TWI714552B - 抗人類pd-1單株抗體之結晶體 - Google Patents

抗人類pd-1單株抗體之結晶體 Download PDF

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Abstract

本文提供派姆單抗(pembrolizumab)及結構上類似之抗PD-1單株抗體之結晶體，以及產生該等結晶體之方法，及包含該等抗體結晶體之組合物在(例如)癌症治療上之用途。

Description

抗人類PD-1單株抗體之結晶體
本發明概言之係關於單株抗體之結晶型。更特定而言，本發明係關於派姆單抗(pembrolizumab)及其結構變體之結晶體，包含該等抗體結晶體之醫藥組合物，及該等組合物在癌症之治療中之用途。
許多腫瘤均會產生引起抵抗腫瘤之內源性免疫反應之抗原。然而，此反應通常係無效的，乃因腫瘤細胞可活化關鍵免疫檢查點從而造成局部化免疫阻抑。該等免疫檢查點中之一者係人類細胞表面受體PD-1(程式化死亡-1或程式化細胞死亡-1)，其係表現於經活化T細胞之表面上之抑制性信號傳導受體。因結合其配體PD-L1或PD-L2中之一者對PD-1抑制之信號傳導的活化導致抑制抵抗腫瘤細胞之T細胞介導之免疫反應。為防反此PD-1路徑介導的對抵抗腫瘤之抗腫瘤免疫反應之抑制，若干公司正研發與人類PD-1結合且阻斷PD-1與其配體間之相互作用之單株抗體(mAb)。
該等抗PD-1 mAb中之一者係派姆單抗(一種人類化IgG4 mAb)，其係在美國經批准用於治療患有不可切除或轉移性的黑色素瘤且在伊匹單抗(若BRAF V600突變為陽性，則BRAF抑制劑)後疾病有所進展之患者。派姆單抗在治療眾多其他癌症適應症中之效能及安全性正在研究中。
派姆單抗目前經調配用於靜脈內(IV)輸注，且派姆單抗之凍乾形式及包含25mg/ml mAb之溶液調配物闡述於WO2012/135408中。然而，經設計以進行皮下投與之高濃度調配物可為合意之替代物，此部分地由於其可使得患者能夠自投與派姆單抗。
治療性抗體傳統上係以凍乾形式或以溶液形式來製備。凍乾形式可展現增強之長期穩定性，但其需要在使用前進行重構，此使得其於自投與而言不那麼理想。溶液調配物無需重構，但可遭受降低之穩定性且在使用前通常需要冷藏。凍乾形式及溶液調配物可能均無法提供足夠高濃度以容許藉由皮下投與之高劑量遞送，乃因1.2ml係用於皮下投與之最大較佳體積(Yang,M.X.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)100：6934-1939(2003))。然而，抗體之高濃度溶液調配物(若可獲得)亦可易於脫離溶液，或可能太黏而無法在(例如)為皮下投與、具體而言自投與所需要之窄規格針中遞送。
達成高濃度抗體調配物之一種所建議方法係製備具有抗體結晶體之調配物，例如參見Yang等人，上文文獻；美國專利第7,833,525號及WO2012/135035。製備抗體結晶體之治療性抗體組合物之基本原理包括室溫下液體溶液中蛋白質結晶體之經改良穩定性、高抗體濃度溶液之降低的黏度及操縱結晶條件以針對期望之受控釋放性質達成不同形態之能力(例如參見Yang等人，上文文獻及Basu,S.K.等人，Expert Opin.Biol.Thera.4：301-317(2004))。
據信抗體由於重鏈及輕鏈之撓性而尤其難以結晶。儘管最近30年已有眾多全抗體結晶之報導，但RCSB蛋白質數據庫中僅儲存四種結構，相比之下，儲存超過800種Fab apo結構或複雜結構。Altus Pharmaceuticals之研究者首次闡述使三種市售單株抗體：利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)及英利昔單抗(infliximab)結晶之結晶方法(WO02/072636)。其他已公開專利申請案闡述製備抗IL-13 mAb(WO2005/121177)、抗TNF α mAb(WO2008/057240)、抗骨硬化素mAb(WO2012/135035)及抗IL-23 mAb(WO2014/004436)之結晶體之方法。儘管存在用於抗體結晶之方法之該等實例，但蛋白質結晶業界通常同意鑑別適於具體抗體之結晶條件仍係經驗練習，且不存在可應用至所述具體抗體來可靠預測哪種結晶條件將產生該抗體之結晶體之一般規則。
因此，業內存在製備派姆單抗之結晶型之方法。該等結晶體可用於闡明派姆單抗之結構(藉由x射線繞射分析)及用於製備改良之派姆單抗醫藥組合物用於治療癌症。
本發明藉由提供派姆單抗結晶體及產生派姆單抗結晶體之方法滿足了該等需要且更多需要。本發明方法之一個實施例產生適於X射線繞射之結晶體，且本發明者在本文中使用該等結晶體將派姆單抗之三維結構解析至2.3Å解析度。
因此，在一個態樣中，本發明提供抗PD-1抗體之結晶體。抗體係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體。在實施例中，結晶體包含抗體及溶劑。在實施例中，結晶體之長度係介於以下範圍中之任一者之間：1微米至200微米、1微米至100微米、1微米至20微米、5微米至100微米、5微米至50微米或5微米至20微米。在實施例中，抗體結晶體之特徵在於a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°之單位晶胞尺寸及P212121之空間群。在實施例中，抗體結晶體可將X射線繞射至3.5Å或更好(即少於3.5Å)下之解析度。
在另一態樣中，本發明提供產生抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體之方法，其中mAb係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體。該方法包含：(a)在至少25℃且不大於50℃之溫度下 使mAb之溶液(抗體溶液)暴露於沈澱劑溶液達足以形成結晶體(結晶)之時間，及(b)收穫結晶體。在實施例中，暴露步驟係在不大於約40℃至約45℃之溫度下實施。在一個實施例中，該方法中所使用之沈澱劑溶液具有約4.0至5.0之pH且包含1.0M至2.5M磷酸二氫銨(ADP)。在實施例中，沈澱劑溶液亦包含足夠量之緩衝劑以將沈澱劑溶液之pH調節至pH 4.0至5.0。在實施例中，緩衝劑係Tris-HCl或二鹼式磷酸銨。在實施例中，抗體溶液包含抗PD-1 mAb，其濃度為3mg/ml至100mg/ml、10mg/ml至90mg/ml、20mg/ml至80mg/ml、30mg/ml至70mg/ml、40mg/ml至60mg/ml或約50mg/ml。在實施例中，抗體係實施3天、4天或5天中之至少任一者。在實施例中，抗體溶液包含10mM組胺酸(pH 5.6)。在實施例中，抗體溶液進一步包含聚山梨醇酯，其最大濃度為約0.01%。在實施例中，暴露步驟包含實施選自由以下組成之群之結晶技術：懸滴蒸氣擴散、沉滴蒸氣擴散、透析、微批量法及批量法。在實施例中，暴露步驟包含混合等體積之抗體溶液及沈澱劑溶液以形成結晶混合物。
在另一態樣中，本發明提供使抗PD-1單株抗體(mAb)自包含抗PD-1 mAb之溶液結晶之方法，其中抗體係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體。該方法包含：(a)合併抗PD-1 mAb溶液與沈澱劑溶液並加抗PD-1 mAb之結晶體之晶種以產生加晶種之結晶混合物；(b)在至少20℃且不大於40℃之溫度下培育加晶種之結晶混合物；及(c)收穫結晶體。在實施例中，培育溫度為約30℃且沈澱劑溶液包含選自由以下組成之群之混合物：(1)20%聚乙二醇4000(PEG 4K)及20%異丙醇；(2)18%聚乙二醇10000(PEG 10K)、20%甘油、100mM Tris-HCl(pH 8.5)；及(3)2.0M磷酸二氫銨及100mM Tris-HCl。在另一實施例中，培育溫度為約22℃且沈澱劑溶液包含選自由以下組成之群之混合物：(1)25%PEG 4K、100mM Tris- HCl(pH 8.5)及100mM CaCl2及(2)1.26M硫酸銨、乙酸鈉(pH 4.5)及0.2M NaCl。在一些實施例中，晶種結晶體來自抗PD-1 mAb之結晶體之晶種儲備，該等結晶體係藉由在約30℃之溫度下在具有4.0至5.0之pH且包含1.0M至2.5M ADP之沈澱劑溶液中結晶產生的。
