JP5679219B2 - 開花誘導剤 - Google Patents
開花誘導剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5679219B2 JP5679219B2 JP2011540549A JP2011540549A JP5679219B2 JP 5679219 B2 JP5679219 B2 JP 5679219B2 JP 2011540549 A JP2011540549 A JP 2011540549A JP 2011540549 A JP2011540549 A JP 2011540549A JP 5679219 B2 JP5679219 B2 JP 5679219B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- flowering
- protein
- seq
- amino acid
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 title claims description 209
- 239000000411 inducer Substances 0.000 title claims description 82
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 276
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 200
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 93
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 83
- 241000555678 Citrus unshiu Species 0.000 claims description 41
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 38
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims description 36
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims description 34
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 31
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 64
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 8
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 108010023832 Florigen Proteins 0.000 description 6
- 244000202052 Poncirus trifoliata Species 0.000 description 6
- 235000000404 Poncirus trifoliata Nutrition 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 244000175448 Citrus madurensis Species 0.000 description 5
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 101150054603 ft gene Proteins 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000017317 Fortunella Nutrition 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- -1 t-butyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 235000001759 Citrus maxima Nutrition 0.000 description 3
- 244000276331 Citrus maxima Species 0.000 description 3
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 3
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 2
- 108700000205 Arabidopsis FT Proteins 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 2
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008384 Capsicum annuum var. annuum Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007871 Chrysanthemum coronarium Nutrition 0.000 description 1
- 244000067456 Chrysanthemum coronarium Species 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000183685 Citrus aurantium Species 0.000 description 1
- 235000007716 Citrus aurantium Nutrition 0.000 description 1
- 241000951471 Citrus junos Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 240000004307 Citrus medica Species 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 244000295848 Citrus x nobilis Species 0.000 description 1
- 235000017102 Citrus x nobilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009008 Eriobotrya japonica Nutrition 0.000 description 1
- 244000061508 Eriobotrya japonica Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WWUVLNPEWUTCEI-KRWDZBQOSA-N Flowerone Chemical compound C1=C(O)C(CC=C(C)C)=CC([C@H]2OC3=C(O)C(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 WWUVLNPEWUTCEI-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 235000017316 Fortunella japonica Nutrition 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241001236294 Hebe Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000237509 Patinopecten sp. Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000011158 Prunus mume Nutrition 0.000 description 1
- 244000018795 Prunus mume Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M Stearyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 229910052570 clay Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- YVBUWVMMORNHHZ-UHFFFAOYSA-N flowerone Natural products CC(=C)CCc1cc(ccc1O)C1CC(=O)c2c(O)cc(O)c(O)c2O1 YVBUWVMMORNHHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003501 hydroponics Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 235000020637 scallop Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
- A01N65/36—Rutaceae [Rue family], e.g. lime, orange, lemon, corktree or pricklyash
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Forests & Forestry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
本発明は、開花誘導剤などに関する。
カンキツなどの果樹は、発芽後一定の年数を経過しないと花を着けない。花などの生殖器官に対し、葉や茎のことを栄養器官というが、花を着けない期間に、果樹は、栄養器官のみを茂らせる栄養成長を続ける。この栄養成長を続ける期間のことを幼若期という。カンキツ交雑実生では、幼若期は8〜12年に及ぶ。幼若期の後に、成熟期に入る。この成熟期間では、果樹は、生殖生長（栄養生長に対する言葉で、開花・結実など生殖に関係する生育過程を生殖生長という。）を行い、開花がおこる。
果樹栽培では、しばしば接木を行う。接ぎ木を行う理由の一つは、果樹は幼若期が長いという問題を克服するためである(非特許文献１：Nobuhito Mitani, Ryoji Matsumoto, Terutaka Yoshioka, and Takeshi Kuniga (2008) “Citrus hybrid seedlings reduce initial time to flower when grafted onto shiikuwasha rootstock” Scientia Horticulturae 116, 452-455.)。カンキツの１つであるウンシュウミカンの場合、カラタチの台木に、成熟期のウンシュウミカンの穂木を、接木することがしばしば行われる。この場合、穂木は、成熟期にある。したがって、穂木は、本来、花芽形成能をもつ。しかしながら、穂木は、接木後しばらくは栄養生長のみを行い、花芽形成がおこらない。この穂木の部分（接ぎ木苗の部分）の栄養生長期間を、栄養的成熟期という。栄養的成熟期は４年程度続くことが一般的である。しかし、栽培経費の削減、投入した経費の早期回収及び品種改良の効率化の観点から、栄養的成熟期を短くする方法の開発が求められていた。
ここで、開花に関連する遺伝子として、「開花遺伝子座Ｔ（Flowering Locus T）」の遺伝子（以下、「FT遺伝子」という）が知られている。このFT遺伝子がコードしているタンパク質を、FTタンパク質と呼ぶ。図１のように、FTタンパク質は、日長などの環境の変化に応じて葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導することが既にわかっている（非特許文献２：Laurent Corbesier, Coral Vincent, Seonghoe Jang, Fabio Fornara, Qingzhi Fan, Iain Searle, Antonis Giakountis, Sara Farrona, Lionel Gissot, Colin Turnbull, and George Coupland (2007) “FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis” Science 316, 1030 - 1033.）。このように、葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導する物質のことを花成ホルモンというが、FTタンパク質はこの花成ホルモンの本体であると考えられている。
シロイヌナズナのFT遺伝子を用いて、シロイヌナズナの開花の時期を早める研究が進んでいる。例えば、特許文献１（特表2002-511270号公報）に記載の方法では、FTタンパク質を植物体で高発現させるために、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの後ろにFT遺伝子をつないだものを含むDNA断片をシロイヌナズナに導入し、遺伝子組換えシロイヌナズナを作っている。結果として、開花の時期が早まった遺伝子組換えシロイヌナズナが得られている。
同様の研究は、カンキツでも行われている（非特許文献３：Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) “Ectopic expression of an FThomolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)”Transgenic Research 14, 703-712.）。この研究ではシロイヌナズナのFT遺伝子と高い相同性があるウンシュウミカン（Citrus unshiu Marc.）由来のCiFT遺伝子を用いている。この方法では、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの後ろにCiFT遺伝子をつないだものを含むDNA断片をカラタチ（Poncirus trifoliata）に導入し、遺伝子組換えカラタチを作っている。結果として、カラタチの開花の時期が早まっている。より詳細には、上胚軸が現れてから、最小半年程度で開花が見られている。
これら従来技術は、いずれも遺伝子組換え植物を用いて、FTタンパク質（上記のCiFTタンパク質のような、シロイヌナズナのFTタンパク質と高い相同性を有するタンパク質も、本明細書では、単に「FTタンパク質」という場合がある。）を植物体で高発現させている。しかし、遺伝子組換え植物を用いる方法には、いくつかの留意事項がある。
一つは、この開花が早い植物が遺伝子組換え植物であるという点である。遺伝子組換え植物には法的な制約が多いので、圃場で遺伝子組換え植物を栽培できるようになるまでには、時間を要する。また、遺伝子組換え植物に対する消費者の理解が進んでいないという現状がある。
もう一つは、きわめて若い植物で、花芽が形成される場合があることである（非特許文献３：Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) “Ectopic expression of an FT homolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)” Transgenic Research 14, 703-712.）。果実ができると、葉の生育、ひいては植物体の生育が阻害を受ける。そのため、早すぎる花芽形成は、若い植物体にとって大きな負担となるため、植物の生育にとっても果実の生産にとっても望ましいものではない場合がある。
Nobuhito Mitani, Ryoji Matsumoto, Terutaka Yoshioka, and Takeshi Kuniga (2008) "Citrus hybrid seedlings reduce initial time to flower when grafted onto shiikuwasha rootstock" Scientia Horticulturae 116, 452-455.
Laurent Corbesier, Coral Vincent, Seonghoe Jang, Fabio Fornara, Qingzhi Fan, Iain Searle, Antonis Giakountis, Sara Farrona, Lionel Gissot, Colin Turnbull, and George Coupland (2007) "FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis" Science 316, 1030 - 1033.
Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) "Ectopic expression of an FThomolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)"Transgenic Research 14, 703-712.
