JP6412964B2 - 抗スクレロスチン抗体結晶およびその製剤 - Google Patents

抗スクレロスチン抗体結晶およびその製剤 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年３月２５日出願の米国仮特許出願第６１／４６７，８６８号の優先権の利益を主張する。
電子的に提出された資料の参照による援用
本出願は、開示の別個の部分として、参照によりその全体が組み込まれる、コンピュータ可読形態（ファイル名：４６０５３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成：２０１１年３月２５日、４０，９１１バイト）での配列表を含む。
モノクローナル抗体は、生物学的薬物として幅広く使用されており、送達のために１００ｍｇ／ｍｌを超える高濃度を満たすことが次第に要求されている。好ましい皮下投与限度は１．２ｍｌであるため、これは皮下経路による溶解度が制限されたタンパク質の課題を提示する（Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｘ．，Ｓｈｅｎｏｙ，Ｂ．，Ｄｉｓｔｔｌｅｒ，Ｍ．，Ｐａｔｅｌ，Ｒ．，ＭｃＧｒａｔｈ，Ｍ．，Ｐｅｃｈｅｎｏｖ，Ｓ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．（２００３）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＰＮＡＳ １００，６９３４−６９３９）。高濃度製剤の開発には、製剤化、分析、安定性、製造および薬物送達の観点から、多くの課題が伴う（Ｓｈｉｒｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｒａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｊ．（２００４）Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３，１３９０−１４０２）。今のところ、高濃度製剤の要求は、安定性を増加させ、凝集および粘度を低減するアミノ酸、糖および塩等の賦形剤の添加により満たされている（Ｓｈｉｒｅ，ｓｕｐｒａ ａｎｄ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｔ．Ｗ．（１９９８）Ｔｈｒｅｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｂｌｅｍ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７：３７６−３８２）。
タンパク質結晶は、単なるタンパク質構造への中間体であるとみなされることが多いが、それらはまた、製剤化の面で重要な役割を有する。結晶形態のタンパク質分子は、最も低いエントロピーを有し、これによって液体状態よりも３〜６ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定となる（Ｄｒｅｕｔｈ，Ｊ．，Ｈａａｓ，Ｃ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ １２２，１０７−１０９）。結晶製剤の主な利点は、高タンパク質濃度、より低い粘度、安定性、高濃度による頻繁な投与の排除、および制御放出特性を含む（Ｙａｎｇ，ｓｕｐｒａ、およびＢａｓｕ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｏｖａｒｄｈａｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｕｎｇ，Ｃ．Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａ．４，３０１−３１７）。
結晶化条件は、所望の制御放出特性のための異なる形態を達成するように操作することができる（Ｐｅｃｈｅｎｏｖ，Ｓ．，Ｓｈｅｎｏｙ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｘ．，Ｂａｓｕ，Ｓ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．（２００４）Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９６，１４９−１５８）。インスリン結晶製剤は、１９２０年代に初めて報告され、今日では、ＦＤＡにより承認された最初の組み換えタンパク質治療薬であるだけでなく、初めて承認された結晶性タンパク質治療薬である（Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｈ．Ｃ．；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｂ．Ｎ．；Ｋｒａｒｕｐ，Ｎ．Ｂ．；Ｗｏｄｓｔｒｕｐ，Ｉ．Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎａｔｅ，（１９３６）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．１０６，１７７−１８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉ．Ｓ．（２００３）Ｔｈｅ ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｒｉｂｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｒｕｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２，７４７−７５１；およびＢａｓｕ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｏｖａｒｄｈａｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｕｎｇ，Ｃ．Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａ．４，３０１−３１７）。巨大分子はその固有の柔軟性により結晶化が難しいが、一旦結晶化すると、製剤化および規制の面で課題をもたらすことが多い（Ｂａｓｕ，ｓｕｐｒａ，ａｎｄ Ｊｅｎ，Ａ．，Ｍｅｒｋｌｅ，Ｈ．Ｐ．（２００１）Ｄｉａｍｏｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｕｇｈ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｆｒｏｍ ａ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１８，１４８３−１４８８）。
本発明は、非経口投与用製剤における使用に好適な抗スクレロスチン免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（より具体的には、Ａｂ−３０およびＡｂ−３１）の結晶、そのような結晶の溶液、塩およびそれを精製するための方法、医薬としての使用のための製剤を調製するためにそのような結晶を使用する方法、ならびに、哺乳動物、具体的には人間を処置するためにそのような製剤を使用する方法に関する。
本明細書に記載の結晶または製剤において、結晶または製剤中の抗スクレロスチンＩｇＧ抗体は、Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１のいずれかの重鎖および軽鎖可変領域を含み得る。したがって、特定の実施形態において、抗体は、（ａ）好ましくはそれぞれ好適な定常領域に融合した、配列番号５（Ａｂ−３０重鎖可変領域）および配列番号３（Ａｂ−３０軽鎖可変領域）、もしくは（ｂ）配列番号１５（Ａｂ−３０成熟重鎖）および配列番号１３（Ａｂ−３０成熟軽鎖）；（ｃ）好ましくはそれぞれ好適な定常領域に融合した、配列番号１７（Ａｂ−３０Ｒ重鎖可変領域）および配列番号１６（Ａｂ−３０Ｒ軽鎖可変領域）；（ｄ）配列番号１７（Ａｂ−３０Ｒｍ重鎖可変領域）および配列番号２０（Ａｂ−３０Ｒｍ軽鎖可変領域）；または（ｅ）好ましくはそれぞれ好適な定常領域に融合した、配列番号２５（Ａｂ−３１重鎖可変領域）および配列番号２３（Ａｂ−３１軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を含むＩｇＧである。いくつかの実施形態において、抗体は、Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の成熟重鎖および軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、本明細書に記載のように、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１のいずれかの、重鎖および／もしくは軽鎖、または代替として、好ましくはそれぞれ好適な定常領域に融合した重鎖および／もしくは軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡを哺乳動物宿主細胞において発現させることにより得ることができるアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、１０−７Ｍ以下のＫｄ結合親和性で、配列番号１のスクレロスチンに結合する。
本明細書に記載の抗体結晶は、例えば、サイズ、形状、形態、塩含量および他の特性により特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、結晶の長さは、約１００μＭから約５００μＭまで、または約５０μＭから約１００μＭまで、または約１μＭから約５０μＭまでの範囲であり、任意選択で、針状、棒状、板状、ブロック状、ＵＦＯ状、フットボール状、葉状、小麦状、シングレット状、羽毛状、楕円体（もしくはサーフボード状）、ストロー状、菊状、もしくは球状、またはそれらの混合である形態を有する。いくつかの実施形態において、結晶の長さは、約１μｍから約１０μｍまで、または約１μｍから約１５μｍまで、または約１μｍから約２０μｍまで、または約１μｍから約２５μｍまで、または約１μｍから約３０μｍまで、または約１μｍから約３５μｍまで、または約１μｍから約４０μｍまで、または約１μｍから約４５μｍまで、または約５μｍから約１０μｍまで、または約５μｍから約１５μｍまで、または約５μｍから約２０μｍまで、または約５μｍから約２５μｍまで、または約５μｍから約３０μｍまで、または約５μｍから約３５μｍまで、または約５μｍから約４０μｍまで、または約５μｍから約４５μｍまで、または約５０μｍから約７５μｍまで、または約５０μｍから約８０μｍまでまたは約５０μｍから約８５μｍまで、または約５０μｍから約９０μｍまで、または約５０μｍから約９５μｍまで、または約１００μｍから約１５０μｍまで、または約１００μｍから約２００μｍまで、または約１００μｍから約２５０μｍまで、または約１００μｍから約３００μｍまで、または約１００μｍから約３５０μｍまで、または約１００μｍから約４００μｍまで、または約１００μｍから約４５０μｍまでの範囲である。
任意選択で、結晶は、クラスタ状であってもよい。また、結晶は、Ｘ線回折により特性決定される。例えば、Ａｂ−３０結晶は、針状、棒状、ブロック状、もしくは板状、またはそれらの混合、または他の形状を示してもよい。Ａｂ−３０結晶のほとんどは、棒状、針状または楕円体状を示した。例えば、Ａｂ−３１結晶は、サーフボードもしくは楕円体形状、または他の形状を示してもよい。
いくつかの実施形態において、結晶の長さは、約５μｍ、または約１０μｍ、または約１５μｍ、または約２０μｍ、または約２５μｍ、または約３０μｍ、または約３５μｍ、または約４０μｍ、または約４５μｍ、または約５０μｍ、または約５５μｍ、または約６０μｍ、または約６５μｍ、または約７０μｍ、または約７５μｍ、または約８０μｍ、または約８５μｍ、または約９０μｍ、または約９５μｍ、または約１００μｍ、または約１２５μｍ、または約１５０μｍ、または約１７５μｍ、または約２００μｍ、または約２５０μｍ、または約３００μｍ、または約３５０μｍ、または約４００μｍ、または約４５０μｍ、または約５００μｍである。本明細書に記載の様々な結晶化条件により生成される結晶の長さとは無関係に、長さは、後に、当該技術分野において知られた方法により、所望の長さに変更され得る。例えば、結晶化条件が約５μｍから約１００μｍまでまたは約５μｍから約５００μｍまでまたは約１００μｍから約５００μｍまでの長さの抗体結晶を生成する場合、結晶は、約５μｍから約５０μｍまでの範囲の長さ等のより短い長さまで粉砕され得る。
いくつかの実施形態において、結晶成長条件は、考慮される結晶の特定のサイズ、形状、長さおよび／または形態を得るように修正される。結晶成長条件は、これらに限定されないが、ｐＨの変更、沈殿剤の添加の変更、沈殿剤の濃度の変更、温度の変更、ならびに、これらに限定されないが、塩（これらに限定されないが、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸アンモニウム、酢酸カルシウム、酢酸リチウム二水和物、酢酸マグネシウム四水和物、塩化マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウムおよびそれらの組み合わせを含む）、アミノ酸、糖、炭水化物、洗浄剤（イオン性非イオン性両性イオン）および界面活性剤を含む添加剤の含有を含む、当該技術分野において知られた任意の手段により修正される。
いくつかの、または任意の実施形態において、本明細書に記載の抗体結晶は、結晶化試薬中の塩の種類により特徴付けられる。
Ａｂ−３０結晶の生成に好適な塩は、これらに限定されないが、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、タクシメート、クエン酸ナトリウム二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酢酸塩、酢酸カルシウム、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、硫酸リチウム、塩化マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化セシウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムおよびギ酸アンモニウムを含む。例えば、Ａｂ−３０結晶の生成のための他の塩（水和物を含む）は、例えば、一価（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム）または二価カチオン（例えば、亜鉛、マグネシウム）との、他のリン酸二水素塩、リン酸水素塩、リン酸塩、フッ化物塩、塩化物塩、硫酸塩、酒石酸塩、タクシメート塩、クエン酸塩、酢酸塩、マロン酸塩、カコジル酸塩、およびヨウ化物塩、チオシアン酸塩、またはギ酸塩を含み得る。
Ａｂ−３１結晶の生成に好適な塩は、これらに限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびヒスチジンを含む。例えば、Ａｂ−３１結晶の生成のための他の塩は、例えば、一価（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム）カチオンとの、塩化物塩、酢酸塩、またはリン酸塩を含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、結晶成長および／または形状に影響し得る結晶化添加剤により特徴付けられる。好適な結晶化添加剤は、これらに限定されないが、約２００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａまで、もしくは約４００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａまで、もしくは約１０００ｋＤから約１０，０００ｋＤまでの分子量を有するＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−３３５０もしくはＰＥＧ−８０００）または２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）等の沈殿剤、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等の界面活性剤、洗浄剤（イオン性、非イオン性および両性イオン）、アミノ酸、短ペプチド、有機小分子、有機塩、ヌクレオチドならびに炭水化物を含む。いくつかの実施形態において、添加剤（例えば、ＰＥＧ、ＭＰＤ、グリセロール）は、約０．１％〜約７５％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）、または約０．１〜５０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）、または約０．１〜１０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）、または約１０％〜約５０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）、または約２０％〜５０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の濃度である。いくつかの、または任意の実施形態において、結晶はまた、残留不純物を含めて、それらが生成されるプロセスにより特徴付けられる。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、コハク酸、ＨＥＰＥＳおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００を含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化条件は、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍのコハク酸（または約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍのコハク酸）を含み、任意選択でさらに約６〜約９もしくは約７〜約８．５のｐＨの、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４ＭのＨＥＰＥＳ（または約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５ＭのＨＥＰＥＳ）、および任意選択で約０．１％〜約６０％（ｗ／ｖ）、もしくは約０．１％〜約１％、もしくは約１％〜約３％、もしくは約２％〜約４％、もしくは約３％〜約５％または約２０％〜約４０％、もしくは約３０％〜約６０％、もしくは約１０％〜約２０％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約１５％〜約２５％のポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００（または約０．１％、もしくは約０．５％、もしくは約１％、もしくは約１．５％、もしくは約２％、もしくは約２．５％、もしくは約３％、もしくは約３．５％、もしくは約４．５％、もしくは約５％、もしくは約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％、もしくは約５５％、もしくは約６０％のポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００）を含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、１．０Ｍのコハク酸、ｐＨ７の０．１ＭのＨＥＰＥＳ、および１％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールモノエチルエーテル２０００を含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、ＰＥＧ−８０００、イミダゾールおよび酢酸カルシウムを含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約２５％〜約５０％、もしくは約３０％〜約４５％、もしくは約４０％〜約５０％のＰＥＧ−８０００（または約１％、もしくは約２％、もしくは約３％、もしくは約４％、もしくは約５％、もしくは約６％、もしくは約７％、もしくは約８％、もしくは約９％、もしくは約１０％、もしくは約１１％、もしくは約１２％、もしくは約１３％、もしくは約１４％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％のＰＥＧ−８０００）を含み、任意選択でさらに約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．０５〜約０．１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍのイミダゾール（または約０．０５、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍのイミダゾール）、および任意選択で約０．１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍ（または約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍ）の酢酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．１Ｍのイミダゾール、および０．２Ｍの酢酸カルシウムを含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、ＰＥＧ−８０００、ＴＲＩＳおよび塩化マグネシウムを含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約２５％〜約５０％、もしくは約３０％〜約４５％、もしくは約４０％〜約５０％のＰＥＧ−８０００（または約１％、もしくは約２％、もしくは約３％、もしくは約４％、もしくは約５％、もしくは約６％、もしくは約７％、もしくは約８％、もしくは約９％、もしくは約１０％、もしくは約１１％、もしくは約１２％、もしくは約１３％、もしくは約１４％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％のＰＥＧ−８０００）を含み、任意選択でさらに約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４ＭのＴＲＩＳ（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５ＭのＴＲＩＳ）、および任意選択で約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．０５〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍの塩化マグネシウム（または約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍの塩化マグネシウム）を含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．１Ｍのトリス、および０．２Ｍの塩化マグネシウムを含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、ＰＥＧ−１０００、リン酸ナトリウム／カリウムおよび塩化ナトリウムを含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１０％〜約８０％、もしくは約１０％〜１５％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約４０％〜約７０％、もしくは約５０％〜約８０％、もしくは約３０％〜約７５％のＰＥＧ−１０００（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％、もしくは約５５％、もしくは約６０％、もしくは約６５％、もしくは約７０％、もしくは約７５％、もしくは約８０％のＰＥＧ−１０００）を含み、任意選択でさらに約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍのリン酸ナトリウム／カリウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍのリン酸ナトリウム／カリウム）、および任意選択で約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍの塩化ナトリウム（または約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍの塩化ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１０００、０．１Ｍのリン酸ナトリウム／カリウム、および０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、ＰＥＧ−８０００、カコジル酸塩、酢酸カルシウムおよびグリセロールを含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約２５％〜約５０％、もしくは約３０％〜約４５％、もしくは約４０％〜約５０％のＰＥＧ−８０００（または約１％、もしくは約２％、もしくは約３％、もしくは約４％、もしくは約５％、もしくは約６％、もしくは約７％、もしくは約８％、もしくは約９％、もしくは約１０％、もしくは約１１％、もしくは約１２％、もしくは約１３％、もしくは約１４％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％のＰＥＧ−８０００）を含み、任意選択でさらに約５〜約７、もしくは約６〜約７、もしくは約６．５のｐＨの、約０．０５Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍのカコジル酸塩（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．０６Ｍ、もしくは約０．０７Ｍ、もしくは約０．８Ｍ、もしくは約０．９Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍのカコジル酸塩）、任意選択で約０．０５Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約２Ｍの酢酸カルシウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．１２Ｍ、もしくは約０．１４Ｍ、もしくは約０．１６Ｍ、もしくは約０．１８Ｍ、もしくは約０．２Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍの酢酸カルシウム）、および任意選択で約１％〜約６５％（ｗ／ｖ）、もしくは約１％〜約１０％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約３５％〜約５０％、もしくは約５０％〜約６５％のグリセロール（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％のグリセロール）を含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、１４．４％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、０．０８Ｍのカコジル酸塩、０．１６Ｍの酢酸カルシウム、および２０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、イソプロパノールおよびリン酸ナトリウム／カリウムを含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約１００％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約３５％〜約５０％、もしくは約４０％，〜約６０％、もしくは約７５％〜約９０％、もしくは約８０％〜約１００％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％、もしくは約５５％、もしくは約６０％、もしくは約６５％、もしくは約７０％、もしくは約７５％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５％、もしくは約１００％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール）、および任意選択で約０．０５〜約４Ｍ、もしくは約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約０．１Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約２Ｍ、もしくは約２Ｍ〜約４Ｍ、もしくは約３Ｍ〜約４Ｍのリン酸ナトリウム／カリウム（または約０．１Ｍ、もしくは約０．２Ｍ、もしくは約０．３Ｍ、もしくは約０．４Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約０．６Ｍ、もしくは約０．７Ｍ、もしくは約０．８Ｍ、もしくは約０．９Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍのリン酸ナトリウム／カリウム）を含む。いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１９．９％のイソプロパノールおよび約０．