SCP-2蛋白-胆固醇复合物从膜上脱落，转运到受体膜上然后释放胆固醇。(5)SCP-2蛋白结合到受体膜上，然后结合胆固醇，释放胆固醇到受体膜，但是本身并不脱离受体膜。转运体外胆固醇的机制虽然不能说明在细胞和组织内的转运情况，但是至少可以说明了几个问题：(1)胆固醇转运速度很快的，SCP-2蛋白参与的转运是必需的。(2)SCP-2蛋白不仅能在体外供体膜/受体膜之间转运胆固醇，在完整细胞和组织中参与了胆固醇的转运。(3)SCP-2蛋白转运胆固醇在不同细胞器供体膜和受体膜之间的转运是一个有序的过程。(4)胆固醇在体内转运可能存在多种竞争性途径，胆固醇在体内具体如何转运尚需进一步研究。
胆固醇和脂类是昆虫细胞膜成分，同时，胆固醇也是蜕皮激素生物合成的前体。而胆固醇的吸收和运输主要通过SCP-2家族的蛋白进行。研究发现，当给美洲棉铃虫(Heliothis zea)喂食缺少胆固醇培养基时，美洲棉铃虫不能蜕皮进入下个幼虫期或蛹期(Nesetal,1997)。SCP2蛋白抑制剂SCPI能够抑制埃及伊蚊SCP2蛋白和胆固醇的正常结合，阻断蜕皮激素的生物合成，从而有效地杀灭埃及伊蚊或影响其繁殖(Lan and Wessely，2004；Blitzer,et al.,2005)。
目前，尚没有针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的杀虫化合物的细胞筛选系统和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株及其制备方法和应用，通过上述方法建立了SCP-2稳定转化的细胞株，通过该细胞株可确定待测化合物是否可以与胆固醇竞争性地与固醇转运蛋白SCP-2结合，从而抑制胆固醇吸收进入细胞。如果某一化合物可以抑制胆固醇进入稳定转化SCP-2后的细胞，其可视为作用于SCP-2的候选杀虫化合物。该细胞株具有筛选精度高、操作简单、结果准确的优势。
本发明的具体的技术方案为：一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
步骤1：从斜纹夜蛾克隆SCP-2基因的cDNA；
步骤2：把编码SCP-2蛋白的cDNA克隆进入pcDNA5/FRT质粒，形成重组的pcDNA5/FRT-SCP2质粒；
步骤3：用该pcDNA5/FRT-SCP2质粒转化大肠杆菌，经培养后获得转化的大肠杆菌；
步骤4：从转化的大肠杆菌中提取重组的质粒DNA，并进行纯化；
步骤5：用经过纯化的重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒DNA转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；
步骤6：转染后的CHO细胞在含有抗生素hygromycinB的培养基中进行筛选及连续的继代培养即得。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，所述的步骤6之后还包括依次进行的以下步骤：
步骤7：对继代培养后的细胞进行连续的梯队稀释，最终使96孔培养板上每一孔具有单一的细胞，当判断SCP-2基因已整合进入细胞基因组中,则得到了SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株；
步骤8：于液氮中保存重组的SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，在步骤7中判断是否得到了SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株的方法具体为：利用PCR和western blot技术检查每个细胞克隆中SCP-2基因是否已整合进入到细胞的基因组中，并得到蛋白表达。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，所述的步骤2具体为：
S21：根据NCBI上SlSCPx序列上pro-SlSCPx-2结构域序列的ORF，运用PrimerPremier5.0软件设计上下游引物，并在上下游引物上分别加入酶切位点KpnI和NotI；
S22：运用PCR技术扩增得到目的片段，将目的片段进行胶回收，连接到pMD-18T载体使pMD-18T载体上连接编码SCP-2蛋白的cDNA；
S23：将S22中的pMD-18T载体上的编码SCP-2蛋白的cDNA转到表达载体pcDNA5/FRT上，得到pcDNA5/FRT-SCP2质粒。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，所述的步骤3具体为：
将重组的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经过氨苄青霉素的筛选得到单克隆菌株；将单克隆细胞扩大培养，并运用PCR技术和双酶切鉴定得到的单克隆菌株。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的菌株的制备方法中，所述的步骤4具体为：
从成功转化的单克隆细胞中提取质粒酶切得到目的基因片段SCP2，将目的基因片段连接到同样经过双酶切的表达载体pcDNA5/FRT载体中，经转化及筛选，得到重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，所述的步骤5具体为：
