CN107937400A - 沉默ns1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，通过建立稳定表达H5N1型禽流感病毒NS1‑表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的人胚肾293细胞系，合成4条靶向NS1基因不同位点的siRNA，并转染该稳定细胞系；通过实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western‑blot检测siRNA的沉默效果，最终筛选出沉默NS1基因表达效果最好的siRNA(299)。本发明为后续研究H5N1型禽流感病毒NS1基因在感染及致病中的分子机制和进一步应用核糖核酸干扰技术通过抑制H5N1型禽流感病毒NS1基因的表达奠定了重要基础，有很好的实用价值。

Description

沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用
技术领域
本发明属于生物基因工程及生物技术药物技术领域，具体涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，本发明还涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法与应用。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种能够在禽类和人类之间相互传播的传染病，严重威胁着全球范围内的禽类养殖业，也日益威胁着人类健康。世界动物卫生组织(OIE)将AI分为3类：高致病性、低致病性和非致病性。我国将高致病性AI列为一类动物疫病，其中高致病性禽流感病毒H5N1亚型、以及2013年3月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正黏科病毒，其基因组主要由单股负链RNA组成，RNA含有8大小不同的片段，NS基因位于第8个片段，在感染初期翻译形成NS1蛋白，它是目前为止发现的唯一一个非结构蛋白，主要以二聚体的形式存在于核内，分子量为24kD，它是一种多功能调节蛋白，主要作用是通过调控干扰素和肿瘤坏死因子的释放而抑制宿主蛋白的合成。NS1蛋白的功能主要包括两个方面：首先，它是AIV的主要毒力因子，对病毒的感染、复制和变异具有重要影响，它可以与宿主细胞核蛋白相互作用，阻断细胞核mRNA的运输，从而抑制宿主蛋白的生物合成；其次，它能够拮抗干扰素和肿瘤坏死因子的分泌，有报道称NS1基因敲除病毒比亲本病毒诱导宿主产生干扰素和肿瘤坏死因子的含量更高。AIV形态呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜，依据其外膜血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。感染人类的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6～9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5N1)。
核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(doublestranded RNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)降解的转录后基因沉默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸诱导的静默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)作用下降解。核糖核酸干扰(RNAi，Ribonucleic acid interference)RNA是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于核糖核酸干扰(RNAi)来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核酸(mRNA)序列随机设计的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)的筛选是应用核糖核酸干扰(RNAi)技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，能够有效沉默禽流感病毒亚型H5N1中NS1基因表达，为开展靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的基因功能、基因治疗的相关研究提供了依据。
本发明的第二个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法。
本发明的第三个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的应用。
本发明所采用的技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，小核糖核酸分子的序列信息为：
正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；
反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。
本发明所采用的第二个技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；
步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；
步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中引物F、R进行降落PCR扩增NS1CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；
步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经XhoI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，XhoI和EcoRI双酶切鉴定，得到重组表达质粒pNS1-EGFP；
步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；
步骤3，根据NS1基因的序列，合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；
步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系；
步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。
本发明的特征还在于，
步骤1.1中NS1真核表达引物F、R具体为：
F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；
R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’；
其中引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点。
步骤1.2中降落PCR扩增NS1CDS编码区的反应体系为50μL，具体为：模板cDNA 1.5μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 26μL，灭菌蒸馏水20.5μL；
降落PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；
当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
步骤2的具体过程为：
步骤2.1，将人胚肾293细胞HEK293在含体积分数10％的胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基中，于温度37℃、体积分数5％的二氧化碳的饱和湿度下培养，在转染的前一天，计数人胚肾293细胞HEK293并铺于6孔板中，确保转染时细胞密度达到70-80％；