在再一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含(a)抗PD-1抗體之結晶體，其中抗體係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體，及(b)至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在實施例中，賦形劑實施至少一種選自囊封結晶體、包埋結晶體及穩定地維持結晶體之功能。在一些實施例中，組合物中結晶體之平均長度為1微米至20微米、5微米至20微米、5微米至50微米或5微米至100微米。在實施例中，組合物包含懸浮於液體介質中之抗PD-1 mAb結晶體。在實施例中，組合物中抗PD-1 mAb之濃度為至少約50mg/ml且不大於約250mg/ml。在另一實施例中，組合物為固體，其係藉由將結晶體之液體懸浮液去水或凍乾製備的。在實施例中，在將液體或固體醫藥組合物在室溫(例如20℃至25℃)下儲存至少一個月後存在抗PD-1 mAb之生物活性之至少95%、97%或99%。
在另一態樣中，本發明提供包含上述醫藥組合物中之任一者之容器。該容器可為單一劑量小瓶、多劑量小瓶、預填充之注射器或自注射裝置。在實施例中，該容器包含單一劑量之約200mg至約250mg之抗PD-1 mAb，即派姆單抗、派姆單抗變體或派姆單抗生物相似藥。
在再一態樣中，本發明包含治療人類個體之癌症之方法，其包含投與患者治療有效量之上述醫藥組合物中任一者。在實施例中，該癌症係實體腫瘤，例如，膀胱癌、乳癌、透明細胞腎癌、頭/頸鱗狀細胞癌、肺鱗狀細胞癌、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌症、小細胞肺癌(SCLC)或三陰 性乳癌。在另一實施例中，該癌症係原血紅素惡性腫瘤，例如，急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV陽性DLBCL、原發性縱膈大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富型大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤(MM)、骨髓細胞白血病-1蛋白質(Mc1-1)、骨髓增生異常症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。在實施例中，醫藥組合物包含至少200mg/ml之派姆單抗且係以皮下方式投與。在實施例中，在第一次投與醫藥組合物前自個體去除之癌症之組織切片經測試對於PD-L1及PD-L2中之一者或二者之表現為陽性。在實施例中，藉由免疫組織化學(IHC)分析對於PD-L1表現測試組織切片中腫瘤細胞之至少50%為陽性。
本專利或申請案檔案含有至少一個有色圖式。在要求並支付必要費用之後專利事務局可提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之複本。
圖1顯示派姆單抗及本文所闡述之派姆單抗變體之輕鏈CDR序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：1-3)。
圖2顯示派姆單抗及本文所闡述之派姆單抗變體之重鏈CDR序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4-6)。
圖3顯示派姆單抗之重鏈(圖3A)及輕鏈(圖3B)之胺基酸序列(分別為SEQ ID NO 7及8)。
圖4顯示派姆單抗結晶懸浮液內結晶體之顯微照片，該等結晶體係藉由在30℃下使用2.0M磷酸二氫銨、100mM Tris-HCl之沈澱劑溶液進行蒸氣擴散獲得的。100×放大率下之顯微照片係在3天後使用 SONICC成像系統獲得，其中圖4A係使用SHG模式產生且圖4B係使用UV-TPEF模式產生。參見實例1。
圖5顯示派姆單抗結晶懸浮液內結晶體之顯微照片，該等結晶體係藉由在30℃下使用2.0M磷酸二氫銨、100mM Tris之沈澱劑溶液在0.02%聚山梨醇酯80存在(圖5A)或不存在(FIG 5B)下進行自由界面擴散獲得的。100×放大率下之顯微照片係在2天後使用Fluidigm自動化成像系統獲得的。參見實例2。
圖6顯示派姆單抗結晶懸浮液內結晶體之顯微照片，該等結晶體係藉由在30℃下使用1.5M磷酸二氫銨、100mM Tris-HCl之沈澱劑溶液進行懸滴蒸氣擴散獲得的。100×放大率下之顯微照片係在3天後使用Nikon SMZ1500 Stereo顯微鏡及Nikon ES400照相機成像系統獲得的。參見實例4。
圖7顯示派姆單抗結晶懸浮液內結晶體之顯微照片，該等結晶體係藉由在30℃下使用1.8M磷酸二氫銨、120mM Tris-HCl之沈澱劑溶液進行批量法結晶獲得的。參見實例5。100×放大率下之顯微照片係在5天後使用Nikon SMZ1500 Stereo顯微鏡及Nikon ES400照相機成像系統獲得的。雙側箭頭指示長度約20微米之結晶體。
圖8顯示派姆單抗3-二維結構之帶狀圖，其係藉由在30℃下使用1.8M磷酸二氫銨、100mM Tris-HCl作為沈澱劑之懸滴擴散方法獲得之結晶體之X射線繞射分析解析的。參見實例7。帶狀圖在圖8A中以色彩顯示的，其中兩條重鏈為黃色及青色，且兩條輕鏈為洋紅色(FAB-1)及綠色(FAB-2)，同時相同帶狀圖在圖8B中以灰色調顯示。
圖9顯示派姆單抗結晶懸浮液內結晶體之顯微照片，該等結晶體藉由在30℃下使用1.9M磷酸二氫銨及0.09M磷酸氫銨作為沈澱劑之蒸氣擴散獲得的。參見實例8。70×放大率下之顯微照片係在3天後使用Rock Imager系統(Formulatrix,Bedford,MA)獲得的，且雙側箭頭指 示20微米之距離。
圖10顯示藉由如實例13中所闡述之不同的派姆單抗溶液之UPLC-SEC表徵產生之圖形，顯示於圖10A中之派姆單抗一直未結晶且於圖10B中之派姆單抗係自派姆單抗結晶體溶解的。
I. 縮寫.在整個本發明之詳細闡述及實例中，將使用以下縮寫：
Figure 105105288-A0202-12-0008-1
Figure 105105288-A0202-12-0009-2
II. 定義
為可更易於瞭解本發明，下文明確定義某些技術及科學術語。除非在此文件其他部分中明確定義，否則本文所使用之所有其他技術及科學術語皆具有熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解的含義。
如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，除非上下文明確指示，否則詞語之單數形式(例如「一(a、an)」及「該(the)」)包括其相應複數個指示物。
「約」在用於修飾數值定義之參數(例如，溶液中組份之濃度)時意味著該參數可變化高於或低於該參數之所述數值的多達10%。例如，包含約200mg/ml指定抗體之組合物可具有介於180mg/ml與220mg/ml之間之抗體。類似地，約30℃之溫度意指介於27℃與33℃之間之任一溫度。
「投與」及「治療」在其應用至動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時，係指外源性醫藥、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體接觸。「投與」及「治療」可指例如治療方法、藥物動力學方法、診斷方法、研究方法及實驗方法。細胞之處理涵蓋使試劑與細胞接觸，以及使試劑與流體接觸，其中該流體係與細胞接觸。「投與」及「治療」亦包括藉由試劑、診斷劑、結合組合物或藉由另一細胞對(例如)細胞之活體外及離體處理。術語「個體」包括任一生物體，較佳動物，更 佳哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、狗、貓、兔)，且最佳人類。
如本文所使用，術語「抗體」係指包括兩對相同的多肽鏈之四聚體，每一對均具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。每一鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100個至110個或更多胺基酸的可變區。重鏈之羧基末端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。每一輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點通常係相同的。
