CN103517920A - 抗硬化蛋白(sclerostin)抗体晶体及其制剂 - Google Patents

Abstract

本文描述抗硬化蛋白抗体晶体、制备所述抗体晶体的方法和包含所述抗体晶体的制剂。

Description

抗硬化蛋白(SCLEROSTIN)抗体晶体及其制剂

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背景

单克隆抗体广泛用作生物治疗剂，其中对满足超过100mg/ml的高浓度递送的要求日益增加。此对于通过皮下途径递送的溶解度有限的蛋白质而言提出挑战，因为优选皮下施药极限是1.2ml(Yang,M.X.,Shenoy,B.,Disttler,M.,Patel,R.,McGrath,M.,Pechenov,S.,Margolin,A.L.(2003)Crystalline monoclonal antibodies forsubcutaneous delivery,PNAS100,6934-6939)。就配制、分析、稳定性、制造和药物递送观点来看，开发高浓度制剂提出许多挑战(Shire,S.J.,Zahra,S.,Liu,J.(2004)Challenges in the development of highconcentration formulations,J.Pharm.Sci.93,1390-1402)。迄今为止，高浓度配制要求已通过添加增加稳定性、降低聚集和粘度的赋形剂，如氨基酸、糖和盐而得以满足(Shire(同上)；和Jenkins,T.W.(1998)Three solutions of the protein solubility problem,Protein Science7:376-382)。

虽然蛋白质晶体常仅被视为蛋白质结构的中间体，但其就配制观点而言也具有重要作用。呈结晶形式的蛋白质分子的熵最低，因此使其比在液态下稳定3-6kcal/mol(Dreuth,J.,Haas,C.(1992)Proteincrystals and their stability,J.Crystal Growth122,107-109)。结晶制剂的主要优势包括蛋白浓度较高、粘度较低、稳定、因浓度较高及控制释放性质而免于频繁给药(Yang(同上)；和Basu,S.K.,Govardhan,C.P.,Jung,C.W.,Margolin,A.L.(2004)Protein crystals for the delivery ofbiopharmaceuticals,Expert Opin.Biol.Thera.4,301-317)。

可操控结晶条件以针对所需控制释放性质实现不同形态(Pechenov,S.,Shenoy,B.,Yang,M.X.,Basu,S.,Margolin,A.L.(2004)Injectable controlled release formulations incorporating protein crystals,Journal of Controlled Release96,149-158)。胰岛素结晶制剂首次报道于20世纪20年代，并且当今，其不仅是由FDA批准的首个重组蛋白质治疗剂，其也是首个被批准的结晶蛋白质治疗剂(Hagedorn H.C.;Jensen,B.N.;Krarup,N.B.;Wodstrup,I.Protamine insulinate,(1936)J.Am.Med.Assn.106,177-180；Johnson,I.S.(2003)The trials andtribulations of producing the first genetically engineered drug.Nat.Rev.Drug.Discovery2,747-751；和Basu,S.K.,Govardhan,C.P.,Jung,C.W.,Margolin,A.L.(2004)Protein crystals for the delivery ofbiopharmaceuticals,Expert Opin.Biol.Thera.4,301-317)。使大分子结晶会因大分子固有的可挠性而具有挑战性，但一旦结晶，就配制及调控观点而言常常会提出挑战(Basu(同上)；和Jen,A.,Merkle,H.P.(2001)Diamonds in the rough:Protein crystals from a formulation perspective,Pharm.Res.18,1483-1488)。

发明概述

本发明涉及抗硬化蛋白免疫球蛋白G型(IgG)抗体(更特定为Ab-30和Ab-31)的晶体，其适用于用于胃肠外施用的制剂中；产生所述晶体的溶液、盐和方法；使用所述晶体制备用作药物的制剂的方法，以及使用所述制剂治疗哺乳动物(特定为人)的方法。

在本文所述的晶体或制剂中，晶体或制剂中的抗硬化蛋白IgG抗体可包含Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31中任一个的重链可变区和轻链可变区。因此，在特定实施方案中，抗体是包含以下氨基酸序列的IgG：(a)各自优选融合于适合恒定区的SEQ ID NO:5(Ab-30重链可变区)和SEQ ID NO:3(Ab-30轻链可变区)；或(b)SEQ ID NO:15(Ab-30成熟重链)和SEQ ID NO:13(Ab-30成熟轻链)；(c)各自优选融合于适合恒定区的SEQ ID NO:17(Ab-30R重链可变区)和SEQ IDNO:16(Ab-30R轻链可变区)；(d)SEQ ID NO:17(Ab-30Rm重链可变区)和SEQ ID NO:20(Ab-30Rm轻链可变区)；或(e)各自优选融合于适合恒定区的SEQ ID NO:25(Ab-31重链可变区)和SEQ ID NO:23(Ab-31轻链可变区)。在一些实施方案中，抗体包含Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的成熟重链及轻链。在一些实施方案中，抗体包含可通过使编码如本文所述的抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31中任一个的重链和/或轻链或者各自优选融合于适合恒定区的重链可变区和/或轻链可变区的cDNA在哺乳动物宿主细胞中表达而获得的氨基酸序列。优选地，抗体以10^-7M或10^-7M以下的Kd结合亲和力结合具有SEQ ID NO:1的硬化蛋白。

本文所述的抗体晶体可例如由尺寸、形状、形态、盐含量和其它性质来表征。在一些实施方案中，晶体长度在约100μM至约500μM范围内，或在约50μM至约100μM范围内，或在约1μM至约50μM范围内，任选具有呈针状、棒状、板状、块状、UFO状、足球状、叶状、小麦状、单峰状、羽毛状、椭球形(或冲浪板状)、麦杆状、菊花状或球状或其混合物的形态。在一些实施方案中，晶体长度在约1μm至约10μm范围内，或在约1μm至约15μm范围内，或在约1μm至约20μm范围内，或在约1μm至约25μm范围内，或在约1μm至约30μm范围内，或在约1μm至约35μm范围内，或在约1μm至约40μm范围内，或在约1μm至约45μm范围内，或在约5μm至约10μm范围内，或在约5μm至约15μm范围内，或在约5μm至约20μm范围内，或在约5μm至约25μm范围内，或在约5μm至约30μm范围内，或在约5μm至约35μm范围内，或在约5μm至约40μm范围内，或在约5μm至约45μm范围内，或在约50μm至约75μm范围内，或在约50μm至约80μm范围内，或在约50μm至约85μm范围内，或在约50μm至约90μm范围内，或在约50μm至约95μm范围内，或在约100μm至约150μm范围内，或在约100μm至约200μm范围内，或在约100μm至约250μm范围内，或在约100μm至约300μm范围内，或在约100μm至约350μm范围内，或在约100μm至约400μm范围内，或在约100μm至约450μm范围内。

任选地，晶体呈簇状。晶体也由x射线衍射来表征。举例而言，Ab-30晶体可呈现针状、棒状、块状或板状，或其混合物，或其它形状。大部分Ab-30晶体呈现棒状、针状或椭球状。举例而言，Ab-31晶体可呈现冲浪板状或椭球状或其它形状。

在一些实施方案中，晶体长度为约5μm，或约10μm，或约15μm，或约20μm，或约25μm，或约30μm，或约35μm，或约40μm，或约45μm，或约50μm，或约55μm，或约60μm，或约65μm，或约70μm，或约75μm，或约80μm，或约85μm，或约90μm，或约95μm，或约100μm，或约125μm，或约150μm，或约175μm，或约200μm，或约250μm，或约300μm，或约350μm，或约400μm，或约450μm，或约500μm。无论由本文所述的各种结晶条件产生的晶体的长度如何，随后可通过本领域已知方法使长度变为所需长度。举例而言，如果结晶条件产生长度为约5μm至约100μm或约5μm至约500μm或约100μm至约500μm的抗体晶体，则可将晶体研磨至较短长度，如约5μm至约50μm范围内的长度。

在一些实施方案中，改进晶体生长条件以获得所考虑的特定晶体尺寸、形状、长度和/或形态。晶体生长条件是由本领域已知的任何方法来改进，所述方法包括但不限于改变pH、改变沉淀剂的添加、改变沉淀剂的浓度、改变温度和纳入添加剂，所述添加剂包括但不限于盐(包括但不限于乙酸锌、氯化锌、硫酸锌、乙酸铵、乙酸钙、二水合乙酸锂、四水合乙酸镁、氯化镁、甲酸镁、硝酸镁、硫酸镁及其组合)、氨基酸、糖、碳水化合物、清洁剂(离子型、非离子型、两性离子型)和表面活性剂。

在一些或任何实施方案中，本文所述的抗体晶体由结晶试剂中盐的类型表征。

适用于产生Ab-30晶体的盐包括但不限于磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、四水合酒石酸钾钠、他希美特(tacsimate)、二水合柠檬酸钠、三水合乙酸钠、酒石酸二铵、丙二酸钠、乙酸盐、乙酸钙、二甲胂酸盐、CHES、硫酸锂、氯化镁、乙酸锌、氯化铯、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氟化钠、碘化钾、碘化钠、碘化铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。举例而言，用于产生Ab-30晶体的其它盐(包括水合物)可包括其它磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸盐、氟化物盐、氯化物盐、硫酸盐、酒石酸盐、他希美特盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙二酸盐、二甲胂酸盐和碘化物盐、硫氰酸盐或甲酸盐；其具有例如单价阳离子(例如钠、钾、铵)或二价阳离子(例如锌、镁)。

适用于产生Ab-31晶体的盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、乙酸钠、磷酸钾及组氨酸。举例而言，用于产生Ab-31晶体的其它盐包括氯化物盐、乙酸盐或磷酸盐；其具有例如单价(例如钠、钾、铵)阳离子。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体由可影响晶体生长和/或形状的结晶添加剂表征。适合结晶添加剂包括但不限于沉淀剂，如分子量为约200kDa至约20,000kDa，或约400kDa至约20,000kDa，或约1000kD至约10,000kD的PEG(例如PEG-3350或PEG-8000)或2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)；表面活性剂，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80；清洁剂(离子型、非离子型和两性离子型)；氨基酸、短肽、小有机分子、有机盐、核苷酸和碳水化合物。在一些实施方案中，添加剂(例如PEG、MPD、甘油)的浓度为约0.1%至约75%(w/v或v/v)，或约0.1%至50%(w/v或v/v)，或约0.1%至10%(w/v或v/v)，或约10%至约50%(w/v或v/v)，或约20%至50%(w/v或v/v)，或至少10%，或至少20%(w/v或v/v)。在一些或任何实施方案中，晶体也由产生其的方法，包括残留杂质表征。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含丁二酸、HEPES和聚乙二醇单甲醚2000的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶条件包含约0.1M至约5M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M丁二酸(或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M丁二酸)；任选进一步包含约0.1M至约5M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M HEPES(或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M HEPES)，其pH为约6至约9或约7至约8.5；且任选包含约0.1%至约60%(w/v)，或约0.1%至约1%，或约1%至约3%，或约2%至约4%，或约3%至约5%，或约20%至约40%，或约30%至约60%，或约10%至约20%，或约25%至约30%，或约15%至约25%聚乙二醇单甲醚2000(或约0.1%，或约0.5%，或约1%，或约1.5%，或约2%，或约2.5%，或约3%，或约3.5%，或约4.5%，或约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约55%，或约60%聚乙二醇单甲醚2000)。在一些实施方案中，结晶试剂包含1.0M丁二酸；0.1M HEPES(pH7)；和1%(w/v)聚乙二醇单乙醚2000。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含PEG-8000、咪唑及乙酸钙的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约1%至约5%，或约5%至约10%，或约10%至约15%，或约20%至约30%，或约25%至约50%，或约30%至约45%，或约40%至约50%PEG-8000(或约1%，或约2%，或约3%，或约4%，或约5%，或约6%，或约7%，或约8%，或约9%，或约10%，或约11%，或约12%，或约13%，或约14%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%PEG-8000)；任选进一步包含约0.05M至约5M，或约0.05M至约0.1M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M咪唑(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M咪唑)；且任选包含约0.1M至约5M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M(或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M)乙酸钙。在一些实施方案中，结晶试剂包含10%(w/v)PEG-8000、0.1M咪唑和0.2M乙酸钙。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含PEG-8000、TRIS和氯化镁的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约1%至约5%，或约5%至约10%，或约10%至约15%，或约20%至约30%，或约25%至约50%，或约30%至约45%，或约40%至约50%PEG-8000(或约1%，或约2%，或约3%，或约4%，或约5%，或约6%，或约7%，或约8%，或约9%，或约10%，或约11%，或约12%，或约13%，或约14%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%PEG-8000)；任选进一步包含约0.05M至约5M，或约0.05M至约1M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M TRIS(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M TRIS)；且任选包含约0.05M至约5M，或约0.05M至约1M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M氯化镁(或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M氯化镁)。在一些实施方案中，结晶试剂包含10%(w/v)PEG-8000、0.1M Tris和0.2M氯化镁。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含PEG-1000、磷酸钠/钾和氯化钠的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约10%至约80%，或约10%-15%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约20%至约30%，或约40%至约70%，或约50%至约80%，或约30%至约75%PEG-1000(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约55%，或约60%，或约65%，或约70%，或约75%，或约80%PEG-1000)；任选进一步包含约0.05M至约5M，或约0.05M至约1M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M磷酸钠/钾(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M磷酸钠/钾)；且任选包含约0.05M至约5M，或约0.05M至约1M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M氯化钠(或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M氯化钠)。在一些实施方案中，结晶试剂包含20%(w/v)PEG1000、0.1M磷酸钠/钾和0.2M氯化钠。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含PEG-8000、二甲胂酸盐、乙酸钙和甘油的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约1%至约5%，或约5%至约10%，或约10%至约15%，或约20%至约30%，或约25%至约50%，或约30%至约45%，或40%至约50%PEG-8000(或约1%，或约2%，或约3%，或约4%，或约5%，或约6%，或约7%，或约8%，或约9%，或约10%，或约11%，或约12%，或约13%，或约14%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%PEG-8000)；任选进一步包含约0.05M至约5M，或约0.1M至约2M，或约0.1M至约1M，或约1M至约5M，或约3M至约5M，或约2M至约4M二甲胂酸盐(或约0.05M，或约0.06M，或约0.07M，或约0.8M，或约0.9M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M二甲胂酸盐)，其pH为约5至约7，或约6至约7，或约6.5；任选包含约0.05M至约2M，或约0.5M至约1M，或约0.1M至约1M，或约5M至约1M，或约1M至约2M乙酸钙(或约0.05M，或约0.1M，或约0.12M，或约0.14M，或约0.16M，或约0.18M，或约0.2M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M乙酸钙)；且任选包含约1%至约65%(w/v)，或约1%至约10%，或约1%至约5%，或约5%至约10%，或约10%至约15%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约20%至约30%，或约35%至约50%，或约50%至约65%甘油(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%甘油)。在一些实施方案中，结晶试剂包含约14.4%(w/v)PEG-8000、0.08M二甲胂酸盐、0.16M乙酸钙和20%(w/v)甘油。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含异丙醇和磷酸钠/钾的结晶试剂的结晶条件下产生。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约100%，或约1%至约5%，或约5%至约10%，或约10%至约15%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约20%至约30%，或约35%至约50%，或约40%至约60%，或约75%至约90%，或约80%至约100%(v/v)异丙醇(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约55%，或约60%，或约65%，或约70%，或约75%，或约80%，或约85%，或约90%，或约95%，或约100%(v/v)异丙醇)；且任选包含约0.05M至约4M，或约0.05M至约1M，或约0.1M至约1M，或约5M至约1M，或约1M至约2M，或约2M至约4M，或约3M至约4M磷酸钠/钾(或约0.1M，或约0.2M，或约0.3M，或约0.4M，或约0.5M，或约0.6M，或约0.7M，或约0.8M，或约0.9M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M磷酸钠/钾)。在一些实施方案中，结晶试剂包含约19.9%异丙醇和约0.2M磷酸钠/钾。

在一些或任何实施方案中，抗体晶体在包含含选自由以下组成的组的成员的结晶试剂的结晶条件下产生：2-丙醇、磷酸氢二铵、PEG-1000、硫酸铵、酒石酸钾/钠、PEG-3000、PEG-8000、1,4-丁二醇、氯化钠、乙醇、PEG-400、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、JeffamineM-600、PEG-10,000。举例而言，在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约10%至约20%，或约1%至约10%，或约5%至约10%，或约8%至约12%，或约15%至约20%，或约20%至约35%，或约40%至约50%(v/v)2-丙醇(或约1%，或约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%(v/v)2-丙醇)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约0.05M至约10M，或约0.5M至约1M，或约1M至约5M，或约5M至约10M磷酸氢二铵(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M，或约6M，或约6.5M，或约7M，或约7.5M，或约8M，或约8.5M，或约9M，或约9.5M，或约10M磷酸氢二铵)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约10%至约80%，或约10%至约15%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约20%至约30%，或约40%至约70%，或约50%至约80%，或约30%至约75%(w/v)PEG-1000(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约55%，或约60%，或约65%，或约70%，或约75%，或约80%(w/v)PEG-1000)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约0.5M至约10M，或约0.5M至约1M，或约1M至约5M，或约5M至约10M硫酸铵(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M，或约6M，或约6.5M，或约7M，或约7.5M，或约8M，或约8.5M，或约9M，或约9.5M，或约10M硫酸铵)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约0.5M至约10M，或约0.5M至约1M，或约1M至约5M，或约5M至约10M酒石酸钾/钠(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M，或约6M，或约6.5M，或约7M，或约7.5M，或约8M，或约8.5M，或约9M，或约9.5M，或约10M酒石酸钾/钠)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约1%至约5%，或约1%至约10%，或约10%至约20%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约30%至约50%(v/v)1,4-丁二醇(或约1%，或约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%(v/v)1,4-丁二醇)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约0.5M至约10M，或约0.5M至约1M，或约1M至约5M，或约5M至约10M氯化钠(或约0.05M，或约0.1M，或约0.5M，或约1M，或约1.5M，或约2M，或约2.5M，或约3M，或约3.5M，或约4M，或约4.5M，或约5M，或约6M，或约6.5M，或约7M，或约7.5M，或约8M，或约8.5M，或约9M，或约9.5M，或约10M氯化钠)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约10%至约50%，或约10%至约20%，或约14%至约18%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约30%至约50%(v/v)乙醇(或约1%，或约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%(v/v)乙醇)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约10%至约80%，或约10%至约15%，或约15%至约20%，或约20%至约25%，或约25%至约30%，或约20%至约30%，或约40%至约70%，或约50%至约80%，或约30%至约75%(w/v)PEG-400、PEG-1000、PEG-3,000、PEG-8,000或PEG-10,000(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约55%，或约60%，或约65%，或约70%，或约75%，或约80%(w/v)PEG-400、PEG-1000、PEG-3,000、PEG-8,000或PEG-10,000)。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约10%至约50%(w/v)2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)(或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%(w/v)2-甲基-2,4-戊二醇(MPD))。

在一些实施方案中，结晶试剂包含约1%至约50%，或约1%至约10%，或约5%至约15%，或约10%至约20%，或约20%至约25%，或约20%至约30%，或约15%至25%，或约30%至约50%(v/v)JeffamineM-600(或约1%，或约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%(v/v)Jeffamine M-600)。

本文所述的另一方面提供制备本文所述的晶体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的溶液与包含适当盐(包括先前所述的任何盐)的结晶试剂组合，从而形成晶体。在本文所述的任何实施方案中，盐在结晶试剂中以约0.1M至约30M，任选约0.1M至约10M，或约1M至约10M，或约1M至约5M，或约5M至约10M的浓度存在。在一些实施方案中，所述方法包括将抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的溶液与包含丁二酸、PEG-1000、PEG-8000或异丙醇的结晶试剂组合，从而形成晶体。对于本文所述的任何晶体产生方法，在一些实施方案中，溶液中原始量抗体的至少80%(例如至少85%，或至少90%，或至少95%或95%以上)在组合步骤后结晶。可通过例如实施例5中所述的方法或本领域已知的其它方法来测定结晶抗体百分比。

