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Verfahren zur Herstellung von Butylalkohol und Aceton durch Gärung
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Butylalkohol und Aceton durch Vergärung
von Kohlehydraten mittels Bakterien der Species Bacillus Amylobacber A. M. @et Bredemann
(Zentralblatt f. Bakteriologie zgog, 1I. Abt., 23, 385).
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Als Ausgangsstoffe für .dieses biologische Verfahren können sowohl
stärkehaltige als auch zuckerhaltige natürliche Rohstoffe dienen, da .die Erreger
der bakteriellen acetonbutylalkoholi.schen Gärung Stärke zu Mono-' sacchariden enzymatisch
leicht abzubauen vermögen. Butylalkohol und Aceton werden von allen bisher verwendeten
Gärungserregern im festen Verhältnis von a : r gebildet. Die Ausbeute an Lösungsmitteln
schwankt zwischen sr und a5°/, auf trockenen Mais berechnet. Daneben entstehen als
gasförmige Gärungsprodukte Kohlensäure und Wasserstoff.
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Die Entwicklung .dieser Art von Gärung bis zum gegenwärtigen Stand
der Technik ist insbesondere durch die Erkenntnis gefördert worden, daß man zur
regelmäßigen Erzielung kräftiger Gärungen von Kulturen ausgehen niuß, die keine
vegetativen Formen, sondern ausschließlich Sporen enthalten. Man verwendet demgemäß
zur Aussaat Kulturen, die kurze Zeit auf etwa g5° erhitzt worden sind. Weiter hat
sich ergeben, daß die bei der Gärung entstehenden Säuren nicht mit Kreide abgestumpft
werden dürfen. Vielmehr ist für den regelrechten Verlauf der Gärung Erfordernis,
daß die Acidität anfangs stetig ansteigt, bis sie ein Maximum erreicht, um sodann
bis zum Schluß der Gärung wieder stetig abzusinken. Die Gärungskurve hat sich zu
einem wichtigen Mittel der Betriebsüber= wachung herausgebildet: Wenn die Acidität
sehr langsam oder etwa auch gar nicht zurückgeht, so ist dies ein sicheres Zeichen
dafür, daß die Maischen infiziert sind oder der Gärungserreger selbst geschwächt
ist. Der Kohlehydratgehalt der Maischen muß wesentlich unter Aden Konzentrationen
liegen, die bei .der alkoholischen Gärung zulässig sind; die oberste Grenze wird
mit 80/, Stärke angegeben. Die Erreger der acetonbutylalkoholischen Gärung
sind also gegen ihre eigenen Stoffwechselprodukte empfindlicher als die Hefe. Trotz
geringerer Konzentration ist aber die Viscosität der Maischen, welche durch Dämpfen
der Ausgangsprodukte unter Druck hergestellt werden, insbesondere bei der Verarbeitung
von Maismehl, beträchtlich, weshalb vorgeschlagen worden ist, diese Druckkochung
unter Zusatz jener beschränkten Mengen von Salzsäure auszuführen,
welche
gerade ausreichen, um die im Mehle enthaltenen Diphosphate in Monophosphate überzuführen.
Schließlich wurde schon empfohlen, den eingemaischten kohleliydrathaltigen Rohstoffen
erforderlichenfalls aufgeschlossene oder teilweise abgebaute Hefe als-Nährstoff
zuzusetzen.
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Neben diesen für die technische Entwick= lung des Verfahrens mehr
oder minder wichtigen Vorschlägen finden sich, insbesondere in vielen Patentschriften,
Angaben über verschiedene Organismen, welchen für diesen Prozeß spezifische Eignungen
zugeschrieben werden. Nach der österreichischen Patentschrift 95.U9 sollen im allgemeinen
hitzebeständige, u. a. im Boden und auf Feldfrüchten vorkommende Bakterien verwendet
werden, die Gelatine verflüssigen und ohne Mitverwendung von Hefe o. dgl. den größeren
Teil von Mais- oder anderer Zerealienstärke unter aeroben oder anaeroben Bedingungen
unmittelbar in eine -Mischung von Butylalkohol und Aceton verwandeln. Andere haben
besondere Arten von 1Iikroorganismen für diesen Zweck beschrieben. Es ist nun gelungen,
die Eigenschaften des Bacillus Amylobacter A. M. et Bredemann durch ein besonderes
Züchtungsverfahren derart zu beeinflussen, daß er für die acetonbutvlalkoholische
Gärung in störungslosem Großbetrieb geeignet wird, ohne daß man an die Auswahl von
vornherein morphologisch unterschiedener Stämme gebunden wäre.
