KR20170120155A

KR20170120155A - 항-인간 pd-1 단일클론 항체의 결정

Info

Publication number: KR20170120155A
Application number: KR1020177026777A
Authority: KR
Inventors: 파울 라이헤르트; 위니프레드 더블유. 프로시스; 지오반나 스카핀; 샤오위 양; 라메쉬 카시; 코리 스트릭랜드
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2017-10-30
Also published as: BR112017016434A8; US11014986B2; CN107249624A; CA2975623A1; AR103726A1; TW201639886A; RU2017133449A; EP3261663A1; BR112017016434A2; TWI714552B; EP3261663A4; AU2022200142A1; WO2016137850A1; AU2016223047A1; CN107249624B; MX2017011003A; JP2018510142A; KR102622285B1; JP6999419B2; RU2017133449A3

Abstract

펨브롤리주맙 및 구조적으로 유사한 항-PD-1 단일클론 항체의 결정, 뿐만 아니라 그러한 결정의 제조 방법, 및 예컨대 암의 치료에서 그러한 항체 결정을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 본 발명은 펨브롤리주맙 결정 및 펨브롤리주맙 결정의 제조 방법을 제공함으로써 이러한 필요 및 그 이상을 만족시킨다. 본 발명의 방법의 한 실시양태는 X-선 회절에 적합한 결정을 생성하고, 본원의 발명자들은 그러한 결정을 2.3 A 분해능으로 펨브롤리주맙의 3차원 구조를 밝히는데 사용하였다.

Description

항-인간 PD-1 단일클론 항체의 결정

본 발명은 일반적으로 단일클론 항체의 결정질 형태에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 그의 구조적 변이체의 결정, 그러한 항체 결정을 포함하는 제약 조성물, 및 암의 치료에서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

많은 종양은 종양에 대한 내인성 면역 반응을 일으키는 항원을 생산한다. 그러나, 이러한 반응은 종종 효과가 없는데 종양 세포가 국소적 면역 억제를 일으키는 핵심적인 면역-체크포인트를 활성화할 수 있기 때문이다. 이러한 면역 체크포인트 중 하나는 인간 세포 표면 수용체 PD-1 (예정 사멸-1 또는 예정 세포 사멸-1)이고, 활성화된 T 세포의 표면에 발현되는 억제성 신호 수용체이다. 그것의 리간드, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나의 결합으로 PD-1 억제성 신호가 활성화되면 그 결과 종양 세포에 대한 T-세포-매개 면역 반응이 억제된다. 종양에 대한 항종양 면역 반응의 이러한 PD-1 경로-매개 억제에 대응하기 위해서, 몇몇 회사는 인간 PD-1에 결합하고 PD-1 및 그의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 단일클론 항체 (mAb)를 개발하고 있다.

이러한 항-PD-1 mAb 중 하나는 펨브롤리주맙이고, 이는 이필리무맙(ipilimumab) 및, BRAF V600 돌연변이 양성인 경우, BRAF 억제제 이후에 절제불가 또는 전이성 흑색종 및 질병 진행을 갖는 환자의 치료에 대해 미국에서 승인된 인간화 IgG4 mAb이다. 무수한 다른 암 적응증의 치료에서의 펨브롤리주맙의 효능 및 안전성이 조사되고 있다.

펨브롤리주맙은 현재 정맥내 (IV) 주입을 위해 제형화되고, 25 mg/ml의 mAb를 포함하는 펨브롤리주맙의 동결건조 및 용액 제형물은 WO2012/135408에 기재되어 있다. 그러나, 피하로 투여하기 위해 고안된 고농도 제형물은 바람직한 대안일 수 있는데, 부분적으로 그것이 환자가 펨브롤리주맙을 자가-투여할 수 있게 만들 수 있기 때문이다.

치료 항체는 종래에 동결건조 형태로 또는 용액으로 제조되었다. 동결건조 형태는 향상된 장기간 안정성을 보일 수 있지만, 사용하기 전에 재구성을 필요로 하고, 이는 그들을 자가-투여에 이상적이지 않게 만든다. 용액 제형물은 재구성을 필요로 하지 않지만, 감소된 안정성을 겪을 수 있고 일반적으로 사용 전 저온 저장을 필요로 한다. 동결건조 및 용액 제형물 모두 피하 투여에 의한 고용량 전달을 허용하기 위한 충분히 높은 농도를 제공하지 못할 수 있는데, 1.2 ml가 피하 투여에 바람직한 최대 부피이기 때문이다 (문헌 [Yang, M.X. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci .(USA) 100:6934-1939 (2003)]). 그러나, 달성할 수 있는 경우, 항체의 고농도 용액 제형물은 또한 용액에서 이탈되기 쉽거나, 또는 예컨대 피하 투여, 특히 자가-투여에 요구되는 바와 같이 좁은 게이지 바늘을 통해 전달되기에 너무 점성이 있을 수 있다.

고농도 항체 제형을 달성하기 위한 한 제안된 한 접근법은 항체 결정으로 제형물을 제조하는 것이고, 예컨대, 상기 Yang et al.; 미국 특허 No. 7,833,525 및 WO2012/135035를 참조하라. 항체 결정의 치료 항체 조성물 제조에 대한 근거는 실온에서 액체 용액 내 단백질 결정의 개선된 안정성, 고농도 항체 용액의 더 낮은 점도 및 요망되는 조절되는 방출 특성을 위한 상이한 형태를 달성하기 위해 결정화 조건을 조작하는 능력을 포함한다 (예컨대, 상기 Yang et al. 및 문헌 [Basu, S.K., et al., Expert Opin. Biol. Thera. 4:301-317 (2004)])을 참조하라).

항체는 중쇄 및 경쇄의 가요성으로 인해 특히 결정화하기 어려운 것으로 여겨진다. 지난 30 년에 걸쳐 온전한 항체의 결정화에 대한 수많은 보고가 있었지만, Fab 아포(apo) 또는 복합체 구조는 800 개를 넘는 구조가 저장된 것과 대조적으로, 오직 4 개의 구조만이 RCSB 단백질 데이터뱅크에 저장되었다. 앨투스 파마수티컬즈(Altus Pharmaceuticals)의 연구자들은 3 개의 상업적으로 이용가능한 단일클론 항체: 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab) 및 인플릭시맙(infliximab)을 결정화하는 결정화 방법을 최초로 기술하였다 (WO02/072636). 다른 공개된 특허 출원은 항-IL-13 mAb (WO2005/121177), 항-TNF 알파 mAb (WO2008/057240), 항-스클레로스틴(sclerostin) mAb (WO2012/135035) 및 항-IL-23 mAb (WO2014/004436)의 결정의 제조 방법을 기술한다. 항체의 결정화 방법의 이러한 예시에도 불구하고, 특정 항체에 대해 적합한 결정화 조건을 확인하는 것은 여전히 실증적 활동이고, 어떤 결정화 조건이 그 항체의 결정을 생산할 것인지를 신뢰성있게 예측하기 위해 관심있는 특정 항체에 적용될 수 있는 일반적인 규칙은 없다는 단백질 결정화 기술분야에서의 일반적인 통념이 있다.

따라서 펨브롤리주맙의 결정질 형태의 제조 방법에 대한 요구가 존재한다. 그러한 결정은 x-선 회절 분석에 의해 펨브롤리주맙의 구조를 밝히는데 및 암을 치료하기 위해 펨브롤리주맙의 개선된 제약 조성물을 제조하는데 유용할 수 있다.

