FI93655B - Menetelmä solun ulkopuolisten entsyymien talteenottamiseksi täysfermentoidusta oluesta - Google Patents

Description

o 7 < C Π y O O u \j

Menetelmä solun ulkopuolisten entsyymien talteenottamisek-si täysfermentoidusta oluesta Tämä keksintö koskee solunulkoisten entsyymien tal-5 teenottamista täysfermentoidusta oluesta lisäämällä täys-olueeseen polymeerin ja epäorgaanisen suolan seos.

Teollisten entsyymien tuottaminen viljelemällä mikro-organismeja, kuten bakteereja, sieniä ja hiivaa, vettä sisältävässä ravintoaineessa, on hyvin tunnettua. Riippuen 10 kyseessä olevan mikro-organismin luonteesta tuotetut entsyymit (tuotettu entsyymi) voivat olla solunulkoisia, so-lunsisäisiä tainiiden seoksia. Kun tuotetut entsyymit (tuotettu entsyymi) ovat solunulkoisia, ne saadaan yleensä ensin erottamalla entsyymiä sisältävä supernatantti mikro-15 organismisoluista ja ottamalla talteen entsyymi(t) super-natantista hyvin tunnetuilla menetelmillä, kuten saosta-malla, ultrasuodatuksella ja haihdutuksella. Kun tuotetut entsyymit (tuotettu entsyymi) ovat solunsisäisiä, ne täytyy ensin vapauttaa soluistaan. Tämä voidaan saada aikaan 20 kemiallisesti ja/tai mekaanisesti. Sen jälkeen, kun entsyymit on saatu liuokseen, ne voidaan ottaa talteen yllä mainituilla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

On tunnettua, että solunulkoisilla entsyymeillä on . koostumuksia ja ominaisuuksia, jotka ovat erilaisia solun- •25 sisäisiin entsyymeihin verrattuina. Solunulkoisilla ent syymeillä yleensä on esimerkiksi huomattavasti alemmat molekyylimassat kuin solunsisäisillä entsyymeillä. Soluista vapautettuja solunsisäisiä entsyymejä sisältävä liuos sisältää myös merkittäviä määriä muuta solunsisäistä ma-30 teriaalia, joka ei ole läsnä täysfermentoidussa oluessa, joka sisältää solunulkoisia entsyymejä. Näiden eroavaisuuksien vuoksi voidaan joutua käyttämään erilaisia käsittelyjä niitä talteenotettaessa ja puhdistettaessa myös silloin, kun ne molemmat ovat vesiliuoksessa. Solunsisäi-35 sille entsyymeille sopiva talteenottamismenettely ei siten 93655 2 ilmeisesti ole käyttökelpoinen solunulkoisille entsyymeille.

Entsyymituotannon ja -talteenoton tehokkuuden ja tarkoituksenmukaisuuden parantamiseksi on tunnettua, että 5 entsyymejä voidaan tuottaa mikro-organismifermentoinnilla kaksifaasi-ravintoaineessa, joka sisältää polyetyleenigly-kolin ja dekstraanin seoksen. Käymisen loputtua solunul-koinen entsyymi konsentroituu ylempään polyetyleeniglyko-lifaasiin, kun taas solut ja muut käymistuotteet konsen-10 troituvat alempaan dekstraanifaasiin. Tätä on kuvattu julkaisussa Enzyme and Microb. Technol. Voi. 7, 333 - 338 (1985). Alfa-amylaasin partitiokerroin esimerkiksi siinä systeemissä on suurimmillaan 4.

Yllä mainitun menettelyn muunnelma on kuvattu yh-15 dysvaltalaisessa patenttijulkaisussa nro 4 508 825, jossa solunulkoista entsyymiä sisältävä supernatantti erotetaan soluista, soluja sisältämätön supernatantti sekoitetaan polyetyleeniglykolin ja kationisen epihalogeenihydriini/ polyamiini-kopolymeerin tai dekstraani-polymeerin kanssa 20 kahden faasin muodostamiseksi. Tätä tekniikkaa voidaan käyttää solunulkoisen proteaasin ja amylaasin erottamiseksi, jolloin proteaasi konsentroituu polyetyleeniglykoli-faasiin ja amylaasi konsentroituu kationisen kopolymeerin tai dekstraanin faasiin.