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Die Erfindung geht von der Tatsache aus, daß alle Erreger der acetonbutylalkoholischen
Gärung säureempfindlich sind, indem sie in sauren Nährmedien degenerieren, asporogen
«-erden und schließlich zugrunde gehen, und besteht im Wesen darin, daß Stämme des
Bacillus Amylobacter A. M. et Bredemann als Gärungserreger verwendet werden, die
durch Züchtung an steigende Wasserstoffionenkonzentrationen gewöhnt worden sind.
Ein hierzu besonders geeignetes Züchtungsverfahren besteht im Wesen darin, daß man
den Bacillus Amylobacter A. M. et Bredemann auf Nährböden mit steigender Anfangsacidität
ohne Abstumpfung der sich bei ,der Gärung bildenden Säure so lange fortzüchtet,
bis er in erwünschtem Maß säurefest geworden ist, dabei aber zwischen je zwei aufeinanderfolgenden
Züchtungen auf einem solchen Nährboden, die im folgenden als Gewöhnungsgärungen
bezeichnet werden, eine Gärung in einem neutralen oder alkalischen Medium unter
Abstumpfung der sich bei der Gärung bildenden Säuren, im folgenden Sporulierungsgärungen
genannt, einschaltet und die Kulturen vor dein Überimpfen auf die nächste Gewöhnungsgärung
mit höherer Anfangsacidität jedesmal in der üblichen Weise kurze Zeit erhitzt, um
alle vegetativen Formen abzutöten, so daß nur Sporen in den Gewöhnungsgärungen weitergezüchtet
werden.
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` -Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der ' Erfindung wird durch
Pufferung des Nährmediums der Gewöhnungsgärungen verhindert, daß die Wasserstoffionenkonzentration
trotz Zunahme der Säure während der Gärung gewisse Grenzen überschreitet, wobei
der Pufferungsgrad #T der Nährmedien in den aufeinanderfolgenden Gewöhnungsgärungen
entsprechend der steigenden Anfangsacidität gesteigert wird. Zur P,ufferung sind
insbesondere die bekannten Systeme: Gemische von schwachen Säuren mit ihren Alkalisalzen
(vgl. M i ch ae 1 i s , Die Wasserstoffionenkonzentration, 1922 S. 37 u. ff. und
S.89 u. ff.) geeignet.
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Der Pufferungsgrad,z wird mathematisch durch die Gleichung 7c
=
ausgedrückt. Den unten angeführten -r-Werten liegt die folgende bekannte Bestimmungsmethode
zugrunde: Es werden je drei Proben des Gärme-diums von je i crn' gleichzeitig entnommen.
In einer dieser Proben wird das PH nach einer üblichen Methode gemessen. Der zweiten
Probe werden 0,25 cm3 niioo HQSO,, der dritten o,25 cm3 nlioo Na OH zugesetzt,
worauf der pH-Wert: auch in diesen beiden Proben nach derselben Methode gemessen
wird. Die Änderungen der PH-Werte sind der Pufferung,z indirekt proportional. Die
Beträge dieser Änderungen sollten theoretisch bei verschiedenen Vorzeichen denselben
Wert haben. Praktisch zeigen sich zwischen den Änderungen des PH-Wertes, die durch
äquivalente Mengen Säure und Lauge hervorgerufen werden, oft bedeutende Abweichungen.
