CN116375864B - 一种抗大熊猫amh单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
一种抗大熊猫amh单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗大熊猫AMH单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。该抗大熊猫AMH单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性AMH单克隆抗体，为AMH蛋白的定位和组织表达信息，及利用AMH高特异性的单克隆抗体对AMH及其受体和靶细胞的研究，探讨AMH在大熊猫上生物学作用以及AMH及其受体的调控机制，揭示其在大熊猫生长发育期的作用提供了资料和思路。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗大熊猫AMH单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
抗缪勒氏管激素（Anti-MμLlerian Hormone，AMH）（又称作缪勒氏管抑制物（MμLlerian-Inhibiting Substance，MIS）是未成熟的支持细胞和正在生长的卵泡颗粒细胞分泌的由两个相同的70 kDa亚基通过二硫键连接组成的二聚体糖蛋白。与抑制素、激活素、骨形态发生蛋白和生长分化因子等共同构成转化生长因子β超家族。AMH 作为转化生长因子β超家族的成员之一，其通过AMHRⅡ、AMHRⅠ受体和 2个效应分子来激活 Smads蛋白信号转导途径。最重要的生物学功能是诱导雄性胎儿苗勒氏管的退化。在性别分化前，胎儿有一个未分化的性腺，包含一对沃尔夫管和苗勒氏管。在SRY 基因的存在下，未分化的性腺发育成睾丸，产生AMH 和睾酮。胎儿支持细胞产生的AMH在性别分化中至关重要；AMH与AMH II型受体的相互作用引发级联效应，导致苗勒氏管的退化。在SRY基因缺乏的情况下，未分化的性腺发育成胎儿卵巢。与睾丸相反，胎儿卵巢不产生AMH 或睾酮。最终，苗勒氏管发育成输卵管、子宫、宫颈和阴道末端，沃尔夫管退化。
AMH 基因的位置在不同的物种中是不同的。在人类AMH 基因位于19 号染色体上，5 段外显子，编码氨基酸 560个，成熟的AMH蛋白包括2个不相等的结构域。小鼠AMH定位于第10号染色体短臂上，其成熟mRNA的全长为1665 bp，包含5段外显子，编码构成AMH蛋白的2个结构域，554个氨基酸构成AMH前体，其中24个氨基酸为信号肽。牛和马上AMH位于7号染色体上，马与牛的AMH 前体长度相似，含有573个氨基酸。雄性动物在生长发育时，睾丸表达AMH及AMHRⅡ受体，在精索开始发育时，支持细胞开始表达AMH，在胎儿和新生儿时期，由于雄激素受体的缺乏，睾酮无法抑制AMH的表达，从胎儿出生开始至青春期前，AMH在睾丸中持续高表达，进入青春期后，AMH的表达开始逐渐降低。在雌性动物中越来越多的研究表明，AMH与卵泡发育、卵巢储备功能存在密切的相关性，是评价卵巢储备功能的一个有用的指标。
目前，由于大熊猫中缺乏AMH特异抗体，导致关于大熊猫AMH的研究存在空白。因此，建立大熊猫高特异性的AMH单克隆抗体，并将其应用于Western Blot蛋白印迹检测，为AMH蛋白的定位和组织表达信息，及利用AMH高特异性的单克隆抗体对AMH及其受体和靶细胞的研究，探讨AMH在大熊猫上生物学作用以及AMH及其受体的调控机制，揭示其在大熊猫生长发育期的作用具有重要的基础作用。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种抗大熊猫AMH单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用，以解决现有技术中缺少特异的抗大熊猫AMH特异抗体的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种抗大熊猫AMH单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，其重链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1所示序列具有80%以上同源性，且具有相同功能的氨基酸序列；
其轻链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2所示序列具有80%以上同源性，且具有相同功能的氨基酸序列。
进一步地，重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；轻链全长氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
进一步地，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，抗大熊猫AMH单克隆抗体的亚型为IgG1。
一种表达载体，包括上述抗大熊猫AMH单克隆抗体。
一种分泌上述抗大熊猫AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株AMH-W，该杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC NO：C202284，于2022年3月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
上述抗大熊猫AMH单克隆抗体在大熊猫抗缪勒氏管激素检测中的应用。
进一步地，采用Western Blot进行检测。
上述抗大熊猫AMH单克隆抗体在制备用于检测大熊猫抗缪勒氏管激素WesternBlot检测试剂盒中的应用。
上述抗大熊猫AMH单克隆抗体的制备方法，步骤如下：
（1）原核表达大熊猫AMH（24-518）氨基酸序列，具体序列信息如下：APGGEGSSAPASPGEPGTGGLIFHQDWDWPPGSPQDPLCLVTLDQTGNRSSTPLRVAGALRGYEHAFLEVVQQARWGPRDLAALGVCTASAGQPGLLRLRQLQAWLGEPGGRRLAVLHLQEVTWEPTFSLKFQDPPPGGASPLELALLVLYPGPGPEVTVTGTGLPGTQNLCWSRDTRYLVLAVDHPAGAWHSPGVTLTLQPRGDGHAGAPLSTPQLQELLFGHDPRCFTRMTPALLLLPPPGPTPMPAHGLLDQVPFPPPRPSQEQEPKEPPPSADPFLETLTRLVRALRGPPAEASPPRLALDPGALAGFPQGLVNLSDPATQERLLDGEEPLLLLLPPSTAAAGDPAPLQGPESAPWAEGLGHRVATELPAAAAELRELPGLPPAATPLLERLLALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGACGWPQSDRNPRYGNHAVLLLKMQARGAALARAPCCVPTAYAGKLLISLSEERIRAHHVPNMVATECGCR，作为生产特异性抗体的免疫原AMH(24-518)；
（2）以步骤（1）制备的免疫原AMH(24-518)免疫小鼠；
（3）细胞融合得到抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株AMH-W；
（4）扩大培养得到抗大熊猫AMH单克隆抗体。
本发明的有益效果：
本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗 AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性AMH单克隆抗体，并建立高特异性的AMH单克隆抗体应用于Western Blot蛋白检测，为AMH蛋白的定位和组织表达信息，及利用AMH高特异性的单克隆抗体对 AMH及其受体和靶细胞的研究，探讨AMH在大熊猫上生物学作用以及AMH及其受体的调控机制，揭示其在大熊猫生长发育期的作用，提供了新的资料和思路。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析AMH（24-518）蛋白的表达结果图；其中，条带 M: SDS-PAGEProtein Marker；条带 0:对照(不加IPTG)；条带 1: 15℃诱导16 h；条带 2: 37℃诱导16h；
图2为SDS-PAGE分析AMH（24-518）蛋白可溶性检测结果图；其中，条带 M: SDS-PAGE Protein Marker；条带 1：全菌破菌后上清；条带 2：全菌破菌后沉淀；