上記状況において、遺伝子組換えによらずに開花を誘導できる技術、すなわち、植物体外から植物体内に投与することができる開花誘導剤などが求められていた。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、所定のFTタンパク質を植物体外から植物体内に投与することで、遺伝子組換え植物の作出を行わないで、投与した植物体、および、投与した植物体に隣接する植物体の開花時期を早めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、開花誘導剤、開花誘導方法などを提供する。
[１] 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[２] 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１]記載の開花誘導剤。
[３] 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[４] 前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[３]記載の開花誘導剤。
[５] 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、上記[１]記載の開花誘導剤。
[６] 配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、上記[３]記載の開花誘導剤。
[７] 果樹の開花誘導に用いられる、上記[１]〜[６]のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
[８] 果樹がカンキツである、上記[７]記載の開花誘導剤。
[９] カンキツがウンシュウミカンである、上記[８]記載の開花誘導剤。
[１０] 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[１１] 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１０]記載の方法。
[１２] 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[１３] 前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[１２]記載の方法。
[１４] 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１０]記載の方法。
[１５] 配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１２]記載の方法。
[１６] 前記タンパク質が、果樹の開花誘導に用いられる、上記[１０]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法。
[１７] 果樹がカンキツである、上記[１６]記載の方法。
[１８] カンキツがウンシュウミカンである、上記[１７]記載の方法。
[１９] 植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、上記[１０]〜[１８]のいずれか１項に記載の方法。
[２０] 前記タンパク質を投与した植物を、開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、上記[１０]〜[１９]のいずれか１項に記載の方法。
[１] 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[２] 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１]記載の開花誘導剤。
[３] 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[４] 前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[３]記載の開花誘導剤。
[５] 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、上記[１]記載の開花誘導剤。
[６] 配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、上記[３]記載の開花誘導剤。
[７] 果樹の開花誘導に用いられる、上記[１]〜[６]のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
[８] 果樹がカンキツである、上記[７]記載の開花誘導剤。
[９] カンキツがウンシュウミカンである、上記[８]記載の開花誘導剤。
[１０] 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[１１] 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１０]記載の方法。
[１２] 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[１３] 前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[１２]記載の方法。
[１４] 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１０]記載の方法。
[１５] 配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１２]記載の方法。
[１６] 前記タンパク質が、果樹の開花誘導に用いられる、上記[１０]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法。
[１７] 果樹がカンキツである、上記[１６]記載の方法。
[１８] カンキツがウンシュウミカンである、上記[１７]記載の方法。
[１９] 植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、上記[１０]〜[１８]のいずれか１項に記載の方法。
[２０] 前記タンパク質を投与した植物を、開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、上記[１０]〜[１９]のいずれか１項に記載の方法。
本発明は、植物体外から植物体内に投与することができる開花誘導剤を提供する。本発明の好ましい態様の開花誘導剤は、果樹の外から果樹内に投与することで開花までの期間を短くすることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009-260847号(2009年11月16日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009-260847号(2009年11月16日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
（１）本発明の概要
本発明は、FTタンパク質（以下、本発明のタンパク質と呼ぶ場合がある。）を有効成分として含有する開花誘導剤である。本発明の開花誘導剤は、植物体外から植物体内に投与することができる。これまでのところ、植物体外から植物体内にFTタンパク質を投与することで、植物体の開花時期を早めることができたという報告はない。
本発明は、FTタンパク質（以下、本発明のタンパク質と呼ぶ場合がある。）を有効成分として含有する開花誘導剤である。本発明の開花誘導剤は、植物体外から植物体内に投与することができる。これまでのところ、植物体外から植物体内にFTタンパク質を投与することで、植物体の開花時期を早めることができたという報告はない。
本発明者らは、ウンシュウミカンの葉から抽出したRNAを鋳型として、シロイヌナズナのFT遺伝子と高い相同性を有するCiFT2遺伝子のcDNAを単離した。CiFT2遺伝子のcDNAをプラスミドpET-28b(+)へクローニングし、CiFT2遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し形質転換体を得た。得られた形質転換体を用いてCiFT2タンパク質を生産した。
生産したCiFT2タンパク質を、一年生苗木に投与した。この一年生苗木は、カラタチを台木とし、これにウンシュウミカンを穂木として接木し、12ヵ月経過したものである。この一年生苗木の接ぎ木部上部の主幹にCiFT2タンパク質を投与した。その結果、CiFT2タンパク質投与群では、投与から5〜13ヵ月後の4月〜5月にかけて、有葉花の着花が多く見られた。また、CiFT2タンパク質投与群の隣に配置したCiFT2タンパク質未投与群においても、有葉花の着花が多く見られた。有葉花は、葉を伴った花であり、花だけの花芽である直花と比較して、結実率が高く、また、そこから生じる果実も品質の良いことが多い。
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を含むものである。配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
本発明のタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を含むものである。配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明のタンパク質は、前記のものに限定されることはなく、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質であって、かつ開花誘導活性を有するタンパク質を含むものである。
ここで、「開花誘導活性」とは、植物の開花の時期を通常の開花時期よりも早める活性、植物の開花を促進する活性などを意味する。
また、本発明のタンパク質には、配列番号２記載のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質も含まれる。
上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性は、BLAST（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
配列番号２記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸に欠失、置換および／または付加の変異が生じたアミノ酸配列としては、例えば（i）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２記載のアミノ酸配列の１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iv）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
さらに、後述の本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
本発明のタンパク質はさらに精製のためのペプチド配列および／または分泌シグナルペプチドを含んでいてもよい。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、Ｔ７タグ配列、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列またはプロテインＡのアミノ酸配列などがあげられる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質を、細胞膜透過させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、報告されている（例えばvon Heijine G (1988) Biochim. Biohys. Acra 947: 307-333、von Heijine G (1990) J. Membr. Biol. 115: 195-201など参照）。分泌シグナルペプチドとしては、より具体的には、例えば、大腸菌の外膜タンパク質A由来の分泌シグナルペプチド（ompA）（Ghrayeb, J. et al. (1984) EMBO J. 3:2437-2442）、コレラ菌由来コレラトキシン由来の分泌シグナルペプチドなどがあげられる。
本発明のタンパク質はさらに切断のためのペプチド配列を含んでいてもよい。切断のためのペプチド配列は、目的タンパク質から、精製のためのペプチド配列および／または分泌シグナルペプチドを切り離すための配列であり、例えば、トロンビン認識配列などが挙げられる。
本発明の一つの態様のタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。このタンパク質は、配列番号２記載のアミノ酸配列の後方に、トロンビン認識部位、T7タグおよびヒスチジンタグが順に融合されたタンパク質である。
