CN102757958A - 一种cd14真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株的方法。具体而言，本发明将CD14全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中，并用构建的真核表达载体转染胃癌SGC-7901细胞，建立CD14稳定过表达的胃癌细胞系。

Description

一种CD14真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株。具体而言，本发明将CD14全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中，并用构建的真核表达载体转染胃癌SGC-7901细胞，建立CD14稳定过表达的胃癌细胞系。

背景技术

胃癌对人类的健康构成了很大的威胁，胃癌在各类肿瘤引起的死亡中位居第二，又因其同时具有高发性和普遍性的特点所以受到国内外的广泛关注。胃癌的发生是一个复杂的过程，包含着多个因素多个基因的相互作用，其中某些原癌基因的激活以及抑癌基因的失活突变是细胞增殖失控并癌变的主要原因。

随着研究的深入，人们逐渐发现致病菌感染是引起某些基因的异常表达并引发胃癌的根源。幽门螺杆菌(H.pylori)是胃癌及胃黏膜相关淋巴瘤的第一类致癌原，也是危害人类健康的重要病原体之一。Bhasin DK等[Bhasin DK，KakkarN，Sharma BC et al.Helicobacter pylori in gastric cancer in India.TropGactroenterol.1999，20(2)：70-72]发现在接受组织学检查的胃癌患者中有1/3存在着Hp感染。在癌前病变胃粘膜中，Hp感染者的c-met表达明显高于未感染者，且c-met的表达随着病变的进展而增强，表明Hp的感染增加了胃粘膜的损伤程度和敏感性。幽门螺杆菌为微需氧革兰氏染色阴性菌，脂多糖(LPS)是其主要毒性物质，LPS通过与体内多种蛋白的结合而引发一系列的炎性反应。

CD14是富含亮氨酸重复序列的一种糖蛋白，为细菌脂多糖(LPS)的高亲和性受体，主要表达于外周血的单核细胞和组织中的巨噬细胞膜上，可识别革兰氏阴性菌、真菌、结核菌、梅毒螺旋体菌体成分以及与葡萄球菌肠毒素等细菌产物结合，CD14介导机体对LPS的识别及结合，在TLR的配合下将信号传递到细胞内，激活NF-kB进一步诱导一系列细胞因子的表达，引发炎症级联反应。CD14的表达受LPS及其下游炎性细胞因子的调节，并且具有剂量依赖性。另外CD14还可通过细胞内的传导通路引起某些癌基因的活化，对细胞生长、分化、癌细胞产生具有推动作用。

CD14单克隆抗体处理过的单核-巨噬细胞受LPS刺激而被激活的能力明显降低，表明了CD14在宿主细胞中识别LPS及级联反应中的重要作用。近年来，CD14因在病菌感染及介导炎性反应中的重要作用而受到广泛关注。CD14与肿瘤发生发展的关系在国内外已有报道，Tshela等发现CD14高表达的男性中患前列腺癌的风险较高。Martina Seiffert等发现CD14是一种新型的单核细胞衍生的慢性淋巴细胞性白血病细胞的生存因子，由白血病细胞诱导，在体内异常高表达，CD14的rs4914CG基因型多态性与罹患大肠癌高风险性密切相。ChristophL.等推测，CD14的水平可能影响体内TLR辅助调节效应，从而影响某些抗癌疗法或抗病毒反应。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，Zhao等发现CD14基因-260CT和-260TT多态性会增加胃癌的风险，说明CD14与胃癌发生存在关联。

本发明将CD14全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中，经双酶切及测序鉴定所构建的pcDNA3.1-EGFP-CD14重组子含有完整及正确的CD14基因。用所述重组质粒转染胃癌SGC-7901细胞，建立CD14稳定过表达的胃癌细胞系。

发明内容

本发明根据GenBank中CD14的mRNA序列(NM_000591)，设计包括整个CD14编码区的上、下游引物，上游引物F1的序列见序列表SEQ NO.1，F1的5’端引入HindIII酶切位点，下游引物R1的序列见SEQ NO.2，R1的5’引入BamHI酶切位点，扩增长度为1153bp。同时设计用于细胞转染后RT-PCR鉴定的CD14片段扩增引物F2其序列见序列表SEQ NO.3，R2序列见序列表SEQNO.4，内参引物β-actin上游引物F3其序列见序列表SEQ NO.5，下游引物R3的序列见序列表SEQ NO.6。