通常，重鏈及輕鏈中之每一者之可變區包含三個高變區，該等區亦稱為互補決定區(CDR)，其位於相對保守之框架區(FR)內。CDR通常係藉由框架區對準，使得能夠結合至特異性表位。一般而言，自N-末端至C-末端，輕鏈及重鏈可變結構域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4(即CDRL1、CDRL2及CDRL3在輕鏈可變結構域中，而CDRH1、CDRH2及CDRH3在重鏈可變結構域中)。胺基酸至每一結構域之分配通常符合以下文獻之定義：Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；國立衛生研究院，Bethesda,Md.；第5版；NIH出版號91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883。
如本文所使用，磷酸二氫銨(NH4H2PO4)或ADP與單鹼式磷酸銨、磷酸一銨及一鹽基磷酸銨同義。
如本文所使用，磷酸氫銨((NH4)2HPO4)或AHP與二鹼式磷酸銨、磷酸氫二銨及磷酸氫二-銨同義。
術語「癌症」、「癌性」或「惡性」係指或闡述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長失調之生理學病況。癌症之實例包括(但不限於) 癌、淋巴瘤、白血病、胚細胞瘤及肉瘤。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、多發性骨髓瘤、胃腸(道)癌症、腎癌、卵巢癌、肝癌、淋巴胚細胞性白血病、淋巴球性白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經胚細胞瘤、胰臟癌、多形性神經膠胚細胞瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌。可根據本發明治療之尤佳癌症包括彼等特徵在於在測試組織試樣中PD-L1及PD-L2中之一者或二者之表現有所升高。
「濃度」在提及本發明之結晶抗體懸浮液使用時係指存在於給定宏觀單位體積之溶液中之抗體(例如，派姆單抗)之量。術語濃度係以其慣常意義使用，但與傳統溶液相比，懸浮液具有固有異質性。結晶懸浮液中抗體之濃度等於其中抗體不呈結晶型之等效試樣之濃度。
「保守修飾之變體」或「保守取代」係指胺基酸取代為熟習此項技術者已知且通常可在不改變所得分子之生物活性之情況下進行，即便在多肽之必需區中。該等例示性取代較佳根據下表1中所述進行：
Figure 105105288-A0202-12-0011-3
Figure 105105288-A0202-12-0012-4
如整個說明書及申請專利範圍中所用，「基本上由……組成(consists essentially of)」及變化形式(例如「consist essentially of」或「consisting essentially of」)指示包括任何所列舉之成份或成份群組，且視情況包括具有與所列舉成份類似或不同性質且不會顯著改變指定劑量方案、方法或組合物之基本或新穎性質之其他成份。作為非限制性實例，基本上由抗體結晶體及特定的醫藥上可接受之賦形劑組成之醫藥組合物亦可包括一或多種不會顯著影響醫藥組合物之性質之其他賦形劑。
如本文所使用，「抗PD-1 mAb結晶體」或「結晶抗PD-1 mAb」係指含有以在三維中週期性地重複之晶格結構排列之抗體之結晶體。相比之下，例如，藉由凍乾溶解於溶液中之mAb產生之固體非晶形形式之mAb並不展現結晶抗體形式特有之光學性質(例如折射率及雙折射)。
如本文所使用，且關於基於透析之結晶方法，「透析溶液」係指 針對其透析派姆單抗溶液(「抗體溶液」)以驅動形成本發明結晶抗體之溶液。「保留物」係指透析後之抗體溶液，其可包括抗體之結晶體，可收穫該等結晶體。抗體溶液/保留物在透析膜之一側上，且透析溶液在相對側上。
術語「微米(micron及micrometer)」在本文中可互換使用且各自意指1米之1/1000000。
如本文所使用，「單株抗體」或「mAb」或「Mab」係指一群實質上均質之抗體，即包含該群體之抗體分子之胺基酸序列相同，可以少量存在之可能天然突變除外。相比之下，習用(多株)抗體製劑通常包括眾多在其可變結構域、具體而言其CDR中具有不同胺基酸序列之不同抗體，該等結構域通常特異於不同表位。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一具體方法來產生該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首次由Kohler等人(1975)Nature 256：495闡述之雜交瘤方法來製備，或可藉由重組DNA方法來製備(例如參見美國專利第4,816,567號)。亦可使用闡述於(例如)Clackson等人(1991)Nature 352：624-628及Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中之技術自噬菌體抗體文庫分離「單株抗體」。亦參見Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116：731。
如本文所使用，「PD-L1」或「PD-L2」表現意指在細胞表面上指定PD-L蛋白質或在細胞或組織內指定PD-L mRNA之任一可檢測表現程度。可在腫瘤組織切片之IHC分析中利用診斷性PD-L抗體或藉由流式細胞術檢測PD-L蛋白質表現。或者，可使用特異性結合至期望PD-L靶標(例如，PD-L1或PD-L2)之結合劑(例如，抗體片段、親核體及諸如此類)藉由PET成像檢測腫瘤細胞之PD-L蛋白質表現。用於檢測及量測PD-L mRNA表現之技術包括RT-PCR及即時定量RT-PCR。
已闡述用於在腫瘤組織切片之IHC分析中對PD-L1蛋白質表現進行定量之若干方法。例如參見Thompson,R.H.等人，PNAS 101(49)；17174-17179(2004)；Thompson,R.H.等人，Cancer Res. 66：3381-3385(2006)；Gadiot,J.等人，Cancer 117：2192-2201(2011)；Taube,J.M.等人，Sci Transl Med 4,127ra37(2012)；及Toplian,S.L.等人，New Eng.J Med. 366(26)：2443-2454(2012)。
一種方法採用針對PD-L1表現陽性或陰性之簡單二進制終點，其中陽性結果係在展現細胞-表面膜染色之組織學證據之腫瘤細胞之百分比方面進行定義。對於PD-L1表現為總腫瘤細胞之至少1%且較佳5%，將腫瘤組織切片計數為陽性。
在另一方法中，在腫瘤細胞中以及在主要包含淋巴球之浸潤免疫細胞中對腫瘤組織切片中之PD-L1表現進行定量。展現膜染色之腫瘤細胞及浸潤免疫細胞之百分比單獨定量為<5%、5%至9%，且然後以10%增量至最多100%。對於腫瘤細胞，若分值<5%分值，則PD-L1表現經計數為陰性，且若分值
Figure 105105288-A0202-12-0014-35
5%，則為陽性。免疫浸潤中之PD-L1表現係以稱為經調節發炎分值(AIS)之半定量量測來報告，其係藉由膜染色細胞之百分比乘以浸潤強度來確定，其被分級為無(0)、輕度(1之分值，淋巴球稀疏)、中等(2之分值，因淋巴球與組織細胞聚集物而腫瘤局灶浸潤)或嚴重(3之分值，彌漫浸潤)。若AIS
Figure 105105288-A0202-12-0014-36
5，則藉由免疫浸潤對於PD-L1表現將腫瘤組織切片計數為陽性。
可將PD-L mRNA表現程度與通常用於定量RT-PCR中之一或多種參考基因(例如泛蛋白C)之mRNA表現程度進行比較。
在一些實施例中，基於與適當對照在PD-L1表現(蛋白質及/或mRNA)方面之比較，將惡性細胞及/或腫瘤內浸潤免疫細胞之PD-L1表現(蛋白質及/或mRNA)之程度確定為「過表現」或「升高」。例如，對照PD-L1蛋白質或mRNA表現程度可為在相同類型之非惡性細 胞中或在來自匹配正常組織之切片中進行定量之程度。在一些較佳實施例中，若腫瘤試樣中之PD-L1蛋白質(及/或PD-L1 mRNA)較對照多至少10%、20%或30%，則確定該試樣中之PD-L1表現有所升高。