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はない。本発明のタンパク質としては、化学合成により合成したポリペプチドでもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。本発明のタンパク質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明のタンパク質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を作製することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現系での発現などについては、後記する。
（３）本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のタンパク質は前述のとおりである。本発明の遺伝子は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のタンパク質は前述のとおりである。本発明の遺伝子は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、開花誘導活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、塩基配列の同一性は、BLAST（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
また、本発明の遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号１記載の塩基配列において、１個または数個の塩基に欠失、置換および／または付加の変異が生じた塩基配列であって、開花誘導活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明の遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子などは本発明の遺伝子に含まれる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、６×SSC（１×SSCは塩化ナトリウム8.76g 、クエン酸ナトリウム4.41g を１リットルの水に溶かしたもの）、１％ SDS、100μg／mlサケ精子DNA、0.1％ ウシ血清アルブミン、0.1％ ポリビニルピロリドン、0.1％ フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件をあげることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）等を参照することができる。
以下に、ハイブリダイゼーションにより本発明の遺伝子を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。
まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してDNAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNAを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含有していればよく、たとえば配列番号１記載の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチドまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用することができる。
まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してDNAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNAを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含有していればよく、たとえば配列番号１記載の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチドまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用することができる。
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。
こうして得られたクローンの中には、目的の開花誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が保持されている。そして、クローンから目的の遺伝子を得るには、アルカリ-SDS法などの公知のポリヌクレオチド抽出方法を使用する。
また、配列番号１記載の塩基配列において１個または数個の塩基に欠失、置換および／または付加の変異が生じた塩基配列としては、例えば（i）配列番号１記載の塩基配列において、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号１記載の塩基配列の１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号１記載の塩基配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）配列番号１記載の塩基配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が挿入された塩基配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。
このように種々のDNAが本発明の遺伝子の範囲内に含まれるのは、以下の理由によるものである。即ち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在することができる。
遺伝子は自然界において必ずしも安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。したがって、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、開花誘導活性を示すタンパク質をコードするDNAである限り、本発明の遺伝子に含まれるものである。
また、遺伝子に変異を導入することによって、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換および／または付加の変異を導入することもできる。アミノ酸配列と遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
本発明において、DNAの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主が大腸菌（エシェリヒア・コリ）であれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法等により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、T.ManiatisらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual等に記載されている。また、市販のシークエンサー（Applied Biosystems 3130 ジェネェテェックアナライザ（ライフテクノロジーズ社製）、ABI PRISM 3100 DNAアナライザ（ライフテクノロジーズ社製）など）により、配列を自動決定することもできる。
得られた遺伝子が目的のタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
本発明の遺伝子は、精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）および／または分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含んでいてもよい。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどがあげられる。分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、当記述分野において知られている分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。分泌シグナルペプチドとしては、前記したものなどがあげられる。
本発明の遺伝子はさらに切断のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含んでいてもよい。切断のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている切断のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。切断のためのペプチド配列としては、前記したものなどがあげられる。
本発明の一つの態様の遺伝子に含まれるDNAの塩基配列を、配列番号３に示す。このDNAは、配列番号１記載の塩基配列からなるDNAの後方に、トロンビン認識部位をコードするDNA、Ｔ７タグをコードするDNAおよびヒスチジンタグをコードするDNAが順に融合されたDNAである。
（４）本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質を製造するには、まず本発明のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中より開花誘導活性を有するタンパク質を採取することにより本発明のタンパク質を製造することができる。
本発明のタンパク質を製造するには、まず本発明のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中より開花誘導活性を有するタンパク質を採取することにより本発明のタンパク質を製造することができる。
本発明の遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。
本発明の組換えベクターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該タンパク質をコードする遺伝子を挿入すればよい。なお、ターミネーターを必ずしも必要としない場合がある。
本明細書において、プロモーターは、例えば、trcプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
本明細書において、ターミネーターは、例えば、trpオペロンターミネータ、T7ターミネーターをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法、相同組換えを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、pET-28 b (+)（Merck社）、pTrc99A（GEヘルスケアバイオサイエンス）、pACYC184（ニッポンジーン）、pMW118（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のタンパク質を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、ロドコッカス菌（Rhodococcus）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれらの野生株由来の派生株である、JM109株、XL1-Blue株（例えば、XL1-Blue MRF’）、K802株、C600株、Origami B(DE3)株などを挙げることができる。
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
本発明の形質転換体を培養して、培養物から開花誘導活性を有するタンパク質を採取することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることもできる。
本発明のタンパク質は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいはゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を単独または適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる（例えば、SDS-PAGE）。
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された本発明のタンパク質が不溶物［封入体（inclusion body）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらにクロマトグラフィー操作などを行って目的とする開花誘導活性を有するタンパク質を精製することができる。