25 Kahden faasin entsyymintalteenottamismenetelmiä on käytetty myös solunsisäisillä entsyymeillä. Yhdysvaltalainen patentti nro 4 144 130 kuvaa (1) korkean molekyylimas-san omaavan, substituoimattoman tai substituoidun polyal-koholin, polyeetterin, polyesterin, polyvinyylipyrrolido-30 nin tai polysakkaridin ja epäorgaanisen suolan seoksen ‘ käyttöä, tai (2) vähintään kahden yllä mainitun, korkean molekyylimassan omaavan polymeerin seoksen käyttöä solun-sisäisten entsyymien talteenottamiseksi vesiliuoksesta, johon ne on vapautettu soluista. Käytettäessä esimerkiksi 35 polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan seosta toi- >3655 3 vottu solunsisäinen entsyymi menee ylempään polyetyleeni-glykolikerrokseen, kun taas solujäännökset ja muut käymis-tuotteet menevät alempaan, suolaa sisältävään kerrokseen. Partitiokerroin erilaisilla talteenotetuilla entsyymeillä 5 glykolikerroksessa oli noin 0,3 käsiteltäessä täysfermen-toitua olutta. Partitiokerroin kasvoi ainoastaan arvoon 3, kun pakastettuja soluja sekoitettiin veteen ja hajotettiin niiden entsyymien vapauttamiseksi.

Polyetyleeniglykolin lisääminen epäorgaanisten suo-10 lojen avustamiseksi saostettaessa entsyymejä soluja sisältämättömistä liuoksista sisältyy yhdysvaltalaiseen patenttiin nro 4 016 039.

Aiemmin ei ole ehdotettu, että polyetyleeniglykolia ja epäorgaanisia suoloja voitaisiin käyttää kaksifaasime-15 netelmässä solunulkoisten entsyymien talteenottamiseksi täysfermentoidusta oluesta partitiokertoimien ollessa vähintään 50.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti esitetään menetelmä solunulkoisten entsyymien talteenottamiseksi täys-20 fermentoidusta oluesta. Menetelmälle on tunnusomaista, että täysfermentoitu olut, joka sisältää mikroorganisraiso-luja ja solunulkoista entsyymiä, saatetaan kosketukseen seoksen kanssa, joka sisältää kalsiumklorididihydraattia, mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja mahdollisesti 25 kalsiumhydroksidia, minkä jälkeen siihen lisätään (a) polymeeri, joka on polyetyleeniglykoli, polyetyleeniglykolin amiinijohdannainen, polyetyleeniglykolin karboksylaatti-johdannainen, polypropyleeniglykoli, polypropyleeniglyko-lin amiinijohdannainen, polypropyleeniglykolin karboksy-30 laattijohdannainen, poly(etyleeniglykoli)esteri, polyety-leeni-imiini, trimetyyliamino-polyetyleeniglykoli, polyvi-nyylialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni tai niiden seos, ja (b) epäorgaaninen suola, joka valitaan yhdisteryhmästä, jossa kationit ovat natrium, kalium, magnesium ja ammonium 35 ja anionit ovat sulfaatit, karbonaatit, sitraatit, klori- 93655 4 dit, fosfaatit ja niiden seokset, täysfermentoitu olut-polymeeri-suolaseoksen annetaan erottua runsaasti entsyymiä sisältäväksi polymeerifaasiksi ja vähän entsyymiä sisältäväksi suolafaasiksi ja otetaan talteen runsaasti ent-5 syymiä sisältävä tuote.

Solunulkoisia entsyymejä sisältävät täysfermentoi-dut oluet, jotka ovat käyttökelpoisia raaka-aineiksi esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat alalla hyvin tunnettuja. Esimerkiksi Bacillus licheniformis, 10 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis ja Mucor miehei ovat tunnettuja solunulkoisten entsyymien, kuten esimerkiksi proteaasin, amylaasin ja mikrobijuoksuttimen, tuottamiseksi kasvatettaessa sopivassa ravintoaineessa. Tuloksena saatavaa solujäännöksen, solunulkoisten, liu-15 koisten entsyymien ja muiden käymistuotteiden seosta voi daan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä ilman, että lisäksi erotetaan solujäännös liukoisista entsyymeistä. Tässä yhteydessä käytettynä termi "solu-jäännös" tarkoittaa sekä kokonaisia soluja että solufrag-20 mentteja.

Täysfermentoitu olut sekoitetaan sitten polymeerin ja epäorgaanisen suolan kanssa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi. Haluttu solunulkoinen entsyymi kerääntyy poly-meerifaasiin, kun taas solujäännös kerääntyy suolafaasiin.

25 Edullinen polymeeri on polyetyleeniglykoli. Mikä tahansa polyetyleeniglykolin muoto, joka on liukoinen vettä sisältävässä täysfermentoidussa oluessa, on sopiva. Erityisen hyödyllisellä polyetyleeniglykolilla molekyyli-massa on noin 3 350. Se on kiinteä huoneen lämpötilassa, 30 ja sitä voidaan helposti käsitellä kaupallisessa tuotanto- mittakaavassa.