２Ｍのリン酸ナトリウム／カリウムを含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、抗体結晶は、２−プロパノール、二塩基性リン酸アンモニウム、ＰＥＧ−１０００、硫酸アンモニウム、酒石酸カリウム／ナトリウム、ＰＥＧ−３０００、ＰＥＧ−８０００、１，４−ブタンジオール、塩化ナトリウム、エタノール、ＰＥＧ−４００、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ−６００、ＰＥＧ−１０，０００からなる群から選択される要素を含む結晶化試薬を含む結晶化条件下で生成される。例えば、いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％、もしくは約１０％〜約２０％、もしくは約１％〜約１０％、もしくは５％〜約１０％、もしくは約８％〜約１２％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約３５％、もしくは約４０％〜約５０％（ｖ／ｖ）の２−プロパノール（または約１％、もしくは約５％、もしくは約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％（ｖ／ｖ）の２−プロパノール）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約０．０５Ｍ〜約１０Ｍ、もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１０Ｍの二塩基性リン酸アンモニウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍ、もしくは約６Ｍ、もしくは約６．５Ｍ、もしくは約７Ｍ、もしくは約７．５Ｍ、もしくは約８Ｍ、もしくは約８．５Ｍ、もしくは約９Ｍ、もしくは約９．５Ｍ、もしくは約１０Ｍの二塩基性リン酸アンモニウム）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１０％〜約８０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約４０％〜約７０％、もしくは約５０％〜約８０％、もしくは約３０％〜約７５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−１０００（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％、もしくは約５５％、もしくは約６０％、もしくは約６５％、もしくは約７０％、もしくは約７５％、もしくは約８０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−１０００）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約０．５Ｍ〜約１０Ｍ、もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１０Ｍの硫酸アンモニウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍ、もしくは約６Ｍ、もしくは約６．５Ｍ、もしくは約７Ｍ、もしくは約７．５Ｍ、もしくは約８Ｍ、もしくは約８．５Ｍ、もしくは約９Ｍ、もしくは約９．５Ｍ、もしくは約１０Ｍの硫酸アンモニウム）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約０．５Ｍ〜約１０Ｍ、もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１０Ｍの酒石酸カリウム／ナトリウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍ、もしくは約６Ｍ、もしくは約６．５Ｍ、もしくは約７Ｍ、もしくは約７．５Ｍ、もしくは約８Ｍ、もしくは約８．５Ｍ、もしくは約９Ｍ、もしくは約９．５Ｍ、もしくは約１０Ｍの酒石酸カリウムナトリウム）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％、もしくは約１％〜約５％、もしくは約１％〜約１０％、もしくは約１０％〜約２０％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約３０％〜約５０％（ｖ／ｖ）の１，４−ブタンジオール（または約１％、もしくは約５％、もしくは約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％（ｖ／ｖ）の１，４−ブタンジオール）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約０．５Ｍ〜約１０Ｍ、もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍ、もしくは約１Ｍ〜約５Ｍ、もしくは約５Ｍ〜約１０Ｍの塩化ナトリウム（または約０．０５Ｍ、もしくは約０．１Ｍ、もしくは約０．５Ｍ、もしくは約１Ｍ、もしくは約１．５Ｍ、もしくは約２Ｍ、もしくは約２．５Ｍ、もしくは約３Ｍ、もしくは約３．５Ｍ、もしくは約４Ｍ、もしくは約４．５Ｍ、もしくは約５Ｍ、もしくは約６Ｍ、もしくは約６．５Ｍ、もしくは約７Ｍ、もしくは約７．５Ｍ、もしくは約８Ｍ、もしくは約８．５Ｍ、もしくは約９Ｍ、もしくは約９．５Ｍ、もしくは約１０Ｍの塩化ナトリウム）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１０％〜約５０％、もしくは約１０％〜約２０％、もしくは約１４％〜約１８％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約３０％〜約５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（または約１％、もしくは約５％、もしくは約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％（ｖ／ｖ）のエタノール）を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１０％〜約８０％、もしくは約１０％〜約１５％、もしくは約１５％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２５％〜約３０％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約４０％〜約７０％、もしくは約５０％〜約８０％、もしくは約３０％〜約７５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−３，０００、ＰＥＧ−８，０００もしくはＰＥＧ−１０，０００（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％、もしくは約５５％、もしくは約６０％、もしくは約６５％、もしくは約７０％、もしくは約７５％、もしくは約８０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−３，０００、ＰＥＧ−８，０００もしくはＰＥＧ−１０，０００を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１０％〜約５０％（ｗ／ｖ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）（または約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％（ｗ／ｖ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ））を含む。
いくつかの実施形態において、結晶化試薬は、約１％〜約５０％、もしくは約１％〜約１０％、もしくは約５％〜約１５％、もしくは約１０％〜約２０％、もしくは約２０％〜約２５％、もしくは約２０％〜約３０％、もしくは約１５％〜２５％、もしくは約３０％〜約５０％（ｖ／ｖ）のＪｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ−６００（または約１％、もしくは約５％、もしくは約１０％、もしくは約１５％、もしくは約２０％、もしくは約２５％、もしくは約３０％、もしくは約３５％、もしくは約４０％、もしくは約４５％、もしくは約５０％（ｖ／ｖ）のＪｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ−６００）を含む。
本明細書に記載の別の態様は、本明細書に記載の結晶を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、結晶が形成されるように、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の溶液を、前述した塩のいずれかを含む適切な塩を含む結晶化試薬と組み合わせることを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、結晶化試薬中の塩は、約０．１Ｍ〜約３０Ｍ、任意選択で約０．１Ｍ〜約１０Ｍ、または約１Ｍ〜約１０Ｍ、または約１Ｍ〜約５Ｍ、または約５Ｍ〜約１０Ｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、方法は、結晶が形成されるように、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の溶液を、コハク酸、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００またはイソプロパノールを含む含む結晶化試薬と組み合わせることを含む。本明細書に記載の結晶生成方法のいずれ対しても、いくつかの実施形態において、溶液中の抗体の元の量の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、またはそれ以上）が、組み合わせるステップの後に結晶化する。結晶化抗体のパーセンテージの決定は、例えば実施例５に記載される方法、または当該技術分野において知られている他の方法により行うことができる。
抗体結晶を作製する方法は、任意選択で、結晶が形成された後に結晶化試薬の少なくとも一部を（例えば遠心分離により）除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、次いで結晶は、有機添加剤（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）を含む溶液中に入れられる。いくつかの実施形態において、賦形剤（例えば、スクロース、トレハロースまたはソルビトール）が溶液に添加される。
抗体結晶を作製する方法は、任意選択で、形成した結晶を（例えば、結晶を空気乾燥させることにより、または結晶を真空もしくは窒素ガスに暴露することにより）乾燥させるステップをさらに含む。
本明細書に記載の抗体結晶を生成するための例示的方法は、当該技術分野において知られている蒸気拡散およびバッチ結晶化を含む。
本明細書に記載の別の態様は、製剤（例えば、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む粉末および液体製剤）、ならびに、人間を含む哺乳動物の治療のための製剤等の医薬を調製するために、本明細書に記載の抗体結晶を使用する方法である。任意選択で本明細書に記載の用量および時期的な計画のいずれかを使用した、本明細書に記載のいずれの状態の治療も帰途される。製剤は、本明細書に記載の特性（例えば、サイズ、長さ、形状、塩含量、添加剤含量、または他の特性）の１つ以上を有する抗体結晶、例えばＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶を含む。いくつかの実施形態において、製剤中のＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶は、約２０μｍ〜約１ｍｍの長さを有し、また楕円体、棒および針、またはそれらの混合の形状を有する。いくつかの実施形態において、製剤中のＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶は、約５μｍ〜約５００μｍの長さを有し、また楕円体、棒および針、またはそれらの混合の形状を有する。
いくつかの、または任意の実施形態において、製剤は、無菌であり、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を含み、抗体の少なくとも７０％（または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、またはそれ以上）が結晶形態である。いくつかの実施形態において、製剤中の抗スクレロスチンＩｇＧ抗体は、配列番号３および５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号１３および１５のアミノ酸配列を有する。
製剤は、非経口投与に好適であり、例えば無菌であり、非経口投与に許容される、例えば＜０．２５ＥＵ／ｍＬまたは０．００８ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンレベルを有し、薬学的に許容される賦形剤を含む。製剤はまた、好ましくは、高タンパク質濃度、例えば少なくとも製剤１ｍｌ当たり少なくとも１００ｍｇの抗体、または少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１６０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１．５ｍｌ以下の液体中に分散した少なくとも１４０ｍｇの抗体の濃度を有する。例示的実施形態において、そのような製剤は、約約１０ｃＰ以下、任意選択で８ｃＰ以下、または６ｃＰ以下の粘度を有する。「粘度」という用語は、本明細書において使用される場合、「絶対粘度」を指す。動的または単純粘度と呼ばれることもある絶対粘度は、動粘性率と流体密度の積であり、すなわち 絶対粘度＝動粘性率×密度である。動粘性率の次元は、Ｌ２／Ｔ（式中、Ｌは長さであり、Ｔは時間である）である。一般に、動粘性率は、センチストークス（ｃＳｔ）で表現される。動粘性率のＳＩ単位は、ｍｍ２／ｓであり、これは１ｃＳｔである。絶対粘度は、センチポアズ（ｃＰ）の単位で表現される。絶対粘度のＳＩ単位は、ミリパスカル−秒（ｍＰａ−ｓ）であり、１ｃＰ＝１ｍＰａ−ｓである。
いくつかの、または任意の実施形態において、保存および／または投与温度における再懸濁された液体製剤の絶対粘度は、１５ｃＰ以下、または１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、もしくは４ｃＰ以下である。いくつかの、または任意の実施形態において、製剤は、臨床的に許容される量の力を使用して、２０ゲージ針またはそれより微細な針（例えば、２５ゲージ針、２７ゲージ針またはそれより微細な針）のシリンジを通して注射可能である。
いくつかの、または任意の実施形態において、製剤は、これらに限定されないが、スクロース、トレハロースおよびソルビトール、または他の糖もしくはポリオールを含む賦形剤を含む。
いくつかの、または任意の実施形態において、製剤は、約２〜約１２、または約６〜約９、または約６〜８．５、または約７〜約７．５のｐＨ、および約１８０〜約４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２００〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２５０〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有する。等張（２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）および生理学的ｐＨ（約７〜７．５）が好ましいが、製剤は、これらの範囲外で調製されてもよい。
製剤は、任意選択で、非経口投与前に懸濁ビヒクル中に再懸濁される。例示的懸濁ビヒクルは、これらに限定されないが、グルタメート、ソルビトール、ＨＥＰＥＳ、デキストロースおよび水を含む。いくつかの実施形態において、懸濁ビヒクルはデキストロースであり、デキストロースは、約１％から約１０％までのデキストロース、または約５％から約１０％までのデキストロース、または約１％から約５％までのデキストロース、または約２％から約４％までのデキストロース（例えば、約１％のデキストロース、約２％のデキストロース、約３％のデキストロース、約４％のデキストロース、約５％のデキストロース、約６％のデキストロース、約７％のデキストロース、約８％のデキストロース、約９％のデキストロース、または約１０％のデキストロース）の範囲の量で提供される。いくつかの実施形態において、懸濁ビヒクルはソルビトールであり、ソルビトールは、約１％から約１０％までのソルビトール、または約５％から約１０％までのソルビトール、または約１％から約５％までのソルビトール、または約２％から約４％までのソルビトール（例えば、約１％のソルビトール、約２％のソルビトール、約３％のソルビトール、約４％のソルビトール、約５％のソルビトール、約６％のソルビトール、約７％のソルビトール、約８％のソルビトール、約９％のソルビトール、または約１０％のソルビトール）の範囲の量で提供される。いくつかの実施形態において、懸濁ビヒクルはグルタメートであり、グルタメートは、１ｍＭから約２０ｍＭまでのグルタメート、もしくは約１０ｍＭから約１５ｍＭまで、もしくは約５から約１０ｍＭまで、もしくは約８ｍＭから約１２ｍＭまで（または約１ｍＭのグルタメート、約２ｍＭのグルタメート、約３ｍＭのグルタメート、約４ｍＭのグルタメート、約５ｍＭのグルタメート、約６ｍＭのグルタメート、約７ｍＭのグルタメート、約８ｍＭのグルタメート、約９ｍＭのグルタメート、約１０ｍＭのグルタメート、約１１ｍＭのグルタメート、約１２ｍＭのグルタメート、約１３ｍＭのグルタメート、約１４ｍＭのグルタメート、約１５ｍＭのグルタメート、約１６ｍＭのグルタメート、約１７ｍＭのグルタメート、約１８ｍＭのグルタメート、約１９ｍＭのグルタメート、もしくは約２０ｍＭのグルタメート）の範囲の量で提供される。いくつかの実施形態において、懸濁ビヒクルは、ソルビトールおよびグルタメートの組み合わせ（例えば、約１ｍＭ〜約２０ｍＭのグルタメート（上に特定される中間的範囲を含む）、および約１％〜約１０％のソルビトール（上に特定される中間的範囲を含む）を含む。いくつかの実施形態において、懸濁ビヒクルは、約１０ｍＭのグルタメートおよび約５％のソルビトールを含む。
他の実施形態において、懸濁ビヒクルは、（１）ＨＥＰＥＳおよびＰＥＧ−３３５０（例えば、０．５Ｍ ＨＥＰＥＳおよび２０％ ＰＥＧ−３３５０、ｐＨ７．５）、（２）トリスおよびＰＥＧ−３３５０（例えば、０．５Ｍトリスおよび５０％ ＰＥＧ−３３５０、ｐＨ８）ならびに（３）トリスおよびＰＥＧ−３３５０（例えば、０．５Ｍトリスおよび５０％ ＰＥＧ−３３５０、ｐＨ８．５）からなる群から選択される。
任意選択で、非経口投与（例えば、皮下または筋肉内）に好適な製剤は、容器内、例えば単回用量バイアル、複数回用量バイアル、シリンジ、予め充填されたシリンジまたは注射デバイス内にあってもよい。いくつかの、または任意の実施形態において、容器は、抗スクレロスチン抗体の単回用量（例えば、約７０〜約４５０ｍｇの抗スクレロスチン抗体）を含む。いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも約５ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇまたは最大約１，０００ｍｇの抗スクレロスチン抗体を含む。これらの端点の全ての間の範囲、例えば約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２８０、約７０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または約２８０ｍｇ〜約４１０ｍｇの抗スクレロスチン抗体もまた企図される。用量は、任意の間隔で、例えば１週間に複数回（例えば、週に２回または３回）、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。例えば、いくつかの、または任意の実施形態において、約１２０ｍｇ〜約２１０ｍｇの範囲の抗スクレロスチン抗体の用量が、１週間に２回投与される。いくつかの、または任意の実施形態において、約１４０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体が、１週間に２回投与される。本明細書に記載の用量のいずれも、分割用量として投与され得る。例えば、１４０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、７０ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得る。同様に、２１０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、１０５ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得る。
いくつかの、または任意の実施形態において、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体の結晶を含む製剤は、結晶化されていない同じ抗体の少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％）以上のｉｎ ｖｉｖｏ活性を維持する。例えば、いくつかの実施形態において、Ａｂ３０の結晶を含む製剤は、結晶化していないＡｂ３０抗体と同じ（または同様の）用量で与えられ、また同じ（または同様の）様式で投与された場合、少なくとも約５０％〜約１００％、または少なくとも約７０％〜約１００％、または少なくとも８０％〜少なくとも１００％、または少なくとも９０％〜約１００％（例えば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％）の活性のレベルを維持する。製剤は、本明細書の別の箇所に記載されるように、単回用量または複数回用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ベースラインと比較した、全身（例えば、頭部、胴体、腕、および脚）または股関節（例えば、全股関節および／もしくは大腿骨頸）、脊椎（例えば、腰椎）、手首、指、脛骨ならびに／または踵の骨ミネラル密度の増加である。
いくつかの、または任意の実施形態において、本明細書に記載のようなＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶を含む製剤は、哺乳動物対象に投与された場合、結晶化していないＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１抗体により媒介される骨ミネラル密度増加のレベルの少なくとも約７０％（または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％）である（ベースラインまたは対照と比較した）骨ミネラル密度の増加を媒介する（同じ（または同様の）用量で、および同じ（または同様の）投与経路で投与された場合；例えば、約１００ｍｇ／ｍｌ等の本明細書に記載の用量で、皮下注射により投与された場合）。製剤は、本明細書の別の箇所で記載されるように、単一用量または複数回用量で投与され得る。
１つの例示的実施形態において、容器は、約７０ｍｇまたは７５ｍｇの抗スクレロスチン抗体の製剤を含有してもよく、約１ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与に好適である。他の実施形態において、容器は、約５０ｍｇ、または約６０ｍｇ、または約７０ｍｇ、または約８０ｍｇ、または約９０ｍｇ、または約１００ｍｇ、または約１２０ｍｇ、または約１３０ｍｇ、または約１４０ｍｇ、または約１５０ｍｇ、または約１６０ｍｇ、または約１７０ｍｇ、または約１８０ｍｇ、または約１９０ｍｇ、または約２００ｍｇ、または約２１０ｍｇ、または約２２０ｍｇ、または約２３０ｍｇ、または約２４０ｍｇ、または約２５０ｍｇ、または約２５０ｍｇ〜約４５０ｍｇ、または約２８０ｍｇ、または２９０ｍｇ、または３００ｍｇ、または約３５０ｍｇ、または３６０ｍｇ、または約４２０ｍｇ、または４３０ｍｇ、または４４０ｍｇ、または４５０ｍｇの、抗スクレロスチン抗体の製剤を含有してもよい。そのような実施形態のいずれにおいても、容器は、約２〜約６ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ（体重）（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ、または約４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ、または約６ｍｇ／ｋｇ（体重））の単回用量の投与に好適となり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、容器は、本明細書に記載のような高タンパク質濃度の抗体を含んでもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、容器は、粉末または凍結乾燥製剤を含んでもよく、約０．５〜２ｍＬの体積への懸濁用であってもよい。
また、上記粉末製剤のいずれかを再懸濁させる方法であって、本明細書に記載のような高タンパク質濃度を達成するために、無菌希釈剤を添加することを含む方法が開示される。
また、そのような容器と、約０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の用量を達成するために必要な、適切な体積または量の製剤を使用するための説明書を含むラベルとを備えるキットが開示される。いくつかの実施形態において、製剤の用量は、体重１キログラム当たり約０．１から約５０ミリグラムの間（例えば、約５から５０ミリグラムの間）、または約１から約１００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の間の抗スクレロスチン抗体を含む。例えば、抗スクレロスチン抗体の用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、または約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または最大約１００ｍｇ／ｋｇを含み得る。これらの端点の全ての間の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇもまた企図される。
また、本明細書において、室温および／または４℃で少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはそれ以上安定である製剤（例えば、粉末（すなわち、凍結乾燥された）および／または液体製剤）が開示される。いくつかの実施形態において、製剤は、Ａｂ−３０結晶を含み、製剤は、室温および／または４℃で少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはそれ以上安定である。いくつかの実施形態において、Ａｂ−３０製剤は、４℃および／または室温で少なくとも９ヶ月安定である。
また、本明細書において、これらに限定されないが、軟骨形成不全、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫症、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、化膿性骨髄炎、歯周病、抗てんかん薬誘導性骨量減少、原発性もしくは二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘導性骨量減少、男性における骨粗鬆症、閉経後骨量減少、変形性関節症、腎性骨ジストロフィー、骨の浸潤性障害、口蓋骨量減少、顎部の骨壊死、若年性パジェット病、流蝋性過骨症、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌状赤血球貧血／疾患、臓器移植関連骨量減少、腎臓移植関連骨量減少、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、てんかん、若年性関節炎、サラセミア、ムコ多糖症、ファブリー病、ターナー症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ハンセン病、ペルテス病、青年期特発性脊柱側弯、乳児性発症多系統炎症性疾患、ウィンチェスター症候群、メンケス病、ウィルソン病、虚血性骨疾患（例えばレッグ−カルヴェ−ペルテス病もしくは局所遊走性骨粗鬆症）、貧血状態、ステロイドに起因する症状、糖質コルチコイド誘導性骨量減少、ヘパリン誘導性骨量減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏症、骨粗鬆症、骨減少症、アルコール依存症、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性症状、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、末端肥大症、性腺機能低下症、運動抑制もしくは廃用、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、局所骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換に関連する骨量減少、ＨＩＶ関連骨量減少、成長ホルモンの損失に関連する骨量減少、嚢胞性線維症に関連する骨量減少、化学療法関連骨量減少、腫瘍誘導性骨量減少、癌関連骨量減少、ホルモン切除の骨量減少、多発性骨髄腫、薬物誘導性骨量減少、拒食症、疾患関連顔面骨量減少、疾患関連頭蓋骨量減少、顎の疾患関連骨量減少、頭蓋の疾患関連骨量減少、加齢に関連する骨量減少、加齢に関連する顔面骨量減少、加齢に関連する頭蓋骨量減少、加齢に関連する顎骨減少、加齢に関連する頭骨量減少、または宇宙旅行に関連する骨量減少を含む、減少した骨密度に関連した任意の障害（骨関連障害）を処置するために、本明細書に記載の製剤を使用する方法が記載される。