また、上記で得られた遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行えば、得られた遺伝子（例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子）と配列は少し異なるが、同様な開花誘導活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ、これも本発明の範囲内のものである。
得られた遺伝子が目的のタンパク質をコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子の塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用いたPCRによって不足する領域を増幅したり、あるいは得られた遺伝子の断片をプローブとしてDNAライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード領域を得ることができる。
こうして得られた本発明の遺伝子を含有する形質転換体を作製して該遺伝子によりコードされる本発明のタンパク質を発現させ、さらに発現させたタンパク質を精製することができる。形質転換体の作製、タンパク質の発現および精製はいずれも上記と同様の方法で行うことができる。こうして得られたタンパク質も本発明に含まれる。
また、本発明においては、本発明の遺伝子または本発明のベクターから、本発明のタンパク質を製造することも可能である。すなわち、本発明においては、いわゆる無細胞タンパク質合成系を採用して、本発明のタンパク質を産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる本発明のタンパク質は、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、濃縮、精製することができる。
（５）本発明の開花誘導剤および開花誘導剤方法
本発明の開花誘導剤は、本発明のタンパク質を有効成分として含むものであり、当該開花誘導剤を植物体に投与することにより、植物体の開花を誘導することができる。また、上記開花誘導剤を製造するため、本発明のタンパク質を使用することができる。
本発明の開花誘導剤は、本発明のタンパク質を有効成分として含むものであり、当該開花誘導剤を植物体に投与することにより、植物体の開花を誘導することができる。また、上記開花誘導剤を製造するため、本発明のタンパク質を使用することができる。
本発明の開花誘導剤の投与対象の植物は、花を着ける植物であれば特に限定されず、果樹、マツ・スギ・ヒノキ等の樹木、ツツジ・ツバキ・サザンカ等の花木（観賞樹木）、ニンジン・キュウリ・ダイコン・カボチャ・ナス・トマト・キャベツ・ジャガイモ・ハクサイ・シュンギク・コマツナ・ピーマン・ネギ・タマネギ・レタス・ショウガ・ ニンニク・イチゴなどの野菜、イネ・コムギ・トウモロコシなどの穀物、キク・チューリップ・バラなどの花卉、ダイズ・エンドウなどの豆類、モデル植物のシロイヌナズナ等が挙げられる。投与対象の植物は、好ましくは、発芽〜着花までの期間である幼若期が比較的長い（１０年以上、９年以上、８年以上、７年以上、６年以上、５年以上、４年以上または３年以上の）植物であり、例えば、果樹である。果樹は、木本性であること、他の農作物と比較して栽培本数が少ないことなどから、本発明の開花誘導剤の投与が比較的容易である。果樹として、カンキツ、キンカン、リンゴ、ウメ、モモ、ブドウ、ナシ、ビワ、カキ、イチジク等があげられる。
投与対象の植物は、より好ましくは、カンキツである。カンキツは、マンダリン類（例、ウンシュウミカン、ポンカン、タチバナ、紀州ミカン、キング、クレメンテイン、カラ等）、オレンジ類（例、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、ブラッドオレンジ、ハムリンオレンジ等）、グレープフルーツ（例、グレープフルーツ、スウィーティ、オロブランコ等）、香酸カンキツ類（例、ユズ、ダイダイ、カボス、スダチ、レモン、シイクワシャー、ライム、シトロン、ヘベス、ユコウ等）、雑柑（例、ナツミカン、川野ナツダイダイ（甘夏）、ハッサク、ヒュウガナツ、ジャバラ、河内晩柑、三宝柑、ナルト、キンコウジ等）、タンゴール（イヨカン、清見、はるみ、タンカン、マーコット、オータニーク等）、ダンゼロ（例、セミノール、ヤラハ、ミネオラ、オーランド等）、ブンタン類（例、カオファン、晩白柚、江上ブンタン、平戸ブンタン、麻豆ブンタン等）、カラタチ類（カラタチ、ヒリュウ、ルビドー等）、キンカン類（ニンポーキンカン、丸キンカン、長キンカン等）等が挙げられる。投与対象の植物は、さらに好ましくは、ウンシュウミカンである。
本発明のいくつかの好ましい態様では、投与対象の植物は、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である。穂木は、上記した開花誘導剤の投与対象の植物を挙げることができ、好ましくは、上記の果樹であり、より好ましくは、上記のカンキツであり、さらに好ましくは、ウンシュウミカンである。また、台木としては、公知の台木を用いることができ、例えば、上記した開花誘導剤の投与対象の植物を挙げることができ、好ましくは、上記の果樹であり、より好ましくは、上記のカンキツであり、さらに好ましくは、カラタチである。
例えば、カンキツ交雑実生では、幼若期は８〜１２年に及ぶ。本発明の好ましい態様の開花誘導剤により、成熟相にある穂木を接ぎ木したカンキツを処理することで開花までの期間を少なくとも２年以内に短縮でき、結果として、早期にカンキツの果実を収穫できるようになる。
例えば、カンキツ交雑実生では、幼若期は８〜１２年に及ぶ。本発明の好ましい態様の開花誘導剤により、成熟相にある穂木を接ぎ木したカンキツを処理することで開花までの期間を少なくとも２年以内に短縮でき、結果として、早期にカンキツの果実を収穫できるようになる。
本発明の開花誘導剤は、本発明のタンパク質を有効成分として含有するものであり、本発明のタンパク質以外にも、通常用いられている担体、乳化剤、分散剤、展着剤、湿展剤、固着剤、崩壊剤などの補助剤を含有させることができる。
担体としては、例えば、水；エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；酢酸エチルなどのエステル類、並びに、固体担体、例えば、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、消石灰、ケイ砂、硫安、尿素などが例示される。
乳化剤または分散剤としては、通常、界面活性剤が用いられ、例えば高級アルコール硫酸ナトリウムなどの陰イオン系界面活性剤、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドなどの陽イオン系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどの非イオン系界面活性剤、などが例示される。
本発明の開花誘導剤の剤形は特に限定されず、乳剤、懸濁剤、粉剤、水和剤、水溶剤、粒剤、ペースト剤、エアゾール剤などが挙げられる。
本発明の開花誘導剤の使用時期および使用方法は、植物の種類などによって適宜選択することができるが、植物、例えば、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物に対して、注入する、吸収させる、などの方法が挙げられる。「注入する方法」では、植物体の茎、葉、根などから、スポイト、本発明の開花誘導剤を染み込ませた脱脂綿などを用いて、植物体に注入することができる。「吸収させる方法」では、本発明の開花誘導剤を植物体の茎、葉、根などに、直接、塗布する。この際、界面活性剤、展着剤等を共に用いても良い。また、別の「吸収させる方法」では、水耕栽培の際、養液中に本発明の開花誘導剤を加える方法がある。
本発明の開花誘導剤中の本発明のタンパク質の含有量及び本発明の開花誘導剤の投与量は、植物の種類、剤形、使用方法、使用時期などによって異なる。例えば、本発明の開花誘導剤をカンキツに水溶剤として注入する場合、本発明のタンパク質が20〜10000ppm、好ましくは50〜10000ppm、より好ましくは100〜10000ppmの濃度になる範囲で調整し、カンキツの生理的花芽分化期に、0.1〜5.0ml、好ましくは0.2〜2.0ml、より好ましくは0.5〜1.0mlの量で、カンキツに注入する。
また、本発明は、本発明のタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法を提供する。「本発明のタンパク質を用いて植物を処理する」ことには、本発明のタンパク質を目的の植物に投与すること、本発明のタンパク質を投与した植物を目的の植物の隣に配置することなどが含まれる。「隣に配置」することには、本発明のタンパク質を投与した植物の主幹（主幹は植物体のほぼ中心に位置する）からその隣に配置した植物の主幹までの距離にして、例えば、２ｍ以内、１．９ｍ以内、１．８ｍ以内、１．７ｍ以内、１．６ｍ以内、１．５ｍ以内、１．４ｍ以内、１．３ｍ以内、１．２ｍ以内、１．１ｍ以内、１ｍ以内、０．９ｍ以内、または０．８ｍ以内に配置することが含まれる。本発明の開花誘導方法において、投与対象の植物、補助剤、使用時期、使用方法、本発明のタンパク質の含有量、本発明の開花誘導剤の投与量等は、前記開花誘導剤で説明したのと同様である。
本発明の好ましい態様の開花誘導剤または開花誘導方法は、（a）結実の時期が早まることから結実までの栽培経費の削減ができること、(b) 結実の時期が早まることから開園時に投入した経費の早期回収につながること、および(c)早期に花が咲くことにより品種改良を効率化できること、からなる群から選択される少なくとも１つの効果を奏する。
本発明のさらに好ましい態様の開花誘導剤または開花誘導方法は、カンキツ、特にはウンシュウミカンの隔年結果を防止することができる。
また、本発明のいくつかの態様の開花誘導剤または開花誘導方法では、他の開花誘導方法として、遺伝子組換え植物を用いない。
尚、発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。
１．CiFT2遺伝子のPCR
ウンシュウミカンの葉から抽出したRNAを鋳型として、FTの相補的DNAと高い相同性を示す相補的DNAをRT-PCR法で得た。具体的には、以下の方法で行った。RT-PCR法で使うプライマーは、ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456、配列番号５）およびこれとDNA配列が99%一致するウンシュウミカンのCiFT2（アクセションナンバーAB301934、配列番号７）（Fumie Nishikawa, Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Tokurou Shimizu, Mitsuo Omura, and Yoshinori Ikoma (2007) “Increased CiFT abundance in the stem correlates with floral induction by low temperature in Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.).”J. Exp. Bot. 58, 3915-3927）のcDNA配列を元に設計した。尚、配列番号５および７の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および８に示す。
ウンシュウミカンの葉から抽出したRNAを鋳型として、FTの相補的DNAと高い相同性を示す相補的DNAをRT-PCR法で得た。具体的には、以下の方法で行った。RT-PCR法で使うプライマーは、ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456、配列番号５）およびこれとDNA配列が99%一致するウンシュウミカンのCiFT2（アクセションナンバーAB301934、配列番号７）（Fumie Nishikawa, Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Tokurou Shimizu, Mitsuo Omura, and Yoshinori Ikoma (2007) “Increased CiFT abundance in the stem correlates with floral induction by low temperature in Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.).”J. Exp. Bot. 58, 3915-3927）のcDNA配列を元に設計した。尚、配列番号５および７の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および８に示す。