Edullisia epäorgaanisia suoloja ovat natriumkloridi ja natriumsulfaatti.

Polymeeriä ja epäorgaanista suolaa lisätään täys-35 fermentoituun olueeseen sellaiset määrät, jotta muodostuu g 7. £ tr Γ S -J U vJ 5 kokonaisseos, joka sisältää 64 - 90 % täysfermentoitua olutta, 1 - 15 % polymeeriä ja 8 - 35 % epäorgaanista suolaa, mainittujen prosenttiosuuksien ollessa painoprosentteja perustuen seoksen kokonaispainoon. Edullista on, että 5 kokonaisseos sisältää 73 - 79 % täysfermentoitua olutta, 3 - 4 % polymeeriä ja 15 - 24 % epäorgaanista suolaa.

Sen jälkeen kun polymeeri ja suola on lisätty, muodostuu kaksi faasia. Polymeerifaasi on yleensä suolafaasin yläpuolella. Kaksi faasia voi muodostua selkeyttämällä, 10 jolloin seoksen annetaan seistä hiljaa noin viisi tuntia. Entsyymiä sisältävä polymeerifaasi voidaan sitten erottaa millä tahansa standardi-neste/neste-erotustekniikalla, kuten sifonoimalla ja dekantoimalla, entsyymin talteenot-tamiseksi. Edullista on kuitenkin käyttää sentrifugointia 15 faasien erottamiseksi. Käyttökelpoinen erotin on jatkuvatoiminen, kiinteämaljäinen sentrifugi. Jotta saavutettaisiin toivottu entsyymikonsentraatio lopullisessa, erotetussa polymeeritaasissa, on edullista, että runsaasti entsyymiä sisältävän polymeerifaasin tilavuussuhde vähän ent-20 syymiä sisältävään suolafaasiin nähden on 0,12 - 0,15.

Jotta kaikkein tehokkaimmin otettaisiin talteen solunulkoinen entsyymi, tulisi sentrifugia käyttää siten, ettei yhtään polymeerifaasia sekoitu suolafaasiin, joka heitetään pois. Tuloksena saatavassa, kerätyssä polymeeri-25 faasissa voi olla sekoittuneena jonkun verran suolafaasia. Seos erotetaan sentrifugoimalla toisen kerran, jolloin sentrifugia käytetään siten, ettei yhtään polymeerifaasia sekoitu suolafaasiin ja siten, että ainoastaan vähäinen määrä suolafaasia on sekoittunut polymeerifaasiin.

30 Siten kerättyä, runsaasti entsyymiä sisältävää po lymeerifaasia voidaan suoraan käyttää entsyymilähteenä. Esimerkiksi emäksinen proteaasi, joka on otettu talteen polyetyleeniglykolifaasiin, on sopiva entsyymipesuaine-koostumuksissa. Glykoli on hyödyllinen entsyymin stabili-35 soimisessa. Jos on toivottua, entsyymi voidaan erottaa > 6655 6 polymeeristä tunnetuilla tekniikoilla, kuten saostamalla, ultrasuodatuksella tai haihduttamalla, lähes kokonaan polymeeriä sisältämättömän entsyymituotteen valmistamiseksi.

Täysfermentoitu olut esikäsitellään edullisesti 5 seoksella, jossa on 1,5 - 5,0 % kalsiumklorididihydraat-tia, 0,1 - 1,2 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja 0 - 0,6 % kalsiumhydroksidia, mainittujen prosenttien ollessa laskettu paino/tilavuus-perusteella lisäaineen painosta ja fermentoidun oluen tilavuudesta. Tämä esikäsitte-10 lyvaihe helpottaa solujäännöksen flokkuloimista ja parantaa entsyymin erottumista solujäännöksestä lisättäessä seuraavassa vaiheessa polymeeri ja epäorgaaninen suola. Edullisesti otettaessa talteen proteaasia esikäsittelyvai-heessa tulisi käyttää 1,5 - 5,0 % kalsiumklorididihydraat-15 tia ja 0,2 - 1,2 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia. Otettaessa talteen amylaasia, esikäsittelyvaiheessa tulisi käyttää 1,5 - 5,0 % kalsiumklorididihydraattia 0,1 - 1,0 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja 0,1 - 0,6 % kalsiumhydroksidia .

20 Partitiokerroin on sinänsä tunnettu erottumisen tehokkuuden mittana. Se ilmaistaan entsyymiaktiivisuuskon-sentraationa ylä- tai polymeerifaasissa jaettuna entsyymi-aktiivisuuskonsentraatiolla pohja- tai epäorgaaninen suola -faasissa. Entsyymiaktiivisuus kussakin faasissa voidaan 25 mitata tunnetuilla menetelmillä. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan saavuttaa partitiokerroin ainakin 50, joka on merkittävä edistys verrattuna aikaisempiin menetelmiin.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa 30 esimerkeissä.

