CN103060280A

CN103060280A - 一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法

Info

Publication number: CN103060280A
Application number: CN 201310001456
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 杜瑶瑶; 刘玲玲; 王鉴; 陈剑清; 舒特俊
Original assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明涉及一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法，属于DNA重组技术和蛋白纯化技术领域。本发明通过引物设计，构建重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱重组目的蛋白；将得到的重组目的蛋白在经过superdex75分离，可以得到较纯的重组目的蛋白，再将该重组目的蛋白进行点晶条件的探索，液滴中可以看到不规则结构形成。本发明提供的方法，流程简单，对蛋白结晶的一种全新的探索方法，具有重要意义。

Description

一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和蛋白质技术领域，特别是涉及一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法。

背景技术

蛋白结晶技术的发展是本世纪的重要项目，不仅仅对研究蛋白尤其是膜蛋白的结构和功能有作用，还在病毒学中有着一定的应用。但是现有的蛋白结晶技术，不但要求蛋白具有活性而且必须具有很高的纯度，其蛋白的结晶条件也很难摸索。已有文献报道运用共结晶技术可以帮助某些蛋白的结晶，且MnSOD的结晶技术已经很成熟，故可利用MnSOD-Hemolin的共结晶对Hemolin结晶条件进行探索。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法。

为达到上述目的，本发明提供一种MnSOD-Hemolin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

为达到上述目的，本发明提供一种上述MnSOD-Hemolin融合蛋白的结晶方法，所述方法包括以下步骤：

1) Hemolin基因的获得；

2)重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin的构建；

3)重组蛋白的表达；

4)重组蛋白的初步纯化；

5)重组目的蛋白的进一步纯化；

6)重组目的蛋白的结晶。

优选地，其中所述结晶方法包括以下步骤：

1)通过设计引物，以家蚕蚕蛹cDNA为模板扩增，获得Hemolin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示;

2)将步骤1)所得Hemolin基因连接到pET-28a-MnSOD载体中，构建重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin；

3)将步骤2)所得重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin导入大肠杆菌BL21中，诱导表达获得大量重组蛋白；

4)将步骤3)所得重组蛋白与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑洗杂蛋白，200mM/L的咪唑洗脱重组目的蛋白；

5)将步骤4)所得重组目的蛋白浓缩后，利用superdex 75进一步分离纯化，得到较纯的重组目的蛋白;

6)收集步骤5)中的第一个峰的所有溶液，并浓缩，将浓缩好的蛋白用于点晶。

优选地，其中所述步骤1)中扩增方法为PCR扩增方法。

优选地，其中所述步骤3)中，将步骤2)所得重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin，将该重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin在在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5时，加终浓度为1mM 的IPTG，37℃诱导培养4h，获得大量重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤4)中，将步骤3)所得基因重组工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin扩大培养，之后于4℃下6000rpm离心30min，弃去培养基，沉淀即为菌体，然后超声破碎，于4℃下12000rpm离心30min，分为沉淀和上清，将含有目的蛋白的上清溶液过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

优选地，其中所述步骤4)中，将步骤3)所得重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

优选地，其中所述步骤5)中，将步骤4)所得目的蛋白经过50kD的超滤管浓缩，利用Superdex 75进一步分离纯化，得到较纯的目的蛋白。

优选地，其中所述步骤6)中点晶具体包括：

(1)对24孔晶体培养板上的小孔进行编号，每一个编号小孔对应一个的蛋白结晶试剂盒筛选的条件，每个小孔中依次加入200 μL不同试剂盒中不同条件的结晶缓冲液，参考MnSOD-Hemolin的蛋白性质预测信息，共使用了500个蛋白结晶的条件；

(2)用结晶专用移液器吸取1 μL纯化后的目的蛋白样品，然后滴在硅化盖玻片上，每个盖玻片上点3个不同浓度的目的蛋白样品；同时要在每个点好的目的蛋白样品中滴入1 μL的结晶缓冲液，将其混匀；