Bei der praktischen Bestimmung wird das arithmetische Mittel der reziproken Werte
der Änderungen des PH-Wertes nach der sauren und nach der alkalischen Seite hin
als -t angenommen. Der Pufferungsgrad der Nährmedien der aufeinanderfolgenden Gewöhnungsgärungen
wird unter Anwendung dieser Bestimmungsmethode derart geregelt, daß er von etwa
q. am Beginn der Züchtungsreihe langsam ansteigt. Dabei hat es sich als sehr vorteilhaft
erwiesen, zur Pufferung des Gärmediums gut puffernde Stoffgemische von gleicher
Art mitzuverwenden, wie sie hernach in den Hauptgärungen dem kohlehydrathaltigen
Ausgangsstoff als stickstoffhaltige Nährstoffe zugesetzt werden (z. B. .Malzkeime,
abgetötete und zweckmäßig abgebaute Hefe, Harnstoff, Aminoniumphosphat o. dgl.).
Hierdurch wird erreicht, daß der Mikroorganismus reit ler Gewöhnung an steigende
Säuremengen
gleichzeitig auch an steigende Mengen solcher stickstoffhaltiger
Nährstoffzusätze gewöhnt wird.
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Zur Ansäuerung der Nährmedien dieser Gewöhnungsgärungen werden am
besten organische Säuren; vorzugsweise Milchsäure, verwendet. Man kommt zu den günstigsten
Ergebnissen, wenn man die Anfangsacidität des Gärmediums in den aufeinanderfolgenden
Gewöhnungsgärungen bei einem n von etwa 4 von o,i bis 1,6 ansteigen läßt. (Die Aciditätsgrade
geben hier und in der Folge die Anzahl derKubkzentimebern-NaOH an, welche zur N
Neutralisierung von ioo cm3 des Mediums erforderlich sind.) Mit dem Ansteigen der
Acidität und des P.ufferungsgrades kann man ferner auch die Konzentration des Nährmediums
an Kohlehydraten von Gewöhnungsgärung zu Gewöhnungsgärung stetig wachsen lassen.
Man beginnt zweckmäßig mit Nährmedien, die i °/o Kohlehydrat (als Stärke gerechnet)
enthalten, und endigt mit einem Kohlehydratgehalt von 6 bis ä °l,.
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Der für die Gewöhnungsgärungen verwendete Nährboden kann als kohlehydrathaltige
Ausgangsstoffe beispielsweise Kartoffeln, Mais- oder Reismehl enthalten. Die stickstoffhaltigen
Pufferungsmischungen enthalten z. B. Malzkeime oder autolysierte Hefe usw. in verschiedenen
Kombinationen. Das Nährmedium für die S.porulierungsgärungen ist von gleichbleibender
Zusammensetzung und besteht beispielsweise aus ioo (Gewichtsteilen) Kartoffelbrei,
ioo Wasser, io Malzkeimen oder Blut und 2 Kreide. Beide Nährböden werden in Reagenzgläsern
gefüllt und dreimal fraktioniert .sterilisiert. Der Bazillus wird entweder aus dem
Boden oder aus Feldfrüchten entnommen und reingezüchtet, oder es werden Sporen verschiedener
Stämme des Bazillus schon vorhandenen Kulturen entnommen. Die Organismen werden
zunächst 24 Stunden .auf dem Sporulierungsnährbioden weitergezüchtet, sodann etwa
5 Minuten auf etwa 9o ° erhitzt und in das Nährmedium der ersten'Gewöhnungsgärung
übergeimpft. Nach 48stündiger Gärung werden die Kulturen in der üblichen Weise auf
ihre bakteriologischen, morphologischen und physiologischen Eigenschaften untersucht.
Die bestgeeigneten Mikroorganismen werden hernach einer zweiten Gärung auf dem Sporulierungsnährboden
überlassen und nach der Abtötung der vegetativen Formen auf den entsprechend vorbereiteten
Nährboden der zweiten Gewöhnungsgärung übertragen.- Alle Gärungen werden völlig
anaerob bei 37 bis 3$° geführt. Dieses Verfahren der abwechselnden Gewöhnungs-und
Sporulierungsgärung wird so lange fortgesetzt, bis eine Prüfungsgärung zeigt, daß
die Organismen eine 6 bis 8 °1o Stärke enthaltende Maische, die durch Zusatz
von Säure bis zu einer Titrationsacidität von 1,4 bis 1,6 angesäuert worden ist
und bei einem Anfangspufferungsgrad von mindestens 4. ein PH von 5 bis 4,7 besitzt,
praktisch bis zum Verschwinden der Kohlehydrate zu vergären imstande ist. Zu diesem
Ziel kommt man :erst nach einer sehr langen Reihe von Gewöhnungsgärungen.