本发明构建了CD14真核表达载体，通过以下步骤制备：表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建。

1)表达CD14的细胞总RNA的提取：

a)收集所培养的SGC-7901细胞加入1ml Trizol裂解液，室温下静置5min。

b)加入200μl三氯甲烷，充分混匀，室温放置3min，12000rpm离心10min，取上清。

c)加入500μl异丙醇混匀，室温静置10min，12,000rpm离心10min。

d)弃上清，加1ml75％的乙醇漂洗，7500rpm离心5min。

e)吸取75％的乙醇，于超净台晾干，直到EP管底部的RNA变透明，加入20μl RNase-free ddH2O，所得即为样本总RNA。

2)CD14编码区的克隆

a)利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，将上一步得到的总RNA进行反转录反应，在200μl反应管中加入总RNA1μg，oligo(dT)151μl，random1μl，dNTP(2.5mM each)2μl，加ddH2O至14.5μl，混匀后70℃加热5min，冰上冷却2min。瞬时离心后再加入5×First-Strand Buffer4μl，RNasin0.5μ1，TIANScript M-MLV1μl(200U)，总反应体积为20μl，混匀后42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应。

b)取1μl反转录产物，加入上述CD14编码区上下游引物各1μl，2×Taq PCRMaster Mix210μl，用ddH2O补足20μl。PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min结束反应。将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化，得到CD14编码区DNA。

3)CD14真核表达载体的构建

用HindIII和BamHI双酶切pcDNA3.1-EGFP质粒DNA及纯化的CD14编码区DNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化目的片段，加入T4 DNAligase，16℃连接过夜。连接产物转化到克隆菌中如：大肠杆菌DH5α感受态。挑取单克隆置于LB培养基中振荡培养，提取质粒进行酶切鉴定，并将切下目的条带的质粒送测序公司进行测序。

本发明通过将上述得到的pcDNA3.1-EGFP-CD14真核表达载体转入SGC-7901细胞中，得到稳定表达CD14的细胞株，转染条件及稳定细胞株的筛选和鉴定方法如下：

1、细胞转染及稳转细胞系的筛选

1)在转染前撤除培养基中的抗生素，将处于对数生长期的SGC-7901细胞接种至6孔板中培养24h，待细胞长至80％-90％融合时进行转染。

2)采用脂质体法转染，使用前轻轻混合Lipofectamine^TM2000，取8ul试剂用400ul无血清培养基稀释，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。

3)孵育5分钟后，取pcDNA3.1-EGFP空质粒和pcDNA3.1-EGFP-CD14各20ug，分别与稀释的Lipofectamine^TM2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。

4)将质粒-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含SGC-7901细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。

5)37℃，CO₂培养箱孵育4小时改换含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白瞬时表达情况。

6)用胰酶消化阳性细胞并传代，在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中加入800μg/ml的G418进行培养，2周后将G418浓度降低为400μg/ml维持筛选。用含400μg/ml G418的选择培养液培养4周后，分离阳性克隆并扩大培养，得到稳定表达CD14的SGC-7901细胞株L1。

2、稳转细胞系中CD14的表达鉴定

收集细胞株L1、同时以未转染SGC-7901细胞、pcDNA3.1-EGFP空质粒转染的SGC-7901细胞为对照，提取上述细胞的总RNA及蛋白质。从mRNA水平检测CD14的表达：将上述得到的细胞总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，通过引物F2和R2扩增CD14mRNA，通过引物F3和R3扩增内参β-actin，采用RT-PCR检测上述细胞CD14mRNA的表达，并将扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后进行灰度分析。