本明細書に記載の製剤は、整形外科的処置、歯科的処置、移植手術、関節置換、骨グラフト、骨美容整形手術および骨修復、例えば骨折治癒、癒着不能治癒、遷延治癒および顔の形成における結果を改善するために有用である。１つ以上の製剤が、処置、置換、グラフト、手術または修復の前、間、および／または後に投与されてもよい。
また、本明細書に記載の製剤を含む歯科インプラント、マトリックス、ゲルおよび創傷包帯材も企図される。いくつかの実施形態において、歯科インプラント、マトリックス、ゲルおよび創傷包帯材は、製剤でコーティングされる。他の実施形態において、製剤は、任意選択で歯科インプラント、マトリックスまたは創傷包帯材の適用前（または後）に、標的領域（すなわち、対象の罹患歯茎領域または罹患歯周ポケット）に適用される。これらの実施形態において、製剤は、当技術分野において知られた任意の手段により適用される。いくつかの実施形態において、製剤は、歯科インプラント、マトリックスまたは創傷包帯材の適用前に、皮下注射により標的領域に投与される。他の実施形態において、製剤は、歯科インプラント、マトリックスまたは創傷包帯材の適用前に、患部領域をブラッシングまたは別様にコーティングすることにより患部領域に投与される。
別の態様において、哺乳動物対象における骨ミネラル密度を増加させる方法であって、本明細書に記載の製剤を、骨ミネラル密度を増加させるのに効果的な量で哺乳動物対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、方法は、任意選択で、骨形成のマーカーのレベルを増加させる。いくつかの実施形態において、骨ミネラル密度は、少なくとも約７日間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、８週間、２ヶ月、３ヶ月またはそれ以上増加される。関連する態様において、哺乳動物対象における骨関連障害を処置する方法であって、本明細書に記載の製剤を、骨関連障害を処置するのに効果的な量で対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、製剤は、骨形成のマーカーのレベルを、骨マーカーレベルのない処置と比較して、少なくとも約１０％増加させる。製剤は、単回用量または複数回用量で投与され得る。例えば、本明細書に記載の製剤は、例えば骨形成を増加させるために、短期治療計画で投与されてもよく、および／または、維持治療計画において骨ミネラル密度の損失を防止するために長期で投与されてもよい。
上記方法のいずれにおいても、骨形成のマーカーのレベルは、その患者集団の処置前レベルまたは正常レベルと比較して、少なくとも約２週間、３週間、３０日、１ヶ月、６週間、２ヶ月またはそれ以上の間に、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％またはそれ以上増加される。限定されない例として、処置後３週間での骨形成のマーカーのレベルは、例えば、その患者集団の処置前レベルまたは正常レベルと比較して、少なくとも約２０％増加される。１つの例示的実施形態において、骨吸収のマーカーは、Ｉ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）の血清レベルである。他の例示的実施形態において、骨形成のマーカーは、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、オステオカルシン（ＯｓｔＣａ）、および／または１型プロコラーゲンのＮ−末端伸長（Ｐ１ＮＰ）である。
別の態様において、骨関連障害を処置する方法であって、本明細書に記載の製剤を、全身（例えば、頭部、胴体、腕および脚）または股関節（例えば、全股関節および／もしくは大腿骨頸）、脊椎（例えば、腰椎）、手首、指、脛骨ならびに／または踵の骨ミネラル密度を、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約８％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、もしくは３０％またはそれ以上増加させるのに効果的な量で哺乳動物に投与することを含む方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、処置前の哺乳動物対象の骨ミネラル密度は、骨粗鬆症または骨減少症の特徴を示し、製剤の１つ以上の用量が、骨ミネラル密度がもはや骨粗鬆症および／または骨減少症の特徴を示さないように骨ミネラル密度を改善するのに効果的な量および期間で投与される。例えば、１つ以上の用量は、初期期間で、２．５または１の若年成人の正常密度の標準偏差の範囲内（すなわち、Ｔ−スコア≧−２．５またはＴ−スコア≧−１）となるように骨ミネラル密度を増加させるように投与され得る。例示的実施形態において、初期期間は、約３ヶ月以下、６ヶ月以下、９ヶ月以下、１年以下、１８ヶ月以下、またはそれより長期である。方法は、さらに、それに続いて、任意選択で少なくとも約６ヶ月、１年、２年またはそれ以上の（例えば、対象の一生にわたる）維持期間に、骨ミネラル密度を維持するために効果的な１つ以上の量の本明細書に記載の製剤を投与することを含んでもよい。
別の態様において、本明細書に記載の製剤を投与することにより、哺乳動物対象における骨関連疾患を処置する方法が本明細書に記載され、製剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、または約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または最大約１００ｍｇ／ｋｇの用量の本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む。これらの端点の全ての間の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇもまた企図される。
いくつかの実施形態において、約５０ミリグラムから約１，０００ミリグラムまでの用量が、対象（例えば、人間対象）に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、製剤は、約５ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇまたは最大約１，０００ｍｇの抗スクレロスチン抗体の用量の本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む。これらの端点の全ての間の範囲、例えば約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２１０、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または約２８０〜約４１０ｍｇもまた企図される。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、用量は、任意の間隔で、例えば１週間に複数回（例えば、週に２回または３回）、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。いくつかの、または任意の実施形態において、約１２０ｍｇから約２１０ｍｇまでの範囲の用量の本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む製剤が、１週間に２回投与される。いくつかの、または任意の実施形態において、約１４０ｍｇの製剤の用量の本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む製剤が、１週間に２回投与される。本明細書に記載の用量のいずれも、分割用量として投与され得る。例えば、１４０ｍｇの抗スクレロスチン抗体の用量としての本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む製剤は、７０ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得る。同様に、２１０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、１０５ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得る。
さらに、低カルシウム血症または高カルシウム血症に罹患している、または罹患する危険性のある哺乳動物対象、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体による処置が禁忌である哺乳動物対象、またはビスホスホネートによる処置が禁忌である哺乳動物対象における骨関連障害を治療する方法が、本明細書に記載される。方法は、本明細書に記載の製剤を、低カルシウム血症または高カルシウム血症（例えば、臨床的に意義のある低カルシウム血症または高カルシウム血症）をもたらすことなく、骨形成のマーカーのレベルを増加させるのに効果的な量で哺乳動物対象に投与することを含む。
さらに別の態様において、第１の量であって、股関節、脊椎、手首、指、脛骨および／または踵の骨ミネラル密度を、少なくとも約３％増加させるのに効果的である量で、第１の期間、続いて骨ミネラル密度を維持するのに効果的な第２の量で第２の期間、骨関連障害を処置するための医薬の調製における、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体結晶の使用が本明細書に記載される。
また、第１の量であって、股関節、脊椎、手首、指、脛骨および／または踵の骨ミネラル密度を、少なくとも約３％増加させるのに効果的である量で、第１の期間、続いて骨ミネラル密度を維持するのに効果的な第２の量で第２の期間、骨関連障害を処置するための、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体結晶の使用が提供される。例示的用量は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜約１２ｍｇ／ｋｇ、または約０．５〜約１２ｍｇ／ｋｇ、または約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１〜約８ｍｇ／ｋｇ、または約２〜約８ｍｇ／ｋｇ、または約３〜約８ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態において、約５０ミリグラムから約１，０００ミリグラムまでの用量が、対象（例えば、人間対象）に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、製剤は、約５ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇまたは最大約１，０００ｍｇの抗スクレロスチン抗体の用量の本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体を含む。これらの端点の全ての間の範囲、例えば約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２１０、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または約２８０〜約４１０ｍｇもまた企図される。
いくつかの、または任意の実施形態において、本明細書に記載の方法または使用は、本明細書に記載の骨関連障害の治療のための第２の骨形成促進治療薬を投与することをさらに含んでもよい。この種の多くの治療薬が当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、骨形成促進治療薬は、再吸収阻害薬、骨形成薬剤、エストロゲン受容体調整剤（これらに限定されないが、ラロキシフェン、バゼドキシフェンおよびラソフォキシフェンを含む）ならびに破骨細胞に対する阻害作用を有する薬物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の骨形成促進剤は、ビスホスホネート（これらに限定されないが、アレンドロン酸ナトリウム（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、リセドロン酸塩、イバンドロン酸ナトリウム（ＢＯＮＩＶＡ（登録商標））およびゾレドロン酸（ＲＥＣＬＡＳＴ（登録商標））を含む）、エストロゲンまたはエストロゲン類似体、カルシウム源、チボロン、カルシトニン、カルシトリオールならびにホルモン補充治療薬からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の骨形成促進剤は、これらに限定されないが、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはそのペプチド断片、ＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒｐ）、骨形成タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、ＰＧＥ２作動薬、スタチン、抗ＤＫＫ１抗体もしくは阻害剤、抗ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）抗体（例えば、ＰＲＯＬＩＡ（登録商標））もしくはＲＡＮＫＬ阻害剤、ラネル酸ストロンチウム、ビタミンＤ、もしくはビタミンＤ誘導体またはその模倣薬を含む。いくつかの実施形態において、第２の骨形成促進剤は、Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）（テリパラチド、もしくは組み替えヒト副甲状腺ホルモン類似体（１−３４））またはＰｒｅｏｔａｃｔ（登録商標）（副甲状腺ホルモン）である。いくつかの、または任意の実施形態において、骨形成促進剤は、Ｐｒｏｔｅｌｏｓ（登録商標）である。
いくつかの実施形態において、第２の骨形成促進剤は、製剤と同時に投与される（例えば、処置期間内のある長さの時間）。他の実施形態において、第２の骨形成促進剤は、抗スクレロスチン抗体による処置期間が終了したら、ある長さの時間（すなわち、維持期間）投与される。そのような実施形態において、第２の骨形成促進剤は、約１週間〜約５年の維持期間投与される。
方法は、さらに、それに続いて、処置期間が終了した後、任意選択で少なくとも約１２週間、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上の（例えば、対象の一生にわたる）維持期間に、骨ミネラル密度を維持するために効果的な１つ以上の量の製剤を投与することを含んでもよい。
本発明の追加の態様を、以下の番号付けされた項に定義または要約する。
１．配列番号３および５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号１３および１５のアミノ酸配列を有する、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶。
２．抗体の少なくとも７０％が結晶形態である、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を含む無菌製剤。
３．抗体の少なくとも９０％が結晶形態である、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を含む無菌製剤。
４．ＩｇＧ抗体は、配列番号３および５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号１３および１５のアミノ酸配列を有する、項２または項３に記載の製剤。
５．結晶は、最大５００μｍの長さを有する、前項のいずれか一項に記載の結晶または製剤。
６．結晶は、楕円体、棒および針からなる群から選択される形状を有する、前項のいずれか一項に記載の結晶または製剤。
７．最大約５００μｍの長さ、ならびに楕円体、棒および針またはそれらの混合からなる群から選択される形状を有する結晶を含む、前項のいずれか一項に記載の製剤。
８．結晶は、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、タクシメート、クエン酸ナトリウム二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酢酸塩、酢酸カルシウム、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、硫酸リチウム、塩化マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化セシウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムおよびギ酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含む、前項のいずれか一項に記載の結晶または製剤。
９．凍結乾燥製剤である、前項のいずれか一項に記載の製剤。
１０．液体製剤である、前項のいずれか一項に記載の製剤。
１１．製剤１ｍｌ当たり少なくとも約１００ｍｇの前記抗体の濃度を有する、項１０に記載の製剤。
１２．１．５ｍｌ以下の液体中に分散した少なくとも約１４０ｍｇの抗体を含む、項１０に記載の製剤。
１３．臨床的に許容される量の力を使用して、２０ゲージ針またはそれより微細な針を有するシリンジを通して注射可能である、項１１または項１２に記載の製剤。
１４．同じ用量および同じ様式で与えられた場合、結晶化していない前記抗体の液体製剤の少なくとも５０％のｉｎ ｖｉｖｏ活性を維持する、前項のいずれか一項に記載の製剤。
１５．哺乳動物対象に投与された際に、製剤、および結晶化していない抗体の液体製剤が、同じ用量および同じ様式で対象に投与された場合、結晶化していない抗体の液体製剤により媒介される骨ミネラル密度増加のレベルの少なくとも約７０％である骨ミネラル密度の増加を媒介する、項１１または項１２に記載の製剤。
１６．単回用量として投与される、項１４または項１５に記載の製剤。
１７．複数回用量で投与される、項１４または項１５に記載の製剤。
１８．少なくとも２０％のＰＥＧ−３３５０を含む、前項のいずれか一項に記載の製剤。
１９．少なくとも１０％のＰＥＧ−８０００を含む、前項のいずれか一項に記載の製剤。
２０．製剤のオスモル濃度は、約１８０〜約４２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である、前項のいずれか一項に記載の製剤。
２１．０．５〜２ｍＬの体積への懸濁のための少なくとも５０ｍｇの項１に記載の抗体結晶を含む容器。
２２．項２または項３に記載の製剤を含む容器。
２３．バイアル、シリンジまたは注射デバイスである、項２１または２２に記載の容器。
２４．シリンジ針が２０ゲージまたはそれより微細である、項２３に記載の容器。
２５．項９に記載の製剤を再懸濁させる方法であって、製剤を約０．５〜２ｍＬの無菌懸濁ビヒクルに接触させることを含む方法。
２６．懸濁ビヒクルは、グルタメート、ソルビトール、ＨＥＰＥＳ、デキストロースおよび水またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、項２５に記載の方法。
２７．配列番号３および５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号１３および１５のアミノ酸配列を有する、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を作製する方法であって、結晶が形成されるように、任意選択で約６〜約８のｐＨで、抗体の溶液を、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、タクシメート、クエン酸ナトリウム二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酢酸塩、酢酸カルシウム、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、硫酸リチウム、酢酸リチウム二水和物、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム四水和物、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化セシウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムおよびギ酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含む結晶化試薬と組み合わせることを含む、方法。
２８．塩の濃度は、約０．１Ｍから約１０Ｍまでである、項２７に記載の方法。
２９．試薬は、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、項２７に記載の方法。
３０．ＭＰＤは、約０．１％〜約５０％の濃度で存在する、項２７に記載の方法。
３１．ＰＥＧは、約４００ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの分子量を有する、項２７に記載の方法。
３２．ＰＥＧは、０．１％〜約５０％の濃度で存在する、項３１に記載の方法。
３３．配列番号３および５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号１３および１５のアミノ酸配列を有する、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を作製する方法であって、結晶が形成されるように、抗体の溶液を、コハク酸、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００およびイソプロパノールからなる群から選択される要素を含む結晶化試薬と組み合わせることを含む、方法。
３４．結晶化試薬は、
（ａ）約０．１Ｍから約５Ｍまでのコハク酸、約０．１Ｍから約５ＭまでのＨＥＰＥＳおよび約０．１％（ｗ／ｖ）から約６０％（ｗ／ｖ）までのポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００、
（ｂ）約１％（ｗ／ｖ）から約５０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−８０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのイミダゾールおよび約０．１Ｍから約５Ｍまでの酢酸カルシウム、
（ｃ）約１％（ｗ／ｖ）から約５０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−８０００、約０．０５Ｍから約５ＭまでのＴＲＩＳおよび約０．０５Ｍから約５Ｍまでの塩化マグネシウム、
（ｄ）約１０％から約８０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−１０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのリン酸ナトリウム／カリウムおよび約０．０５Ｍから約５Ｍまでの塩化ナトリウム、
（ｅ）約１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−８０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのカコジル酸塩、約０．１Ｍから約２Ｍまでの酢酸カルシウム、および約１０％から約３０％（ｗ／ｖ）までのグリセロール、または、
（ｆ）約１０％から約３０％までのイソプロパノールおよび約０．１Ｍから約２Ｍまでのリン酸ナトリウム／カリウムを含む、項３３に記載の方法。
３５．結晶が形成した後の結晶化試薬の少なくとも一部を除去することをさらに含む、項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．結晶化試薬の一部は、遠心分離により除去される、項３５に記載の方法。
３７．結晶は、有機添加剤を含有する溶液に入れられる、項３５に記載の方法。
３８．溶液への賦形剤の添加をさらに含む、項３７に記載の方法。
３９．賦形剤は、スクロース、トレハロース、およびソルビトールからなる群から選択される、項３８に記載の方法。
４０．有機添加剤は、エタノールまたはイソプロパノールである、項３７に記載の方法。
４１．形成した結晶を乾燥させることをさらに含む、項２７または項３３に記載の方法。
４２．結晶は、空気への暴露により、または真空への暴露により、または窒素ガスへの暴露により乾燥される、項４１に記載の方法。
４３．抗体の少なくとも８０％が結晶化する、項２７または３３に記載の方法。
４４．バッチ結晶化法である、項２７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．項２７または項３３に記載の方法により生成される抗体結晶。
４６．哺乳動物対象において、骨ミネラル密度を増加させる、骨密度の減少に関連した障害を処置する、骨関連障害を処置する、または処置、置換、グラフト、手術もしくは修復の結果を改善する方法であって、前項のいずれか一項に記載の製剤を、対象における骨ミネラル密度を増加させるのに効果的な量で投与することを含む方法。
４７．配列番号２３および２５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号３３および３５のアミノ酸配列を有する、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶。
４８．結晶は、約１００μＭ〜約５００μＭ、または約５μＭ〜約５０μＭの長さを有する、項４７に記載の結晶。
４９．結晶は、楕円体形状を有する、項４７または４８に記載の結晶。
５０．結晶は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびヒスチジンからなる群から選択される塩を含む、項４７〜４９のいずれか一項に記載の結晶。
５１．抗体の少なくとも７０％が結晶形態である、項４７に記載の抗体結晶を含む無菌製剤。
５２．結晶は、最大約５００μｍの長さを有する、項４７〜５１のいずれか一項に記載の結晶または製剤。
５３．結晶は、楕円体、棒および針からなる群から選択される形状を有する、項４７〜５１のいずれか一項に記載の結晶または製剤。
５４．最大約５００μｍの長さ、ならびに楕円体、棒および針またはそれらの混合からなる群から選択される形状を有する結晶を含む、項５１〜５３のいずれか一項に記載の製剤。
５５．配列番号２３および２５の軽鎖および重鎖可変領域を含み、好ましくは配列番号３３および３５のアミノ酸配列を有する、抗スクレロスチンＩｇＧ抗体の結晶を作製する方法であって、結晶が形成されるように、抗体の溶液を、任意選択で約６〜約８のｐＨで、リン酸カリウムおよびヒスチジンからなる群から選択される塩を含む結晶化試薬と組み合わせることを含む、方法。
５６．塩の濃度は、約１〜３０ｍＭ、任意選択で約１０ｍＭである、項５５に記載の方法。
５７．結晶化試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、項５５または５６に記載の方法。
５８．結晶が形成した後の結晶化試薬の少なくとも一部を除去することをさらに含む、項５５に記載の方法。
５９．結晶化試薬の一部は、遠心分離により除去される、項５８に記載の方法。
６０．結晶は、有機添加剤を含有する溶液に入れられる、項５５に記載の方法。
６１．溶液への賦形剤の添加をさらに含む、項５５に記載の方法。
６２．賦形剤は、スクロース、トレハロース、またはソルビトールからなる群から選択される、項６１に記載の方法。
６３．有機添加剤は、エタノールまたはイソプロパノールである、項６０に記載の方法。
６４．形成した結晶を乾燥させることをさらに含む、項５５に記載の方法。
６５．結晶は、空気への暴露により、または真空への暴露により、または窒素ガスへの暴露により乾燥される、項６４に記載の方法。
６６．項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法により生成される抗体結晶。
６７．凍結乾燥製剤である、項５１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
６８．液体製剤である、項５１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
６９．製剤１ｍｌ当たり少なくとも約１００ｍｇの前記抗体の濃度を有する、項６８に記載の製剤。
７０．結晶は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびヒスチジンからなる群から選択される塩を含む、項５１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
７１．スクロース、トレハロースおよび／またはソルビトールを含む、項５１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
７２．製剤のオスモル濃度は、約１８０〜約４２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である、項６８に記載の製剤。
７３．１．５ｍｌ以下の液体中に分散した少なくとも約１４０ｍｇの抗体を含む、項６８に記載の製剤。
７４．臨床的に許容される量の力を使用して、２０ゲージ針またはそれより微細な針を有するシリンジを通して注射可能である、項６９または７３に記載の製剤。
７５．同じ用量および同じ様式で与えられた場合、結晶化していない前記抗体の液体製剤の少なくとも５０％のｉｎ ｖｉｖｏ活性を維持する、項５１〜５４および６６〜７５のいずれか一項に記載の製剤。
７６．０．５〜２ｍＬの体積への懸濁のための少なくとも５０ｍｇまたはそれ以上の項６６に記載の抗体結晶を含む容器。
７７．項５１の製剤を含む容器。
７８．バイアル、シリンジまたは注射デバイスである、項７７に記載の容器。
７９．シリンジは、２０ゲージまたはそれより微細な針を有する、項７８に記載の容器。
８０．項６７に記載の製剤を再懸濁させる方法であって、結晶を約０．５〜２ｍＬの無菌懸濁ビヒクルに接触させることを含む方法。
８１．同じ用量および同じ様式で与えられた場合、結晶化していない前記抗体の液体製剤の少なくとも５０％のｉｎ ｖｉｖｏ活性を維持する、項５１〜５４および６６〜７５のいずれか一項に記載の製剤。
