CN109112153A - 一种lpor-y193f突变体蛋白晶体的制备方法 - Google Patents

一种lpor-y193f突变体蛋白晶体的制备方法 Download PDF

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

本发明公开了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，具体包括获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列、表达载体构建、LPOR‑Y193F突变体蛋白表达、LPOR‑Y193F突变体蛋白分离、LPOR‑Y193F突变体蛋白纯化和LPOR‑Y193F突变体蛋白结晶。本发明提供了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

Description

一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法。
背景技术
LPORs是可溶性的单体蛋白，约300个氨基酸，从SDR家族总科的一个分支进化而来。LPOR蛋白与SDR家族共同的特征是光依赖性。类似于另一种已知的光酶DNA光解酶，它含有两个色团：FAD和MDHF/8-HDF，所有的LPORs蛋白都含有NADPH作为辅因子，并有一个Tyr-依赖的催化部位，同时，它的底物Pchlide本身作为光的天线或另一个共因子。整体LPORs结晶的结构，非常类似于一个未知SDR-like蛋白质序列，29.89％的同源性，3rd5来自于partuberculosis分枝杆菌，这也使得LPORs晶体成为了迄今最好的建模模板。然而，获得LPOR蛋白x射线晶体结构，解决相位问题，仍然需要重金属衍生品。
因此，对LPOR-Y193F突变体蛋白的晶体结构分析，从而对LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，包括以下步骤：
(1)获得突变的LPOR-Y193F cDNA序列
设计LPOR cDNA Y193F突变引物，利用KOD Plus mutagenesis kit(TYOBO)获得突变的LPOR-Y193F cDNA序列为SEQ ID NO 1；其中LPOR cDNA Y193F突变引物为：
Y193FN 5’-GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG-3’；SEQ ID NO 2
Y193FC 5’-GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG-3’；SEQ ID NO 3；
(2)表达载体构建
将得到的所述LPOR-Y193F cDNA克隆到原核表达载体pE-SUMO3中，得到pE-SUMO3-LPOR-Y193F；
(3)LPOR-Y193F突变体蛋白表达
将所述pE-SUMO3-LPOR-Y193F转入大肠杆菌BL21细胞中，并于25-37℃，培养3-5小时，直到OD600达到0.8，加入诱导剂于25-30℃，培养3-6小时，得到菌体悬液；
(4)LPOR-Y193F突变体蛋白分离
将步骤3得到的所述菌体悬液进行离心并弃上清液，将得到的菌体重悬于冰浴的溶液A中，得到悬浊液；将所述悬浊液进行均质后离心，得悬浊液上清液并将所述悬浊液上清液经0.44um的滤膜过滤后，上样5-ml HiTrap FF原油柱，利用溶液B按咪唑浓度梯度洗脱；
(5)LPOR-Y193F突变体蛋白纯化
收集步骤(4)洗脱下来的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C进行透析；随后，蛋白上样5-ml Hitrap Q HP柱，洗脱溶液为0.05–0.5M NaCl梯度洗脱液；回收蛋白峰，过Superdex 75分子筛柱子，得到LPOR-Y193F突变体蛋白；
(6)LPOR-Y193F突变体蛋白结晶
将(5)得到的所述LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩至26-30mg/ml，随后浓缩蛋白在蛋白点晶池液中生长1周；挑取晶体在防冻保护液中浸泡5-10s，随即放入液氮管中保存，得到所述LPOR-Y193F突变体蛋白结晶。
优选的，步骤(4)中所述菌体悬液离心方法为5000-7000转/分钟，4℃，离心20-30分钟。
优选的，步骤(4)中所述悬浊液离心方法为16000-20000转/分钟，4℃，离心30分钟。
本发明通过公开了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。
进一步地，步骤(3)中所述诱导剂为0.3mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
进一步地，步骤(4)所述溶液A由20mM Tris-HCl，0.3M NaCl和20mM咪唑组成，其pH为7.4。
进一步地，步骤(4)所述悬浊液均质方法为利用高压均质机破碎，8000压力，破碎3次，每次3分钟。
进一步地，步骤(4)所述溶液B由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和0.02–0.3M咪唑组成，其pH为7.4。本发明中以溶液B洗脱杂蛋白，以利于后期得到纯度较高的目的蛋白。
进一步地，步骤(5)所述溶液C由20mM Tris-HCl和0.05 MNaCl组成，其pH为7.4。本发明中利用溶液C进行透析，有利于保持蛋白的活性。
进一步地，步骤(6)所述LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩方法为，利用浓缩缓冲液在30KD的蛋白浓缩管中进行浓缩；所述浓缩缓冲液包括20mM Tris-HCl和150mM NaCl。本发明选用此浓缩缓冲液进行蛋白浓缩，有利于保护高浓度蛋白活性。
进一步地，步骤(6)所述蛋白点晶池液包括等体积的所述浓缩缓冲液和溶液D；所述溶液D由0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌和1.4M乙酸钠组成，其pH为6.5。本发明中的蛋白点晶池液为坐滴提供稳定的晶体生长环境。
进一步地，步骤(6)所述防冻保护液由1.4M乙酸钠的0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌，10mM NADPH和20％甘油组成，其pH为6.5。晶体在防冻保护液中浸泡有利于保护蛋白晶体，增强蛋白晶体的稳定性，如果晶体不在防冻保护液中浸泡就直接冻融会使蛋白晶体结构遭到破坏。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，具有如下技术优点：
(1)本发明公开了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；
(2)本发明提供的制备LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的方法，同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
LPOR-Y193F突变体蛋白表达