Esimerkki 1

Emäksisen proteaasin tuottamiseen sopiva ravintoaine valmistettiin lisäämällä seuraavat aineet 22 712 litran (6 000 gallonan) fermentoriin: 93655 7 vehnägluteiini 681 kg (1500 naulaa) natriumsitraatti 74,9 kg (165 naulaa) kalsiumklorididihydraatti 74,9 kg (165 naulaa) maissitärkkelys 2270 kg (5000 naulaa) 5 soijajauho 1135 kg (2500 naulaa) lämmönkestävä alfa-amylaasi 2,27 kg (5 naulaa) mononatriumfosfaatti 181,6 kg (400 naulaa) dinatriumfosfaatti 181,6 kg (400 naulaa) vaahdonestoaine 62,5 1 (16,5 gal) 10 vesi (mainittuun tilavuuteen asti) 22712 1 (6000 gal)

Ravintoaineeseen siirrostettiin sitten eläviä Bacillus licheniformis -soluja ja annettiin fermentoitua 15 36 tunnin ajan 36 °C:ssa. Tuloksena saatuun täysfermentoi- tuun olueeseen lisättiin 811 1 (214 gal) 70-%:ista (paino/ tilavuus) kalsiumklorididihydraatin vesiliuosta ja 136 kg (300 naulaa) mononatriumfosfaattia. Tämä johtaa seokseen, joka sisältää 2,5 % (paino/tilavuus) kalsiumklorididihyd-20 raattia ja 0,6 % (paino/tilavuus) mononatriumfosfaattia perustuen kunkin lisäaineen painoon ja fermentoidun oluen tilavuuteen. Seoksen pH pidettiin välillä 6,8 - 7,6 nat-riumhydroksidin lisäyksen avulla, samalla kun lisäaineita sekoitettiin mukaan. Sen jälkeen kun sekoittuminen oli . 25 täydellinen, pH säädettiin välille 7,4 - 7,6 lisäämällä natriumhydroksidia flokkuloitumisen täydellistämiseksi. Sitten pH säädettiin välille 6,4 - 6,6 lisäämällä 50-%: ista etikkahapon vesiliuosta. Tuloksena saatuun seokseen lisättiin 5 260 kg (11 600 naulaa) natriumkloridia lämpö-30 tilassa 25 - 27 °C, ja seosta sekoitettiin tunnin ajan : kaiken natriumkloridin liuottamiseksi. Sitten lisättiin 1 400 kg (3 100 naulaa) polyetyleeniglykolia, jonka mole-kyylimassa on 3 350, ja 1 930 kg (4 250 naulaa) natrium-sulfaattia, ja täysoluen lämpötila kohotettiin välille 30 35 - 32 °C. Täysoluen pH säädettiin välille 6,0 - 6,2 lisää mällä etikkahappoliuosta, ja koko seosta sekoitettiin kah- 8

Q 7 £ c C

·>; o J j den tunnin ajan. Koko seos sisälsi 15 paino-% natriumklo-ridia, 4 paino-% polyetyleeniglykolia, 5,5 paino-% nat-riumsulfaattia ja 75,5 paino-% täysfermentoitua olutta. Prosenttioisuudet laskettiin lisäaineen painosta fermen-5 toidun oluen ja lisäaineiden kokonaismassaa kohden. Sekoittamisen jälkeen, koko seos jakautui ylempään polyety-leeniglykolifaasiin ja alempaan natriumkloridi-natriumsul-faatti-solujäännös-faasiin. Faasisuhde ylemmän faasin tilavuuden ja alemman faasin tilavuuden välillä oli 0,15. 10 Proteaasiaktiivisuuden konsentraatio ylemmässä faasissa jaettuna proteaasiaktiivisuuden konsentraatilla alemmassa faasissa johti partitiokertoimeen 60 - 80. Jatkuvatoimista kiinteämaljäistä sentrifugia käytettiin sitten kahden faasin erottamiseen. Sentrifugi säädettiin ensimmäistä erot-15 tamista varten, jossa erottamisessa ei tapahtunut polyety-leeniglykolifaasin sekoittumista suolafaasiin, joka heitettiin pois. Glykolifaasi sisälsi 90 - 92 % fermentaatio-oluen koko entsyymiaktiivisuudesta. Tämä glykolifaasi sisälsi myös noin 5 - 20 % sekoittunutta suolafaasia. Edellä 20 kuvatulla tavalla kerätty glykolifaasi erotettiin toisen kerran käyttäen samanlaista laitetta, jossa käyttöparamet-rit asetettiin siten, että sallittiin vähemmän kuin kaksi tilavuusprosenttia suolafaasin sekoittumista glykolifaa-, siin. Suolafaasi heitettiin sitten pois, eikä se sisältä- 25 nyt yhtään glykolifaasia. Yllä kuvatulla tavalla kerätty glykolifaasi sijoitettiin sitten jäähdytettyyn tankkiin 10 °C:ssa natriumsulfaattijäännösten poistamiseksi. Pieni määrä natriumsulfaattikiteitä lisättiin indusoimaan nat-riumsulfaattikiteiden kasvua. Kahden tunnin kevyen sekoi-30 tuksen jälkeen 10 °C:ssa, natriumsulfaattia sisältämätön glykolifaasi juoksutettiin pois. Se sekoitettiin sitten aktiivihiileen ja suodatusapuaineeseen ja suodatettiin sitten käyttäen suodatuspainoa. Tuloksena saatua emäksistä, runsaasti proteaasia sisältävää glykoliliuosta voidaan 35 käyttää suoraan nestemäisissä entsyymipesuainekoostumuk-sissa.