步骤2.2，用250μL无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2μg步骤1的重组表达质粒pNS1-EGFP和6μL转染试剂，在转染当天孵育5min后，将两者轻微混匀后于室温孵育20min，得到脱氧核糖核酸-转染试剂复合物；
步骤2.3，将步骤2.2的脱氧核糖核酸-转染试剂复合物直接加入含细胞和无双抗培养基的6孔板中，混匀；待转染24h后，换完全培养基培养24h，同时使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1:10-20的比例稀释传代，待细胞贴壁后，在含有氨基糖苷类抗生素的选择性培养基中加压筛选，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；采用极限稀释法将克隆稀释至96孔板进行单克隆筛选，再将筛选出的单克隆扩增培养，从而获得NS1-EGFP稳定细胞系。
步骤3中的四组不同的针对NS1基因的小干扰核糖核酸分子siRNAs如下所示：
步骤3中四个小干扰核糖核酸分子siRNAs的合成过程中均遵循以下原则：
1)GC含量在30％-50％之间；
2)Sense链的第15-19碱基中含有不少于3个A/U；
3)不含反向重复序列；
4)Sense链的第19碱基为A；
5)Sense链的第3碱基为A；
6)Sense链的第10碱基为U；
7)Sense链的第19碱基不是G/C；
8)Sense链的第13碱基不是G。
步骤4的转染具体步骤为：
步骤4.1，在12孔板内放入200μL完全培养基，同时将8×105个步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系铺于12孔板内；
步骤4.2，用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释2μL浓度为20μM 的小干扰核糖核酸分子siRNAs，用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释9μL高效转染试剂转染试剂，然后将两个稀释物混合，充分搅拌均匀后形成转染复合物，在室温放置5-10min；
步骤4.3，将步骤4.2的的转染复合物滴入细胞培养孔内，轻摇混合均匀，然后放入37℃的二氧化碳培养箱中培养；在培养6h后，添加700μL杜比克改良伊格氏完全培养基，完成转染。
步骤5的实时荧光定量聚合酶链式反应中，合成靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因为：
上游引物为：5′-GCCGAGATCAGAAGTCCCTAAG-3′，
下游引物为：5′-TCCGCTCCACTATATGCTTTCC-3′；
Western-blot检测中所用的抗体，一抗为鼠抗NS1多克隆抗体，鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单抗；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠免疫球蛋白G。
本发明所采用的第三个技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子作为治疗禽流感病毒H5N1疫苗及其生物制药中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的筛选方法通过先建立稳定表达H5N1型禽流感病毒NS1-增强型绿色荧光蛋白EGFP融合蛋白的人胚肾293细胞系HEK293；然后合成四条位点不同的靶向NS1的小干扰核糖核酸分子siRNAs，再应用高效转染试剂(HiPerfectTransfection Reagent)将四条小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，转染EGFP-NS1稳定细胞系；最后筛选出能高效抑制H5N1基因表达的小干扰核糖核酸分子siRNA，即第1条(299)小干扰核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制H5N1型禽流感病毒NS1基因的表达，为开展靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的基因功能、基因治疗等相关研究提供依据。
附图说明
图1是本发明重组表达质粒pEGFP-NS1的鉴定图；
图2是本发明稳定表达H5N1型禽流感病毒NS1蛋白的人胚肾293细胞系HEK293的建立图；
图3是本发明利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测siRNA抑制NS1基因的mRNA水平；
图4是本发明流式细胞术检测转染小干扰核糖核酸分子siRNAs后NS1-EGFP融合蛋白的蛋白表达水平图；
图5是本发明蛋白质印迹western blot检测转染小干扰核糖核酸分子siRNAs后NS1-EGFP融合蛋白表达量的变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明通过先建立稳定表达H5N1型禽流感病毒NS1-增强型绿色荧光蛋白EGFP融合蛋白的人胚肾293细胞系HEK293；然后根据NS1基因的序列，设计合成四条不同的靶向NS1的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)、应用高效转染试剂将四条小干扰核糖核酸分子(siRNAs)转染该稳定细胞系；其次利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术检测和蛋白质印迹Western-blot鉴定其干扰效果，筛选出能高效抑制NS1基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNA)。最后综合这些数据，发现第1条(299)小干扰核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制NS1基因的表达。
步骤1、重组表达质粒pNS1-EGFP的构建
根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列(GenBank登录号:FJ455824)，同时参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物如下：
F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；
R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’。
将pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点，具体如下划线所示，设计的引物送北京六合华大基因(广州)科技股份有限公司合成。
以cDNA为模板，以F、R为引物进行降落PCR扩增NS1 CDS编码区，反应体系为50μL：模板cDNA 1.5μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 26μL，灭菌蒸馏水20.5μL。
降落PCR测序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
将扩增出的目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳，并利用DNA纯化试剂盒进行胶回收。
将DNA纯化后的扩增产物与pEGFP-N1质粒同时经Xho I和EcoR I双酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳，利用DNA纯化试剂盒回收线性化载体与扩增产物，在T4 DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌提取质粒，Xho I和EcoR I双酶切鉴定，并送生工生物工程上海有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为：pNS1-EGFP。具体酶切鉴定结果如图1所示：M1为λDNA/HindⅢDNA Marker；1为重组质粒pNS1-EGFP；2为重组质粒pNS1-EGFP经Xho I和EcoR I双酶切产物；M2为D2000 DNA Marker，经分析表明，pNS1-EGFP构建正确。