본 발명은 펨브롤리주맙 결정 및 펨브롤리주맙 결정의 제조 방법을 제공함으로써 이러한 필요 및 그 이상을 만족시킨다. 본 발명의 방법의 한 실시양태는 X-선 회절에 적합한 결정을 생성하고, 본원의 발명자들은 그러한 결정을 2.3 Å 분해능으로 펨브롤리주맙의 3차원 구조를 밝히는데 사용하였다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 항-PD-1 항체의 결정을 제공한다. 항체는 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체이다. 실시양태에서, 결정은 항체 및 용매를 포함한다. 실시양태에서, 결정의 길이는 임의의 다음 범위 사이에 있다: 1 내지 200 마이크로미터, 1 내지 100 마이크로미터, 1 내지 20 마이크로미터, 5 내지 100 마이크로미터, 5 내지 50 마이크로미터 또는 5 내지 20 마이크로미터. 실시양태에서, 항체 결정은 a = 63.5 내지 78.9 Å, b = 110.2 내지 112.2 Å, c = 262.5 내지 306 Å, α =90, β =90, γ = 90°의 단위 세포 크기 및 P2₁2₁2₁의 공간군을 특징으로 한다_.실시양태에서, 항체 결정은 3.5 Å 또는 더 나은 분해능으로, 즉, 3.5 Å 미만에서 X-선을 회절시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항-PD-1 단일클론 항체 (mAb)의 결정의 제조 방법을 제공하고, 여기서 mAb는 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체이다. 방법은 (a) 결정 형성 (결정화)에 충분한 시간 동안 25 ℃ 이상 및 50 ℃ 이하의 온도에서 mAb의 용액 (항체 용액)을 침전제 용액에 노출시키는 단계, 및 (b) 결정을 회수하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 노출시키는 단계는 약 40 ℃ 내지 약 45 ℃ 이하의 온도에서 수행된다. 한 실시양태에서, 방법에 사용된 침전제 용액은 약 4.0-5.0의 pH를 갖고 1.0 M 내지 2.5 M 인산 2수소 암모늄 (ADP)을 포함한다. 실시양태에서, 침전제 용액은 또한 침전제 용액의 pH를 pH 4.0 내지 5.0으로 조절하기에 충분한 양의 완충제를 포함한다. 실시양태에서, 완충제는 트리스-HCl 또는 이염기 인산 암모늄이다. 실시양태에서, 항체 용액은 항-PD-1 mAb를 3 내지 100 mg/ml, 10 내지 90 mg/ml, 20 내지 80 mg/ml, 30 내지 70 mg/ml, 40 내지 60 mg/ml 또는 약 50 mg/ml의 농도로 포함한다. 실시양태에서, 항체는 적어도 3, 4 또는 5 일 중 어느 하나 동안 수행된다. 실시양태에서, 항체 용액은 10 mM 히스티딘 (pH 5.6)을 포함한다. 실시양태에서, 항체 용액은 폴리소르베이트를 약 0.01 %의 최대 농도로 더 포함한다. 실시양태에서, 노출시키는 단계는 행잉 드롭(hanging drop) 증기 확산법, 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산법, 투석, 미소배치 및 배치로 구성되는 군에서 선택된 결정화 기술을 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 노출시키는 단계는 동일한 부피의 항체 용액 및 침전제 용액을 혼합하여 결정화 혼합물을 형성하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항-PD-1 단일클론 항체(mAb)를 포함하는 용액에서 항-PD-1 mAb를 결정화하는 방법을 제공하고, 여기서 항체는 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체이다. 방법은 (a) 항-PD-1 mAb 용액과 침전제 용액 및 항-PD-1 mAb의 종자 결정을 합하여 시딩된 결정화 혼합물을 생성하는 단계; (b) 시딩된 결정화 혼합물을 20 ℃ 이상 및 40 ℃ 이하의 온도에서 인큐베이션 하는 단계; 및 (c) 결정을 회수하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 인큐베이션 온도는 약 30 ℃이고 침전제 용액은 (1) 20 % 폴리에틸렌 글리콜 4000 (PEG 4K) 및 20 % 이소프로판올; (2) 18 % 폴리에틸렌 글리콜 10000 (PEG 10K), 20 % 글리세롤, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.5); 및 (3) 2.0 M 인산 2수소 암모늄 및 100 mM 트리스-HCl으로 구성되는 군에서 선택된 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 인큐베이션 온도는 약 22 ℃이고 침전제 용액은 (1) 25 % PEG 4K, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.5) 및 100 mM CaCl₂ 및 (2) 1.26 M 암모늄 설페이트, 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 및 0.2 M NaCl으로 구성되는 군에서 선택된 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종자 결정은 4.0 내지 5.0의 pH를 갖고 1.0 내지 2.5 M ADP를 포함하는 침전제 용액에서 약 30 ℃의 온도에서 결정화에 의해 제조된 항-PD-1 mAb의 결정의 종자 스톡 유래이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 항체의 결정, 및 (b) 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 실시양태에서, 부형제는 결정 캡슐화, 결정 매립 및 결정을 안정하게 유지 중에서 선택된 적어도 하나의 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 조성물 내 결정의 평균 길이는 1 내지 20 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터, 5 내지 50 마이크로미터 또는 5 내지 100 마이크로미터이다. 실시양태에서, 조성물은 액체 매질에 현탁된 항-PD-1 mAb 결정을 포함한다. 실시양태에서, 조성물 내 항-PD-1 mAb 농도는 적어도 약 50 mg/ml 및 약 250 mg/ml 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 결정의 액체 현탁액을 탈수시키거나 또는 동결건조시켜 제조된 고체이다. 실시양태에서, 항-PD-1 mAb의 생물학적 활성의 적어도 95 %, 97 % 또는 99 %가 실온에서 (예컨대 20 ℃ - 25 ℃) 적어도 1 개월 동안 액체 또는 고체 제약 조성물의 저장 후 존재한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 상기 제약 조성물을 포함하는 용기를 제공한다. 용기는 단일 용량 바이알, 복수용량 바이알, 사전충전 주사기 또는 자가주사 장치일 수 있다. 실시양태에서, 용기는 약 200 내지 약 250 mg의 단일 용량의 항-PD-1 mAb, 즉, 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 상기 제약 조성물을 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암에 대해 인간 대상을 치료하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 암은 고형 종양, 예컨대, 방광암, 유방암, 투명 세포 콩팥암, 머리/목 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암, 소세포 폐암 (SCLC), 또는 삼중 음성 유방암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 헴(Heme) 악성, 예컨대, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수형성이상 증후군 (MDS), 비호지킨 림프종 (NHL), 또는 소림프구 림프종 (SLL)이다. 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 200 mg/ml의 펨브롤리주맙을 포함하고 피하 투여된다. 실시양태에서, 제약 조성물의 최초 투여 전 대상에서 제거된 암의 조직 절편은 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 모두의 발현에 대해 양성 반응을 보였다. 실시양태에서, 조직 절편에서 적어도 50 %의 종양 세포가 면역조직화학적 (IHC) 분석에 의해 PD-L1 발현에 대한 양성 반응을 보였다.

특허 또는 출원 신청서는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 출원 또는 특허 출원 공보의 복사본은 요청 및 필요한 비용 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 본 명세서에 기재된 펨브롤리주맙에 대한 및 펨브롤리주맙 변이체에 대한 경쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열식별번호(SEQ ID NO):1-3).
도 2는 본 명세서에 기재된 펨브롤리주맙에 대한 및 펨브롤리주맙 변이체에 대한 중쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열식별번호:4-6).
도 3은 펨브롤리주맙에 대한 중쇄 (도 3a) 및 경쇄 (도 3b)의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열식별번호. 각각 7 및 8).
도 4는 2.0 M 인산 2수소 암모늄, 100 mM 트리스-HCl의 침전제 용액을 사용하여 30 ℃에서 증기 확산에 의해 수득된, 펨브롤리주맙 결정질 현탁액 내 결정의 현미경사진을 나타낸다. 100X 배율의 현미경사진은 SONICC 영상화 시스템을 사용하여 3 일 후에 촬영하였고, 도 4a는 SHG 모드를 사용하여 생성하였고 도 4b는 UV-TPEF 모드를 사용하여 생성하였다. 실시예 1 참조.
도 5는 0.02 % 폴리소르베이트 80의 존재 (도 5a) 또는 부존재 (도 5b) 하 2.0 M 인산 2수소 암모늄, 100 mM 트리스의 침전제 용액을 사용하여 30 ℃에서 자유 계면 확산에 의해 수득된, 펨브롤리주맙 결정질 현탁액 내 결정의 현미경사진을 나타낸다. 100 X 배율의 현미경사진은 플루이다임(Fluidigm) 자동화 영상화 시스템을 사용하여 2 일 후에 촬영하였다. 실시예 2 참조.
도 6은 1.5 M 인산 2수소 암모늄, 100 mM 트리스-HCl의 침전제 용액을 사용하여 30 ℃에서 행잉 드롭 증기 확산에 의해 수득된, 펨브롤리주맙 결정질 현탁액 내 결정의 현미경사진을 나타낸다. 100 X 배율의 현미경사진은 니콘(Nikon) SMZ1500 입체 현미경 및 니콘 ES400 카메라 영상화 시스템을 사용하여 3 일 후에 촬영하였다. 실시예 4 참조.
도 7은 1.8 M 인산 2수소 암모늄, 120 mM 트리스-HCl의 침전제 용액을 사용하여 30 ℃에서 배치 결정화에 의해 수득된, 펨브롤리주맙 결정질 현탁액 내 결정의 현미경사진을 나타낸다. 실시예 5 참조. 100 X 배율의 현미경사진은, 니콘 SMZ1500 입체 현미경 및 니콘 ES400 카메라 영상화 시스템을 사용하여 5 일 후에 촬영하였다. 양쪽 화살표는 길이가 약 20 마이크로미터인 결정을 나타낸다.
도 8은 1.8 M 인산 2수소 암모늄, 100 mM 트리스-HCl을 침전제로 사용하여 30 ℃에서 행잉 드롭 확산 방법에 의해 수득된 결정의 X-선 회절 분석에 의해 해석한 펨브롤리주맙 3-차원 구조의 리본 다이어그램을 나타낸다. 실시예 7 참조. 리본 다이어그램은 2 개의 중쇄가 노란색 및 청록색으로, 2 개의 경쇄는 자홍색 (FAB-1) 및 초록색 (FAB-2)로 도 8a에 컬러로 나타나 있고, 동일한 리본 다이어그램이 도 8b에 회색 색조로 나타나 있다.
도 9는 1.9 M 인산 2수소 암모늄 및 0.09 M 인산 수소 암모늄을 침전제로 사용하여 30 ℃에서 증기 확산에 의해 수득된, 펨브롤리주맙 결정질 현탁액 내 결정의 현미경 사진을 나타낸다. 실시예 8 참조. 70X 배율의 현미경사진은 로크(Rock) 영상기 시스템 (포뮬라트릭스(Formulatrix), 베드포드(Bedford), 메사추세츠)을 사용하여 3 일 후에 촬영하였고, 양쪽 화살표는 20 마이크로미터의 거리를 나타낸다.
도 10은 실시예 13에 기재된 상이한 펨브롤리주맙 용액의 UPLC-SEC 특성화에 의해 생성된 플롯을 나타내고, 도 10a에는 결정화된 적이 없는 펨브롤리주맙, 도 10b에는 펨브롤리주맙 결정으로부터 가용화된 펨브롤리주맙이 나타나 있다.

I. 약어. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐 다음 약어가 사용될 것이다:

ADP 인산 2수소 암모늄

AHP 인산 수소 암모늄

CDR 상보성 결정 영역

CHO 중국 햄스터 난소

DFS 무병 생존

FR 기본틀 영역

IHC 면역조직화학 또는 면역조직화학적

NCBI 미국 국립 생물공학 정보 센터

NCI 미국 국립 암 연구소

PD 진행성 질환

PD-1 예정 사멸 1

PD-L1 예정 세포 사멸 1 리간드 1

PD-L2 예정 세포 사멸 1 리간드 2

PFS 무진행 생존

PR 부분 반응

OR 전체 반응

OS 전체 생존

Q2W 2 주 마다 1 용량

Q3W 3 주 마다 1 용량

QD 하루에 1 용량

RECIST 고형 종양에서의 반응 평가 기준

SD 안정 병변

VH 면역글로불린 중쇄 가변 영역

VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역

II. 정의

본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의된다. 본 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 다른 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.

첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 그의 상응하는 복수의 언급 대상을 포함한다.

"약"은 수치적으로 정의된 변수 (예컨대, 용액 내 성분의 농도)를 수식하기 위하여 사용된 경우 변수가 그 변수에 대해 언급된 수치 값의 10 % 초과 또는 미만으로 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 200 mg/ml의 특정된 항체를 포함하는 조성물은 180 mg/ml 내지 220 mg/ml 사이의 항체를 가질 수 있다. 유사하게, 약 30 ℃의 온도는 27 ℃ 내지 33 ℃ 사이의 임의의 온도를 의미한다.

"투여" 및 "처치"는 그것이 동물, 인간, 실험 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 제약, 치료, 진단 작용제 또는 조성물의 접촉을 지칭한다. "투여" 및 "처치"는 예컨대, 치료, 약동학, 진단, 연구, 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라 유체에 대한 시약의 접촉을 포함하고, 여기서 유체는 세포와 접촉한다. "투여" 및 "처치"는 또한, 예컨대, 세포의, 시약, 진단, 결합 조성물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한 시험관 내 및 세포 외 처치를 포함한다. 용어 "대상"은 임의의 생물, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유류 (예컨대, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 사량체를 지칭하고, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식의 주된 책임이 있는 약 100 내지 110 개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 반응기 기능에 주된 책임이 있는 불변 영역을 정의한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 온전한 항체는 2 개의 결합 부위를 가진다. 이관능 또는 2중특이 항체를 제외하고, 2 개의 결합 부위는 보통 동일하다.