93655 9

Esimerkki 2

Esimerkin 1 menettely toistettiin vaiheesta, jossa lisätään kalsiumklorididihydraatti ja mononatriumfosfaat-ti. Tuloksena saatu täysfermentoitu olut-lisäaine-seos 5 sekoitettiin sitten 970 kg:aan (2 130 naulaan ) polyety-leeniglykolia, jonka molekyylimassa on 3 350, ja 4 850 kg:aan (10 660 naulaan) natriumsulfaattia, ja täysoluen lämpötila nostettiin välille 30 - 32 °C. Koko seosta, joka sisälsi 3 paino-% polyetyleeniglykolia, 15 paino-% nat-10 riumsulfaattia ja 82 paino-% täysfermentoitua olutta, sekoitettiin sitten tunnin ajan. Sekoittamisen jälkeen koko-naisseos jakautui ylemmäksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja alemmaksi natriumsulfaatti-solujäännös-faasiksi. Ylemmän faasin tilavuuden suhde alemman faasin tilavuuteen oli 15 0,12. Proteaasiaktiivisuuskonsentraatio ylemmässä faasissa jaettuna proteaasiaktiivisuuskonsentraatiolla alemmassa faasissa johti partiotiokertoimeen 60 - 80. Emäksinen pro-teaasi glykolifaasissa oli amorfisen, kiinteän aineen muodossa. Kaksi faasia erotettiin sitten sentrifugilla, kuten 20 on kuvattu esimerkissä 1, jotta saataisiin aikaan glykoli-faasi, joka sisältää amorfista, kiinteää proteaasia ja vähemmän kuin kaksi tilavuusprosenttia sekoittunutta suo-lafaasia. Kiinteät aineet otettiin sitten talteen sentri-fugin avulla, ja niitä voidaan käyttää raeproteaasina rae-- 25 maisissa entsyymipesuainetuotteissa.

Esimerkki 3 Lämmönkestävän alfa-amylaasin valmistamiseen sopiva ravintoaine valmistettiin lisäämällä seuraavat aineet 22 712 litran (6 000 gallonan) fermentoriin: . 30 kalsiumklorididihydraatti 10,2 kg (22,5 naulaa) mononatriumfosfaatti 136,2 kg (300 naulaa) dinatriumfosfaatti 317,8 kg (700 naulaa) ammoniumsulfaatti 113,5 kg (250 naulaa) natriumsitraatti 45,4 kg (100 naulaa) 35 maissin liotusnestettä 454 kg (1000 naulaa) 93655 10 laktoosi 3178 kg (7000 naulaa) puuvillansiemenjauho 681 kg (1500 naulaa) soijajauho 908 kg (2000 naulaa) vaahdonestoaine 625 1 (165 gal) 5 vesi (mainituun tilavuuteen asti) 2712 1 (6000 gal)

Ravintoaineeseen siirrostettiin sitten eläviä Bacillus licheniformis -soluja ja annettiin fermentoitua 10 108 - 110 tunnin ajan 42 °C:ssa, samalla kun pH pidettiin välillä 7,05 - 7,15 lisäämällä ajoittain natriumhydroksi-dia. Tuloksena saatuun täysfermentoituun olueeseen lisättiin 1 300 1 (434 gal) 70-%:ista (paino/tilavuus) kalsium-klorididihydraatin vesiliuosta, 908 1 (240 gal) 10-%:ista 15 (paino/tilavuus) kalsiumhydroksidin vesiliuosta ja 27 kg (60 naulaa) monokaliumfosfaattia. Tämä johti seokseen, joka sisälsi 4 % (paino/tilavuus) kalsiumklorididihydraat-tia, 0,4 % (paino/tilavuus) kalsiumhydroksidia ja 0,12 % (paino/tilavuus) monokaliumfosfaattia perustuen kunkin 20 lisäaineen painoon ja fermentoidun oluen tilavuuteen.