从蛋白水平检测CD14的表达：将上述提取的细胞蛋白质，定量后做WesternBlot，凝胶成像后进行灰度分析。

本发明所述的引物F1和R1在制备检测人CD14基因试剂盒中的应用。

本发明所述的pcDNA3.1-EGFP-CD14真核表达载体和稳定表达CD14的细胞株在制备人CD14蛋白中的应用。

附图说明

图1CD14全长扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2CD14重组载体和空载体酶切琼脂糖酶切电泳图，A：pcDNA3.1-EGFP质粒DNA，B：重组质粒的单酶切产物，C：重组质粒的双酶切产物。

图3转染细胞显微镜下观察结果，A：转染48h的倒置显微镜下观察结果；B：转染48h的荧光显微镜下观察结果；C：稳定转染细胞的倒置显微镜下观察结果；D：稳定转染细胞的荧光显微镜下观察结果。

图4稳转细胞系中CD14mRNA的表达，M：Marker；C：未转染组；N：空质粒转染组；T：重组质粒转染组。

图5稳转细胞系中CD14蛋白的表达，C：未转染组；N：空质粒转染组；T：重组质粒转染组。

实施例1一种CD14基因的特异性引物的设计

根据GenBank中CD14的mRNA序列(NM_000591)，设计包括整个CD14编码区的上、下游引物，上游引物F1的序列见序列表SEQ NO.1，F1的5’端引入HindIII酶切位点，下游引物R1的序列见SEQ NO.2，R1的5’引入BamHI酶切位点，扩增长度为1153bp。同时设计用于细胞转染后RT-PCR鉴定的CD14片段扩增引物F2其序列见序列表SEQ NO.3，R2序列见序列表SEQ NO.4，内参引物β-actin上游引物F3其序列见序列表SEQ NO.5，下游引物R3的序列见序列表SEQ NO.6。扩增长度分别为170bp和200bp。

实施例2 CD14真核表达载体的构建

1材料与方法

1.1材料

大肠杆菌DH5α、胃癌细胞系SGC-7901、pcDNA3.1-EGFP真核表达载体；总RNA提取试剂盒；TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒；2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司；pMD19-T载体购自大连宝生物工程有限公司；HindIII和BamHI内切酶购自NEB公司；脂质体Lipofectamine2000、G418和购自Invitrogen公司；RPMI1640、胎牛血清(FBs)购自GibcoBRL公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1胃癌细胞系SGC-7901总RNA的提取

收集所培养的SGC-7901细胞加入1ml RZ裂解液，室温下静置5min。加入200μl氯仿，充分混匀，室温放置3min，12000rpm离心10min，取上清。加入0.5倍体积无水乙醇，混匀并转移至吸附柱CR3中，12,000rpm离心30s。加入500μl去蛋白液RD，12000rpm离心30s。加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心30s。将吸附柱转入一个新的离心管中，干燥后加入40μl RNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，所得即为样本总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测量其A260和A280值，计算RNA浓度及纯度。

1.2.2反转录及RT-PCR

利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行反转录反应，在200μl反应管中加入总RNA1μg，oligo(dT)1μl，random1μl，dNTP(2.5mM each)2μ1，加ddH₂O至14.5μl，混匀后70℃加热5min，冰上冷却2min。瞬时离心后再加入5×First-Strand Buffer4μl，RNasin0.5μl，TIANScript M-MLV1μl(200U)，总反应体积为20μl，混匀后42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应。取1μl反转录产物加入上下游引物F1和R1各1μl，2×Taq PCR Master Mix 10μl，用ddH₂O补足20μl。PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min结束反应。将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化。

1.2.3真核表达载体的构建

用HindIII和BamHI双酶切pcDNA3.1-EGFP质粒DNA及纯化的CD14 PCR产物，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化目的片段，加入T4 DNAligase，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆进行酶切鉴定并委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

2结果

2.1总RNA的提取及RT-PCR

琼脂糖凝胶电泳结果得到18s和28s两条清晰明亮的普带，表明RNA没有发生降解。紫外分光光度计检测A260与A280的比值均在1.9-2.1之间，表明所提取RNA纯度较高基本没有DNA及蛋白质污染。利用CD14全长扩增引物F1和R1扩增出的CD14片段大小约1100bp，普带清晰明亮，电泳图见图1。