일반적으로, 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리기도 하는, 3 개의 초가변 영역을 포함하고, 이는 상대적으로 보존된 기본틀 영역 (FR) 내에 위치한다. CDR은 보통 기본틀 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 만든다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두가 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 (즉 경쇄 가변 도메인에 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인에 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은, 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; 문헌 [Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75]; 문헌 [Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]; 문헌 [Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917] 또는 문헌 [Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의와 일치한다.

본 명세서에 사용된 인산 2수소 암모늄 (NH₄H₂PO4) 또는 ADP는 일염기 인산 암모늄, 모노-암모늄 포스페이트 및 prim-암모늄 포스페이트와 유의어이다.

본 명세서에 사용된 인산 수소 암모늄 ((NH₄)₂HPO₄) 또는 AHP는 이염기 인산 암모늄, 이암모늄 수소 포스페이트 및 이-암모늄 수소 포스페이트와 유의어이다.

용어 "암", "암의", 또는 "악성"은 조절되지 않는 세포 성장을 일반적으로 특징으로 하는 포유류의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예시는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종, 및 육종을 포함하지만, 이에 한정되지 아니한다. 그러한 암의 더 구체적인 예시는 편평 세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경아교종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발 골수종, 위장 (관) 암, 신장암, 난소암, 간암, 림프모구 백혈병, 림프구 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 콩팥암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 아교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장 암종, 및 머리 및 목 암을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 특히 바람직한 암은 시험된 조직 샘플에서의 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 모두의 상승된 발현을 특징으로 하는 것들을 포함한다.

"농도"는, 본 발명의 결정질 항체 현탁액을 언급하며 사용되는 경우, 주어진 거시적 단위 부피의 용액에 존재하는 항체 (예컨대, 펨브롤리주맙)의 양을 지칭한다. 용어 농도는 통상적인 용액과 비교할 때, 현탁액의 고유한 이질성에도 불구하고, 그것의 관례적인 의미로 사용된다. 결정질 현탁액 내 항체의 농도는 항체가 결정질 형태로 있지 않은 동등한 샘플의 농도와 같다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 해당 기술분야의 기술자에게 알려져 있고, 심지어 폴리펩티드의 핵심적 영역에서 생성된 분자의 생물학적 활성을 바꾸지 않고 일반적으로 만들어질 수 있다고 알려진 아미노산의 치환을 지칭한다. 그러한 예시적 치환은 바람직하게는 하기 표 1에 제시된 것과 일치하게 만들어진다:

<표 1>

예시적인 보존적 아미노산 치환

본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된, "필수적으로 구성되는" 및 "필수적으로 구성하는" 또는 "필수적으로 구성되고"와 같은 변형은, 임의의 나열된 요소 또는 요소의 집단의 포함, 및 특정된 투여 요법, 방법, 또는 조성물의 기본적이거나 또는 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않는, 나열된 요소와 유사하거나 상이한 본질을 갖는 다른 요소의 임의의 포함을 나타낸다. 비제한적인 예시로서, 항체 결정 및 특정 제약상 허용되는 부형제로 필수적으로 구성되는 제약 조성물은 제약 조성물의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 다른 부형제를 또한 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "항-PD-1 mAb 결정" 또는 "결정질 항-PD-1 mAb"는 3 차원에서 주기적으로 반복되는 격자 구조로 나열된 항체를 함유하는 결정을 지칭한다. 대조적으로, mAb의 고체, 무정형 형태, 예컨대, 용액에 용해된 mAb를 동결건조하여 생성된 것과 같은 것은, 결정질 항체 형태의 전형적인 굴절률 및 복굴절과 같은 광학적 특성을 보이지 않는다.

본 명세서에서 및 투석에 기초한 결정화 방법에 관하여 사용된, "투석 용액"은 본 발명의 결정질 항체의 형성을 추진하기 위해 펨브롤리주맙 용액 ("항체 용액")이 이에 대해 투석되는 용액을 지칭한다. "투석유물(retentate)"은 회수된 항체의 결정을 포함할 수 있는 투석 후 항체 용액을 지칭한다. 항체 용액 / 투석유물은 투석 막의 한쪽 편에 있고, 투석 용액은 반대 편에 있다.

용어 "미크론" 및 "마이크로미터"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고 각각은 1 미터의 1/1000000을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "단일클론 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 동종인 항체의 집단을 지칭하고, 즉, 집단을 구성하는 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 잠재적인 자연 발생적 돌연변이를 제외하고 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 전통적인 (다클론성) 항체 제제는 일반적으로 그들의 가변 도메인, 특히 그들의 CDR의 아미노산 서열이 상이한 다수의 다른 항체를 포함하고, 이들은 종종 상이한 에피토프에 특이적이다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 동종 집단의 항체로부터 얻는 항체의 특징을 지칭하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용된 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 No. 4,816,567 참조)에 의해 만들어질 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 문헌 [Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리에서 단리될 수 있다. 또한 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol. 116:731] 참조.

본 명세서에 사용된 "PD-L1" 또는 "PD-L2" 발현은 세포 표면 상의 지정된 PD-L 단백질이 또는 세포 또는 조직 내 지정된 PD-L mRNA가 임의의 검출가능한 수준으로 발현되는 것을 의미한다. PD-L 단백질 발현은 유동 세포계측에 의해 또는 종양 조직 절편의 IHC 분석에서 진단적 PD-L 항체로 검출될 수 있다. 별법으로, 종양 세포에 의한 PD-L 단백질 발현은 원하는 PD-L 표적, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2에 특이적으로 결합하는 결합제 (예컨대, 항체 단편, 어피바디(affibody) 등)를 사용하여, PET 영상법에 의해 검출될 수 있다. PD-L mRNA 발현을 검출하고 측정하기 위한 기술은 RT-PCR 및 실시간 정량적 RT-PCR을 포함한다.

종양 조직 절편의 IHC 분석에서 PD-L1 단백질 발현을 정량화하기 위한 여러 접근법이 기술되었다. 예컨대, 문헌 [Thompson, R. H., et al., PNAS 101 (49); 17174-17179 (2004)]; 문헌 [Thompson, R. H. et al., Cancer Res. 66:3381-3385 (2006)]; 문헌 [Gadiot, J., et al., Cancer 117:2192-2201 (2011)]; 문헌 [Taube, J. M. et al., Sci Transl Med 4, 127ra37 (2012)]; 및 문헌 [Toplian, S. L. et al., New Eng. J Med. 366 (26): 2443-2454 (2012)] 참조.

한 접근법은 PD-L1 발현에 양성 또는 음성의 단순한 2원 종점을 이용하고, 양성 결과는 세포-표면 막 염색의 조직학적 증거를 보이는 종양 세포의 백분율에 관하여 정의된다. 종양 조직 절편은 총 종양 세포의 적어도 1 %, 및 바람직하게는 5 %인 PD-L1 발현에 대해 양성으로 계수된다.

또 다른 접근법에서, 종양 조직 절편 내 PD-L1 발현은 종양 세포에서뿐만 아니라 주로 림프구를 포함하는, 침윤 면역 세포에서도 정량화된다. 막 염색을 나타내는 종양 세포 및 침윤 면역 세포의 백분율은 < 5 %, 5 내지 9 %, 그런 다음 100 %까지 10 % 증분으로 개별적으로 정량화된다. 종양 세포의 경우, PD-L1 발현은 스코어가 < 5 % 스코어이면 음성으로, 및 스코어가 ≥ 5 %이면 양성으로 계수된다. 면역 침윤에서의 PD-L1 발현은 보정 염증 스코어 (AIS)라고 불리는 반-정량적 측정으로 보고되고, 이는 막 염색 세포의 퍼센트와, 없음 (0), 경도 (스코어 1, 희귀 림프구), 중등도 (스코어 2, 림프조직구성 군체에 의한 종양의 집중적 침윤), 또는 고도 (스코어 3, 광범위 침윤)로 등급이 나뉘는 침윤의 강도를 곱하여 결정된다. 종양 조직 절편은 AIS가 ≥ 5인 경우 면역 침윤에 의한 PD-L1 발현에 양성으로 계수된다.

PD-L mRNA 발현의 수준은 정량적 RT-PCR에 빈번하게 사용되는 하나 이상의 기준 유전자, 예를 들면 유비퀴틴 C의 mRNA 발현 수준과 비교될 수 있다.

일부 실시양태에서, 악성 세포에 의한 및/또는 종양 내 침윤 면역 세포에 의한 PD-L1 발현 (단백질 및/또는 mRNA) 수준은 적절한 대조군에 의한 PD-L1 발현 (단백질 및/또는 mRNA) 수준과 비교를 토대로 "과다발현된" 또는 "상승된" 것으로 결정되었다. 예를 들어, 대조군 PD-L1 단백질 또는 mRNA 발현 수준은 동일 유형의 비악성 세포에서 또는 대응 정상 조직의 절편에서 정량화된 수준일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 종양 샘플에서의 PD-L1 발현은 샘플 내 PD-L1 단백질 (및/또는 PD-L1 mRNA)이 대조군에서보다 적어도 10 %, 20 %, 또는 30 % 큰 경우, 상승된 것으로 결정된다.

본 명세서에 사용된, "펨브롤리주맙"은 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)]에 기재된 구조를 갖고 머크 샤프 & 돔 코프. (Merck Sharp & Dohme Corp.) (MSD), MSD를 관리하거나 그에 의해 관리되는 회사, 또는 그의 이익의 승계자 (개별적으로 및 집합적으로, "MSD")에 의해, 또는 대신하여 제조되는 IgG4 단일클론 항체를 의미한다. 펨브롤리주맙의 각 경쇄는 도 1에 나타난 3 개의 CDR 서열 (CDRL1로서 서열식별번호:1, CDRL2로서 서열식별번호:2 및 CDRL3로서 서열식별번호:3)을 포함하고 펨브롤리주맙의 각 중쇄는 도 2에 나타난 CDR 서열 (CDRH1로서 서열식별번호:4, CDRH2로서 서열식별번호:5 및 CDRH3로서 서열식별번호:6)을 포함한다. 펨브롤리주맙의 전체 길이 중쇄 및 경쇄는 도 3에 나타난 중쇄 및 경쇄 서열 (각각 서열식별번호:7 및 서열식별번호:8)을 포함한다.