制备抗体晶体的方法任选进一步包括在形成晶体后移除至少一部分结晶试剂(例如通过离心)。在一些实施方案中，接着将晶体置放于包含有机添加剂(例如乙醇或异丙醇)的溶液中。在一些实施方案中，将赋形剂(例如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇)添加至溶液中。

制备抗体晶体的方法任选进一步包括干燥已形成晶体的步骤(例如通过空气干燥晶体或使晶体暴露于真空或氮气)。

产生本文所述的抗体晶体的示例性方法包括本领域已知的蒸气扩散及分批结晶。

本文所述的另一方面为制剂(例如包含本文所述的抗硬化蛋白抗体的粉末及液体制剂)和使用本文所述的抗体晶体制备用于哺乳动物(包括人)疗法的药物(如制剂)的方法。涵盖任选使用本文所述的任何给药和时程方案实现的针对本文所述的任何病状的疗法。制剂包含具有本文所述的一种或多种性质(例如尺寸、长度、形状、盐含量、添加剂含量或其它性质)的抗体晶体，例如Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体。在一些实施方案中，制剂中的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体的长度为约20μm至约1mm，并且形状呈椭球状、棒状和针状或其混合物。在一些实施方案中，制剂中的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体的长度为约5μm至约500μm，并且形状呈椭球状、棒状和针状或其混合物。

在一些或任何实施方案中，制剂为无菌制剂且包含抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，其中至少70%(或至少75%，或至少80%，或至少85%或至少90%，或至少95%或95%以上)抗体呈结晶形式。在一些实施方案中，制剂中的抗硬化蛋白IgG抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区。

所述制剂适用于胃肠外施用，例如为无菌的；具有可为胃肠外施用所接受的内毒素含量，例如<0.25EU/mL或0.008EU/mg；且包含药学上可接受的赋形剂。所述制剂也优选具有高蛋白浓度，例如每毫升制剂至少100mg抗体，或至少120mg/ml，或至少140mg/ml，或至少160mg/ml，或至少180mg/ml，或至少200mg/ml，或至少220mg/ml，或至少240mg/ml或240mg/ml以上。在一些实施方案中，制剂包含至少140mg抗体分散于1.5ml或小于1.5ml液体中的浓度。在示例性实施方案中，所述制剂的粘度为约10cP或10cP以下，任选为8cP或8cP以下，或6cP或6cP以下。本文所用的术语“粘度”是指“绝对粘度”。绝对粘度有时称作动态或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积：绝对粘度=运动粘度×密度。运动粘度的量纲是L²/T，其中L是长度且T是时间。通常，运动粘度以厘沲(centistoke，cSt)表示。运动粘度的SI单位是mm²/s，其为1cSt。绝对粘度以厘泊(centipoise，cP)单位表示。绝对粘度的SI单位是毫帕-秒(mPa^-s)，其中1cP=1mPa^-s。

在一些或任何实施方案中，重悬液体制剂在储存和/或施药温度下的绝对粘度是15cP或15cP以下，或14cP、13cP、12cP、11cP、10cP、9cP、8cP、7cP、6cP、5cP或4cP或4cP以下。在一些或任何实施方案中，制剂可通过注射器，使用临床上可接受的力量来注射，所述注射器是20号针或更细针(例如25号针、27号针或更细针)。

在一些或任何实施方案中，制剂包含赋形剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖和山梨糖醇或其它糖或多元醇。

在一些或任何实施方案中，制剂的pH在约2至约12，或约6至约9，或约6至8.5，或约7至约7.5范围内，并且渗透重量摩尔浓度在约180至约420mOsm/kg，或约200至约400mOsm/kg，或约250至约350mOsm/kg范围内。虽然等张(250-350mOsm/kg)及生理pH(约7至7.5)为优选的，但可在这些范围以外制备制剂。

任选在胃肠外施用之前将制剂重悬于悬浮媒介物中。示例性悬浮媒介物包括但不限于谷氨酸盐、山梨糖醇、HEPES、右旋糖和水。在一些实施方案中，悬浮媒介物为右旋糖且右旋糖是以以下范围内的量提供：约1%至约10%右旋糖，或约5%至约10%右旋糖，或约1%至约5%右旋糖，或约2%至约4%右旋糖(例如约1%右旋糖、约2%右旋糖、约3%右旋糖、约4%右旋糖、约5%右旋糖、约6%右旋糖、约7%右旋糖、约8%右旋糖、约9%右旋糖，或约10%右旋糖)。在一些实施方案中，悬浮媒介物为山梨糖醇且山梨糖醇是以以下范围内的量提供：约1%至约10%山梨糖醇，或约5%至约10%山梨糖醇，或约1%至约5%山梨糖醇，或约2%至约4%山梨糖醇(例如约1%山梨糖醇、约2%山梨糖醇、约3%山梨糖醇、约4%山梨糖醇、约5%山梨糖醇、约6%山梨糖醇、约7%山梨糖醇、约8%山梨糖醇、约9%山梨糖醇或约10%山梨糖醇)。在一些实施方案中，悬浮媒介物是谷氨酸盐且谷氨酸盐是以以下范围内的量提供：1mM至约20mM谷氨酸盐，或约10mM至约15mM，或约5至约10mM，或约8mM至约12mM(或约1mM谷氨酸盐、约2mM谷氨酸盐、约3mM谷氨酸盐、约4mM谷氨酸盐、约5mM谷氨酸盐、约6mM谷氨酸盐、约7mM谷氨酸盐、约8mM谷氨酸盐、约9mM谷氨酸盐、约10mM谷氨酸盐、约11mM谷氨酸盐、约12mM谷氨酸盐、约13mM谷氨酸盐、约14mM谷氨酸盐、约15mM谷氨酸盐、约16mM谷氨酸盐、约17mM谷氨酸盐、约18mM谷氨酸盐、约19mM谷氨酸盐或约20mM谷氨酸盐)。在一些实施方案中，悬浮媒介物包含山梨糖醇与谷氨酸盐的组合(例如约1mM至约20mM谷氨酸盐(包括上文所鉴定的中间范围)和约1%至约10%山梨糖醇(包括上文所鉴定的中间范围))。在一些实施方案中，悬浮媒介物包含约10mM谷氨酸盐和约5%山梨糖醇。

在其它实施方案中，悬浮媒介物选自由以下组成的组：(1)HEPES和PEG-3350(例如0.5M HEPES和20%PEG-3350，pH7.5)；(2)Tris和PEG-3350(例如0.5M Tris和50%PEG-3350，pH8)；以及(3)Tris和PEG-3350(例如0.5M Tris和50%PEG-3350，pH8.5)。

任选地，适用于胃肠外施用(例如皮下或肌肉内)的制剂提供于容器，如单剂量小瓶、多剂量小瓶、注射器、预填充注射器或注射装置中。在一些或任何实施方案中，容器包含单剂量抗硬化蛋白抗体(例如约70至约450mg抗硬化蛋白抗体)。在一些实施方案中，所述剂量包含至少约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约280mg、约300mg、约350mg、约400mg、约420mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg，或高达约1,000mg抗硬化蛋白抗体。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约350mg、约70mg至约280mg、约70mg至约210mg、约75mg至约100mg、约100mg至约150mg、约140mg至约210mg，或约150mg至约200mg，或约280mg至约410mg的抗硬化蛋白抗体。以任何间隔，如一周多次(例如每周两次或三次)、一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述剂量。举例而言，在一些或任何实施方案中，一周两次施用剂量在约120mg至约210mg范围内的抗硬化蛋白抗体。在一些或任何实施方案中，一周两次施用约140mg剂量的抗硬化蛋白抗体。可以分次剂量形式施用本文所述的任何剂量。举例而言，可以两次注射70mg抗硬化蛋白抗体的形式施用140mg剂量的抗硬化蛋白抗体。类似地，可以两次注射105mg抗硬化蛋白抗体的形式施用210mg剂量的抗硬化蛋白抗体。

在一些或任何实施方案中，包含本文所述的抗硬化蛋白抗体晶体的制剂保留相同未结晶抗体的至少50%(或至少60%，或至少65%，或至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%)或50%以上体内活性。举例而言，在一些实施方案中，包含Ab30晶体的制剂在以与未结晶Ab30抗体相同(或类似)剂量给与且以与未结晶Ab30抗体相同(或类似)方式施用时保留至少约50%至约100%，或至少约70%至约100%，或至少80%至至少100%或至少90%至约100%(例如约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约100%)的活性度。制剂可如本文别处所述以单次剂量或多次剂量形式施用。在一些实施方案中，体内活性为全身(例如头、躯干、手臂和腿)或髋部(例如全髋和/或股骨颈)、脊椎(例如腰脊椎)、腕部、手指、胫骨和/或脚跟的骨矿物质密度相较于基线有所增加。

在一些或任何实施方案中，包含如本文所述的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体的制剂在向哺乳动物受试者施用时所介导的骨矿物质密度增加(相较于基线或对照)是由未结晶Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31抗体所介导的骨矿物质密度增加度的至少约70%(或至少约80%，或至少约90%，或至少约100%)(当以相同(或类似)剂量且通过相同(或类似)施药途径施用时；例如以本文所述的剂量，如约100mg/ml的剂量，通过皮下注射施用)。制剂可如本文别处所述以单次剂量或多次剂量形式施用。

在一个示例性实施方案中，容器可含有约70mg或75mg抗硬化蛋白抗体制剂且将适于施用约1mg/kg的单次剂量。在其它实施方案中，容器可含有约50mg，或约60mg，或约70mg，或约80mg，或约90mg，或约100mg，或约120mg，或约130mg，或约140mg，或约150mg，或约160mg，或约170mg，或约180mg，或约190mg，或约200mg，或约210mg，或约220mg，或约230mg，或约240mg，或约250mg，或约250mg至约450mg；或约280mg或290mg或300mg；或约350mg或360mg；或约420mg或430mg或440mg或450mg抗硬化蛋白抗体制剂。在任何所述实施方案中，容器可适于施用以下单次剂量：每千克体重约2至约6mg，或每千克体重约1mg至约4mg，或每千克体重约3mg至约5mg，或每千克体重约1mg至约3mg(例如每千克体重约2mg，或每千克体重约3mg，或每千克体重约4mg，或每千克体重约5mg或每千克体重约6mg)。在任何这些实施方案中，容器可包含高蛋白浓度(如本文所述的浓度)的抗体。在任何这些实施方案中，容器可包含粉末状或冻干制剂，并且用于约0.5mL-2mL体积的混悬液。

也公开使上述任何粉末状制剂重悬的方法，所述方法包括添加无菌稀释剂以实现高蛋白浓度，如本文所述的浓度。

本文也公开一种试剂盒，其包含所述容器和包含关于使用为实现每千克患者体重约0.5mg至20mg，或每千克患者体重0.5mg至10mg的剂量所需的适当体积或量的制剂的说明的标签。在一些实施方案中，制剂的剂量包含每千克体重在约0.1毫克至约50毫克(例如在约5毫克与约50毫克之间)，或约1毫克至约100毫克之间的抗硬化蛋白抗体(mg/kg)。举例而言，抗硬化蛋白抗体的剂量可包含至少约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg，或约49mg/kg，或约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg，或高达约100mg/kg。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约2mg/kg至约6mg/kg、约1mg/kg至约4mg/kg，或约3mg/kg至约5mg/kg。

本文也公开在室温和/或4℃下保持稳定至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或10年以上的制剂(例如粉末状(即冻干)和/或液体制剂)。在一些实施方案中，制剂包含Ab-30晶体且制剂在室温和/或4℃下保持稳定至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或10年以上。在一些实施方案中，Ab-30制剂在4℃和/或室温下保持稳定至少9个月。

本文也描述使用本文所述的制剂治疗任何与骨密度降低有关的病症(骨相关病症)的方法，所述病症包括但不限于软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、软骨发育不良、纤维性结构不良、高雪氏病(Gaucher′s Disease)、低磷酸盐血症性佝偻病、马方氏综合征(Marfan′ssyndrome)、多发性遗传性外生骨疣、神经纤维瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、硬化性病变、假性关节、化脓性骨髓炎、牙周病、抗癫痫药物诱发性骨质流失、原发性或继发性副甲状腺机能亢进、家族性副甲状腺机能亢进综合征、失重诱发的骨质流失、男性骨质疏松症、停经后骨质流失、骨关节炎、肾性骨营养不良、浸润性骨病症、口腔骨质流失、颌骨坏死、青少年佩吉特氏病(juvenile Paget′s disease)、肢骨纹状肥大、代谢性骨病、肥大细胞增多症、镰状细胞贫血/疾病、器官移植相关性骨质流失、肾移植相关性骨质流失、全身性红斑狼疮、强直性脊柱炎、癫痫症、青少年关节炎性皮疹、地中海贫血症、粘多糖贮积症、法布里病(Fabry Disease)、特纳氏综合征(Turner Syndrome)、唐氏综合征(Down Syndrome)、克氏综合征(Klinefelter Syndrome)、麻风病、佩氏病(Perthe′s Disease)、青少年特发性脊柱侧弯、婴儿发病型多系统发炎性疾病、温氏综合征(Winchester Syndrome)、门克斯病(Menkes Disease)、威尔逊氏病(Wilson′s Disease)、缺血性骨病(如累-卡-佩三氏病(Legg-Calve-Perthes disease)或局限性移行性骨质疏松症)、贫血病况、由类固醇所引起的病状、糖皮质激素诱发性骨质流失、肝素诱发性骨质流失、骨髓病症、坏血症、营养不良、钙缺乏症、骨质疏松症、骨质减少、酒精中毒、慢性肝病、停经后病况、慢性发炎性病状、类风湿性关节炎、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、发炎性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、月经过少、闭经、妊娠、糖尿病、甲状腺机能亢进、甲状腺病症、副甲状腺病症、库兴氏病(Cushing′sdisease)、肢端肥大症、性腺低能症、固定或废用、反射性交感神经营养不良综合征、局限性骨质疏松症、骨软化病、与关节置换术有关的骨质流失、HIV相关性骨质流失、与生长激素丧失有关的骨质流失、与囊肿性纤维化有关的骨质流失、化学疗法相关性骨质流失、肿瘤诱发的骨质流失、癌症相关性骨质流失、激素去除性骨质流失、多发性骨髓瘤、药物诱发性骨质流失、神经性厌食症、疾病相关性面骨骨质流失、疾病相关性颅骨骨质流失、疾病相关性颌骨骨质流失、疾病相关性头骨骨质流失、与老化有关的骨质流失、与老化有关的面骨骨质流失、与老化有关的颅骨骨质流失、与老化有关的颌骨骨质流失、与老化有关的头骨骨质流失或与太空旅行有关的骨质流失。

本文所述的制剂适用于改善矫形外科程序、牙科程序、植入手术、关节置换术、骨移植、骨整形手术和骨修复(如骨折愈合、骨不连愈合、骨愈合延迟愈合)和面部重建术的结果。一种或多种制剂可在程序、置换术、移植、手术或修复之前、期间和/或之后施用。

也涵盖包含本文所述的制剂的牙科植入物、基质、凝胶及创口敷料。在一些实施方案中，牙科植入物、基质、凝胶及创口敷料涂有制剂。在其它实施方案中，任选在施用牙科植入物、基质或创口敷料之前(或之后)将制剂施用于目标区域(即受试者的患病齿龈区域或患病牙周袋)。在这些实施方案中，通过本领域已知的任何方法施用制剂。在一些实施方案中，在施用牙科植入物、基质或创口敷料之前通过皮下注射向目标区域施用制剂。在其它实施方案中，在施用牙科植入物、基质或创口敷料之前通过刷涂或以其它方式涂布受影响区域来向受影响区域施用制剂。

另一方面，本文描述增加哺乳动物受试者的骨矿物质密度的方法，所述方法包括以有效增加骨矿物质密度的量向哺乳动物受试者施用本文所述的制剂。在一些实施方案中，所述方法任选增加骨形成标记的含量。在一些实施方案中，使骨矿物质密度增加至少约7天、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、3个月或3个月以上。在相关方面，本文描述一种治疗哺乳动物受试者的骨相关病症的方法，所述方法包括以有效治疗骨相关病症的量向所述受试者施用本文所述的制剂。

在一些实施方案中，所述制剂使骨形成标记的含量相较于在不存在治疗下的骨标记含量增加至少约10%。制剂可通过单次剂量或多次剂量施用。举例而言，本文所述的制剂可以短期治疗方案施用以例如增加骨形成和/或可以维持治疗方案长期施用以预防骨矿物质密度降低。

在前述任何方法中，使所述患者群体的骨形成标记的含量相较于治疗前含量或正常含量持续至少约2周、3周、30天、1个月、6周、2个月或2个月以上增加至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%或100%以上。非限制性地举例而言，截至治疗后第3周，使所述患者群体的骨形成标记含量相较于治疗前含量或正常含量增加例如至少约20%。在一个示例性实施方案中，骨再吸收的标记是I型胶原蛋白(CTX)的C-端肽的血清含量。在其它示例性实施方案中，骨形成标记是骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、骨钙化素(OstCa)和/或1型原胶原(P1NP)的N端延伸段。

另一方面，本文描述一种治疗骨相关病症的方法，其中所述方法包括以一定量向哺乳动物施用本文所述的制剂，所述量有效地使全身(例如头、躯干、手臂和腿)或髋部(例如全髋和/或股骨颈)、脊椎(例如腰脊椎)、腕部、手指、胫骨和/或脚跟的骨矿物质密度增加约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约8%、约10%、约12%、约15%、约18%、约20%、约25%或30%或30%以上。在一些实施方案中，哺乳动物受试者在治疗之前的骨矿物质密度的特征是骨质疏松或骨质减少，并且以有效改善骨矿物质密度的量及时间施用一剂或多剂制剂，从而使骨矿物质密度的特征不再是骨质疏松和/或骨质减少。举例而言，可持续初始时段施用一剂或多剂以使骨矿物质密度增加至年轻成人正常密度的2.5个或1个标准偏差内(即T计分≥-2.5或T计分≥-1)。在示例性实施方案中，初始时段是约3个月或小于3个月、6个月或小于6个月、9个月或小于9个月、1年或小于1年、18个月或小于18个月或18个月以上。所述方法可进一步包括随后任选持续至少约6个月、1年、2年或2年以上的维持时段(例如历经受试者一生)施用一种或多种有效维持骨矿物质密度的量的本文所述的制剂。

另一方面，本文描述一种通过施用本文所述的制剂来治疗哺乳动物受试者的骨相关病症的方法，其中所述制剂包含以下剂量的本文所述的抗硬化蛋白抗体：0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg，或约49mg/kg，或约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg，或高达约100mg/kg。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约2mg/kg至约6mg/kg、约1mg/kg至约4mg/kg，或约3mg/kg至约5mg/kg。

在一些实施方案中，向受试者(例如人受试者)施用约50毫克至约1,000毫克的剂量。举例而言，在一些实施方案中，制剂包含以下剂量的本文所述的抗硬化蛋白抗体：约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约280mg、约300mg、约350mg、约400mg、约420mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg，或高达约1,000mg抗硬化蛋白抗体。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约350mg、约70mg至约280mg、约70mg至约210mg、约75mg至约100mg、约100mg至约150mg、约140mg至约210mg，或约150mg至约200mg，或约280mg至约410mg。

在本文所述的任何方法中，以任何间隔，如一周多次(例如每周两次或三次)、一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述剂量。在一些或任何实施方案中，以约120mg至约210mg范围内的剂量一周两次施用包含本文所述的抗硬化蛋白抗体的制剂。在一些或任何实施方案中，以约140mg制剂的剂量一周两次施用包含本文所述的抗硬化蛋白抗体的制剂。本文所述的任何剂量可以分次剂量形式施用。举例而言，可以两次注射70mg抗硬化蛋白抗体形式施用以140mg剂量之抗硬化蛋白抗体形式包含本文所述的抗硬化蛋白抗体的制剂。类似地，可以两次注射105mg抗硬化蛋白抗体形式施用210mg剂量的抗硬化蛋白抗体。