如本文所用之「派姆單抗」意指(a)具有闡述於WHO Drug Information，第27卷，第2期，第161頁至第162頁(2013)中之結構且係由Merck Sharp &Dohme公司(MSD)(控制MSD或由MSD控制之公司)或其權利繼承者(個別及共同地，「MSD」)製造的或代表該公司或其權利繼承者之IgG4單株抗體。派姆單抗之每一輕鏈均包含顯示於圖1中之三個CDR序列(SEQ ID NO：1視為CDRL1，SEQ ID NO：2視為CDRL2且SEQ ID NO：3視為CDRL3)，且派姆單抗之每一重鏈均包含顯示於圖2中之CDR序列(SEQ ID NO：4視為CDRH1，SEQ ID NO：5視為CDRH2且SEQ ID NO：6視為CDRH3)。派姆單抗之全長度重鏈及輕鏈包含顯示於圖3中之重鏈及輕鏈序列(分別SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)。
派姆單抗生物相似藥意指由除MSD以外之實體製造且由任一國家之管理機構批准作為派姆單抗生物相似藥出售之生物產品。在實施例中，派姆單抗生物相似藥包含派姆單抗變體作為原料藥。在實施例中，派姆單抗生物相似藥具有與派姆單抗相同之胺基酸序列。
如本文所使用，「派姆單抗變體」意指包含重鏈及輕鏈序列與派姆單抗(分別SEQ ID NO：7及8)相同之單株抗體，在位於輕鏈CDR外部之位置處具有三個、兩個或一個保守胺基酸取代及在重鏈CDR外部之位置處六個、五個、四個、三個、兩個或一個保守胺基酸取代(例如，變體位置位於框架區或恆定區中)除外。換言之，派姆單抗及派姆單抗變體包含相同CDR序列，但由於在其全長度輕鏈及重鏈序列中在分別不超過三個或六個其他位置處具有保守胺基酸取代而彼此不同。派姆單抗變體在以下性質方面實質上與派姆單抗相同：與PD-1之結合親和力及阻斷PD-L1及PD-L2中之每一者與PD-1結合之能力。
「沈澱劑」係使多肽(例如抗體)在濃溶液中之溶解度降低之化合物。在批量法結晶方法中，沈澱劑包括於「沈澱劑溶液」中，且在大量透析方法中，沈澱劑包括於「透析溶液」中。沈澱劑因環繞多肽分子形成能量上不利的沈澱劑空乏層而誘導結晶。為最小化此空乏層之相對量，多肽形成締合物及最終結晶體。此製程闡明於Weber(1991)Advances in protein Chemistry 41：1中。各種沈澱劑為業內已知且包括：硫酸銨、乙醇、異丙醇、1,2丙二醇、3-乙基-2,4戊二醇；及許多聚二醇，例如聚乙二醇(例如PEG 300及PEG 400)。除沈澱劑以外，有時將其他材料添加至多肽沈澱劑溶液中。該等包括用以調節溶液之pH(及因此肽上之表面電荷)之緩衝劑(例如Tris或HEPES)及用以降低多肽之溶解度之鹽(例如氯化鈉、氯化鋰及檸檬酸鈉)。
如本文所用術語「治療有效量」或「有效量」係指抗PD-1抗體在單獨或與另一治療劑組合投與細胞、組織或個體時可有效治療癌症之量。當應用至單獨投與之抗PD-1抗體時，治療有效量係指該單獨成份。當應用至組合時，無論係組合、連續抑或同時投與，治療有效量均指引起治療性效應之抗PD-1抗體及其他治療劑之組合量。
「組織切片」係指單一部分或單片組織試樣，例如，自正常組織或腫瘤之試樣切下之組織薄片。
如本文所使用，「治療(treat或treating)」癌症意指向具有癌症或診斷患有癌症之個體投與本發明醫藥組合物，以達成至少一種積極治療效應，例如，減少癌細胞數量，減小腫瘤大小，降低癌細胞浸潤至外周器官之速率，或降低腫瘤轉移或腫瘤生長之速率。可以眾多方式量測癌症之積極治療效應(參見W.A.Weber,J.Nucl.Med.50：1S-10S(2009))。例如，關於腫瘤生長抑制，根據NCI標準，小於等於42%之T/C係抗腫瘤活性之最低水準。小於10%之T/C視為高抗腫瘤活性水準，且T/C(%)=經治療之中值腫瘤體積/對照之中值腫瘤體積×100。 在一些實施例中，藉由本發明之組合達成之治療為PR、CR、OR、PFS、DFS及OS中之任一者。PFS亦稱作「腫瘤進展時間」，其指示在治療期間及之後癌症不再生長之時間長度，且包括患者已經歷CR或PR之時間量，以及患者已經歷SD之時間量。DFS係指在治療期間及之後患者保持無疾病之時間長度。OS係指與原始或未經治療之個體或患者相比預期壽命之延長。在一些較佳實施例中，對本發明組合之反應係PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中之任一者，其係使用RECIST 1.1反應準則來評價。可有效治療癌症患者之針對本發明組合之治療方案可根據患者之疾病狀態、年齡及重量及療法在個體中引發抗癌反應之能力等因素諸如而變化。儘管本發明態樣中之任一者之實施例可能不會在每一個體中有效達成積極治療效應，但可在統計顯著量之個體中達成，如藉由業內已知之任一統計測試(例如司徒登氏t測試(Student’s t-test)、卡平方測試(chi2-test)、根據Mann及Whitney之U測試、克魯斯卡爾-沃利斯測試(Kruskal-Wallis test，H測試)、喬治-斯特拉測試(Jonckheere-Terpstra-test)及維克松測試(Wilcoxon-test))來確定。
如本文所使用，「Tris」(2-胺基-2-羥基甲基-丙烷-1,3-二醇)與TRIS、Tris鹼、曲茲馬(Trizma)、曲沙明(Trisamine)、THAM、曲美胺(Tromethamine)、曲美他醇(Trometamol)、曲美噻(Tromethane)及曲沙米醇(Trisaminol)同義。
「腫瘤」在其應用至經診斷患或懷疑患腫瘤之個體時係指具有任一大小之惡性或潛在惡性贅瘤或組織塊，且包括原發性腫瘤及繼發性贅瘤。實體腫瘤係通常不含囊腫或液體區域之組織之異常生長或塊。不同類型之實體腫瘤針對形成其之細胞類型來命名。實體腫瘤之實例係肉瘤、癌及淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不會形成實體腫瘤(National Cancer Institute,Dictionary of Cancer Terms)。
「腫瘤負荷」亦稱為「腫瘤負載」，係指分佈於整個體內之腫瘤物質之總量。腫瘤負荷係指整個體內之癌症細胞總量或腫瘤之總大小，包括淋巴結及骨髓。腫瘤負荷可藉由業內已知之各種方法來測定，例如當腫瘤自個體移除時(例如)使用卡尺、或當在體內時使用成像技術(例如超音波、骨掃描、電腦斷層攝影(CT)或磁共振成像(MRI)掃描)量測其尺寸。
術語「腫瘤大小」係指腫瘤之總大小，其可量測為腫瘤之長度及寬度。腫瘤大小可藉由業內已知之各種方法來測定，例如當腫瘤自個體移除時(例如)使用卡尺、或當在體內時使用成像技術(例如骨掃描、超音波、CT或MRI掃描)量測其尺寸。
III.抗體結晶
本發明部分地係基於用於派姆單抗之結晶條件之鑑別。結晶條件包含以下各項之獨特組合：(1)沈澱劑溶液，其包含高鹽濃度(即，1.0M至2.5M或1.5M至2.0M下之ADP)且具有酸性pH(即，以下4.0至5.0、4.2至4.8、4.4至4.6或4.5中之任一者之pH)；及(2)高溫(即，至少25℃且至多50℃)。在實施例中，可藉由包括在沈澱劑溶液中之緩衝劑將pH維持在所需範圍內。適宜緩衝劑包括(例如)Tris-HCl、磷酸氫銨、組胺酸及氫氧化銨。較佳係針對欲實施結晶之溫度來確定沈澱劑溶液之pH，在一個實施例中，該溫度為27℃至約30℃之溫度。本發明之結晶條件與若干結晶技術均相容，且能夠端視結晶體之預期用途產生具有各種長度(包括1微米至20微米及5微米至100微米)之抗PD-1 mAb結晶型以及具有低解析度(例如，3.5Å)或高解析度(例如，2.3Å)之結晶體。
已知各種蛋白質結晶方法。Giege等人(1994)Giege.D50：339；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1。該等技術包括懸滴蒸氣擴散(McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300)、沉滴蒸氣擴散、微批 量法及透析。
懸滴及沉滴蒸氣擴散需要容許含有經純化蛋白質、緩衝劑及沈澱劑之小滴與含有較高濃度之類似緩衝劑及沈澱劑較大貯存器進行平衡。最初，蛋白質溶液之小滴含有不足以結晶之濃度之沈澱劑，但在水自該小滴蒸發並轉移至貯存器時，沈澱劑濃度會增加至結晶最佳之水準。由於系統處於平衡中，故維持該等最佳條件直至完成結晶為止。懸滴方法與沉滴方法之不同之處在於蛋白質溶液滴在系統內垂直定向。
在微批量法方法中，將多肽與沈澱劑混合以達成過飽和，且密封器皿，並擱置一旁直至出現結晶體為止。
在透析方法中，多肽保留於與含有沈澱劑之溶液接觸之透析膜之一側。跨膜平衡會增加沈澱劑濃度藉此使得多肽達到過飽和水準。
使用該等技術中之一部分來製備本發明之派姆單抗結晶體，如實例1至7中更詳細闡述。高通量實例最適於篩選以最佳化沈澱劑溶液，而非用於大規模結晶體產生。