步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；
将人胚肾293细胞HEK293在含体积分数10％的胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中，于温度37℃、体积分数5％的二氧化碳的饱和湿度下培养，按照转染试剂(LipofectamineTM 2000,Invitrogen,USA)操作说明书将重组质粒pNS1-EGFP转染入人胚肾293细胞(HEK293)内，简述如下：
在转染的前一天，计数人胚肾293细胞HEK293并铺于6孔板中，确保转染时细胞密度达到70-80％；用250μL无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2μg步骤1的重组表达质粒pNS1-EGFP和6μL转染试剂，在转染当天孵育5min后，将两者轻微混匀后于室温孵育20min，得到脱氧核糖核酸-转染试剂复合物；将脱氧核糖核酸-转染试剂复合物直接加入含细胞和无双抗培养基的6孔板中，，十字形轻摇以混匀；转染24h后，换完全培养基培养24h，同时使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1:10-20的比例稀释传代，待细胞贴壁后，在含有氨基糖苷类抗生素(G418，500μg/mL)的选择性培养基中加压筛选，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；采用极限稀释法将克隆稀释至96孔板进行单克隆筛选，再将筛选出的单克隆扩增培养，从而获得稳定表达NS1-EGFP融合蛋白的人胚肾293细胞(HEK293)，对稳定细胞系进行荧光显微镜检测和Western Blot鉴定，结果如图2所示，图2A为稳定表达空载EGFP-N1的稳定细胞系和稳定表达NS1-EGFP的稳定细胞系，图2B为稳定细胞系的Western-blot鉴定结果；分析表明：稳定表达NS1-EGFP融合蛋白的人胚肾293细胞(HEK293)正确表达H5N1型禽流感病毒NS1-增强型绿色荧光蛋白EGFP融合蛋白，而对照则否，说明稳定细胞系构建正确。
步骤3，根据NS1基因的序列，遵循小干扰核糖核酸分子(siRNAs)设计的基本原则：
1)GC含量在30％-50％之间；
2)Sense链的第15-19碱基中含有不少于3个A/U；
3)不含反向重复序列；
4)Sense链的第19碱基为A；
5)Sense链的第3碱基为A；
6)Sense链的第10碱基为U；
7)Sense链的第19碱基不是G/C；
8)Sense链的第13碱基不是G；
合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs，详见表1：
表1小干扰核糖核酸分子(siRNAs)序列
步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系，具体为：
在12孔板内放入200μL完全培养基，同时将8×105个步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系铺于12孔板内；用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释2μL浓度为20μM的小干扰核糖核酸分子siRNAs，用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释9μL高效转染试剂转染试剂，然后将两个稀释物混合，充分搅拌均匀后形成转染复合物，在室温放置5-10min；将步骤4.2的的转染复合物滴入细胞培养孔内，十字形轻摇以混合均匀，然后放入37℃的二氧化碳培养箱中培养；在培养6h后，添加700μL杜比克改良伊格氏完全培养基，完成转染。
步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。具体为：
(1)实时荧光定量聚合酶链式反应
转染48h后，吸出培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞层1-2次，用0.125％的胰酶进行常规消化，收集细胞，根据核糖核酸提取试剂盒说明书分离出高品质的总核糖核酸；并测定纯化的核糖核酸(RNA)浓度，采用溴化乙锭染色电泳鉴定其完整性；使用第一链试剂盒合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(Green qPCR SuperMix-UDG Kit)，利用比较CT法来检测膜NS1基因的mRNA表达水平，所用引物为，设计并合成靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因：
上游引物为：5′-GCCGAGATCAGAAGTCCCTAAG-3′，
下游引物为：5′-TCCGCTCCACTATATGCTTTCC-3′；
设计并合成靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：
上游引物为：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，
下游引物为：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′，
结果见图3，图3中的横坐标是稳定表达NS1-EGFP的稳定细胞系分别转染scramble-siRNA、阴性对照pEGFP-siRNA、siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4，纵坐标是荧光强度的相对值，scramble-siRNA是相对NS1无关的非特异小干扰核糖核酸分子。结果表明：实时荧光定第一条siRNA1(299)小干扰核糖核酸分子(siRNA)能靶向抑制NS1mRNA水平，抑制效率为80％。
(2)流式细胞术
转染48h后，流式细胞术检测NS1-EGFP融合蛋白的蛋白表达水平。流式细胞仪采用激发波长408nm，发射波长507nm，检测表达EGFP的细胞数量和平均荧光强度。结果见图4所示，流式细胞术检测表明，转染siRNA1(299)小干扰核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的阳性率和平均荧光强度抑制最为明显。
(3)Western-blot
转染48h后，吸出培养液，磷酸盐缓冲液洗涤细胞层1-2次，0.125％的胰酶常规消化，收集细胞。利用IP裂解液进行裂解，提取总蛋白，利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12％的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行蛋白质印迹(western blot)，主要的抗体，一抗为鼠抗NS1多克隆抗体(mouse polyclonal anti-NS1，1:1000倍稀释)，鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗(GAPDHrabbit mAB，1:5000倍稀释)；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(HRP labeled goat anti-rabbit IgG，1:5000倍稀释)。结果见图5所示，1-8分别依次代表空白HEK293细胞系、NS1-EGFP稳定细胞系、EGFP空载的稳定细胞系、NS1-EGFP稳定细胞系转染阴性对照pEGFP-siRNA、NS1-EGFP稳定细胞系转染siRNA1、NS1-EGFP稳定细胞系转染siRNA2、NS1-EGFP稳定细胞系转染siRNA3、NS1-EGFP稳定细胞系转染siRNA4后NS1蛋白表达水平，结果表明，转染siRNA1(299)小干扰核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的NS1-EGFP融合蛋白的表达水平受到抑制最为明显。