８２．哺乳動物対象に投与された際に、結晶化していない前記抗体の液体製剤により媒介される骨ミネラル密度増加のレベルの少なくとも約７０％である骨ミネラル密度の増加を媒介し、製剤、および結晶化していない抗体の液体製剤は、同じ用量および同じ様式で対象に投与される、項５１〜５４および６６〜７５のいずれか一項に記載の製剤。
８３．単回用量として投与される、項８１または８２に記載の製剤。
８４．複数回用量で投与される、項８１または８２に記載の製剤。
８５．哺乳動物対象において、骨ミネラル密度を増加させる、骨密度の減少に関連した障害を処置する、骨関連障害を処置する、または処置、置換、グラフト、手術もしくは修復の結果を改善する方法であって、項５１〜５４および６６〜７５のいずれか一項に記載の製剤を、対象における骨ミネラル密度を増加させるのに効果的な量で投与することを含む方法。
本明細書における様々な実施形態は、「含む」という言語を用いて示されているが、様々な状況において、関連する実施形態はまた、「〜からなる」または「本質的に〜からなる」という言語を用いて説明され得ることを理解されたい。「１つ（ａまたはａｎ）」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を示すように理解されることに留意されたい。したがって、「１つ（ａまたはａｎ）」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において、交換可能に使用され得る。
値の範囲を説明する際に、説明されている特性は、範囲内に見出される個々の値であってもよいことを理解されたい。例えば、「約ｐＨ４から約ｐＨ６までのｐＨ」は、これらに限定されないが、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５等、およびそのような値の間の任意の値であってもよい。さらに、「約ｐＨ４から約ｐＨ６までのｐＨ」は、保存中に問題の製剤のｐＨがｐＨ４からｐＨ６までの範囲内で２ｐＨ単位変動することを意味するように解釈されるべきではなく、値は、溶液のｐＨのその範囲内で選択することができ、ｐＨは、ほぼそのｐＨで緩衝が維持される。いくつかの実施形態において、「約」という用語が使用される場合、これは、列挙された数字プラスマイナス列挙された数字の５％、１０％、１５％またはそれ以上を意味する。意図される実際の変動は、文脈から決定され得る。
本明細書に記載の範囲のいずれにおいても、範囲の端点はその範囲に含まれる。しかしながら、本説明は、下限および／または上限の端点が除外される同じ範囲も企図する。本発明の追加的特徴および変形例は、図面および詳細な説明を含む本出願の全内容から当業者に明らかとなり、そのような特徴は全て、本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載される本発明の特徴は、特徴の組み合わせが本発明の態様または実施形態として上記で具体的に言及されているかとは無関係に、同じく本発明の態様として意図される追加の実施形態に再び組み合わされてもよい。また、本発明に重要であるとして説明されるそのような限定のみが、そのようなものとして考慮されるべきであり、本明細書において重要であるとして説明されていない限定を有さない本発明の変動は、本発明の態様として意図される。
図１Ａは、様々なＡｂ−３０Ｒｍ結晶化スクリーンに対するオスモル濃度データを示す。 図１Ｂは、組成物Ａｂ−３０Ｒｍ、ＬＩＳＳ ＢｕｆｆｅｒｓおよびＸ％ ＰＥＧ−３３５０のオスモル濃度データを示すグラフである。 Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｃａｍ ＭＲｃ顕微鏡を使用して観察および記録された、＃１２ ０．０５Ｍ トリス ｐＨ８．０中および異なるパーセンテージのＰＥＧ−３３５０でのＡｂ−３０Ｒｍ結晶形態を示す図である。 様々な懸濁ビヒクルに対するＡｂ−３０結晶の溶解速度を示すグラフである。 同上。 結晶形態に基づくＡｂ−３０結晶の溶解速度を示すグラフである。 結晶充填に基づくＡｂ−３０結晶の溶解速度を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 温度および結晶形態に基づくＡｂ−３０結晶の溶解速度を示すグラフである。 同上。 緩衝剤／ビヒクルの単回注射または「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ（５０ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射または「結晶／結晶性」Ａｂ−３０Ｒｍ（５０ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射の投与後の、腰椎で測定された経時的な絶対骨ミネラル密度（ＢＭＤ）（Ａ）およびベースラインからのパーセント変化（Ｂ）としてのラットにおけるＢＭＤを示す図である。ＢＬ＝ベースラインである。データは、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。緩衝液／ビヒクル対照群に対する統計的に有意な差は、アスタリスクで示されている。ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｔｅｓｔにより、＊ｐ＜０．０５対ビヒクルである。緩衝液／ビヒクル群に対して、Ｎ＝９である。「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ群に対して、Ｎ＝１０である。「結晶／結晶性」Ａｂ−３０Ｒｍ群に対して、Ｎ＝１０である。 同上。 緩衝剤／ビヒクルの単回注射または「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ（５０ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射または「結晶／結晶性」Ａｂ−３０Ｒｍ（５０ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射の投与後の、脚（大腿骨−脛骨）で測定された経時的な絶対骨ミネラル密度（ＢＭＤ）（Ａ）およびベースラインからのパーセント変化（Ｂ）としてのラットにおけるＢＭＤを示す図である。ＢＬ＝ベースラインである。データは、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。緩衝液／ビヒクル対照群に対する統計的に有意な差は、アスタリスクで示されている。図８Ｂに対して、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｔｅｓｔにより＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクルである。各群に対して、Ｎ＝８、緩衝液／ビヒクル群に対して、Ｎ＝９である。「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ群に対して、Ｎ＝１０である。「結晶／結晶性」Ａｂ−３０Ｒｍ群に対して、Ｎ＝１０である。 同上。 緩衝剤／ビヒクルの単回注射または「液体」Ａｂ−３０（１００ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射または結晶製剤Ｗ３５、Ｉ３４、Ｉ３６もしくはＷ４６の「結晶／結晶性」Ａｂ−３０（１００ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射の投与後の、腰椎で測定された経時的な絶対骨ミネラル密度（ＢＭＤ）（Ａ）およびベースラインからのパーセント変化（Ｂ）としてのラットにおけるＢＭＤを示す図である。ＢＬ＝ベースラインである。データは、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。緩衝液／ビヒクル対照群に対する統計的に有意な差は、アスタリスクで示されている。図９Ａに対して、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｔｅｓｔにより＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクルである。図９Ｂに対して、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｔｅｓｔにより＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクルである。 同上。 緩衝剤／ビヒクルの単回注射または「液体」Ａｂ−３０（１００ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射または結晶製剤Ｗ３５、Ｉ３４、Ｉ３６もしくはＷ４６の「結晶／結晶性」Ａｂ−３０（１００ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）の単回注射の投与後の、脚（大腿骨−脛骨）で測定された経時的な絶対骨ミネラル密度（ＢＭＤ）（Ａ）およびベースラインからのパーセント変化（Ｂ）としてのラットにおけるＢＭＤを示す図である。ＢＬ＝ベースラインである。データは、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。緩衝液／ビヒクル対照群に対する統計的に有意な差は、アスタリスクで示されている。図１０Ｂに対して、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｔｅｓｔにより＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクルである。各群に対して、Ｎ＝８である。 同上。
本明細書において、非経口投与用製剤における使用に好適な抗スクレロスチン免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の結晶、医薬としての使用のための製剤を調製するためにＡｂ−３０またはＡｂ−３１のような結晶を使用する方法、高濃度の結晶性抗スクレロスチン抗体を含む製剤、これらの製剤を処置に使用する方法、これらの製剤を、例えば皮下または筋肉内投与する方法、およびこれらの製剤を含む容器もしくはキットが記載される。
Ｉ．製剤中の抗体
いくつかの実施形態において、製剤中の抗スクレロスチン抗体は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０１ｍｇ／ｍｌ、約１０２ｍｇ／ｍｌ、約１０３ｍｇ／ｍｌ、約１０４ｍｇ／ｍｌ、約１０５ｍｇ／ｍｌ、約１０６ｍｇ／ｍｌ、約１０７ｍｇ／ｍｌ、約１０８ｍｇ／ｍｌ、約１０９ｍｇ／ｍｌ、約１１０ｍｇ／ｍｌ、約１１１ｍｇ／ｍｌ、約１１２ｍｇ／ｍｌ、約１１３ｍｇ／ｍｌ、約１１４ｍｇ／ｍｌ、約１１５ｍｇ／ｍｌ、約１１６ｍｇ／ｍｌ、約１１７ｍｇ／ｍｌ、約１１８ｍｇ／ｍｌ、約１１９ｍｇ／ｍｌ、約１２０ｍｇ／ｍｌ、約１２１ｍｇ／ｍｌ、約１２２ｍｇ／ｍｌ、約１２３ｍｇ／ｍｌ、約１２４ｍｇ／ｍｌ、約１２５ｍｇ／ｍｌ、約１２６ｍｇ／ｍｌ、約１２７ｍｇ／ｍｌ、約１２８ｍｇ／ｍｌ、約１２９ｍｇ／ｍｌ、約１３０ｍｇ／ｍｌ、約１３１ｍｇ／ｍｌ、約１３２ｍｇ／ｍｌ、約１３２ｍｇ／ｍｌ、約１３３ｍｇ／ｍｌ、約１３４ｍｇ／ｍｌ、約１３５ｍｇ／ｍｌ、約１３６ｍｇ／ｍｌ、約１３７ｍｇ／ｍｌ、約１３８ｍｇ／ｍｌ、約１３９ｍｇ／ｍｌ、約１４０ｍｇ／ｍｌ、約１４１ｍｇ／ｍｌ、約１４２ｍｇ／ｍｌ、約１４３ｍｇ／ｍｌ、約１４４ｍｇ／ｍｌ、約１４５ｍｇ／ｍｌ、約１４６ｍｇ／ｍｌ、約１４７ｍｇ／ｍｌ、約１４８ｍｇ／ｍｌ、約１４９ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１５１ｍｇ／ｍｌ、約１５２ｍｇ／ｍｌ、約１５３ｍｇ／ｍｌ、約１５４ｍｇ／ｍｌ、約１５５ｍｇ／ｍｌ、約１５６ｍｇ／ｍｌ、約１５７ｍｇ／ｍｌ、約１５８ｍｇ／ｍｌ、約１５９ｍｇ／ｍｌ、約１６０ｍｇ／ｍｌ、約１６１ｍｇ／ｍｌ、約１６２ｍｇ／ｍｌ、約１６３ｍｇ／ｍｌ、約１６４ｍｇ／ｍｌ、約１６５ｍｇ／ｍｌ、約１６６ｍｇ／ｍｌ、約１６７ｍｇ／ｍｌ、約１６８ｍｇ／ｍｌ、約１６９ｍｇ／ｍｌ、約１７０ｍｇ／ｍｌ、約１７１ｍｇ／ｍｌ、約１７２ｍｇ／ｍｌ、約１７３ｍｇ／ｍｌ、約１７４ｍｇ／ｍｌ、約１７５ｍｇ／ｍｌ、約１７６ｍｇ／ｍｌ、約１７７ｍｇ／ｍｌ、約１７８ｍｇ／ｍｌ、約１７９ｍｇ／ｍｌ、約１８０ｍｇ／ｍｌ、約１８１ｍｇ／ｍｌ、約１８２ｍｇ／ｍｌ、約１８３ｍｇ／ｍｌ、約１８４ｍｇ／ｍｌ、約１８５ｍｇ／ｍｌ、約１８６ｍｇ／ｍｌ、約１８７ｍｇ／ｍｌ、約１８８ｍｇ／ｍｌ、約１８９ｍｇ／ｍｌ、約１９０ｍｇ／ｍｌ、約１９１ｍｇ／ｍｌ、約１９２ｍｇ／ｍｌ、約１９３ｍｇ／ｍｌ、約１９４ｍｇ／ｍｌ、約１９５ｍｇ／ｍｌ、約１９６ｍｇ／ｍｌ、約１９７ｍｇ／ｍｌ、約１９８ｍｇ／ｍｌ、約１９９ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌの濃度（「高タンパク質濃度」）で存在し、例えば、約４００ｍｇ／ｍｌ、約３９０ｍｇ／ｍｌ、約３８０ｍｇ／ｍｌ、約３７０ｍｇ／ｍｌ、約３６０ｍｇ／ｍｌ、約３５０ｍｇ／ｍｌ、約３４０ｍｇ／ｍｌ、約３３０ｍｇ／ｍｌ、約３２０ｍｇ／ｍｌ、約３１０ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ、約２９０ｍｇ／ｍｌ、約２８０ｍｇ／ｍｌ、約２７０ｍｇ／ｍｌ、約２６０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ、または約２４０ｍｇ／ｍｌまでの範囲であってもよい。これらに限定されないが、約７０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ〜約１４０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ〜約２１０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌ、約２８０ｍｇ／ｍｌ〜約４１０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約３２０ｍｇ／ｍｌまたは約１００ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌを含む、上記端点の組み合わせを考慮した任意の範囲が企図される。
抗スクレロスチン抗体は、任意選択で、単回用量（例えば、約７０〜約４５０ｍｇの抗スクレロスチン抗体）として製剤化される。いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも約５ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇまたは最大約１，０００ｍｇの抗スクレロスチン抗体を含む。これらの端点の全ての間の範囲、例えば約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２８０、約７０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または約２８０ｍｇ〜約４１０ｍｇの抗スクレロスチン抗体もまた企図される。用量は、任意の間隔で、例えば１週間に複数回（例えば、週に２回または３回）、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。例えば、いくつかの、または任意の実施形態において、約１２０ｍｇ〜約２１０ｍｇの範囲の抗スクレロスチン抗体の用量が、１週間に２回投与される。いくつかの、または任意の実施形態において、約１４０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体が、１週間に２回投与される。本明細書に記載の用量のいずれも、分割用量として投与され得る。例えば、１４０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、７０ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得る。同様に、２１０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、１０５ｍｇの抗スクレロスチン抗体の２回の注射として投与され得、また１４０ｍｇの用量の抗スクレロスチン抗体は、２０ｍｇの抗スクレロスチン抗体の７回の注射として投与され得る。
いくつかの実施形態において、製剤は、約７０ｍｇまたは７５ｍｇの抗スクレロスチン抗体を含み、これは、約１ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与するのに好適である。他の実施形態において、製剤は、約５０ｍｇ、または約６０ｍｇ、または約７０ｍｇ、または約８０ｍｇ、または約９０ｍｇ、または約１００ｍｇ、または約１２０ｍｇ、または約１３０ｍｇ、または約１４０ｍｇ、または約１５０ｍｇ、または約１６０ｍｇ、または約１７０ｍｇ、または約１８０ｍｇ、または約１９０ｍｇ、または約２００ｍｇ、または約２１０ｍｇ、または約２２０ｍｇ、または約２３０ｍｇ、または約２４０ｍｇ、または約２５０ｍｇ、または約２５０ｍｇ〜約４５０ｍｇ、または約２８０ｍｇ、または２９０ｍｇ、または３００ｍｇ、または約３５０ｍｇ、または３６０ｍｇ、または約４２０ｍｇ、または４３０ｍｇ、または４４０ｍｇ、または４５０ｍｇの抗スクレロスチン抗体を含む。そのような実施形態のいずれにおいても、製剤は、約２〜約６ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ（体重）（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ、または約４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ、または約６ｍｇ／ｋｇ（体重））の単回用量を投与するのに好適な抗スクレロスチン抗体の量を含む。
いくつかの実施形態において、抗スクレロスチン抗体は、Ａｂ−３０である。いくつかの実施形態において、抗スクレロスチン抗体は、Ａｂ−３１である。抗体Ａｂ−３０およびＡｂ−３１は、以前に米国特許出願公開第２００７／０１１０７４７号に記載されており、その開示は、配列表を含めて、参照により全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、抗スクレロスチン抗体は、Ａｂ−３０Ｒ（配列番号１６〜１９）、またはＡｂ−３０Ｒｍ（配列番号１７および１９〜２１）である。
本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体は、配列番号１のスクレロスチンに、１０−６Ｍ以下、または１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下、または１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する。親和性は、例えば米国特許出願公開第２００７／０１１０７４７号に記載のようなＢｉａｃｏｒｅ技術およびＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野において知られている任意の手段により決定され得る。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の重鎖および／または軽鎖を含む。定常領域を含む抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１の成熟全長軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１３および１５、配列番号１６および１９、配列番号２０および１９、および配列番号３３および３５に記載される。定常領域を含む抗体Ａｂ−３０およびＡｂ−３１の全長軽鎖および重鎖をコード化する対応するｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１２および１４、配列番号３２および３４に記載される。
「Ａｂ−３０抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの重鎖および２つの軽鎖で構成されるＩｇＧ免疫グロブリンを指し、重鎖は、ＩｇＧ定常領域に融合した配列番号５（Ａｂ−３０重鎖可変領域）を含み、軽鎖は、軽鎖定常領域に融合した配列番号３（Ａｂ−３０軽鎖可変領域）を含む。好ましくは、Ａｂ−３０は、それぞれ配列番号１５および１３に記載される成熟重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、２、３もしくは４のヒト重鎖定常領域に融合した抗体Ａｂ−３０配列番号５（Ａｂ−３０重鎖可変領域）（例えば、天然、コンセンサスもしくは修飾されている、および、結合に影響しないことが知られているいくつかの修飾が当該技術分野において知られている）、ならびに／または、ヒト軽鎖定常領域に融合した配列番号３（Ａｂ−３０軽鎖可変領域）（例えば、天然、コンセンサスもしくは結合に影響しないことが知られているいくつかの修飾を有するように修飾されている）、アイソタイプＩｇＧ１、２、３もしくは４のヒト重鎖定常領域に融合した配列番号１７（Ａｂ−３０Ｒ重鎖可変領域）、ならびに／または、ヒト軽鎖可変領域に融合した配列番号１６（Ａｂ−３０Ｒ軽鎖可変領域）；アイソタイプＩｇＧ１、２、３もしくは４のヒト重鎖定常領域に融合した配列番号１７（Ａｂ−３０Ｒｍ重鎖可変領域）、ならびに／または、ヒト軽鎖定常領域に融合した配列番号２０（Ａｂ−３０Ｒｍ軽鎖可変領域）の、重鎖および／または軽鎖可変領域を含む。
「Ａｂ−３１抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの重鎖および２つの軽鎖で構成されるＩｇＧ免疫グロブリンを指し、重鎖は、ＩｇＧ定常領域に融合した配列番号２５（Ａｂ−３１重鎖可変領域）を含み、軽鎖は、軽鎖定常領域に融合した配列番号２３（Ａｂ−３１軽鎖可変領域）を含む。好ましくは、Ａｂ−３１は、それぞれ配列番号３５および３３に記載される成熟重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、２、３もしくは４のヒト重鎖定常領域に融合した抗体Ａｂ−３１配列番号２５（Ａｂ−３０重鎖可変領域）（例えば、（例えば、天然、コンセンサスもしくは結合に影響しないことが知られているいくつかの修飾を有するように修飾されている）、ならびに／または、ヒト軽鎖定常領域に融合した配列番号２３（Ａｂ−３１軽鎖可変領域）（例えば、（例えば、天然、コンセンサスもしくは結合に影響しないことが知られているいくつかの修飾を有するように修飾されている）の重鎖および／または軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１の、重鎖および／もしくは軽鎖、または代替として、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡを哺乳動物宿主細胞において発現させることにより得ることができるアミノ酸配列を含む。「抗体」という用語は、無傷免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧの場合、２つの重鎖および２つの軽鎖（例えば、好ましくは全長重鎖および／または軽鎖を有し、任意選択で、抗スクレロスチン結合特性を維持するフレームワークまたは定常領域内に変異を有する、キメラ、ヒト化、またはヒト型）で構成される四量体免疫グロブリンを指す。
「単離された」抗体は、本明細書においてその用語が定義されるように、その自然環境の成分から分離された抗体を指す。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療上の使用に干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質溶質を含み得る。ある特定の実施形態において、抗体は、（１）９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超の抗体まで、（２）Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用した還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。単離された自然発生的抗体は、組み換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕの抗体を含むが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
「モノクローナル」抗体は、多様なエピトープに結合する多様な配列の抗体の混合集団を指す「ポリクローナル」抗体と比較して、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な自然発生的変異を除いて同一である。「ヒト化抗体」という用語は、配列をより人間のようにする修飾を含む非ヒト抗体、典型的にはげっ歯類モノクローナル抗体の配列から得られる抗体を指す。代替として、ヒト化抗体は、キメラ抗体から得ることができる。「ヒト」抗体という語句は、例えば、ヒト抗体遺伝子のスクリーニングライブラリを通じて、ファージディスプレイ等の既知の技術によりヒト配列から得られる抗体、または、内因性免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作された形質転換動物を使用して生成される抗体を指す。
「免疫グロブリンＧ」または「天然ＩｇＧ抗体」は、四量体糖タンパク質である。自然発生的免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を画定する。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して異なるクラスに帰属させることができる。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。これらのいくつかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
「超可変」領域という用語は、相補性決定領域またはＣＤＲからのアミノ酸残基（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）により説明されるような軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３））を指す。「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外のそれらの可変領域残基である。
「変異体」という用語は、抗体と関連して使用される場合、変異体が所望の結合親和性または生物活性を維持する限り、可変領域または可変領域に等価な部分において少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を指す。さらに、本明細書に記載のような抗体は、半減期もしくはクリアランス、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含む、抗体のエフェクター機能を修飾するアミノ酸修飾を定常領域に有してもよい。そのような修飾は、例えば、薬物動態を向上させる、または抗体の治療有効性を向上させることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジまたはＣＨ２領域に対する修飾は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含むエフェクター機能を増加または減少させ得る。他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域は、抗体−抗原凝集体形成を減少させるように修飾される。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域への修飾は、半抗体の形成を低減し得る。
「修飾」という用語は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと関連して使用される場合、これらに限定されないが、１つ以上のアミノ酸変化（置換、挿入または欠失を含む）、スクレロスチン結合活性に干渉しない化学修飾、治療または診断薬剤への共役による共有結合修飾、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等の共有ポリマー結合および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明の修飾ポリペプチド（抗体を含む）は、本発明の非修飾分子の結合特性を維持する。
「誘導体」という用語は、本発明の抗体またはポリペプチドと関連して使用される場合、治療または診断薬剤への共役、標識化（例えば、放射性各種または様々な酵素による）、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等の共有ポリマー結合、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換により共有結合修飾された抗体またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、本発明の誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を維持する。
タンパク質および非タンパク質薬剤は、当該技術分野において知られている方法により抗体に共役し得る。共役方法は、直接結合、共有結合したリンカーによる結合、および特異的結合対要素（例えば、アビジン−ビオチン）を含む。そのような方法は、例えば、ドキソルビシンの共役に関してはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０，６６００−６６０７（１９９０）により説明されるもの、および白金化合物の共役に関してはＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３，７９−９０（１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５，５０８−５１４（１９９１）により説明されるものを含む。