S51：在转染的前一天晚上，向6孔板的每孔中加入1-5×105个中国仓鼠卵巢细胞，每孔中加入2mlF-12完全培养基，含血清10％；在37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养12个小时；
S52：第二天早上移走完全培养基，用PBS清洗细胞，每孔加入800μlOpti-MEM，在培养箱中培养30min；
S53：用倒置显微镜观察确认细胞完全贴壁，并将6孔板放回培养箱中；
S54：准备转染混合物，用两个1.5ml的离心管，分别标记A和B，按照如下加入试剂：A：2.5μg的重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒，用Opti-MEM补充体积至100μl；B：10μl脂质体和90μlOpti-MEM，总体积100μl；
S55：将A管和B管轻轻混匀10s，在室温下放置20min；
S56：将S55中得到的混合物逐滴加入每孔中，并将6孔板在培养箱中放置4小时；
S57：4小时后每孔中加入1ml的F-12完全培养基；
S58：24小时后，用预冷的PBS清洗细胞，并将细胞放于冰上，每孔中加入120μl裂解液，冰上放置30min；
S59：用裂解液吹打细胞，并收集细胞于预冷的离心管中，做好标记，冰上放置30min；
S510：将离心管放于4℃离心机中，14000G离心25min；
S511：收集上清液，放于冰上，测定蛋白的浓度，并于-20℃保存备用。
在上述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法中，所述的步骤6具体为：将S511收集的转染后48小时的贴壁细胞，用胰酶消化，制备成细胞悬液，并用新鲜培养基按照1：5的比例稀释到6孔板中，于培养箱中培养，待细胞完全贴壁之后，换用含有500μg/ml Hygromycin B的新鲜培养基继续培养细胞；每隔3天换一次培养基，直到有存活的细胞聚集成团出现；经过两周的初步筛选，未转染目的蛋白的细胞全部死亡，转染了目的蛋白的存活细胞大量聚集，此时，用500μl的不含HygromycinB的完全培养基收集细胞，并用血球细胞计数板计算细胞的密度。
同时，本发明还提供一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株，所述的细胞株通过如上所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法制备得到。
此外，本发明的一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的杀虫剂化合物的筛选体系、用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的人类和动物相关药物的筛选体系、用于研究胆固醇运转蛋白SCP-2的生物学功能、用于研究细胞胆固醇和脂肪酸代谢途径及其调控。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本方案通过将斜纹夜蛾克隆SCP-2基因的cDNA经过重组、转染、提取、纯化后经过继代培养得到SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株，转化稳定。
同时本发明得到的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株能够有效的待测化合物结合，并且若优于与胆固醇的结合，可以有效抑制胆固醇进入细胞，达到阻隔昆虫生长、发育、繁殖的目的。
本发明的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株主要用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的杀虫剂化合物的筛选体系、用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的人类和动物相关药物的筛选体系、用于研究胆固醇运转蛋白SCP-2的生物学功能、用于研究细胞胆固醇和脂肪酸代谢途径及其调控。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例
在阐述本发明的方法之前对以下简称进行解释和描述：
Ham’s F-12培养基：
NCBI：美国国家生物技术信息中心
SlSCPx：斜纹夜蛾SCPx
pro-SlSCPx-2：斜纹夜蛾SCPx-2前体
ORF：开放阅读框
DH5α：细菌菌株名(大肠杆菌感受态细胞)
Opti-MEM：培养基
Hygromycin B：潮霉素
trypsin-EDTA：胰蛋白酶
DMSO：二甲亚砜
SCP-2基因编号：FJ986464
文献出处：
Guo,X.R.,Zheng,S.C.,Liu,L.and Feng,Q.L.The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase(SCPx)is involved in cholesterol uptake in the midgutof Spodoptera litura:gene cloning,expression,localization and functionalanalyses.BMC Mol.Biol.10,102－120(2009)