另外，本文描述治疗患有低钙血症或高钙血症或有低钙血症或高钙血症风险的哺乳动物受试者、对以副甲状腺激素或其类似物治疗有禁忌的哺乳动物受试者或对以双膦酸盐治疗有禁忌的哺乳动物受试者的骨相关病症的方法。所述方法包括以有效增加骨形成标记的含量而不引起低钙血症或高钙血症(例如临床显著性低钙血症或高钙血症)的量向所述哺乳动物受试者施用本文所述的制剂。

另一方面，本文描述本文所述的抗硬化蛋白抗体晶体用于制备治疗骨相关病症的药物的用途，所述药物首先以第一量持续第一时段，其中所述量有效地使髋部、脊椎、腕部、手指、胫骨和/或脚跟处的骨矿物质密度增加至少约3%，继而以有效维持骨矿物质密度的第二量持续第二时段来治疗所述骨相关病症。

也提供本文所述的抗硬化蛋白抗体晶体用于治疗骨相关病症的用途，所述晶体首先以第一量持续第一时段，其中所述量有效地使髋部、脊椎、腕部、手指、胫骨和/或脚跟处的骨矿物质密度增加至少约3%，继而以有效维持骨矿物质密度的第二量持续第二时段来治疗所述骨相关病症。示例性剂量在约0.1至约20mg/kg，或约0.1至约12mg/kg，或约0.5至约12mg/kg，或约1至约10mg/kg，或约1至约8mg/kg，或约2至约8mg/kg，或约3至约8mg/kg范围内。在一些实施方案中，向受试者(例如人受试者)施用约50毫克至约1,000毫克的剂量。举例而言，在一些实施方案中，制剂包含以下剂量的本文所述的抗硬化蛋白抗体：约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约280mg、约300mg、约350mg、约400mg、约420mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg，或高达约1,000mg抗硬化蛋白抗体。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约350mg、约70mg至约280mg、约70mg至约210mg、约75mg至约100mg、约100mg至约150mg、约140mg至约210mg，或约150mg至约200mg，或约280至约410mg。

在一些或任何实施方案中，本文所述的方法或用途进一步包含施用用于治疗本文所述的骨相关病症的第二骨增强治疗剂。许多此类型治疗剂在本领域中是已知的。在一些实施方案中，骨增强治疗剂选自由以下组成的组：抗再吸收药物、骨形成剂、雌激素受体调节剂(包括但不限于雷洛昔芬(raloxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)和拉索昔芬(lasofoxifene))和对破骨细胞有抑制作用的药物。在一些实施方案中，第二骨增强剂选自由以下组成的组：双膦酸盐(包括但不限于阿仑膦酸钠(alendronate sodium)(FOSAMAX

)、利塞膦酸盐(risedronate)、伊班膦酸钠(ibandronate sodium)(BONIVA

)和唑来膦酸(zoledronicacid)(RECLAST

))、雌激素或雌激素类似物、钙源、替勃龙(Tibolone)、抑钙素、钙化三醇和激素替代疗法。在一些实施方案中，第二骨增强剂包括但不限于副甲状腺激素(PTH)或其肽片段、PTH相关蛋白(PTHrp)、骨形态生成蛋白、成骨素、NaF、PGE₂促效剂、斯达汀(statin)、抗DKK1抗体或抑制剂、抗RANK配体(RANKL)抗体(例如PROLIA)或RANKL抑制剂、雷尼酸锶(strontium ranelate)、维生素D或维生素D衍生物或其模拟物。在一些实施方案中，第二骨增强剂是Forteo

(特立帕肽(Teriparatide)或重组人副甲状腺激素类似物(1-34))或Preotact

(副甲状腺激素)。在一些或任何实施方案中，骨增强剂是Protelos

在一些实施方案中，第二骨增强剂与制剂并行施用(例如持续治疗时段内的一段时长)。在其它实施方案中，一旦抗硬化蛋白抗体的治疗时段结束即持续一段时长(即持续维持时段)施用第二骨增强剂。在所述实施方案中，持续约1周至约5年的维持时段施用第二骨增强剂。

所述方法可进一步包括在治疗时段结束后随后任选持续至少约12周、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或5年以上的维持时段(例如历经受试者一生)施用一种或多种有效维持骨矿物质密度的量的制剂，。

本发明的其它方面定义或概述于以下编号段落中：

1.一种抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区。

2.一种无菌制剂，所述制剂包含抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，其中至少70%的抗体呈结晶形式。

3.一种无菌制剂，所述制剂包含抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，其中至少90%的抗体呈结晶形式。

4.如段落2或段落3所述的制剂，其中所述IgG抗体包含SEQ IDNO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区。

5.如前述段落中任一段落所述的晶体或制剂，其中所述晶体的长度为至多500μm。

6.如前述段落中任一段落所述的晶体或制剂，其中所述晶体的形状选自由椭球状、棒状和针状组成的组。

7.如前述权利要求中任一段落所述的制剂，所述制剂包含长度为至多约500μm且形状选自由椭球状、棒状和针状或其混合物组成的组的晶体。

8.如前述段落中任一段落所述的晶体或制剂，其中所述晶体包含选自由以下组成的组的盐：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、四水合酒石酸钾钠、他希美特、二水合柠檬酸钠、三水合乙酸钠、酒石酸二铵、丙二酸钠、乙酸盐、乙酸钙、二甲胂酸盐、CHES、硫酸锂、氯化镁、乙酸锌、氯化铯、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氟化钠、碘化钾、碘化钠、碘化铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。

9.如前述段落中任一段落所述的制剂，所述制剂是冻干制剂。

10.如前述段落中任一段落所述的制剂，所述制剂是液体制剂。

11.如段落10所述的制剂，所述制剂包含每毫升制剂至少约100mg浓度的所述抗体。

12.如段落10所述的制剂，所述制剂包含分散于1.5ml或小于1.5ml液体中的至少约140mg抗体。

13.如段落11或段落12所述的制剂，所述制剂可通过具有20号针或更细针的注射器，使用临床上可接受的力量来注射。

14.如前述段落中任一段落所述的制剂，所述制剂在以相同剂量且以相同方式给与时保留含有未结晶所述抗体的液体制剂的至少50%体内活性。

15.如段落11或段落12所述的制剂，当所述制剂与含有未结晶抗体的液体制剂以相同剂量且以相同方式向所述受试者施用时，所述制剂在向哺乳动物受试者施用时所介导的骨矿物质密度增加是由含有未结晶抗体的液体制剂所介导的骨矿物质密度增加度的至少约70%。

16.如段落14或段落15所述的制剂，所述制剂以单次剂量形式施用。

17.如段落14或段落15所述的制剂，所述制剂以多次剂量形式施用。

18.如前述段落中任一段落所述的制剂，所述制剂包含至少20%PEG-3350。

19.如前述段落中任一段落所述的制剂，所述制剂包含至少10%PEG-8000。

20.如前述段落中任一段落所述的制剂，其中所述制剂的渗透重量摩尔浓度在约180至约420mOsm/kg范围内。

21.一种容器，所述容器包含用于0.5mL-2mL体积的混悬液的至少50mg如段落1所述的抗体晶体。

22.一种容器，所述容器包含如段落2或段落3所述的制剂。

23.如段落21或22所述的容器，其中所述容器为小瓶、注射器或注射装置。

24.如段落23所述的容器，其中所述注射器针为20号或更细。

25.一种使如段落9所述的制剂重悬的方法，所述方法包括使所述制剂与约0.5mL-2mL无菌悬浮媒介物接触。

26.如段落25所述的方法，其中所述悬浮媒介物选自由谷氨酸盐、山梨糖醇、HEPES、右旋糖和水或其组合组成的组。

27.一种制备抗硬化蛋白IgG抗体的晶体的方法，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区，所述方法包括任选在约6至约8的pH下，将抗体溶液与包含选自由以下组成的组的盐的结晶试剂组合，从而形成晶体：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、乙酸铵、四水合酒石酸钾钠、他希美特、二水合柠檬酸钠、三水合乙酸钠、酒石酸二铵、丙二酸钠、乙酸盐、乙酸钙、二甲胂酸盐、CHES、硫酸锂、二水合乙酸锂、氯化镁、四水合乙酸镁、甲酸镁、硝酸镁、硫酸镁、乙酸锌、氯化锌、硫酸锌、氯化铯、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氟化钠、碘化钾、碘化钠、碘化铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。

28.如段落27所述的方法，其中所述盐的浓度为约0.1M至约10M。

29.如段落27所述的方法，其中所述试剂进一步包含2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)或聚乙二醇(PEG)。

30.如段落27所述的方法，其中MPD以约0.1%至约50%的浓度存在。

31.如段落27所述的方法，其中PEG的分子量为约400kDa至约20,000kDa。

32.如段落31所述的方法，其中PEG以0.1%至约50%的浓度存在。

33.一种制备抗硬化蛋白IgG抗体的晶体的方法，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区，所述方法包括将抗体溶液与包含选自由以下组成的组的成员的结晶试剂组合，从而形成晶体：丁二酸、PEG-1000、PEG-8000和异丙醇。

34.如段落33所述的方法，其中所述结晶试剂包含

(a)约0.1M至约5M丁二酸、约0.1M至约5M HEPES和约0.1%(w/v)至约60%(w/v)聚乙二醇单甲醚2000；

(b)约1%(w/v)至约50%(w/v)PEG-8000、约0.05M至约5M咪唑和约0.1M至约5M乙酸钙；

(c)约1%(w/v)至约50%(w/v)PEG-8000、约0.05M至约5M TRIS和约0.05M至约5M氯化镁；

(d)约10%至约80%(w/v)PEG-1000、约0.05M至约5M磷酸钠/钾和约0.05M至约5M氯化钠；

(e)约1%(w/v)至约20%(w/v)PEG-8000、约0.05M至约5M二甲胂酸盐、约0.1M至约2M乙酸钙和约10%至约30%(w/v)甘油；或

(f)约10%至约30%异丙醇和约0.1M至约2M磷酸钠/钾。

35.如段落27至34中任一段落所述的方法，所述方法进一步包括在晶体形成后移除至少一部分结晶试剂。

36.如段落35所述的方法，其中通过离心移除所述部分结晶试剂。

37.如段落35所述的方法，其中将晶体置放于含有有机添加剂的溶液中。

38.如段落37所述的方法，所述方法进一步包括将赋形剂添加至溶液中。

39.如段落38所述的方法，其中所述赋形剂选自由蔗糖、海藻糖和山梨糖醇组成的组。

40.如段落37所述的方法，其中所述有机添加剂是乙醇或异丙醇。

41.如段落27或段落33所述的方法，所述方法进一步包括干燥已形成晶体。

42.如段落41所述的方法，其中通过暴露于空气，或通过暴露于真空，或通过暴露于氮气来干燥晶体。

43.如段落27或33所述的方法，其中使至少80%抗体结晶。

44.如段落27至43中任一段落所述的方法，所述方法为分批结晶方法。

45.一种抗体晶体，所述晶体由段落27或段落33所述的方法产生。

46.一种增加哺乳动物受试者的骨矿物质密度、治疗与骨密度降低有关的病症、治疗骨相关病症或改善程序、置换术、移植、手术或修复的结果的方法，所述方法包括以有效增加所述受试者的骨矿物质密度的量施用如前述段落中任一段落所述的制剂。

47.一种抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，所述抗体包含SEQ ID NO:23和25的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:33和35的轻链可变区和重链可变区。

48.如段落47所述的晶体，其中所述晶体的长度为约100μM至约500μM或约5μM至约50μM。

49.如段落47或48所述的晶体，其中所述晶体具有椭球形状。

50.如段落47至49中任一段落所述的晶体，其中所述晶体包含选自由氯化钠、氯化钾、乙酸钠、磷酸钾和组氨酸组成的组的盐。

51.一种包含如段落47所述的抗体晶体的无菌制剂，其中至少70%抗体呈结晶形式。

52.如段落47至51中任一段落所述的晶体或制剂，其中所述晶体的长度为至多约500μm。

53.如段落47至51中任一段落所述的晶体或制剂，其中所述晶体的形状选自由椭球状、棒状和针状组成的组。

54.如段落51至53中任一段落所述的制剂，所述制剂包含长度为至多约500μm且形状选自由椭球状、棒状和针状或其混合物组成的组的晶体。

55.一种制备抗硬化蛋白IgG抗体的晶体的方法，所述抗体包含SEQ ID NO:23和25的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:33和35的轻链可变区和重链可变区，所述方法包括任选在约6至约8的pH下，将抗体溶液与包含选自由磷酸钾和组氨酸组成的组的盐的结晶试剂组合，从而形成晶体。

56.如段落55所述的方法，其中所述盐的浓度为约1mM至30mM，任选为约10mM。

57.如段落55或56所述的方法，其中所述结晶试剂进一步包含聚乙二醇(PEG)。

58.如段落55所述的方法，其进一步包括在晶体形成后移除至少一部分结晶试剂。

59.如段落58所述的方法，其中通过离心移除所述部分结晶试剂。

60.如段落55所述的方法，其中将晶体置放于含有有机添加剂的溶液中。

61.如段落55所述的方法，其进一步包括将赋形剂添加至溶液中。

62.如段落61所述的方法，其中所述赋形剂选自由蔗糖、海藻糖或山梨糖醇组成的组。

63.如段落60所述的方法，其中所述有机添加剂是乙醇或异丙醇。

64.如段落55所述的方法，其进一步包括干燥已形成晶体。

65.如段落64所述的方法，其中通过暴露于空气，或通过暴露于真空，或通过暴露于氮气来干燥晶体。

66.一种抗体晶体，其由段落55至65中任一段落所述的方法产生。

67.如段落51至54中任一段落所述的制剂，所述制剂是冻干制剂。

68.如段落51至54中任一段落所述的制剂，所述制剂是液体制剂。

69.如段落68所述的制剂，所述制剂包含每毫升制剂至少约100mg浓度的所述抗体。

70.如段落51至54中任一段落所述的制剂，其中所述晶体包含选自由氯化钠、氯化钾、乙酸钠、磷酸钾和组氨酸组成的组的盐。

71.如段落51至54中任一段落所述的制剂，所述制剂包含蔗糖、海藻糖和/或山梨糖醇。

72.如段落68所述的制剂，其中所述制剂的渗透重量摩尔浓度在约180至约420mOsm/kg范围内。

73.如段落68所述的制剂，所述制剂包含分散于1.5ml或小于1.5ml液体中的至少约140mg抗体。

74.如段落69或73所述的制剂，所述制剂可通过具有20号针或更细针的注射器，使用临床上可接受的力量来注射。

75.如段落51至54及66至75中任一段落所述的制剂，所述制剂在以相同剂量且以相同方式给与时保留含有未结晶所述抗体的液体制剂的至少50%体内活性。

76.一种容器，所述容器包含用于0.5mL-2mL体积的混悬液的至少50mg或50mg以上如段落66所述的抗体晶体。

77.一种容器，所述容器包含如段落51所述的制剂。

78.如段落77所述的容器，其中所述容器为小瓶、注射器或注射装置。

79.如段落78所述的容器，其中所述注射器具有20号或更细的针。

80.一种使如段落67所述的制剂重悬的方法，所述方法包括使晶体与约0.5mL-2mL无菌悬浮媒介物接触。

81.如段落51至54及66至75中任一段落所述的制剂，所述制剂在以相同剂量且以相同方式给与时保留含有未结晶所述抗体的液体制剂的至少50%体内活性。

82.如段落51至54及66至75中任一段落所述的制剂，所述制剂在向哺乳动物受试者施用时所介导的骨矿物质密度增加是由含有未结晶所述抗体的液体制剂所介导的骨矿物质密度增加度的至少约70%，其中所述制剂与含有未结晶抗体的液体制剂以相同剂量且以相同方式向所述受试者施用。

83.如权利要求81或82所述的制剂，所述制剂以单次剂量形式施用。

84.如权利要求81或82所述的制剂，所述制剂以多次剂量形式施用。

85.一种增加哺乳动物受试者的骨矿物质密度、治疗与骨密度降低有关的病症、治疗骨相关病症或改善程序、置换术、移植、手术或修复的结果的方法，所述方法包括以有效增加所述受试者的骨矿物质密度的量施用如段落51至54及66至75中任一段落所述的制剂。

应了解，虽然在说明书中在各种情况下使用“包含”措辞呈现各种实施方案，但也可使用“由......组成”或“主要由......组成”措辞描述相关实施方案。应注意，术语“一(a)”或“一(an)”是指一个(种)或多个(种)，例如，“一个免疫球蛋白分子”应理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。因而，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。

也应了解，当描述值的范围时，所描述特征可为所述范围内所见的个别值。举例而言，“约pH4至约pH6的pH”可为但不限于pH4、4.2、4.6、5.1、5.5等及介于所述值之间的任何值。另外，“约pH4至约pH6的pH”不应解释为意指在储存期间所述制剂的pH在pH4至pH6范围内变化2个pH单位，而是意指溶液的pH可在所述范围内选出，并且在大约所述pH下，pH保持缓冲。在一些实施方案中，当使用术语“约”时，其意指所述数目加上或减去那个所述数目的5%、10%、15%或15%以上。所意图的实际变化可根据情况来确定。

在本文所述的任何范围内，范围的终点包括在所述范围内。然而，描述也涵盖排除下限和/或上限终点的相同范围。本发明的其它特征和变化将根据本申请的全文(包括附图和详述)而为本领域技术人员所显而易知且所有所述特征都意图为本发明的方面。同样地，本文所述的本发明特征可重组合成也意图为本发明的方面的其它实施方案，无论特征的组合是否在上文特定提及为本发明的一方面或实施方案。此外，唯有在本文中描述为对本发明关键的所述限制才应视为如上所指；缺少未在本文中描述为关键的限制的本发明的变化形式意图为本发明的方面。

附图简述

图1A提供各种Ab-30Rm结晶筛选的渗透重量摩尔浓度数据。图1B是显示组合物Ab-30Rm、LISS缓冲液和X%PEG-3350的渗透重量摩尔浓度数据的图。

图2显示如使用Carl Zeiss Axiocam MRc显微镜观察及记录的在第12号0.05M Tris pH8.0中且在不同PEG-3350百分比下的Ab-30Rm晶体形态。

图3A和3B是显示Ab-30晶体在各种悬浮媒介物中的溶解速率的图。

图4是显示基于晶体形态的Ab-30晶体溶解速率的图。

图5A-5F是显示基于晶体堆积的Ab-30晶体溶解速率的图。

图6A和6B是显示基于温度和晶体形态的Ab-30晶体溶解速率的图。

图7显示在施用缓冲液/媒介物单次注射或“液体”Ab-30Rm(50mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射或“晶体/结晶”Ab-30Rm(50mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射后随时间推移在腰椎处测量的大鼠骨矿物质密度(BMD)(绝对BMD(A)和从基线变化百分比(B))。BL=基线。数据显示为平均值+/-平均值标准误差(SEM)。相较于缓冲液/媒介物对照的统计显著差异由星号指示。根据ANOVA杜奈特氏检验，相较于媒介物，^*p<0.05。对于缓冲液/媒介物组，N=9。对于“液体”Ab-30Rm组，N=10。对于“晶体/结晶”Ab-30Rm组，N=10。

图8显示在施用缓冲液/媒介物单次注射或“液体”Ab-30Rm(50mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射或“晶体/结晶”Ab-30Rm(50mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射后随时间推移在腿(股骨-胫骨)处测量的大鼠骨矿物质密度(BMD)(绝对BMD(A)和从基线变化百分比(B))。BL=基线。数据显示为平均值+/-平均值标准误差(SEM)。相较于缓冲液/媒介物对照的统计显著差异由星号指示。对于图8B，根据ANOVA杜奈特氏检验，相较于媒介物，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。对于各组，N=8，对于缓冲液/媒介物组，N=9。对于“液体”Ab-30Rm组，N=10。对于“晶体/结晶”Ab-30Rm组，N=10。