ＩＩ．結晶、結晶製剤および組成物の生成
ポリペプチド結晶は、水溶液から、または有機溶媒もしくは添加剤を含有する水溶液からのポリペプチドの制御結晶化により成長する。制御され得る溶液条件は、例えば、溶媒、有機溶媒または添加剤の蒸発速度、適切な共溶質および緩衝剤の存在、ｐＨ、ならびに温度を含む。タンパク質の結晶化に影響する様々な因子の包括的な考察は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１４：１１２−１２０）により公開されている。さらに、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＧｉｌｌｉｌａｎｄ（１９８８，Ｊ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，９０：５１−５９）は、結晶化したポリペプチドおよびそれらが結晶化した条件の包括的なリストをまとめた。結晶および結晶化の手法の概要、ならびに解明されたタンパク質構造の配位のレポジトリは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／； Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１２：５３５−５４２）により管理されている。しかしながら、上に挙げた参考文献のほとんどにおいて報告されている条件は、ほとんどの場合において、いくつかの大きな回折品質の結晶を生じるように最適化されていることに留意されたい。したがって、これらの条件はタンパク質ごとに変動し、所与のポリペプチドの結晶の大量生成のための高収率プロセスを提供するわけではないことが、当業者に理解される。
一般的には、結晶は、結晶化されるポリペプチド（すなわち、抗体）を、好適な水性溶媒、または、塩もしくは有機溶媒もしくは添加剤（集合的に「結晶化試薬」）等の適切な結晶化薬剤を含有する水性溶媒と組み合わせることにより生成される。溶媒は、ポリペプチドと組み合わされ、結晶化の誘導に適切であり、ポリペプチド活性および安定性の維持に許容されることが実験的に決定される温度での撹拌に供されてもよい。実験室規模の結晶化の方法は、ハンギングドロップ蒸気拡散、シッティングドロップ蒸気拡散、微小透析、マイクロバッチ、油下、ゲル中およびサンドイッチドロップ法を含む。溶媒は、任意選択で、共結晶化添加剤、例えば沈殿剤、脂肪酸、還元剤、グリセロール、スルホベタイン、界面活性剤、ポリオール、二価カチオン、補因子、またはカオトロピック剤、およびｐＨを制御するための緩衝剤種を含んでもよい。
「共結晶化添加剤」は、ポリペプチドの結晶化を促進する化合物、および／またはタンパク質を安定化し変質から保護する化合物を含む。共溶質の例は、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、フッ化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カドミウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化セシウム、塩化コバルト、ＣＨ３（ＣＨ２）１５Ｎ（ＣＨ３）３ ＋Ｂｒ．−（ＣＴＡＢ）、クエン酸ジアンモニウム、リン酸水素ジアンモニウム、リン酸ジアンモニウム、酒石酸ジアンモニウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、酒石酸二ナトリウム、ＤＬ−リンゴ酸、塩化第二鉄、Ｌ−プロリン、酢酸リチウム、塩化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、酢酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、フッ化カリウム、ギ酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム、酒石酸カリウムナトリウム、硫酸カリウム、チオシアン酸カリウム、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、コハク酸、タクシメート、クエン酸トリアンモニウム、クエン酸三リチウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、クエン酸三カリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、および共溶質を供給するように機能する他の化合物を含む。「結晶化緩衝剤」は、溶液のｐＨを、ポリペプチドの結晶化を促進する所望の範囲に維持する化合物を含む。例は、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（２，２−ビス−（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール）、ホウ酸、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（ＨＥＰＰＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＮＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、グリシル−グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、イミダゾール、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム）、ＴＡＰＳ（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、トリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、トリス−ＨＣｌ、ＴＲＩＺＭＡ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、および、溶液を特定のｐＨに、またはその近傍に維持するように機能する他の化合物を含む。
沈殿剤の選択は、結晶化に影響する１つの因子である。例として、例えば分子量６００〜２０，０００ｋＤのＰＥＧ生成物を使用することができる。ＰＥＧ−３３５０は、体積排除効果により作用する長鎖ポリマー沈殿剤または脱水剤である。硫酸アンモニウム等のリオトロピック塩は、カプリル酸等の短鎖脂肪酸と同様に、沈殿プロセスを促進する。ポリイオン性種もまた、沈殿剤として有用である。
例えば、皮下注射用製剤における使用のための抗体は、好ましくは、生理学的ｐＨ範囲で、および等張オスモル濃度を提供する結晶化試薬中で沈殿する。
添加剤、共溶質、緩衝剤等の必要性、およびそれらの濃度は、結晶化を促進するように実験的に決定される。ポリペプチドの好適な結晶化条件のいくつかの例は、以下の実施ｋ例１に記載されている。
Ａｂ−３０は、特に、様々な条件下で容易に結晶化される。Ａｂ−３０結晶の様々な形態を、拡大規模条件下で成長させることができ、液体製剤中の抗体は、ある体積の既知の結晶化試薬に添加され、密封容器内で保存される。Ａｂ−３０結晶は、室温または冷蔵温度（４℃）において２４時間未満でこれらの条件下で成長させることができ、持続放出および高収率をもたらすことが示されている。
工業規模プロセスにおいて、結晶化をもたらす制御沈殿は、ポリペプチド、沈殿剤、共溶質、および任意選択で緩衝剤の単純な組み合わせにより、バッチプロセスで最も良好に行うことができる。別の選択肢として、ポリペプチドは、出発材料としてポリペプチド沈殿物を使用すること（「播種」）により結晶化され得る。この場合、ポリペプチド沈殿物は、結晶化溶液に添加され、結晶が形成されるまでインキュベートされる。透析または蒸気拡散等の代替の実験室結晶化方法もまた適用され得る。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（上記参照）およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ（上記参照）は、結晶化に関する文献での考察において、好適な条件の包括的なリストを含む。時折、結晶化ポリペプチドが架橋される場合、意図される架橋剤と結晶化媒体との間の不適合性により、結晶をより安定な溶媒系に交換することが必要となり得る。
いくつかの実施形態によれば、ポリペプチド結晶、結晶製剤および組成物は、以下のプロセスにより調製される：まず、ポリペプチドが結晶化される。次に、本明細書に記載のような賦形剤または成分が、直接母液に添加される。代替として、母液が除去された後、最短で１時間から最長で２４時間、結晶が賦形剤または他の製剤成分の溶液に懸濁される。賦形剤濃度は、典型的には、約０．０１％から３０％ｗ／ｗの間であり、これは、それぞれ９９．９９％〜７０％ｗ／ｗのポリペプチド結晶濃度に対応する。一実施形態において、賦形剤濃度は、約０．１％〜１０％の間であり、これは、それぞれ９９．９％〜９０％ｗ／ｗの結晶濃度に対応する。母液は、濾過、緩衝液交換、または遠心分離により、結晶スラリーから除去することができる。その後、結晶は、任意選択で５０％〜１００％の１種以上の有機溶媒または添加剤の溶液で、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノールまたは酢酸エチル等で、室温または−２０℃〜２５℃の間の温度で洗浄される。結晶は、結晶の上に窒素、空気、または不活性ガスのストリームを通過させることにより乾燥される。代替として、結晶は、空気乾燥により、または凍結乾燥により、または真空乾燥により乾燥される。乾燥は、最終生成物の含水率が１０重量％未満、最も好ましくは５％未満となるまで、洗浄後最短１時間〜最長７２時間行われる。最後に、必要に応じて結晶の微粉化を行うことができる。ポリペプチド結晶の乾燥は、Ｎ２、空気、もしくは不活性ガスによる乾燥、真空炉乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒もしくは添加剤による洗浄に続く溶媒の蒸発、またはドラフト内での蒸発を含む手段による、水、有機溶媒もしくは添加剤、または液体ポリマーの除去である。典型的には、乾燥は、結晶が自由流動性の粉末となった時に達成される。乾燥は、湿潤結晶の上にガスのストリームを通過させることにより行われてもよい。ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。本発明のポリペプチド結晶は、ジェットミル等の好適なミル内での微粉化により、所望の粒度分布を達成するようにさらに処理されてもよく、粒子または粉末製剤の成分は、微粉化の前または後に混合されてもよい。達成される粒子の直径は、０．１〜１００マイクロメートル、または０．２〜１０マイクロメートルの範囲内、または１０〜５０マイクロメートルの範囲内、または０．５〜２マイクロメートルの範囲内であってもよい。一実施形態において、ポリペプチド結晶〜形成される粒子は、０．５〜１マイクロメートルの範囲内であり、これは、例えば吸入に好適な範囲である。
いくつかの実施形態によれば、タンパク質結晶、タンパク質結晶製剤または組成物を調製する際、結晶化の間、促進剤（例えば界面活性剤）は添加されない。賦形剤または成分は、結晶化の後、約１％〜１０％ｗ／ｗの間の濃度、代替として約０．１％〜２５％ｗ／ｗの間の濃度、代替として約０．１％〜５０％ｗ／ｗの間の濃度で母液に添加される。これらの濃度は、それぞれ、９９％〜９０％ｗ／ｗ、９９．９％〜７５％ｗ／ｗおよび９９．９％〜５０％ｗ／ｗの結晶濃度に対応する。賦形剤または成分は、母液中で結晶と共に約０．１〜３時間インキュベートされ、代替として、インキュベーションは、０．１〜１２時間行われ、代替として、インキュベーションは、０．１〜２４時間行われる。
いくつかの、または任意の実施形態において、成分または賦形剤は、母液以外の溶液に溶解され、タンパク質結晶が母液から取り出されて賦形剤または成分の溶液に懸濁される。成分または賦形剤の濃度およびインキュベーション時間は、上述のものと同じである。
ポリペプチド結晶
本明細書において使用される場合、「結晶」または「結晶性」は、物質の固体状態の一形態を指し、第２の形態、すなわち非晶質固体状態とは異なる。結晶は、格子構造を含む特徴的な外観、特徴的な形状、ならびに屈折率および複屈折等の光学特性を示す。結晶は、３次元で周期的に反復するパターンで配置された原子からなる（Ｃ．Ｓ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｔａｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５２，ｐ．１）。対照的に、非晶質材料は、物質の非結晶性固体形態であり、時折非晶質沈殿物と呼ばれる。そのような沈殿物は、結晶性固体状態に特徴的な分子格子構造を有さず、物質の結晶性形態に典型的な複屈折または他の分光学的特徴を示さない。
ポリペプチド結晶は、結晶格子として配置されたポリペプチド分子である。ポリペプチド結晶は、３次元で周期的に反復する特定のポリペプチド−ポリペプチド相互作用のパターンを含有する。本発明のポリペプチド結晶は、ポリペプチド溶液を凍結乾燥することにより得られるもの等のポリペプチドの非晶質固体形態または沈殿物とは区別されるべきものである。
ポリペプチド結晶において、ポリペプチド分子は、一緒に配置されて対称単位を形成する、非対称単位を形成する。ポリペプチド結晶の対称単位の幾何構造は、例えば、立方晶系、六方晶系、単斜晶系、斜方晶系、正方晶系、三斜晶系、または三方晶系であってもよい。その全体としての結晶の全般的構造は、例えば、両錐体、立方体、針、板、プリズム、菱形、棒、もしくは球、またはそれらの組み合わせの形態であってもよい。他の観察される形態は、ブロック状、ＵＦＯ状、フットボール状、葉状、小麦状、シングレット状、羽毛状、ストロー状、菊状、球状またはそれらの混合を含む。いくつかの実施形態において、結晶は、クラスタとして観察される。「立方」構造クラスの結晶は、より具体的には、十八面体または十二面体結晶形態を有してもよい。結晶の直径は、マーチンの直径と定義される。これは、無作為に配向した結晶を２つの等しい投影領域に分割するオキュラースケールに平行な線の長さとして計測される。針または棒等の形態の結晶はまた、本明細書において結晶の長さと呼ばれる最大寸法を有する。また、結晶は、Ｘ線回折により特性決定される。
結晶性ポリペプチドの特性試験
ポリペプチド結晶が形成された後、そのポリペプチド含量を確認し、さらにその物理構造を検査するために、結晶を様々な分析に供することができる。例えば、必要に応じて、個々の結晶を結晶化溶液から取り出して、水性または有機溶媒または添加剤で洗浄し、次いで、（例えば、空気乾燥により、結晶の上に不活性ガスのストリームを通過させることにより、凍結乾燥により、または真空により）乾燥させてもよい。結晶は単離され、結晶成長ドロップから取り出し、次いでＸ線回折のために装着され得る。
また、結晶は、当該技術分野において説明されている様々な手段により特性決定することができる。例えば、タンパク質結晶生成および製剤化手順、ならびに結晶およびその成分タンパク質の特性決定のための分析ツールの開示に関して、参照により本明細書にその全体が組み込まれるＢａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａ．４，３０１−３１７（２００４）を参照されたい。結晶性材料の同定には一般に粉末Ｘ線回折が使用されるが、非常に大量で完全なタンパク質結晶を必要とし、結晶性製剤において典型的に使用されるタンパク質微結晶には一般に適用されない。結晶の特性決定に、電子線回折および固体核磁気共鳴（ｓｓＮＭＲ）を適用することができる。結晶サイズ、形状および形態（例えば、表面形態）は、例えば、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、および／または光散乱（例えば、光子相関分光法またはＤＬＳ、小角レーザー光散乱またはＬＡＡＬＳ）により調査することができる。結晶の全表面積および空隙率もまた特性決定され得る。質量分析、マイクロ減衰全反射フーリエ変換赤外分析（ＦＴＩＲ）および／または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、タンパク質の一次および二次構造に関する情報を提供し得る。
別の例として、ポリペプチド結晶は、結晶化溶液から取り出されて洗浄される、もしくは濯がれてもよく、または、結晶化溶液の大部分が結晶から取り出されて、異なる溶液と置き換えられてもよい。このようにして、結晶化手順において使用された特定の塩は、結晶格子内で異なる塩と置き換えられてもよい。本発明の一実施形態において、結晶化したＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１抗体は、結晶化緩衝液から分離されて、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウムの塩（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、または硫酸マグネシウム）を含有する溶液中に入れられる。Ｘ線回折のために、置換溶液は、結晶化ポリペプチドの原子座標の決定に有用な重原子を含有することができる。さらなる実施形態として、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１は、Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１−スクレロスチン相互作用の詳細な構造の決定のために、スクレロスチンと共結晶化され得る。
さらなる例において、ポリペプチド結晶は、結晶化溶液から取り出されて、さらなる試験に適切な緩衝液、例えばゲル電気泳動により結晶化されたポリペプチドの分析のためのＳＤＳ含有緩衝液中に可溶化されてもよい。ゲル電気泳動によるタンパク質の分析のための方法は周知であり、銀またはクマシーブルー染料によるゲルの染色、および結晶化されたポリペプチドの電気泳動の、既知の分子量のポリペプチドマーカーの泳動との比較を含む。別の方法において、ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体の使用により、ゲル内で可視化される。また、結晶化したポリペプチドは、質量分析のために、他の分光学的散乱、屈折、回折、もしくは吸収試験のために、またはポリペプチドへの標識分子の結合によるポリペプチドの標識化のために、エドマン分解によるアミノ酸配列決定に適切な緩衝液中に可溶化されてもよい。
ＩＩＩ．治療的投与のための製剤
本明細書において使用されるような「組成物」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくとも２つの成分を含む混合物を意味する。特に、本明細書において、結晶性抗スクレロスチン抗体を含む組成物、および結晶性抗スクレロスチン抗体を使用して調製される組成物が記載される。いくつかの実施形態において、結晶性抗スクレロスチン抗体を含む、またはそれを使用して調製される組成物はまたは製剤は、それを必要とする患者に対する注射および／または投与に好適である。患者に対し薬学的な目的で投与される組成物は、実質的に無菌であり、被投与者に対し過度に毒性または感染性である薬剤を含有しない。
いくつかの実施形態において、結晶性抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０Ｒｍ、またはＡｂ−３１等の結晶性抗スクレロスチン抗体は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤の１つ以上を用いて製剤化される結晶性抗スクレロスチン抗体を含む生理学的に許容される組成物（本明細書において、薬学的組成物または薬学的製剤とも呼ばれる）の形態で投与される。そのような担体、賦形剤、または希釈剤は、使用される用量および濃度において被投与者に対し非毒性である。通常、そのような組成物の調製は、結晶性抗スクレロスチン抗体を、緩衝剤、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、低分子量ポリペプチド（例えば、１０未満のアミノ酸を有するもの）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロースもしくはデキストリン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、グルタチオンならびに他の安定剤および賦形剤の１つ以上と組み合わせることを伴う。液体製剤において、中性緩衝生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は、適切な希釈剤の例である。適切な業界標準に従い、ベンジルアルコール等の保存料もまた添加されてもよい。薬学的製剤中に使用され得る成分のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎにより共同出版されたＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに示されている。
一実施形態において、本明細書に記載の製剤は、バルク製剤として調製され、したがって、薬学的組成物の成分は、投与に必要なものより高くなるように調節され、投与前に適切に希釈されることが企図される。
本明細書に記載の抗体結晶は、保存および取り扱いに好適な形態、ならびに吸入または経肺投与に好適な形態、例えば、エアロゾル製剤の調製用粉末の形態での、固体結晶または粉末製剤として製剤化され得る。さらなる実施形態において、抗体結晶は、そのような結晶の溶液、またはそのような結晶のスラリーとして製剤化され得る。別の実施形態において、抗体結晶は、治療的投与のための水性製剤等の液体製剤を調製するために使用される。
Ａ．抗体結晶の固体製剤
抗体結晶の固体製剤は、溶液から実質的に単離され、または乾燥され、例えば粉末形態での自由結晶または粒子として存在する結晶を含む。これに関して、「粉末」という用語は、本質的に乾燥した、すなわち含水率が約１０重量％未満、または６重量％未満、または４重量％未満である粒子の集合を指す。ポリペプチド結晶または粉末は、任意選択で担体または界面活性剤と組み合わされてもよい。好適な担体薬剤は、これらに限定されないが、１）炭水化物、例えば、フルクトース、ガラクトース、グルコースおよびソルボース等の単糖類、２）乳糖およびトレハロース等の二糖類、３）ラフモース、マルトデキストリンおよびデキストラン等の多糖類、４）マンニトールおよびキシリトール等のアルジトール、５）塩化ナトリウム等の無機塩、ならびに６）クエン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウム等の有機塩を含む。ある特定の実施形態において、担体は、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトール、スクロース、塩化ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムからなる群から選択される。界面活性剤は、脂肪酸の塩、胆汁塩またはリン脂質からなる群から選択され得る。脂肪酸塩は、カプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、およびミリスチン酸ナトリウム等のＣ１０−１４脂肪酸の塩を含む。胆汁塩は、ウルソデオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、およびタウロジヒドロフシデートの塩を含む。一実施形態において、界面活性剤は、タウロコール酸ナトリウム等のタウロコレートの塩である。界面活性剤として使用され得るリン脂質は、リゾホスファチジルコリンを含む。本発明の粉末製剤中の界面活性剤に対する結晶性ポリペプチドのモル比は、例えば、９：１〜１：９、または５：１〜１：５の間、または３：１〜１：３の間である。
Ｂ．溶液またはスラリー中の結晶
また、本明細書において、ポリペプチド結晶を、懸濁液中での保存に好適とするための方法であって、結晶化緩衝液（母液）を非水性溶媒と置き換えることを含む方法が記載される。さらに別の実施形態において、結晶性スラリーは、第１の溶媒を回転除去し、第２の有機溶媒または添加剤を使用して残りの結晶固体を洗浄して水を除去し、続いて非水性溶媒を蒸発させることにより、固体とすることができる。結晶性治療タンパク質の非水性スラリーは、皮下送達に特に有用である。
１つのそのような実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド結晶は、ポリペプチド結晶を安定化することを目的として、液体有機添加剤と組み合わされる。そのような混合物は、ｎ％有機添加剤（ｎは１〜９９の間である）、およびｍ％水溶液（ｍは１００−ｎである）を含む水性−有機混合物として特徴付けることができる。有機添加剤の例は、フェノール化合物、例えばｍ−クレゾールもしくはフェノールまたはそれらの混合物、およびアセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、クロロホルム、１−プロパノール、イソプロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル、１−ブタノール、２−ブタノール、エチルアルコール、シクロヘキサン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、四塩化炭素、またはそれらの組み合わせを含む。
Ｃ．液体製剤
本明細書において提供される別の実施形態は、薬学的組成物の安定な長期保存を可能とする水性製剤であり、結晶性抗スクレロスチン抗体は、薬学的組成物の調製において使用される活性成分である。この製剤は、１つには、再水和等の任意の追加のステップを必要としないことから、患者への使用により便利であるため有用である。本明細書において使用される場合、「溶液」または「液体製剤」は、好適な溶媒または互いに混和性の溶媒の混合物に溶解した１種以上の化学物質を含有する液体調製物である。
再構成は、ポリペプチド結晶または結晶製剤または組成物の、適切な緩衝液または薬学的製剤への溶解である。
再懸濁は、ポリペプチド結晶の、適切な緩衝液または薬学的製剤への懸濁を指す。いくつかの
Ｄ．薬学的製剤の成分
本発明の薬学的組成物は、上述のような結晶性抗スクレロスチン抗体に加えて、その多くまたは全てが販売供給業者から入手可能である、以下の段落において列挙される以下の種類の成分または賦形剤の１つ以上を組み合わせることにより調製される。組成物に含まれる様々な成分の組み合わせは、いかなる適切な順番でも行うことができ、すなわち、緩衝剤が最初、中間または最後に添加されてもよく、等張性調節剤もまた最初、中間または最後に添加されてもよい。また、これらの化学物質のいくつかは、ある特定の実施形態において不適合性であってもよく、またそれに従い、同様の特性を有するが関連混合物に適合性である異なる化学物質と容易に置換されることが、当業者に理解されるべきである。賦形剤、ならびに例えば薬学的組成物の保存に使用される容器および／または治療的投与に使用されるデバイス内に存在する他の成分または材料の様々な組み合わせの好適性に関する知見が、当該技術分野において存在する（例えば、Ａｋｅｒｓ，２００２，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２８３−２３００を参照されたい）。