郭兴荣，郑思春，刘琳，冯启理固醇转运蛋白2/3酰基辅酶A硫解酶(SCPx)参与斜纹夜蛾中肠胆固醇吸收：基因克隆、表达、定位及功能分析BMC Mol.Biol.10,102－120(2009)
pcDNA5/FRT是Invitrogen出售的载体，序列是公开的(类似pMD-18T，序列为本领域公知)
1.细胞株
中国仓鼠卵巢细胞CHO(Chinese Hamster ovary)的培养条件：在含有10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的Ham’sF-12(GIBCO,USA)培养基中于37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养。细胞每隔3天用1ml的0.25％trypsin-EDTA处理，按照1：5的比例稀释传代培养。
2.表达载体的构建
1)根据NCBI上SlSCPx序列上pro-SlSCPx-2结构域序列的ORF(open readingframe)，运用Primer Premier5.0软件设计上下游引物，并在上下游引物上分别加入酶切位点KpnI和NotI。2)运用PCR技术扩增得到目的片段，将目的片段进行胶回收，连接到pMD-18T载体上，转到表达载体pcDNA5/FRT上，得到重组的pcDNA5/FRT-SCP2质粒。3)将重组的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经过氨苄青霉素的筛选得到单克隆菌株。将单克隆菌扩大培养，并运用PCR技术和双酶切鉴定确认得到的单克隆菌株。4)从成功转化的单克隆菌中提取质粒酶切得到目的基因片段，将目的基因片段连接到同样经过双酶切的表达载体pcDNA5/FRT载体中；5)重复步骤(3)获得表达载体pcDNA5/FRT-SCP2，提取、纯化质粒。
3.细胞转染和细胞总蛋白的提取
1)在转染的前一天晚上，向6孔板的每孔中加入1-5×105个细胞(2mlF-12完全培养基，含血清10％)，在37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养12个小时；2)第二天早上移走完全培养基，用PBS清洗细胞，每孔加入800μlOpti-MEM，在培养箱中培养30min；3)用倒置显微镜观察确认细胞完全贴壁，并将6孔板放回培养箱中；4)准备转染混合物，用两个1.5ml的离心管，分别标记A和B，按照如下加入试剂：A：2.5μg的质粒，用Opti-MEM补充体积至100μl；B：10μl脂质体和90μl Opti-MEM，总体积100μl；5)将A管和B管轻轻混匀10s，在室温下放置20min；6)将混合物逐滴加入每孔中，并将6孔板在培养箱中放置4小时；7)4小时后每孔中加入1ml的F-12完全培养基；8)24小时后，用预冷的PBS清洗细胞，并将细胞放于冰上，每孔中加入120μl裂解液，冰上放置30min；9)用裂解液吹打细胞，并收集细胞于预冷的离心管中，做好标记，冰上放置30min；10)将离心管放于4℃离心机中，14000g离心25min；11)收集上清，放于冰上，测定蛋白的浓度，并于-20℃保存备用。
4.稳定细胞株的筛选
1)初步筛选：将转染后48小时的贴壁细胞，用胰酶消化，制备成细胞悬液，并用新鲜培养基按照1：5的比例稀释到6孔板中，于培养箱中培养，待细胞完全贴壁之后，换用含有500μg/ml Hygromycin B的新鲜培养基继续培养细胞；每隔3天换一次培养基，直到有存活的细胞聚集成团出现；2)经过两周的初步筛选，未转染目的蛋白的细胞全部死亡，转染了目的蛋白的存活细胞大量聚集，此时，用500μl的完全培养基(不含HygromycinB)收集细胞，并用血球细胞计数板计算细胞的密度；3)假设细胞的密度是1×104cells/ml,那么细胞总数为5×103,则取100μl细胞悬液加入900μl完全培养基中，细胞密度降为1×103cells/ml；4)再从(3)中得稀释液中取100μl细胞悬液加入900μl完全培养基中，细胞密度降为1×102cells/ml；5)按照上述的方法继续稀释，直到5cells/ml，取此时的细胞悬液，按照每孔100μl加入到96孔板中，观察并标记只有1个细胞的孔；6)待到单个细胞完全贴壁之后，移走完全培养基，换用含500μg/ml HygromycinB的新鲜培养基；7)每隔12小时用倒置显微镜拍照观察，每隔3天换一次液；8)当单个细胞长满整个孔时，转移到48孔板，依次类推，转移到24孔板，12孔板，6孔板，直到最后25cm2flask(培养瓶)；9)收集细胞，分别提取总蛋白和基因组进行western blot和PCR检测。
5.细胞抗性分析
1)通过细胞计数取细胞数目大致相同，且细胞密度小于25％的正常细胞和稳定转化的细胞，接种于6孔板中。2)待细胞完全贴壁之后，移走完全培养基，换用含有500μg/mlHygromycinB的新鲜培养基继续培养细胞，每隔3天换一次培养基；3)每隔24h拍照观察，并统计同一放大倍数下，随机的5个视野的细胞进行计数，直到正常生长的细胞完全死亡为止；4)计算细胞的生长率(％)＝(某个时间细胞的最终数目-初始细胞数目)/初始细胞数目×100％；5)并由Graphpad Software软件分析误差做出曲线图。