Seoksen pH pidettiin välillä 7,6 - 8,4 lisäaineita sekoitettaessa lisäämällä natriumhydroksidia. Sen jälkeen kun sekoittuminen oli täydellinen, pH säädettiin välille 8,4 - 8,6 lisäämällä natriumhydroksidia. Tuloksena saatuun seok-; 25 seen lisättiin 1 180 kg (2 600 naulaa) polyetyleeniglyko-lia, jonka molekyylimassa on 3 350, ja 3 370 kg (7 420 naulaa) natriumkloridia lämpötilassa 25 - 27 °C, ja seoksen annettiin sekoittua vähintään tunnin ajan. Natriumsul-faattia lisättiin sitten 2 700 kg (5 940 naulaa), ja fer-30 mentoidun oluen seosta kuumennettiin 30 - 32 °C:seen, pH säädettiin välille 7,9 - 8,1 lisäämällä natriumhydroksidia ja kokonaisseosta sekoitettiin vähintään kahden tunnin ajan. Kokonaisseos sisälsi 3,5 paino-% polyetyleeniglyko-lia, 10 paino-% natriumkloridia, 8 paino-% natriumsulfaat-35 tia ja 78,5 paino-% täysfermentoitua olutta. Sekoittamisen jälkeen kokonaisseos erottui ylemmäksi polyetyleeniglyko-

II

s' ^ < c; c / 'J O 3 j lifaasiksi ja alemmaksi natriumkloridi-natriumsulfaatti-solujäännös-faasiksi. Ylemmän faasin tilavuuden faasisuhde alemman faasin tilavuuteen oli 0,12. Amylaasiaktiivisuus-konsentraatio ylemmässä faasissa jaettuna amylaasiaktiivi-5 suuskonsentaatilla alemmassa faasissa johti partitioker-toimeen 50 - 70. Jatkuvatoimista kiinteämaljäistä sentri-fugia käytettiin, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, runsaasti amylaasia sisältävän glykolifaasin talteenottamiseksi, joka faasi sitten puhdistettiin, kuten on kuvattu esimer-10 kissä 1, runsaasti amylaasia sisältävän glykolituotteen valmistamiseksi.

Esimerkki 4

Alfa-amylaasin tuottamiseen sopiva ravintoaine valmistettiin lisäämällä seuraavat aineet 22 712 1 (6 000 15 gallonan) fermentoriin; kalsiumkarbonaatti 241,6 kg (530 naulaa) kalajauho 340,5 kg (750 naulaa) jauhettu soijajauho 1271 kg (2800 naulaa) maissin liotusneste 681 kg (1500 naulaa) 20 laktoosi 3178 kg (7000 naulaa) diammoniumfosfaatti 59 kg (130 naulaa) vaahdonestoaine 151,4 1 (40 naulaa) vesi (mainittuun tilavuuteen asti) 22712 1 (6000 gal) 25

Ravintoaineeseen siirrostettiin sitten eläviä Bacillus amyloliguefaciens -soluja ja annettiin fermentoitua 60 tunnin ajan 34 °C:ssa, samalla kun pH pidettiin välillä 7,05 - 7,15 lisäämällä ajoittain natriumhydroksidia. Tu-30 loksena saatuun täysfermentoituun olueeseen lisättiin 973 . 1 (257 gal) 70-%:ista (paino/tilavuus) kalsiumklorididi- hydraatin vesiliuosta, 681 1 (180 gal) 10-%:ista (paino/ tilavuus) kalsiumhydroksidin vesiliuosta ja 136 kg (300 naulaa) monokaliumfosfaattia. Tämä johtaa seokseen, joka 35 sisältää 3 % (paino/tilavuus) kalsiumklorididihydraattia, 0,3 % (paino/tilavuus) kalsiumhydroksidia ja 0,6 % (paino/ 12 95655 tilavuus) monokaliumfosfaattia perustuen kunkin lisäaineen painoon ja fermentoidun oluen tilavuuteen. Seoksen pH pidettiin lisäaineita lisättäessä välillä 6,8 - 7,6 lisäämällä natriumhydroksidia. Sen jälkeen, kun sekoittuminen 5 oli täydellinen, pH säädettiin välille 7,4 - 7,6 lisäämällä natriumhydroksidia. Tuloksena saatuun seokseen lisättiin 1 140 kg (2 510 naulaa) polyetyleeniglykolia, jonka molekyylimassa on 3 350, ja 3 600 kg (7 960 naulaa) nat-riumkloridia lämpötilassa 25 - 27 °C, ja seoksen annettiin 10 sekoittua vähintään tunnin ajan. Sitten lisättiin natrium-sulfaattia 4 870 kg (10 700 naulaa) , ja fermentoidun oluen seosta kuumennettiin 30 - 32 °C:een. pH säädettiin välille 7,4 - 7,6 lisäämällä natriumhydroksidia ja kokonaisseosta sekoitettiin vähintään kahden tunnin ajan. Kokonaisseos 15 sisälsi 3,15 paino-% polyetyleeniglykolia, 10 paino-% nat-riumkloridia, 13,5 paino-% natriumsulfaattia ja 73,35 paino-% täysfermentoitua olutta. Sekoittamisen jälkeen kokonaisseos erottui kahdeksi faasiksi, kuten on kuvattu esimerkissä 3, siten että faasisuhde oli 0,12 ja partitioker-20 roin 50 - 70. Faasit käsiteltiin, kuten esimerkissä 3 on kuvattu, jolloin saatiin runsaasti amylaasia sisältävä glykolituote.