2.2重组载体pcDNA3.1-EGFP-CD14的鉴定

将两端带有HindIII和BamHI酶切位点的CD14 PCR产物进行双酶切，并插入pcDNA3.1-EGFP空载体中，CD14酶切产物与pcDNA3.1-EGFP空载酶切产物的摩尔比为5∶1，通过T4DNAligase将两片段连接，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定，结果见图2，切出约1100bp的CD14片段和6000bp左右的pcDNA3.1-EGFP载体片段，与预期结果一致。测序结果同样表明该重组质粒含有完整的CD14基因序列。

实施例3

1材料与方法

1.1材料

胃癌细胞系SGC-7901、pcDNA3.1-EGFP真核表达载体、重组载体pcDNA3.1-EGFP-CD14；总RNA提取试剂盒TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒；2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技有限公司；脂质体Lipofectamine2000、G418购自Invitrogen公司；RPMI1640、胎牛血清(FBs)等购自GibcoBRL公司。其他试剂为国产分析纯，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞转染及稳转细胞系的筛选

1)在转染前撤除培养基中的抗生素，将处于对数生长期的SGC-7901细胞接种至6孔板中培养24h，待细胞长至80％-90％融合时进行转染。

2)采用脂质体法转染，使用前轻轻混合Lipofectamine^TM2000，取8ul试剂用400ul无血清培养基稀释，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。

3)孵育5分钟后，取pcDNA3.1-EGFP空质粒和pcDNA3.1-EGFP-CD14各20ug，分别与稀释的Lipofectamine^TM2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。

4)将质粒-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含SGC-7901细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。

5)37℃，CO₂培养箱孵育4小时改换含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白瞬时表达情况。

6)用胰酶消化阳性细胞并传代，在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中加入800μg/ml的G418进行培养，2周后将G418浓度降低为400μg/ml维持筛选。用含400μg/ml G418的选择培养液培养4周后，分离阳性克隆并扩大培养。

1.2.2稳转细胞系中CD14的表达鉴定

收集稳定转染细胞，同时以未转染细胞，pcDNA3.1-EGFP空质粒转染的细胞为对照，提取总RNA及蛋白质。以β-actin为内参，采用RT-PCR检测CD14mRNA的表达，Western Blot检测CD14蛋白的表达，凝胶成像后进行灰度分析。

2结果

2.1稳定转染细胞系的检测

CD14转染SGC-7901细胞48h后，置于荧光显微镜下观察即可见发出绿色荧光的细胞(图3B)，表明所构建的重组载体中的绿色荧光蛋白得到了表达，同时表明CD14基因也得到了瞬时表达。经含G418培养基抗性筛选的SGC-7901-CD14细胞系在荧光显微镜下可观察到很强的荧光表达，在暗视野下呈现均匀的绿色(图3D)，荧光表达率为100％，证明已经得到了CD14高表达的稳转细胞系。

2.2稳转细胞系中CD14的表达

利用上述设计的检测CD14表达的引物F2和R2，采用RT-PCR的方法，检测未转染细胞、空质粒转染细胞和重组pcDNA3.1-EGFP-CD14质粒转染细胞中β-actin内参以及CD14 mRNA的表达，琼脂糖凝胶电泳表明三个样本的内参表达差异不大，且都有CD14的表达(图4)。对电泳图片进行灰度分析，表明重组质粒转染细胞株CD14的相对表达量是未转染细胞的2.61倍。Western Blot检测结果三个样本在55kDa左右处都有CD14的表达(图5)，灰度分析表明重组质粒转染细胞株CD14蛋白的相对表达量是未转染细胞的1.88倍。表明CD14基因已成功转染入SGC-7901细胞且得到了较高的表达。

Claims (8)

1.一种CD14基因的特异性引物对，其序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

2.CD14真核表达载体制备方法，其通过如下步骤制备，表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建。

3.根据权利要求2所述的CD14真核表达载体制备方法，其特征在于，所述的表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建，