本發明結晶方法中所使用之抗PD-1 mAb溶液將具有3mg/ml至100mg/ml之抗體濃度且在約10mM組胺酸之緩衝劑(pH約5.5)中便捷地提供。
關於例如用於治療用途之抗PD-1 mAb結晶體之大規模產生，實例5及9至11總結批量法結晶方案。在實施例中，使派姆單抗自溶液結晶之批量法包含製備在1.8M至2.5M ADP中包含至少10mg/ml派姆單抗且具有約4.4至4.6之pH之結晶混合物。在實施例中，結晶混合物進一步包含選自由3%1,5二胺基戊烷二鹽酸鹽、3%異丙醇及4%丙二醇組成之添加劑。可使用業內已知之方法(例如離心、透析及各種過濾方法，包括中空纖維切向流過濾)自批量法結晶混合物收穫結晶體。
可藉由各種方法分析抗PD-1 mAb結晶體來檢查或表徵其物理性 質，例如結晶體大小、形狀、表面形態、總表面積及孔隙度。該等分析技術包括(例如)電子繞射及固態核磁共振(ssNMR)、光學顯微術、穿透電子顯微術、掃描電子顯微術、原子力顯微術及各種光散射技術。
呈本發明結晶體形式之抗PD-1 mAb之生物活性及/或生物物理性質可藉由將抗體結晶體「再溶解」或溶解於適於期望分析技術之緩衝劑中來分析。例如，可藉由ELISA、粒徑篩析層析、SDS PAGE及動態光散射中之一或多者分析經溶解抗PD-1 mAb。本文之本發明者預計本文所闡述之結晶條件將可用於批量法結晶技術來製備派姆單抗及結構上類似之抗PD-1 mAb(即派姆單抗變體及派姆單抗生物相似藥)之結晶懸浮液。由於使用高結晶溫度(至少25℃且至多50℃)，本發明者預計使用該等條件產生之結晶懸浮液及包含該等結晶體之醫藥組合物可在室溫下儲存至少一個月之時段且抗PD-1 mAb之生物活性或穩定性極少改變或不發生改變。
已自根據本發明製備之抗體結晶體溶解之抗PD-1 mAb(派姆單抗、派姆單抗變體或派姆單抗生物相似藥)應使預結晶起始材料之性質保持在可接受容限內。各種功能參數之可接受容限可基於預期用途而變化，但關於結合親和力或生物活性，可包括保留最初(非結晶)親和力或活性之至少80%、至少90%或至少95%。例如，可使用闡述於實例12中之方法量測抗PD-1 mAb阻斷PD-L1結合至PD-1之能力。
如本文實例11至12中所闡述，自溶解派姆單抗結晶體獲得之派姆單抗及尚未結晶之派姆單抗之生物活性及生物物理性質係使用ELISA及粒徑篩析層析來比較且經確定係實質上類似的。該等結果支持包含派姆單抗結晶體之醫藥組合物用於治療性治療人類個體之用途。
IV. 醫藥組合物
為製備醫藥組合物，將本發明之抗PD-1 mAb結晶體或自該等結 晶體溶解之抗PD-1 mAb與至少一種醫藥上可接受之賦形劑混合。參見例如Remington'sPharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing公司，Easton,PA(1984)。並不要求用於本發明醫藥組合物中之抗PD-1 mAb結晶體具有任何具體繞射品質，只要抗體之生物活性及穩定性維持在期望範圍內即可。
在一些實施例中，在結晶期間或之後將賦形劑直接添加至結晶液劑。在其他實施例中，首先自液劑收穫結晶體，藉由於穩定溶液中之懸浮液洗滌，自穩定溶液收穫且然後將其懸浮於包含賦形劑之液體溶液中。組合物之液體可為任一醫藥上可接受之介質，且可包括(例如)水溶液及油包水混合物。
可藉由(例如)藉由使氮、空氣或惰性氣體流於結晶體上方穿過、藉由空氣乾燥、真空乾燥或凍乾乾燥包含結晶體及期望賦形劑之液體懸浮液來製備呈固體形式之結晶體醫藥組合物。最終產品中之水分含量通常將少於10重量%、7重量%、5重量%或3重量%。
呈液體懸浮液形式或呈乾燥固體形式之包含已自派姆單抗結晶體溶解之派姆單抗醫藥組合物可藉由以下來製備：將期望量之結晶體添加至醫藥上可接受之溶解緩衝劑中，並在4℃下培育直至結晶體溶解為止。在實施例中，溶解緩衝劑包含10mM組胺酸(pH 5.6)、0.02%聚山梨醇酯80及至多4%蔗糖w/v。在實施例中，所得組合物中之任何微粒均在投與之前藉由(例如)離心或過濾去除。
V. 治療方法
可由臨床醫師(例如)使用業內已知或懷疑可影響治療或預測可影響治療之參數或因素確定用於治療具體患者之具體癌症之本發明醫藥組合物之適當劑量。例如，醫師可選擇利用稍少於最佳劑量或批准劑量之劑量來起始治療，且然後以小增量增加劑量直至相對於任何負面 副效應達成期望或最佳效應為止。
在實施例中，組合物之劑量及投與途徑將提供於派姆單抗抗體之中值暴露，其與由200mg Q2W或Q3W劑量下之未結晶派姆單抗所提供者實質上類似。
熟習此項技術者結合業內常識可自含於本文中之教示明瞭本發明之該等及其他態樣(包括下文所列示之例示性特定實施例)。
VI.本發明之例示性特定實施例
1.一種抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體，其中該mAb係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體。
2.如實施例1之結晶體，其中該結晶體之特徵在於具有選自由以下組成之群之範圍之長度：1微米至200微米、1微米至100微米、1微米至20微米、5微米至100微米、5微米至50微米5微米至40微米、5微米至30微米、5微米至20微米、5微米至10微米、10微米至100微米、10微米至50微米及10微米至20微米。
3.如實施例3之結晶體，其中該結晶體之特徵在於具有5微米至10微米、5微米至20微米或5微米至40微米之長度。
4.如實施例2之結晶體，其中該結晶體之特徵在於具有50微米至100微米之長度。
5.如實施例1至4中之任一者之結晶體，其特徵在於a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°之單位晶胞尺寸及P212121之空間群。
6.如上述實施例中之任一者之結晶體，其能夠將X射線繞射至選自由以下組成之群之解析度：2.3Å至3.5Å、2.3Å至3.0Å、2.3Å至2.75Å、2.3Å至2.5Å及2.3Å。
7.如上述實施例中之任一者之結晶體，其係懸浮於包含該相同抗PD-1 mAb之其他結晶體之液體介質中。
8.如上述實施例中之任一者之結晶體，其中該抗PD-1 mAb係派姆單抗。
9.一種產生抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體之方法，其中該mAb係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體，且該方法包含在為至少25℃且不大於50℃、45℃、40℃或37℃之溫度下使包含該抗PD-1 mAb之溶液暴露於沈澱劑溶液達足以形成結晶體之時間，其中該沈澱劑溶液具有4.0至5.0之pH且包含1.0M至2.5M磷酸二氫銨。
10.如實施例9之方法，其中該暴露步驟包含混合該抗體溶液及該沈澱劑溶液以形成結晶混合物並將結晶製程施加至該混合物。
11.如實施例10之方法，其中該結晶製程選自由以下組成之群：懸滴蒸氣擴散、沉滴蒸氣擴散及批量法。
12.如實施例11之方法，其中該結晶製程係批量法製程且該方法進一步包含利用該抗PD-1 mAb之結晶體對該結晶混合物加晶種。
13.如實施例9至12中之任一者之方法，其中該結晶混合物中之抗體濃度為約10mg/ml或約20mg/ml。
14.如實施例9之方法，其中該暴露步驟包含使用30kD分子量截留膜針對該沈澱劑溶液透析該抗體溶液。
15.如實施例9至14中之任一者之方法，其中該抗體溶液包含該抗PD-1 mAb，其濃度為2mg/ml至200mg/ml、3mg/ml至100mg/ml、10mg/ml至90mg/ml、20mg/ml至80mg/ml、30mg/ml至70mg/ml、40mg/ml至60mg/ml或約50mg/ml。
16.如實施例9至15中之任一者之方法，其中該沈澱劑溶液具有選自由以下組成之群之pH：4.2至4.8、4.4至4.6及4.5。
17.如實施例9至16中之任一者之方法，其中該沈澱劑溶液進一步包含緩衝劑。
18.如實施例17之方法，其中該緩衝劑係Tris-HCl、磷酸氫銨、氫氧化銨或組胺酸。
19.如實施例9至18中之任一者之方法，其中該沈澱劑溶液基本上由1.5M至2.0M磷酸二氫銨及100mM至120mM Tris-HCl組成。
20.如實施例9至17中之任一者之方法，其中該沈澱劑溶液包含磷酸二氫銨及磷酸氫銨之混合物。
21.如實施例20之方法，其中該沈澱劑溶液基本上由1.9M磷酸二氫銨及0.09M磷酸氫銨組成。
22.如實施例9至中之任一者21之方法，其中該暴露步驟係在約30℃之溫度下實施至少3天、4天或5天。