TRIZOL（Invitrogen社）を用いて、添付の説明書に従って、ウンシュウミカンの葉からRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型とし、DNA配列がCAAATTAAGCATGTATGG（配列番号９）であるプライマーにより、Piero Carninci, Yoko Nishiyama, Arthur Westover, Masayoshi Itoh, Sumiharu Nagaoka, Nobuya Sasaki, Yasushi Okazaki, Masami Muramatsu, and Yoshihide Hayashizaki (1998) “Thermostabilization and thermoactivation of thermolabile enzymes by trehalose and its application for the synthesis of full length cDNA”Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 520-524.記載の条件に従って、SuperScript II（Invitrogen社）酵素により逆転写反応を行い、相補的DNAを得た。
次に、この相補的DNAを鋳型にして、nested PCRを行うこととした。一回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：CAAATTAAGCATGTATGG（配列番号１０）
プライマー：GTGCTTAGTGTTGTTGAG（配列番号１１）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。
プライマー：CAAATTAAGCATGTATGG（配列番号１０）
プライマー：GTGCTTAGTGTTGTTGAG（配列番号１１）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。
二回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：AGGAGATATACCATGTCTAGCAGGGAGAGAGA（配列番号１２）
プライマー：CACCAGGCCGCTGCTTCGTCTGACAGGCCTTCCGC（配列番号１３）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。
プライマー：AGGAGATATACCATGTCTAGCAGGGAGAGAGA（配列番号１２）
プライマー：CACCAGGCCGCTGCTTCGTCTGACAGGCCTTCCGC（配列番号１３）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。
三回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG（配列番号１４）
プライマー：GCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCT（配列番号１５）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして40回繰り返した。
プライマー：AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG（配列番号１４）
プライマー：GCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCT（配列番号１５）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして40回繰り返した。
なお、この二回目および三回目のPCR反応のプライマー配列には、プラスミドpET-28b(+)（Merck社）と相同な配列をPCR産物に付加するための配列が含まれる。
２．PCR産物のプラスミドpET-28b(+)へのクローニング
PCR産物のプラスミドへのクローニングは酵母相同組換え法で行った（Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) “Highly efficient yeast-based in vivo DNA cloning of multiple DNA fragments and the simultaneous construction of yeast/ Escherichia coli shuttle vectors” BioTechniques 40, 79-83.）。図２のように、プラスミドpET-28b(+)を制限酵素NcoIとClaIで切断したもの、プラスミドpYES2/CT（Invitrogen社）を制限酵素HindIIIとXhoIで切断したもの、および上記PCR産物を、同時に酵母に形質転換した。すると、酵母細胞内の相同組換え反応によって、pET-28b(+)が酵母の複製起点および酵母の選択マーカーURA3を持つようになると同時に、PCR産物がpET-28b(+)にクローニングされる。この実験は、Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) BioTechniques 40, 79-83.に従って行った。得られたプラスミドにより、FTタンパク質の後方に、トロンビン認識部位、エピトープタグであるT7タグ、および精製のためのタグであるヒスタグが順に融合されたタンパク質の発現が可能になる。形質転換された酵母コロニーの集団を回収し、この集団からプラスミドDNAを精製した。次に、精製したプラスミドDNAを大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌コロニーの一つからプラスミドDNAを精製し、PCR産物が挿入された部分のDNA配列を決定した。
PCR産物のプラスミドへのクローニングは酵母相同組換え法で行った（Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) “Highly efficient yeast-based in vivo DNA cloning of multiple DNA fragments and the simultaneous construction of yeast/ Escherichia coli shuttle vectors” BioTechniques 40, 79-83.）。図２のように、プラスミドpET-28b(+)を制限酵素NcoIとClaIで切断したもの、プラスミドpYES2/CT（Invitrogen社）を制限酵素HindIIIとXhoIで切断したもの、および上記PCR産物を、同時に酵母に形質転換した。すると、酵母細胞内の相同組換え反応によって、pET-28b(+)が酵母の複製起点および酵母の選択マーカーURA3を持つようになると同時に、PCR産物がpET-28b(+)にクローニングされる。この実験は、Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) BioTechniques 40, 79-83.に従って行った。得られたプラスミドにより、FTタンパク質の後方に、トロンビン認識部位、エピトープタグであるT7タグ、および精製のためのタグであるヒスタグが順に融合されたタンパク質の発現が可能になる。形質転換された酵母コロニーの集団を回収し、この集団からプラスミドDNAを精製した。次に、精製したプラスミドDNAを大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌コロニーの一つからプラスミドDNAを精製し、PCR産物が挿入された部分のDNA配列を決定した。
得られたDNA配列を配列番号１に示す。また、このDNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。このDNAの配列は、ウンシュウミカンのCiFT2のものと同じであった。このCiFT2がコードしているものがCiFT2タンパク質である。
３．CiFT2タンパク質のアミノ酸配列の比較
図３は、いくつかの植物由来FTタンパク質間のアミノ酸配列の比較を示す。CiFT2タンパク質は、ウンシュウミカン由来のCiFTタンパク質およびウンシュウミカン由来のCiFT3タンパク質と、それぞれ、99%および95%のアミノ酸配列の一致を示す。また、CiFT2タンパク質は、カラタチ、リンゴ、ウメ、モモ、およびブドウ由来のFTタンパク質とそれぞれ99%、84%、83%、82%および81%のアミノ酸配列の一致を示す。一方、CiFT2タンパク質はシロイヌナズナ由来のFTタンパク質と75%のアミノ酸配列の一致を示す。このように、CiFT2タンパク質は、シロイヌナズナ由来のFTタンパク質よりも果樹由来のFTタンパク質と相対的にアミノ酸配列が類似している。
図３は、いくつかの植物由来FTタンパク質間のアミノ酸配列の比較を示す。CiFT2タンパク質は、ウンシュウミカン由来のCiFTタンパク質およびウンシュウミカン由来のCiFT3タンパク質と、それぞれ、99%および95%のアミノ酸配列の一致を示す。また、CiFT2タンパク質は、カラタチ、リンゴ、ウメ、モモ、およびブドウ由来のFTタンパク質とそれぞれ99%、84%、83%、82%および81%のアミノ酸配列の一致を示す。一方、CiFT2タンパク質はシロイヌナズナ由来のFTタンパク質と75%のアミノ酸配列の一致を示す。このように、CiFT2タンパク質は、シロイヌナズナ由来のFTタンパク質よりも果樹由来のFTタンパク質と相対的にアミノ酸配列が類似している。
４．大腸菌形質転換体によるCiFT2タンパク質の生産
次にCiFT2タンパク質を大腸菌で生産させた。構築したプラスミドを大腸菌Origami B (DE3)（Merck社）に形質転換した。この大腸菌を100 μg/mlのアンピシリンを含むTerrific培地（1リットルの水あたりYeast Extract 24 g、Peptone 12 g、リン酸水素二カリウム 9.4 g、リン酸二水素カリウム 2.2 g、グリセロール4 ml）250ml中で37℃の条件下、600 nmの吸光度が0.7程度になるまで培養した。次に1 mM になるようにIPTGを加えて、15℃で二日間培養した。
次にCiFT2タンパク質を大腸菌で生産させた。構築したプラスミドを大腸菌Origami B (DE3)（Merck社）に形質転換した。この大腸菌を100 μg/mlのアンピシリンを含むTerrific培地（1リットルの水あたりYeast Extract 24 g、Peptone 12 g、リン酸水素二カリウム 9.4 g、リン酸二水素カリウム 2.2 g、グリセロール4 ml）250ml中で37℃の条件下、600 nmの吸光度が0.7程度になるまで培養した。次に1 mM になるようにIPTGを加えて、15℃で二日間培養した。
培養した大腸菌を集菌し、リン酸緩衝生理食塩水（塩化ナトリウム 8 g、塩化カリウム 0.2 g、リン酸水素二ナトリウム 1.44 g、 リン酸二水素カリウム 0.24 gを800 ml水にとかし、pHを7.4にした後、水で1リットルにした緩衝液）40 mlに懸濁した。この懸濁液にフッ化フェニルメチルスルホニル（タンパク質分解酵素の阻害剤）を1 mMになるように、デオキシリボヌクレアーゼ（DNA加水分解酵素）を10 μg/mlになるように、リゾチーム（最近の細胞壁を溶解する酵素）を100 μg/mlになるように加えて、30度で15分間反応させた。
次に、フレンチプレスを用いて、この反応液を約150メガパスカルの圧力条件下で破砕した。細胞破砕液から不溶性画分を除くために、20,000gで10分の遠心を2回行った。この上清を、ニッケルイオンでチャージした10 mlのChelating Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に通した。次に、100 mlの洗浄バッファー１（50 mM リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、1% Triton X-100）で洗浄し、次に20 mlの洗浄バッファー２（50 mM リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム）で洗浄し、最後に20 mlの洗浄バッファー３（50 mM リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、100 mMイミダゾール）で洗浄した。
次に、5 mlの溶出バッファー（50 mM リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、200 mMイミダゾール）で計6回（計30 ml）、組換えタンパク質の溶出を行った。溶出液の3番目から6番目に多くの組換えタンパク質が含まれていたので、この分画を透析にかけて、イミダゾールを除いた。透析は、25倍のリン酸緩衝生理食塩水で計5回行った。得られたタンパク質の濃度はBIO-RAD社のプロテインアッセイ（ブラッドフォード法）で添付の説明書に従って行った。
