DE1276582B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutamin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

C07c

6b-16/02

12 q-6/01

P 12 76 582.1-41 (K 58590)

28. Februar 1966

5. September 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutamin durch Züchtung von Micrococcus glutamicus ATCC 14 751 oder 14 752 in einem Nährmedium, das bestimmte Metallionen enthält.

Es ist aus der britischen Patentschrift 981 132 bekannt, daß L-Glutamin durch Gärung gebildet wird und daß große Mengen desselben in der Kulturflüssigkeit angesammelt werden, wenn die Gärung mit Mikroorganismen, die fähig sind, Glutaminsäure zu erzeugen, wie Micrococcus glutamicus ATCC 14 751 oder ATCC 14752, in einem Nährmedium ausgeführt wird, welches Kohlenhydrate als Grundnährstoff enthält, wozu Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze und dergleichen, in Mengen zugegeben werden, die diejenigen übersteigen, wie sie für das Wachstum der Zellkörper und für die Herstellung von L-Glutaminsäure erforderlich sind. Demzufolge wird bei diesem Verfahren die L-Glutaminsäuregärung in eine L-Glutamingärung durch Zugabe von mehr als 10 Gewichtsteilen Stickstoff je 100 Gewichtsteile Kohlenstoff zum Nährmedium umgewandelt.

Bei dem vorstehend beschriebenen bisherigen Fermentationsverfahren ist es erforderlich, daß eine hohe Stickstoffmenge (Konzentration des Ammoniumsalzes) in der Kulturflüssigkeit aufrechterhalten wird. Dadurch wird jedoch das Wachstum der Mikroorganismen beträchtlich gehemmt. Darüber hinaus ist, wie sich aus dem folgenden L-Glutamin-Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
L-Glutamin

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke

und Dipl.-Ing. H. Agular, Patentanwälte,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Yuichi Noguchi,

Junichi Nakajima,

Tetsuo Uni,

Toru Nakanishi, Hofu-shi (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 1. März 1965 (11 369)

säure-Reaktionsschema ergibt, ein molares Äquivalent von Adenosintriphosphat (ATP) notwendig, um L-Glutamin aus L-Glutaminsäure zu bilden. Infolgedessen wird bei diesem Fermentiersystem mehr Energie benötigt.

Glutamat + ATP*) ^=^ Glutamylphosphat + ADP**)

Glutamylphosphat + NH3 - " Glutamin + Phosphat

Glutamat + ATP + NHs ^=⁵= Glutamin + ADP + Phosphat

*) Adenosintriphosphat.
**) Adenosindiphosphat.

Daraus läßt sich ersehen, daß die Untersuchungen der Wachstums- und Erzeugungsfaktoren bei einer L-Gl utaminfermentation weit komplizierter als bei einer L-Glutaminsäurefermentation sind. Die Lösung dieses Problems ist wichtig, um eine gesteigerte Ausbeute an L-Glutamin bei der fermentativen Erzeugung zu erhalten.

Nach der genannten britischen Patentschrift 981132 sind im Nährmedium lediglich Kohlenhydrate, wie Glucose und dergleichen. Stickstoffquellen, wie anorganische und organische Ammoniumsalze, Ammoniak. Harnstoff und dergleichen, Nährstoffe, wie Biotin. Thiamin und dergleichen in Spurenmengen, und anorganische Verbindungen, wie Phosphorsäuresalze, Magnesiumsalze und Mangansalze, vorhanden. Es werden keine weiteren Angaben gemacht, die sich auf Faktoren beziehen, durch die die Bildung von L-Glutamin durch Fermentation beschleunigt wird, mit Ausnahme der vorstehend aufgeführten, die sich auf eine Erhöhung der Stickstoffmenge im Kulturmedium bezieht.