图3为SDS-PAGE分析包涵体中AMH（24-518）蛋白纯化结果图；其中，条带 M: SDS-PAGE Protein Marker；条带 1：包涵体溶解离心后上清；条带 2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；条带 3-4：100mM Imidazole的洗脱组分；条带 5：300mM Imidazole的洗脱组分；
图4为大熊猫AMH单克隆抗体Western-blot检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
1.抗大熊猫AMH单克隆抗体的制备
1.1免疫原制备：
1.1.1 AMH（24-518）重组质粒的制备
根据NCBI数据库大熊猫AMH氨基酸序列，登录号：XP_034513312.1，序列为：
MWALLLWPPALVLLAMGPLLGPGAPGGEGSSAPASPGEPGTGGLIFHQDWDWPPGSPQDPLCLVTLDQTGNRSSTPLRVAGALRGYEHAFLEVVQQARWGPRDLAALGVCTASAGQPGLLRLRQLQAWLGEPGGRRLAVLHLQEVTWEPTFSLKFQDPPPGGASPLELALLVLYPGPGPEVTVTGTGLPGTQNLCWSRDTRYLVLAVDHPAGAWHSPGVTLTLQPRGDGHAGAPLSTPQLQELLFGHDPRCFTRMTPALLLLPPPGPTPMPAHGLLDQVPFPPPRPSQEQEPKEPPPSADPFLETLTRLVRALRGPPAEASPPRLALDPGALAGFPQGLVNLSDPATQERLLDGEEPLLLLLPPSTAAAGDPAPLQGPESAPWAEGLGHRVATELPAAAAELRELPGLPPAATPLLERLLALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGACGWPQSDRNPRYGNHAVLLLKMQARGAALARAPCCVPTAYAGKLLISLSEERIRAHHVPNMVATECGCR（SEQ IDNO.5）。共计518个氨基酸，为获得特异的免疫原，通过原核表达的方式构建表达AMH蛋白24-518的氨基酸序列的AMH(24-518)重组蛋白表达载体。采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将AMH（24-518）基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性。
1.1.2 AMH（24-518）蛋白表达与鉴定
（1）将构建好的含有AMH（24-518）基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。
（2）从转化的平板中挑选单克隆，接种到4 mL的LB培养基中（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素），待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2 mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。取诱导后的培养液12000 rpm离心5 min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10 min，然后离心取上清电泳。160 V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1 cm，取出凝胶利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色，结果见图1。
（3）扩大培养：生长至OD600=0.8时，加终浓度0.2 mM IPTG，15℃诱导16 h后收集菌体。全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole含1% Triton X-100，1mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测，蛋白表达在包涵体中（图2）。
（4）包涵体采用50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl含1% Triton X-100，2 mMEDTA，5 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图3。
（5）经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的条带 3和5，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液［1×PBS(pH7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，0.4M L-Arginine，1 M Urea］中复性，复性后AMH（24-518）蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4) 溶液约6-8 h。透析复性结束后，上清用0.22 μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃保存备用。
1.2抗原小鼠免疫
用佐剂：抗原=1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中（共400μL，四只的量），再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中（共400μL，四只的量）；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化（乳化大概10多分钟，至油包水状态即可），最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
第1天： 腹腔注射，200μL一只。(抗原量为100μg/只)
第14天：腹腔注射，200μL一只。（之后抗原都为50μg/只）
第21天：腹腔注射，200μL一只。
第27天：腹腔注射，200μL一只。
第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp，8min，取血清测定其效价，以AMH（24-518）蛋白，包被浓度为20ng/mL作为抗原，ELISA方法检测血清效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。免疫血清效价如表1所示：
表1 免疫后血清效价
以上结果表明2，3，6号鼠达到免疫要求，可进行细胞融合实验。
1.4细胞融合：
1.4.1 骨髓瘤细胞（SP2）的复苏
先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15mL的离心管中，再取大概5mL的PBS，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱中培养。
1.4.2 SP2细胞的传代
当培养瓶中的细胞长满瓶底80%左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加PBS 5mL，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2mL 10%完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
1.4.3滋养层巨噬细胞的制备（融合前一天可准备）：
小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75%酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8mL的含双抗的不完全培养基注射入腹腔（双抗:不完全培养液=1:100），注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000 r/min离心5min，弃去上清。再用PBS洗涤四次。将细胞重悬于10%的完全培养液中。
将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100μL，最后将96孔板放入CO2的培养箱培养。（巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。）