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Unter Anwendung dieser Methode ist es gelungen, in Reihen von mehr
als hundert Gewöhnungsgärungen zwei für die Durchführung der acetonbutylalkoholischen
Gärung besonders geeignete Stämme dieser Species heranzuzüchten, welche als Bacillus
Amylobocter W. und als Bacillus Amylobacter S. bezeichnet werden sollen. Diese bei-den
Stämme unterscheiden sich morphologisch in ihren Vegetationsformen lediglich dadurch
voneinander, daß der Bacillus W. längere Stäbchen bildet, wogegen die Vegetationsformen
des anderen Stammes eine weniger schlanke Gestalt haben. Im Sporulierungsstadium
wiegen beim Bacillus Amylobacter W. die Plectridienformen, beim anderen Stamm die
Clostridienformen vor. Die Oidienformen beider Organismen sind lebhaft beweglich.
Beide Stämme verflüssigen Gelatine nicht und sind obligat anaerob; sie stehen daher
in diesen beiden Hinsichten im Gegensatz zu den in der österreichischen Patentschrift
95 449 genannten Bakterien.
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Zur Durchführung der Gärung in- großem Maßstab werden lediglich Sporen
enthaltende Kulturen, wie dies allgemein üblich ist, in mehreren Ansätzen von zunehmendem
Volumen vermehrt, bis schließlich die zum Anstellen .der Hauptmaische erforderliche
Ansatzmenge vorhanden ist.
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Auch die Maischen für die große Gärung werden in der üblichen Art
bereitet. Abweichend vom Bekannten läßt man jedoch der Erfindung gemäß die Hauptgärung
in Maischen vor sich gehen, die vor Einleitung der Gärung durch den Zusatz oder
die fermentative Bildung von organischen Säuren, insbesondere von Milchsäuren, angesäuert
werden. Auch der Hauptmaische werden ferner vorteilhaft gut puffernde Stoffgemische,
die gleichzeitig stickstoffhaltige Nährstoffe darstellen, z. B. eiweißhaltige Gemische
pflanzlichen Ursprungs, ferner Ammoniumverbindungen oder Harnstoffe zugesetzt.
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Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt, die Anfangsaci,dität .der
Hauptmaische (Titrationsacidität gegen Bromthymolblau) auf mindestens 1,4 bis i,6°
einzustellen. Der pH-Wert soll bei einem Pufferungsgrad von mindestens -l. zwischen
5 und 4,6 liegen. In Verbindung damit hat sich zur Betriebskontrolle die Regel ergeben,
den Verlauf der Gärung
nicht nur durch bakteriologische Untersuchung
und Bestimmung der Acid.itätskurve, sondern auch durch periodische Messungen des
Pufferungsgrades zu überwachen, wobei der -.T.-Wert der Veränderung der Acidität
angepaßt wird, d. h. mit diesem ansteigen und vorteilhaft mit dem Säuremaximum den
höchsten Wert gleichzeitig erreichen soll. Wird ein ungenügend hoher Pufferungsgrad
festgestellt, so ist dies durch Zugabe von hochpuffernden Zusätzen, z. B. milchsaure,
weinsaure, citronensaure oder oxalsaure Salze, im Zuge der Hauptgärung auszugleichen.