図４は、精製したタンパク質の一部を14%のSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色したものである。比較的高純度で精製されたことがわかる。組換えタンパク質の相対分子量は、予測値とほぼ一致した。なお、CiFT2タンパク質の後方に、トロンビン認識部位、エピトープタグであるT7タグ、および精製のためのタグであるヒスチジンタグが順に融合されているが、この余分な配列の除去は行わず、以降の実施例に用いた。
ここで得られた組換えタンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号３に示す。また、その塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
５．開花誘導剤の投与及びその結果(No. 1)
５．１．開花誘導剤の投与
次に、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質を含む開花誘導剤をウンシュウミカンに注入した。用いた植物は、カラタチを台木とし、これにウンシュウミカン（品種は青島温州）を穂木として接木し、12ヶ月経過したもの（2008年4月の時点）、すなわち一年生苗木といわれるものである。ウンシュウミカンへの開花誘導剤の注入は以下の二通りの方法で行った。参考までに、2009年4月に撮影した一年生苗木の写真を図５に示す。
５．１．開花誘導剤の投与
次に、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質を含む開花誘導剤をウンシュウミカンに注入した。用いた植物は、カラタチを台木とし、これにウンシュウミカン（品種は青島温州）を穂木として接木し、12ヶ月経過したもの（2008年4月の時点）、すなわち一年生苗木といわれるものである。ウンシュウミカンへの開花誘導剤の注入は以下の二通りの方法で行った。参考までに、2009年4月に撮影した一年生苗木の写真を図５に示す。
注入方法１）
2008年の9月、10月、11月にそれぞれ開花誘導剤の注入を行った。注入は、接ぎ木部上部の主幹に対して行った。上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して、500ppmの開花誘導剤を調製した。500ppm（0.5 mg/ml）の開花誘導剤1 mlをプラスチックスポイトで吸い込んだ。次に、皮部を木部に達するまで切開し、そこにプラスチックスポイトの先を挿入し、この挿入部分を接着剤（アロンアルファTM（東亜合成株式会社））で覆うことにより、開花誘導剤の液が漏れないようにした（図６）。スポイトはテープを用いて茎に固定した。なお、液はスポイトを押すことにより注入したのではなく、液が自然に吸い込まれるのを利用して注入した。
2008年の9月、10月、11月にそれぞれ開花誘導剤の注入を行った。注入は、接ぎ木部上部の主幹に対して行った。上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して、500ppmの開花誘導剤を調製した。500ppm（0.5 mg/ml）の開花誘導剤1 mlをプラスチックスポイトで吸い込んだ。次に、皮部を木部に達するまで切開し、そこにプラスチックスポイトの先を挿入し、この挿入部分を接着剤（アロンアルファTM（東亜合成株式会社））で覆うことにより、開花誘導剤の液が漏れないようにした（図６）。スポイトはテープを用いて茎に固定した。なお、液はスポイトを押すことにより注入したのではなく、液が自然に吸い込まれるのを利用して注入した。
なお、この時期（9月、10月、11月）は、ウンシュウミカンにとって生理的花芽分化期である。前記の通り、開花を誘導する物質は葉で合成されるが、様々な時期に植物体から葉を取り除く実験から、この生理的花芽分化期にこの開花誘導物質が合成されることがわかっている。生理的花芽分化期には、顕微鏡で観察できるような形態の変化はおこらない。実際に開花がおこるのは翌4月である。
注入方法２）
2008年4月に接ぎ木部上部の主幹に開花誘導剤を注入した。皮部を木部に達するまでナイフで切断後、脱脂綿に約0.2mlの開花誘導剤を吸い込ませたものを切り口に被せ、その周りをテープ（接木用テープ）で巻くことによって、開花誘導剤を注入した（図７）。脱脂綿に吸い込ませた開花誘導剤の濃度は、10,000ppm、1,000ppmまたは100ppmであった。これらの各濃度の開花誘導剤は、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して調製した。
2008年4月に接ぎ木部上部の主幹に開花誘導剤を注入した。皮部を木部に達するまでナイフで切断後、脱脂綿に約0.2mlの開花誘導剤を吸い込ませたものを切り口に被せ、その周りをテープ（接木用テープ）で巻くことによって、開花誘導剤を注入した（図７）。脱脂綿に吸い込ませた開花誘導剤の濃度は、10,000ppm、1,000ppmまたは100ppmであった。これらの各濃度の開花誘導剤は、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して調製した。
５．２．開花誘導剤投与の結果
処理した植物の大部分で、2009年4月の初めには、明らかなつぼみの形成を観察できた。また、4月の終わりから5月の初めにそれらは開花した。
処理した植物の大部分で、2009年4月の初めには、明らかなつぼみの形成を観察できた。また、4月の終わりから5月の初めにそれらは開花した。
下記表１は、注入方法１で行った実験の結果である。この表で、発育枝（無着花枝）とは、文字通り、着花がおこらず、発育（栄養生長）をしている枝である。また、花芽には二種類あり、葉を伴った有葉花と、花だけの花芽である直花がある。通常、直花の約９０％は落花または落果し、果実ができたとしてもその品質が不良なことが多い。一方、有葉花は結実率が高く、果実の品質がよいことが多い。
表１から明らかなように大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。なお、コントロールの植物（無処理の植物）で得られた結果については後で詳しく触れるが、一般に、ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年ではまだ栄養生長が盛んで、通常ほとんど開花しない。処理した月による明確な差はなかった。なお、10月に処理したNo. 4で着花が少なかった理由は不明である。
上記表１中のNo.3の植物の写真を、図８に示す。図８には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。
下記表２は、注入方法２で行った実験の結果である。大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。処理した濃度による明確な差はなかった。
上記表２中のNo.21の植物の写真を図９に示す。図９には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。
下記表３は、注入方法２で処理した植物に隣接する区画（80 cm以内）の結果である。表２と同様に、大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。何故、この区画で、すなわち無処理の対象区画で着花がおこったかについては、後で議論する。
ここで、注入方法２で処理した植物に隣接する区画までの距離とは、処理した植物の主幹からその隣接する区画に配置した植物の主幹までの距離のこととした。
ここで、注入方法２で処理した植物に隣接する区画までの距離とは、処理した植物の主幹からその隣接する区画に配置した植物の主幹までの距離のこととした。
上記表３中のNo.24の植物の写真を図１０に示す。図１０には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。
下記表４は、注入方法２で処理した植物に隣接する区画（80 cm以内）から、さらに離れた区画の実験結果である。ここで、「距離」は注入方法２で処理した植物に隣接する区画からの距離を示す。表４には、注入方法２で処理した植物に隣接する区画からの距離を示してある。距離に応じて、着花数が減少する傾向がある。前にも触れたが、一般に、ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年では、通常ほとんど開花しない。特に、今回のように植木鉢で植えた場合より、圃場に直に植えた露地栽培の場合は、その傾向が顕著である。したがって、No. 37の状態がもっとも通常な状態に近いと言える。
図１１は2.9 m離れた植物の写真である。なお、植物体の一部（例えば、葉の表面）に白く見える部分があるが、これは光の反射によるものであり、着花は見られない。
また、開花とともに別の現象もみられた。ウンシュウミカンは本来、雄性不稔性であり、ハウス栽培の加温により花粉を形成することがあるが、露地栽培での花粉形成はほとんど認められない。しかし、本実験において、着生した花の多くは、葯壁が裂開し、花粉を形成していたことが、この一連の実験でわかった。このウンシュウミカンの貴重な花粉は、交雑に利用することができる。この花粉形成により、雄性不稔性で花粉親としての利用が不可能であったカンキツの花粉親としての利用が可能となる。このことはカンキツの品種改良の効率化にもつながる。
さて、このように、この一連の実験では、開花誘導剤の処理樹の隣に配置した開花誘導剤の無処理樹にも着花が見られた。また、開花誘導剤の処理樹から離れるほど開花誘導剤の無処理樹の着花が少なくなった。ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年では、通常ほとんど開花しない。開花誘導剤を注入した植物の隣に位置する開花誘導剤の無処理植物で着花がおこるメカニズムの一つの可能性として、開花誘導剤を注入した植物から、「花成フェロモン」とでも言うべき、未知の開花誘導物質が放出されている可能性が考えられる（図１２）。以下、この仮説について説明するが、本発明は、開花誘導が以下の仮説のメカニズムに従って生じる場合に限定されない。
フェロモンは、個体が体内で生成して体外に分泌後、同種の他の個体に一定の行動や発育の変化を促す生理活性物質のことである。フェロモンによる個体間のコミュニケーションは、自然界に幅広く見られる現象である。本発明者らがみつけた現象は、このフェロモンによる個体間のコミュニケーションで説明できる。
ミカンを含む果樹の多くで、隔年結果（ここの「結果」は「実を結ぶこと」を意味する）という現象が知られている。果樹園全体で、一年おきに豊作不作を繰り返す現象である。しかし、隔年結果がおこる理由はよくわかっていない。隔年結果は、果樹園全体で着花が同期する現象である。この隔年結果という現象は、フェロモンによる個体間のコミュニケーションで説明できる可能性がある。
また、今回の実験では、投与時期や濃度を変えて処理を行ったが、着花数に明確な差がなかった。着花数に明確な差がなかったことは、フェロモンによる個体間のコミュニケーションによって説明できる。
1937年、旧ソ連のMikhail Chailakhyanは、葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導する物質が存在することを示した。この物質を花成ホルモンという。この物質は長年にわたって同定することができなかったが、現在では、様々な研究から、FTタンパク質がこの花成ホルモンの本体であると考えられている。しかし、あくまでもこの仮説は様々な研究結果からの推定である。FTタンパク質が花成ホルモンであることを最終的に示すためには、FTタンパク質を植物体に注入して、開花を誘導する必要がある。この実験で、本発明者らは、FTタンパク質が花成ホルモンであることを最終的に証明した。さらに、また、本発明者らはFTタンパク質を最初に農業に応用した。加えて、我々は花成フェロモンの存在を提唱した。
上記実施例では、ウンシュウミカンに本発明の開花誘導剤を投与した場合を例に挙げて説明したが、以下に説明するように、本発明の開花誘導剤は、他の植物へも適用可能である。
まず、他のカンキツへの本発明の開花誘導剤の適用について説明する。CiFT2タンパク質はカラタチのFTタンパク質とアミノ酸配列が99%一致することから類推して、カンキツの間で、FTタンパク質のアミノ酸配列は極めてよく保存されていると推定できる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、そのカンキツ種由来のFTタンパク質を用いなくても、ウンシュウミカンに由来するCiFT2タンパク質を用いて、その他のカンキツ種の開花誘導が可能である。