(3)将上述滴有目的蛋白样品和结晶缓冲液的盖玻片翻转垂直盖于24晶体孔培养板的相应小孔上；等加完所用的目的蛋白样品和结晶缓冲液后，盖上24孔板的板盖；并将上述蛋白晶体培养板放于16℃的晶体培养室中培养。

本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的结晶方法流程简单，且获得的晶体分辨率高，为研究未知蛋白或者结晶比较困难的蛋白的三维结构和功能提供重要的条件。

附图说明

图1是本发明Hemolin基因的PCR扩增回收结果图；M：DNA Ladder Mix；1： PCR扩增条带；

图2 是本发明重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin的PCR扩增及双酶切图；M：DNA Ladder Mix；1：Hemolin基因片段的PCR扩增；2、经BamHⅠ、Xho I双酶切；

图3是本发明融合蛋白 MnSOD-Hemolin的表达图； M：低分子质量蛋白标准；1：未诱导的MnSOD-Hemolin；2：诱导的MnSOD-Hemolin；

图4是本发明融合蛋白MnSOD-Hemolin的初步纯化图。M：低分子量标准蛋白；1：离心后的上清溶液；2：未与Ni²⁺-NTA柱结合的蛋白；4-9：分别用30 mM/L、50 mM/L、100 mM/L、150 mM/L、200 mM/L、500 mM/L咪唑溶液洗脱；

图5是本发明的MnSOD-Hemolin融合蛋白用Superdex 75色谱纯化的曲线图；

图6A是本发明的MnSOD-Hemolin融合蛋白用Superdex 75色谱纯化的出峰后第一个峰的蛋白样品鉴定图；M：低分子量标准蛋白；1：Ni²⁺-NTA柱纯化后的蛋白；数字：对应Superdex 75色谱收集峰号；

图6B是本发明的MnSOD-Hemolin融合蛋白用Superdex 75色谱纯化的出峰后第二个峰的蛋白样品鉴定图；M：低分子量标准蛋白；1：Ni²⁺-NTA柱纯化后的蛋白；数字：对应Superdex 75色谱收集峰号；

图7A是本发明5mg/mL的蛋白在PEG/Ion 2 Screen HR2-098的46号条件下晶体初探的晶体电镜图；

图7B是本发明3mg/mL的蛋白在Index HR2-144的72号条件下晶体初探的晶体电镜图；

图7C是本发明5mg/mL的蛋白在Index HR2-144的72号条件下晶体初探的晶体电镜图。

具体实施方式

应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：Hemolin目的基因的获得

扩增Hemolin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物设计如下：

F: 5’-ATCGGATCCATGCAGCCCGTTAATTCCGG-3’ (下划线为 BamHⅠ位点)

R: 5’-CTGCTCGAGTTAAGCGACTTGAAG-3’ (下划线为XhoⅠ位点)

实施例2：重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin的构建

(1)以家蚕蚕蛹cDNA(浙江中奇生物药业股份有限公司)为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，循环30次；最后72℃延伸4min。

在50μL离心管中，加入下列组分：

ddH₂O 25μL

2mM dNTPs 7.5μL

TAQ Buffer 5μL

cDNA 5μL

F 2.5μL

R 2.5μL

TAQ Polymerase(2U/μL) 2.5μL

50μL

各组分混合均匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时割胶回收目的片段。

(2)以步骤(1)中回收产物为模板，F和R第2次扩增目的片段，具体程序同上。最后回收的片段(如图1)。

(3)将第2次PCR割胶回收产物和载体pET-28a-MnSOD(张小蓓，杨波，王小飞等. MnSOD融合表达家蚕核型多角体病毒P10蛋白并进行共结晶条件初筛[OL]. [2012-11-26]. 中国科技论文在线，http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201211-468) ，用BanHⅠ( Fermentas公司)和XhoⅠ( Fermentas公司)同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high( Fermentas公司)进行室温连接30min，并转化到E.coli TG1感受态细胞(购自Invitrogen公司)中。挑取单菌落摇菌培养后抽提质粒，重组好的质粒用PCR和双酶切进行鉴定(见图2)，将鉴定好的阳性克隆送华大基因测序，其结果与预期相同，说明克隆成功。