In dieser Weise wird die Herabsetzung der Empfindlichkeit der Gärungserreger gegen
Säuren durch die oben beschriebene Gewöhnungsgärung ausgenutzt, um die Reinheit
der Hauptgärung in einem bisher nicht erreichten Grad und im Zusammenhang damit
die regelmäßige Erzielung höchster Ausbeuten sicherzustellen. Ausführungsbeispiel
ioo 1 der Maische sollen etwa 35 bis 37 kg Kartoffeln oder 9 bis io kg Maismehl
enthalten. Andere stärkehaltige Materialien werden entsprechend ihrem Stärkegehalt
zu Maischen gleicher Konzentration (6 bis 7 °1o reine Stärke) verarbeitet. Man bringt
die Kartoffeln unzerkleinert, Mais o. dgl. in Mehlform mit der geeigneten Wassermenge
in Autoklaven ein, die finit Rührwerken ausgestattet sind, und dämpft bei einem
Druck von 2 bis 3 Atm. etwa i bis 2 Stunden. Die Nährstoffzusätze werden der Maische
zweckmäßig schon im Autoklaven zugefügt. Passende Zusammensetzungen sind z. B.:
auf ioo 1 Maische 125 g abgetötete oder abgebaute Hefe, 125 g Malzkeime und 4o g
Ammoniumsulfat. Die' Maische wird unmittelbar in vorher sorgfältig sterilisierte,
mit Rührwerken versehene Gärgefäße, die vollkommen geschlossen und mit einem zum
Abfangen der entweichenden Gase geeigneten Gäraufsatz versehen sein müssen, ausgeblasen.
Nach Einstellung der entsprechenden Anfangsacidität, wozu zweckmäßig So bis go cm'
einer So°loigen Milchsäure auf je ioo 1 der Maische zugesetzt werden, wird die Maische
auf die Gärtemperatur von 37 bis 38° eingestellt.
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Wenn die Hauptmaische zum Anstellen bereit ist, muß auch der zum Anstellen
dienende Bakterienansatz von geeignetem Volumen fertig sein. Zu seiner Herstellung
überimpft man Bacterium Amylobacter W.,oder S. nach kurzer Erhitzung auf etwa go°
auf ioo cms eines annähernd in gleicher Weise wie die Hauptmaische bereiteten Nährbodens
und überläßt ihn bei 37 bis 38° unter anaeroben Bedingungen der Entwicklung. Nach
etwa 48 Stunden beginnt das Wachstum und die Entwicklung der Oidien. Nachdem man
sich von der einwandfreien Beschaffenheit der Kultur überzeugt hat, erfolgt die
Überimpfung auf etwa 21 steriler Maische von gleicher Beschaffenheit und nach etwa
24 Stunden auf etwa 201 gleichartiger Maische. Nach weiteren 24 Stunden kommen diese
2o 1 in eine vorbereitete Maische von 200 bis 3001, welche nach weiteren 24 Stunden
in die inzwischen zum Anstellen fertiggemachte Hauptmaische übergeführt wird.
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Während der Gärung der Hauptmaische werden mindestens viermal täglich
neben der bakteriologischen Kontrolle und der Titrationsacidität das PH und der
Pufferungsgrad festgestellt, was unter Umständen zum Zusatz weiterer Pufferstoffe
führt.
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Bei der betriebsmäßigen Ausführung des Verfahrens unter Verwendung
von Mais als Ausgangsstoff ist ein Säuregrad von 6 durchschnittlich nach io bis
12 Stunden erreicht; es wird aber auch ein Säuregehalt von 8 bis 9° von den an Säure
gewöhnten Organismen in Verbindung mit dem hohen Pufferungsgrad der Maische ohne
Schwächung vertragen. Nach etwa 17 bis 22 Stunden ist die Gärung praktisch beendet.
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Nach Beendigung der Gärung werden die gebildeten Hauptprodukte (Butylalkohol
und Aceton) neben bescheidenen Mengen Äthylalkohol im üblichen Verfahren durch fraktionierte
Destillation gewonnen.
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Die Gesamtausbeute an flüssigen Endprodukten (Butylalkohol, Aceton
und Äthylalkohol) beträgt, bezogen auf ioo Teile Stärke, 41 bis 41'/,'1" wovon etwa
260/" auf reinen Butylalkohol entfallen.