次に、他の果樹への本発明の開花誘導剤の適用について説明する。CiFT2タンパク質は既知の果樹由来FTタンパク質とアミノ酸配列で80%以上の一致を示す。このように高い相同性を示すことから、本発明の好ましい態様によれば、ウンシュウミカンに由来するCiFT2タンパク質を他の果樹に投与することで開花誘導が可能である。本発明の別の好ましい態様によれば、投与する果樹に由来する組換えFTタンパク質を用いてもよい。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、CiFT2タンパク質など他の植物由来FTタンパク質を用いても開花誘導ができる。なぜなら、ウンシュウミカン由来のCiFT遺伝子が高発現する遺伝子組換えシロイヌナズナで開花が早まるという報告がある（Yasushi Kobayashi, Hidetaka Kaya, Koji Goto, Masaki Iwabuchi, and Takashi Araki (1999) “A Pair of Related Genes with Antagonistic Roles in Mediating Flowering Signals” Science 286, 1960-1962.）ので、FTタンパク質の開花誘導機能にそれほど種特異性がないと考えられるからである。
６．開花誘導剤の投与及びその結果（No.2）
６．１．開花誘導剤の投与
一年生の苗木（カラタチの台木に、成熟期のウンシュウミカンの穂木を、接木したもの）の先端に、ウンシュウミカンの珠心胚実生を二重に接ぎ木したものを用いて、FTタンパク質の注入実験を行った。すなわち、カラタチが台木、成熟期のウンシュウミカンが中間台木、ウンシュウミカンの珠心胚実生が穂木となる。珠心胚実生とは、受精の結果生じた胚から生じた芽ではなく、珠心胚から生じた芽を指す。珠心胚実生は、無性生殖の一つであり、親のクローンである。ちなみに、実生とは、（接ぎ木・挿し木などによらず）種子から芽を出して生長することを指す。実生は、幼若期にある。
６．１．開花誘導剤の投与
一年生の苗木（カラタチの台木に、成熟期のウンシュウミカンの穂木を、接木したもの）の先端に、ウンシュウミカンの珠心胚実生を二重に接ぎ木したものを用いて、FTタンパク質の注入実験を行った。すなわち、カラタチが台木、成熟期のウンシュウミカンが中間台木、ウンシュウミカンの珠心胚実生が穂木となる。珠心胚実生とは、受精の結果生じた胚から生じた芽ではなく、珠心胚から生じた芽を指す。珠心胚実生は、無性生殖の一つであり、親のクローンである。ちなみに、実生とは、（接ぎ木・挿し木などによらず）種子から芽を出して生長することを指す。実生は、幼若期にある。
ここで考え方を説明すると、穂木の部分が珠心胚由来であることは重要ではなく、穂木の部分が実生であること、すなわち、穂木の部分が幼若期にあることが重要である。
開花誘導剤の注入は、2008年の9月、10月、11月にそれぞれ行った。注入は、中間台木の部分である成熟期のウンシュウミカンに対して行ったものであり、穂木の部分であるウンシュウミカンの珠心胚実生に対して行ったものではない。すなわち、注入は、カラタチの台木に成熟期のウンシュウミカンの穂木を継いだ部分の上部の主幹に対して行った。実施例１で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩生理食塩水で希釈して500ppmの開花誘導剤を調製した。500ppm（0.5 mg/ml）の開花誘導剤1 mlをプラスチックスポイトで吸い込んだ。次に、皮部を木部に達するまで切開し、そこにプラスチックスポイトの先を挿入し、この挿入部分を接着剤（アロンアルファTM(東亜合成株式会社)）で覆うことにより、開花誘導剤の液が漏れないようにした。スポイトはテープを用いて茎に固定した。なお、液はスポイトを押すことにより注入したのではなく、液が自然に吸い込まれるのを利用して注入した。
対照として、開花誘導剤処理した植物の区画(FT処理区)から2.9m離れた区画(対照区)の開花誘導剤未処理植物を用いた。
対照として、開花誘導剤処理した植物の区画(FT処理区)から2.9m離れた区画(対照区)の開花誘導剤未処理植物を用いた。
６．２．開花誘導剤投与の結果
上記開花誘導剤投与実験の結果を図１３に示した。また、図１３の数値データを表５にまとめた。図１３及び表５から、開花誘導剤を投与した群(NS-Sep-1〜NS-Nov-3)では、着花の数において、対照区の群(Cont-1〜3)と差がないことがわかる。
上記開花誘導剤投与実験の結果を図１３に示した。また、図１３の数値データを表５にまとめた。図１３及び表５から、開花誘導剤を投与した群(NS-Sep-1〜NS-Nov-3)では、着花の数において、対照区の群(Cont-1〜3)と差がないことがわかる。
また、開花誘導剤を投与した群(NS-Sep-1〜NS-Nov-3)について、珠心胚実生の幹経と着花数の間の相関の有無を調べたところ、珠心胚実生の幹経と着花数の間に負の相関があることがわかった（図１４）。一方、珠心胚実生の高さと着花数の間には相関がなかった（図１５）。
以上の結果から次のことが推測される。
1)FTタンパク質の作用を抑える物質が、珠心胚実生から出る。
2)この物質は、珠心胚実生から、中間台木に移動して、FTタンパク質の作用を抑える。
3)珠心胚実生の幹経（生育量の目安）が大きいほど、この物質の量は多い。
1)FTタンパク質の作用を抑える物質が、珠心胚実生から出る。
2)この物質は、珠心胚実生から、中間台木に移動して、FTタンパク質の作用を抑える。
3)珠心胚実生の幹経（生育量の目安）が大きいほど、この物質の量は多い。
また、他の実験も行った。カワノナツダイダイ（川野夏橙）の珠心胚実生、あるいは、カワチバンカン（河内晩柑）の放任受粉した交雑実生を育て、発芽後三ヶ月の実生を得た。これに対して、FTタンパク質の注入を行ったが、一年経っても開花は見られなかった。この結果からも、実生にFTタンパク質の作用を抑える物質があることが示唆される。
以上のことから、栄養的成熟期のウンシュウミカンは、実生などの幼若期のものと異なり、FTタンパク質の作用を抑える物質の影響が少なく、本発明の開花誘導剤による開花誘導効果がより大きく出ることが期待できる。
［配列番号１］実施例で得られたDNAの塩基配列。
［配列番号２］配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号３］配列番号１記載の塩基配列からなるDNAの後方に、トロンビン認識部位をコードするDNA、Ｔ７タグをコードするDNAおよびヒスチジンタグをコードするDNAが順に融合されたDNAの配列。
［配列番号４］配列番号３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号５］ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456）。
［配列番号６］配列番号５の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号７］ウンシュウミカンのCiFT2のcDNA配列（アクセションナンバーAB301934）。
［配列番号８］配列番号７の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号９］プライマー
［配列番号１０］プライマー
［配列番号１１］プライマー
［配列番号１２］プライマー
［配列番号１３］プライマー
［配列番号１４］プライマー
［配列番号１５］プライマー
［配列番号２］配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号３］配列番号１記載の塩基配列からなるDNAの後方に、トロンビン認識部位をコードするDNA、Ｔ７タグをコードするDNAおよびヒスチジンタグをコードするDNAが順に融合されたDNAの配列。
［配列番号４］配列番号３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号５］ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456）。
［配列番号６］配列番号５の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号７］ウンシュウミカンのCiFT2のcDNA配列（アクセションナンバーAB301934）。
［配列番号８］配列番号７の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号９］プライマー
［配列番号１０］プライマー
［配列番号１１］プライマー
［配列番号１２］プライマー
［配列番号１３］プライマー
［配列番号１４］プライマー
［配列番号１５］プライマー
Claims (18)
- 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含み、カンキツの開花誘導に用いられる開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質 - 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項１記載の開花誘導剤。
- 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含み、カンキツの開花誘導に用いられる開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３記載の開花誘導剤。
- 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、請求項１記載の開花誘導剤。
- 配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、請求項３記載の開花誘導剤。
- カンキツがウンシュウミカンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
- 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理し、カンキツの開花を誘導することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質 - 前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項８記載の方法。
- 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理し、カンキツの開花を誘導することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１０記載の方法。
- 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項８記載の方法。
- 配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項１０記載の方法。
- カンキツがウンシュウミカンである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質を用いて処理した植物を、前記タンパク質を用いて処理していない開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記開花誘導剤が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物を処理するために用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
- 前記開花誘導剤が、前記タンパク質を用いて処理した植物の隣に配置された前記タンパク質を用いて処理していない植物の開花を誘導するために用いられる、請求項１〜７及び１７のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011540549A JP5679219B2 (ja) | 2009-11-16 | 2010-11-12 | 開花誘導剤 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009260847 | 2009-11-16 | ||
| JP2009260847 | 2009-11-16 | ||
| PCT/JP2010/070181 WO2011059051A1 (ja) | 2009-11-16 | 2010-11-12 | 開花誘導剤 |
| JP2011540549A JP5679219B2 (ja) | 2009-11-16 | 2010-11-12 | 開花誘導剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2011059051A1 JPWO2011059051A1 (ja) | 2013-04-04 |
| JP5679219B2 true JP5679219B2 (ja) | 2015-03-04 |
Family