Es ist weiter bekannt, daß die Bildung von L-Glutamin in der Fermentationsflüssigkeit signifikant gesteigert werden kann, wenn die Züchtung in Gegenwart von Zink- oder Molybdänsalzen oder beiden Stoffen zusammen mit üblichen Metallsalzen, wie Magnesium, Eisen, Mangan und dergleichen, im Nährmedium durchgeführt wird. Es wurde auch

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festgestellt, daß die Zugabe von Zink besonders der Menge an gebildetem L-Glutamin bei unterwirksam ist. schiedlichen Konzentrationen von Ammoniumchlorid Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun in dem Nährmedium zeigt. Der bei diesem Versuch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von angewandte Stamm war Micrococcus glutamicus L-Glutamin durch Züchten von Micrococcus glut- 5 ATCC 14 752. Die Zusammensetzung des Grundamicus ATCC 14 751 oder ATCC 14 752 in einem mediums war folgende: wäßrigen Nährmedium, das mindestens 10 Ge- γί η ι?ηο/

wichtsteile Stickstoff auf 100 Gewichtsteile Kohlen- κΗοΡΟ 0 05«/

stoff enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegen- K)HPf)⁴ o'o5°/

wart von Metallsalzen, das dadurch gekennzeichnet io Jen ^4>üi'n n'nso/

ist, daß das Nährmedium pro Liter 10-« bis 10 * Mol ™gfcUi · /M₂U u,U3/o

Bleiionen, 10-6 _{bis 10}-4 _Mol Chromionen, 10 -β bis ρ en lun η nmo,

10-⁴ Mol Nickelionen, 10-⁶ bis 10 ³ Mol Aluminium- ^_n ¹' ' „² _n η nmo °

ionen, 10~⁷ bis 10~⁵ MoI Kobaltionen oder IO"⁶ Sutnff η so/

bis 10 5 Mol Quecksilberionen oder Mischungen 15 r CO 2 0°/

dieser Metallionen in den genannten Konzentrations- _ß. . ³ ς'_η !,

bereichen enthält. ^S_nC_n ι „,Si

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des NHCl*)

Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die ^l „

Bleiionen in Form von Bleiacetat, die Chromionen 20 *» ⁴·^{α 5Λ 6}·°> ^{wie aus Tabelle l} <-™<*"^Ichin Form von Kaliumchromat, die Nickelionen in Die oben angegebenen Mengen sind in 1 1 Wasser Form von Nickelchlorid, die Aluminiumionen in enthalten. Die Züchtung wurde in Kolben unter Form von Aluminiumsulfat, die Kobaltionen in aerobem Schütteln ausgeführt. Die in Tabelle I auf-Form von Kobaltchlorid und die Quecksilberionen geführten, zu dem Nährmedium zugegebenen Metallin Form von Quecksilberacetat verwendet. 25 ionen wurden in Form der folgenden Salze zu-

Das angewandte Grundnährmedium ist das üb- gegeben:

licherweise hierfür angewandte und enthält Kohlen- _D, _D, ,_{ru nrir}>_s ττ r\

hydrate, Stickstoffquellen, anorganische Salze und ™; ^(CH₃IUu)₂-H₂U

Spuren-Nährstoffe, wie Biotin und dergleichen. *.\ ^y₍^ Λ-ττ ρ.

Um die Auswirkung der vorliegenden Erfindung 30 .}' V-¹AWOn \ ία η η

zu zeigen, wurde ein Versuch durchgeführt, der in ™^:, ^'rf 6H>O

der nachfolgenden Tabelle I die Beziehung zwischen „ ' h ~' ^V

der Konzentration der angewandten Metallionen und ^Hg:

Tabelle I
Menge an gebildetem L-Glutamin (mg/ml)