«

Claims (11)

1. Menetelmä solunulkoisen entsyymin talteenotta-miseksi täysfermentoidusta oluesta, tunnettu sii-5 tä, että täysfermentoitu olut, joka sisältää mikroorganis-misoluja ja solunulkoista entsyymiä, saatetaan kosketukseen seoksen kanssa, joka sisältää kalsiumklorididihyd-raattia, mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja mahdollisesti kalsiumhydroksidia, minkä jälkeen siihen lisätään 10 (a) polymeeri, joka on polyetyleeniglykoli, polyetyleeni- glykolin amiinijohdannainen, polyetyleeniglykolin karbok-sylaattijohdannainen, polypropyleeniglykoli, polypropylee-niglykolin amiinijohdannainen, polypropyleeniglykolin kar-boksylaattijohdannainen, poly(etyleeniglykoli)esteri, po-15 lyetyleeni-imiini, trimetyyliamino-polyetyleeniglykoli, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni tai niiden seos, ja (b) epäorgaaninen suola, joka valitaan yhdiste-ryhmästä, jossa kationit ovat natrium, kalium, magnesium .···. ja ammonium ja anionit ovat sulfaatit, karbonaatit, sit- • · **! 20 raatit, kloridit, fosfaatit ja niiden seokset, täysfermen-• * # ·*·; toitu olut-polymeeri-suolaseoksen annetaan erottua run- • · säästi entsyymiä sisältäväksi polymeeri faasiksi ja vähän : .* entsyymiä sisältäväksi suolafaasiksi ja otetaan talteen runsaasti entsyymiä sisältävä tuote. • · J ί ' 25

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täysfermentoidun oluen, po- ♦·· lymeerin ja epäorgaanisen suolan seos sisältää 64 - 90 %, ♦ ··« edullisesti 73 - 79 % täys ferment o itua olutta, 1 - 15 %, / # edullisesti 3 - 4 % polymeeriä ja 8 - 35 %, edullisesti 15 • · · *· ’· 30 - 24 % epäorgaanista suolaa, jolloin prosenttiosuudet pe- ***** rustuvat paino-osuuksiin seoksen kokonaispainosta.

.*.*. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, • · · 9 • ♦ .···. tunnettu siitä, että polymeeri on polyetyleenigly- • · köli ja epäorgaaninen suola on natriumkloridin ja natrium-35 sulfaatin seos tai natriumsulfaatti yksistään. t \..i il £. t-v C i jOjj

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennen kuin polymeeri ja epäorgaaninen suola lisätään, täysfermentoitu olut saatetaan kosketukseen seoksen kanssa, jossa on 1,5 - 5,0 5 % kalsiumklorididihydraattia, 0,1 - 1,2 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja 0 - 0,6 % kalsiumhydroksidia, jolloin prosenttiosuudet on laskettu paino/tilavuus-perus-teella lisäaineiden painosta fermentoidun oluen tilavuuteen nähden.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täysfermentoitu olut saatetaan kosketukseen seoksen kanssa, jossa on 1,5 - 5.0 % kalsiumkloridihydraattia ja 0,2 - 1,2 % mononatrium-fosfaattia tai monokaliumfosfaattia.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täysfermentoitu olut saatetaan kosketukseen seoksen kanssa, jossa on 1,5 - 5.0 % kalsiumklorididihydraattia, 0,1 - 0,6 % kalsiumhydroksidia ja 0,1 - 1,0 % mononatrium- tai monokaliumfos- 20 faattia.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että runsaasti entsyymiä sisältävän polymeeritaasin tilavuussuhde vähän entsyymiä sisältävän suolafaasin tilavuuteen on 0,12 - 0,15.