펨브롤리주맙 바이오시밀러는 MSD를 제외한 기업에 의해 제조되고 펨브롤리주맙 바이오시밀러로서 판매하는데 대해 임의의 나라에서 관리 기관에 의해 승인된 생물학적 제품을 의미한다. 실시양태에서, 펨브롤리주맙 바이오시밀러는 약물 물질로서의 펨브롤리주맙 변이체를 포함한다. 실시양태에서, 펨브롤리주맙 바이오시밀러는 펨브롤리주맙과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

본 명세서에 사용된, "펨브롤리주맙 변이체"는 경쇄 CDR 외부에 위치한 위치에서의 3, 2 또는 1 개의 보존적 아미노산 치환 및 중쇄 CDR의 외부에 위치한 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 펨브롤리주맙의 서열 (각각 서열식별번호:7 및 8)과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단일클론 항체를 의미하고, 예컨대, 변이체 위치는 기본틀 영역 또는 불변 영역에 위치한다. 다시 말해, 펨브롤리주맙 및 펨브롤리주맙 변이체는 동일한 CDR 서열을 갖지만, 그들의 전체 길이 경쇄 및 중쇄 서열에서 각각 3 개 또는 6 개 이하의 다른 위치에서 보존적 아미노산 치환을 갖기 때문에 서로 다르다. 펨브롤리주맙 변이체는 다음 특성에 관하여 펨브롤리주맙과 실질적으로 동일하다: PD-1에 대한 결합 친화력 및 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2 각각의 결합을 차단하는 능력.

"침전제"는 농축 용액에서 폴리펩티드, 예를 들면 항체의 용해도를 감소시키는 화합물이다. 배치 결정화 방법에서, 침전제는 "침전제 용액"에 포함되고 벌크 투석 방법에서 침전제는 "투석 용액"에 포함된다. 침전제는 폴리펩티드 분자 주위에 에너지적으로 불리한 침전제-고갈 층을 형성하여 결정화를 유도한다. 이러한 고갈 층의 상대적인 양을 최소화하기 위하여, 폴리펩티드는 회합 및, 궁극적으로, 결정을 형성한다. 이러한 과정은 문헌 [Weber (1991) Advances in Protein Chemistry 41:1]에서 설명되었다. 다양한 침전제가 해당 기술분야에 알려져 있고 암모늄 설페이트, 에탄올, 이소프로판올, 1,2 프로판디올, 3-에틸-2,4 펜탄디올; 및 다수의 폴리글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 PEG 300 및 PEG 400)을 포함한다. 침전제 외에, 다른 물질이 때때로 폴리펩티드 침전제 용액에 첨가된다. 이러한 것은 용액의 pH (및 따라서 펩티드 상의 표면 전하)를 조절하기 위한 완충제, 예를 들면 트리스 또는 HEPES, 및 폴리펩티드의 용해도를 감소시키기 위한 염, 예를 들면 염화 나트륨, 염화 리튬 및 소듐 시트레이트를 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 단독으로 또는 추가적 치료제와 병용하여 세포, 조직, 또는 대상에게 투여되었을 때 암을 치료하는데 효과적인 항-PD-1 항체의 양을 지칭한다. 단독으로 투여된 항-PD-1 항체에 적용되는 경우, 치료적 유효량은 그 성분 단독을 지칭한다. 병용에 적용되는 경우, 치료적 유효량은 연속적으로 또는 동시에 병용 투여되었는지에 상관 없이 치료적 효과를 가져오는 항-PD-1 항체 및 추가적 치료제의 합한 양을 지칭한다.

"조직 절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예컨대, 정상 조직의 또는 종양의 샘플로부터 절개된 조직의 얇은 조각을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"은 예를 들면 암 세포 수 감소, 종양 크기 감소, 말초 기관으로의 암세포 침윤 속도 감소, 또는 종양 전이 또는 종양 성장 속도 감소와 같은 적어도 하나의 긍정적인 치료 효과를 성취하기 위해, 본 발명의 제약 조성물을 암에 걸린, 또는 암으로 진단 받은 대상에게 투여하는 것을 의미한다. 암에서의 긍정적인 치료 효과는 수많은 방법으로 측정될 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)] 참조). 예를 들어, 종양 성장 억제에 관하여, NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42 %는 항종양 활성의 최소 수준이다. T/C < 10 %는 높은 항종양 활성 수준으로 간주되고, T/C (%) = 치료된 것의 중간 종양 부피/대조군의 중간 종양 부피 × 100이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조합에 의해 성취된 치료는 PR, CR, OR, PFS, DFS 및 OS 중 임의의 것이다. "종양 진행까지의 시간"이라고도 지칭되는 PFS는 치료 중 및 치료 후에 암이 성장하지 않는 시간의 길이를 나타내고, 환자가 CR 또는 PR을 경험한 시간의 양뿐만 아니라, 환자가 SD를 경험한 시간의 양을 포함한다. DFS는 치료 중 및 치료 후에 환자가 병이 없는 상태를 유지하는 시간의 길이를 지칭한다. OS는 실험 받은 적이 없는 또는 치료받지 않은 개체 또는 환자와 비교하여 기대 수명의 연장을 지칭한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조합에 대한 반응은 RECIST 1.1 반응 기준을 사용하여 평가된 PR, CR, PFS, DFS, OR 또는 OS 중 임의의 것이다. 암 환자를 치료하는데 효과적인 본 발명의 조합에 대한 치료 요법은 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 및 대상에게서 항암 반응을 이끌어내는 요법의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 임의의 양태의 실시양태가 모든 대상에서 긍정적인 치료 효과를 달성하는데 효과적이지 않을 수 있지만, 스투던트 t-검정 (Student's t-test), 카이(chi)² 검정, 만(Mann) 및 휘트니(Whitney)에 따른 U-검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 (H-검정), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra)-검정 및 윌콕슨(Wilcoxon)-검정과 같은 해당 기술분야에 공지된 임의의 통계 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의한 수의 대상에서 그렇게 해야 한다.

본 명세서에 사용된 "트리스" (2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올)는 TRIS, 트리스 염기, 트리즈마(Trizma), 트리스아민(Trisamine), THAM, 트로메타민, 트로메타몰, 트로메탄, 및 트리사미놀과 유의어이다.

"종양"은 그것이 암으로 진단되거나, 또는 암에 걸린 것으로 의심되는 대상에게 적용되는 때, 임의의 크기의 악성 또는 잠재적으로 악성인 신생물 또는 조직 덩어리를 지칭하고, 원발성 종양 및 2차 신생물을 포함한다. 고형 종양은 통상적으로 낭 또는 액체 구역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 덩어리이다. 고형 종양의 여러 유형은 이들을 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다. 고형 종양의 예시는 육종, 암종, 및 림프종이다. 백혈병 (혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (국립 암 연구소, 암 용어 사전).

"종양 부담"은 또한 "종양 부하"로 지칭되고, 신체 전체에 걸쳐 분포된 종양 물질의 총량을 지칭한다. 종양 부담은 림프절 및 골수를 비롯하여, 신체 전체에 걸친 암 세포의 총 개수 또는 종양(들)의 총 크기를 지칭한다. 종양 부담은 해당 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 예컨대 대상으로부터 제거시, 예컨대, 캘리퍼를 사용하거나, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예컨대, 초음파, 골 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

용어 "종양 크기"는 종양의 길이 및 너비로서 측정될 수 있는 종양의 총 크기를 지칭한다. 종양 크기는 해당 기술분야에 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 예컨대 대상으로부터 제거시, 예컨대, 캘리퍼를 사용하거나, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예컨대, 골 스캔, 초음파, CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

III. 항체 결정화

본 발명은, 부분적으로, 펨브롤리주맙의 결정화 조건의 식별을 기초로 한다. 결정화 조건은 (1) 높은 염 농도 (즉, 1.0 M 내지 2.5 M 또는 1.5 M 내지 2.0 M의 ADP)를 포함하고 산성 pH (즉, 4.0 내지 5.0, 4.2 내지 4.8, 4.4 내지 4.6 또는 4.5 중 임의의 pH)를 갖는 침전제 용액; 및 (2) 높은 온도 (즉, 적어도 25 ℃ 및 50 ℃까지)의 고유한 조합을 포함한다. 실시양태에서, 침전제 용액에 완충제를 포함하여 pH를 요구되는 범위 내로 유지할 수 있다. 적합한 완충제는 예컨대, 트리스-HCl, 인산 수소 암모늄, 히스티딘 및 암모늄 히드록시드를 포함한다. 침전제 용액의 pH는 바람직하게는 결정화가 수행될 온도에 대해 결정되고, 한 실시양태에서 온도는 27 ℃ 내지 약 30 ℃이다. 본 발명의 결정화 조건은 여러 결정화 기술과 상용되고, 결정의 의도된 용도에 따라 1 내지 20 마이크로미터 및 5 내지 100 마이크로미터를 비롯하여 다양한 길이의 항-PD-1 mAb의 결정질 형태, 뿐만 아니라 저분해능 (예컨대, 3.5 Å) 또는 고분해능 (예컨대, 2.3 Å)을 갖는 결정을 만들 수 있다. 다양한 회절 특성을 포함하여, 3.5 회절 분해능보다 약하게.

단백질 결정화의 다양한 방법이 알려져 있다. 문헌 [Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339]; 문헌 [McPherson (1990) Eur . J. Biochem. 189:1]. 그러한 기술은 행잉 드롭 증기 확산 (McPherson (1976) J. Biol . Chem . 251:6300), 시팅 드롭 증기 확산, 마이크로배치 및 투석을 포함한다.

행잉 드롭 및 시팅 드롭 증기 확산 둘 모두가 정제된 단백질, 완충제, 및 침전제를 함유하는 소적을 수반하고 비슷한 완충제 및 침전제를 더 높은 농도로 함유하는 더 큰 저장조와 평형을 이룰 수 있게 한다. 초기에, 단백질 용액의 소적은 결정화에 불충분한 농도의 침전제를 함유하지만, 물이 방울에서 증발하고 저장조로 이동함에 따라서, 침전제 농도가 결정화에 최적인 수준으로 증가한다. 시스템이 평형에 있으므로, 이러한 최적 조건은 결정화가 완료될 때까지 유지된다. 행잉 드롭 방법은 시스템 내 단백질 용액 방울이 수직 배향된다는 점에서 시팅 드롭 방법과 차이가 있다.

마이크로배치 방법에서, 폴리펩티드는 과포화를 달성하기 위해 침전제와 혼합되고, 용기는 밀봉하여 결정이 나타날 때까지 놓아 둔다.

투석 방법에서, 폴리펩티드는 침전제를 함유하는 용액과 접촉하여 배치되는 투석 막의 한쪽 편에 보유된다. 막을 가로지르는 평형은 침전제 농도를 증가시켜서 폴리펩티드가 과포화 수준에 도달하게 만든다.

이러한 기술 중 일부가 본 발명의 펨브롤리주맙 결정을 제조하는데 사용되었고, 실시예 1-7에 보다 자세히 기술된 바와 같다. 고-처리량 실시예는 대규모 결정 제조보다 침전제 용액을 최적화하기 위한 스크리닝에 가장 적합하다.