具体方法如下：

1)表达CD14的细胞总RNA的提取

a)收集所培养的SGC-7901细胞加入1ml Trizol裂解液，室温下静置5min。

b)加入200μl三氯甲烷，充分混匀，室温放置3min，12000rpm离心10min，取上清。

c)加入500μl异丙醇混匀，室温静置10min，12,000rpm离心10min。

d)弃上清，加1ml75％的乙醇漂洗，7500rpm离心5min。

e)吸取75％的乙醇，于超净台晾干，直到EP管底部的RNA变透明，加入20μl RNase-free ddH₂O，所得即为细胞总RNA。

2)CD14编码区的克隆

a)利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，将上一步得到的总RNA进行反转录反应，在200μl反应管中加入总RNA1μg，oligo(dT)1μl，random1μl，dNTP(2.5mM each)2μl，加ddH₂O至14.5μl，混匀后70℃加热5min，冰上冷却2min。瞬时离心后再加入5×First-Strand Buffer 4μl，RNasin0.5μl，TIANScript M-MLV1μl(200U)，总反应体积为20μl，混匀后42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应。

b)取1μl反转录产物，加入上述权利要求1所述的引物对各1μl，2×TaqPCR Master Mix10μl，用ddH₂O补足20μl。PCR反应程序为：95℃5min；95℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min结束反应。将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化，得到CD14编码区DNA。

3)CD14真核表达载体的构建

用HindIII和BamHI双酶切pcDNA3.1-EGFP质粒DNA及纯化的CD14编码区DNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化目的片段，加入T4DNAligase，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单克隆置于培养基中振荡培养，提取质粒进行酶切鉴定，并将切下目的条带的质粒送测序公司进行测序。

4.一种稳定转染细胞株的方法，包括将权利要求2-3任意一项所述的CD14真核表达载体转染、稳转细胞系的筛选、稳转细胞系中CD14的表达鉴定。

5.根据权利要求4所述的一种稳定转染细胞株的方法，具体包括以下步骤：

1)将权利要求2-3任意一项所述的CD14真核表达载体转染

a)在转染前撤除培养基中的抗生素，将处于对数生长期的SGC-7901细胞接种至6孔板中培养24h，待细胞长至80％-90％融合时进行转染。

b)采用脂质体法转染，使用前轻轻混合Lipofectamine^TM2000，取8ul试剂用400ul无血清培养基稀释，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。

c)孵育5分钟后，取pcDNA3.1-EGFP空质粒和权利要求2-3任意一项所述的CD14真核表达载体转染各20ug，分别与稀释的Lipofectamine^TM2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟。

d)将质粒-Lipofectamine^TM2000复合物加入到包含SGC-7901细胞和培养基的孔中，通过轻轻地前后摇动培养板混合。

e)37℃，CO2培养箱孵育4小时改换含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白瞬时表达情况。

2)稳转细胞系的筛选

用胰酶消化阳性细胞并传代，在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中加入800μg/ml的G418进行培养，2周后将G418浓度降低为400μg/ml维持筛选。用含400μg/ml G418的选择培养液培养4周后，分离阳性克隆并扩大培养，得到稳定表达CD14的SGC-7901细胞株。

3)稳转细胞系中CD14的表达鉴定

a)从mRNA水平检测CD14的表达：收集稳定表达CD14的SGC-7901细胞，同时以未转染SGC-7901细胞、pcDNA3.1-EGFP空质粒转染的SGC-7901细胞为对照，提取上述细胞的总RNA将上述得到的细胞总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，通过引物F2和R2扩增CD14mRNA，通过引物F3和R3扩增内参β-actin，采用RT-PCR检测上述细胞CD14mRNA的表达。

b)从蛋白水平检测CD14的表达：收集稳定表达CD14的SGC-7901细胞，同时以未转染SGC-7901细胞、pcDNA3.1-EGFP空质粒转染的SGC-7901细胞为对照，提取上述细胞的蛋白质，定量后做Western Blot，凝胶成像后进行灰度分析。

6.一种稳定表达CD14的SGC-7901细胞株，其由权利要求4或5制备得到。

7.权利要求1的引物在制备检测人CD14基因试剂盒中的应用。

8.权利要求2-3任意一项所述的载体或权利要求6的细胞株在制备人CD14蛋白中的应用。

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