设计LPOR cDNA Y193F突变引物，利用KOD Plus mutagenesis kit(TYOBO)获得突变的LPOR-Y193F cDNA序列为SEQ ID NO 1；其中LPORcDNA Y193F突变引物为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3，将得到的LPOR-Y193F cDNA克隆到原核表达载体pE-SUMO3中，其中原核表达载体pE-SUMO3购自于优宝生物，即得到pE-SUMO3-LPOR-Y193F。
将pE-SUMO3-LPOR-Y193F转入大肠杆菌BL21细胞中，并于37℃，培养5小时，直到OD600达到0.8，加入诱导剂于28℃，培养5小时，得到菌体悬液；其中诱导剂为0.3mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。其中大肠杆菌BL21购自于天根生物公司。
将得到的菌体悬液5000转/分钟，4℃，离心30分钟，并弃去上清液，将得到的菌体重悬于冰浴的溶液A中得到悬浊液，其中溶液A由20mM Tris-HCl，0.3M NaCl和20mM咪唑组成，其pH为7.4。将悬浊液用高压均质机破碎，均质破碎条件为8000压力，3分钟，破碎3次，再离心30分钟，离心条件为16000转/分钟，4℃得悬浊液上清液。
实施例2
LPOR-Y193F突变体蛋白的纯化
将所得到的悬浊液上清液经0.44um的滤膜过滤后，上样5-ml HiTrap FF原油柱，利用溶液B按咪唑浓度梯度洗脱，其中溶液B由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和0.02–0.3M咪唑组成，其pH为7.4。收集洗脱下来的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C进行透析，其中溶液C由20mM Tris-HCl和0.05MNaCl组成，其pH为7.4。随后，蛋白上样5-mlHitrap Q HP柱，洗脱溶液为0.05–0.5MNaCl梯度洗脱液；回收蛋白峰，过Superdex 75分子筛柱子，得到LPOR-Y193F突变体蛋白。
实施例3
LPOR-Y193F突变体蛋白的结晶
利用millipur蛋白浓缩管30KD，将所得LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩至26mg/ml，其中浓缩缓冲液包括20mM Tris-HCl和150mMNaCl。随后浓缩蛋白在蛋白点晶的池液中使晶体生长1周，达到最佳状态。其中蛋白点晶池液包括等体积的浓缩缓冲液和溶液D；溶液D由0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌和1.4M乙酸钠组成，其pH为6.5。
挑取晶体在防冻保护液中浸泡5s，随即放入液氮管中保存，以备收集衍射数据，其中护液防冻保护液由1.4M乙酸钠的0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌，10mM NADPH和20％甘油组成，其pH为6.5。
实施例4
将得到的LPOR-Y193F突变体蛋白晶体放入SSRF BL17U收集衍射数据，其结果如表1所示。
表1 LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的衍射数据
Crystallographic data collection and refinement statistics
aIntensities estimated from amplitudes.
bTheoretical values of＜|L|＞，<L2＞for acentric re_ections are 0.5，0.333
respectively for untwinned datasets，and 0.375，0.2 for perfectlytwinned datasets.
其中，由表1可知，LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的衍射数据为
本发明通过公开了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 浙江善测禾骑士生物科技有限公司
<120> 一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtgatc agccacgccc aacggtcatt attacgggtg catcctctgg agtcggattg 60
tatgctacca aggccttagc caatcggggc tggcacgtta taatggcctg ccgcaatctt 120
gaaaaagcag agcaagccgc caaaaacttg cagattccgc cggaggccta cacgattttg 180
cacttggact tgtcctcctt ggccagtgtg cgcggctttg ttgaatcatt tcgggcattg 240
aatcgcccct tgcgtgccct tgtctgcaat gccgctgtct attatcccct gctcaaggaa 300
cctatctaca gtgtggatgg ctatgaaatc actgtggcca ccaaccattt ggggcatttt 360
cttttgatca acctgctgct agaagacttg aaaaattctc ccgaaagcga taagcgcttg 420
gtgattctcg gcacagtgac agccaaccgc aaagaactcg gcggtaaaat tcccattcct 480
gctccccctg atttgggcaa cctcgaaggc tttgaaaaag gcttcaagaa gccgattgcc 540
atgattaacg gtaagccctt caagtcgggc aaggccttca aagacagcaa gctctgcaat 600
atgctgacgg cacgggaact gcatcgccgc tttcacgaga gcaccggaat tgtttttaat 660
tccctttacc ccggttgtgt ggccgacaca cccctgtttc gccaccactt ccccctgttt 720
cagaaactct tccccctctt ccagaaaaag attactgggg gctatgtcag ccaagaactg 780
gcgggtgagc gcgtcgcgat ggtggtcgca gacccagagt ttcgccagtc gggggtccac 840
tggagctggg gtaatcgcca aaaagaaggc cgcaaagcct ttgtccaaga actatcggca 900
gaggcaagtg atgagcaaaa agcccgccgt ctttgggagc tgagtgaaaa actggtggga 960
ttggcctaa 969
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaaggcctt caaagacagc atgctcagca atatgctg 38
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctttggcg gccttgcccg acttgaaggg cttaccg 37