本明細書に記載の製剤中に含めることができる追加的薬剤の限定されない例は、酸性化剤（これらに限定されないが、酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸、および他の好適な酸を含む）；活性成分（これらに限定されないが、適切な用量の、注射部位の不快感を低減するための追加的活性成分、および非ステロイド系抗炎症薬、例えばトロメタミン等を含む）；エアロゾル噴射剤（これらに限定されないが、ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパンおよびトリクロロモノフルオロメタンを含む）；アルコール変性剤（これらに限定されないが、安息香酸デナトニウム、メチルイソブチルケトン、オクタ酢酸スクロースを含む）；アルカリ化剤（これらに限定されないが、強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミンを含む）；凝固防止剤（これらに限定されないが、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素およびタルクを含む）；消泡剤（これらに限定されないが、ジメチコンおよびシメチコンを含む）；キレート剤（金属イオン封鎖剤とも呼ばれる）（これらに限定されないが、エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸および塩ならびにエデト酸を含む）；コーティング剤（これらに限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、薬学的グレーズ、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸フタル酸ビニル、シェラック、スクロース、二酸化チタン、カルナバワックス、微結晶性ワックスおよびゼインを含む）；着色料（これらに限定されないが、カラメル、エリトロシン（ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．３）；ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．４０；ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．５；ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６；ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．１、赤、黄色、黒、青またはブレンドおよび酸化鉄を含む）；錯化剤（これらに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその塩、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミドならびに硫酸オキシキノリンを含む）；乾燥剤（これらに限定されないが、塩化カルシウム、硫酸カルシウムおよび二酸化ケイ素を含む）；濾過助剤（これらに限定されないが、粉末セルロースおよび精製ケイ質土を含む）；香味剤および香料（これらに限定されないが、アネトール、アニス油、ベンズアルデヒド、シナモン油、ココア、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸ナトリウム、オレンジフラワー油、オレンジ油、ペパーミント、ペパーミント油、ハッカ精、バラ油、強バラ水、チモール、トルーバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキおよびバニリンを含む）；保湿剤（これらに限定されないが、グリセリン、へキシレングリコール、プロピレングリコールおよびソルビトールを含む）；軟膏基剤（これらに限定されないが、ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ワセリン、親水性ワセリン、白色ワセリン、バラ水軟膏およびスクアランを含む）；可塑剤（これらに限定されないが、ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、フタル酸ジエチル、グリセリン、モノ−およびジ−アセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチンならびにクエン酸トリエチルを含む）；ポリマー膜（これに限定されないが、酢酸セルロースを含む）；溶媒（これらに限定されないが、アセトン、アルコール、希釈アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、へキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱物油、落花生油、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、ゴマ油、注射用蒸留水、注射用滅菌水、潅注用滅菌水および精製水を含む）；吸着剤（これらに限定されないが、粉末セルロース、木炭、精製ケイ質土；ならびに二酸化炭素吸着剤：水酸化バリウム石灰およびソーダ石灰を含む）；硬化剤（これらに限定されないが、硬化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、硬質脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ワックス、白色ワックスおよび黄色ワックスを含む）；坐薬基剤（これらに限定されないが、ココアバター、硬質脂肪およびポリエチレングリコールを含む）；懸濁化および／または増粘剤（これらに限定されないが、アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラギーナン、微結晶およびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントならびにキサンタンガムを含む）；甘味剤（これらに限定されないが、アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、カルシウムサッカリン、ナトリウムサッカリン、ソルビトール、溶液ソルビトール、スクロース、圧縮糖、粉砂糖およびシロップを含む）；錠剤結合剤（これらに限定されないが、アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、アルファ化デンプンおよびシロップを含む）；錠剤および／またはカプセル希釈剤（これらに限定されないが、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、三塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、圧縮糖および粉砂糖を含む）；錠剤崩壊剤（これらに限定されないが、アルギン酸、微結晶性セルロース、クロスカメロースナトリウム、コースポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンおよびアルファ化デンプンを含む）；錠剤および／またはカプセル潤滑剤（これらに限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、軽質鉱物油、ポリエチレングリコール、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、硬化植物油およびステアリン酸亜鉛を含む）；イークル（これらに限定されないが、香味および／または甘味が加えられたもの（芳香エリキシル剤、複合ベンズアルデヒドエリキシル剤、イソアルコールエリキシル剤、ペパーミント水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ）；油性（アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽質鉱物油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、アンズ油、ゴマ油、大豆油、スクアラン）；固体担体、例えば糖球；および無菌ビヒクル（静菌性注射用蒸留水、静菌性塩化ナトリウム注射剤）；ならびに水反発剤（これらに限定されないが、シクロメチコン、ジメチコンおよびシメチコンを含む）を含む。
不適切または望ましくない三元または四元錯体に会合するポリペプチドの傾向を低減する凝集阻害剤もまた、本明細書に記載の製剤に含まれてもよい。好適な凝集阻害剤は、長期間、例えば２年以上にわたりＦｃドメインを含有するポリペプチドの凝集を低減するように作用し得る、アミノ酸Ｌ−アルギニンおよび／またはＬ−システインを含む。製剤中の凝集阻害剤の濃度は、約１ｍＭ〜１Ｍ、または約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、または約２５ｍＭであってもよい。
酸化防止剤もまた、本明細書に記載の製剤に含まれてもよい。製剤の調製における使用に企図される酸化防止剤は、グリシンおよびリシン等のアミノ酸、ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡ等のキレート剤、ならびにソルビトールおよびマンニトール等のフリーラジカルスカベンジャーを含む。追加的な酸化防止剤は、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール、およびとこフェロール賦形剤を含む。また、酸化の阻害における使用が企図されるのは、窒素または二酸化炭素オーバーレイである。窒素または二酸化炭素オーバーレイは、充填プロセス中に、バイアルのヘッドスペースまたは予め充填されたシリンジに導入され得る。
薬学的製剤を所望の範囲内に維持する緩衝剤もまた、本明細書に記載の製剤に含まれてもよい。薬学的組成物のｐＨが生理学的レベルまたはその近傍に設定されると、投与後の患者の快適性が最大化される。具体的には、ある特定の実施形態において、薬学的組成物のｐＨは約４．０〜８．４のｐＨ範囲内、または約５．０〜８．０のｐＨ範囲内、または約５．８〜７．４のもしくは約６．２〜７．０のｐＨ範囲内である。ｐＨは、必要に応じて、特定の製剤中のポリペプチドの安定性および溶解度を最大化するように調節されてもよく、したがって、生理学的範囲外ではあるが患者に許容可能なｐＨは、本発明の範囲内であることを理解されたい。本発明の薬学的組成物における使用に好適な様々な緩衝剤は、ヒスチジン、アルカリ塩（リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたはその水素もしくは二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、クエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、様々な形態の酢酸塩およびジエタノールアミン、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、乳酸、リン酸、メタリン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、乳酸ナトリウム溶液、ならびに当該技術分野において知られている他の任意の薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤を含む。塩酸、水酸化ナトリウム、またはそれらの塩等のｐＨ調整剤もまた、所望のｐＨを得るために含まれてもよい。１つの好適な緩衝剤は、薬学的組成物をｐＨ６．２またはその近傍に維持するためのリン酸ナトリウムである。別の例において、酢酸塩はｐＨ６よりもｐＨ５においてより効率的な緩衝剤であるため、ｐＨ６の場合よりも少ない酢酸塩がｐＨ５の溶液において使用され得る。製剤中の緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約１Ｍ、または約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、または約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３００ｍＭの間であってもよい。
ポリマー担体もまた、本明細書に記載の製剤に含まれてもよい。ポリマー担体は、生物学的送達を含むポリペプチドの送達のためのポリペプチド結晶のカプセル化に使用されるポリマーである。そのようなポリマーは、生体適合性および生分解性ポリマーを含む。ポリマー担体は、単一ポリマー型であってもよく、または、ポリマー型の混合で構成されてもよい。ポリマー担体として有用なポリマーは、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、例えばポリ（乳酸）もしくはＰＬＡ、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）もしくはＰＬＧＡ、ポリ（Ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、天然および合成ポリペプチド、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、またはポリペプチド結晶をカプセル化する任意の従来の材料を含む。
抗菌保存料等の保存料もまた、本明細書に記載の製剤における使用に企図される。好適な保存料は、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、およびチモールを含む。含まれる保存料の量は、０％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲内または約１％（ｗ／ｖ）である。
ポリペプチドの溶解度を増加させる、および／あるいは溶液中にある（または乾燥もしくは凍結形態の）ポリペプチドを安定化させる可溶化剤および安定剤（乳化剤、共溶質、または共溶媒とも呼ばれる）もまた、薬学的組成物に添加されてもよい。可溶化および安定化剤の例は、これらに限定されないが、糖／ポリオール、例えば、スクロース、乳糖、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース；ポリマー、例えば、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡ（ＨＳＡ）、もしくは組み換えＨＡ）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）；非水性溶媒、例えば、多価アルコール（例えば、ＰＥＧ、エチレングリコールおよびグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；アミノ酸、例えば、プロリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、グリシン、リシン塩酸塩、サルコシン、およびガンマ−アミノ酪酸；界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＳＤＳ、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー；ならびに、種々の安定化賦形剤、例えば、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、金属イオン（例えば、亜鉛、銅、カルシウム、マンガン、およびマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウレート、２−Ｏ−ベータ−マンノグリセレート；または、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン（付加物）、グリセリルモノステアレート、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−およびジ−グリセリド、モノエタノールアミン（付加物）、オレイン酸（付加物）、オレイルアルコール（安定剤）、ポロキサマー、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミン、乳化ワックス；湿潤および／または可溶化剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポリオキシ５０ステアレート、チロキサポールのいずれか；または、上記の任意の組み合わせを含む。製剤中の可溶化剤／安定剤の濃度は、約０．００１重量％〜５重量％、または約０．１重量％〜２重量％の間であってもよい。一実施形態において、安定剤は、これらに限定されないが、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０を含むソルビタンモノ−９−オクタデセノエートポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体から選択される。この実施形態において使用されるポリソルベート２０または８０の量は、単回使用または複数用量製剤において、０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内、例えば０．００５％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内の遊離Ｌ−メチオニンが、製剤中に含まれ、遊離Ｌ−メチオニンの量は、単回使用製剤の場合０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、および複数用量製剤の場合１ｍＭ〜１０ｍＭである。
等張性調節剤もまた、本明細書に記載の製剤に含まれてもよい。等張性調節剤は、溶液のオスモル濃度に寄与する分子として理解される。薬学的組成物のオスモル濃度は、好ましくは、活性成分の安定性を最大化すると共に、投与後の患者に対する不快感を最小限とするために制御される。血清は、１キログラム当たり約３００＋／−５０ミリオスモルである。一般に、薬学的組成物は、血清と等張であること、すなわち、同じまたは同様のオスモル濃度を有することが好ましく、これは、等張性調節剤の添加により達成され、したがって、オスモル濃度は、約１８０〜約４２０ミリオスモルとなることが企図されるが、オスモル濃度は、特定の条件による要件に応じてそれより高くても、または低くてもよいことを理解されたい。オスモル濃度を調節するための等張性調節剤の例は、これらに限定されないが、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、ヒスチジンおよびグリシン）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびクエン酸ナトリウム）ならびに／またはサッカリド（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、グリセリン、およびマンニトール）を含む。製剤中の等張性調節剤の濃度は、約１ｍＭ〜１Ｍ、または約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの間であってもよい。一実施形態において、等張性調節剤は、０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度範囲内の塩化ナトリウムである。別の実施形態において、等張性調節剤は、ソルビトールまたはトレハロースであり、塩化ナトリウムは存在しない。
ある特定の実施形態において、製剤は、１）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、プロリン等のアミノ酸の塩；２）炭水化物、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース等の単糖類；３）ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース等の二糖類；４）マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン等の多糖類；５）マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトール等のアルジトール；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸；７）メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等のシクロデキストリン；８）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、ホウ酸、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機塩；９）酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩等の有機塩；１０）アカシア、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレート、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレートおよび他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体等の乳化または可溶化剤；１１）寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポール等の増粘試薬；ならびに１２）スクロース、トレハロース、乳糖、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウムの塩、例えば酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の特定の成分から選択される化合物、またはその任意の組み合わせを含む。
Ｅ．徐放性形態
いくつかの実施形態において、結晶性抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の徐放性形態；結晶性抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１、および結晶性抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の物理的放出または生物学的利用率を延長するための物質を含む徐放性または制御放出形態を含む、結晶性抗スクレロスチン抗体の徐放性形態（「制御放出」形態とも呼ばれる）が使用される。
開示される方法における使用に好適な徐放性形態は、これらに限定されないが、低速溶解生体適合性ポリマー（例えば、本明細書に記載のポリマー担体、米国特許第６，０３６，９７８号に記載のアルギネートマイクロ粒子、または米国特許第６，０８３，５３４号に記載のポリエチレン‐酢酸ビニルおよびポリ（乳酸−グリコール酸）組成物）等の徐放性材料にカプセル化され、そのようなポリマーと混合された（局所適用ヒドロゲルを含む）、および／または生体適合性半透過性インプラント内に封入された結晶性抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１を含む。本発明のさらなる実施形態は、追加的な徐放性形態、例えばポリマーマイクロ粒子（活性成分およびポリマー（例えばＰＬＧＡ）等の徐放性手段の混合物は、連続相内に分散され、得られた分散物は直接凍結乾燥されて水および有機溶媒が除去され、前記マイクロ粒子を形成する（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０２０，００４号））；生分解性アニオン性多糖類、例えばアルギネートエステル、ポリペプチド、および少なくとも１つの結合した多価金属イオンを含む注射用ゲル組成物（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４３２，４４９号）；逆熱ゲル化特性および任意選択でｐＨ応答性ゲル化／脱ゲル化特性を有する注射用生分解性ポリマーマトリックス（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５４１，０３３号および米国特許第６，４５１，３４６号）；生分解性ポリオール：油懸濁液、例えば懸濁液が約１５重量％から約３０重量％までの範囲内でポリオールを含むもの（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２４５，７４０号）を含む。そのような徐放性形態は、デポー剤形の形態での投与によるポリペプチドの連続送達に好適であり、デポー剤形は、インプラントであってもよく、または、注射用ミクロスフェア、ナノスフェアもしくはゲルの形態であってもよい。上に列挙された米国特許（米国特許第６，０３６，９７８号；米国特許第６，０８３，５３４号；米国特許第６，０２０，００４号；米国特許第６，４３２，４４９号；米国特許第６，５４１，０３３号；米国特許第６，４５１，３４６号および米国特許第６，２４５，７４０号）は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本発明の結晶性ポリペプチドの徐放性または制御放出形態は、Ｋｉｍ、Ｃ．，２０００，”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｔｅｃｈｏｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｐａ．に記載のもの等の徐放性材料の種類を含み、これには、天然ポリマー（ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、アラビアガム、もしくはキトサン）、半合成ポリマーまたはセルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、ならびに合成ポリマー（例えば、イオン交換樹脂（メタクリル酸、スルホン化ポリスチレン／ジビニルベンゼン）、ポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、ポリ（ＭＭＡ／ＭＡＡ）、ポリ（ＭＭＡ／ＤＥＡＭＡ）、ポリ（ＭＭＡ／ＥＡ）、ポリ（酢酸フタル酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ（ジメチルシリコーン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレン／酢酸ビニル）、ポリ（エチレン／ビニルアルコール）、ポリブタジエン、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（グルタミン酸））が含まれる。
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５４１，６０６号に記載されるように、その天然および生物学的に活性な三元構造を保持するためのポリマー担体のマトリックス内へのカプセル化によりミクロスフェアを形成するために、少なくとも１つのポリマー担体内にカプセル化されたＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶を含む。Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍもしくはＡｂ−３１結晶またはその製剤は、有機溶媒または添加剤に溶解したＰＬＧＡ等のポリマー担体中に懸濁される。そのようなカプセル化されたＡｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１結晶は、同等の条件下で保存された場合、溶液としての抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１よりも長期間、抗体Ａｂ−３０、Ａｂ−３０Ｒ、Ａｂ−３０ＲｍまたはＡｂ−３１の生物活性を維持する。
ＩＶ．キット
追加的な態様として、本明細書において、対象への投与のための使用を容易化する様式でパッケージされた本明細書に記載の１つ以上の製剤を含むキットが記載される。一実施形態において、そのようなキットは、任意選択で容器に貼り付けられた、またはパッケージ内に含められた、方法の実践における化合物または組成物の使用を説明するラベルと共に、密閉瓶、槽、使い捨てもしくは複数回使用バイアル、予め充填されたシリンジ、または予め充填された注射デバイス等の容器内にパッケージされた、本明細書に記載の製剤（例えば、本明細書に記載の抗体のいずれかを含む組成物）を含む。一態様において、化合物または組成物は、単位剤形内にパッケージされる。キットは、特定の投与経路による組成物の投与に好適なデバイスをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の製剤の使用を説明するラベルを含有する。
Ｖ．用量
本明細書に記載の状態を処置するための方法に関与する投薬計画は、薬物の作用を変化させる様々な因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食生活、任意の感染の重傷度、投与時期ならびに他の臨床的因子を考慮して、担当医により決定される。様々な態様において、一日の計画は、体重１キログラム当たり０．１〜５０ｍｇの抗体の調製物の範囲内（化学修飾を含まないタンパク質のみの質量を計算）である。いくつかの実施形態において、用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。
製剤は、一般に、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、エアロゾルを介して（肺内または吸入投与）、または長期放出のためのデポー剤形として投与される。いくつかの実施形態において、製剤は、薬物製品の治療循環レベルを維持するための最初のボーラスに続く連続的輸液により、静脈内投与される。他の実施形態において、製剤は、１回用量として投与される。当業者は、適切な医療行為および個々の患者の臨床状態により決定されるように、効果的な用量および投与計画を容易に最適化する。投薬頻度は、薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存する。最適な薬学的製剤は、投与経路および所望の用量に依存して、当業者により決定される。例えば、参照により本明細書にその開示が組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２を参照されたい。そのような製剤は、投与される薬剤の物理状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ 放出の速度、ｉｎ ｖｉｖｏ クリアランスの速度に影響し得る。投与経路に依存して、好適な用量は、体重、体表面積または臓器サイズに従い計算され得る。上述の製剤のそれぞれが関与する処置のための適切な用量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、特に本明細書に開示される用量の情報およびアッセイ、ならびに上述の人間に対する臨床試験において観察される薬物動態データに照らして、必要以上の実験を行うことなく当業者により慣例的に決定される。適切な用量は、適切な用量反応データと併せて、血液レベル用量を決定するための確立されたアッセイの使用により確定することができる。
試験を行うに伴い、適切な用量レベルならびに様々な疾患および状態に対する処置の期間に関するさらなる情報が生成される。
ＶＩ．製剤の治療的使用