23.一種使抗PD-1單株抗體(mAb)自包含該抗PD-1 mAb之溶液結晶之方法，其中該抗體係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體且該方法包含：(a)合併該抗PD-1 mAb溶液與沈澱劑溶液及該抗PD-1 mAb之晶種結晶體以產生加晶種之結晶混合物；(b)在至少20℃且不大於40℃之溫度下培育該加晶種之結晶混合物；及(c)收穫結晶體。
24.如實施例23之方法，其中該培育溫度為約30℃且該沈澱劑溶液包含選自由以下組成之群之混合物：(1)20%聚乙二醇4000(PEG 4K)及20%異丙醇；(2)18%聚乙二醇10000(PEG 10K)、20%甘油、100mM Tris-HCl(pH 8.5)；及(3)2.0M磷酸二氫銨及100mM Tris-HCl。
25.如實施例23之方法，其中該培育溫度為約22℃且該沈澱劑溶液包含選自由以下組成之群之混合物：(1)25%PEG 4K、100mM Tris-HCl(pH 8.5)及100mM CaCl2及(2)1.26M硫酸銨、乙酸鈉(pH 4.5)及0.2M NaCl。
26.如實施例23至25中之任一者之方法，其中該晶種結晶體係 來自藉由如實施例9至22中之任一者之方法產生之該抗PD-1 mAb之結晶體之晶種儲備。
27.如實施例9至26中之任一者之方法，其中該抗PD-1 mAb係派姆單抗。
28.一種抗PD-1 mAb結晶體，其係藉由如實施例9至27中之任一者之方法產生。
29.一種醫藥組合物，其包含(a)抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體，其中該抗體係派姆單抗、派姆單抗變體或呈派姆單抗生物相似藥形式之抗體；及(b)至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
30.如實施例29之組合物，其中該賦形劑實施選自由囊封該等結晶體、包埋該等結晶體及維持該等結晶體穩定組成之群之至少一種功能。
31.如實施例29或30之組合物，其中該等抗PD-1 mAb結晶體中之每一者均係如實施例1至8或27中之任一者之結晶體。
32.如實施例29至31中之任一者之組合物，其係液體。
33.如實施例29至31中之任一者之組合物，其係固體。
34.如實施例29至32中之任一者之組合物，其中該組合物中之抗PD-1 mAb濃度為至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少200mg/ml或至少250mg/ml。
35.如實施例29至34中之任一者之組合物，其中在將該組合物在20℃至25℃下儲存至少一個月之後存在該抗PD-1 mAb之生物活性之至少95%。
36.一種治療人類個體之癌症之方法，其包含向該患者投與治療有效量如實施例29至35中之任一者之醫藥組合物。
37.如實施例36之方法，其中該癌症係膀胱癌、乳癌、透明細胞腎癌、頭/頸鱗狀細胞癌、肺鱗狀細胞癌、惡性黑色素瘤、非小細 胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌症、小細胞肺癌(SCLC)、三陰性乳癌、急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV陽性DLBCL、原發性縱膈大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富型大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤(MM)、骨髓細胞白血病-1蛋白質(Mcl-1)、骨髓增生異常症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
38.如實施例36或37之方法，其中該醫藥組合物包含至少200mg/ml之該mAb且係以皮下方式投與。
39.如實施36至38中之任一者之方法，其中該癌症係實體腫瘤，且在第一次投與該醫藥組合物之前自該個體去除之該癌症之組織切片經測試對於PD-L1及PD-L2中之一者或二者之表現為陽性。
40.如實施例39之方法，其中藉由免疫組織化學(IHC)分析該組織切片中該等腫瘤細胞之至少50%經測試對於PD-L1表現為陽性。
參考以下實例可最好的瞭解本發明之寬範圍，該等實例並非意欲將本發明限於特定實施例。本文所闡述之特定實施例僅以實例方式提供，且本發明應受到隨附申請專利範圍以及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範圍的限制。
實例 實例1：派姆單抗之滴式蒸氣擴散結晶篩選
於10mM組胺酸(pH 5.6)中製備34mg/ml全長度派姆單抗之溶液。自Hampton Research(Aliso Viejo,CA,USA)在MRC 96孔結晶板中實施之沉滴蒸氣擴散實驗中篩選此溶液，且四次市售高通量篩選來自Rigaku公司(Seattle,WA,USA)及Jena Bioscience(Jena,DE,USA)。每次篩選均由96種獨特溶液組成，其總結於下表2中。
Figure 105105288-A0202-12-0027-5
對於每一篩選實驗，將派姆單抗溶液(0.2μl)與篩選溶液(0.2μl)混合，並使用來自Douglas Instruments公司(Hungerford,Berkshire,UK)之Oryx結晶機器人將其在板孔中在80μl篩選溶液上方分層。針對每一篩選溶液在4℃、18℃及30℃中之每一者下實施實驗；因此，總共測試1,152種不同結晶條件。用顯微鏡監測板孔隨時間之結晶體形成。
3天後僅在測試條件中之一者下觀察到結晶體：30℃，利用Jena 2(Salt)#91(100mM Tris-HCl(pH 8.5),2.0M磷酸二氫銨)。使用來自Formulatrix(Bedford,MA,USA)之SONICC成像系統顯現結晶體。SONICC系統具有兩種成像方法：二次諧波產生(Second Harmonic Generation，SHG)，其探查結晶度，及紫外線雙光子激發螢光(Ultraviolet Two-Photon Excited Fluorescence，UV-TPEF)，其特異於蛋白質性試樣。所觀察到結晶體之影像顯示於圖4A(SHG)及圖4B(UV-TPEF)中。
實例2：派姆單抗之自由界面擴散結晶篩選
基於僅在實例1中在30℃下形成之結晶體，選擇此溫度使用自由界面擴散技術進一步研究用於派姆單抗之篩選條件。
於10mM組胺酸(pH 5.6)中且在具有或沒有0.02%聚山梨醇酯80下製備具有34mg/ml派姆單抗之抗體溶液，且在Topaz晶片及來自Fluidigm公司(South San Francisco,CA,USA)之結晶器中利用與實例1中所使用相同之篩選溶液進行篩選。在30℃下培育晶片並使用Fluidigm自動化成像系統用顯微鏡進行監測。僅在Jena 2(Jena Bioscience)編號91溶液(100mM Tris,pH 8.5,2.0M磷酸二氫銨)下再次觀察到結晶體。來自兩種不同派姆單抗溶液之所觀察到結晶體之影像顯示於圖5A(具有0.02%聚山梨醇酯80之抗體溶液)及圖5B(沒有聚山梨醇酯80之抗體溶液)中。
實例3：派姆單抗之微種晶基質篩選
此實例研究派姆單抗可自加有預存派姆單抗結晶體之晶種之溶液結晶之條件。所篩選沈澱劑溶液係實例1中所闡述之該四種市售篩選物。
自在實例1中藉由合併1μl派姆單抗結晶體懸浮液及99μl之1.8M ADP、100mM Tris-HCl之穩定溶液(藉由混合適當量之2.5M ADP及1M Tris-HCl(pH 8.5)之原液製備)產生之結晶體懸浮液(於2.0M ADP、100mM Tris-HCl中之派姆單抗結晶體)製備派姆單抗結晶體之晶種儲備。在10mM組胺酸(pH 5.6)中製備34mg/ml派姆單抗之抗體溶液。在MRC 96孔結晶板(Hampton Research)中實施沉滴蒸氣擴散實驗。
對於每一篩選實驗，將派姆單抗溶液(0.3μl)與篩選溶液(0.3μl)及0.1μl晶種儲備混合並使用Oryx結晶機器人在板孔中在80μl篩選溶液上方分層。針對每一篩選溶液在22℃及30℃中之每一者下實施實驗；因此，總共測試768種結晶條件。用顯微鏡監測板孔隨時間之結晶體，且在1週後在顯示於下表3中之5種條件下用顯微鏡觀察結晶體。結晶體藉由SONICC(UV正性)之顯現證實所觀察結晶體之內容物為蛋白質。
Figure 105105288-A0202-12-0029-6
實例4：在ADP/Tris-HCl中蒸氣擴散結晶之最佳化.