图9显示在施用缓冲液/媒介物单次注射或“液体”Ab-30(100mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射或晶体制剂W35、I34、I36或W46的“晶体/结晶”Ab-30(100mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射后随时间推移在腰椎处测量的大鼠骨矿物质密度(BMD)(绝对BMD(A)和从基线变化百分比(B))。BL=基线。数据显示为平均值+/-平均值标准误差(SEM)。相较于缓冲液/媒介物对照的统计显著差异由星号指示。对于图9A，根据ANOVA杜奈特氏检验，相较于媒介物，^**p<0.01。对于图9B，根据ANOVA杜奈特氏检验，相较于媒介物，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

图10显示在施用缓冲液/媒介物单次注射或“液体”Ab-30(100mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射或晶体制剂W35、I34、I36或W46的“晶体/结晶”Ab-30(100mg/kg的100mg/ml溶液)单次注射后随时间推移在腿(股骨-胫骨)处测量的大鼠骨矿物质密度(BMD)(绝对BMD(A)和从基线变化百分比(B))。BL=基线。数据显示为平均值+/-平均值标准误差(SEM)。相较于缓冲液/媒介物对照的统计显著差异由星号指示。对于图10B，根据ANOVA杜奈特氏检验，相较于媒介物，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。对于各组，N=8。

详述

本文描述适用于供胃肠外施用的制剂中的抗硬化蛋白免疫球蛋白G型(IgG)抗体的晶体；使用Ab-30或Ab-31的所述晶体制备用作药物的制剂的方法；包含高浓度结晶抗硬化蛋白抗体的制剂；使用这些制剂进行治疗的方法；施用这些制剂(例如皮下或肌肉内)的方法；和包含这些制剂的容器或试剂盒。

I.制剂中的抗体

在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体在制剂中以以下浓度(“高蛋白浓度”)存在：至少约100mg/ml、约101mg/ml、约102mg/ml、约103mg/ml、约104mg/ml、约105mg/ml、约106mg/ml、约107mg/ml、约108mg/ml、约109mg/ml、约110mg/ml、约111mg/ml、约112mg/ml、约113mg/ml、约114mg/ml、约115mg/ml、约116mg/ml、约117mg/ml、约118mg/ml、约119mg/ml、约120mg/ml、约121mg/ml、约122mg/ml、约123mg/ml、约124mg/ml、约125mg/ml、约126mg/ml、约127mg/ml、约128mg/ml、约129mg/ml、约130mg/ml、约131mg/ml、约132mg/ml、约132mg/ml、约133mg/ml、约134mg/ml、约135mg/ml、约136mg/ml、约137mg/ml、约138mg/ml、约139mg/ml、约140mg/ml、约141mg/ml、约142mg/ml、约143mg/ml、约144mg/ml、约145mg/ml、约146mg/ml、约147mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、约150mg/ml、约151mg/ml、约152mg/ml、约153mg/ml、约154mg/ml、约155mg/ml、约156mg/ml、约157mg/ml、约158mg/ml、约159mg/ml、约160mg/ml、约161mg/ml、约162mg/ml、约163mg/ml、约164mg/ml、约165mg/ml、约166mg/ml、约167mg/ml、约168mg/ml、约169mg/ml、约170mg/ml、约171mg/ml、约172mg/ml、约173mg/ml、约174mg/ml、约175mg/ml、约176mg/ml、约177mg/ml、约178mg/ml、约179mg/ml、约180mg/ml、约181mg/ml、约182mg/ml、约183mg/ml、约184mg/ml、约185mg/ml、约186mg/ml、约187mg/ml、约188mg/ml、约189mg/ml、约190mg/ml、约191mg/ml、约192mg/ml、约193mg/ml、约194mg/ml、约195mg/ml、约196mg/ml、约197mg/ml、约198mg/ml、约199mg/ml、约200mg/ml，并且范围可达例如约400mg/ml、约390mg/ml、约380mg/ml、约370mg/ml、约360mg/ml、约350mg/ml、约340mg/ml、约330mg/ml、约320mg/ml、约310mg/ml、约300mg/ml、约290mg/ml、约280mg/ml、约270mg/ml、约260mg/ml、约250mg/ml，或约240mg/ml。涵盖以上述终点的组合为特征的任何范围，包括但不限于：约70mg/ml至约250mg/ml、约70mg/ml至约140mg/ml、约70mg/ml至约350mg/ml、约50mg/ml至约80mg/ml、约70mg/ml至约210mg/ml、约100mg/ml至约150mg/ml、约280mg/ml至约410mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约100mg/ml至约250mg/ml、约100mg/ml至约300mg/ml、约100mg/ml至约320mg/ml，或约100mg/ml至约350mg/ml。

抗硬化蛋白抗体任选配制成单次剂量(例如约70至约450mg抗硬化蛋白抗体)。在一些实施方案中，所述剂量包含至少约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约280mg、约300mg、约350mg、约400mg、约420mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg，或高达约1,000mg抗硬化蛋白抗体。也涵盖这些终点中的任何和全部之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约350mg、约70mg至约280mg、约70mg至约210mg、约75mg至约100mg、约100mg至约150mg、约140mg至约210mg，或约150mg至约200mg，或约280mg至约410mg抗硬化蛋白抗体。以任何间隔，如一周多次(例如每周两次或三次)、一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述剂量。举例而言，在一些或任何实施方案中，一周两次施用剂量在约120mg至约210mg范围内的抗硬化蛋白抗体。在一些或任何实施方案中，一周两次施用约140mg剂量的抗硬化蛋白抗体。可以分次剂量形式施用本文所述的任何剂量。举例而言，可以两次注射70mg抗硬化蛋白抗体的形式施用140mg剂量的抗硬化蛋白抗体。类似地，可以两次注射105mg抗硬化蛋白抗体的形式施用210mg剂量的抗硬化蛋白抗体，并且可以七次注射20mg抗硬化蛋白抗体形式施用140mg剂量的抗硬化蛋白抗体。

在一些实施方案中，制剂包含适于施用约1mg/kg的单次剂量的约70mg或75mg抗硬化蛋白抗体。在其它实施方案中，制剂包含约50mg，或约60mg，或约70mg，或约80mg，或约90mg，或约100mg，或约120mg，或约130mg，或约140mg，或约150mg，或约160mg，或约170mg，或约180mg，或约190mg，或约200mg，或约210mg，或约220mg，或约230mg；或约240mg，或约250mg，或约250mg至约450mg；或约280mg或290mg或300mg；或约350mg或360mg；或约420mg或430mg或440mg或450mg抗硬化蛋白抗体。在任何所述实施方案中，制剂包含适于施用以下单次剂量的量的抗硬化蛋白抗体：每千克体重约2至约6mg，或每千克体重约1mg至约4mg，或每千克体重约3mg至约5mg，或每千克体重约1mg至约3mg(例如每千克体重约2mg，或每千克体重约3mg，或每千克体重约4mg，或每千克体重约5mg或每千克体重约6mg)。

在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体为Ab-30。在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体为Ab-31。抗体Ab-30及Ab-31先前描述于美国专利申请公布号2007/0110747中，所述公布的公开内容(包括序列表)以全文引用的方式并入本文。在其它实施方案中，抗硬化蛋白抗体为Ab-30R(SEQ ID NO:16至19)或Ab-30Rm(SEQ ID NO:17及19至21)。

本文所述的抗硬化蛋白抗体以10^-6M或10^-6M以下，或10^-7M或10^-7M以下，或10^-8M或10^-8M以下，或10^-9M或10^-9M以下的Kd结合具有SEQ ID NO:1的硬化蛋白。亲和力可通过本领域已知的任何方法，包括通过如例如美国专利申请公布号2007/0110747中所述的Biacore技术和ELISA来测定。

在一些实施方案中，抗体包含抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的重链和/或轻链。抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的包括恒定区的成熟全长轻链和重链的氨基酸序列分别阐述于SEQID NO:13和15；SEQ ID NO:16和19；SEQ ID NO:20和19；以及SEQ ID NO:33和35中。编码抗体Ab-30和Ab-31的包括恒定区的全长轻链和重链的相应cDNA序列分别阐述于SEQ ID NO:12和14；SEQ ID NO:32和34中。

本文所用的术语“Ab-30抗体”是指主要由两条重链和两条轻链组成的IgG免疫球蛋白，其中重链包含融合于IgG恒定区的SEQ ID NO:5(Ab-30重链可变区)，并且轻链包含融合于轻链恒定区的SEQ ID NO:3(Ab-30轻链可变区)。优选地，Ab-30包含分别阐述于SEQ ID NO:15和13中的成熟重链和轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下重链可变区和/或轻链可变区：抗体Ab-30的融合于同种型IgG1、2、3或4的人重链恒定区的SEQ ID NO:5(Ab-30重链可变区)(例如天然、共有或经修饰，并且已知不影响结合的许多修饰在本领域中为已知的)和/或融合于人轻链恒定区的SEQ ID NO:3(Ab-30轻链可变区)(例如天然、共有或经修饰以具有已知不影响结合的许多修饰)；融合于同种型IgG1、2、3或4的人重链恒定区的SEQ ID NO:17(Ab-30R重链可变区)和/或融合于人轻链恒定区的SEQ ID NO:16(Ab-30R轻链可变区)；融合于同种型IgG1、2、3或4的人重链恒定区的SEQ IDNO:17(Ab-30Rm重链可变区)和/或融合于人轻链恒定区的SEQ IDNO:20(Ab-30Rm轻链可变区)。

本文所用的术语“Ab-31抗体”是指主要由两条重链和两条轻链组成的IgG免疫球蛋白，其中重链包含融合于IgG恒定区的SEQ ID NO:25(Ab-31重链可变区)，并且轻链包含融合于轻链恒定区的SEQ IDNO:23(Ab-31轻链可变区)。优选地，Ab-31包含分别阐述于SEQ IDNO:35和33中的成熟重链和轻链氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，抗体包含以下重链可变区和/或轻链可变区：抗体Ab-31的融合于同种型IgG1、2、3或4的人重链恒定区的SEQ ID NO:25(Ab-30重链可变区)(例如天然、共有或经修饰以具有已知不影响结合的许多修饰)和/或融合于人轻链恒定区的SEQ ID NO:23(Ab-31轻链可变区)(例如天然、共有或经修饰以具有已知不影响结合的许多修饰)。

在一些实施方案中，抗体包含可通过使编码抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的重链和/或轻链或者重链可变区和/或轻链可变区的cDNA在哺乳动物宿主细胞中表达而获得的氨基酸序列。术语“抗体”是指完整免疫球蛋白，例如在IgG的情况下是指主要由两条重链和两条轻链组成的四聚免疫球蛋白(例如优选具有全长重链和/或轻链，任选在框架区或恒定区中具有突变的保留抗硬化蛋白结合性质的嵌合、人源化或人形式)。

“分离”的抗体是指抗体(所述术语如本文所定义)已与其天然环境中的组分分离。其天然环境中的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，抗体将被纯化以(1)达到抗体重量大于95%，并且最优选重量大于99%，(2)达到足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选银染色剂测定具有均一性。分离的天然存在的抗体包括原位处于重组细胞内的抗体，因为将不存在抗体的天然环境中的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

“单克隆”抗体是指从实质上均质抗体群体获得的抗体，即相较于“多克隆”抗体，构成所述群体的个别抗体除可能以较少量存在的天然存在的可能突变外都相同，所述“多克隆”抗体是指结合不同表位的具有不同序列的抗体的混合群体。词语“人源化抗体”是指源自非人抗体(通常为啮齿动物单克隆抗体)序列的包含使得所述序列更类人的修饰的抗体。或者，人源化抗体可源自嵌合抗体。词语“人”抗体是指例如通过已知技术(如噬菌体展示)筛选人抗体基因文库而从人序列获得的抗体，或使用不产生内源性免疫球蛋白且被工程改造以含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物产生的抗体。

“免疫球蛋白G”或“天然IgG抗体”为四聚糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，各四聚物主要由两对相同多肽链组成，各对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa-70kDa)。各链的氨基端部分包括具有约100至110个或110个以上氨基酸的主要负责抗原识别的“可变”(“V”)区。各链的羧基端部分界定主要负责效应功能的恒定区。免疫球蛋白可视其重链的恒定域的氨基酸序列而归于不同类别。重链分类为μ、Δ、γ、α和ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些同种型中的若干可进一步分成子类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同同种型具有不同效应功能；例如IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。人轻链分类为κ和λ轻链。在轻链和重链内，可变区与恒定区由具有约12个或12个以上氨基酸的“J”区接合，其中重链也包括具有约10个或10个以上氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.编,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))。

术语“高变”区是指来自互补决定区或CDR的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如由Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述)。“框架”或FR残基是除高变区残基以外的那些可变区残基。

术语“变体”在连同抗体一起使用时是指在可变区或等效于可变区的部分中含有至少一个氨基酸取代、缺失或插入的抗体多肽序列，前提是变体保留所需结合亲和力或生物活性。此外，如本文所述的抗体可在恒定区中具有氨基酸修饰以改进抗体的效应功能，包括半衰期或清除率、ADCC和/或CDC活性。所述修饰可例如增强抗体的药物动力学或增强抗体的治疗有效性。参见Shields等,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001)，其以全文引用的方式并入本文。在IgG1的情况下，对恒定区(特别是铰链区或CH2区)的修饰可增加或降低效应功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其它实施方案中，修饰IgG2恒定区以减少抗体-抗原聚集体形成。在IgG4的情况下，对恒定区(特别是铰链区)的修饰可减少半抗体形成。

术语“修饰”在连同本文所述的抗体或多肽一起使用时包括但不限于一个或多个氨基酸变化(包括取代、插入或缺失)；不干扰硬化蛋白结合活性的化学修饰；通过缀合至治疗剂或诊断剂实现的共价修饰；标记(例如用放射性核种或各种酶)；共价聚合物连接，如聚乙二醇化(用聚乙二醇进行衍生化)；以及通过化学合成非天然氨基酸实现的插入或取代。在一些实施方案中，修饰的本发明多肽(包括抗体)将保留未修饰的本发明分子的结合性质。

术语“衍生物”在连同本发明的抗体或多肽一起使用时是指通过以下方式加以共价修饰的抗体或多肽：缀合至治疗剂或诊断剂、标记(例如用放射性核种或各种酶)、共价聚合物连接(如聚乙二醇化(用聚乙二醇进行衍生化))以及通过化学合成非天然氨基酸进行插入或取代。在一些实施方案中，本发明的衍生物将保留未衍生的本发明分子的结合性质。

可通过本领域已知方法使蛋白质和非蛋白质药剂缀合至抗体。缀合方法包括直接连接、通过共价连接的接头连接以及通过特定结合对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)连接。所述方法包括例如由Greenfield等,Cancer Research50,6600-6607(1990)关于阿霉素(doxorubicin)的缀合所述的方法，以及由Arnon等,Adv.Exp.Med.Biol.303,79-90(1991)和Kiseleva等,Mol.Biol.(USSR)25,508-514(1991)关于铂化合物的缀合所述的方法。

II.产生晶体、晶体制剂和组合物

通过控制多肽从水溶液或从含有有机溶剂或添加剂的水溶液的结晶来使多肽晶体生长。可控制的溶液条件包括例如溶剂蒸发速率、有机溶剂或添加剂、适当共溶质和缓冲剂的存在、pH以及温度。影响蛋白质结晶的各种因素的综合评述已由McPherson(1985,MethodsEnzymol114:112-120)发表。此外，McPherson和Gilliland(1988,JCrystal Growth,90:51-59)已汇编已结晶多肽的综合性清单以及其结晶条件。晶体和结晶配方的概要以及解析蛋白质结构的坐标库由Brookhaven National Laboratory的Protein DataBank(www.rcsb.org/pdb/；Bernstein等,1977,J Mol Biol112:535-542)维护。然而，应注意，以上引用的大部分参考文献中所报道的条件已被优化以在大多数情况下产生一些具有衍射品质的大晶体。因此，本领域技术人员应了解，这些条件可随蛋白质而变化，并且不提供大规模产生任何给定多肽的晶体的高产方法。

一般而言，通过将要结晶的多肽(即抗体)与适当水性溶剂或含有适当结晶剂(如盐或有机溶剂或添加剂(统称为“结晶试剂”))的水性溶剂组合来产生晶体。将溶剂与多肽组合且可在以实验方式测定适于诱导结晶且可为维持多肽活性和稳定性所接受的温度下进行搅动。实验室规模的结晶方法包括悬滴式蒸气扩散法、沉滴式蒸气扩散法、微量透析法、微配液法(microbatch)、油下结晶法、凝胶中结晶法和夹层液滴法。溶剂可任选包括共结晶添加剂，如沉淀剂、脂肪酸、还原剂、甘油、磺基甜菜碱、表面活性剂、多元醇、二价阳离子、辅助因子或离液剂，以及控制pH的缓冲物质。

“共结晶添加剂”包括促成多肽结晶的化合物和/或使蛋白质稳定且保护其免遭变性的化合物。共溶质的实例包括乙酸铵、氯化铵、氟化铵、甲酸铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、氯化镉、硫酸镉、乙酸钙、氯化钙、氯化铯、氯化钴、CH₃(CH₂)₁₅N(CH₃)₃ ⁺Br.^-(CTAB)、柠檬酸二铵、磷酸氢二铵、磷酸二铵、酒石酸二铵、磷酸二钾、磷酸二钠、酒石酸二钠、DL-苹果酸、氯化铁、L-脯氨酸、乙酸锂、氯化锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、氯化镁、甲酸镁、硝酸镁、硫酸镁、氯化镍、乙酸钾、溴化钾、氯化钾、柠檬酸钾、氟化钾、甲酸钾、硝酸钾、磷酸钾、酒石酸钾钠、硫酸钾、硫氰酸钾、乙酸钠、溴化钠、氯化钠、柠檬酸钠、氟化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、硫氰酸钠、丁二酸、他希美特、柠檬酸三铵、柠檬酸三锂、三甲胺N-氧化物、柠檬酸三钾、柠檬酸三钠、乙酸锌、硫酸锌以及其它用以提供共溶质的化合物。“结晶缓冲剂”包括将溶液的pH维持在所需范围内以促成多肽结晶的化合物。实例包括ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、BIS-TRIS(2,2-双-(羟甲基)-2,2′,2″-氮基三乙醇)、硼酸、CAPS(3-[环己氨基]-1-丙烷磺酸)、EPPS(HEPPS、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)、Gly-Gly(NH₂CH₂CONHCH₂COOH、甘氨酰基-甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)、咪唑、MES(2-吗啉基乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙烷磺酸))、乙酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠(sodium phosphatemonobasic)(磷酸二氢钠(sodium dihydrogen phosphate))、TAPS(N-[三-(羟甲基)甲基]-3-氨基丙烷磺酸)、TAPSO(N-[参(羟甲基)甲基]-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸)、TES(N-[参(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸)、Tricine(N-[参(羟甲基)甲基]甘氨酸)、Tris-HCl、TRIZMA(2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)以及其它用以将溶液维持在指定pH或接近指定pH的化合物。

沉淀剂的选择是影响结晶的一个因素。举例而言，可使用例如分子量为600kD至20,000kD的PEG产品。PEG-3350是通过体积排阻效应起作用的长聚合物沉淀剂或脱水剂。感胶离子盐(如硫酸铵)促进沉淀过程，短链脂肪酸(如辛酸)也如此。多离子(polyionic)物质也为适用沉淀剂。