6.细胞的传代培养
1)从培养箱中拿出细胞瓶，迅速倒置摇晃数下以清洗除去细胞瓶表面的雾气，并正置放入超净工作台中；吸取3.8ml新鲜培养基至新的培养瓶中，并标记代数、日期及细胞名称)。2)将旧瓶中的培养基吸走，加入约1ml的PBS清洗细胞；3)吸走PBS，加入1ml的0.25％trypsin-EDTA，消化细胞约30s；4)吸走0.25％trypsin-EDTA，用1ml的新鲜培养基清洗细胞；5)吸走培养基，再次加入1ml的新鲜培养基，将细胞吹打下来；6)取200μl的细胞悬液放入(2)中，上下前后骤停轻摇混匀细胞，剩下的细胞悬液留作冻存。7)将正常生长的细胞直接放入培养箱中，继续混匀培养；8)将筛选出来的细胞避光分别加入40μl的Hygromycin B后放入培养箱中继续混匀培养。
7细胞的冻存与复苏
1)待细胞密度达到90％以上，用胰酶将细胞消化，使其脱离细胞培养瓶底部，再用1ml的细胞培养基轻轻吹打细胞形成细胞悬液，取900μl移入细胞冻存管中，加入100μl的DMSO混匀；2)在冻存管上做好代数、细胞名称以及日期的标记，并用封口膜封好；3)将冻存管放入4℃30min,再转入-20℃30min，最后存于液氮罐中；4)在细胞复苏前，打开水浴锅，将温度调至37℃，待温度恒定，取出存于液氮罐中的细胞，快速放入水浴锅中；5)待管中的冰融化成液体，8000rpm低速离心，弃去液体，加入1ml新鲜的培养基重悬沉淀细胞形成细胞悬液；6)将细胞悬液加入含有3ml新鲜培养基的25cm2的细胞培养瓶中，混匀后做好标记，于37℃培养箱中培养。
本实施例制备得到的细胞株可以用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的杀虫剂化合物的筛选体系、可以用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的人类和动物相关药物的筛选体系、可以用于研究胆固醇运转蛋白SCP-2的生物学功能、可以用于研究细胞胆固醇和脂肪酸代谢途径及其调控。
特别地，在杀虫化合物筛选中有着独特的应用。在昆虫中，胆固醇不仅是昆虫细胞膜的成分之一，也是蜕皮激素生物合成的前体。由于昆虫体内缺少两种合成胆固醇所必需的关键性酶(鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶)，所以昆虫不能自主地从简单的前体从头合成胆固醇，而必须通过吸收植物甾醇，再将植物甾醇转化为胆固醇来满足生长、发育和繁殖的需要。固醇转运蛋白SCP-2是运输胆固醇及脂肪酸类酯最重要的转运蛋白。胆固醇通过固醇转运蛋白SCP-2吸收和运输进入体内以满足昆虫生长发育的需要。干扰或阻断固醇转运蛋白SCP-2与运输底物的结合，将干扰或阻断胆固醇的吸收、运输和转化，都会抑制昆虫的生长、发育和繁殖。利用这个原理，可构建杀虫剂化合物的细胞筛选体系。把SCP-2基因转化细胞，获得重组的可表达SCP-2的稳定细胞株。在386孔的微孔板上培养稳定转化SCP-2后的细胞株，然后每个培养孔中加入荧光标记的胆固醇和待测的不同化合物，即可以在短时间内通过高通量分析检测进入细胞中的荧光标记的胆固醇的量，与对照相比，即可确定待测化合物是否可以与胆固醇竞争性地与固醇转运蛋白SCP-2结合，从而抑制胆固醇吸收进入细胞。如果某一化合物可以抑制胆固醇进入稳定转化SCP-2后的细胞，其可视为作用于SCP-2的候选杀虫化合物。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特征在于，包括依次进行的以下步骤：
步骤1：从斜纹夜蛾克隆SCP-2基因的cDNA；
步骤2：把编码SCP-2蛋白的cDNA克隆进入pcDNA5/FRT质粒，形成重组的pcDNA5/FRT-SCP2质粒；
步骤3：用该pcDNA5/FRT-SCP2质粒转化大肠杆菌，经培养后获得转化的大肠杆菌；
步骤4：从转化的大肠杆菌中提取重组的质粒DNA，并进行纯化；
步骤5：用经过纯化的重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒DNA转染中国仓鼠卵巢细胞；
步骤6：转染后的CHO细胞在含有抗生素hygromycinB的培养基中进行筛选及连续的继代培养即得。
2.根据权利要求1所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特征在于，所述的步骤6之后还包括依次进行的以下步骤：
步骤7：对继代培养后的细胞进行连续的梯队稀释，最终使96孔培养板上每一孔具有单一的细胞，当判断SCP-2基因已整合进入细胞基因组中,则得到了SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株；
步骤8：于液氮中保存重组的SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株。