实施例3：重组蛋白的表达

将实施例2鉴定成功的重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen公司)中，获得重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin，将该重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37℃，220 rpm振荡培养至OD600≈0.5时，加入IPTG(购自Promega公司，终浓度 0.1 mM)，37℃诱导培养4h，获得大量重组蛋白。然后取1.5mL菌液于12000rpm离心后，将沉淀加入50μL1×PBS重悬，然后取40μL，加入10μL 5×上样缓冲液100℃煮沸10 min, 12000rpm离心5 min ，上清用12%SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示，在72 kDa处，2号泳道的蛋白比1号泳道明显浓度多，表明目的蛋白MnSOD-Hemolin已诱导表达。

实施例4：重组蛋白的初步纯化

将实施例3所得基因重组工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin扩大培养，即，将菌种与培养基按照1:100的体积比进行摇菌培养，培养10瓶，每瓶300mL的菌体，之后于4℃下6000rpm离心30min，弃去培养基，沉淀即为菌体，然后超声破碎，于4℃下12000rpm离心30min，分为沉淀和上清，将含有目的蛋白的上清溶液或实施例3所得重组蛋白过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用不同浓度的咪唑溶液进行洗涤，分别取不同浓度的咪唑洗脱液(30 mM/L、50 mM/L、100 mM/L、150 mM/L、200 mM/L、500 mM/L的咪唑溶液)制备蛋白样品(分别取洗脱液40μL，5*的Loading Buffer 10μL，混合后，100℃金属浴上煮10 min)，走12%SDS-PAGE。结果如图4所示，在第8泳道时，目的蛋白浓度较高，杂蛋白浓度较低，所以经上述不同浓度咪唑溶液洗涤摸索后，可以用20mM/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用200mM/L的咪唑溶液洗脱重组目的蛋白。

实施例5：重组目的蛋白的进一步纯化

将实施例4纯化后的重组目的蛋白经过50kD的超滤管浓缩，利用Superdex 75分离。主要步骤为：将凝胶过滤层析柱 Superdex 75(柱体积为120 mL)接入AKTA explorer 10。平衡：用Tris·HCl溶液平衡凝胶过滤层析柱，流速为1.5 mL/min，约平衡1.5个柱体积(180 mL)，至UV 280 nm监测曲线为水平。上样：在上样环中注入2 mL的DEAE离子交换层析分离后的浓缩样品。洗脱：用Tris·HCl溶液洗脱，流速为1.5 mL/min。收集：用2 mL EP管收集洗脱下的蛋白峰，1.5 mL/管。Superdex 200洗脱后的峰如图5所示，选取主要的峰用SDS-PAGE 检测(图6A、图6B)，结果显示第一个峰主要是重组目的蛋白，且比较纯，可以看出Superdex 75分离纯化的效果较好。

实施例6：融合蛋白的点晶

将实施例5中纯化后的第一个峰浓缩后，利用BCA定量法定量后蛋白浓度为5 mg/mL，用于点晶。

(1)对24孔晶体培养板上的小孔进行编号，每一个编号小孔对应一个的蛋白结晶试剂盒(Molecular Dimension 公司)筛选的条件，每个小孔中依次加入200 μL不同试剂盒中不同条件的结晶缓冲液，参考MnSOD的结晶条件以及MnSOD-Hemolin的预测所得到的蛋白性质共使用了500个蛋白结晶的条件（本实验室所具有的全部点晶试剂盒）；

(2)用结晶专用移液器吸取1 μL纯化后的蛋白样品，然后滴在硅化盖玻片上，每个盖玻片上点3个不同浓度的蛋白样品；同时要在每个点好的蛋白样品中滴入1 μL的结晶缓冲液，将其混匀；

(3)将上述滴有蛋白样品和结晶缓冲液的盖玻片翻转垂直盖于24晶体孔培养板的相应小孔上；等加完所用的蛋白样品和结晶缓冲液后，盖上24孔板的板盖；并将上述蛋白晶体培养板放于16℃的晶体培养室中培养。为了探索MnSOD蛋白晶体生长的状况，我们一天早晚各观察晶体生长1次(每次都利用显微镜)，并记录晶体的生长情况，晶体的生长结果如图7A、图7B、图7C所示，可以在从图中看出规则且不同的蛋白晶体。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津耀宇生物技术有限公司