8. Menetelmä solunulkoisen alkalisen proteaasin talteenottamiseksi, jolloin fermentoidaan sopiva Bacillus licheniformis-kanta sopivassa ravintoaineessa täysfermen-toidun oluen tuottamiseksi, joka täysfermentoitu olut sisältää Bacillus licheniformis-soluja ja solunulkoista, 30 alkalista proteaasia, tunnettu siitä, että täys- fermentoituun olueeseen lisätään 2,5 % kalsiumklorididihydraattia ja 0,6 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia, jolloin prosenttiosuudet on laskettu paino/tilavuus-perus-teella lisäaineen painosta fermentoidun oluen tilavuuteen 35 nähden, edellä kuvattuun seokseen lisätään 3 % polyetylee- 11 > ’.j 0 u vj 15 niglykolia ja 15 % natriumsulfaattia, jolloin prosenttiosuudet perustuvat paino-osuuksiin fermentoidun oluen ja lisäaineiden kokonaisseoksen painosta, muodostetaan runsaasti alkalista proteaasia sisältävä polyetyleeniglykoli-5 faasi ja vähän alkalista proteaasia sisältävä natriumsul-faattifaasi, ja erotetaan kaksi faasia runsaasti alkalista proteaasia sisältävän tuotteen talteenottamiseksi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kalsiumklorididihydraatin ja 10 mononatrium- tai monokaliumfosfaatin lisäyksen jälkeen seos saatetaan kosketukseen 15 % natriumkloridia, 4 % po-lyetyleeniglykolia ja 5,5 % natriumsulfaattia kanssa, jolloin prosenttiosuudet perustuvat paino-osuuksiin fermentoidun oluen ja lisäaineiden kokonaisseoksen painosta.

10. Menetelmä solunulkoisen lämmönkestävän alfa- amylaasin talteenottamiseksi, jolloin fermentoidaan sopiva Bacillus licheniformis-kanta sopivassa ravintoaineessa täysfermentoidun oluen tuottamiseksi, joka täysfermentoitu olut sisältää Bacillus licheniformis-soluja ja solunul-20 koista alfa-amylaasia, tunnettu siitä, että täys-fermentoituun olueeseen lisätään 0,4 % kalsiumhydroksidia, 0,12 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia ja 4 % kal-siumklorididihydraattia, jolloin prosenttiosuudet on las-, kettu paino/tilavuus-perusteella lisäaineen painosta fer- 25 mentoidun oluen tilavuuteen nähden, edellä kuvattuun seokseen lisätään 3,5 % polyetyleeniglykolia, 10 % natriumkloridia ja 8 % natriumsulfaattia, jolloin prosenttiosuudet perustuvat paino-osuuksiin fermentoidun oluen ja lisäaineiden kokonaisseoksen painosta, muodostetaan runsaasti 30 amylaasia sisältävä polyetyleeniglykolifaasi ja vähän amy-laasia sisältävä natriumkloridi-natriumsulfaattifaasi ja erotetaan kaksi faasia runsaasti amylaasia sisältävän tuotteen talteenottamiseksi.

11. Menetelmä solunulkoisen alfa-amylaasin talteen-35 ottamiseksi, jolloin fermentoidaan sopiva Bacillus amylo- 93655 liquefaciens-kanta sopivassa ravintoaineessa täysfermen-toidun oluen tuottamiseksi, joka täysfermentoitu olut sisältää Bacillus amyloliquefaciens-soluja ja solunulkoista alfa-amylaasia, tunnettu siitä, että täysfermen-5 toituun olueeseen lisätään 3 % kalsiumklorididihydraattia, 0,3 % kalsiumhydroksidia ja 0,6 % mononatrium- tai monokaliumfosfaattia, jolloin prosenttiosuudet on laskettu paino/tilavuus-perusteella lisäaineen painosta fermentoi-dun oluen tilavuuteen nähden, edellä kuvattuun seokseen 10 lisätään 3,15 % polyetyleeniglykolia, 10 % natriumkloridia ja 13,5 % natriumsulfaattia, jolloin prosenttiosuudet perustuvat paino-osuuksiin fermentoidun oluen ja lisäaineiden kokonaisseoksen painosta, muodostetaan runsaasti amy-laasia sisältävä polyetyleeniglykolifaasi ja vähän amylaa-15 siä sisältävä natriumkloridi-natriumsulfaattifaasi ja erotetaan kaksi faasia runsaasti amylaasia sisältävän tuotteen talteenottamiseksi. tl ·' ·. *7 V "', h\ h l-' ^ ’»j O u o