1.4.4免疫脾细胞制备：
（1）取小鼠脾脏
取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75%的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置（超净台中），进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于PBS中洗涤。
（2）脾细胞悬液制备
先用PBS洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加PBS洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5mL PBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤完后加2mL 不完全培养液（DMEM）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
（3）SP2细胞悬液的制备
用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜（细胞均为悬浮或轻微帖壁生长），再将细胞液用加样抢转移至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS5mL，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2mL不完全培养液（DMEM）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
1.4.5 PEG作用下进行细胞融合
（1）将SP2与脾细胞按1：4（1:10至1:4之间）的比例混合在一起，离心，600rpm，3min;弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6mL50% PEG溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液10mL以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心，800rpm，5min，弃上清；再用PBS或不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。
（2）洗涤完后弃上清，用10mLHAT选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内（用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体），每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含HAT的完全培养液（19.6mL 10%完全培养液+0.4mL HAT），每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。
1.4.6选择培养
（1）融合培养的第四天半液法换HAT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μL HAT培养液（HAT培养液配制为：10%的完全培养液：HAT=1:50），每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HAT。
（2）融合培养的第七天半液法换HT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μL HT培养液（HT培养液的配制为：10%的完全培养液：HT=1:50），每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HT。
1.4.7阳性克隆筛选
在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时（大概在第12天左右），可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
（1）先将之前包被好的相应的ELISA(包被AMH（24-518），包被浓度为20ng/mL)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100μL每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10%的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清（融合前小鼠眼眶采血的血清）。
（2）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
（3）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
（4）加双抗：双抗稀释10000倍，50μL每孔。
（5）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
（6）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
（7）显色：每孔加显色剂TMB100μL，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。
（8）比色测定：每孔加终止液50μL（终止液=21.5mL的浓硫酸定容至200mL），轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。
选取阳性结果高者（至少为阴性对照的4倍），作为阳性克隆孔。
1.4.8有限稀释法筛选抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株
（1）阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔孔可做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15mL的离心管中（边吹打边旋转，使细胞悬浮），再补加10%的完全培养液至2mL；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验（由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞）。
（2）将细胞液加入200mL完全培养液中，混匀，96孔板加样，200μL/孔，共十块96孔板。
（3）最后将培养板置CO2培养箱中培养。
（4）培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
（5）培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10%完全培养液100μL/孔。
（6）第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测（ELSIA检测），阳性强的孔即为抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株，本发明最终筛选得到3株抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株。
1.4.9亚型鉴定
使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503 试剂盒进行亚型鉴定。
准备工作：将试剂盒中TBS溶于500mL双蒸水中，用于稀释样品， 870mL双蒸水与30mL 30X Wash Buffer混匀，用于洗板， 根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450μL的样品稀释液，吸取20μL的细胞培养液加入980μL的TBS中混匀。