<120> 一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法

<130> 122436-I-CP-TJYU

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> Hemolin 基因

<400> 1

atgaattcct ggacgttatt agttttggga acatgtgtta tttacactac ggggcagccc 60

gttaattccg gagacaaggt tcccgttctc aaggaggcac cggccgaggt attgttcaga 120

gagggacagg ccacgaggct ggagtgcgcc acagagggag acgacagtgg tgtcgaatac 180

tcgtggcgaa aagacggcat gcattttagc gtcggtctag acacgctcac cactatcgac 240

gctggctctc ttgtgttcag ccaaaccaaa gcttcggacg aaggcgagta ccagtgcttc 300

gccaaaagcg actttggggt cgccagcaca agggctacta agctccgccg tacgtacata 360

gagactcctg catttgagga gaaaaaagtg acggtggtcg aaggaaaacc ctttgaactc 420

cgctgtccag tgcccggggg ctacccgaag ccgaccataa gctggatgag acatcatgac 480

gaggacggct ccactgagaa cttcatggac agaagagcga cttattcacc cgagggaacc 540

ctgtactttt ccaatgcgag tcttgacgat gccaacgata aaaccaagct ggtctgcatg 600

gcctcttctc ctgccgccga cgagggtgtg cccatagtca cgtattacat cacgcaagtg 660

actcccgcct cggagcccac gtatggagag ctgatccctc agtacttgag tgaccacgtg 720

gtggcgaaag ttggcgatct gacgtatcta tactgcattt atggcggaac tcccctagcc 780

cacccaagct ggtccaagga cggtgtaaac gtggacaaca cctacaagga tcgcataacc 840

cgccacaaca ggtcctctgg gaggagactg gtcatcaagg aggtttgggc agaggacgcg 900

ggcacttaca cgtgcgatgt agataatcag gccggcagaa gactgcaaca cacaatcacc 960

tttagtgttg tcagtgcacc aaccttcacg actaaaccag agaaacgaac gctggcaacc 1020

caaggcgagg acgtcacaat accttgtaag gcgacaggaa ttccgtcacc tctagtttcg 1080

tggacttaca atggcgaacc cgtgaccgaa ggggtcactg gtgacggact ggtgatcaag 1140

gctgtcaata aatctaatca aggctactac gggtgtactg cctcgaatga gcacggcgca 1200

gaatacgccg aaacggctct tcaagtcgct taa 1233

<210> 2

<211> 596

<212> PRT

<213> MnSOD-Hemolin融合蛋白

<400> 2

Met Pro Phe Glu Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala Leu Glu

1 5 10 15

Pro His Ile Asp Lys Glu Thr Met Asn Ile His His Thr Lys His His

20 25 30

Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Gly His Pro Asp

35 40 45

Leu Gln Asn Lys Ser Leu Glu Glu Leu Leu Ser Asn Leu Glu Ala Leu

50 55 60

Pro Glu Ser Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly His Ala

65 70 75 80

Asn His Ser Leu Phe Trp Thr Ile Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu

85 90 95

Pro Thr Gly Glu Leu Ala Glu Ala Ile Asn Lys Lys Phe Gly Ser Phe

100 105 110

Thr Ala Phe Lys Asp Glu Phe Ser Lys Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly

115 120 125

Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Val Asn Asn Gly Glu Leu Glu Ile Thr

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Gln Asp Ser Pro Ile Met Glu Gly Lys Thr Pro Ile

145 150 155 160

Leu Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys Tyr Gln Asn

165 170 175

Arg Arg Pro Glu Tyr Ile Ala Ala Phe Trp Asn Ile Val Asn Trp Asp

180 185 190

Glu Val Ala Lys Arg Tyr Ser Glu Ala Lys Ala Lys Gln Pro Val Asn

195 200 205

Ser Gly Asp Lys Val Pro Val Leu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Val Leu