본 발명의 결정화 방법에 사용된 항-PD-1 mAb 용액은 3 내지 100 mg/ml의 항체 농도를 가질 것이고 pH가 약 5.5인, 약 10 mM 히스티딘의 완충액에 편리하게 제공된다.

예컨대 치료 용도를 위한, 항-PD-1 mAb 결정의 대규모 생산에 관하여, 실시예 5 및 9-11은 배치 결정화 프로토콜을 요약한다. 실시양태에서, 용액으로부터 펨브롤리주맙을 결정화하기 위한 배치 방법은 1.8 내지 2.5 M ADP 중 적어도 10 mg/ml 펨브롤리주맙을 포함하고 pH가 약 4.4 내지 4.6인 결정화 혼합물을 제조하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 결정화 혼합물은 3 % 1,5 디-아미노 펜탄 디-히드로클로라이드; 3 % 이소프로판올 및 4 % 프로필렌 글리콜로 구성되는 군에서 선택된 첨가제를 더 포함한다. 결정은 원심분리, 투석, 및 중공사 횡류 여과를 비롯한 다양한 여과 방법과 같이, 해당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 배치 결정화 혼합물로부터 회수될 수 있다.

항-PD-1 mAb 결정은 결정 크기, 모양, 표면 형태학, 총 표면적 및 공극률과 같은 그들의 물리적 특성을 검사하거나 또는 특성화하는 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 그러한 분석 기술은, 예컨대, 전자 회절 및 고체 상태 핵 자기 공명 (ssNMR), 광학 현미경, 투과 전자 현미경, 주사 전자 현미경, 원자력 현미경, 및 다양한 광 산란 기술을 포함한다.

본 발명의 결정 내 항-PD-1 mAb의 생물학적 활성 및/또는 생물리학적 특성은 원하는 분석 기술에 적합한 완충액에 항체 결정을 "재용해하거나" 또는 가용화하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 가용화된 항-PD-1 mAb는 ELISA, 크기 배제 크로마토그래피, SDS PAGE, 및 동적 광 산란 중 하나 이상에 의해 분석될 수 있다. 본원의 발명자들은 본 명세서에 기재된 결정화 조건이 펨브롤리주맙의 및 구조적으로 유사한 항-PD-1 mAb, 즉, 펨브롤리주맙 변이체 및 펨브롤리주맙 바이오시밀러의 결정질 현탁액을 제조하기 위한 배치 결정화 기술에 유용할 것이라고 생각한다. 높은 결정화 온도가 사용되기 때문에 (적어도 25 ℃ 및 50 ℃까지), 본 발명자들은 이들 조건을 사용하여 제조된 결정질 현탁액, 및 그러한 결정을 포함하는 제약 조성물이 항-PD-1 mAb의 생물학적 활성 또는 안정성이 거의 또는 전혀 변하지 않으면서 적어도 1 개월의 기간 동안 실온에서 보관될 수 있다고 생각한다.

본 발명에 따라 제조된 항체 결정으로부터 가용화된 항-PD-1 mAb (펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러)는 허용가능한 허용오차 내에서 결정화 전 출발 물질의 특성을 보유해야 한다. 다양한 기능적 파라미터에 대한 허용가능한 허용오차는 의도하는 용도를 토대로 달라질 수 있지만, 결합 친화력 또는 생물학적 활성에 관하여, 원래 (비결정화) 친화력 또는 활성을 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 보유를 포함할 수 있다. 예를 들어, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항-PD-1 mAb의 능력은 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

본 명세서의 실시예 11-12에 기재된 바와 같이, 펨브롤리주맙 결정을 용해하여 수득된 펨브롤리주맙 및 결정화되지 않은 펨브롤리주맙의 생물학적 활성 및 생물리학적 특성을 ELISA 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 비교하였고 실질적으로 비슷한 것으로 결정되었다. 이러한 결과는 인간 대상의 치료적 처치를 위한 펨브롤리주맙 결정을 포함하는 제약 조성물의 용도를 뒷받침한다.

IV. 제약 조성물

제약 조성물을 제조하기 위해, 본 발명의 항-PD-1 mAb 결정, 또는 그러한 결정으로부터 가용화된 항-PD-1 mAb를 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제와 혼합한다. 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S . Pharmacopeia:National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)] 참조. 본 발명의 제약 조성물에 사용된 항-PD-1 mAb 결정은 항체의 생물학적 활성 및 안정성이 요망되는 범위 내로 유지되는 한, 임의의 특정 회절 품질을 가질 필요는 없다.

일부 실시양태에서, 부형제(들)은 결정화 중 또는 후에 결정화 리큐르에 직접 첨가된다. 다른 실시양태에서, 리큐르로부터 결정을 먼저 회수하고, 안정화 용액 중 현탁액에 의해 세척하고, 안정화 용액으로부터 회수한 다음에 부형제(들)을 포함하는 액체 용액에 현탁시킨다. 액체의 조성은 임의의 제약상 허용되는 매질일 수 있으며, 예컨대 수용액 및 유중수(water in oil) 혼합물을 포함할 수 있다.

고체 형태인 결정의 제약 조성물은 결정 및 요망되는 부형제(들)을 포함하는 액체 현탁액을 건조시키는 것에 의해, 예컨대, 질소, 공기 또는 불활성 기체의 스트림을 결정에 통과시키는 것에 의해, 공기 건조, 진공 건조 또는 동결건조에 의해 제조될 수 있다. 최종 생성물 내 수분 함량은 일반적으로 10 중량%, 7 중량%, 5 중량% 또는 3 중량% 미만이다.

액체 현탁액 중 또는 건조된 고체 중 펨브롤리주맙 결정으로부터 가용화된 펨브롤리주맙을 포함하는 제약 조성물은 제약상 허용되는 용해 완충액에 요망되는 양의 결정을 첨가하고 결정이 용해될 때까지 4 ℃에서 인큐베이션하여 제조될 수 있다. 실시양태에서, 용해 완충액은 10 mM 히스티딘 (pH 5.6), 0.02 % 폴리소르베이트 80 및 최대 4 % (w/v) 수크로스를 포함한다. 실시양태에서, 생성된 조성물 중 임의의 미립자는 투여 전에, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다.

V. 치료 방법

특정 환자에서 특정 암을 치료하기 위한 본 발명의 제약 조성물의 적절한 용량의 결정은 예컨대, 치료에 영향을 미치거나 또는 치료에 영향을 미치는 것으로 예상된다고 해당 기술분야에 알려진 또는 의심되는 변수 또는 요인을 사용하여 임상의에 의해 행해진다. 예를 들어, 의사는 최적 용량 또는 허가된 용량보다 다소 적은 용량으로 치료를 시작하고 그런 다음 임의의 부정적인 부작용에 상대적으로 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 작은 증분으로 용량을 증가시키기로 선택할 수 있다.

실시양태에서, 조성물의 용량 및 투여 경로는 200 mg Q2W 또는 Q3W의 용량의 미결정화 펨브롤리주맙에 의해 제공되는 것과 실질적으로 유사한 펨브롤리주맙 항체에 대한 중간 노출을 제공할 것이다.

아래에 나열된 예시적인 구체적 실시양태를 비롯한 본 발명의 이들 및 다른 양태는, 해당 기술분야의 일반적인 지식과 조합하여 본 명세서에 포함된 교시로부터 숙련된 기술자에게 명백할 것이다.

VI. 본 발명의 예시적인 구체적 실시양태

1. 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 단일클론 항체 (mAb)의 결정.

2. 실시양태 1에 있어서, 1 내지 200 마이크로미터, 1 내지 100 마이크로미터, 1 내지 20 마이크로미터, 5 내지 100 마이크로미터, 5 내지 50 마이크로미터, 5 내지 40 마이크로미터, 5 내지 30 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터, 5 내지 10 마이크로미터, 10 내지 100 마이크로미터, 10 내지 50 마이크로미터 및 10 내지 20 마이크로미터로 구성되는 군에서 선택된 범위의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 결정.

3. 실시양태 3에 있어서, 5 내지 10 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터 또는 5 내지 40 마이크로미터의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 결정.

4. 실시양태 2에 있어서, 50 내지 100 마이크로미터의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 결정.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, a = 63.5 내지 78.9 Å, b = 110.2 내지 112.2 Å, c = 262.5 내지 306 Å, α =90, β =90, γ = 90°의 단위 세포 치수 및 P2₁2₁2₁의 공간군을 특징으로 하는 결정.

6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 2.3 Å 내지 3.5 Å, 2.3 Å 내지 3.0 Å, 2.3 Å 내지 2.75 Å, 2.3 Å 내지 2.5 Å 및 2.3 Å으로 구성되는 군에서 선택된 분해능으로 X-선을 회절시킬 수 있는 결정.

7. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 동일한 항-PD-1 mAb의 추가적 결정을 포함하는 액체 매질에 현탁된 결정.

8. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 mAb가 펨브롤리주맙인 결정.

9. 결정 형성에 충분한 시간 동안 적어도 25 ℃이고 50 ℃, 45 ℃, 40 ℃ 또는 37 ℃ 이하인 온도에서 항-PD-1 단일클론 항체(mAb)를 포함하는 용액을 침전제 용액에 노출시키는 단계를 포함하고, 여기서 침전제 용액은 4.0 내지 5.0의 pH를 갖고 1.0 M 내지 2.5 M 인산 2수소 암모늄을 포함하는 것인, 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 mAb의 결정의 제조 방법.

10. 실시양태 9에 있어서, 노출시키는 단계가 항체 용액 및 침전제 용액을 혼합하여 결정화 혼합물을 형성하는 것 및 혼합물에 결정화 공정을 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.

11. 실시양태 10에 있어서, 결정화 공정이 행잉 드롭 증기 확산, 시팅 드롭 증기 확산 및 배치로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.

12. 실시양태 11에 있어서, 결정화 공정이 배치 공정이고, 결정화 혼합물에 항-PD-1 mAb의 결정을 시딩하는 단계를 더 포함하는 방법.

13. 실시양태 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 결정화 혼합물 내 항체 농도가 약 10 mg/ml 또는 약 20 mg/ml인 방법.

14. 실시양태 9에 있어서, 노출시키는 단계가 30 kD 분자량 차단 막을 사용하여 침전제 용액에 대해 항체 용액을 투석하는 것을 포함하는 것인 방법.

15. 실시양태 9 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 항체 용액이 2 내지 200 mg/ml, 3 내지 100 mg/ml, 10 내지 90 mg/ml, 20 내지 80 mg/ml, 30 내지 70 mg/ml, 40 내지 60 mg/ml 또는 약 50 mg/ml의 농도의 항-PD-1 mAb를 포함하는 것인 방법.