為鑑別適於製備繞射品質結晶體之最佳ADP濃度及pH條件，實施以下篩選實驗，該等實驗檢查pH在8.8至9.4之間變化之100mM Tris-HCl及濃度在1.60M至1.74M之間變化之ADP之混合物。相對於在VDX 24孔(6×4陣列)結晶板(Hampton Research)中使用OptiMatrix MakerTM液體處置系統(Rigaku公司，Seattle,WA,USA)設計之慣常最佳化篩選，在懸滴蒸氣擴散實驗中設置派姆單抗(34mg/ml,10mM組胺酸，pH 5.6)。對於每一篩選實驗，將由1.0μl蛋白質+1.0μl篩選溶液組成之懸滴置於22mm蓋玻片之下側上並置於含有1ml篩選溶液之孔上，使得100mM Tris-HCl組份之pH在垂直的4個孔中有所變化且ADP濃度在水平的6個孔上有所變化。在30℃下培育該板並隨時間用顯微鏡監測。圖6顯示在3天後在100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1.5M ADP篩選溶液中觀察到之結晶體之顯微照片。
實例5：於ADP/Tris-HCl中派姆單抗之批量法結晶.
藉由在22℃下將10μl 50mg/ml派姆單抗溶液(10mM組胺酸，pH 5.6)與50μl 120mM Tris-HCl(pH 8.5)、1.8M ADP合併來製備結晶混合物。將此結晶混合物置於放置於VDX板(Hampton Research)之孔內側之Micro-Bridge(Hampton Research)中。該孔含有1ml 100mM Tris-HCl(pH 8.5)、1440mM ADP。使用22mm玻璃蓋玻片密封該孔並將該 孔在30℃下培育5天。所得結晶懸浮液之顯微照片顯示於圖7中。觀察到在約5微米至至少約20微米範圍內之結晶體大小。
實例6：用於最佳化蒸氣擴散結晶條件之添加劑篩選.
在10mM組胺酸(pH 5.6)中製備34mg/ml派姆單抗之溶液。在沉滴蒸氣擴散實驗中針對使用Additive Screen HTTM套組(Hampton Research)製備之96種沈澱劑溶液篩選此派姆單抗溶液。此套組含有96種不同的添加劑溶液。
對於每一添加劑，將80μl含有72μl 1.74mM ADP、100mM Tris-HCl(pH 9.0)之沈澱劑溶液及8.0μl添加劑溶液添加至MRC 96孔結晶板之孔中。將派姆單抗溶液(0.2μl)與孔溶液(0.2μl)混合並使用Oryx結晶機器人(Douglas Instruments)在80μl孔溶液上方分層。密封該板並在30℃下培育並隨時間用顯微鏡監測。在3天至7天後觀察到結晶體。1週後，在含有以下添加劑中之一者之Tris、ADP沈澱劑溶液中觀察到結晶體：(a)3%1,5二-胺基戊烷二鹽酸鹽、(b)3%異丙醇或(c)4%丙二醇。然而，在其他93種沈澱劑溶液中之任一者下並未觀察到結晶體，表明彼等溶液中之添加劑阻礙結晶體成核或生長。
實例7：派姆單抗結晶體之X射線繞射分析.
使用懸滴技術在30℃下生長全長度派姆單抗之繞射品質結晶體。將派姆單抗於10mM組胺酸(pH 5.6)(1μl)中之34mg/ml溶液與1.8M磷酸二氫銨、100mM Tris-HCl(pH 8.0)(1μl)合併。在7天至60天後收穫結晶體，並使用於1.5M硫酸銨、0.2M NaCl中之飽和(100%)蔗糖溶液或於1.5M硫酸銨、0.2M NaCl中之35%乙二醇進行低溫保護。
在ID-17(Argonne National Laboratory,Argonne,Ill.,USA)處使用同步加速器輻射收集X射線繞射數據，並使用autoPROC(Vonrhein C.等人，Acta Cryst.D67：293-302(2011))處理並按比例縮放。自蔗糖保 護之結晶體獲得最好數據集，且延伸至2.28埃(Å)。基於24個數據集，派姆單抗之結晶體屬a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å且α=β=γ=90°之P212121系統。
使用如PHASER中所執行之分子替代程序自X射線繞射數據解析派姆單抗結構(McCoy A.J.等人，J.Appl.Cryst.40：658-674(2007))。使用抗IL-23p19 mAb之fab之結構及IgG4 FC結構(PDB條目4C54,Davies A.M.等人，J.Mol.Biol.：426(3)：630-644(2014))(其中去除糖及水)作為搜尋模型。最初利用REFMAC(Murshudov G.N.等人，Acta Crystall.D53：240-25(1997))且隨後利用autoBUSTER(Bricogne G等人BUSTER 2.11.5.[網際網路].Cambridge 2011)實施精修。在COOT(Emsley P等人，Acta Cryst.D66：486-501(2010))中建立模型。最終模型含有全抗體(兩條輕鏈及兩條重鏈、兩條7殘基糖鏈)、5個硫酸根離子及來自低溫保護劑溶液之3個蔗糖分子及480個水分子。
圖解說明於圖8中之派姆單抗結構係約140Å寬及120Å長之四聚體。Fc結構域在兩條鏈上在CH2結構域在Asn297處中糖基化。
實例8：在磷酸銨混合物中之蒸氣擴散結晶.
此實例研究沈澱劑溶液中除Tris-HCl以外之緩衝劑之用途。在沉滴蒸氣擴散實驗中使用96種不同磷酸二氫銨/磷酸氫二銨混合物之篩選基質篩選派姆單抗溶液(34mg/ml抗體，10mM組胺酸，pH 5.6)，其中單鹼式組份與二鹼式組份之比率有所變化但總磷酸鹽濃度保持恆定為1.99M。使用Oryx結晶機器人(Douglas Instruments有限公司)，在MRC-2 96孔結晶板(Hampton Research)之孔中將由0.25μl派姆單抗溶液+0.75μl篩選溶液組成之液滴分配於80μl該篩選溶液上方。在30℃下培育該板並使用Rock Imager 1000系統(Formulatrix,Bedford,MA)監測。自1天至56天觀察結晶體。在3天後在1.9M ADP、0.09M AHP沈澱劑溶液中觀察到之結晶體之顯微照片顯示於圖9中。
實例9：於Tris/ADP中派姆單抗之批量法結晶(1ml規模).
藉由在4℃下合併167μl派姆單抗溶液(47mg/ml,10mM組胺酸，pH 5.5)及833μl沈澱劑溶液(120mM Tris-HCl,pH 8.4，及1.9M ADP)在1.5ml微離心管中製備抗體混合物。將含有抗體混合物之該管在30℃下培育5天。
實例10：於Tris/ADP中派姆單抗之批量法透析結晶.
在30℃下在DispoDialyzer®中使用30kD分子量截留膜(Spectrum Laboratories公司，Rancho Dominguez,CA USA)針對20ml 100mM Tris-HCl(pH 8.4)、1.9M磷酸二氫銨將200微升派姆單抗溶液(47mg/ml抗體，10mM組胺酸，pH 5.5)透析5天。如實例11中所闡述收穫結晶懸浮液。
實例11：自結晶懸浮液製備派姆單抗溶液.