210 215 220

Phe Arg Glu Gly Gln Ala Thr Arg Leu Glu Cys Ala Thr Glu Gly Asp

225 230 235 240

Asp Ser Gly Val Glu Tyr Ser Trp Arg Lys Asp Gly Met His Phe Ser

245 250 255

Val Gly Leu Asp Thr Leu Thr Thr Ile Asp Ala Gly Ser Leu Val Phe

260 265 270

Ser Gln Thr Lys Ala Ser Asp Glu Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Lys

275 280 285

Ser Asp Phe Gly Val Ala Ser Thr Arg Ala Thr Lys Leu Arg Arg Thr

290 295 300

Tyr Ile Glu Thr Pro Ala Phe Glu Glu Lys Lys Val Thr Val Val Glu

305 310 315 320

Gly Lys Pro Phe Glu Leu Arg Cys Pro Val Pro Gly Gly Tyr Pro Lys

325 330 335

Pro Thr Ile Ser Trp Met Arg His His Asp Glu Asp Gly Ser Thr Glu

340 345 350

Asn Phe Met Asp Arg Arg Ala Thr Tyr Ser Pro Glu Gly Thr Leu Tyr

355 360 365

Phe Ser Asn Ala Ser Leu Asp Asp Ala Asn Asp Lys Thr Lys Leu Val

370 375 380

Cys Met Ala Ser Ser Pro Ala Ala Asp Glu Gly Val Pro Ile Val Thr

385 390 395 400

Tyr Tyr Ile Thr Gln Val Thr Pro Ala Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Glu

405 410 415

Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Ser Asp His Val Val Ala Lys Val Gly Asp

420 425 430

Leu Thr Tyr Leu Tyr Cys Ile Tyr Gly Gly Thr Pro Leu Ala His Pro

435 440 445

Ser Trp Ser Lys Asp Gly Val Asn Val Asp Asn Thr Tyr Lys Asp Arg

450 455 460

Ile Thr Arg His Asn Arg Ser Ser Gly Arg Arg Leu Val Ile Lys Glu

465 470 475 480

Val Trp Ala Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Asp Val Asp Asn Gln

485 490 495

Ala Gly Arg Arg Leu Gln His Thr Ile Thr Phe Ser Val Val Ser Ala

500 505 510

Pro Thr Phe Thr Thr Lys Pro Glu Lys Arg Thr Leu Ala Thr Gln Gly

515 520 525

Glu Asp Val Thr Ile Pro Cys Lys Ala Thr Gly Ile Pro Ser Pro Leu

530 535 540

Val Ser Trp Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Val Thr Glu Gly Val Thr Gly

545 550 555 560

Asp Gly Leu Val Ile Lys Ala Val Asn Lys Ser Asn Gln Gly Tyr Tyr

565 570 575

Gly Cys Thr Ala Ser Asn Glu His Gly Ala Glu Tyr Ala Glu Thr Ala

580 585 590

Leu Gln Val Ala

595

Claims

1.一种MnSOD-Hemolin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种权利要求1所述MnSOD-Hemolin融合蛋白的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) Hemolin基因的获得；

2)重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin的构建；

3)重组蛋白的表达；

4)重组蛋白的初步纯化；

5)重组目的蛋白的进一步纯化；

6)重组目的蛋白的结晶。

3.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

4.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤1)中扩增方法为PCR扩增方法。

5.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)所得重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin，将该重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5时，加终浓度为1mM 的IPTG，37℃诱导培养4h，获得大量重组目的蛋白。

6.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤4)中，将步骤3)所得基因重组工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin扩大培养，之后于4℃下6000rpm离心30min，弃去培养基，沉淀即为菌体，然后超声破碎，于4℃下12000rpm离心30min，分为沉淀和上清，将含有目的蛋白的上清溶液过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

7.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤4)中，将步骤3)所得重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

8.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤5)中，将步骤4)所得目的蛋白经过50kD的超滤管浓缩，利用Superdex 75进一步分离纯化，得到较纯的目的蛋白。

9.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤6)中点晶具体包括：