3.根据权利要求2所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤7中判断是否得到了SCP-2稳定转化的阳性克隆细胞株的方法具体为：利用PCR和westernblot技术检查每个细胞克隆中SCP-2基因是否已整合进入到细胞的基因组中，并得到蛋白表达。
4.根据权利要求1所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特征在于，所述的步骤2具体为：
S21：根据NCBI上SlSCPx序列上pro-SlSCPx-2结构域序列的ORF，运用PrimerPremier5.0软件设计上下游引物，并在上下游引物上分别加入酶切位点KpnI和NotI；
S22：运用PCR技术扩增得到目的片段，将目的片段进行胶回收，连接到pMD-18T载体，使pMD-18T载体上连接编码SCP-2蛋白的cDNA；
S23：将S22中的pMD-18T载体上的编码SCP-2蛋白的cDNA转到表达载体pcDNA5/FRT上，得到重组的pcDNA5/FRT-SCP2质粒。
5.根据权利要求1所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特在于，所述的步骤3具体为：
将重组的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经过氨苄青霉素的筛选得到单克隆菌株；将单克隆菌株扩大培养，并运用PCR技术和双酶切鉴定获得的单克隆菌株。
6.根据权利要求5所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特在于，所述的步骤4具体为：
从成功转化的单克隆菌株中的单克隆细胞中提取质粒酶切得到目的基因片段SCP2，将目的基因片段连接到同样经过双酶切的表达载体pcDNA5/FRT载体中，经转化及筛选，得到重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒。
7.根据权利要求1所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特在于，所述的步骤5具体为：
S51：在转染的前一天晚上，向6孔板的每孔中加入1-5×105个中国仓鼠卵巢细胞，每孔中加入2ml F-12完全培养基，含血清10％；在37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养12个小时；
S52：第二天早上移走完全培养基，用PBS清洗细胞，每孔加入800μl Opti-MEM，在培养箱中培养30min；
S53：用倒置显微镜观察确认细胞完全贴壁，并将6孔板放回培养箱中；
S54：准备转染混合物，用两个1.5ml的离心管，分别标记A和B，按照如下加入试剂：A：2.5μg的重组pcDNA5/FRT-SCP2质粒，用Opti-MEM补充体积至100μl；B：10μl脂质体和90μlOpti-MEM，总体积100μl；
S55：将A管和B管轻轻混匀10s，在室温下放置20min；
S56：将S55中得到的混合物逐滴加入每孔中，并将6孔板在培养箱中放置4小时；
S57：4小时后每孔中加入1ml的F-12完全培养基；
S58：24小时后，用预冷的PBS清洗细胞，并将细胞放于冰上，每孔中加入120μl裂解液，冰上放置30min；
S59：用裂解液吹打细胞，并收集细胞于预冷的离心管中，做好标记，冰上放置30min；
S510：将离心管放于4℃离心机中，14000G离心25min；
S511：收集上清液，放于冰上，测定蛋白的浓度，并于-20℃保存备用。
8.根据权利要求7所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法，其特在于，所述的步骤6具体为：将S511收集的转染后48小时的贴壁细胞，用胰酶消化，制备成细胞悬液，并用新鲜培养基按照1：5的比例稀释到6孔板中，于培养箱中培养，待细胞完全贴壁之后，换用含有500μg/ml Hygromycin B的新鲜培养基继续培养细胞；每隔3天换一次培养基，直到有存活的细胞聚集成团出现；经过两周的初步筛选，未转染目的蛋白的细胞全部死亡，转染了目的蛋白的存活细胞大量聚集，此时，用500μl的不含HygromycinB的完全培养基收集细胞，并用血球细胞计数板计算细胞的密度。
9.一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株，其特征在于，所述的细胞株通过如权利要求1至8任一所述的斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的制备方法制备得到。
10.一种斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化的细胞株的用途，其特征在，如权利要求9所述的细胞株用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的杀虫剂化合物的筛选体系、用于针对胆固醇运转蛋白SCP-2作为分子靶标的人类和动物相关药物的筛选体系、用于研究胆固醇运转蛋白SCP-2的生物学功能、用于研究细胞胆固醇和脂肪酸代谢途径及其调控。
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