综上所述，从中筛选出能特异且高效抑制H5N1型禽流感病毒NS1蛋白表达的siRNA1(299)小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，序列信息为：
正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5’-3’)；
反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5’-3’))，
以上信息为后续研究H5N1型禽流感病毒NS1基因在感染及致病中的分子机制和进一步应用核糖核酸干扰(RNAi)技术通过抑制H5N1型禽流感病毒NS1基因的表达奠定了重要基础。

Claims (10)

1.沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，其特征在于，所述小核糖核酸分子的序列信息为：
正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；
反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。
2.如权利要求1所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；
步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；
步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中引物F、R进行降落PCR扩增NS1CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；
步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经XhoI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，XhoI和EcoRI双酶切鉴定，得到重组表达质粒pNS1-EGFP；
步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；
步骤3，根据NS1基因的序列，合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；
步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系；
步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。
3.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.1中NS1真核表达引物F、R具体为：
F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；
R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’；
其中引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点。
4.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.2中降落PCR扩增NS1CDS编码区的反应体系为50μL，具体为：模板cDNA 1.5μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 26μL，灭菌蒸馏水20.5μL；
所述降落PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；
当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
5.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤2的具体过程为：
步骤2.1，将人胚肾293细胞HEK293在含体积分数10％的胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基中，于温度37℃、体积分数5％的二氧化碳的饱和湿度下培养，在转染的前一天，计数人胚肾293细胞HEK293并铺于6孔板中，确保转染时细胞密度达到70-80％；
步骤2.2，用250μL无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2μg步骤1的重组表达质粒pNS1-EGFP和6μL转染试剂，在转染当天孵育5min后，将两者轻微混匀后于室温孵育20min，得到脱氧核糖核酸-转染试剂复合物；
步骤2.3，将步骤2.2的脱氧核糖核酸-转染试剂复合物直接加入含细胞和无双抗培养基的6孔板中，混匀；待转染24h后，换完全培养基培养24h，同时使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1:10-20的比例稀释传代，待细胞贴壁后，在含有氨基糖苷类抗生素的选择性培养基中加压筛选，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；采用极限稀释法将克隆稀释至96孔板进行单克隆筛选，再将筛选出的单克隆扩增培养，从而获得NS1-EGFP稳定细胞系。
6.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤3中的四组不同的针对NS1基因的小干扰核糖核酸分子siRNAs如下所示：
7.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤3中四个小干扰核糖核酸分子siRNAs的合成过程中均遵循以下原则：
1)GC含量在30％-50％之间；
2)Sense链的第15-19碱基中含有不少于3个A/U；
3)不含反向重复序列；
4)Sense链的第19碱基为A；
5)Sense链的第3碱基为A；
6)Sense链的第10碱基为U；
7)Sense链的第19碱基不是G/C；
8)Sense链的第13碱基不是G。
8.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤4的转染具体步骤为：
步骤4.1，在12孔板内放入200μL完全培养基，同时将8×105个步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系铺于12孔板内；
步骤4.2，用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释2μL浓度为20μM的小干扰核糖核酸分子siRNAs，用100μL无血清的Opti-MEM I培养基稀释9μL高效转染试剂转染试剂，然后将两个稀释物混合，充分搅拌均匀后形成转染复合物，在室温放置5-10min；
步骤4.3，将步骤4.2的的转染复合物滴入细胞培养孔内，轻摇混合均匀，然后放入37℃的二氧化碳培养箱中培养；在培养6h后，添加700μL杜比克改良伊格氏完全培养基，完成转染。
9.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤5的实时荧光定量聚合酶链式反应中，合成靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因为：
上游引物为：5′-GCCGAGATCAGAAGTCCCTAAG-3′，
下游引物为：5′-TCCGCTCCACTATATGCTTTCC-3′；
所述Western-blot检测中所用的抗体，一抗为鼠抗NS1多克隆抗体，鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单抗；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠免疫球蛋白G。
10.如权利要求1所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子作为治疗禽流感病毒H5N1疫苗及其生物制药中的应用。
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