本明細書に記載の製剤は、骨関連障害、例えば異常骨芽細胞または破骨細胞活性に関連した骨関連障害の処置または予防に有用である。いくつかの実施形態において、製剤は、軟骨形成不全、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫症、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、化膿性骨髄炎、歯周病、抗てんかん薬誘導性骨量減少、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘導性骨量減少、男性における骨粗鬆症、閉経後骨量減少、変形性関節症、腎性骨ジストロフィー、骨の浸潤性障害、口蓋骨量減少、顎部の骨壊死、若年性パジェット病、流蝋性過骨症、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌状赤血球貧血／疾患、臓器移植関連骨量減少、腎臓移植関連骨量減少、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、てんかん、若年性関節炎、サラセミア、ムコ多糖症、ファブリー病、ターナー症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ハンセン病、ペルテス病、青年期特発性脊柱側弯、乳児性発症多系統炎症性疾患、ウィンチェスター症候群、メンケス病、ウィルソン病、虚血性骨疾患（例えばレッグ−カルヴェ−ペルテス病および局所遊走性骨粗鬆症）、貧血状態、ステロイドに起因する症状、糖質コルチコイド誘導性骨量減少、ヘパリン誘導性骨量減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏症、骨粗鬆症、骨減少症、アルコール依存症、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性症状、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、末端肥大症、性腺機能低下症、運動抑制または廃用、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、局所骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換に関連する骨量減少、ＨＩＶ関連骨量減少、成長ホルモンの損失に関連する骨量減少、嚢胞性線維症に関連する骨量減少、化学療法関連骨量減少、腫瘍誘導性骨量減少、癌関連骨量減少、ホルモン切除の骨量減少、多発性骨髄腫、薬物誘導性骨量減少、拒食症、疾患関連顔面骨量減少、疾患関連頭蓋骨量減少、顎の疾患関連骨量減少、頭蓋の疾患関連骨量減少、加齢に関連する骨量減少、加齢に関連する顔面骨量減少、加齢に関連する頭蓋骨量減少、加齢に関連する顎骨減少、加齢に関連する頭骨量減少、および宇宙旅行に関連する骨量減少からなる群から選択される骨関連障害に罹患した対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、整形外科的処置、歯科的処置、移植手術、関節置換、骨グラフト、骨美容整形手術および骨修復、例えば骨折治癒、癒着不能治癒、遷延治癒および顔の形成における結果を改善するために有用である。１つ以上の組成物が、処置、置換、グラフト、手術または修復の前、間、および／または後に投与されてもよい。
製剤は、有益な生物学的反応を達成するために、対象の障害を治癒または骨関連障害の発症から完全に保護する必要はない。製剤は、予防的に、つまり骨関連障害またはその症状から全体的または部分的に保護するように使用されてもよい。製剤はまた、全体的もしくは部分的に、骨関連障害もしくはその症状を改善するように、または、全体的もしくは部分的に、骨関連障害もしくはその症状のさらなる進行から保護するように使用されてもよい。実際に、本発明の材料および方法は、骨ミネラル密度の増加、および増加した骨ミネラル密度のある期間にわたる維持に特に有用である。
例えば約１週間〜約１８ヶ月（例えば、約１ヶ月〜約１２ヶ月、約１ヶ月〜約９ヶ月、または約１ヶ月〜約６ヶ月、または約１ヶ月〜約３ヶ月）の治療期間にわたり、本明細書に記載の製剤の１回以上の投与が行われてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、例えば約１ヶ月〜約１２ヶ月（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、または約１１ヶ月）の治療期間にわたり、本明細書に記載の製剤の１つ以上の用量を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、骨ミネラル密度を維持するために、製剤の１つ以上の用量を投与される。「骨ミネラル密度を維持する」という用語は、本明細書において使用される場合、製剤の最初の用量から得られる増加した骨ミネラル密度が、約６ヶ月、約９ヶ月、約１年、約１８ヶ月、約２年にわたって、または患者の一生にわたって約１％超〜約５％降下しないことを意味する。患者は、骨密度の増加および骨密度の維持のための交互の処置段階を必要とし得ることが理解される。
さらに、特定の患者に対して選択された治療計画に依存して、製剤の複数用量を投与すること、または用量の投与間隔を空けることが有利となり得る。製剤は、１年以下の期間（例えば、９ヶ月以下、６ヶ月以下、または３ヶ月以下）にわたり周期的に投与されてもよい。これに関して、製剤は、約３日、または約７日、または２週間、３週間、または４週間、または５週間、または６週間、または７週間、または８週間、または９週間、または１０週間、または１１週間、または１２週間、または１３週間、または１４週間、または１５週間、または１６週間、または１７週間、または１８週間、または１９週間、または２０週間、または２１週間、または２２週間、または２３週間、または６ヶ月、または１２ヶ月に１回、人間に投与されてもよい。
ＶＩＩ．観察療法
抗スクレロスチン抗体が媒介する骨ミネラル含量または骨密度の増加は、単一および二重エネルギーＸ線吸収法、超音波、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線撮影法、および磁気共鳴画像化を使用して測定することができる。骨量もまた、体重から、または他の方法（例えば、Ｇｕｉｎｎｅｓｓ−Ｈｅｙ，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ Ｄｉｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，５：１７７−１８１（１９８４）を参照されたい）を使用して計算することができる。例えば、骨量減少、骨吸収、骨形成、骨強度、または骨石灰化のパラメータに対する薬学的組成物および方法の効果を試験するために、骨粗しょう症および骨減少症等の人間の疾患の状態を模倣する動物モデルが使用される。そのようなモデルの例は、卵巣切除ラットモデルを含む（Ｋａｌｕ，Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ，１５：１７５−１９２（１９９１）；Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｊｅｅ，Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ，１８：２２７−２３６（１９９２）；およびＪｅｅ ａｎｄ Ｙａｏ，Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１：１９３−２０７（２００１））。本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体活性を測定するための方法は、他のスクレロスチン阻害剤の有効性を決定するためにも使用することができる。
人間において、骨ミネラル密度は、例えば股関節および脊椎の二重Ｘ線吸収法（ＤＸＡ）を使用して臨床的に決定することができる。他の技術は、定量的コンピュータ断層撮影法（ＱＣＴ）、超音波検査、単一エネルギーＸ線吸収法（ＳＸＡ）、およびＸ線吸収法を含む。測定のための一般的な中心骨格部位は、脊椎および股関節を含み、末梢部位は、前腕、指、手首および踵を含む。超音波検査を除いて、ＢＭＤ技術は典型的にはＸ線の使用を伴い、放射線の減衰は放射線経路における組織の厚さおよび組成に依存するという原理に基づくことが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎにより説明されている。全ての技術は、基準データベースとの結果の比較を含む。
代替として、骨マーカーレベルを監視することにより、１種以上のスクレロスチン結合薬剤に対する生理学的反応を計測することができる。骨マーカーは、骨再形成プロセスの間に形成される産物であり、骨、骨芽細胞および／または破骨細胞により放出される。骨吸収および／または骨形成「マーカー」レベルの変動は、骨再形成／モデリングの変化を示唆する。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＩＯＦ）は、骨密度治療を監視するために骨マーカーを使用することを推奨している（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤｅｌｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ．，Ｓｕｐｐｌ．６：Ｓ２−１７（２０００）を参照されたい）。骨吸収（または破骨細胞活性）を示すマーカーは、例えば、Ｃ−テロペプチド（例えば、１型コラーゲンのＣ−末端テロペプチド（ＣＴＸ）または血清架橋Ｃ−テロペプチド）、Ｎ−テロペプチド（１型コラーゲンのＮ−末端テロペプチド（ＮＴＸ））、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン、尿中ヒドロキシプロリン、ガラクトシルヒドロキシリシン、および酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（例えば、血清酒石酸塩耐性酸ホスファターゼアイソフォーム５ｂ）を含む。骨形成／石灰化マーカーは、これらに限定されないが、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、Ｉ型プロコラーゲンのＮ−およびＣ−末端伸長（Ｐ１ＮＰ、ＰＩＣＰ）から放出されたペプチド、ならびにオステオカルシン（ＯｓｔＣａ）を含む。尿および血液等の臨床試料中のマーカーを検出および定量するためのいくつかのキットが市販されている。
ＶＩＩＩ．併用療法
同じ病原体または生化学的経路を標的化する２種以上の薬剤を組み合わせることによる病状の処置は、各薬剤単独の治療上該当する用量の使用に比べて、より高い有効性および副作用の低下をもたらすことがある。ある場合には、混合薬の有効性は相加的（混合の有効性はそれぞれの薬単独の効果の和にほぼ等しい）であるが、ある場合には、効果は相乗的（混合の有効性はそれぞれ所定の薬単独の効果の和よりも大きい）となり得る。本明細書において使用される場合、「併用療法」という用語は、２種類の化合物が同時に、例えば並行して送達され得る、または、化合物のうちの１つが最初に投与され、続いて第２の薬剤が投与される様式で、例えば逐次的に送達され得ることを意味する。望ましい結果は、用量の被投与者における１つ以上の症状の自覚的な軽減、または客観的に確認できる改善であってもよい。
いくつかの実施形態において、製剤は、減少した骨ミネラル密度の処置のための標準的治療薬と共に投与される。本明細書において使用される場合、「標準的治療」という用語は、ある種類の病気を診断された患者のある特定のタイプに対して、臨床医学者により一般的に許容される処置を指す。いくつかの実施形態において、標準的治療薬は、再吸収阻害薬、骨形成薬剤、エストロゲン受容体拮抗薬（これらに限定されないが、ラロキシフェン、バゼドキシフェンおよびラソフォキシフェンを含む）ならびに破骨細胞に対する刺激作用を有する薬物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、再吸収阻害薬は、これらに限定されないが、ビスホスホネート（これらに限定されないが、アレンドロン酸塩、リセドロン酸塩、イバンドロン酸塩およびゾレドロン酸塩を含む）、エストロゲンまたはエストロゲン類似体、選択的エストロゲン受容体調整剤（ＳＥＲＭ）およびカルシウム源、チボロン、カルシトニン、カルシトリオールならびにホルモン補充治療薬を含む。いくつかの実施形態において、骨形成薬剤は、これらに限定されないが、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはそのペプチド断片、ＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒｐ）、骨形成タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、ＰＧＥ２作動薬、スタチン、抗ＤＫＫ抗体、およびＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）を含む。いくつかの実施形態において、破骨細胞に対する刺激作用を有する薬物は、これらに限定されないが、ビタミンＤ、もしくはビタミンＤ誘導体またはその模倣薬を含む。
いくつかの実施形態において、製剤は、本明細書に記載の標準的治療薬の処置が禁忌である場合、対象に投与される。
実施例１ − Ａｂ−３０の結晶化
２つの成熟重鎖（配列番号１５）および２つの成熟軽鎖（配列番号１３）のそれぞれをコード化するＤＮＡによって組み換えにより生成されたそれらの鎖からなる抗体Ａｂ−３０を、様々な条件下で結晶化させた。
Ａｂ−３０の結晶化は、「ハンギングドロップ」蒸気拡散として知られる巨大分子の結晶化のための方法を使用する結晶化スクリーン（Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して達成した。ポリペプチド試料および結晶化試薬（「結晶化緩衝液」または「母液」）の混合物で構成される液滴を、シアラン化したカバースリップの底面に滴下し、次いでカバースリップ上の液滴をグリースで封止し、典型的には、試薬の液体貯蔵容器との蒸気平衡をもたらす２４ウェルＶＤＸトレイ上に設置する。平衡を達成するために、液滴とトレイのウェル内の１ｍｌ貯蔵容器溶液との間で水蒸気が交換される。液滴から水がなくなると、ポリペプチド試料は相対濃度を増加させ、これは最終的に過飽和をもたらし得る。結晶化が生じるために必要なのは、ポリペプチド試料の濃度の増加である。典型的には、液滴は、貯蔵容器よりも低い濃度の試薬を含有し、典型的には、等体積の試料および試薬を混合して液滴を形成したため、液滴は、貯蔵容器における試薬の濃度の半分を含有した。
これらの実験において、液滴中の初期ポリペプチド濃度は、通常０．１〜３００ｍｇ／ｍＬであるか、または３〜１００ｍｇ／ｍＬの間である。
結晶化スクリーンは、２４ウェルＶＤＸポリプロピレン組織培養トレイ内に設置した。ＶＤＸトレイにおけるそれぞれの位置は、１ｍＬの試薬貯蔵容器を含有したが、異なる結晶化緩衝液条件のアレイを確立するために、各ウェルにおける試薬貯蔵容器は、他のウェルにおける試薬貯蔵容器とは組成が異なっていた。各ポリペプチド濃度の１〜１０μＬのポリペプチド溶液を、１〜１０μｌの貯蔵容器溶液に添加して、液滴を形成した。４℃または周囲室温においてトレイをインキュベートした。
結晶化条件：Ａｂ−３０結晶化は、複数の試薬を使用して、４℃および室温の両方において観察された（以下の表１〜８を参照されたい）。
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Ａｂ−３０結晶の様々な形態を、拡大規模条件下で成長させることができ、液体製剤中の抗体は、ある体積の既知の結晶化試薬に添加され、密封容器内で保存される。Ａｂ−３０結晶は、室温または冷蔵温度（４℃）において２４時間未満でこれらの条件下で成長させることができ、持続放出および高収率をもたらすことが示されている。
表１〜１１に示される条件のいくつかにおいて生成されたＡｂ−３０結晶は、４℃において６ヶ月を超える期間、ならびに室温（ＲＴ）において２１ヶ月（Ｉｎｄｅｘ＃３６および異なる濃度の抗凍結剤）、２２ヶ月（Ｉｎｄｅｘ＃３６およびアミノ酸）、３２ヶ月（Ｉｎｄｅｘ＃３６および塩）、および２５ヶ月（Ｉｎｄｅｘ＃３６、異なるパーセンテージのポリソルベート２０）の期間の保存に耐えることが示されている。そのようなＡｂ−３０結晶を生成する例示的結晶化条件、ならびに４℃および室温における保存期間の長さは、それぞれ、以下の表１２および１３に示されている。
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上記の実施例は、Ａｂ−３０が、様々な結晶化条件下で結晶化し得るが、試験した全ての条件下で結晶が形成したわけではなかったことを実証している。複数の異なる市販の（すなわち、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）および専用のスクリーンにおいて、約２０００の結晶化条件を試験したが、約７７５の条件のみがＡｂ−３０結晶を生成した。
実施例２ − Ａｂ−３０のバッチ結晶化
７５．７ｍｇ／ｍＬのＡｂ−３０ ５０μＬを、５０μＬの結晶化条件（ＧＲＡＳ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｗｉｚａｒｄ Ｉ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｗｉｚａｒｄ ＩＩ ＳｃｒｅｅｎおよびＷｉｚａｒｄ ＩＩＩ Ｓｃｒｅｅｎ）と混合し、１．５ｍＬ微小遠心管内で全部で１００μＬのバッチ体積を作製した。４０μＬのＡｂ−３０（７５．７ｍｇ／ｍＬ）を、２０μＬのＬｏｗ Ｉｃｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｓｃｒｅｅｎ緩衝液および５０μＬの４％ＰＥＧ−３３５０と混合し、全部で１１０μＬのバッチ体積を作製した。使用した結晶化条件は、以下の表１４に記載される通りであった。
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Ａｂ−３０は、全部で１０４の条件においてバッチ結晶化され、室温で４０％〜９２％のパーセンテージ収率範囲を示した（表１４を参照されたい）。これらの条件は全て、ハンギングドロップ蒸気拡散により室温において結晶ヒットを有していたが、その全てがバッチ形式で結晶化したわけではなかった。１０４のバッチ結晶化条件のうち、室温で１日目に８５％を超えるパーセンテージ収率を有する条件はわずか８つであった（すなわち、ＩＮＤＸ ＃３４、ＷＩＺ Ｉ ＃４６、ＷＩＺ ＩＩ ＃４３、ＷＩＺ ＩＩ ＃１４、ＷＩＺ ＩＩＩ ＃３５およびＧＲＡＳ １）。Ａｂ−３０結晶において達成された最高収率は、ＷＩＺ ＃３５の１日目の９２．１９５％であった。結晶収率は、結晶成長条件に基づいて変化した。Ａｂ−３０は室温および４℃の両方において結晶化したが、室温での結晶化の効率に基づき、室温での結晶ヒットのみが考慮された。
実施例３ − Ａｂ−３０のバッチ結晶化、懸濁および溶解試験
２００μｌのＡｂ−３０（７５．７ｍｇ／ｍｌ）を、１．５ｍｌの微小遠心管内で、２００μｌの結晶化条件（以下の表１５に記載される）と室温で混合した。結晶化条件の添加後に管をボルテックスし、透明度、乳白光または沈殿物形成について目視検査した。Ａｘｉｏｃａｍソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて、０日目および１日目において試験された各結晶化条件について各微小遠心管の写真を撮影した。各結晶化条件下で生成された結晶の形態を記録した。試験４（結晶充填に基づく結晶溶解、結晶は８日目に採取した）を除き、個々の条件に対して最高パーセント収率に到達した時間に関係なく、３つの溶解速度試験全てにおいて３日目に結晶を採取した。
結晶を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、上澄みを除去し、結晶を異なるビヒクル（以下の表１５に記載される）に再懸濁させた。実験の間、微小遠心管を室温で保存した。パーセント収率は、ＵＶ分光法を使用してＡ２８０ｎｍとして測定した。微小遠心管を卓上遠心分離機で１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理した。水中で１：１００希釈を行い、Ａ２８０をＵＶ分光器で測定した。
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結晶溶解および懸濁ビヒクル：試験１〜４に対する溶解速度実験を、室温で行った。アスタリスク（＊）が付された試験５に対する溶解速度実験試料は、４℃で保存し、二重アスタリスク（＊＊）が付された試験５試料は、３７℃で保存した。Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ ＃３６である試験＃１および＃２においては、結晶成長条件を一定に保持し、結晶溶解速度を監視するために、結晶を異なるビヒクルに再懸濁させた。Ｉｎｄｅｘ ＃３６は、非常に容易に結晶を形成するため、これを成長条件として選択した。試験＃３において、結晶成長条件および形態は変動したが、結晶懸濁ビヒクルＰＢＳは、全ての条件に対して一定であった。
Ａ５２ＳｕＴ（１０ｍＭ酢酸塩、９％スクロース、０．００４％ポリソルベート２０、ｐＨ５．２）、生理食塩水およびＰＢＳは、溶解速度において最大の差異を示した。水およびデキストロースは、Ｔ＝０と比較した場合、４２日後に大きな溶解活性を示さなかった。したがって、水およびデキストロースは、洗浄ステップ中に結晶の多くを失うことなくＡｂ−３０結晶を洗浄するための理想的なビヒクルである。Ｌｏｗ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｓｃｒｅｅｎ緩衝液０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５ ２０％ＰＥＧ−３３５０、０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０ ２０％ＰＥＧ−３３５０、０．０５Ｍトリス ｐＨ８．５ ２０％ＰＥＧ−３３５０は、１ヶ月にわたり特にベースラインに近い極めて低い溶解速度を示した。これらの緩衝液中での結晶の遅い溶解の１つの可能性は、２０％ＰＥＧ−３３５０による結晶コーティングに起因する可能性がある。１０ｍＭグルタメート、５％ソルビトール（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグルタメート、５％ソルビトール（ｐＨ５．０）は、試験＃１における水およびデキストロース溶解速度と同様の約１ｍｇ／ｍｌの溶解速度を示した。Ａ５２ＳｕＴ、生理食塩水、デキストロース、ＰＢＳおよび１０ｍＭグルタメート緩衝液は、等張性であり、注射可能である（図３および４を参照されたい）。
結晶溶解および結晶形態：試験＃３において、結晶成長条件および形態は異なり、一方、懸濁ビヒクルＰＢＳは全ての条件に対して同じであった。楕円体、棒、沈殿物および微小楕円体の全部で４つの異なる形態が考慮された。ｍｇ／ｍｌ結晶溶解は、結晶形態に基づき異なっていたが、全体的に、全ての形態は、１２日目に溶解ピークを有する同様の溶解パターンに従った。得られた溶解プロファイルに基づき、結晶溶解は結晶形態、結晶サイズ、結晶成長条件、およびさらに結晶充填に依存すると結論付けることができる。
結晶溶解および結晶充填：試験＃４において、結晶成長条件は異なり、一方、結晶形態および懸濁ビヒクル（ＰＢＳ）は全ての条件において一定であった。Ｉｎｄｅｘ３６において、Ａｂ−３０は、異なる添加剤（１０ｍＭ塩）と共に成長した。この試験のデータは、添加剤における異なるカチオンおよびアニオンが結晶充填に影響を与えることを示唆している（図５Ａ〜５Ｆ）。全ての添加剤のうち、亜鉛塩は、最も低い溶解を示し、これは、亜鉛が徐放性作用のために添加され得ることを示唆している。塩化亜鉛は、他の亜鉛塩と比較して最も低い溶解を示し、一方、硝酸マグネシウムは、マグネシウム塩の中で最も低い溶解を示した。
温度および結晶形態に基づく結晶溶解：試験＃５において、結晶成長条件、結晶形態、結晶保存温度は異なったが、懸濁ビヒクルデキストロースは、全ての条件に対して同じに保持された。結晶をデキストロースに再懸濁させ、４℃および３７℃で保存し、溶解速度を９日間監視した。結晶溶解速度は、予想されるように、ほとんどの場合温度に依存せず（溶解速度が４℃に対して３７℃でより高かったＷＩＺ ＩＩＩ ＃３５を除く）、または形態に依存しなかった。その代わり、溶解速度は、結晶成長条件に関連した。溶解速度の傾向は、特定の結晶成長条件の温度に関係なく同様であった（図６Ａおよび６Ｂ）。これは、異なる条件で成長し、異なる温度で同じ、または異なる懸濁ビヒクルに再懸濁された全てのＡｂ−３０結晶には当てはまらない可能性がある。
要約すると、結晶溶解は、２つ以上の因子、すなわち、結晶成長溶液およびその成分、結晶形状、サイズ、長さ、結晶形態、結晶懸濁ビヒクル、温度ならびに／または結晶充填に依存する。上述の因子の１つ以上は、異なる種類（液体、固体またはスラリー）の製剤を製剤化するための様々な組み合わせにおいて変化し得る。
実施例４ − Ａｂ−３０結晶のタンパク質含量の分析
塩は、しばしば試料または逆溶媒中に存在し、これらの塩は、結晶化を試みている間に結晶を形成し得る。塩結晶の成長を関心標的結晶から区別する１つの良く知られた方法は、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ、Ｃａｌｉｆ）により製造されているＩＺＩＴ（商標）等の染色染料への暴露によるものである。ＩＺＩＴ（商標）染料は、タンパク質結晶を青色に染色するが、塩結晶は染色しない。
１５％ｖ／ｖタクシメート ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、２％ｗ／ｖポリエチレングリコール８０００の結晶化条件下で生成されたＡｂ−３０結晶は、染色（ＩＺＩＴ（商標）染料；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりタンパク質結晶であることが確認され、結晶ヒットとして記録された。
実施例５ − 結晶性抗スクレロスチン抗体製剤
この実施例は、配列番号１９および２１にそれぞれ記載されるＡｂ−３０Ｒｍ重鎖および軽鎖を含む抗スクレロスチン抗体を使用した、徐放性の可能性を有する高濃度のタンパク質を含む抗スクレロスチン抗体結晶の製剤化を示す。
簡潔には、Ｌｏｗ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｓｃｒｅｅｎを使用して、全部で１０８の結晶化条件をＡｂ−３０Ｒｍに対してスクリーニングした（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３，２８５−２８９； Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）。２つの条件が、ｐＨ、オスモル濃度、注射可能成分および結晶化効率パーセントに基づく製剤化に絞り込まれた。動物試験における皮下注射に好適なＡｂ−３０Ｒｍ結晶の製剤の生成に成功した。
材料および方法
ハンギングドロップ蒸気拡散およびタンパク質結晶ヒットの目視検査：
ＶＤＸ ２４ウェルプレートおよび封止剤（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ （ＨＲ３−１７０））を使用したハンギングドロップ蒸気拡散を用いて、Ａｂ−３０Ｒｍ結晶を成長させた。１ｍｌの脱水剤２４％ＰＥＧ−３３５０を、ウェル溶液に滴下した。Ａ５ＳｕＴ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム（酢酸から）、９％スクロース、０．００４％ポリソルベート２０ ｐＨ５．０）中４ｍｇ／ｍｌのＡｂ−３０Ｒｍ ４ μｌ、およびＬｏｗ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、およびｘ％ＰＥＧ−３３５０ ５ｕｌを、カバースリップ（ＨＲ３−２３３、直径２２ｍｍおよび厚さ０．２２ｍｍのシリコン処理ガラスカバースリップ：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ）上に加え、最終体積を１１μｌとした。液滴を混合せずにカバースリップを反転し、すでに間隔を空けた気密性シール上に設置した。ハンギングドロップ蒸気拡散実験において、液滴とウェル溶液との間で平衡が達成されると、結晶が形成される。
Ｌｏｗ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｓｃｒｅｅｎ（ＬＩＳＳ）（ＨＲ２−１２０、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、全部で１０８の条件を設定した。ＬＩＳＳは、３つの部分で構成される結晶化スクリーンであり、２〜１２のｐＨ範囲の１８の緩衝液、６つの異なるパーセンテージの沈殿剤ＰＥＧ−３３５０、および脱水剤としての２４％ＰＥＧ−３３５０を有する。以下の表１６を参照されたい。
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ソフトウェアＡｘｉｏｖｉｓｏｎ ４．０を備えるＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１顕微鏡を使用して、結晶トレイを１週間毎日、次いで１週間に１度走査した。結晶ヒットを記録し、独自の結晶スコアシステムおよび形態説明を使用して特性決定した。
以下の２組の条件は、抗体結晶製剤の例示的条件である：（ａ）Ａ５ＳｕＴ＋０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０＋２２％ＰＥＧ−３３５０（最終ｐＨ 約７．２、オスモル濃度は３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、および％効率９５％）；（ｂ）Ａ５ＳｕＴ＋０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０＋２４％ＰＥＧ−３３５０（最終ｐＨ 約７．２、オスモル濃度は４１２ｍＯｓｍ／ｋｇ、および％効率９９％）。
ｐＨ測定：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＭＰ２３０ ｐＨ計を使用してｐＨを測定し、ｐＨ４．０およびｐＨ７．０緩衝液標準に対して較正した。ｐＨ測定のために、４０μｌのタンパク質、２０μｌのＬＩＳＳ緩衝液および５０μｌの各パーセンテージのＰＥＧ−３３５０をエッペンドルフ管に加えることにより試料を調製し、ボルテックスした。
オスモル濃度：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ２０２０マルチサンプル浸透圧計（Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）を使用して、オスモル濃度を測定した。この機器は、凝固点降下法を用いてオスモル濃度を測定する。Ｌｏｗ Ｉｏｎｉｃ ＳｃｒｅｅｎにおけるＡｂ−３０Ｒｍのオスモル濃度測定のために、８μｌのタンパク質、２μｌのＬＩＳＳ緩衝液および５μｌのｘ％ＰＥＧ−３３５０を混合した。正確に２０μｌのこの混合物を使い捨てのマイクロ試料管（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、カタログ番号２０２８２５）に入れ、機器のカルーセルに設置した。
効率：１．５ｍｌのエッペンドルフ管を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、ミリＱ水で上澄みを１：１００希釈し、ＵＶ−ＶＩＳ分光器でＡ２８０で測定することにより、％効率を計算した。