用于供皮下注射的制剂中的抗体例如优选在生理pH范围内且在提供等张渗透重量摩尔浓度的结晶试剂中沉淀。

对添加剂、共溶质、缓冲剂等的需要以及其浓度是以实验方式确定以促成结晶。适用于多肽的结晶条件的一些实例描述于以下实施例1中。

Ab-30特别易于在多种条件下结晶。可在按比例放大条件下使各种形态的Ab-30晶体生长，其中将呈液体制剂形式的抗体添加至一定体积的已知结晶试剂中且储存于密封容器中。可在这些条件下，在室温或冷藏温度(4℃)下使Ab-30晶体生长小于24小时，并且已显示产生缓慢释放和高产率。

在工业规模过程中，导致结晶的控制沉淀可最佳通过以分批过程简单组合多肽、沉淀剂、共溶质和任选缓冲剂来进行。作为另一可选方案，可通过使用多肽沉淀物作为起始物质来使多肽结晶(“接种”)。在这个情况下，将多肽沉淀物添加至结晶溶液中且孵育直至晶体形成。也可采用替代性实验室结晶方法，如透析或蒸气扩散。McPherson(同上)和Gilliland(同上)在其对结晶文献的评述中包括适合条件的综合性清单。有时，在要使结晶的多肽交联的情况下，预定交联剂与结晶介质之间的不相容性可能需要将晶体交换至更适合溶剂系统中。

根据一些实施方案，通过以下方法制备多肽晶体、晶体制剂和组合物：首先，使多肽结晶。其次，将如本文所述的赋形剂或成分直接添加至母液中。或者，在移除母液后，将晶体悬浮于赋形剂或其它配制成分的溶液中，持续最少1小时至最多24小时。赋形剂浓度通常在约0.01%至30%w/w之间，此分别对应于99.99%至70%w/w的多肽晶体浓度。在一个实施方案中，赋形剂浓度在约0.1%至10%之间，此分别对应于99.9%至90%w/w的晶体浓度。可通过过滤、缓冲剂交换或通过离心从晶体浆料移除母液。随后，在室温下或在-20℃至25℃之间的温度下，任选用50%至100%一种或多种有机溶剂或添加剂(例如像乙醇、甲醇、异丙醇或乙酸乙酯)的溶液洗涤晶体。通过使氮气、空气或惰性气体流在晶体上通过来干燥晶体。或者，通过空气干燥或通过冻干或通过真空干燥来干燥晶体。在洗涤后进行干燥最少1小时至最多72小时，直至最终产物的水分含量低于10重量%，最优选低于5%。最后，必要时可对晶体进行微粒化。干燥多肽晶体是通过包括以下的方法来移除水、有机溶剂或添加剂或液体聚合物：用N₂、空气或惰性气体干燥；真空烘箱干燥；冻干；用挥发性有机溶剂或添加剂洗涤，继而蒸发溶剂；或在通风橱中蒸发。通常，在晶体变成自由流动粉末时实现干燥。可通过使气体流在湿晶体上通过来进行干燥。气体可选自由以下组成的组：氮气、氩气、氦气、二氧化碳、空气或其组合。可通过在适合研磨机(如喷射研磨机)中进行微粒化来进一步加工本发明的多肽晶体以实现所需粒度分布，并且可在微粒化之前或之后混合粒子或粉末制剂的组分。实现的粒子直径可在0.1微米至100微米范围内，或在0.2微米至10微米范围内，或在10微米至50微米范围内，或在0.5微米至2微米范围内。在一个实施方案中，由多肽晶体形成的粒子在0.5微米至1微米范围内，此范围是适用于例如吸入的范围。

根据一些实施方案，当制备蛋白质晶体、蛋白质晶体制剂或组合物时，在结晶期间不添加增强剂(如表面活性剂)。在结晶后将赋形剂或成分以在约1%-10%w/w之间的浓度，或者以在约0.1%-25%w/w之间的浓度，或者以在约0.1%-50%w/w之间的浓度添加至母液中。这些浓度分别对应于99%-90%w/w、99.9%-75%w/w和99.9%-50%w/w的晶体浓度。将赋形剂或成分与晶体一起在母液中孵育约0.1小时-3小时，或者进行孵育0.1小时-12小时，或者进行孵育0.1小时-24小时。

在一些或任何实施方案中，将成分或赋形剂溶解于除母液以外的溶液中，并且从母液移出蛋白质晶体且将其悬浮于赋形剂或成分溶液中。成分或赋形剂浓度和孵育时间与以上所述相同。

多肽晶体

如本文所用，“晶体”或“结晶”是指物质的一种固态形式，其不同于第二形式--非晶形固态。晶体展示包括晶格结构、特征形状和光学性质(如折射率和双折射)的特有特征。晶体由以在三维中周期性重复的样式排列的原子组成(C.S.Barrett,Structure of Metals,第2版,McGraw-Hill,New York,1952,第1页)。相反，非晶形物质为物质的非结晶固体形式，有时称为非晶形沉淀物。所述沉淀物不具有结晶固态所特有的分子晶格结构且不展示双折射或物质的结晶形式所典型的其它光谱特征。

多肽晶体是以晶格形式排列的多肽分子。多肽晶体含有在三维中周期性重复的特定多肽-多肽相互作用的样式。本发明的多肽晶体将与多肽的非晶形固体形式或沉淀物(如通过冻干多肽溶液获得的那些)相区分。

在多肽晶体中，多肽分子形成不对称单位，所述不对称单位一起排列形成对称单位。多肽晶体的对称单位的几何结构可为例如立方晶系、六方晶系、单斜晶系、斜方晶系、四方晶系、三斜晶系或三角晶系。晶体整体上的总体结构可例如呈双锥晶体、立方晶系、针状晶体、板状晶体、棱晶、长斜方形、棒状晶体或球状晶体或其组合的形式。观察到的其它形式包括块状、UFO状、足球状、叶状、小麦状、单峰状、羽毛状、麦秆状、菊花状、球状或其混合物。在一些实施方案中，观察到晶体呈簇状。具有“立方晶系”结构类别的晶体可更特定具有十八面体或十二面体晶形。晶体的直径定义为马丁直径(Martin′sdiameter)。其被测量为平行于目镜标尺的将随机定向的晶体分成两个相等投影面积的线的长度。呈如针状晶体或棒状晶体形式的晶体也具有在本文中称为晶体长度的最大尺寸。晶体也由x射线衍射表征。

测试结晶多肽的性质

在多肽晶体形成后，可对其进行各种分析以确定其多肽含量且进一步研究其物理结构。举例而言，必要时可从结晶溶液移出个别晶体且用水性或有机溶剂或添加剂洗涤，接着干燥(例如通过空气干燥、通过使惰性气体流在晶体上通过、通过冻干或通过真空)。可分离晶体，从晶体生长液滴中移出，并且接着固定以进行X射线衍射。

晶体也可由本领域所述的多种方法表征。参见例如Basu等,Expert Opin.Biol.Thera.4,301-317(2004)，其关于蛋白质晶体产生和配制程序以及用于表征晶体及其组分蛋白的分析工具的公开内容以全文引用的方式并入本文。虽然通常使用粉末X射线衍射来鉴定结晶物质，但其需要极大且完整的蛋白质晶体且不常应用于通常用于结晶制剂中的蛋白质微晶体。电子衍射和固态核磁共振(ssNMR)可应用于表征晶体。晶体大小、形状和形态(例如表面形态)可例如通过光学显微术、透射电子显微术、扫描电子显微术、原子力显微术和/或光散射(例如光子相关光谱学或DLS、低角度雷射光散射或LAALS)来检测。也可表征晶体的总表面积和孔隙度。质谱、微衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)和/或差示扫描量热法(DSC)可提供关于蛋白质一级和二级结构的信息。

作为另一实例，可从结晶溶液移出多肽晶体且洗涤或冲洗，或可从晶体移除大部分结晶溶液且用不同溶液替换。以此方式，用于结晶程序中的特定盐可在晶格中被不同盐置换。在本发明的一个实施方案中，从结晶缓冲液分离结晶的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31抗体且置放于含有钠盐、钾盐或镁盐(例如乙酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、柠檬酸钾或硫酸镁)的溶液中。对于X射线衍射，替换溶液可含有适用于测定结晶多肽的原子坐标的重原子。作为另一实施方案，可使抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31与硬化蛋白共结晶以测定Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31-硬化蛋白相互作用的详细结构。

在另一实施例中，可从结晶溶液移出多肽晶体且溶解于适当缓冲液中以进一步测试，如溶解于含有SDS的缓冲液中以通过凝胶电泳分析已结晶的多肽。通过凝胶电泳分析蛋白质的方法为熟知的且包括用银或考马斯蓝染料对凝胶进行染色，以及比较已结晶多肽的电泳迁移与具有已知分子量的多肽标记的迁移。在另一方法中，于凝胶中通过使用特异性结合多肽的经标记抗体来使多肽显现。也可使已结晶多肽溶解于适用于通过埃德曼降解(Edman degradation)进行氨基酸测序、适用于质谱、适用于其它光谱散射、折射、衍射或吸收研究或适用于通过使标记分子连接至多肽来标记多肽的缓冲液中。

III.供治疗性施用的制剂

如本文所用，本文所用的术语“组合物”意指包含至少两种组分的混合物。特定而言，本文描述包含结晶抗硬化蛋白抗体的组合物和使用结晶抗硬化蛋白抗体制备的组合物。在一些实施方案中，包含结晶抗硬化蛋白抗体或使用结晶抗硬化蛋白抗体制备的组合物或制剂适用于向有需要的患者注射和/或施用。意图出于药物目的向患者施用的组合物实质上无菌且不含有对接受者具有过度毒性或感染性的药剂。

在一些实施方案中，结晶抗硬化蛋白抗体(如结晶抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31)是以包含结晶抗硬化蛋白抗体的生理学上可接受的组合物(在本文中也称为药物组合物或药物制剂)形式施用，所述组合物是用以下一或多者配制：生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述载体、赋形剂或稀释剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒。通常，制备所述组合物需要将结晶抗硬化蛋白抗体与以下一或多者组合：缓冲剂；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽(如具有少于10个氨基酸的多肽)；蛋白质；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合剂，如EDTA、谷胱甘肽；以及其它稳定剂和赋形剂。在液体制剂中，中性缓冲生理食盐水或与非特异性血清白蛋白混合的生理食盐水为示例性适当稀释剂。根据适当行业标准，也可添加防腐剂，如苯甲醇。可用于药物制剂中的组分的其它实例呈现于Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1980和由American Pharmaceutical Association与Pharmaceutical Society of Great Britain联合出版的Handbook ofPharmaceutical Excipients中。

在一个实施方案中，意图本文所述的制剂被制备成散装制剂(bulkformulation)，并且因而，调整药物组合物的组分以使所述组分高于施药所需，并且在施药之前适当稀释。

本文所述的抗体晶体可配制成固体结晶或粉末制剂，所述制剂呈适用于储存和处理的形式以及适用于吸入或经肺施药的形式，例如呈用于制备气溶胶制剂的粉末形式。在另一个实施方案中，抗体晶体可配制成所述晶体的液体溶液或所述晶体的浆料。在另一个实施方案中，抗体晶体用于制备供治疗性施用的液体制剂，如水性制剂。

A.抗体晶体的固体制剂

抗体晶体的固体制剂包括已实质上从液体溶液分离或干燥且以游离晶体或粒子形式存在于例如粉末形式中的晶体。在本发明上下文中，术语“粉末”是指基本上干燥的粒子的集合，即水分含量低于约10重量%，或低于6重量%，或低于4重量%。多肽晶体或粉末可任选与载体或表面活性剂组合。适合载剂包括但不限于1)碳水化合物，例如单糖，如果糖、半乳糖、葡萄糖和山梨糖；2)二糖，如乳糖和海藻糖；3)多糖，如棉子糖、麦芽糊精和葡聚糖；4)醛糖醇，如甘露糖醇和木糖醇；5)无机盐，如氯化钠；以及6)有机盐，如柠檬酸钠和抗坏血酸钠。在某些实施方案中，载体选自由以下组成的组：海藻糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、肌醇、蔗糖、氯化钠和柠檬酸钠。表面活性剂可选自由脂肪酸盐、胆盐或磷脂组成的组。脂肪酸盐包括C_10-14脂肪酸的盐，如癸酸钠、月桂酸钠和肉豆蔻酸钠。胆盐包括熊脱氧胆酸盐(ursodeoxycholate)、牛磺胆酸盐(taurocholate)、甘胆酸盐(glycocholate)和牛磺二氢夫西地酸盐(taurodihydrofusidate)。在一个实施方案中，表面活性剂是牛磺胆酸盐，如牛磺胆酸钠。可用作表面活性剂的磷脂包括溶血磷脂酰胆碱。本发明的粉末制剂中结晶多肽与表面活性剂的摩尔比为例如9:1至1:9，或在5:1至1:5之间，或在3:1至1:3之间。

B.溶液或浆料中的晶体

本文也描述一种使得多肽晶体适于储存于混悬液中的方法，所述方法包括用非水性溶剂替换结晶缓冲液(母液)。在另一个实施方案中，可通过旋转出第一溶剂且使用第二有机溶剂或添加剂洗涤残余结晶固体以移除水，继而蒸发非水性溶剂来使结晶浆料变成固体。结晶治疗性蛋白质的非水性浆料尤其适用于皮下递送。

在一个所述实施方案中，将本文所述的多肽晶体与液体有机添加剂组合以实现稳定多肽晶体的目标。所述混合物可表征为包含n%有机添加剂(其中n在1与99之间)和m%水溶液(其中m是100-n)的水性-有机混合物。有机添加剂的实例包括酚化合物，如间甲酚或苯酚或其混合物；以及丙酮、甲醇、甲基异丁基酮、氯仿、1-丙醇、异丙醇、2-丙醇、乙腈、1-丁醇、2-丁醇、乙醇、环己烷、二恶烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、二氯乙烷、己烷、异辛烷、二氯甲烷、第三丁醇、甲苯、四氯化碳或其组合。

C.液体制剂

本文提供的另一实施方案是允许稳定长期储存药物组合物的水性制剂，其中结晶抗硬化蛋白抗体是用于制备药物组合物的活性成分。这个制剂部分地因其更便于患者使用而为适用的，因为这个制剂不需要任何额外步骤，如复水。如本文所用，“溶液”或“液体制剂”为含有溶解于适合溶剂或可互相混溶的溶剂的混合物中的一种或多种化学物质的液体制剂。

复原为将多肽晶体或晶体制剂或组合物溶解于适当缓冲液或药物制剂中。

重悬是指将多肽晶体悬浮于适当缓冲液或药物制剂中。在一些em

D.药物制剂的组分

本发明药物组合物是通过除如上所述的结晶抗硬化蛋白抗体之外也组合以下段落中所列的以下一种或多种类型的成分或赋形剂来制备，所述成分或赋形剂中的许多或全部获自商业供应商。本领域一般技术人员应了解，可按任何适当顺序组合来包括在组合物中的各种组分，即可首先、中间或最后添加缓冲剂，并且也可首先、中间或最后添加张力调节剂。本领域一般技术人员也将了解，这些化学物质中的一些在某些组合中可不相容，并且因此，易于用具有类似性质但在相关混合物中相容的不同化学物质替换。本领域中存在关于存在于例如用于储存药物组合物的容器和/或用于治疗性施药的装置中的赋形剂和其它成分或物质的各种组合的适合性的知识(参见例如Akers,2002,J Pharm Sci91:2283-2300)。

可包括在本文所述的制剂中的其它试剂的非限制性实例包括酸化剂(包括但不限于乙酸、冰乙酸、柠檬酸、反丁烯二酸、盐酸、稀盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸和其它适合酸)；活性成分(包括但不限于适当剂量的减轻注射部位不适的其它活性成分，以及非类固醇抗炎药，例如像缓血酸胺(tromethamine))；气溶胶推进剂(包括但不限于丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、异丁烷、丙烷和三氯单氟甲烷)；醇变性剂(包括但不限于地那铵苯甲酸盐(denatonium benzoate)、甲基异丁基酮、蔗糖八乙酸酯)；碱化剂(包括但不限于浓氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺)；防结块剂(包括但不限于硅酸钙、硅酸镁、胶体二氧化硅和滑石)；消泡剂(包括但不限于二甲聚硅氧烷和聚二甲硅氧烷)；螯合剂(chelating agent)(也称作螯合剂(sequestering agent))(包括但不限于依地酸二钠(edetatedisodium)、乙二胺四乙酸及盐和依地酸(edetic acid))；包衣剂(包括但不限于羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药物光滑剂、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡(carnauba wax)、微晶蜡和玉米蛋白(zein))；着色剂(包括但不限于焦糖、红萤素(erythrosine)(FD&C红3号)；FD&C红40号；FD&C黄5号；FD&C黄6号；FD&C蓝1号；红色、黄色、黑色、蓝色或掺合物和氧化铁)；络合剂(包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐、依地酸、龙胆酸乙醇酰胺和硫酸羟基喹啉)；干燥剂(包括但不限于氯化钙、硫酸钙和二氧化硅)；过滤助剂(包括但不限于粉末状纤维素和纯化硅藻土)；调味剂以及香料(包括但不限于大茴香脑、大茴香油、苯甲醛、肉桂油、可可、乙基香兰素、薄荷脑、水杨酸甲酯、谷氨酸单钠、橙花油、橙油、胡椒薄荷、胡椒薄荷油、胡椒薄荷醑、玫瑰油、浓玫瑰水、瑞香草酚、吐鲁香脂酊、香草、香草兰酊和香兰素)；保湿剂(包括但不限于甘油、己二醇、丙二醇和山梨糖醇)；软膏基质(包括但不限于羊毛脂、无水羊毛脂、亲水性软膏、白色软膏、黄色软膏、聚乙二醇软膏、矿脂、亲水性矿脂、白矿脂、玫瑰水软膏和角鲨烷)；增塑剂(包括但不限于蓖麻油、二乙酰化单酸甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油、单乙酰化及二乙酰化单酸甘油酯、聚乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯和柠檬酸三乙酯)；聚合物膜(包括但不限于乙酸纤维素)；溶剂(包括但不限于丙酮、醇、稀醇、水合戊烯、苯甲酸苯甲酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉籽油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮、矿物油、花生油、聚乙二醇、碳酸亚丙酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、无菌注射用水、无菌冲冼用水和纯化水)；吸附剂(包括但不限于粉末状纤维素、木炭、纯化硅藻土；以及二氧化碳吸附剂：氢氧化钡石灰和碱石灰)；硬化剂(包括但不限于氢化蓖麻油、十六十八醇、十六醇、十六基酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙烯赋形剂、十八醇、乳化蜡、白蜡和黄蜡)；栓剂基质(包括但不限于可可脂、硬脂和聚乙二醇)；悬浮剂和/或粘度增加剂(包括但不限于阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、膨润土乳浆、卡波姆(carbomer)934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、角叉菜胶、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚维酮、海藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶体二氧化硅、海藻酸钠、黄芪胶和黄原胶)；甜味剂(包括但不限于阿斯巴甜糖、葡萄糖结合剂、右旋糖、赋形剂右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨糖醇、溶液山梨糖醇、蔗糖、可压缩糖、糖粉和糖浆)；片剂粘合剂(包括但不限于阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚维酮、预胶凝淀粉和糖浆)；片剂和/或胶囊稀释剂(包括但不限于碳酸钙、磷酸氢钙、磷酸三钙、硫酸钙、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖赋形剂、果糖、高岭土、乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉、蔗糖、可压缩糖和糖粉)；片剂崩解剂(包括但不限于海藻酸、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、波拉克林钾(polacrilinpotassium)、羟基乙酸淀粉钠、淀粉和预胶凝淀粉)；片剂和/或胶囊润滑剂(包括但不限于硬脂酸钙、萝酸甘油酯、硬脂酸镁、轻质矿物油、聚乙二醇、硬脂酰反丁烯二酸钠、硬脂酸、纯化硬脂酸、滑石、氢化植物油和硬脂酸锌)；媒介物(包括但不限于调味和/或甜化(芳香酏剂、化合物苯甲醛酏剂、等醇酏剂、胡椒薄荷水、山梨糖醇溶液、糖浆、吐鲁香脂糖浆)；油性剂(杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二烷醇、橄榄油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆油、角鲨烷)；固体载体，如糖球；及无菌媒介物(抑菌注射用水、抑菌氯化钠注射液)；以及抗水剂(包括但不限于环甲聚硅氧烷、二甲聚硅氧烷和聚二甲硅氧烷)。