Ammonium	Metallion	0	1(T7	Metallionenkonzentration (Mol/l)	1(T5	10-*	1(T3
chlorid		29,6		io-6
	Grundmedium		29,4		34,7	29,1	23,2
	Pb		29,2	32,9	35,2	36,2	26,2
	Cr		30,8	33,5	35,7	38,7	9,6
4%	Ni		30,4	34,7	34,0	33,6	32,8
	Al		34,6	33,9	32,9	7,6	—
	Co		29,6	33,6	34,2	20,7	—
	Hg	31,0		33,2
	Grundmedium		31,9		35,2	28,1	20,2
	Pb		32,5	33,5	36,2	39,6	30,1
	Cr		33,6	34,2	37,0	40,2	4,3
5"/,) <	Ni		33,2	35,2	35,8	35,6	34,4
	Al		36,2	34,1	31,6	3,8	—
	Co		31,8	32,3	33,8	15,8	—
	Hg	27,2		34,3
	Grundmedium		27,3		28,2	27,1	16,2
	Pb		27,5	29,5	36,2	37,4	27,6
	Cr		27,4	33,8	37,8	39,8	3,2
6%	Ni		26,9	34,2	34,8	35,2	35,6
	Al		31,8	33,2	30,6	2,1	—
	Co		27.1	30,4	30,1	15,2	—
	Hg		30,2

Aus Tabelle I ergibt sich, daß bei Verwendung von Micrococcus glutamicus ATCC 14 752 die Menge an gebildetem L-Glutamin um mehr als 10¹Vo, verglichen mit derjenigen des Grundmediums, gesteigert wird, wenn die vorstehend aufgeführten Metallionen in den erfindungsgemäßen Konzentrationen zu dem die wesentlichen Nährstoffe für die fermentative Erzeugung von L-Glutamin enthaltenden

Nährmedium zugegeben werden. Die Wirkung ist bei Zugabe von Nickel und Chrom zu dem Nährmedium besonders signifikant. Mit diesen beiden Metallen wurde ein Anstieg um mehr als 20% der erhaltenen Menge an L-Glutamin, verglichen mit dem Grundmedium allein, erhalten. Der Unterschied wird noch signifikanter, wenn die Konzentration an Ammoniumchlorid erhöht wird. Aus dieser Tatsache läßt sich schließen, daß durch die Anwesenheit dieser Metalle die Mikroorganismen eine Salzbeständigkeit erhalten.

Bei Mischungen dieser Metalle läßt sich ein synergistischer Effekt feststellen. Beispielsweise ist die Beziehung zwischen den gebildeten L-Glutaminmengen und der Menge des gleichzeitig zu dem Kulturmedium zugegebenen Chroms und Nickels in Tabelle II gezeigt. Ein signifikanter Synergismus läßt sich feststellen, wenn beide Metalle in ziemlich großen Mengen zugegeben werden.

	0	0	Chromionen*) (Mol/l)	5- 1(T8	ΙΟ"*
Tabelle II	K) ■"'	30,5	ίο-5	35,0	37,0
	5-10 3	35,4	34,2	39,9	40,2
	10 4	37,7	36,7	42,3	43,5
Menge an gebildetem L-Glutamin (mg/ml)		38,5	38,8	43,4	45,6
Nickelionen*)	39,9
(Mol/1)

*) Jedes Metallion wurde in Form des bei Tabelle I genannten Metallsalzes eingesetzt.

Das gemäß der Erfindung angewandte Nährmedium kann entweder ein synthetisches Nährmedium oder ein natürliches Nährmedium sein. Die hierzu üblicherweise angewandten Nährmedien können eingesetzt werden, solange sie die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum der erfindungsgemäß angewandten Mikroorganismen enthalten. Diese Nährstoffe sind bekannt, und hierzu gehören Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen, Spuren-Nährstoffe und dergleichen, die von den erfindungsgemäß angewandten Stämmen in entsprechenden Mengen verwertet werden.