バッチ結晶化および動物研究実験の詳細：Ａ５ＳｕＴ中２４．３９ｍｇ／ｍｌの濃度のＡｂ−３０Ｒｍを、最初のＡｂ−３０Ｒｍ結晶スクリーニングおよびバッチ結晶化に使用した。動物試験のための最終バッチ結晶化試験において、Ａ５ＳｕＴ中３１．１４８ｍｇ／ｍｌの濃度のＡｂ−３０Ｒｍを使用した。動物試験のためのＡｂ−３０Ｒｍの液体製剤は、Ａ５ＳｕＴ中１００ｍｇ／ｍｌであり、一方製剤の結晶スラリーは、０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０、および２２％ＰＥＧ−３３５０中１００ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２であった。
Ａ５ＳｕＴ中Ａｂ−３０Ｒｍ ４００μｌ、および０．０５Ｍ トリス ｐＨ８．０緩衝液２００μｌ、および２２％ＰＥＧ−３３５０沈殿剤５００μｌを、１．５ｍｌエッペンドルフ管内に１．１ｍｌの最終体積となるまで加えることにより、Ａｂ−３０Ｒｍの製剤を調製したが、これは混合後に濁った。溶液は最終的に、２日目に識別可能な結晶の形成と共に透明となった。６日後に結晶を採取し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、管内に可溶性タンパク質が残らないように上澄みを除去した。上澄みを母液と交換した。母液は以下のように調製した：エッペンドルフ管内の０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０緩衝液２００μｌおよび２２％ＰＥＧ−３３５０沈殿剤５００μｌ。これにはＡ５ＳｕＴが添加されていなかったことに留意されたい。１．１ｍｌバッチに１２．４６ｍｇのタンパク質が存在し、したがって１２４．９μｌの母液が添加されて、１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度が達成された。２つの追加のエッペンドルフ管からの１００ｍｇ／ｍｌのスラリーを、１つの３ｃｃバイアル内で混合し、各ラットに対して別個のバイアルを調製した。製剤緩衝液は、以下のように調製した：最終体積１．１ｍｌを作製するためにＡ５ＳｕＴ緩衝液４００μｌおよび０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０緩衝液２００μｌおよび２２％ＰＥＧ−３３５０沈殿剤５００μｌ。１００ｍｇ／ｍｌにおいて、最終注射体積は、個々のラットの体重に依存して２００μｌ〜２５０μｌの間であり、皮下注射に２７Ｇ１／２針を使用した。
８週間継続する単一用量試験を、体重４００〜５００グラムの２８匹の６ヶ月齢雌ＳＤラットを用いて行った。最終用量は、５０ｍｇ／ｋｇであった（各ラットに対して２０〜２５ｍｇタンパク質が必要であった）。各液体および粉末製剤に対して１０匹の個々のラットを使用し、一方プラセボ（Ａ５２ＳｕＴ＋０．０５Ｍトリス ｐＨ８．０＋２２％ＰＥＧ−３３５０）に対して８匹のラットを使用した。
結果および考察：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｌｏｗ Ｉｏｎｉｃ Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｓｃｒｅｅｎ（ＬＩＳＳ）を使用してＡｂ−３０Ｒｍをスクリーニングし、ｐＨ２、およびｐＨ６．５〜９．０の間で全部で２０の結晶ヒットが得られた。スクリーニングした全ての異なるパーセンテージのＰＥＧ−３３５０のうち、８％および１２％のＰＥＧ−３３５０が最も多くの結晶ヒットを有していた。ｐＨ８．０の０．０５Ｍトリスは、４％ＰＥＧ−３３５０を除いて８％〜２４％ＰＥＧ−３３５０からの結晶を有する唯一の条件であった。Ａｂ−３０Ｒｍに対して得られたほとんどの結晶ヒットは、ｐＨ７．０〜７．５のｐＨ範囲内に含まれ、これは、動物試験において、皮下注射後の組織壊死を回避するために重要である。
オスモル濃度データに基づき、１６％および２４％ＰＥＧ−３３５０のいくつか、ならびに２０％ＰＥＧ−３３５０条件の全てが、オスモル濃度範囲内に含まれた。皮下注射に許容されるオスモル濃度範囲は、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇである（図１Ａを参照されたい）。オスモル濃度および結晶ヒットを重ね合わせると、結晶ヒットも有するオスモル濃度範囲内に含まれる条件は３つのみであった（図１Ｂ）。
ＰＥＧ−３３５０は、結晶化をもたらす化学的因子に該当し、体積排除効果により作用する長鎖ポリマー沈殿剤として特徴付けることができる。Ａｂ−３０Ｒｍ結晶の形態は、ＬＩＳＳによるスクリーニングにおいて見られるように、ＰＥＧ−３３５０濃度の増加と共に劣化した（図２）。より高いパーセンテージのＰＥＧ−３３５０結晶ヒットは、二層分離および／または沈殿を有していた。Ａｂ−３０Ｒｍ結晶は、成長するのに約１週間を要したが、これは、バッチ結晶化に同じ条件が使用された場合、遅い。
結晶化の速度は、ハンギングドロップ蒸気拡散およびバッチ結晶化において必ずしも同じではない。結晶化の速度を増加させるために、１２％ＰＥＧ−３３５０のみでのＨＥＰＥＳおよびトリス条件に集中して、Ａｂ−３０Ｒｍの結晶化および濃縮をもたらす別の化学的因子であるｐＨ範囲を操作した。Ａｂ−３０Ｒｍを、ＨＥＰＥＳ Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ ｐＨ６．８〜８．２およびＴｒｉｓ Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ ｐＨ７．０〜９．０に通した。グリッドスクリーンのいずれにおいても結晶化の速度の変化は観察されなかったが、７．５より高いｐＨにおいて、両方のグリッドスクリーンで結晶の増加した存在量が見られた。したがって、結晶化の速度を変化させるために、沈殿剤ＰＥＧ−３３５０の濃度を探求することによる別の試みを行った。
７〜９．０のｐＨ範囲のＬＩＳＳ条件＃１０〜１４を使用し、２％の増分の４％から２４％までのＰＥＧ−３３５０を探求した。２２％および２４％ＰＥＧ−３３５０での０．０５ＭトリスｐＨ８．０は、２日目で最初の結晶ヒットを生じた。これらの条件を、５５μｌ、１１０μｌおよび１ｍｌ総体積でバッチ結晶化したが、全て２日目で結晶ヒットを生じた。２２％および２４％ＰＥＧ−３３５０における結晶化の速度は、１１μｌハンギングドロップ蒸気拡散およびバッチ結晶化において同じである。両方の条件に対して測定された最終ｐＨは、７〜７．５のｐＨ範囲内にあり、２２％ＰＥＧ−３３５０においてｐＨ＝７．２０３、２４％ＰＥＧ−３３５０においてｐＨ＝７．３５４である。０．０５Ｍトリス２２％ＰＥＧ−３３５０のオスモル濃度は３４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、一方、０．０５ＭトリスｐＨ８．０のオスモル濃度は４１２ｍＯｓｍ／ｋｇであり、これはオスモル濃度範囲を超えている。結晶を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、上澄みに対してＡ２８０ｎｍ測定することにより、％効率を測定した。Ａｂ−３０Ｒｍ結晶の水に対する溶解速度は１１分、生理食塩水に対する溶解速度は６分、およびＰＢＳに対する溶解速度は１５分である。
等張性および注射可能な条件は、動物試験のためのＡｂ−３０Ｒｍ製剤において達成され、最終ｐＨは７．２０３、オスモル濃度は３４０ｍＯｓｍｏ／ｋｇ、および結晶化効率は９５％であった。液体対再懸濁抗体結晶製剤を、動物試験において試験した。
上記の実施例は、Ａｂ−３０Ｒｍが、様々な結晶化条件下で結晶化し得るが、試験した全ての条件下で結晶が形成したわけではなかったことを実証している。複数の異なる市販の（すなわち、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）スクリーンにおいて、約２４０の結晶化条件を試験したが、約５０の条件のみがＡｂ−３０Ｒｍ結晶を生成した。興味深いことに、いくつかの異なる市販の（すなわち、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）および専用のスクリーンにおいて、Ａｂ−３０Ｒ（Ａｂ−３０Ｒｍと比較して１つのアミノ酸の違いを有する）は、試験された約１１２０の条件のうち５つのみにおいて結晶を生成した。
上記実施例はまた、哺乳動物に対する投与のための十分なｐＨおよびオスモル濃度のＡｂ−３０Ｒｍ結晶を含む製剤が得られたことを実証している。
実施例６ − 抗スクレロスチン抗体「液体」および「結晶／結晶化」製剤の、ラットにおけるＩｎ ｖｉｖｏ試験
雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、清潔なケージ内に、ケージ当たり２匹の動物で収容した。室温を６８°Ｆ〜７２°Ｆの間に維持し、相対湿度を３４％〜７３％の間に維持した。ケージを収容する実験室は、１２時間の明暗サイクルを有し、全てのＡＡＡＬＡＣ仕様を満たした。
ラットが約６．５ヶ月齢となったら、試験品（液体Ａｂ−３０Ｒｍおよび結晶／結晶化Ａｂ−３０Ｒｍ）ならびに緩衝液（ビヒクル対照）の皮下注射を行った。試験の開始時（０日目）に、以下の成分比で作製された緩衝液を９匹のラットに注射した：４００マイクロリットルのＡ５ＳｕＴ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５、９％スクロース、０．００４％ポリソルベート２０［Ｔｗｅｅｎ］）を取り、次いで２００マイクロリットルの０．０５Ｍトリス ｐＨ８を添加し、次いで５００マイクロリットルの２２％ＰＥＧ−３３５０を添加する。これは、緩衝液／ビヒクル群である。試験の開始時（０日目）に、以下の成分比で作製された懸濁液中の「結晶／結晶化」Ａｂ−３０Ｒｍの１００ｍｇ／ｍｌ溶液を、５０ｍｇ／ｋｇで１０匹のラットに注射した：２００マイクロリットルの０．０５Ｍトリス ｐＨ８、および５００マイクロリットルの２２％ＰＥＧ−３３５０。これは、「結晶／結晶化」群である。試験の開始時（０日目）に、Ａ５ＳｕＴ中の「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ（非結晶化）の１００ｍｇ／ｍｌ溶液を、５０ｍｇ／ｋｇで１０匹のラットに注射した。これは、「液体」群である。
二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ、Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ ４５００ａ、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）により、麻酔したラット（イソフルラン）から面積骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。処置が開始される４日前に、ベースラインＢＭＤを測定した。また、処置（０日目）後２週目、３週目、４週目、６週目および８週目にもＢＭＤを測定した。関心領域（ＲＯＩ）は、腰椎（ＬＶ１−５）および「脚」（大腿骨−脛骨［脛骨／腓骨関節の上の脛骨の部分を加えた全大腿骨］）を含んでいた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して統計分析を行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計学的差異を決定した。各データセットの群平均は、Ｐ値が０．０５（Ｐ＜０．０５）未満の時に有意に異なるとみなした。データは、絶対ＢＭＤ（ｇ／ｃｍ２）として分析し、また別個にベースラインからのＢＭＤのパーセント変化として分析した（それぞれの個々の動物に対して計算した）。
３つの動物群に対するＢＭＤデータ（絶対ＢＭＤおよびベースラインからのＢＭＤのパーセント変化）は、Ａｂ−３０Ｒｍの「液体」製剤の単回投与およびＡｂ−３０Ｒｍの「結晶／結晶化」製剤の単回投与が、本ラット試験においてＢＭＤの同様の増加をもたらしたことを示した。緩衝液／ビヒクル群に対する統計的に有意な増加は、腰椎骨格部位および「脚」（大腿骨−脛骨）骨格部位（図８Ｂ）において、「液体」Ａｂ−３０Ｒｍ群（図７Ａおよび７Ｂ）ならびに「結晶／結晶化」Ａｂ−３０Ｒｍ群の両方に見られた（図７Ｂ）。これらのデータは、「液体」および「結晶／結晶化」Ａｂ−３０Ｒｍ製剤の両方の有益な骨作用を実証している。
実施例７ − 結晶性Ａｂ−３０製剤
この実施例は、２つの成熟重鎖（配列番号１５）および２つの成熟軽鎖（配列番号１３）のそれぞれをコード化するＤＮＡによって組み換えにより生成されたそれらの鎖からなる抗スクレロスチン抗体Ａｂ−３０を含む、徐放性の可能性を有する高濃度のタンパク質を含む抗スクレロスチン抗体結晶の製剤化を示す。
簡潔には、ＧＲＡＳ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ Ｗｉｚａｒｄ Ｉ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｗｉｚａｒｄ ＩＩ ＳｃｒｅｅｎおよびＷｉｚａｒｄ ＩＩＩ Ｓｃｒｅｅｎを使用して、全部で１０４の結晶化条件をＡｂ−３０に対してスクリーニングした。４つの条件が、結晶化効率パーセントに基づく製剤化に絞り込まれた（すなわち、ＷＩＺ ＩＩＩ ＃３５、ＧＲＡＳ ＃１、ＩＮＤＸ ＃３４、ＩＮＤＸ ＃３６およびＷＩＺ Ｉ ＃４６）。動物実験における皮下注射に好適な５％デキストロース中に再懸濁されたＡｂ−３０の製剤の生成に成功した。
実施例８ − 抗スクレロスチン抗体Ａｂ−３０「液体」および「結晶／結晶化」製剤の、ラットにおけるＩｎ ｖｉｖｏ試験
雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、清潔なケージ内に、ケージ当たり２匹の動物で収容した。室温を６８°Ｆ〜７２°Ｆの間に維持し、相対湿度を３４％〜７３％の間に維持した。ケージを収容する実験室は、１２時間の明暗サイクルを有し、全てのＡＡＡＬＡＣ仕様を満たした。
ラットが約６．５ヶ月齢となったら、試験品（液体Ａｂ−３０および様々な結晶／結晶化形態のＡｂ−３０）ならびに緩衝液（ビヒクル対照）の皮下注射を行った。試験の開始時（０日目）に、５％デキストロース（源：Ｂａｘｔｅｒ ＩＶバッグ）を８匹のラットに注射した。これは、緩衝液／ビヒクル群である。試験の開始時（０日目）に、１００ｍｇ／ｍｌの以下のうちの１つの溶液を、１００ｍｇ／ｋｇで８匹のラットに注射した。
−「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤ＷＩＺ ＩＩＩ ＃３５、前記結晶は５％デキストロース（源：Ｂａｘｔｅｒ ＩＶバッグ）に再懸濁されている（「Ｗ３５群」）；
−「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤ＩＮＤＸ ＃３４、前記結晶は５％デキストロース（源：Ｂａｘｔｅｒ ＩＶバッグ）に再懸濁されている（「Ｉ３４群」）；
−「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤ＩＮＤＸ ＃３６、前記結晶は５％デキストロース（源：Ｂａｘｔｅｒ ＩＶバッグ）に再懸濁されている（「Ｉ３６群」）；
−「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤ＷＩＺ Ｉ ＃４６、前記結晶は５％デキストロース（源：Ｂａｘｔｅｒ ＩＶバッグ）に再懸濁されている（「Ｗ４６群」）；または
−Ａ５Ｓｕ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ ５、９％スクロース）中の「液体」Ａｂ−３０（非結晶化）（「液体群」）。
二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ、Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ ４５００ａ、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）により、麻酔したラット（イソフルラン）から面積骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。処置が開始される７日前に、ベースラインＢＭＤを測定した。また、処置（０日目）後２週目および４週目にもＢＭＤを測定した。関心領域（ＲＯＩ）は、腰椎（ＬＶ１−５）および「脚」（大腿骨−脛骨［脛骨／腓骨関節の上の脛骨の部分を加えた全大腿骨］）を含んでいた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して統計分析を行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計学的差異を決定した。各データセットの群平均は、Ｐ値が０．０５（Ｐ＜０．０５）未満の時に有意に異なるとみなした。データは、絶対ＢＭＤ（ｇ／ｃｍ２）として分析し、また別個にベースラインからのＢＭＤのパーセント変化として分析した（それぞれの個々の動物に対して計算した）。
緩衝液／ビヒクル群に対するＢＭＤの統計的に有意な増加は、腰椎において、「液体」Ａｂ−３０群（図９Ａおよび９Ｂ）、ならびに「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤群（図９Ｂ）のいくつか（例えば、Ｗ３５、Ｉ３６）の両方に見られた。緩衝液／ビヒクル群に対するＢＭＤの統計的に有意な増加はまた、「脚」（大腿骨−脛骨）骨格部位において、「液体」Ａｂ−３０群（図１０Ｂ）、および「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤群（図１０Ｂ）のいくつか（例えば、Ｗ３５、Ｉ３６）の両方に見られた。これらのデータは、「液体」および「結晶／結晶化」Ａｂ−３０製剤の両方の有益な骨作用を実証している。
実施例９ − 抗スクレロスチン抗体Ａｂ−３１の結晶化
２つの成熟重鎖（配列番号３５）および２つの成熟軽鎖（配列番号３３）のそれぞれをコード化するＤＮＡによって組み換えにより生成されたそれらの鎖からなる抗体Ａｂ−３１を、様々な条件下で結晶化させた。
Ａｂ−３１の結晶化は、「ハンギングドロップ」蒸気拡散として知られる巨大分子の結晶化のための方法を使用する結晶化スクリーン（ＰＥＧ／ＬｉＣｌ Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して達成した。ポリペプチド試料および結晶化試薬（「結晶化緩衝液」または「母液」）の混合物で構成される液滴を、シアラン化したカバースリップの底面に滴下し、次いでカバースリップ上の液滴をグリースで封止し、典型的には、試薬の液体貯蔵容器との蒸気平衡をもたらす２４ウェルＶＤＸトレイ上に設置する。平衡を達成するために、液滴とトレイのウェル内の１ｍｌ貯蔵容器溶液との間で水蒸気が交換される。液滴から水がなくなると、ポリペプチド試料は相対濃度を増加させ、これは最終的に過飽和をもたらし得る。結晶化が生じるために必要なのは、ポリペプチド試料の濃度の増加である。典型的には、液滴は、貯蔵容器よりも低い濃度の試薬を含有し、典型的には、等体積の試料および試薬を混合して液滴を形成したため、液滴は、貯蔵容器における試薬の濃度の半分を含有した。
これらの実験において、液滴中のＡｂ−３１の初期タンパク質濃度は、３０ｍｇ／ｍｌであった。結晶化スクリーンは、２４ウェルＶＤＸポリプロピレン組織培養トレイ内に設置した。ＶＤＸトレイにおけるそれぞれの位置は、１ｍＬの試薬貯蔵容器を含有したが、異なる結晶化緩衝液条件のアレイを確立するために、各ウェルにおける試薬貯蔵容器は、他のウェルにおける試薬貯蔵容器とは組成が異なっていた。各ポリペプチド濃度の１ｍＬのポリペプチド溶液を、１μｌの貯蔵容器溶液に添加して、液滴を形成した。４℃または周囲室温においてトレイをインキュベートした。
Ａｂ−３１結晶化は、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．１５〜ｐＨ７．４７、および１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２の結晶化条件下で、４℃および室温の両方において観察された。得られた結晶は、その長さが約１００μｍ〜約１０００μｍで変動し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．０ソフトウェアで作動するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃデジタルカメラと結合したＺｅｉｓｓ Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１偏光実体顕微鏡により決定されるように、楕円体形状を示した。
上記の実施例は、Ａｂ−３１が、様々な結晶化条件下で結晶化し得るが、試験した全ての条件下で結晶が形成したわけではなかったことを実証している。約２５０の異なる結晶化条件を試験したが、約３６の条件のみがＡｂ−３１結晶を生成した。
本発明の現在好ましい実施形態を考慮して、当業者は、本発明の実践における数々の修正および変形を思い付くことが予測される。結果として、本発明の範囲に適用されるべき限定は、添付の特許請求の範囲に記載のもののみである。
本明細書において参照される、および／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物は、全て、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。
上記から、本発明の特定の実施形態が例示を目的として本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な修正を行うことができることが理解される。

Claims (20)

  1. それぞれの軽鎖が配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖およびそれぞれの重鎖が配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む２つの重鎖を含む抗スクレロスチンＩｇＧ２抗体を含む無菌製剤であって、前記抗体の少なくとも９０％が、（ａ）５μｍ〜５００μｍの長さ、および（ｂ）楕円体、棒および針またはそれらの混合からなる群から選択される形状を有する結晶形態であり、結晶形態の前記抗体は、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、タクシメート、クエン酸ナトリウム二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酢酸塩、酢酸カルシウム、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、硫酸リチウム、酢酸リチウム二水和物、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム四水和物、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化セシウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムおよびギ酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含む、製剤。
  2. 凍結乾燥製剤である、請求項１に記載の製剤。
  3. 液体製剤である、請求項１に記載の製剤。
  4. ０．５〜２ｍｌの液体中に分散した少なくとも約１００ｍｇの前記抗体の濃度を有する、請求項３に記載の製剤。
  5. １．５ｍｌ以下の液体中に分散した少なくとも約１４０ｍｇの抗体を含む、請求項３に記載の製剤。
  6. 請求項２に記載の製剤を再懸濁させる方法であって、前記製剤を約０．５〜２ｍＬの無菌懸濁ビヒクルに接触させることを含む方法。
  7. 前記懸濁ビヒクルは、グルタメート、ソルビトール、ＨＥＰＥＳ、デキストロースおよび水またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖および配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む２つの重鎖を含む抗スクレロスチンＩｇＧ２抗体の結晶を含む請求項１に記載の製剤を作製する方法であって、前記抗体の結晶が形成されるように、約６〜約８のｐＨで、前記抗体の溶液を、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、タクシメート、クエン酸ナトリウム二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酢酸塩、酢酸カルシウム、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、硫酸リチウム、酢酸リチウム二水和物、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム四水和物、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化セシウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウムおよびギ酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含む結晶化試薬と組み合わせることを含む、方法。
  9. 前記塩の濃度は、約０．１Ｍから約１０Ｍまでである、請求項８に記載の方法。
  10. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖および配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む２つの重鎖を含む抗スクレロスチンＩｇＧ２抗体の結晶を含む請求項１に記載の製剤を作製する方法であって、結晶が形成されるように、前記抗体の溶液を、約６〜約８のｐＨで、コハク酸、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００またはイソプロパノールを含む結晶化試薬と組み合わせることを含む、方法。
  11. 前記抗体の少なくとも９０％が結晶化する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. バッチ結晶化法である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記結晶化試薬は、
    （ａ）約０．１Ｍから約５Ｍまでのコハク酸、約０．１Ｍから約５ＭまでのＨＥＰＥＳおよび約０．１％（ｗ／ｖ）から約６０％（ｗ／ｖ）までのポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００、
    （ｂ）約１％（ｗ／ｖ）から約５０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−８０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのイミダゾールおよび約０．１Ｍから約５Ｍまでの酢酸カルシウム、
    （ｃ）約１０％から約８０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−１０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのリン酸ナトリウム／カリウムおよび約０．０５Ｍから約５Ｍまでの塩化ナトリウム、
    （ｄ）約１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）までのＰＥＧ−８０００、約０．０５Ｍから約５Ｍまでのカコジル酸塩、約０．１Ｍから約２Ｍまでの酢酸カルシウム、および約１０％から約３０％（ｗ／ｖ）までのグリセロール、または、
    （ｅ）約１０％から約３０％までのイソプロパノールおよび約０．１Ｍから約２Ｍまでのリン酸ナトリウム／カリウムを含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記結晶化試薬は、約１Ｍのコハク酸、約０．１ＭのＨＥＰＥＳおよび約１％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールモノメチルエーテル２０００を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記結晶化試薬は、約１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、約０．１Ｍのイミダゾールおよび約０．２Ｍの酢酸カルシウムを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記結晶化試薬は、約２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−１０００、約０．１Ｍのリン酸ナトリウム／カリウムおよび約０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記結晶化試薬は、約１４％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００、約０．０８Ｍのカコジル酸塩、約０．１６Ｍの酢酸カルシウム、および約２０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記結晶化試薬は、約１９％のイソプロパノールおよび約０．２Ｍのリン酸ナトリウム／カリウムを含む、請求項１３に記載の方法。
  19. 哺乳動物対象において、骨ミネラル密度を増加させる、骨密度の減少に関連した障害を処置する、骨関連障害を処置する、または処置、置換、グラフト、手術もしくは修復の結果を改善するための、請求項１に記載の製剤を含む薬学的組成物であって、前記製剤が、前記対象における骨ミネラル密度を増加させるのに効果的な量で提供されるものである、組成物。
  20. 対象における骨粗鬆症を治療するための、請求項１に記載の製剤を含む薬学的組成物。
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