在本文所述的制剂中也可包括降低多肽缔合成不当或非所要三元或四元复合物倾向的聚集抑制剂。适合聚集抑制剂包括可用以在长时段(例如两年或两年以上)内降低含Fc域多肽的聚集的氨基酸L-精氨酸和/或L-半胱氨酸。制剂中聚集抑制剂的浓度可为约1mM至1M，或约10mM至约200mM，或约10mM至约100mM，或约15mM至约75mM，或约5mM至约10mM，或约5mM至约15mM，或约10mM至约20mM，或约150mM至约250mM，或约25mM。

在本文所述的制剂中也可包括抗氧化剂。意图用于制备制剂的抗氧化剂包括氨基酸，如甘氨酸和赖氨酸；螯合剂，如EDTA和DTPA；以及自由基清除剂，如山梨糖醇和甘露糖醇。其它抗氧化剂包括抗坏血酸、抗坏血基棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚和生育酚赋形剂。氮气或二氧化碳上覆层也意图用于抑制氧化。氮气或二氧化碳上覆层可在填充过程期间引入小瓶或预填充注射器的顶部空间中。

在本文所述的制剂中也可包括将药物制剂的pH维持在所需范围内的缓冲剂。当将药物组合物的pH设定在生理水平或接近生理水平时，患者在施药时的舒适性达到最大。特定而言，在某些实施方案中，药物组合物的pH在约4.0至8.4的pH范围内，或在约5.0至8.0的pH范围内，或在约5.8至7.4，或约6.2至7.0的pH范围内。应了解，可根据需要调整pH以使特定制剂中多肽的稳定性和溶解度达到最大且因而，超出生理范围，但患者仍可耐受的pH在本发明的范围内。各种适用于本发明的药物组合物中的缓冲剂包括组氨酸、碱金属盐(磷酸钠或磷酸钾或其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸、柠檬酸钾、顺丁烯二酸、乙酸铵、三-(羟甲基)-氨基甲烷(tris)、各种形式的乙酸盐和二乙醇胺、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、乳酸、磷酸、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乳酸钠溶液以及本领域已知的任何其它药学上可接受的pH缓冲剂。也可包括如盐酸、氢氧化钠或其盐的pH调整剂以获得所需pH。一种适用于将药物组合物维持在pH6.2或pH6.2附近的缓冲剂为磷酸钠。在另一实施例中，乙酸盐是在pH5下比在pH6下更有效的缓冲剂，因此相较于在pH6下，在pH5下于溶液中可使用较少乙酸盐。制剂中缓冲剂的浓度可在约1mM至约1M，或约0.1mM至约1mM，或约0.1mM至约0.5mM，或约10mM至约300mM之间。

在本文所述的制剂中也可包括聚合载体。聚合载体是用于囊封多肽晶体以递送多肽(包括生物递送)的聚合物。所述聚合物包括生物相容性及生物可降解聚合物。聚合载体可为单一聚合物类型或其可主要由各种聚合物类型的混合物组成。适用作聚合载体的聚合物包括例如聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩肽)、聚(酯)，如聚(乳酸)或PLA、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(B-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)和聚(二氧环己酮)；聚(乙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷氮烯]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐-烷基乙烯醚共聚物、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、天然及合成多肽、海藻酸盐、纤维素及纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、玻尿酸、寡糖、甘氨基聚糖、硫酸化多糖或将囊封多肽晶体的任何常规物质。

如抗微生物防腐剂的防腐剂也意图用于本文所述的制剂中。适合防腐剂包括但不限于氯化苯甲烃铵、氯化苯甲烃铵溶液、氯苄硫铵、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡锭、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠盐、苯酚、苯乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠盐、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞和瑞香草酚。包括的防腐剂的量将在0%至2%(w/v)或约1%(w/v)范围内。

也可将增加多肽的溶解度和/或使多肽在溶液中(或呈干燥或冷冻形式)时稳定的增溶剂和稳定剂(也称为乳化剂、共溶质或共溶剂)添加至药物组合物中。增溶剂和稳定剂的实例包括但不限于糖/多元醇，如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA(HSA)或重组HA)、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)；非水性溶剂，如：多元醇(例如PEG、乙二醇和甘油)、二甲亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)；氨基酸，如：脯氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、肌氨酸和γ-氨基丁酸；表面活性剂，如：吐温(Tween)-80、吐温-20、SDS、聚山梨醇酯、聚氧化乙烯共聚物；以及各种稳定性赋形剂，如：磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(例如锌、铜、钙、锰和镁)、CHAPS、单月桂酸酯、2-O-β-甘露甘油酸酯；或以下任一个：阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺(佐剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单酸甘油酯及二酸甘油酯、单乙醇胺(佐剂)、油酸(佐剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧化乙烯50硬脂酸酯、聚烃氧基(polyoxyl)35蓖麻油、聚烃氧基40氢化蓖麻油、聚烃氧基10油基醚、聚烃氧基20十六基十八基醚、聚烃氧基40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、二乙酸丙二醇酯、单硬脂酸丙二醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、单油酸脱水山梨糖醇酯、单棕榈酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡；湿润剂和/或增溶剂，如氯化苯甲烃铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡锭、多库酯钠、壬苯醇醚9、壬苯醇醚10、辛苯聚醇9、聚烃氧基50硬脂酸酯、泰洛沙泊(tyloxapol)；或以上各物的任何组合。制剂中增溶剂/稳定剂的浓度可在约0.001重量%至5重量%，或约0.1重量%至2重量%之间。在一个实施方案中，稳定剂选自脱水山梨糖醇单-9-十八烯酸酯聚(氧基-1,2-乙二基)衍生物，包括但不限于聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在单次使用或多剂量制剂中，要用于此实施方案中的聚山梨醇酯20或80的量在0.001%至1.0%(w/v)范围内，如0.005%(w/v)。在另一个实施方案中，在制剂中包括0.05mM至50mM范围内的游离L-蛋氨酸：单次使用制剂中游离L-蛋氨酸的量为0.05mM至5mM，并且多剂量制剂中游离L-蛋氨酸的量为1mM至10mM。

在本文所述的制剂中也可包括张力调节剂。张力调节剂应理解为促成溶液的渗透重量摩尔浓度的分子。优选调控药物组合物的渗透重量摩尔浓度以使活性成分的稳定性达到最大且也使患者在施药时的不适降至最小。血清为约300+/-50毫渗摩尔(milliosmolal)/千克。一般优选的是药物组合物与血清等张，即具有相同或类似渗透重量摩尔浓度，此通过添加张力调节剂来实现，因此意图渗透重量摩尔浓度将为约180至约420毫渗摩尔，然而，应了解渗透重量摩尔浓度可根据特定条件需要而较高或较低。适于调节渗透重量浓度的张力调节剂的实例包括但不限于氨基酸(例如精氨酸、半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸)、盐(例如氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠)和/或糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、甘油和甘露糖醇)。制剂中张力调节剂的浓度可在约1mM至1M，或约10mM至约200mM之间。在一个实施方案中，张力调节剂是氯化钠，浓度范围是0mM至200mM。在另一个实施方案中，张力调节剂为山梨糖醇或海藻糖且不存在氯化钠。

在某些实施方案中，制剂包含选自以下的化合物或其任何组合：1)氨基酸，如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸的盐；2)碳水化合物，例如单糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3)二糖，如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；4)多糖，如麦芽糊精、葡聚糖、淀粉、肝糖；5)醛糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇；6)葡糖醛酸、半乳糖醛酸；7)环糊精，如甲基环糊精、羟基丙基-β-环糊精；8)无机盐，如氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠的磷酸盐及钾的磷酸盐、硼酸、碳酸铵和磷酸铵；9)有机盐，如乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；10)乳化剂或增溶剂，如阿拉伯胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯以及其它脱水山梨糖醇衍生物、聚烃氧基衍生物、蜡、聚氧化乙烯衍生物、脱水山梨糖醇衍生物；11)粘度增加试剂，如琼脂、海藻酸及其盐、瓜尔胶、果胶、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纤维素及其衍生物、碳酸亚丙酯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊；以及12)特定成分，如蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨糖醇、乳糖醇、肌醇、钠盐及钾盐(如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐)、甘氨酸、精氨酸、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明胶和羟基丙基-β-环糊精。

E.缓释形式

在一些实施方案中，使用结晶抗硬化蛋白抗体的缓释形式(也称作“控制释放”形式)，包括结晶抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的缓释形式；包含结晶抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31及在所需时段内延长结晶抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的物理释放或生物可用性的物质的持续或控制释放形式。

适用于公开的方法中的缓释形式包括但不限于囊封于缓释物质(如缓慢溶解性生物相容性聚合物(例如本文所述的聚合载体、美国专利号6,036,978中所述的海藻酸盐微粒或美国专利号6,083,534中所述的聚乙烯-乙酸乙烯酯和聚(乳酸-乙醇酸)组合物))中、与所述聚合物(包括局部施用的水凝胶)混合，和/或埋入生物相容性半渗透性植入物中的结晶抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31。本发明的其它实施方案包括其它缓释形式，如聚合微粒，其中活性成分与缓释物质(如聚合物(例如PLGA))的混合物分散于连续相内，并且直接冻干所得分散液以移除水和有机溶剂或添加剂并形成所述微粒(美国专利号6,020,004，其以全文引用的方式并入本文)；可注射凝胶组合物，其包含生物可降解阴离子多糖(如海藻酸酯)、多肽和至少一种结合的多价金属离子(美国专利号6,432,449，其以全文引用的方式并入本文)；可注射生物可降解聚合基质，其具有逆向热胶凝性质且任选具有pH反应性胶凝/去胶凝(de-gelation)性质(美国专利号6,541,033和6,451,346，其以全文引用的方式并入本文)；生物相容性多元醇:油混悬液，如混悬液包含约15重量%至约30重量%范围内的多元醇的混悬液(美国专利号6,245,740，其以全文引用的方式并入本文)。所述缓释形式适于通过以储库形式施用来连续递送多肽，其中所述储库可为植入物，或可呈可注射微球体、纳米球体或凝胶形式。以上所列的美国专利(美国专利号6,036,978；6,083,534；6,020,004；6,432,449；6,541,033；6,451,346；和6,245,740)以全文引用的方式并入本文。此外，本发明的结晶多肽的持续或控制释放形式包含各种类型的缓释物质，如Kim,C.,2000,“Controlled Release Dosage Form Design”,Techonomic Publishing Co.,Lancaster Pa.中所述的那些，其包括以下各物：天然聚合物(明胶、海藻酸钠、黄原胶、阿拉伯树胶或聚葡萄胺糖)、半合成聚合物或纤维素衍生物(例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素)、以及合成聚合物(例如离子交换树脂(甲基丙烯酸、磺化聚苯乙烯/二乙烯基苯)、聚丙烯酸(卡巴浦尔(Carbopol))、聚(MMA/MAA)、聚(MMA/DEAMA)、聚(MMA/EA)、聚(乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸/乙醇酸)、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚(二甲基聚硅氧)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(乙烯/乙酸乙烯酯)、聚(乙烯/乙烯醇)、聚丁二烯、聚(酐)、聚(原酸酯)和聚(谷氨酸))。

本文公开的其它实施方案包括囊封于至少一种聚合载体中以形成微球体的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体，藉助于囊封于聚合载体基质内来保持其天然及生物活性三级结构，如美国专利号6,541,606中所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。将Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体或其制剂悬浮于溶解于有机溶剂或添加剂中的聚合载体(如PLGA)中。当储存于类似条件下时，所述囊封的Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31晶体维持抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31的生物活性的时段长于溶液中的抗体Ab-30、Ab-30R、Ab-30Rm或Ab-31。

IV.试剂盒

作为另一方面，本文描述试剂盒，其包含一种或多种本文所述的制剂，所述制剂以有助于其用于向受试者施用的方式加以包装。在一个实施方案中，所述试剂盒包括本文所述的制剂(例如包含其中所述的任何抗体的组合物)，所述制剂包装于容器(如密封瓶、容器、单次使用或多次使用小瓶、预填充注射器或预填充注射装置)中，任选有描述化合物或组合物在实施方法时的使用的标签粘贴于容器或包括在包装中。一方面，化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒可进一步包括适于根据特定施药途径施用组合物的装置。优选地，试剂盒含有描述本文所述的抗体或本文所述的制剂的使用的标签。

V.剂量

治疗本文所述的病状的方法中涉及的给药方案将由主治医师在考虑各种改变药物作用的因素下确定，所述因素为例如患者的年龄、病状、体重、性别和膳食、任何感染的严重性、施药时间以及其它临床因素。在各种方面，每日方案在每千克体重0.1mg-50mg抗体制剂的范围内(计算无化学修饰的单独蛋白质的质量)。在一些实施方案中，剂量为约0.5mg/kg至20mg/kg，或约0.5-10mg/kg，或约1mg/kg至约3mg/kg，或约1mg/kg至约4mg/kg，或约1mg/kg至约5mg/kg，或约2mg/kg至约4mg/kg，或约2mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约6mg/kg，或约3mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg，或约5mg/kg至约20mg/kg。

制剂一般胃肠外施用，例如静脉内、皮下、肌肉内、通过气溶胶施用(肺内或吸入施用)或通过长期释放储库施用。在一些实施方案中，制剂通过初始快速注射(bolus)，继而连续输注以维持药物产品的治疗性循环含量来静脉内施用。在其它实施方案中，制剂以单次剂量形式施用。本领域一般技术人员将易于优化如根据优良医学规范和个别患者的临床病状确定的有效剂量和施药方案。给药频率将视药剂的药物动力学参数和施药途径而定。最佳药物制剂将由本领域技术人员视施药途径和所需剂量来确定。参见例如Remington′s PharmaceuticalSciences,第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA18042)第1435-1712页，其公开内容以引用的方式并入本文。所述制剂可影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。视施药途径而定，可根据体重、体表面积或器官大小计算适合剂量。通常由本领域一般技术人员在不进行过度实验的情况下，尤其根据本文公开的剂量信息和测定以及在以上论述的人临床试验中所观察到的药物动力学数据来对为测定适于涉及以上提及的各制剂的治疗的剂量所需的计算进行进一步改进。适当剂量可通过使用测定血液含量剂量的确定测定法连同适当剂量-反应数据来确定。

在进行研究时，将出现关于适于各种疾病和病状的剂量和治疗持续时间的其它信息。

VI.制剂的治疗用途

本文所述的制剂适用于治疗或预防骨相关病症，如与成骨细胞或破骨细胞活性异常有关的骨相关病症。在一些实施方案中，向患有选自由以下组成的组的骨相关病症的受试者施用制剂：软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、软骨发育不良、纤维性结构不良、高雪氏病、低磷酸盐血症性佝偻病、马方氏综合征、多发性遗传性外生骨疣、神经纤维瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、硬化性病变、假性关节、化脓性骨髓炎、牙周病、抗癫痫药物诱发性骨质流失、原发性及继发性副甲状腺机能亢进、家族性副甲状腺机能亢进综合征、失重诱发的骨质流失、男性骨质疏松症、停经后骨质流失、骨关节炎、肾性骨营养不良、浸润性骨病症、口腔骨质流失、颌骨坏死、青少年佩吉特氏病、肢骨纹状肥大、代谢性骨病、肥大细胞增多症、镰状细胞贫血/疾病、器官移植相关性骨质流失、肾移植相关性骨质流失、全身性红斑狼疮、强直性脊柱炎、癫痫症、青少年关节炎性皮疹、地中海贫血症、粘多糖贮积症、法布里病、特纳氏综合征、唐氏综合征、克氏综合征、麻风病、佩氏病、青少年特发性脊柱侧弯、婴儿发病型多系统发炎性疾病、温氏综合征、门克斯病、威尔逊氏病、缺血性骨病(如累-卡-佩三氏病和局限性移行性骨质疏松症)、贫血病况、由类固醇所引起的病状、糖皮质激素诱发性骨质流失、肝素诱发性骨质流失、骨髓病症、坏血症、营养不良、钙缺乏症、骨质疏松症、骨质减少、酒精中毒、慢性肝病、停经后病况、慢性发炎性病状、类风湿性关节炎、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、发炎性结肠炎、克罗恩氏病、月经过少、闭经、妊娠、糖尿病、甲状腺机能亢进、甲状腺病症、副甲状腺病症、库兴氏病、肢端肥大症、性腺低能症、固定或废用、反射性交感神经营养不良综合征、局限性骨质疏松症、骨软化病、与关节置换术有关的骨质流失、HIV相关性骨质流失、与生长激素丧失有关的骨质流失、与囊肿性纤维化有关的骨质流失、化学疗法相关性骨质流失、肿瘤诱发的骨质流失、癌症相关性骨质流失、激素去除性骨质流失、多发性骨髓瘤、药物诱发性骨质流失、神经性厌食症、疾病相关性面骨骨质流失、疾病相关性颅骨骨质流失、疾病相关性颌骨骨质流失、疾病相关性头骨骨质流失、与老化有关的骨质流失、与老化有关的面骨骨质流失、与老化有关的颅骨骨质流失、与老化有关的颌骨骨质流失、与老化有关的头骨骨质流失和与太空旅行有关的骨质流失。

在一些实施方案中，本文所述的制剂适用于改善矫形外科程序、牙科程序、植入手术、关节置换术、骨移植、骨整形手术和骨修复(如骨折愈合、骨不连愈合、骨愈合延迟愈合)以及面部重建术中的结果。一种或多种组合物可在程序、置换术、移植、手术或修复之前、期间和/或之后施用。

制剂无需治愈受试者的病症或完全防范骨相关病症发病以实现有益生物反应。制剂可预防性使用，即意图完全或部分防范骨相关病症或其症状。制剂也可治疗性使用以完全或部分改善骨相关病症或其症状，或完全或部分防范骨相关病症或其症状进一步进展。实际上，本发明的物质及方法特别适用于增加骨矿物质密度且在一定时段内维持骨矿物质密度增加。

可历经例如约1周至约18个月(例如约1个月至约12个月、约1个月至约9个月，或约1个月至约6个月，或约1个月至约3个月)的治疗时段一或多次施用本文所述的制剂。在一些实施方案中，历经例如约1个月至约12个月(例如约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月，或约11个月)的治疗时段向受试者施用一剂或多剂本文所述的制剂。在一些实施方案中，向受试者施用一剂或多剂制剂以维持骨矿物质密度。本文所用的术语“维持骨矿物质密度”意指在约6个月、约9个月、约1年、约18个月、约2年期间，或在患者一生中由初始剂量的制剂所致的骨矿物质密度增加不下降超过约1%至约5%。应了解，患者可需要增加骨密度与维持骨密度的交替治疗阶段。

另外，视针对特定受试者选择的治疗方案而定，施用多剂制剂或分开施用各剂量可为有利的。可历经一年或一年以内的时段(例如9个月或9个月以内、6个月或6个月以内，或3个月或3个月以内)周期性施用制剂。就此而言，制剂可每约3天、或约7天、或2周、或3周、或4周、或5周、或6周、或7周、或8周、或9周、或10周、或11周、或12周、或13周、或14周、或15周、或16周、或17周、或18周、或19周、或20周、或21周、或22周、或23周、或6个月、或12个月向人施用一次。