Claims (9)

1.一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得突变的LPOR-Y193F cDNA序列
设计LPOR cDNA Y193F突变引物，利用KOD Plus mutagenesis kit获得突变的LPOR-Y193F cDNA序列为SEQ ID NO 1；其中LPOR cDNA Y193F突变引物为
Y193FN 5’-GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG-3’；SEQ IDNO 2；
Y193FC 5’-GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG-3’；SEQ IDNO 3；
(2)表达载体构建
将得到的所述LPOR-Y193F cDNA克隆到原核表达载体pE-SUMO3中，得到pE-SUMO3-LPOR-Y193F；
(3)LPOR-Y193F突变体蛋白表达
将所述pE-SUMO3-LPOR-Y193F转入大肠杆菌BL21细胞中，并于25-37℃，培养3-5小时，直到OD600达到0.8，加入诱导剂于25-30℃，培养3-6小时，得到菌体悬液；
(4)LPOR-Y193F突变体蛋白分离
将步骤3得到的所述菌体悬液进行离心并弃上清液，将得到的菌体重悬于冰浴的溶液A中，得到悬浊液；将所述悬浊液进行均质后离心，得悬浊液上清液，并将所述悬浊液上清液经0.44um的滤膜过滤后，上样5-ml HiTrap FF原油柱，利用溶液B按咪唑浓度梯度洗脱；
(5)LPOR-Y193F突变体蛋白纯化
收集步骤(4)洗脱下来的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C进行透析；随后，蛋白上样5-ml Hitrap Q HP柱，洗脱溶液为0.05–0.5MNaCl梯度洗脱液；回收蛋白峰，过Superdex 75分子筛柱子，得到LPOR-Y193F突变体蛋白；
(6)LPOR-Y193F突变体蛋白结晶
将(5)得到的所述LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩至26-30mg/ml，随后浓缩蛋白在蛋白点晶池液中生长1周；挑取晶体在防冻保护液中浸泡5-10s，随即放入液氮管中保存，得到所述LPOR-Y193F突变体蛋白结晶。
2.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述诱导剂为0.3mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
3.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述溶液A由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和20mM咪唑组成，其pH为7.4。
4.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述悬浊液均质方法为利用高压均质机破碎，8000压力，破碎3次，每次3分钟。
5.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述溶液B由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和0.02–0.3M咪唑组成，其pH为7.4。
6.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述溶液C由20mM Tris-HCl和0.05MNaCl组成，其pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩方法为，利用浓缩缓冲液在30KD的蛋白浓缩管中进行浓缩；所述浓缩缓冲液包括20mM Tris-HCl和150mMNaCl。
8.根据权利要求7所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述蛋白点晶池液包括等体积的所述浓缩缓冲液和溶液D；所述溶液D由0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌和1.4M乙酸钠组成，其pH为6.5。
9.根据权利要求1所述的一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述防冻保护液由含有1.4M乙酸钠的0.1M二甲胂酸钠缓冲液，0.01M氯化锌，10mMNADPH和20％甘油组成，其pH为6.5。
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