So können als Kohlenstoffquelle beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Galactose, Rohrzucker, Mannose, Lactose, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen und dergleichen, verwendet werden. Mischungen von zwei oder mehr dieser Stoffe können ebenfalls angewandt werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat und dergleichen, Nitrate, Harnstoff oder andere Verbindungen, die Stickstoff enthalten, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl und dergleichen, angewandt werden. Selbstverständlich können auch Gemische derartiger Substanzen verwendet werden. Zu den dem Nährmedium zusetzbaren anorganischen Salzen gehören diejenigen der Phosphorsäure sowie Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Mangan- und Zinksalze. Auch diese Substanzen können in Gemischen von zwei oder mehreren angewandt werden. Schließlich ist es notwendig, dem Kulturmedium wesentliche Nährstoffe für das Wachstum des angewandten Mikroorganismus, wie Spurenmengen von Biotin, Thiamin und dergleichen, zuzugeben.

Die Nährmedien können durch Erhitzen mit Dampf entweder in ihrer Gesamtmenge oder in Teilmengen sterilisiert werden.

,ο Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. mittels Schütteln der Kultur, Rühren der Kultur unter Einleitung von Luft und dergleichen, durchgeführt. Die Züchtung wird bei einer Temperatur zwischen 24 und 37^CC ausgeführt. Die bevorzugte Züchtungstemperatur liegt zwischen 28 und 33° C. Am günstigsten ist es, den pH-Wert des Kulturmediums zwischen 6 und 9 während der Züchtung einzustellen. Die Züchtung wird während 2 bis 3 Tagen ausgeführt. Die Gewinnung des L-Glutamins kann durch Filtrieren der Kulturflüssigkeit und Adsorption des L-Glutamins an einem Ionenaustauschharz ausgeführt werden. Das L-Glutamin wird dann vom Ionenaustauschharz eluiert und das Eluat konzentriert, während es bei einem praktisch neutralen pH-Wert gehalten wird. Dann wird Alkohol hinzugegeben. Schließlich wird das L-Glutamin durch Abkühlen der alkoholischen Lösung zur Kristallisation gebracht und kann entweder durch Abfiltrieren oder durch Zentrifugieren gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Falls nichts anderes angegeben ist, sind die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Ein Nährmedium wurde hergestellt durch Zugabe von 0,001°/,) K₂CrO₄ und 0,001% NiCl₂-OH₂O zu einem Grundmedium, das aus 15% Glucose, 4% NH₁Cl, 0,50% Harnstoff, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7H>O, 0,002% FeSO₄ · 7H₂O, 0,002% MnSO₄ · 4H₂O, 0,001% ZnSO₄ · 7H₂O, 5 y/1 Biotin, 1 mg/1 Thiamin und 2,0% CaCOa bestand. 2 1 dieses Nährmediums wurden mit Dampf von 120⁰C während 20 Minuten sterilisiert. Die Menge wurde in ein 5-1-Fermentiergefäß eingebracht, in das 300 ml einer Impfkultur aus Micrococcus glutamicus ATCC 14 752 zugegeben wurden, die während 16 Stunden unter Schütteln in einem Impfmediiim gezüchtet worden war, welches aus 5% Glucose, 0,5% (NH₄^SO₄, 0,05% KH₂PO₄, 0,15% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7H₂O, 20 y/1 Biotin, 1 mg/1 Thiamin, 0,5% Fleischextrakt, 0,5%) Maisquellflüssigkeit und 0,5% Harnstoff bestand. Die Züchtung wurde bei 30⁰C unter Belüftung in einer Menge von 5 1 Luft je Minute und unter Rühren mit 600 Umdrehungen je Minute ausgeführt.

Der pH-Wert wurde während der ersten 24 Stunden nach Beginn der Züchtung mit 15%igem Ammoniakwasser auf 6,8 und anschließend auf 6,2 eingestellt. Die Menge des nach 72stündiger Züchtung angesammelten L-Glutamins betrug 44,3 mg/ml. Die Kulturflüssigkeit wurde filtriert und dann bei neutralem pH-Wert unter Vakuum eingeengt, worauf die gebildete L-Glutaminsäure durch Einstellung des pH-Wertes auf 3,5 mit Salzsäure ausgefällt wurde. Anschließend wurden die Kristalle von L-Glutaminsäure aus der Kulturflüssigkeit entfernt. Das L-Glut-

amin im Filtrat wurde auf einem Ionenaustauschharz adsorbiert und dann hiervon eluiert. Das Eluat wurde eingeengt, Äthylalkohol zugegeben und das alkoholische Gemisch abgekühlt, wobei 78 g rohe Kristalle von L-Glutamin erhalten wurden.