VII.监测疗法

可使用单能及双能X射线吸收测定术、超声波、计算机断层摄影术、放射摄影术和磁共振成像来测量抗硬化蛋白抗体介导的骨矿物质含量或骨密度增加。也可由体重或通过使用其它方法计算骨质量(参见Guinness-Hey,Metab.Bone Dis.Relat.Res.,5:177-181(1984))。在本领域中使用动物模型来测试药物组合物和方法对模拟人疾病(如骨质疏松症和骨质减少)状况的参数(例如骨质流失、骨再吸收、骨形成、骨强度或骨矿化)的影响。所述模型的实例包括切除卵巢的大鼠模型(Kalu,Bone和Mineral,15:175-192(1991)；Frost和Jee,Bone和Mineral,18:227-236(1992)；以及Jee和Yao,J.Musculoskel.Neuron.Interact.,1:193-207(2001))。测量本文所述的抗硬化蛋白抗体活性的方法也可用于测定其它硬化蛋白抑制剂的功效。

在人中，临床上可使用双重x射线吸收测定术(DXA)测定例如髋部和脊椎的骨矿物质密度。其它技术包括定量计算机断层摄影术(QCT)、超声波检查术、单能x射线吸收测定术(SXA)和放射摄影吸收测定术。常用于测量的中心骨骼部位包括脊椎和髋部；周边部位包括前臂、手指、腕部和脚跟。除超声波检查术外，American MedicalAssociation指示BMD技术通常涉及使用x射线且基于辐射衰减取决于辐射路径中组织的厚度和组成的原理。所有技术都涉及将结果与标准数据库比较。

或者，可通过监测骨标记含量来确定对一种或多种硬化蛋白结合剂的生理反应。骨标记是在骨重塑过程期间产生的产物且由骨、成骨细胞和/或破骨细胞释放。骨再吸收和/或骨形成“标记”含量波动暗示骨重塑/塑造变化。International Osteoporosis Foundation(IOF)建议使用骨标记来监测骨密度疗法(参见例如Delmas等,Osteoporos Int.,增刊6:S2-17(2000)，其以引用的方式并入本文)。指示骨再吸收(或破骨细胞活性)的标记包括例如C端肽(例如1型胶原蛋白的C端端肽(CTX)或血清交联C端肽)、N端肽(1型胶原蛋白的N端端肽(NTX))、脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)、吡啶啉、尿羟脯氨酸、半乳糖苷基羟基赖氨酸和抗酒石酸盐酸性磷酸酶(例如血清抗酒石酸盐酸性磷酸酶亚型5b)。骨形成/矿化标记包括但不限于骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、由I型原胶原的N端及C端延伸段释放的肽(P1NP、PICP)和骨钙化素(OstCa)。若干试剂盒可商购获得以侦测且定量临床样本(如尿和血液)中的标记。

VIII.组合疗法

相对于单独使用治疗相关剂量的各药剂，通过组合两种或更多种靶向相同病原体或生物化学路径的药剂来治疗病变有时会产生更大功效且使副作用减少。在一些情况下，药物组合的功效为累加功效(组合的功效近似等于单独各药物的作用总和)，但在其它情况下，作用可为协同作用(组合的功效大于单独给与的各药物的作用总和)。如本文所用，术语“组合疗法”意指可以同时方式(例如并行)递送两种化合物，或其中首先施用一种化合物，继而施用第二药剂(例如依序)。所需结果可为剂量接受者的一种或多种症状主观减轻或可客观鉴定改善。

在一些实施方案中，制剂连同用于治疗骨矿物质密度降低的照护标准治疗剂一起施用。如本文所用，术语“照护标准”是指为临床医师所公认用于诊断患有某一类型疾病的某一类型患者的治疗。在一些实施方案中，照护标准治疗剂选自由以下组成的组：抗再吸收药物、骨形成剂、雌激素受体拮抗剂(包括但不限于雷洛昔芬、巴多昔芬和拉索昔芬)以及对破骨细胞有刺激作用的药物。在一些实施方案中，抗再吸收药物包括但不限于双膦酸盐(包括但不限于阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐和唑来膦酸盐(zoledronate))、雌激素或雌激素类似物、选择性雌激素受体调节剂(SERM)及钙源、替勃龙、抑钙素、钙化三醇和激素替代疗法。在一些实施方案中，骨形成剂包括但不限于副甲状腺激素(PTH)或其肽片段、PTH相关蛋白(PTHrp)、骨形态生成蛋白、成骨素、NaF、PGE₂促效剂、斯达汀、抗DKK抗体和RANK配体(RANKL)。在一些实施方案中，对破骨细胞具有刺激作用的药物包括但不限于维生素D或维生素D衍生物或其模拟物。

在一些实施方案中，在受试者对本文所述的照护标准治疗剂治疗有禁忌时向所述受试者施用制剂。

实施例

实施例1–Ab-30的结晶

在多种条件下使抗体Ab-30结晶，所述抗体由两条成熟重链(SEQID NO:15)和两条成熟轻链(SEQ ID NO:13)组成且由编码这些链中的每一个的DNA重组产生。

使用结晶筛选(索引筛选(Index Screen)；Hampton Research,AlisoViejo,Calif.)使Ab-30结晶，所述筛选采用称为“悬滴式”蒸气扩散的大分子结晶方法。将主要由多肽样本与结晶试剂(“结晶缓冲液”或“母液”)的混合物组成的液滴置于硅烷化盖玻片的下侧上，并且接着用油脂密封盖玻片上的液滴且置放于引起蒸气平衡的具有试剂的液体储槽的通常24孔VDX盘上方。为实现平衡，水蒸气在液滴与盘的孔中的1ml储槽溶液之间进行交换。随着水离开液滴，多肽样本的相对浓度不断增加，此可最终导致过饱和。多肽样本的浓度增加为结晶发生所必需。通常，液滴含有的试剂浓度低于储槽，并且通常，液滴含有的试剂浓度是储槽中浓度的一半，因为等体积样本与试剂混合形成液滴。

在这些实验中，液滴中的初始多肽浓度通常为0.1mg/mL-300mg/mL或在3mg/mL-100mg/mL之间。

在24孔VDX聚丙烯组织培养盘中建立结晶筛选。VDX盘中的各位置都含有1mL的试剂储槽，其中各孔中的试剂储槽组成与其它孔中的试剂储槽组成不同，以形成一系列不同结晶缓冲液条件。将1μL-10μL各多肽浓度的多肽溶液添加至1μl-10μl储槽溶液中以形成液滴。在4℃下或在环境室温下孵育各盘。

结晶条件：使用复数种试剂在4℃和室温下观察Ab-30结晶(参见下表1-8)。

表1.在室温下一天后产生Ab-30晶体的结晶条件

表2.在4℃下一天后产生Ab-30晶体的结晶条件

表3.在室温下两天后产生Ab-30晶体的结晶条件

表4.在4℃下两天后产生Ab-30晶体的结晶条件

表5.在室温下产生Ab-30晶体的其它可商购获得的筛选条件

表6.在4℃下产生Ab-30晶体的其它可商购获得的筛选条件

表7.在室温下产生Ab-30晶体的其它结晶条件

表8.在4℃下产生Ab-30晶体的其它结晶条件

表8.在室温下在索引第36号和添加剂(盐)下产生Ab-30晶体的其它结晶条件

表9.在室温下使用索引第36号和添加剂(氨基酸)产生Ab-30晶体的其它结晶条件

表10.在室温下使用索引第36号和添加剂(低温保护剂)产生AB-30晶体的其它结晶条件

表11.在室温下使用索引第36号和添加剂(聚山梨醇酯20的百分比不同)产生Ab-30晶体的其它结晶条件

可在按比例放大条件下使各种形态的Ab-30晶体生长，其中将呈液体制剂形式的抗体添加至一定体积的已知结晶试剂中且储存于密封容器中。可在这些条件下，在室温或冷藏温度(4℃)下使Ab-30晶体生长小于24小时，并且已显示产生缓慢释放和高产率。

在表1-11中提供的一些条件下产生的Ab-30晶体已显示可经受在4℃下储存超过6个月的时段，并且可经受在室温(RT)下储存21个月(索引第36号和不同浓度的低温保护剂)、22个月(索引第36号和氨基酸)、32个月(索引第36号和盐)以及25个月(索引第36号和不同百分比的聚山梨醇酯20)的时段。产生所述Ab-30晶体的示例性结晶条件和在4℃及室温下的储存时长分别提供于下表12和13中。

表12.

表13.

上述实施例表明Ab-30可在多种结晶条件下结晶，但并非在所测试的每一条件下都形成晶体。在许多不同可商购获得(即HamptonResearch,Emerald Bioscience)及专有的筛选中测试约2000种结晶条件，但仅约775种条件产生Ab-30晶体。

实施例2—Ab-30的分批结晶

在1.5mL微量离心管中，将50μL75.7mg/mL Ab-30与50μL结晶条件(GRAS筛选、索引筛选、Wizard I筛选、Wizard II筛选和Wizard III筛选)混合以产生总共100μL批料体积。将40μLAb-30(75.7mg/mL)与20μL低离子浓度筛选缓冲液及50μL4%PEG-3350混合以产生总共110μL批料体积。所用结晶条件如下表14中所述。

表14.

Ab-30在室温下于总共104种条件下分批结晶，表示出40%-92%的产率百分比范围(参见表14)。所有这些条件都在室温下通过悬滴式蒸气扩散实现晶体命中(hit)，但其并非都以分批形式结晶。在104种分批结晶条件中，仅有8种条件在第一天于室温下的产率百分比大于85%(即INDX第34号、WIZ I第46号、WIZ II第43号、WIZ II第14号、WIZ III第35号和GRAS 1)。在第一天所实现的Ab-30晶体最高产率是92.195%(WIZ第35号)。晶体产率基于晶体生长条件而变化。虽然Ab-30在室温和4℃下均会结晶，但仅基于在室温下的结晶效率考虑室温晶体命中。

实施例3—Ab-30的分批结晶、悬浮和溶解研究

在室温下，于1.5ml微量离心管中将200μl Ab-30(75.7mg/ml)与200μl结晶条件(如下表15中所述)混合。在添加结晶条件后涡旋所述管，并且目视检查澄清度、乳浊度或沉淀物形成。在第0天和第1天用装备有Axiocam软件的Zeiss显微镜获取所测试的各结晶条件的各微量离心管的照片。记录在各结晶条件下产生的晶体的形态。除研究4(基于晶体堆积的晶体溶解，其中在第8天收集晶体)外，在第3天收集晶体以进行所有三项溶解速率研究，而与个别条件达到最高产率百分比所花费的时间无关。

以10,000rpm短暂离心晶体15分钟且移除上清液并将晶体重悬于不同媒介物(如下表15中所述)中。在实验过程期间将微量离心管储存于室温下。使用UV光谱仪在A280nm下测量产率百分比。在台式离心机上以10,000rpm短暂离心微量离心管15分钟。在水中进行1:100稀释且在UV光谱仪上读取A280。

表15.

晶体溶解和悬浮媒介物：在室温下进行研究1-4的溶解速率实验。将用星号(^*)标记的研究5溶解速率实验样本储存于4℃下且将用双星号(^**)标记的研究5样本储存于37℃下。在1号和2号研究中，晶体生长条件保持恒定，所述条件为Hampton Research索引筛选第36号，并且将晶体重悬于不同媒介物中以监测晶体溶解速率。选择索引第36号作为生长条件，因为其极易于形成晶体。在3号研究中，晶体生长条件和形态可变，但所有条件的晶体悬浮媒介物PBS是一致的。

A52SuT(10mM乙酸盐、9%蔗糖、0.004%聚山梨醇酯20，pH5.2)、生理食盐水和PBS在溶解速率方面显示最大差异。水和右旋糖在42天后在相较于T=0时未显示较大溶解活性。因此，水和右旋糖是洗涤Ab-30晶体而不使大量晶体在洗涤步骤期间损失的理想媒介物。低离子浓度筛选缓冲液(0.05M HEPES(pH7.5)、20%PEG-3350；0.05MTris(pH8.0)、20%PEG-3350；0.05M Tris(pH8.5)、20%PEG-3350)历经一个月显示实际上接近于基线的极缓慢溶解速率。晶体在这些缓冲液中缓慢溶解的一种可能性可能归因于晶体由20%PEG-3350包覆。10mM谷氨酸盐、5%山梨糖醇(pH4.8)及10mM谷氨酸盐、5%山梨糖醇(pH5.0)在1号研究中显示类似于水和右旋糖溶解速率的约1mg/ml溶解速率。A52SuT、生理食盐水、右旋糖、PBS和10mM谷氨酸盐缓冲液是等张及可注射的(参见图3和4)。

晶体溶解和晶体形态：在3号研究中，晶体生长条件及形态不同，而所有条件的悬浮媒介物PBS都相同。考虑总共四种不同形态：椭球状晶体、棒状晶体、沉淀和微小椭球状晶体。晶体溶解的毫克/毫升数基于晶体形态而不同，但总体上所有形态都遵循类似溶解样式，其中在第12天达到峰值溶解。基于所得溶解曲线，可得出结论：晶体溶解视晶体形态、晶体大小、晶体生长条件和甚至晶体堆积而定。

晶体溶解和晶体堆积：在4号研究中，晶体生长条件不同，而所有条件的晶体形态和悬浮媒介物PBS都一致。使Ab-30在索引36以及不同添加剂(10mM盐)中生长。这个研究的数据表明添加剂中的不同阳离子和阴离子对晶体堆积有影响(图5A-5F)。在所有添加剂中，锌盐显示最小溶解作用，从而表明可添加锌以实现缓释作用。氯化锌相较于其它锌盐显示最小溶解作用，而硝酸镁在镁盐中显示最小溶解作用。

基于温度和晶体形态的晶体溶解：在5号研究中，晶体生长条件、晶体形态、晶体储存温度不同，但所有条件的悬浮媒介物右旋糖保持相同。将晶体重悬于右旋糖中，储存于4℃和37℃下且监测溶解速率9天。如所预期，晶体溶解速率主要并非取决于温度(除WIZ III第35号外，其中在37℃下的溶解速率高于在4℃下的溶解速率)或形态。实际上，溶解速率与晶体生长条件有关。对于特定晶体生长条件，溶解速率的趋势类似，而与温度无关(图6A和6B)。此对于在不同条件下生长且在不同温度下重悬于相同或不同悬浮媒介物中的所有Ab-30晶体而言未必如此。

概括而言，晶体溶解取决于一种以上因素，即晶体生长溶液及其组分、晶体形状、大小、长度、晶体形态、晶体悬浮媒介物、温度和/或晶体堆积。一种或多种上述因素可以各种组合进行变化以配制不同种类(液体、固体或浆料)的制剂。

实施例4-测定Ab-30晶体的蛋白质含量

盐常常存在于样本或反萃溶剂(countersolvent)中，并且这些盐在试图结晶期间可形成晶体。一种区分盐晶体生长与相关目标晶体生长的普遍方法是暴露于染色染料，如由Hampton Research(Laguna Niguel,Calif)制造的IZIT^TM。IZIT^TM染料将蛋白质晶体染成蓝色，但不对盐晶体进行染色。

通过染色(IZIT^TM染料；Hampton Research)将在15%v/v他希美特(pH7.0)、0.1M HEPES(pH7.0)、2%w/v聚乙二醇8000的结晶条件下产生的Ab-30晶体确定为蛋白质晶体且记录为结晶命中。

实施例5-结晶抗硬化蛋白抗体制剂

这个实施例说明抗硬化蛋白抗体晶体的一种制剂，所述制剂包含高浓度蛋白质，具有缓慢释放潜能，使用包含分别阐述于SEQ ID NO:19和21中的Ab-30Rm重链和轻链的抗硬化蛋白抗体。

简而言之，使用低离子浓度筛选(Harris等,(1995)Crystallizationof intact monoclonal antibodies,Proteins:Structure,Function andGenetics23,285-289；Hampton Research,Aliso Viejo,CA)来筛选Ab-30Rm的总共108种结晶条件。基于pH、渗透重量摩尔浓度、可注射成分和结晶效率百分比缩减至两种条件供制剂用。成功产生适于在动物研究中皮下注射的Ab-30Rm晶体制剂。

材料与方法

悬滴式蒸气扩散与目测蛋白质晶体命中：

利用悬滴式蒸气扩散法，使用具有密封剂的VDX24孔培养盘(Hampton Research,Aliso Viejo,CA(HR3-170))使Ab-30Rm晶体生长。将1ml脱水剂24%PEG-3350吸取于孔溶液中。将4μl含4mg/mlAb-30Rm的A5SuT(10mM乙酸钠(来自乙酸)、9%蔗糖、0.004%聚山梨醇酯20，pH5.0)+2μl低离子浓度缓冲液+5μl x%PEG-3350添加至盖玻片(HR3-233，22mm直径×0.22mm厚度的硅化玻璃盖玻片：Hampton Research,Aliso Viejo,CA)上，达到最终体积11μl。反转盖玻片而不混合液滴且置放于已有间隙的密封剂上以形成气密性密封。在悬滴式蒸气扩散实验中，当在液滴与孔溶液之间达到平衡时形成晶体。

使用低离子浓度筛选(LISS)(HR2-120，Hampton Research)建立总共108种条件。LISS是使用2-12的pH范围内的18种缓冲液、6种不同百分比的沉淀剂PEG-3350且使用24%PEG-3350作为脱水剂的三部分结晶筛选。参见下表16。

表16.