16. 실시양태 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 침전제 용액이 4.2 내지 4.8, 4.4 내지 4.6 및 4.5로 구성되는 군에서 선택된 pH를 갖는 것인 방법.

17. 실시양태 9 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 침전제 용액이 완충제를 더 포함하는 것인 방법.

18. 실시양태 17에 있어서, 완충제가 트리스-HCl, 인산 수소 암모늄, 암모늄 히드록시드 또는 히스티딘인 방법.

19. 실시양태 9 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 침전제 용액이 1.5 M 내지 2.0 M 인산 2수소 암모늄 및 100 내지 120 mM 트리스-HCl으로 필수적으로 구성되는 것인 방법.

20. 실시양태 9 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 침전제 용액이 인산 2수소 암모늄 및 인산 수소 암모늄의 혼합물을 포함하는 것인 방법.

21. 실시양태 20에 있어서, 침전제 용액이 1.9 M 인산 2수소 암모늄 및 0.09 M 인산 수소 암모늄으로 필수적으로 구성되는 것인 방법.

22. 실시양태 9 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 노출시키는 단계가 약 30 ℃의 온도에서 적어도 3, 4 또는 5 일 동안 수행되는 것인 방법.

23. (a) 항-PD-1 단일클론 항체(mAb) 용액을 침전제 용액 및 항-PD-1 mAb의 종자 결정과 합하여 시딩된 결정화 혼합물을 형성하는 단계; (b) 시딩된 결정화 혼합물을 20 ℃ 이상 및 40 ℃ 이하의 온도에서 인큐베이션 하는 단계; 및 (c) 결정을 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 mAb를 포함하는 용액으로부터 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 mAb를 결정화하는 방법.

24. 실시양태 23에 있어서, 인큐베이션 온도가 약 30 ℃이고 침전제 용액이 (1) 20 % 폴리에틸렌 글리콜 4000 (PEG 4K) 및 20 % 이소프로판올; (2) 18 % 폴리에틸렌 글리콜 10000 (PEG 10K), 20 % 글리세롤, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.5); 및 (3) 2.0 M 인산 2수소 암모늄 및 100 mM 트리스-HCl로 구성되는 군에서 선택된 혼합물을 포함하는 것인 방법.

25. 실시양태 23에 있어서, 인큐베이션 온도가 약 22 ℃이고 침전제 용액이 (1) 25 % PEG 4K, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.5) 및 100 mM CaCl₂ 및 (2) 1.26 M 암모늄 설페이트, 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 및 0.2 M NaCl로 구성되는 군에서 선택된 혼합물을 포함하는 것인 방법.

26. 실시양태 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 종자 결정이 실시양태 9 내지 22 중 임의의 하나의 방법에 의해 제조된 항-PD-1 mAb의 결정의 종자 스톡 유래인 방법.

27. 실시양태 9 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 mAb가 펨브롤리주맙인 방법.

28. 실시양태 9 내지 27 중 임의의 하나에서 정의된 방법으로 제조된 항-PD-1 mAb 결정.

29. (a) 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 단일클론 항체 (mAb)의 결정 및 (b) 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.

30. 실시양태 29에 있어서, 부형제가 결정 캡슐화, 결정 매립 및 결정을 안정하게 유지로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 기능을 수행하는 것인 조성물.

31. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 각각의 항-PD-1 mAb 결정이 실시양태 1 내지 8 또는 27 중 임의의 하나에서 정의된 결정인 조성물.

32. 실시양태 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 액체인 조성물.

33. 실시양태 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 고체인 조성물.

34. 실시양태 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 조성물 내 항-PD-1 mAb 농도가 적어도 50 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 200 mg/ml 또는 적어도 250 mg/ml인 조성물.

35. 실시양태 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 mAb의 생물학적 활성의 적어도 95 %가 20 ℃ 내지 25 ℃에서 적어도 1 개월 동안 조성물의 저장 후 존재하는 것인 조성물.

36. 실시양태 29 내지 35 중 임의의 하나의 제약 조성물을 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암에 대해 인간 대상을 치료하는 방법.

37. 실시양태 36에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 투명 세포 콩팥암, 머리/목 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암, 소세포 폐암 (SCLC), 삼중 음성 유방암, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수형성이상 증후군 (MDS), 비호지킨 림프종 (NHL), 또는 소림프구 림프종 (SLL)인 방법.

38. 실시양태 36 또는 37에 있어서, 제약 조성물이 적어도 200 mg/ml의 mAb를 포함하고 피하 투여되는 것인 방법.

39. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 암은 고형 종양이고, 제약 조성물의 최초 투여 전 대상으로부터 제거된 암의 조직 절편이 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 모두의 발현에 양성 반응을 보였던 것인 방법.

40. 실시양태 39에 있어서, 조직 절편에서 적어도 50 %의 종양 세포가 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 PD-L1 발현에 양성 반응을 보였던 것인 방법.

본 발명의 광범위한 범위는 다음 실시예를 참조하면 가장 잘 이해될 수 있으며, 이는 본 발명을 특정 실시양태로 한정시키는 것을 의도하지 않는다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 단지 예시로 제공되며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 용어와 함께, 그러한 청구범위가 부여되는 균등물의 전체 범위에 의해서 한정된다.

실시예

실시예 1: 펨브롤리주맙의 드롭 증기 확산 결정화 스크리닝

34 mg/ml의 전체-길이 펨브롤리주맙 용액을 10 mM 히스티딘 (pH 5.6)에 제조하였다. 이 용액을 시팅 드롭 증기 확산 실험에서 스크리닝 하였고 이는 MRC 96 웰(well) 결정화 플레이트 (햄프톤 리서치(Hampton Research) (알리소 비에호(Aliso Viejo), 캘리포니아주, 미국) 제품) 및 4 개의 상업적으로 이용가능한 고 처리량 스크린 (리가쿠 코포레이션(Rigaku Corporation) (시애틀(Seattle), 워싱턴주, 미국) 및 제나 바이오사이언스(Jena Bioscience) (제나(Jena), 델라웨어주, 미국) 제품)에서 수행되었다. 각 스크린은 96 개의 고유한 용액으로 구성되었으며, 이는 하기 표 2에 요약되어 있다.

표 2. 스크린 용액 요약

각 스크린 실험에 대하여, 펨브롤리주맙 용액 (0.2 ul)을 스크린 용액 (0.2 ul)과 혼합하고 오릭스(Oryx) 결정화 로봇 (더글라스 인스트루먼츠, 인크.(Douglas Instruments, Inc.) (헝거포드(Hungerford), 버크셔(Berkshire), 영국) 제품)을 사용하여 플레이트 웰 내 80 ul의 스크린 용액 위에 층을 이루게 하였다. 실험은 각 스크린 용액에 대해 각각 4 ℃, 18 ℃ 및 30 ℃에서 수행하였고; 따라서, 총 1,152 개의 상이한 결정화 조건을 시험하였다. 플레이트 웰을 시간에 따라 결정 형성에 대해 현미경으로 추적관찰 하였다.

결정은 3 일 후에 시험된 조건 중 오직 하나: 30 ℃ 및 제나 2 (염) #91 (100 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 2.0 M 인산 2수소 암모늄)에서 관찰되었다. 결정은 SONICC 영상화 시스템 (포뮬라트릭스, 베드포드, 메사추세츠주, 미국 제품)을 사용하여 시각화하였다. SONICC 시스템은 2 개의 영상화 방법, 결정화도를 검사하는 제2 고조파 발생 (SHG), 및 단백성 샘플에 특이적인 자외선 이광자 여기 형광 (UV-TPEF)을 갖는다. 관찰된 결정의 이미지는 도 4a (SHG) 및 도 4b (UV-TPEF)에 나타나 있다.

실시예 2: 펨브롤리주맙의 자유 계면 확산 결정화 스크리닝

실시예 1에서 오직 30 ℃에서 결정이 형성된 것을 토대로, 자유 계면 확산 기술을 사용하여 펨브롤리주맙에 대한 스크리닝 조건을 추가로 연구하기 위해 이 온도를 선택하였다.

34 mg/ml의 펨브롤리주맙을 갖는 항체 용액을 10 mM 히스티딘 (pH 5.6) 에서 0.02 % 폴리소르베이트 80과 함께 또는 없이 제조하였고 토파즈(Topaz) 칩 및 결정기 (플루이다임 코포레이션 (사우스 샌 프란시스코(South San Francisco), 캘리포니아주, 미국) 제품)에서 실시예 1에서 사용된 동일한 스크린 용액으로 스크리닝 하였다. 칩을 30 ℃에서 인큐베이션 하고 플루이다임 자동화 영상화 시스템을 사용하여 현미경으로 추적관찰하였다. 결정은 다시금 제나 2 (제나 바이오사이언스) # 91 용액: 100 mM 트리스 (pH 8.5), 2.0 M 인산 2수소 암모늄으로만 관찰되었다. 2 가지 상이한 펨브롤리주맙 용액으로부터 관찰된 결정의 이미지는 도 5a (0.02 % 폴리소르베이트 80이 있는 항체 용액) 및 도 5b (폴리소르베이트 80이 없는 항체 용액)에 나타나 있다.

실시예 3: 펨브롤리주맙의 마이크로- 시딩 매트릭스 스크리닝

본 실시예는 펨브롤리주맙이 기존 펨브롤리주맙 결정을 시딩한 용액으로부터 결정화될 수 있는 조건을 연구하였다. 스크리닝된 침전제 용액은 실시예 1에 기재된 4 개의 상업적으로 이용가능한 스크린과 동일하였다.

펨브롤리주맙 결정의 종자 스톡을 1 ul의 펨브롤리주맙 결정 현탁액 및 1.8 M ADP, 100 mM 트리스-HCl의 99 ul의 안정화 용액 (2.5 M ADP 및 1M 트리스-HCl (pH 8.5)의 스톡 용액의 적절한 양을 혼합하여 제조됨)을 합하는 것에 의해 실시예 1에서 제조된 결정 현탁액 (2.0 M ADP, 100 mM 트리스-HCl 중 펨브롤리주맙 결정)으로부터 제조하였다. 34 mg/ml의 펨브롤리주맙의 항체 용액을 10 mM 히스티딘 (pH 5.6)에서 제조하였다. 시팅 드롭 증기 확산 실험을 MRC 96 웰 결정화 플레이트 (햄프톤 리서치)에서 수행하였다.