使用ADP/Tris-HCl作為沈澱劑藉由合併來自各蒸氣擴散實驗之眾多液滴獲得結晶懸浮液之210μl等份試樣，且其含有總共約400mg派姆單抗結晶體。在室溫下在Fischer牌微離心管中以5000rpm將等份試樣離心5分鐘。藉由抽吸去除上清液(母液)並將糰粒(派姆單抗結晶體)再懸浮於300μl穩定溶液(100mM Tris-HCl,pH 8.4,1.9M ADP)中。在室溫下將所得懸浮液在微離心管中以5,000rpm離心5分鐘。藉由抽吸去除上清液(洗滌)並將所得糰粒(派姆單抗結晶體)再懸浮於500μl溶解緩衝劑(10mM組胺酸，pH 5.5)中並在4℃下培育30分鐘。藉由在4℃下在微離心管中以5,000rpm離心5分鐘使所得派姆單抗溶液澄清。使用澄清派姆單抗溶液用於實例12及13中所闡述之表徵研究。
實例12及13. 自派姆單抗結晶體溶解之派姆單抗之表徵.
使用ELISA及粒徑篩析層析(SEC)表徵以下試樣。
試樣1：200μl起始派姆單抗溶液(40mg/ml於10mM組胺酸中之抗體，pH 5.6)； 試樣2：500μl溶解派姆單抗(自如實例11中所闡述之派姆單抗結晶懸浮液獲得之再溶解結晶體)；及試樣3：500μl 10mM組胺酸(pH 5.6)(緩衝劑對照)
在競爭性結合ELISA中量測試樣1及2中派姆單抗之生物活性，該方法量測派姆單抗與PD-L1競爭並結合至固定於ELISA板上之PD-1受體分子之能力。使用上述試樣之連續稀釋液在恆定濃度之PD-L1存在下生成劑量反應曲線。使用四參數邏輯曲線擬合分析程式確定每一試樣之EC50值(展現最大結合之50%之派姆單抗濃度)。藉由應用劑量反應曲線之平行線分析在SoftMax® Pro 6軟體(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中計算相對功效。以下顯示相對於試樣1以幾何標准偏差及95%信賴區間以幾何平均功效報告之試樣2之競爭性結合功效。
Figure 105105288-A0202-12-0033-7
該等結果指示，在競爭性結合ELISA中一直未結晶之派姆單抗及自結晶派姆單抗懸浮液收穫之派姆單抗結晶體溶解之派姆單抗具有相當之生物活性。
在環境溫度(25℃)下在Waters Acquity UPLC®系統上使用UP-SEC分析實施SEC表徵，該分析採用Waters BEH2000管柱(Waters公司，Milford,MA,USA；P/N：186005225)。取樣器之溫度控制為4℃。使用100mM磷酸鈉、100mM NaCl(pH 7.0)作為移動相以0.5ml/min之流速實施分離。運行時間為5分鐘，其中A214作為建議檢測波長，且亦收集A280。試樣1及2中之每一者之分離圖形分別顯示於圖10A及圖10B中。
本文所引用之所有參考文獻皆以引用方式併入，其併入程度如 同每一個別出版物、數據庫條目(例如，基因庫序列或GeneID條目)、專利申請案或專利均特別且個別地指示以引用方式併入一般。以引用方式併入之專用闡述(若存在)包括在說明書內並不以任一方式減弱以引用方式併入之此一般闡述。本文中參考文獻之引用並非意欲承認該參考文獻係相關先前技術，亦不欲構成對該參考文獻之內容或出版日期之任何承認。
表4提供序列表中序列之簡單闡述。
Figure 105105288-A0202-12-0034-8
<110> 美商默沙東藥廠(Merck Sharp & Dohme Corp.)
<120> 抗人類PD-1單株抗體之結晶體
<140> TW105105288
<141> 2016-02-23
<150> US 62/121867
<151> 2015-02-27
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR
<400> 1
Figure 105105288-A0305-02-0037-1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR
<400> 2
Figure 105105288-A0305-02-0037-2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR
<400> 3
Figure 105105288-A0305-02-0038-3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體重鏈CDR
<400> 4
Figure 105105288-A0305-02-0038-4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體重鏈CDR
<400> 5
Figure 105105288-A0305-02-0038-5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗體重鏈CDR
<400> 6
Figure 105105288-A0305-02-0038-6
<210> 7
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體重鏈
<400> 7
Figure 105105288-A0305-02-0039-7
Figure 105105288-A0305-02-0040-8
Figure 105105288-A0305-02-0041-9
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化輕鏈
<400> 8
Figure 105105288-A0305-02-0041-10
Figure 105105288-A0305-02-0042-11

Claims (17)

  1. 一種抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體，其中該抗PD-1 mAb係派姆單抗(pembrolizumab)，且該結晶體之特徵在於a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°之單位晶胞尺寸及P212121之空間群。
  2. 如請求項1之結晶體，其中該結晶體之特徵在於具有1微米至200微米之範圍的長度。
  3. 如請求項1或2之結晶體，其能夠將X射線繞射至選自由以下組成之群之解析度：2.3Å至3.5Å、2.3Å至3.0Å、2.3Å至2.75Å、2.3Å至2.5Å及2.3Å。
  4. 一種產生抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體之方法，其中該抗PD-1 mAb係派姆單抗，且該方法包含使包含該抗PD-1 mAb之溶液在至少25℃且不大於50℃之溫度下暴露於沈澱劑溶液達足以形成結晶體之時間，其中該沈澱劑溶液具有4.0至5.0之pH且包含1.0M至2.5M磷酸二氫銨。
  5. 如請求項4之方法，其中該暴露步驟包含混合該抗體溶液及該沈澱劑溶液以形成結晶混合物並將結晶方法施加至該混合物，其中該結晶方法係選自由以下組成之群：懸滴蒸氣擴散、沉滴蒸氣擴散及批量法。
  6. 如請求項5之方法，其中該結晶方法係批量法且該方法進一步包含利用該抗PD-1 mAb之結晶體對該結晶混合物加晶種。
  7. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該抗體溶液包含濃2mg/ml至200mg/ml之該抗PD-1 mAb，且該沈澱劑溶液具有4.2至4.8之pH。
  8. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該沈澱劑溶液包含(a)1.5M 至2.0M磷酸二氫銨及100M至120mM Tris-HCl或(b)1.9M磷酸二氫銨及0.09M磷酸氫銨。
  9. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該暴露步驟係在約30℃之溫度下實施至少3天、4天或5天。
  10. 一種使抗PD-1單株抗體(mAb)自包含該抗PD-1 mAb之溶液結晶之方法，其中該抗體係派姆單抗，且該方法包含：(a)合併該抗PD-1 mAb溶液與沈澱劑溶液及該抗PD-1 mAb之晶種結晶體，以產生加晶種之結晶混合物；(b)在至少20℃且不大於約40℃之溫度下培育該加晶種之結晶混合物；及(c)收穫該等結晶體，其中該等晶種結晶體係來自藉由如請求項4至9中任一項之方法產生之該抗PD-1 mAb之結晶體之晶種儲備。
  11. 一種醫藥組合物，其包含(a)抗PD-1單株抗體(mAb)之結晶體，其中該抗體係派姆單抗；及(b)至少一種醫藥上可接受之賦形劑，其中該組合物中該等抗PD-1 mAb結晶體中之每一者係如請求項1至5中任一項所界定之結晶體或係藉由如請求項4至9中任一項之方法產生之結晶體。
  12. 如請求項11之組合物，其中該等抗PD-1 mAb結晶體係懸浮於液體中，且該組合物中抗PD-1 mAb之濃度為至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少200mg/ml或至少250mg/ml。
  13. 如請求項11之組合物，其係固體。
  14. 一種如請求項11至13中任一項之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療人類個體之癌症之藥劑。
  15. 如請求項14之用途，其中該癌症係膀胱癌、乳癌、透明細胞腎癌、頭/頸鱗狀細胞癌、肺鱗狀細胞癌、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌症、小細胞肺癌(SCLC)、三陰性乳癌、急性淋巴胚細胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV陽性DLBCL、原發性縱膈大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富型大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤(MM)、骨髓細胞白血病-1蛋白質(Mcl-1)、骨髓增生異常症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
  16. 如請求項15之用途，其中該醫藥組合物包含至少200mg/ml之該mAb，且係用於皮下投與。
  17. 如請求項14至16中任一項之用途，其中該癌症係實體腫瘤，且在第一次投與該藥劑之前，自該個體去除之該癌症組織切片經測試對於PD-L1及PD-L2中之一者或二者之表現為陽性。
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