Beispiel 2

Ein Nährmedium wurde durch Zugabe von 0,002% K₂CrO₄, 0,002% NiCl₂ · 6H₂O und 0,001% K₂Ak(SOA · 24H₂O zu einem Grundmedium, das aus 14% Glucose, 4% (NH₄J₂SO₄, 0,50% Harnstoff, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 0,002% MnSO₄ -4H₂O, 0,002% FeSO₄-7H₂O, 0,001% ZnSO₄ · 7H₂O, 5 y/1 Biotin, 1 mg/1 Thiamin und 3% CaCO₃ bestand, hergestellt. 151 ,₅ dieses Nährmediums wurden mit Dampf von 120 "C während 20 Minuten sterilisiert, in einen kleinen ' Fermentierbehälter von 30 1 Inhalt gegeben und mit 1,5 1 einer Impfkultur von Micococcus glutamicus ATCC 14 751 beimpft, welche, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet worden war. Die Züchtung wurde dann bei 30~ C unter Belüften mit einer Menge von 10 1 Luft je Minute und unter Rühren mit 400 Umdrehungen je Minute ausgeführt. Der pH-Wert des Mediums wurde konstant auf 6,8 mit 15%iger wäßriger Ammoniaklösung während der Züchtung eingestellt.

Nach 72stündiger Züchtung waren 43,4 mg/ml L-Glutamin gebildet. Entsprechend Beispiel 1 wurden 360 g rohe Kristalle von L-Glutamin aus der Kulturflüssigkeit erhalten.

Beispiel 3

Ein Nährmedium wurde hergestellt durch Zugabe von 0,002% NiCl₂ ■ 6H₂O zu dem Grundmedium nach Beispiel 1. Nach 72stündiger Züchtung waren unter den gleichen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 1 39,1 mg/ml L-Glutamin in der Kulturflüssigkeit vorhanden. Aus dieser Kulturflüssigkeit wurden 70 g rohe Kristalle von L-Glutamin erhalten.

Beispiel 4

Es wurde die gleiche Züchtung wie im Beispiel 2 ausgeführt mit der Ausnahme, daß 0,001% Pb(CH₃COO)₂ · H₂O zu dem Grundmedium des Beispiels 2 zur Bildung des Nährmediums zugegeben wurden. Nach 72stündiger Züchtung waren 38,3 mg/ml L-Glutamin in der Kulturflüssigkeit vorhanden. Aus dieser Flüssigkeit wurden 325 g rohe Kristalle von L-Glutamin erhalten.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutamin durch Züchten von Micrococcus glutamicus ATCC 14 751 oder ATCC 14 752 in einem wäßrigen Nährmedium, das mindestens 10 Gewichtsteile Stickstoff auf 100 Gewichtsteile Kohlenstoff enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Metallsalzen, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium pro Liter 10 ⁶ bis 10 5 Mol Bleiionen, 10 « bis 10 ⁴ Mol Chromionen, 10 ⁶ bei 10 ⁴ Mol Nickelionen, 10 ⁶ bis 10 ³ Mol Aluminiumionen, 10 ⁷ bis 10 ⁵ Mol Kobaltionen oder 10 ^ß bis 10 ⁵ Mol Quecksilberionen oder Mischungen dieser Metallionen in den genannten Konzentrationsbereichen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bleiionen in Form von Bleiacetat, die Chromionen in Form von Kaliumchromat, die Nickelionen in Form von Nickelchlorid, die Aluminiumionen in Form von Aluminiumsulfat, die Kobaltionen in Form von Kobaltchlorid und die Quecksilberionen in Form von Quecksilberacetat verwendet werden.