각 스크린 실험을 위해, 펨브롤리주맙 용액 (0.3 ul)을 스크린 용액 (0.3 ul) 및 0.1 ul의 종자 스톡과 혼합하고 오릭스 결정화 로봇을 사용하여 플레이트 웰 내 80 ul의 스크린 용액 위에 층을 이루게 하였다. 실험은 각 스크린 용액에 대해 각 22 ℃ 및 30 ℃에서 수행하였고; 따라서, 총 768 개의 결정화 조건을 시험하였다. 플레이트 웰을 시간에 따라 결정에 대해 현미경으로 추적관찰하였고 결정은 하기 표 3에 나타난 5 개의 조건으로부터 1 주 후에 현미경으로 관찰되었다. SONICC (UV 양성)에 의한 결정의 가시화를 통해 관찰된 결정이 단백질을 함유한다는 것을 확인하였다.

표 3. 시딩 후 펨브롤리주맙 결정을 생성한 드롭 증기 확산 조건.

실시예 4: ADP / 트리스-HCl 중 증기 확산 결정화의 최적화

회절 품질 결정을 제조하는데 적합한 최적 ADP 농도 및 pH 조건을 확인하기 위하여, 8.8 내지 9.4 사이로 달라지는 pH를 갖는 100 mM 트리스-HCl 및 1.60 내지 1.74 M로 달라지는 농도의 ADP의 혼합물을 조사하는 다음 스크리닝 실험을 수행하였다. 펨브롤리주맙 (34 mg/ml, 10 mM 히스티딘 (pH 5.6))을 VDX 24 웰 (6 x 4 어레이) 결정화 플레이트 (햄프톤 리서치)에서 옵티매트릭스 메이커(OptiMatrix Maker)^TM 액체 조작 시스템 (리가쿠 코포레이션, 시애틀, 워싱턴, 미국)을 사용하여 고안된 맞춤 최적화 스크린에 대한 행잉 드롭 증기 확산 실험에 설치하였다. 각 스크린 실험에 대하여, 1.0 ul의 단백질 + 1.0 ul의 스크린 용액으로 구성되는 행잉 드롭은 22 mm 커버슬립의 하부에 배치되고 100 mM 트리스-HCl 성분의 pH가 4 개의 웰에서 수직으로 달라지고 ADP 농도가 6 개의 웰에 걸쳐 수평으로 달라지도록 1 ml의 스크린 용액을 함유하는 웰 상에 배치되었다. 플레이트를 30 ℃에서 인큐베이션하고 시간에 따라 현미경으로 추적관찰하였다. 도 6은 100 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1.5 M ADP 스크린 용액에서 3일 후에 관찰된 결정의 현미경사진을 나타낸다.

실시예 5: ADP / 트리스-HCl 중 펨브롤리주맙의 배치 결정화.

22 ℃에서 10 ul의 50 mg/ml 펨브롤리주맙 용액 (10 mM 히스티딘 (pH 5.6))과 50 ul의 120 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 1.8 M ADP를 합하여 결정화 혼합물을 제조하였다. 이 결정화 혼합물을 VDX 플레이트 (햄프톤 리서치)의 웰 안에 배치된 마이크로-브릿지(Micro-Bridge) (햄프톤 리서치)에 배치하였다. 웰은 1 ml의 100 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 1440 mM ADP를 함유하였다. 웰을 22 mm 유리 커버슬립을 사용하여 봉하고 및 플레이트를 30 ℃에서 5 일 동안 인큐베이션하였다. 생성된 결정질 현탁액의 현미경사진은 도 7에 나타나 있다. 약 5 마이크로미터 내지 적어도 약 20 마이크로미터 범위의 결정 크기가 관찰되었다.

실시예 6: 증기 확산 결정화 조건을 최적화하기 위한 첨가제 스크리닝.

34 mg/ml의 펨브롤리주맙 용액을 10 mM 히스티딘 (pH 5.6)에 제조하였다. 이 펨브롤리주맙 용액을 시팅 드롭 증기 확산 실험에서 첨가제 스크린 HT^TM 키트 (햄프톤 리서치)를 사용하여 제조된 96 개의 침전제 용액에 대하여 스크리닝 하였다. 이 키트는 96 개의 상이한 첨가제 용액을 함유한다.

각 첨가제에 대하여, 72 ul의 1.74 mM ADP, 100 mM 트리스-HCl (pH 9.0) 및 8.0 ul의 첨가제 용액을 함유하는 80 ul의 침전제 용액을 MRC 96 웰 결정화 플레이트의 웰에 첨가하였다. 펨브롤리주맙 용액 (0.2 ul)을 웰 용액 (0.2 ul)과 혼합하고 오릭스 결정화 로봇 (더글라스 인스트루먼츠)를 사용하여 80 ul 웰 용액 위에 층을 이루게 하였다. 플레이트를 봉하고 30 ℃에서 인큐베이션하고 시간에 따라 현미경으로 추적관찰하였다. 결정은 3-7 일 후에 관찰되었다. 1 주 후에, 결정은 다음 첨가제: (a) 3 % 1,5 디-아미노 펜탄 디-히드로클로라이드, (b) 3 % 이소프로판올 또는 (c) 4 % 프로필렌 글리콜 중 하나를 포함하는 트리스, ADP 침전제 용액에서 관찰되었다. 그러나, 결정은 다른 93 개의 침전제 용액 중 어느 것에서도 관찰되지 않았고, 이는 그러한 용액 중의 첨가제가 결정 핵생성 또는 성장을 지연시킨다는 것을 시사한다.

실시예 7: 펨브롤리주맙 결정의 X-선 회절 분석.

전체-길이 펨브롤리주맙의 회절 품질 결정을 행잉 드롭 기술을 사용하여 30 ℃에서 성장시켰다. 10 mM 히스티딘 (pH 5.6) (1 ul) 중 34 mg/ ml의 펨브롤리주맙 용액을 1.8 M 인산 2수소 암모늄, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.0) (1 ul)과 합하였다. 결정을 7 내지 60 일 후에 회수하였고 1.5 M 암모늄 설페이트, 0.2 M NaCl 중 포화 (100 %) 수크로스 용액 또는 1.5 M 암모늄 설페이트, 0.2 M NaCl 중 35 % 에틸렌 글리콜을 사용하여 동결방지하였다.

X-선 회절 데이터는 ID-17 (아르곤(Argonne) 국립 연구소, 아르곤, 일리노이주, 미국)에서 싱크로트론 방사선을 사용하여 수집하였고, 오토PROC (Vonrhein C. et al., Acta Cryst. D67:293-302 (2011))을 사용하여 처리하고 조정하였다. 최상의 데이터 세트는 수크로스 방지된 결정으로부터 얻었고, 2.28 옹스트롬 (Å)까지 미쳤다. 24 개의 데이터 세트를 근거로, 펨브롤리주맙의 결정은 a = 63.5 내지 78.9 Å, b = 110.2 내지 112.2 Å, c = 262.5 내지 306 Å 및 알파 = 베타 = 감마 = 90 °인 P2₁2₁2₁ 시스템에 속한다.

펨브롤리주맙 구조를 PHASER (McCoy A.J. et al., J. Appl . Cryst. 40:658-674 (2007))에서 시행된 분자 치환 방법을 사용하여 X-선 회절 데이터로부터 밝혔다. 당 및 물을 제거한, 항-IL-23p19 mAb의 fab 구조 및 IgG4 FC 구조 (PDB 엔트리 4C54, Davies A.M. et al., J. Mol . Biol .: 426(3):630-644 (2014))을 탐색 모델로 사용하였다. 개선은 처음에 REFMAC (Murshudov G.N. et al., Acta Crystall . D53:240-25 (1997))로 및 차후에 오토BUSTER (Bricogne G, et al. BUSTER 2.11.5. [Internet]. Cambridge 2011)로 수행하였다. COOT (Emsley P, et al., Acta Cryst. D66:486-501 (2010))에서 모델 구성을 행하였다. 최종 모델은 전체 항체 (2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄, 2 개의 7-잔기 당 사슬), 동결방지 용액으로부터의 5 개의 설페이트 이온 및 3 개의 수크로스 분자, 및 480 개의 물 분자를 함유한다.

도 8에 도시된 펨브롤리주맙 구조는, 약 140 Å 너비 및 120 Å 길이의 사량체이다. Fc 도메인은 양 사슬 상의 CH2 도메인 내의 Asn297에 글리코실화되어 있다.

실시예 8: 인산 암모늄 혼합물에서의 증기 확산 결정화.

본 실시예는 침전제 용액 내 트리스-HCl이 아닌 완충제의 사용을 연구하였다. 펨브롤리주맙 용액 (34 mg/ml 항체, 10 mM 히스티딘 (pH 5.6))을 시팅 드롭 증기 확산 실험에서 스크리닝하였고 96 개의 상이한 일염기 인산 암모늄 / 이염기 인산 암모늄 혼합물의 스크리닝 매트릭스를 사용하였으며 여기서 일염기 및 이염기 성분의 비율은 달라지지만 총 포스페이트 농도는 1.99 M로 일정하게 유지되었다. 오릭스 결정화 로봇을 사용하여 (더글라스 인스트루먼츠 엘티디), 0.25 ul 펨브롤리주맙 용액 + 0.75 ul의 스크린 용액으로 구성된 드롭을 MRC-2 96 웰 결정화 플레이트 (햄프톤 리서치)의 웰 내 80 ul의 동일한 스크린 용액 위에 분배하였다. 플레이트를 30 ℃에서 인큐베이션 하였고 로크 영상기 1000 시스템 (포뮬라트릭스, 베드포드, 메사추세츠주)를 사용하여 추적관찰하였다. 결정은 1-56 일에서부터 관찰되었다. 1.9 M ADP, 0.09 M AHP 침전제 용액에서 3 일 후에 관찰된 결정의 현미경사진은 도 9에 나타나 있다.

실시예 9: 트리스 / ADP 내 펨브롤리주맙의 배치 결정화 (1 ml 척도).

항체 혼합물을 4 ℃에서, 167 ul의 펨브롤리주맙 용액 (47 mg/ml, 10 mM 히스티딘 (pH 5.5)) 및 833 ul의 침전제 용액 (120 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 및 1.9 M ADP)을 합하여 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 제조하였다. 항체 혼합물을 함유하는 튜브를 5 일 동안 30 ℃에서 인큐베이션하였다.

실시예 10: 트리스 / ADP 내 펨브롤리주맙의 배치 투석 결정화

200 마이크로리터의 펨브롤리주맙 용액 (47 mg/ml 항체, 10 mM 히스티딘 (pH 5.5))을 30 ℃에서 5 일 동안 20 ml의 100 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 1.9 M 인산 2수소 암모늄에 대하여 30kD 분자량 차단 막 (스펙트럼 래보라토리즈, 인크.(Spectrum Laboratories, Inc.), 란초 도밍게즈(Rancho Dominguez), 캘리포니아주, 미국)을 사용하여 디스포다이알라이저(DispoDialyzer)®에서 투석하였다. 결정질 현탁액은 실시예 11에 기재된 바와 같이 회수된다.