实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50μL/孔，每个样需加8孔即一条，加入50μL/孔的 Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM HRP，轻柔的晃动板子混匀 盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75μL/孔的TMB显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75μL/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到3株抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株亚型为一株IgG1型，另外2株为IgG2b型，亚型鉴定结果如表2所示：
表2 杂交瘤细胞株亚型
1.4.10单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
（1）批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中（边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移）培养，并加600μL的10%完全培养液培养。
（2）观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养（先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10%的完全培养液7mL）。
（3）观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养（细胞传代）。
（4）可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为Pierce Protein G Agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的抗大熊猫AMH单克隆抗体，-20℃保存备用。
1.4.11单克隆抗体细胞株冻存
将鉴定的3株抗大熊猫AMH单克隆抗体杂交瘤细胞株培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中（细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长），在将细胞转移至15mL的离心管中。离心，1000转/5分钟。用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液（冻存液=5mL血清+4mL DMEM+1mL DMSO，颠倒混匀，过滤备用），混匀。最后加入冻存管中，每管1mL细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将筛选得到的3株阳性细胞株放入液氮中长期保存备用。
实施例2抗大熊猫AMH单克隆抗体效价检测及其在western blot技术中的应用
1、抗大熊猫AMH单克隆抗体在western blot技术中的应用
（1）目的细胞总蛋白的提取
应用蛋白提取试剂盒：C510004-0020，生工生物工程（上海）股份有限公司提供，提取大熊猫骨髓间充质干细胞总蛋白，并通过BCA法对总蛋白浓度进行测定。
（2）制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5% ，分离胶12%。
（3）制样：蛋白上样量为80μg。
（4）电泳：浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，90 min。
（5）转膜：250 mA，40 min。
（6）封闭：5%脱脂乳，37 ℃缓慢震荡2 h。
（7）孵育一抗：3杂交瘤细胞株抗体及GAPDH内参抗体分别均1:1000稀释，4 ℃缓慢振荡过夜，次日37 ℃复温1 h。
（8）孵育二抗：1:8000稀释，37 ℃孵育1 h。
（9）ECL曝光，其检测结果如图4所示。
Western blot结果表明仅一株出现了特异的目的条带，可用于western blot技术中的应用，然后将此杂交瘤细胞株命名为AMH-W， 并于2022年3月27日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: C202284。
2、抗大熊猫AMH单克隆抗体效价测定及序列测定
使用间接ELISA检测培养液上清纯化AMH单克隆抗体(AMH-W)效价，具体步骤如下：
（1）将上述纯化后的AMH蛋白以2μg/mL，50μL/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜包被。
（2）洗净包被板，加入200μL/孔 含2%BSA的PBS， 37℃封闭2h。
（3）洗板后，加入倍比稀释浓度的AMH单克隆抗体（分别为：1000倍，2000倍，4000倍，8000倍，16000倍，32000倍，64000倍，128000倍，256000倍，512000倍，1024000倍，2048000倍，4096000倍 ，8192000倍）和PBS孔作为对照，37℃孵育1h。
（4）洗板后，加入1：5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。
（5）加入TMB显色底物100μL/孔，反应5min。
（6）加入50μL终止液终止反应。
（7）酶标仪450nm处，读取各孔OD值。
检测结果如表3所示，如表3所示，培养液上清纯化的AMH抗体效价达106以上，抗体效价高。
表3 单克隆抗体效价
将获得的抗大熊猫AMH单克隆抗体送至通用生物（安徽）股份有限公司进行测序，该单克隆抗体的重链可变区序列如下：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSRYMMSWVRQISEKRPEWVAYITKDGGNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMRSLKSEDTAMYFCATSGGYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO.1）。
轻链可变区序列如下：
QIVLTQSPVIMSASPGEKVTLTCSASSSVDSNYLYWYQQKPGSSPKLWIFSTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSFEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO.2）。
综上，本发明开发的抗大熊猫AMH单克隆抗体，能准确识别目标蛋白AMH，为AMH蛋白的定位和组织表达信息，及利用AMH高特异性的单克隆抗体对 AMH及其受体和靶细胞的研究，探讨AMH在大熊猫上生物学作用以及AMH及其受体的调控机制，揭示其在大熊猫生长发育期的作用，提供了新的资料和思路。
最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种抗大熊猫AMH单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体，其特征在于，所述抗大熊猫AMH单克隆抗体的亚型为IgG1。
3.一种编码权利要求1所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体的核酸，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种表达载体，其特征在于，表达权利要求1或2所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体。
5.一种分泌如权利要求1或2所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株AMH-W，所述杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC NO：C202284，于2022年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心。
6.权利要求1或2所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体在制备大熊猫抗缪勒氏管激素检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用Western Blot进行检测。
8.权利要求1或2所述的抗大熊猫AMH单克隆抗体在制备用于检测大熊猫抗缪勒氏管激素的Western Blot检测试剂盒中的应用。
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