C=得到晶体

使用装备有软件Axiovison4.0的Carl Zeiss Stemi SV11显微镜持续一周每天扫描晶体盘且接着每周扫描一次。记录晶体命中且使用内部晶体计分系统和形态描述进行表征。

以下两组条件是用于抗体晶体制剂的示例性条件：(a)A5SuT+0.05M Tris(pH8.0)+22%PEG-3350(最终pH为约7.2，渗透重量摩尔浓度为340mOsm/kg且效率%为95%)；(b)A5SuT+0.05MTris(pH8.0)+24%PEG-3350(最终pH为约7.2，渗透重量摩尔浓度为412mOsm/kg且效率%为99%)。

pH测量：使用Mettler Toledo MP230pH计测量pH且相对于pH4.0和pH7.0缓冲液标准品进行校正。为测量pH，通过将40μl蛋白质、20μl LISS缓冲液和50μl各别百分比的PEG-3350添加于eppendorf管中且涡旋来制备样本。

渗透重量摩尔浓度：使用Advanced Instruments2020多样本渗透压计(Norwood,MA)测量渗透重量摩尔浓度。所述仪器通过使用冰点下降法来测量渗透重量摩尔浓度。为在低离子筛选中测量Ab-30Rm的渗透重量摩尔浓度，混合8μl蛋白质、2μl LISS缓冲液和5μl x%PEG-3350。精确地将20μl此混合物置放于抛弃式微量样本管(Advanced Instruments,Norwood,MA.目录号：202825)中且置放于仪器旋转式传送盘(carousel)中。

效率：通过以10,000rpm短暂离心1.5ml eppedorf管15分钟，用mili-Q水对上清液进行1:100稀释且将其在UV-VIS光谱仪上于A280下读取来计算效率%。

分批结晶和动物研究实验的细节：使用A5SuT中浓度为24.39mg/ml的Ab-30Rm进行初始Ab-30Rm晶体筛选和分批结晶。对于针对动物研究的最终分批结晶研究，使用A5SuT中浓度为31.148mg/ml的Ab-30Rm。用于动物研究的液体Ab-30Rm制剂是于A5SuT中的100mg/ml液体制剂，而用于制剂的晶体浆料是以100mg/ml、pH7.2处于0.05M Tris(pH8.0)和22%PEG-3350中。

通过在1.5ml eppedorf管中添加400μl含Ab-30Rm的A5SuT+200μl0.05M Tris(pH8.0)缓冲液+500μl22%PEG-3350沉淀剂达最终体积1.1ml(在混合时变浑浊)来制备Ab-30Rm的制剂。溶液最终在第二天变澄清，其中形成可辨别晶体。六天后收集晶体且以3000rpm短暂离心15分钟并移除上清液以使管中无可溶性蛋白质剩余。用母液替换上清液。如下制备母液：eppedorf管中200μl0.05M Tris(pH8.0)缓冲液+500μl22%PEG-3350沉淀剂。应注意的是不向其中添加A5SuT。在1.1ml批料中存在12.46mg蛋白质，并且因此添加124.9μl母液以达到100mg/ml最终浓度。在一个3cc小瓶中混合来自另外两个eppedorf管的100mg/ml浆料以制备用于各大鼠的单独小瓶。如下制备配制缓冲液：400μl A5SuT缓冲液+200μl0.05M Tris(pH8.0)缓冲液+500μl22%PEG-3350沉淀剂以得到最终体积1.1ml。在100mg/ml下，视个别大鼠的体重而定，最终注射体积介于200μl-250μl之间，并且使用27G1/2针进行皮下注射。

用28只体重在400克-500克之间的6个月大雌性SD大鼠进行持续8周的单次剂量研究。最终剂量是50mg/kg(各大鼠需要20mg-25mg蛋白质)，10只个别大鼠用于各液体和粉末制剂，而8只大鼠用于安慰剂(A52SuT+0.05M Tris(pH8.0)+22%PEG-3350)。

结果与论述：使用Hampton低离子筛选浓度筛选(LISS)来筛选Ab-30Rm且在pH2下和在pH6.5-9.0之间获得总共20个晶体命中。在筛选的所有不同百分比的PEG-3350中，8%和12%PEG-3350具有最多晶体命中。0.05M Tris(pH8.0)是从8%-24%PEG-3350(除4%PEG-3350外)产生晶体的唯一条件。所得大部分Ab-30Rm晶体命中处于pH7.0-7.5的pH范围内，此在动物研究中对于避免在皮下注射后出现组织坏死是重要的。

基于渗透重量摩尔浓度数据，一些16%和24%PEG-3350条件以及所有20%PEG-3350条件处于渗透重量摩尔浓度范围内。为皮下注射可接受的渗透重量摩尔浓度范围是约250-350mOsm/Kg(参见图1A)。当将渗透重量摩尔浓度与晶体命中重叠时，仅有三种条件处于渗透重量摩尔浓度范围内且也具有晶体命中(图1B)。

PEG-3350归为影响结晶的化学因素且可表征为通过体积排阻效应起作用的长链聚合物沉淀剂。如在以LISS进行的筛选中所见，Ab-30Rm晶体的形态随PEG-3350浓度增加而降级(图2)。较高百分比PEG-3350晶体命中具有双相性分离和/或沉淀。Ab-30Rm晶体花费约一周来生长，若将相同条件用于分批结晶，则此为缓慢的。

在悬滴式蒸气扩散与分批结晶中，结晶速率未必相同。为增加结晶速率，操控作为影响Ab-30Rm结晶和浓度的另一化学因素的pH范围，在12%PEG-3350下仅集中于HEPES和Tris条件。对Ab-30Rm进行pH6.8-8.2HEPES网格式筛选(Grid Screen)和pH7.0-9.0Tris网格式筛选。在任一网格式筛选中皆未观察到结晶速率变化，但在两个网格式筛选中均观察到在高于7.5的pH下晶体丰度增加。因此，为改变结晶速率，通过研究沉淀剂PEG-3350的浓度来进行另一尝试。

使用pH范围7-9.0的10-14号LISS条件，并且以增量2%研究4%至24%的PEG-3350。0.05M Tris(pH8.0)在22%和24%PEG-3350下在第2天得到第一晶体命中。以55μl、110μl和1ml总体积于这些条件下进行分批结晶，其中在第2天都得到晶体命中。在11μl悬滴式蒸气扩散与分批结晶中，对于22%和24%PEG-3350，结晶速率相同。对于两种条件所测量的最终pH均处于7-7.5的pH范围内，其中对于22%PEG-3350，pH=7.203，并且对于24%PEG-3350，pH=7.354。对于0.05M Tris、22%PEG-3350，渗透重量摩尔浓度是340mOsm/kg，而对于0.05M Tris(pH8.0)，渗透重量摩尔浓度是412mOsm/kg，其超过渗透重量摩尔浓度范围。通过以10,000rpm旋转晶体15分钟，测量上清液的A280nm来测量效率%。Ab-30Rm晶体于水中的溶解速率是11分钟，于生理食盐水中的溶解速率是6分钟且于PBS中的溶解速率是15分钟。

以最终pH7.203，渗透重量摩尔浓度340mOsmo/kg和结晶效率95%实现Ab-30Rm制剂用于动物研究的等张及可注射条件。在动物研究中相较于重悬抗体晶体制剂测试液体抗体晶体制剂。

上述实施例表明Ab-30Rm可在多种结晶条件下结晶，但并非在所测试的每一条件下都形成晶体。在许多不同可商购获得(即HamptonResearch)的筛选中测试约240种结晶条件，但仅约50种条件产生Ab-30Rm晶体。有趣的是Ab-30R(其相较于Ab-30Rm有一个氨基酸差异)仅在于多种不同可商购获得(即Hampton Research,EmeraldBioscience)及专有的筛选中所测试的约1120种条件中的5种条件下产生晶体。

上述实施例也表明获得pH和渗透重量摩尔浓度足以向哺乳动物施用的包含Ab-30Rm晶体的制剂。

实施例6-抗硬化蛋白抗体“液体”和“晶体/结晶”制剂的大鼠体内 测试

从Charles River Laboratories获得雌性史泊格多利(SpragueDawley，SD)大鼠且舍饲于清洁笼具中，每笼两只动物。维持室温在68℉与72℉之间，并且维持相对湿度在34%与73%之间。置放笼具的实验室具有12小时明/暗周期且符合所有AAALAC规定。

在大鼠约6.5个月大时皮下注射测试物品(液体Ab-30Rm和晶体/结晶Ab-30Rm)以及缓冲液(媒介物对照)。在研究开始时(第0天)，用由以下比率的成分制成的缓冲液对9只大鼠进行注射：取400微升A5SuT(10mM乙酸钠(pH5)、9%蔗糖、0.004%聚山梨醇酯20[吐温])，接着添加200微升0.05M Tris(pH8)且接着添加500微升22%PEG-3350。这个是缓冲液/媒介物组。在研究开始时(第0天)，用“晶体/结晶”Ab-30Rm于由以下比率的成分制成的混悬液中的100mg/ml溶液以50mg/kg对10只大鼠进行注射：200微升0.05M Tris(pH8)和500微升22%PEG-3350。这个是“晶体/结晶”组。在研究开始时(第0天)，用“液体”Ab-30Rm(未结晶)于A5SuT中的100mg/ml溶液以50mg/kg对10只大鼠进行注射。这个是“液体”组。

通过双能X射线吸收测定术(DXA，Hologic QDR4500a，HologicInc.,Bedford,MA)测定麻醉大鼠(异氟烷)的面积骨矿物质密度(BMD)。基线BMD在开始处理前4天测定。也在处理(第0天)后第2周、第3周、第4周、第6周和第8周测定BMD。相关区域(ROI)包括腰椎(LV1-5)和“腿”(股骨-胫骨[整个股骨连同胫骨在胫骨/腓骨接合点以上的部分])。

使用GraphPad Prism进行统计分析。依次使用单因素方差分析(ANOVA)和杜奈特氏检验(Dunnett’s test)来确定统计差异。当P值小于0.05(P<0.05)时，各数据集合的组平均值视作具有显著差异。以绝对BMD(g/cm²)形式以及单独以BMD从基线变化百分比(对于各个别动物进行计算)形式分析数据。

3组动物的BMD数据(绝对BMD和BMD从基线变化百分比)指示，在这个大鼠研究中，单次施用Ab-30Rm的“液体”制剂与单次施用Ab-30Rm的“晶体/结晶”制剂导致BMD实现类似增加。发现“液体”Ab-30Rm组(图7A和7B)与“晶体/结晶”Ab-30Rm组(图7B)在腰椎骨骼部位和“腿”(股骨-胫骨)骨骼部位(图8B)处实现的增加相较于缓冲液/媒介物组均具有统计显著性。这些数据表明“液体”Ab-30Rm制剂与“晶体/结晶”Ab-30Rm制剂两者均具正性骨作用。

实施例7—结晶Ab-30制剂

这个实施例说明抗硬化蛋白抗体晶体的制剂，所述制剂包含高浓度蛋白质，具有缓慢释放潜能，包含由两条成熟重链(SEQ ID NO:15)和两条成熟轻链(SEQ ID NO:13)组成的抗硬化蛋白抗体Ab-30，所述抗体由编码这些链中的每一个的DNA重组产生。

简而言之，使用GRAS筛选、索引筛选、Wizard I筛选、WizardII筛选和Wizard III筛选来筛选Ab-30的总共104种结晶条件。基于结晶效率百分比缩减至四种条件供制剂用(即WIZ III第35号、GRAS第1号、INDX第34号、INDX第36号和WIZ I第46号)。成功产生适于在动物研究中皮下注射的重悬于5%右旋糖中的Ab-30制剂。

实施例8-抗硬化蛋白抗体Ab-30“液体”和“晶体/结晶”制剂的大 鼠体内测试

从Charles River Laboratories获得雌性史泊格多利(SD)大鼠且舍饲于清洁笼具中，每笼两只动物。维持室温在68℉与72℉之间，并且维持相对湿度在34%与73%之间。置放笼具的实验室具有12小时明/暗周期且符合所有AAALAC规定。

在大鼠约6.5个月大时皮下注射施用测试物品(液体Ab-30和各种晶体/结晶形式的Ab-30)以及缓冲液(媒介物对照)。在研究开始时(第0天)，用5%右旋糖(来源：Baxter IV袋)对8只大鼠进行注射。这个是缓冲液/媒介物组。在研究开始时(第0天)，用以下一个的100mg/ml溶液以100mg/kg对8只大鼠进行注射：

-“晶体/结晶”Ab-30制剂WIZ III第35号，所述晶体已重悬于5%右旋糖(来源：Baxter IV袋)中(“W35组”)；

-“晶体/结晶”Ab-30制剂INDX第34号，所述晶体已重悬于5%右旋糖(来源：Baxter IV袋)中(“I34组”)；

-“晶体/结晶”Ab-30制剂INDX第36号，所述晶体已重悬于5%右旋糖(来源：Baxter IV袋)中(“I36组”)；

-“晶体/结晶”Ab-30制剂WIZ I第46号，所述晶体已重悬于5%右旋糖(来源：Baxter IV袋)中(“W46组”)；或

-A5Su(10mM乙酸钠(pH5)、9%蔗糖)中的“液体”Ab-30(未结晶)(“液体组”)。

通过双能X射线吸收测定术(DXA，Hologic QDR4500a，HologicInc.,Bedford,MA)测定麻醉大鼠(异氟烷)的面积骨矿物质密度(BMD)。基线BMD在开始处理前7天测定。也在处理(第0天)后第2周和第4周测定BMD。相关区域(ROI)包括腰椎(LV1-5)和“腿”(股骨-胫骨[整个股骨连同胫骨在胫骨/腓骨接合点以上的部分])。

使用GraphPad Prism进行统计分析。依次使用单因素方差分析(ANOVA)和杜奈特氏检验来确定统计差异。当P值小于0.05(P<0.05)时，各数据集合的组平均值视作具有显著差异。以绝对BMD(g/cm²)形式以及单独以BMD从基线变化百分比(对于各个别动物进行计算)形式分析数据。

发现“液体”Ab-30组(图9A和9B)与一些(例如W35、I36)“晶体/结晶”Ab-30制剂组(图9B)在腰椎处的BMD增加相较于缓冲液/媒介物组均具有统计显著性。也发现“液体”Ab-30组(图10B)与一些(例如W35、I36)“晶体/结晶”Ab-30制剂组(图10B)在“腿”(股骨-胫骨)骨骼部位处的BMD增加相较于缓冲液/媒介物组均具有统计显著性。这些数据表明“液体”Ab-30制剂与“晶体/结晶”Ab-30制剂两者均具正性骨作用。

实施例9-抗硬化蛋白抗体Ab-31的结晶

由两条成熟重链(SEQ ID NO:35)和两条成熟轻链(SEQ ID NO:33)组成的抗体Ab-31由编码这些链中的每一个的DNA重组产生，在多种条件下使所述抗体结晶。

使用结晶筛选(PEG/LiCl网格式筛选；Hampton Research,AlisoViejo,Calif.)使Ab-31实现结晶，所述筛选采用称为‘悬滴式’蒸气扩散的大分子结晶方法。将主要由多肽样本与结晶试剂(“结晶缓冲液”或“母液”)的混合物组成的液滴置于硅烷化盖玻片的下侧上，并且接着用油脂密封盖玻片上的液滴且置放于引起蒸气平衡的具有试剂的液体储槽的通常24孔VDX盘上方。为实现平衡，水蒸气在液滴与盘的孔中的1ml储槽溶液之间进行交换。随着水离开液滴，多肽样本的相对浓度不断增加，此可最终导致过饱和。多肽样本的浓度增加为结晶发生所必需。通常，液滴含有的试剂浓度低于储槽，并且通常，液滴含有的试剂浓度是储槽中浓度的一半，因为等体积样本与试剂混合形成液滴。

在这些实验中，液滴中Ab-31的初始蛋白质浓度为30mg/ml。在24孔VDX聚丙烯组织培养盘中建立结晶筛选。VDX盘中的各位置都含有1mL的试剂储槽，其中各孔中的试剂储槽组成与其它孔中的试剂储槽组成不同，以形成一系列不同结晶缓冲液条件。将1mL各多肽浓度的多肽溶液添加至1μl储槽溶液中以形成液滴。在4℃下或在环境室温下孵育各盘。

在以下结晶条件下于4℃与室温下均观察到Ab-31结晶：10mM组氨酸(pH7.15至pH7.47)以及10mM磷酸钾(pH7.2)。所得晶体的长度从约100μm至约1000μm变化且呈现椭球形状，如由具有偏振的Zeiss Stemi SV11立体显微镜所测定，所述立体显微镜与以AxioVision4.0软件操作的Zeiss AxioCam MRc数字摄影机连接。

上述实施例表明Ab-31可在多种结晶条件下结晶，但并非在所测试的每一条件下都形成晶体。测试约250种不同结晶条件，但仅约36种条件产生Ab-31晶体。

预期本领域技术人员在考虑本发明的当前优选实施方案后会想起本发明实施中的众多修改和变化。因此，应对本发明的范围施加的限制仅为出现在随附权利要求中的限制。

本说明书中提及和/或申请数据表中所列的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都以全文引用的方式并入本文。

根据上述内容应了解，虽然本文已出于说明目的描述本发明的特定实施方案，但可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。

Claims (31)

1.一种抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区。

2.一种无菌制剂，其包含抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，其中至少70%的所述抗体呈结晶形式。

3.一种无菌制剂，其包含抗硬化蛋白IgG抗体的晶体，其中至少90%的所述抗体呈结晶形式。

4.如权利要求2或3所述的制剂，其中所述IgG抗体包含SEQ IDNO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区。

5.如前述权利要求中任一项所述的晶体或制剂，其中所述晶体的长度为至多约500μm。

6.如前述权利要求中任一项所述的晶体或制剂，其中所述晶体的形状选自由椭球状、棒状和针状组成的组。

7.如前述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂包含长度为至多500μm且形状选自由椭球状、棒状和针状或其混合物组成的组的晶体。

8.如前述权利要求中任一项所述的晶体或制剂，其中所述晶体包含选自由以下组成的组的盐：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、四水合酒石酸钾钠、他希美特(tacsimate)、二水合柠檬酸钠、三水合乙酸钠、酒石酸二铵、丙二酸钠、乙酸盐、乙酸钙、二甲胂酸盐、CHES、硫酸锂、氯化镁、乙酸锌、氯化铯、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氟化钠、碘化钾、碘化钠、碘化铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。

9.如前述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂是冻干制剂。

10.如前述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂是液体制剂。

11.如权利要求10所述的制剂，所述制剂包含每毫升制剂至少约100mg浓度的所述抗体。

12.如权利要求10所述的制剂，所述制剂包含分散于1.5ml或小于1.5ml液体中的至少约140mg抗体。

13.如权利要求11或12所述的制剂，所述制剂可通过具有20号针或更细针的注射器，使用临床上可接受的力量来注射。

14.如前述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂在以相同剂量且以相同方式给与时保留含有未结晶所述抗体的液体制剂的至少50%体内活性。

15.如权利要求11或12所述的制剂，所述制剂在向哺乳动物受试者施用时所介导的骨矿物质密度增加是由含有未结晶所述抗体的液体制剂所介导的骨矿物质密度增加度的至少约70%，其中所述制剂与含有未结晶抗体的液体制剂以相同剂量且以相同方式向所述受试者施用。

16.如权利要求14或15所述的制剂，所述制剂以单次剂量形式施用。

17.如权利要求14或15所述的制剂，所述制剂以多次剂量形式施用。

18.一种容器，所述容器包含用于0.5mL-2mL体积的混悬液的至少50mg如权利要求1所述的抗体晶体。

19.一种容器，所述容器包含如权利要求2或权利要求3所述的制剂。

20.如权利要求18或19所述的容器，其中所述容器为小瓶、注射器或注射装置。

21.如权利要求20所述的容器，其中所述注射器针为20号或更细。

22.一种使如权利要求9所述的制剂重悬的方法，所述方法包括使所述制剂与约0.5mL-2mL无菌悬浮媒介物接触。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述悬浮媒介物选自由谷氨酸盐、山梨糖醇、HEPES、右旋糖和水或其组合组成的组。

24.一种制备抗硬化蛋白IgG抗体的晶体的方法，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区，所述方法包括任选在约6至约8的pH下，将抗体溶液与包含选自由以下组成的组的盐的结晶试剂组合，从而形成晶体：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、乙酸铵、四水合酒石酸钾钠、他希美特、二水合柠檬酸钠、三水合乙酸钠、酒石酸二铵、丙二酸钠、乙酸盐、乙酸钙、二甲胂酸盐、CHES、硫酸锂、二水合乙酸锂、氯化镁、四水合乙酸镁、甲酸镁、硝酸镁、硫酸镁、乙酸锌、氯化锌、硫酸锌、氯化铯、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氟化钠、碘化钾、碘化钠、碘化铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、甲酸钠、甲酸钾和甲酸铵。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述盐的浓度为约0.1M至约10M。

26.一种制备抗硬化蛋白IgG抗体的晶体的方法，所述抗体包含SEQ ID NO:3和5的优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:13和15的轻链可变区和重链可变区，所述方法包括将所述抗体的溶液与包含丁二酸、PEG-1000、PEG-8000或异丙醇的结晶试剂组合，从而形成晶体。

27.如权利要求24或26所述的方法，其中使至少80%的所述抗体结晶。

28.如权利要求24或26所述的方法，所述方法为分批结晶方法。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述结晶试剂包含

(a)约0.1M至约5M丁二酸、约0.1M至约5M HEPES和约0.1%(w/v)至约60%(w/v)聚乙二醇单甲醚2000；

(b)约1%(w/v)至约50%(w/v)PEG-8000、约0.05M至约5M咪唑和约0.1M至约5M乙酸钙；

(c)约10%至约80%(w/v)PEG-1000、约0.05M至约5M磷酸钠/钾和约0.05M至约5M氯化钠；

(d)约1%(w/v)至约20%(w/v)PEG-8000、约0.05M至约5M二甲胂酸盐、约0.1M至约2M乙酸钙和约10%至约30%(w/v)甘油；或

(e)约10%至约30%异丙醇和约0.1M至约2M磷酸钠/钾。

30.一种抗体晶体，其由如权利要求24或26所述的方法产生。

31.一种增加哺乳动物受试者的骨矿物质密度、治疗与骨密度降低有关的病症、治疗骨相关病症或改善程序、置换术、移植、手术或修复的结果的方法，所述方法包括以有效增加所述受试者的骨矿物质密度的量施用如权利要求2至17中任一项所述的制剂。

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