실시예 11: 결정질 현탁액으로부터의 펨브롤리주맙 용액의 제조.

210 ul 분취액의 결정질 현탁액을 ADP / 트리스-HCl을 침전제로 사용하는 다양한 증기 확산 실험으로부터의 수많은 방울을 합하는 것에 의해 얻었고 이는 총 약 400 mg의 펨브롤리주맙 결정을 함유하였다. 분취액을 피셔(Fischer) 브랜드 마이크로원심분리기에서 실온에서 5 분 동안 5000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액 (모액)을 흡입에 의해 제거하였고 펠렛 (펨브롤리주맙 결정)을 300 ul의 안정화 용액 용액 (100 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 1.9 M ADP)에 재현탁시켰다. 생성된 현탁액을 실온에서 5 분 동안 5000 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리하였다. 상등액 (세척)을 흡입에 의해 제거하고 생성된 펠렛 (펨브롤리주맙 결정)을 500 ul 용해 완충액(10 mM 히스티딘 (pH 5.5))에 재현탁시키고 30 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 생성된 펨브롤리주맙 용액을 4 ℃에서 5 분 동안 5,000 rpm으로 마이크로원심분리기에서 원심분리하여 청징화하였다. 청징화된 펨브롤리주맙 용액을 실시예 12 및 13에 기재된 특성화 연구에 사용하였다.

실시예 12 및 13. 펨브롤리주맙 결정으로부터 가용화된 펨브롤리주맙의 특성화

다음 샘플을 ELISA 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 특성화하였다.

샘플 1: 200 ul의 출발 펨브롤리주맙 용액 (10 mM 히스티딘 (pH 5.6) 중 40 mg/ml 항체);

샘플 2: 500 ul의 가용화 펨브롤리주맙 (실시예 11에 기재된 대로 펨브롤리주맙 결정질 현탁액으로부터 수득된 재용해 결정); 및

샘플 3: 500 ul의 10 mM 히스티딘 (pH 5.6) (완충액 대조군)

샘플 1 및 2에서의 펨브롤리주맙의 생물학적 활성을 경쟁적 결합 ELISA에서 측정하였고, 이는 PD-L1과의 경쟁에서 이기고 ELISA 플레이트 상에 고정된 PD-1 수용체 분자에 결합하는 펨브롤리주맙의 능력을 측정하였다. 일정한 농도의　PD-L1 존재 하 상기 샘플의 연속 희석을 사용하여 용량 반응 곡선을 생성하였다. 최대 결합의 50 %를 보이는 펨브롤리주맙의 농도인 EC50 값은, 각 샘플에 대해 4-변수 로지스틱 곡선 피팅 분석 프로그램을 사용하여 결정하였다. 상대적인 강도는 소프트맥스(SoftMax)® 프로(Pro) 6 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 서니베일(Sunnyvale), 캘리포니아주)에서 용량-반응 곡선의 평행선 분석을 적용하여 계산하였다. 기하 표준 편차 및 95 % 신뢰 구간과 함께 샘플 1에 상대적인 기하 평균 강도로 보고된 샘플 2의 경쟁적 결합 능력은 아래에 나타나 있다.

이러한 결과는 결정화된 적이 없는 펨브롤리주맙과 결정질 펨브롤리주맙 현탁액으로부터 회수된 펨브롤리주맙 결정으로부터 가용화된 펨브롤리주맙이 경쟁적 결합 ELISA에서 비교할만한 생물학적 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

SEC 특성화는 UP-SEC 분석을 사용하여 수행하였고, 이는 상온 (25 ℃)에서 워터즈 엑퀴티(Waters Acquity) UPLC^® 시스템 상의 워터즈 BEH2000 컬럼 (워터즈 코프., 밀포드(Milford), 메사추세츠주, 미국; P/N: 186005225)을 사용하였다. 시료추출기는 4 ℃에서 온도 제어되었다. 분리는 pH 7.0의 100 mM 소듐 포스페이트, 100 mM NaCl을 이동상으로 사용하여 0.5 ml/분의 유속에서 수행되었다. 실행 시간은 제안된 검출 파장으로 A214를 사용하여 5 분이었고, A280 또한 수집되었다. 각 샘플 1 및 2에 대한 분리 플롯은 각각 도 10a 및 10b에 나타나 있다.

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각 개별적인 문헌, 데이터베이스 엔트리 (예컨대 젠뱅크(Genbank) 서열 및 GeneID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 인용되도록 지시된 것과 같이 동일한 정도로 참조로 인용된다. 명세서 내에 참조로 포함된다는 전용 설명의 포함은, 존재할 경우, 어떠한 방식으로도 참조로 포함된다는 이 일반적인 설명을 약화시키지 않는다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 참고문헌이 관련있는 선행 기술임을 인정하려는 의도가 아니며, 참고문헌의 내용 또는 공개일에 대한 임의의 인정을 구성하지도 않는다.

표 4는 서열 목록에 있는 서열에 대한 간략한 설명을 제공한다.

표 4

서열 식별자

SEQUENCE LISTING <110> REICHERT, PAUL PROSISE, WINIFRED W. SCAPIN, GIOVANNA YANG, XIAOYU KASHI, RAMESH STRICKLAND, COREY <120> CRYSTALS OF ANTI-HUMAN PD-1 MONOCLONAL ANTIBODIES <130> 24029 <140> 62/121867 <141> 2015-02-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Light Chain CDR <400> 1 Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Light Chain CDR <400> 2 Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Light Chain CDR <400> 3 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Heavy Chain CDR <400> 4 Asn Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Heavy Chain CDR <400> 5 Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody Heavy Chain CDR <400> 6 Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HUMANIZED ANTIBODY HEAVY CHAIN <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HUMANIZED LIGHT CHAIN <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 펨브롤리주맙 변이체 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 단일클론 항체 (mAb)의 결정.
제1항에 있어서, 1 내지 200 마이크로미터, 1 내지 100 마이크로미터, 1 내지 20 마이크로미터, 5 내지 100 마이크로미터, 5 내지 50 마이크로미터, 5 내지 40 마이크로미터, 5 내지 30 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터, 5 내지 10 마이크로미터, 10 내지 100 마이크로미터, 10 내지 50 마이크로미터 및 10 내지 20 마이크로미터로 구성되는 군에서 선택된 범위의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 결정.
제2항에 있어서, 5 내지 10 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터, 5 내지 40 마이크로미터 또는 50 내지 100 마이크로미터의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 결정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 mAb가 펨브롤리주맙이고, a = 63.5 내지 78.9 Å, b = 110.2 내지 112.2 Å, c = 262.5 내지 306 Å, α =90, β =90, γ = 90 °의 단위 세포 크기 및 P2₁2₁2₁의 공간군을 갖는 것을 특징으로 하는 결정.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2.3 Å 내지 3.5 Å, 2.3 Å 내지 3.0 Å, 2.3 Å 내지 2.75 Å, 2.3 Å 내지 2.5 Å 및 2.3 Å으로 구성되는 군에서 선택된 분해능으로 X-선을 회절시킬 수 있는 결정.
결정 형성에 충분한 시간 동안 25 ℃ 이상 및 50 ℃ 이하인 온도에서 항-PD-1 단일클론 항체(mAb)를 포함하는 용액을 침전제 용액에 노출시키는 단계를 포함하고, 여기서 침전제 용액은 4.0 내지 5.0의 pH를 갖고 1.0 M 내지 2.5 M 인산 2수소 암모늄을 포함하는 것인, 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 mAb의 결정의 제조 방법.
제6항에 있어서, 노출시키는 단계가 항체 용액 및 침전제 용액을 혼합하여 결정화 혼합물을 형성하는 것 및 혼합물에 결정화 공정을 적용하는 것을 포함하고, 여기서 결정화 공정이 행잉 드롭(hanging drop) 증기 확산법, 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산법 및 배치로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 결정화 공정이 배치 공정이고, 결정화 혼합물에 항-PD-1 mAb의 결정을 시딩하는 단계를 더 포함하는 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 용액이 항-PD-1 mAb를 2 내지 200 mg/ml, 3 내지 100 mg/ml, 10 내지 90 mg/ml, 20 내지 80 mg/ml, 30 내지 70 mg/ml, 40 내지 60 mg/ml 또는 약 50 mg/ml의 농도로 포함하고, 침전제 용액이 4.2 내지 4.8, 4.4 내지 4.6 및 4.5으로 구성되는 군에서 선택된 pH를 갖는 것인 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 침전제 용액이 (a) 1.5 M 내지 2.0 M 인산 2수소 암모늄 및 100 내지 120 mM 트리스-HCl 또는 (b) 1.9 M 인산 2수소 암모늄 및 0.09 M 인산 수소 암모늄을 포함하는 것인 방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 노출시키는 단계가 약 30 ℃의 온도에서 적어도 3, 4 또는 5일 동안 수행되는 것인 방법.
(a) 항-PD-1 단일클론 항체(mAb) 용액을 침전제 용액 및 항-PD-1 mAb의 종자 결정과 합하여 시딩된 결정화 혼합물을 형성하는 단계; (b) 시딩된 결정화 혼합물을 20 ℃ 이상 및 약 40 ℃ 이하의 온도에서 인큐베이션 하는 단계; 및 (c) 결정을 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 종자 결정은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항-PD-1 mAb의 결정의 종자 스톡 유래인, 항-PD-1 mAb을 포함하는 용액으로부터 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 mAb를 결정화하는 방법.
(a) 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 내 항체인 항-PD-1 단일클론 항체 (mAb)의 결정, 및 (b) 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
제13항에 있어서, 조성물 내 각각의 항-PD-1 mAb 결정이 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 결정 또는 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 결정인 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 항-PD-1 mAb 결정이 액체에 현탁되고, 조성물 내 항-PD-1 mAb 농도가 적어도 50 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 200 mg/ml 또는 적어도 250 mg/ml인 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 고체인 조성물.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암에 대해 인간 대상을 치료하는 방법.
제17항에 있어서, 암은 방광암, 유방암, 투명 세포 콩팥암, 머리/목 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암, 소세포 폐암 (SCLC), 삼중 음성 유방암, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B-세포 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수형성이상 증후군 (MDS), 비호지킨 림프종 (NHL), 또는 소림프구 림프종 (SLL)인 방법.
제18항에 있어서, 제약 조성물이 적어도 200 mg/ml의 mAb를 포함하고 피하 투여되는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 암은 고형 종양이고, 제약 조성물의 최초 투여 전에 대상으로부터 제거된 암의 조직 절편이 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 모두의 발현에 대해 양성 반응을 보였던 것인 방법.