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Es ist bereits vorgeschlagen worden, die Gärungserreger der acetonbutylalkoholischen
Gärung durch Gewöhnung an gewisse Stoffe, welche bei der sogenannten trägen Gärung
in der Maische vorhanden sind, in einen Zustand zu bringen, durch den das Eintreten
dieser epidemisch auftretenden Betriebsstörung vermieden werden soll. Diese . Stoffe
bleiben bei sorgfältiger Filtration der Maische durch Bakterienfilter in ihr zurück;
auch aus anderen Gründen wird auf die ultramikroskopische Beschaffenheit der Erreger
der trägen Gärung geschlossen. Es handelt sich also hier, wie angenommen wird, um
die Gewöhnung der Organismen an ein invisibles Virus oder einen Bakteriophagen.
Desgleichen ist auch schon bekannt, die Kulturen einem oder mehreren selektiven
Prozessen zu unterwerfen, wobei diese in einer Nährlösung gezüchtet werden, der
geringe Mengen der durch Gärung zu ,gewinnenden Produkte zugesetzt werden. In diesem
Fall handelt es i sich darum, die Gärungserreger gegen Aceton bzw. Butylalkohol
widerstandsfähig zu
machen. Mit diesen beiden Vorschlägen hat das
vorliegende Verfahren nur die allgemein bekannte bakteriologische Methode der Gewöhnung
von Mikroorganismen an bestimmte Stoffe durch wiederholte Züchtung in Gegenwart
dieser Stoffe gemeinsam.
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Von der allgemein geteilten Annahme ausgehend, daß Essigsäure die
Quelle des Acetons und Buttersäure die des Butylalkohols ist, ist ferner der Vorschlag
gemacht worden, die Art und Menge der bei der acetonbutylalkoholischen Gärung entstehenden
Stoffwechselprodukte durch Zusatz von anderen Fettsäuren planmäßig zu verändern.
So soll z. B. durch .den Zusatz von Propionsäure oder von propionsauren Salzen nach
dem Absinken der Acidität, also nach denn Höhepunkt der Gärung, die Bildung von
Propylalkohol neben Aceton .und Butylalkohol veranlaßt oder durch den Zusatz von
Essigsäure oder ihren Salzen die Bildung von Aceton auf Kosten des Butylalkohols
gesteigert werden. Die Lösungsidee dieses bekannten Verfahrens besteht mithin darin,
in einem Zeitpunkt, wo die Acidität durch die Umwandlung der sauren Zwischenprodukte
der Gärung bereits stark zurückgegangen ist, bestimmte organische Säuren in die
Maische einzubringen, die sodann als zusätzliche Quelle für die Bildung bestimmter
Stoffwechselprodukte dienen.
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In der britischen Patentschrift 218 615 ist ein Zusatz von milchsaurem
Natrium oder Calcium als Mittel in Vorschlag gebracht, um die Ausbeute an Butylalkohol
auf Kosten des Acetons zu steigern. Es soll durch den Zusatz ansehnlicher Mengen
von Lactaten erreicht werden, daß man auf 8.1°1o Butylalkohol nur 16 % Aceton
erhält. Die Milchsäure kann nach dieser Patentschrift in der Maische auch auf bakteriellem
Weg erzeugt werden; hernach wird sie aber vor Einleitung der Gärung unbedingt in
das Natrium- oder Calciumsalz übergeführt. Nebenher ist wohl auch davon die Rede,
bei der Neutralisation der bakteriell erzeugten Milchsäure in der Maische eine schwach
saure Reaktion herzustellen. Doch ist in der Patentschrift ausdrücklich hervorgehoben,
daß nur geringe Abweichungen nach der sauren oder alkalischen Seite hin zulässig
sind und auch diese zu ungünstigeren Arbeitsbedingungen führen. Hierdurch ist das
vorliegende Verfahren nicht bekanntgeworden, zumal da -es bei diesem nur auf die
Wasserstoffionenkonzentration ankommt. Nach einer besonderen Ausführungsform des
vorliegenden Verfahrens ist allerdings auch der Zusatz von milchsauren Salzen vorgesehen.
In .diesem Fall dient dieser Zusatz aber zur Einhaltung eines ganz bestimmten Pufferungsgrades,
der erfindungsgemäß der Veränderung der Acidität angepaßt wird. Für diesen Zweck
sind den milchsauren Salzen viele andere Salze (wie z. B. weinsaure, citronensaure
oder oxalsaure Salze) äquivalent.