ID=43991707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011540549A Expired - Fee Related JP5679219B2 (ja) | 2009-11-16 | 2010-11-12 | 開花誘導剤 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120283102A1 (ja) |
| EP (1) | EP2502496B1 (ja) |
| JP (1) | JP5679219B2 (ja) |
| ES (1) | ES2534359T3 (ja) |
| WO (1) | WO2011059051A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101881977B1 (ko) * | 2017-07-18 | 2018-07-25 | 한국생명공학연구원 | 사계성 또는 일계성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 |
| US11214814B2 (en) | 2019-03-05 | 2022-01-04 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Transformed plant and flowering regulation method using flowering-inducing gene |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150011393A1 (en) * | 2012-02-08 | 2015-01-08 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Method for introducing florigen |
| CN106416805A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 简立华 | 基于容器栽培基质的砂糖橘种植方法 |
| CN106305304A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-11 | 简立华 | 基于容器育苗基质的砂糖橘种植方法 |
| CN106613666A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-05-10 | 广西金神农生态农业科技开发有限公司 | 一种高产的柑橘种植方法 |
| IT201900021546A1 (it) * | 2019-11-19 | 2021-05-19 | Endofruit S R L | Metodo per il trattamento conservativo di almeno una pianta da frutto sintomatica di una malattia |
| CN115349391A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-18 | 西安市农业技术推广中心 | 一种三叶木通果的人工栽培方法 |
| CN115250822A (zh) * | 2022-08-31 | 2022-11-01 | 云南省林业和草原科学院 | 一种促进云南松提早开花结实的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06233685A (ja) * | 1993-02-10 | 1994-08-23 | Ajinomoto Co Inc | 花芽誘導物質ペプチド遺伝子 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9518731D0 (en) * | 1995-09-13 | 1995-11-15 | Innes John Centre | Flowering genes |
| CN101516180A (zh) * | 2006-08-14 | 2009-08-26 | 独立行政法人理化学研究所 | 早熟的转基因植物 |
-
2010
- 2010-11-12 JP JP2011540549A patent/JP5679219B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-12 EP EP10830010.4A patent/EP2502496B1/en not_active Not-in-force
- 2010-11-12 US US13/509,854 patent/US20120283102A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-12 WO PCT/JP2010/070181 patent/WO2011059051A1/ja active Application Filing
- 2010-11-12 ES ES10830010.4T patent/ES2534359T3/es active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06233685A (ja) * | 1993-02-10 | 1994-08-23 | Ajinomoto Co Inc | 花芽誘導物質ペプチド遺伝子 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6014044534; ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＢＯＴＡＮＹ Ｖ５８, 2007, Ｐ３９１５-３９２７ * |
| JPN6014044535; ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖ２８６, 1999, Ｐ１９６０-１９６２ * |
| JPN6014044536; ＴＲＡＮＳＧＥＮＩＣ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｖ１４, 2005, Ｐ７０３-７１２ * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101881977B1 (ko) * | 2017-07-18 | 2018-07-25 | 한국생명공학연구원 | 사계성 또는 일계성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 |
| US11214814B2 (en) | 2019-03-05 | 2022-01-04 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Transformed plant and flowering regulation method using flowering-inducing gene |
| US11814634B2 (en) | 2019-03-05 | 2023-11-14 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Transformed plant and flowering regulation method using flowering-inducing gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2502496B1 (en) | 2015-03-18 |
| ES2534359T3 (es) | 2015-04-21 |
| EP2502496A4 (en) | 2013-03-20 |
| EP2502496A1 (en) | 2012-09-26 |
| WO2011059051A1 (ja) | 2011-05-19 |
| JPWO2011059051A1 (ja) | 2013-04-04 |
| US20120283102A1 (en) | 2012-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5679219B2 (ja) | 開花誘導剤 | |
| CN110637087B (zh) | 一个表观遗传操作植物表型可塑性性状的方法 | |
| US7888554B2 (en) | Plants having improved tolerance to various types of environmental stress, their production, and polyamine metabolism-related enzyme genes | |
| US20060225154A1 (en) | Method for increasing expression of stress defense genes | |
| US8455713B2 (en) | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same | |
| JPH0975093A (ja) | ワタ繊維組織特異的遺伝子 | |
| CN114958903B (zh) | 一种增强大豆香味的方法 | |
| KR102511146B1 (ko) | 지잔티아 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의 용도 | |
| WO2024174841A1 (zh) | 一种创制豆腥味降低的大豆的方法 | |
| CN108220304B (zh) | 小麦条锈菌pstg_06371基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法 | |
| CN108517324A (zh) | 一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因 | |
| CN107827963B (zh) | 拟南芥idd14基因在提升植物干旱胁迫耐性中的应用 | |
| KR100860199B1 (ko) | ＭＡＤＳ―Ｂｏｘ 유전자를 이용한 수형이 변형된과수작물의 제조 | |
| CN104073512B (zh) | 一种调控植物内源乙烯含量的方法 | |
| CN115433264A (zh) | 一种水稻抗病基因lbrw1、重组载体、重组工程菌及应用 | |
| NL2031044B1 (en) | Regulatory gene for floral organ development of chinese cymbidium, and encoded protein and use thereof | |
| CN115704036B (zh) | 一种烟草NtDSR1基因及其应用 | |
| CN115704035B (zh) | 一种烟草NtDSR2基因及其应用 | |
| CN111118029B (zh) | 一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用 | |
| CN108004251B (zh) | 小麦条锈菌pstg_11438基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法 | |
| Passey et al. | Genetic modification to improve fruit quality: benefits for the grower, the consumer and the environment | |
| JP2004180588A (ja) | 環境ストレス抵抗性を改良した植物及びその作出方法 | |
| AU2007237226B2 (en) | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same | |
| CN116004646A (zh) | 一种烟草NtSWEET11基因及其应用 | |
| CN118421645A (zh) | 转录因子PbrCAMTA2及其调控梨果实成熟期的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130920 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141021 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141107 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141216 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141224 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5679219 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |