JP2018510142A - 抗ヒトｐｄ−１モノクローナル抗体の結晶 - Google Patents

Abstract

ペンブロリズマブおよび構造的に類似した抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の結晶、ならびにそのような結晶の製造方法、ならびに例えば癌の治療における、そのような抗体結晶を含む組成物の使用が提供される。本発明は、ペンブロリズマブ結晶およびペンブロリズマブ結晶の製造方法を提供することにより、これらの要求を満たして余りあるものである。本発明の製造方法の実施形態の１つは、Ｘ線回折に適した結晶を製造し、本発明者らはそのような結晶を本発明において使用して、ペンブロリズマブの三次元構造を２．３オングストロームまでの分解能で解明した。【選択図】図８Ｂ

Description

本発明は全般的にはモノクローナル抗体の結晶形態に関する。より詳細には、本発明は、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）およびその構造変異体の結晶、そのような抗体結晶を含む医薬組成物、ならびに癌の治療におけるそのような組成物の使用に関する。

多数の腫瘍は、腫瘍に対する内因性免疫応答をもたらす抗原を産生する。しかし、腫瘍細胞は、局在化免疫抑制を引き起こす重要な免疫チェックポイントを活性化しうるため、この応答はしばしば無効である。これらの免疫チェックポイントの１つはヒト細胞表面受容体ＰＤ−１（プログラム死−１またはプログラム細胞死−１）であり、これは、活性化Ｔ細胞の表面上で発現される抑制性シグナリング受容体である。ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の１つの結合によるＰＤ−１抑制性シグナリングの活性化は、腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答の抑制をもたらす。腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答のこのＰＤ−１経路媒介性抑制に対処するために、幾つかの企業が、ヒトＰＤ−１に結合しＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発中である。

これらの抗ＰＤ−１ ｍＡｂの１つはペンブロリズマブであり、これは、イピリムマブに続いて、およびＢＲＡＦ Ｖ６００突然変異陽性の場合のＢＲＡＦインヒビターに続いて、切除不能または転移性黒色腫および疾患進行を伴う患者の治療に関して米国において承認されたヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂである。幾つかの他の癌適応症の治療におけるペンブロリズマブの有効性および安全性が研究されているところである。

ペンブロリズマブは現在、静脈内（ＩＶ）注入用に製剤化されており、２５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂを含むペンブロリズマブの凍結乾燥および溶液製剤がＷＯ２０１２／１３５４０８に記載されている。しかし、皮下投与されるように設計された高濃度製剤が望ましい代替物であろう。その１つの理由として、それは、患者がペンブロリズマブを自己投与することを可能にしうることが挙げられる。

治療用抗体は伝統的には凍結乾燥形態または溶液中で製造される。凍結乾燥形態は長期安定性の増強を示しうるが、使用前に再構成を要するため、それらは自己投与に理想的なものではない。溶液製剤は再構成を要さないが、安定性の低減を被り、典型的には使用前に冷却保存を要しうる。１．２ｍｌが皮下投与のための最大の好ましい体積であるため（Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６９３４−１９３９（２００３））、凍結乾燥製剤および溶液製剤は共に、皮下投与による高用量運搬を可能にするのに十分な程度に高い濃度をもたらさない可能性がある。しかし、抗体の高濃度溶液製剤は、達成可能であったとしても、溶液からの沈殿を生成し易い可能性もあり、あるいは例えば皮下投与、特に自己投与に必要とされる小口径針での運搬には粘度が高すぎる可能性がある。

高濃度抗体製剤を達成するための１つの提案されているアプローチは、抗体結晶を含有する製剤を製造することである。例えば、Ｙａｎｇら，前掲；米国特許第７，８３３，５２５号およびＷＯ２０１２／１３５０３５を参照されたい。抗体結晶の治療用抗体組成物を製造する理論的根拠には、室温における液体溶液中のタンパク質結晶の安定性の改善、高抗体濃度溶液の粘度の低さ、および所望の制御放出（コントロールリリース）特性のための種々の形態学的特徴を得るために結晶化条件を操作することが可能であることが含まれる（例えば、Ｙａｎｇら，前掲およびＢａｓｕ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａ．４：３０１−３１７（２００４）を参照されたい）。

抗体は重鎖および軽鎖の柔軟性ゆえに結晶化が特に困難であると考えられている。過去３０年間で無傷抗体の結晶化の多数の報告が存在するが、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎデータバンクには４つの構造体が寄託されているに過ぎず、これは、Ｆａｂアポまたは複合構造の８００個を超える構造体が寄託されていることと対照的である。Ａｌｔｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの研究者が、商業的に入手可能な３つのモノクローナル抗体、すなわち、リツキシマブ、トラスツズマブおよびインフリキシマブを結晶化するための結晶化方法を最初に記載した（ＷＯ０２／０７２６３６）。他の公開特許出願は抗ＩＬ−１３ ｍＡｂ（ＷＯ２００５／１２１１７７）、抗ＴＮＦアルファｍＡｂ（ＷＯ２００８／０５７２４０）、抗スクレロスチンｍＡｂ（ＷＯ２０１２／１３５０３５）および抗ＩＬ−２３ ｍＡｂ（ＷＯ２０１４／００４４３６）の結晶の製造方法を記載している。抗体を結晶化するための方法のこれらの例にもかかわらず、個々の抗体に関する適当な結晶化条件の特定は尚も経験的課題であること、およびどのような結晶化条件がその抗体の結晶を産生するのかを信頼可能な様態で予測するために個々の対象抗体に適用されうる一般則は存在しないことが、タンパク質結晶化の分野において一般に受け入れられている。

したがって、ペンブロリズマブの結晶形態の製造方法が必要とされている。そのような結晶は、Ｘ線回折分析によりペンブロリズマブの構造を解明するのに、および癌治療用のペンブロリズマブの改良された医薬組成物を製造するのに有用でありうる。

発明の概括
本発明は、ペンブロリズマブ結晶およびペンブロリズマブ結晶の製造方法を提供することにより、これらの要求を満たして余りあるものである。本発明の製造方法の実施形態の１つは、Ｘ線回折に適した結晶を製造し、本発明者らはそのような結晶を本発明において使用して、ペンブロリズマブの三次元構造を２．３オングストロームまでの分解能で解明した。

したがって、１つの態様においては、本発明は抗ＰＤ−１抗体の結晶を提供する。該抗体はペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である。１つの実施形態において、該結晶は該抗体および溶媒を含む。１つの実施形態において、結晶の長さは以下の範囲のいずれかの間である：１〜２００ミクロン、１〜１００ミクロン、１〜２０ミクロン、５〜１００ミクロン、５〜５０ミクロン、または５〜２０ミクロン。１つの実施形態において、該抗体結晶は、ａ＝６３．５〜７８．９オングストローム、ｂ＝１１０．２〜１１２．２オングストローム、ｃ＝２６２．５〜３０６オングストローム、α＝９０、β＝９０、γ＝９０°の単位格子寸法、およびＰ２_１２_１２_１の空間群により特徴づけられる。１つの実施形態において、該抗体結晶はＸ線を３．５オングストロームまたはそれより良好な（すなわち、３．５オングストローム未満の）分解能で回折する。

もう１つの態様において、本発明は抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶の製造方法を提供し、ここで、該ｍＡｂはペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である。該方法は、（ａ）結晶形成（結晶化）に十分な時間にわたって少なくとも２５℃かつ５０℃以下の温度でｍＡｂの溶液（抗体溶液）を沈殿剤溶液に曝露し、（ｂ）結晶を集めることを含む。１つの実施形態において、該曝露工程を約４０℃以下〜約４５℃の温度で行う。１つの実施形態において、該方法において使用される沈殿剤溶液は約４．０〜５．０のｐＨを有し、１．０Ｍ〜２．５Ｍ リン酸二水素アンモニウム（ＡＤＰ）を含む。１つの実施形態において、該沈殿剤溶液は、該沈殿剤溶液のｐＨをｐＨ４．０〜５．０に調節するための十分な量の緩衝剤をも含む。１つの実施形態において、該バッファー（緩衝剤）はＴｒｉｓ−ＨＣｌまたは第二リン酸アンモニウムである。１つの実施形態において、該抗体溶液は３〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ／ｍｌまたは約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む。１つの実施形態において、該抗体は少なくとも３、４または５日間のいずれかにわたって実施に付される。１つの実施形態において、該抗体溶液は１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）を含む。１つの実施形態において、該抗体溶液は更に、約０．０１％の最大濃度のポリソルベートを含む。１つの実施形態において、該曝露工程は、ハンギングドロップ（懸滴）蒸気拡散、シッティングドロップ蒸気拡散、透析、マイクロバッチおよびバッチからなる群から選択される結晶化技術を行うことを含む。１つの実施形態において、該曝露工程は、等体積の抗体溶液および沈殿剤溶液を混合して結晶化混合物を形成させることを含む。

もう１つの態様において、本発明は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む溶液から結晶化するための方法を提供し、ここで、該抗体はペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である。該方法は、（ａ）抗ＰＤ−１ ｍＡｂ溶液を沈殿剤溶液および抗ＰＤ−１ ｍＡｂの種晶と一緒にして播種（ｓｅｅｄｅｄ）結晶化混合物を得、（ｂ）少なくとも２０℃かつ４０℃以下の温度で該播種結晶化混合物をインキュベートし、（ｃ）結晶を集めることを含む。１つの実施形態において、インキュベート温度は約３０℃であり、沈殿剤溶液は、（１）２０％ ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ ４Ｋ）および２０％ イソプロパノール、（２）１８％ ポリエチレングリコール１００００（ＰＥＧ １０Ｋ）、２０％ グリセロール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、ならびに（３）２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、からなる群から選択される混合物を含む。もう１つの実施形態において、インキュベート温度は約２２℃であり、沈殿剤溶液は、（１）２０％ ＰＥＧ ４Ｋ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１００ｍＭ ＣａＣｌ_２、ならびに（２）１．２６Ｍ 硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および０．２Ｍ ＮａＣｌ、からなる群から選択される混合物を含む。幾つかの実施形態において、種晶は、４．０〜５．０のｐＨを有し１．０〜２．５Ｍ ＡＤＰを含む沈殿剤溶液中の約３０℃の温度での結晶化により製造された抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶の種ストックに由来する。

更にもう１つの態様において、本発明は、（ａ）抗ＰＤ−１抗体の結晶であって、ここで、該抗体はペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である、及び、（ｂ）少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤、を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、賦形剤は、結晶を封入すること、結晶を包埋すること、および結晶を安定に維持することから選択される少なくとも１つの機能を果たす。幾つかの実施形態において、組成物における結晶の平均長は１〜２０ミクロン、５〜２０ミクロン、５〜５０ミクロン、または５〜１００ミクロンである。１つの実施形態において、該組成物は、液体媒体中に懸濁された抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶を含む。１つの実施形態において、該組成物中の抗ＰＤ−１ ｍＡｂ濃度は少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌかつ約２５０ｍｇ／ｍｌ以下である。もう１つの実施形態において、該組成物は、結晶の液体懸濁液を脱水または凍結乾燥することにより製造された固体である。１つの実施形態において、室温（例えば、２０℃〜２５℃）で少なくとも１カ月間の液体または固体医薬組成物の貯蔵の後で、抗ＰＤ−１ ｍＡｂの生物活性の少なくとも９５％、９７％または９９％が存在する。

もう１つの態様においては、本発明は、前記医薬組成物のいずれかを含む容器を提供する。該容器は単一用量バイアル、複数用量バイアル、予充填シリンジまたは自己注射装置でありうる。１つの実施形態において、該容器は抗ＰＤ−１ ｍＡｂ、すなわち、ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体またはペンブロリズマブバイオシミラーの約２００〜約２５０ｍｇの単一用量を含む。

更にもう１つの態様において、本発明は、前記医薬組成物のいずれかの治療的有効量を患者に投与することを含む、癌に対するヒト対象の治療方法を含む。１つの実施形態において、癌は固形腫瘍、例えば膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、頭頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）またはトリプルネガティブ乳癌である。もう１つの実施形態において、癌はヘム悪性疾患、例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチ大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。１つの実施形態において、医薬組成物は少なくとも２００ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブを含み、皮下投与される。１つの実施形態において、医薬組成物の最初の投与の前に被験者から摘出された癌の組織切片はＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現に関して陽性の試験結果を示した。１つの実施形態において、該組織切片における腫瘍細胞の少なくとも５０％が免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイによりＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性の試験結果を示した。

詳細な説明
Ｉ．略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。

ＡＤＰ リン酸二水素アンモニウム
ＡＨＰ リン酸水素アンモニウム
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣
ＤＦＳ 無病生存
ＦＲ フレームワーク領域
ＩＨＣ 免疫組織化学または免疫組織化学的
ＮＣＢＩ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＮＣＩ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ＰＤ 進行性疾患
ＰＤ−１ プログラム死１
ＰＤ−Ｌ１ プログラム細胞死１リガンド１
ＰＤ−Ｌ２ プログラム細胞死１リガンド２
ＰＦＳ 無進行生存
ＰＲ 部分的応答
ＯＲ 全応答
ＯＳ 全生存
Ｑ２Ｗ ２週間ごとに１用量
Ｑ３Ｗ ３週間ごとに１用量
ＱＤ １日当たり１用量
ＲＥＣＩＳＴ 固形腫瘍における応答評価基準
ＳＤ 安定した疾患
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
ＩＩ．定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用語を以下に明確に定義する。本明細書中の他の箇所において特に示されていない限り、本明細書中で用いられる全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の単語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、それらの対応複数形対象物を含む。

数的に定義されるパラメーター（例えば、溶液中の成分の濃度）を修飾するために用いる「約」（ａｂｏｕｔ）は、該パラメーターが、そのパラメーターに関する示されている数値の上下１０％も変動しうることを意味する。例えば、特定されている抗体の約２００ｍｇ／ｍｌを含む組成物は該抗体の１８０ｍｇ／ｍｌ〜２２０ｍｇ／ｍｌを含有しうる。同様に、約３０℃の温度は２７℃〜３３℃の任意の温度を意味する。

「投与」および「治療（処理）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。「投与」および「処理（治療）」は、例えば治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。細胞の処理は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療）」は、試薬、診断剤、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「対象（被験者）」なる語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。

本明細書中で用いる「抗体」なる語は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含む四量体を意味し、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は通常に同一である。

典型的には、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５^ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７ｘ８−８８３の定義に基づいている。

本明細書中で用いるリン酸二水素アンモニウム（ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ４）またはＡＤＰは、一塩基リン酸アンモニウム、リン酸モノアンモニウムおよび第一リン酸アンモニウムと同義である。

本明細書中で用いるリン酸水素アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４）またはＡＨＰは、二塩基リン酸アンモニウム、リン酸水素ジアンモニウムおよびリン酸水素二アンモニウムと同義である。

「癌」、「癌性」または「悪性」なる語は、無制御な細胞増殖により典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理的状態を意味し又は示す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような癌の更に詳細な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、メラノーマ（黒色腫）、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌が含まれる。本発明に従い治療されうる特に好ましい癌には、被検組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現の上昇により特徴づけられる癌が含まれる。

本発明の結晶性抗体懸濁液に関して用いた場合の「濃度」は、与えられた巨視的単位溶液体積中に存在する抗体（例えば、ペンブロリズマブ）の量を意味する。通常の溶液と比べて懸濁液は固有の不均一性を有するにもかかわらず、濃度なる語はその通常の意味で用いられる。結晶懸濁液中の抗体の濃度は、抗体が結晶形態でない同等サンプルの濃度に等しい。

「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、ポリペプチドの必須領域内でさえも、生じる分子の生物活性を改変することなく一般に施されうる当業者に公知のアミノ酸の置換を意味する。そのような典型的な置換は、好ましくは、以下のとおり表１に記載されているものに従い施される。

本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって用いる「からなる」またはその変形、例えば「から実質的になる」もしくは「から実質的になり」は、任意の列挙されている要素または要素群の包含、および特定されている投与レジメン（投与計画）、方法または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、列挙されている要素と類似した又は異なる性質の他の要素の随意的包含を示す。非限定的な例としては、抗体結晶および特定の医薬上許容される賦形剤から実質的になる医薬組成物は、該医薬組成物の特性に実質的に影響を及ぼさない１以上の他の賦形剤をも含みうる。

本明細書中で用いる「抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶」または「結晶性抗ＰＤ−１ ｍＡｂ」は、三次元で規則的に反復する格子構造内に整列した抗体を含有する結晶を意味する。これとは対照的に、ｍＡｂの固体、無定形形態（例えば、溶液中に溶解したｍＡｂを凍結乾燥することにより製造されたもの）は、結晶性抗体形態に典型的である屈折率および複屈折のような光学的特性を示さない。

本明細書中で、そして透析に基づく結晶化方法に関して用いる「透析溶液」は、本発明の結晶性抗体の形成を誘導するためにペンブロリズマブの溶液（「抗体溶液」）が透析される溶液を意味する。「残余液」は透析後の抗体溶液を意味し、これは、回収される抗体結晶を含みうる。抗体溶液／残余液は透析膜の一方の側に存在し、透析溶液は反対側に存在する。

「ミクロン」および「マイクロメートル」なる語は本明細書において互換的に用いられ、それぞれはメートルの１／１００００００を意味する。

本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」は、実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多いそれらの可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要するとは解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。

本明細書中で用いる「ＰＤ−Ｌ１」または「ＰＤ−Ｌ２」発現は、細胞表面における示されているＰＤ−Ｌタンパク質の、または細胞もしくは組織内の示されているＰＤ−Ｌ ｍＲＮＡの任意の検出可能なレベルの発現を意味する。ＰＤ−Ｌタンパク質発現は、腫瘍組織切片のＩＨＣアッセイにおいて診断用ＰＤ−Ｌ抗体で、またはフローサイトメトリーにより検出されうる。あるいは、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌタンパク質発現は、所望のＰＤ−Ｌ標的、例えばＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体フラグメント、アフィボディなど）を使用して、ＰＥＴイメージングにより検出されうる。ＰＤ−Ｌ ｍＲＮＡ発現を検出し測定するための技術にはＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲが含まれる。

腫瘍組織切片のＩＨＣアッセイにおいてＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を定量するための幾つかのアプローチが記載されている。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，ＰＮＡＳ １０１（４９）；１７１７４−１７１７９（２００４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１−３３８５（２００６）；Ｇａｄｉｏｔ，Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ １１７：２１９２−２２０１（２０１１）；Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４，１２７ｒａ３７（２０１２）；およびＴｏｐｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ．３６６（２６）：２４４３−２４５４（２０１２）を参照されたい。

１つのアプローチは、ＰＤ−Ｌ１発現に関する陽性または陰性の単純な二成分（バイナリー）エンドポイントを用いるものであり、陽性結果は、細胞表面膜染色の組織学的証拠を示す腫瘍細胞の割合に関して定められる。腫瘍組織切片がＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性とみなされるのは、全腫瘍細胞の少なくとも１％、好ましくは５％である場合である。

もう１つのアプローチにおいては、腫瘍組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現は、リンパ球を主に含む浸潤性免疫細胞および腫瘍細胞において定量される。膜染色を示す腫瘍細胞および浸潤性免疫細胞の割合は＜５％、５〜９％、そしてついで１０％の増量で１００％まで、別々に定量される。腫瘍細胞の場合、スコアが＜５％スコアであればＰＤ−Ｌ１発現は陰性とみなされ、スコアが＞５％であれば陽性とみなされる。免疫浸潤物におけるＰＤ−Ｌ１発現は、補正（ａｄｊｕｓｔｅｄ）炎症スコア（ＡＩＳ）と称される半定量的測定値として示され、これは膜染色細胞の百分率に浸潤物の強度を掛け算することにより決定され、これは、無し（０）、軽度（１のスコア、希少リンパ球）、中等度（２のスコア、リンパ組織球凝集物による腫瘍の病巣浸潤）または重度（３のスコア、びまん性浸潤）として評価される。ＡＩＳが＞５であれば、腫瘍組織切片は免疫浸潤物によるＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性とみなされる。

ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ発現のレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて頻繁に使用される１以上の参照遺伝子（例えば、ユビキチンＣ）のｍＲＮＡ発現レベルと比較されうる。

幾つかの実施形態において、悪性細胞による及び／又は腫瘍内の浸潤性免疫細胞によるＰＤ−Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）のレベルは、適当な対照によるＰＤ−Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）のレベルとの比較に基づいて、「過剰発現」または「上昇」していると判定される。例えば、対照ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルは、同じタイプの非悪性細胞において、または釣り合わされた正常組織からの切片において定量されたレベルでありうる。幾つかの好ましい実施形態において、腫瘍サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１発現は、サンプル中のＰＤ−Ｌ１タンパク質（および／またはＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ）が対照の場合より少なくとも１０％、２０％または３０％大きいならば、上昇していると判定される。

本明細書中で用いる「ペンブロリズマブ」は、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，ｐｐ．１６１−１６２（２０１３）に記載されている構造を有するヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂであり、これは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．（ＭＳＤ）、ＭＳＤを管理する若しくはＭＳＤにより管理される企業、またはそれと利害関係を有する承継者（個々に及び一括して「ＭＳＤ」）により又はその代理で製造されている。ペンブロリズマブの各軽鎖は、図１に示されている３つのＣＤＲ配列（ＣＤＲＬ１としての配列番号１、ＣＤＲＬ２としての配列番号２およびＣＤＲＬ３としての配列番号３）を含み、ペンブロリズマブの各重鎖は、図２に示されているＣＤＲ配列（ＣＤＲＨ１としての配列番号４、ＣＤＲＨ２としての配列番号５およびＣＤＲＨ３としての配列番号６）を含む。ペンブロリズマブの完全長重鎖および軽鎖は、図３に示されている重鎖および軽鎖配列（それぞれ配列番号７および配列番号８）を含む。

ペンブロリズマブバイオシミラーは、ＭＳＤ以外の企業体により製造されている生物学的製品であって、ペンブロリズマブバイオシミラーとして販売することに関して、いずれかの国の規制機関により承認されている生物学的製品を意味する。１つの実施形態において、ペンブロリズマブバイオシミラーは薬物としてペンブロリズマブ変異体を含む。１つの実施形態において、ペンブロリズマブバイオシミラーはペンブロリズマブと同じアミノ酸配列を有する。

本明細書中で用いる「ペンブロリズマブ変異体」は、軽鎖ＣＤＲの外部に位置する３、２または１個の保存的アミノ酸置換、および重鎖ＣＤＲの外部に位置する６、５、４、３、２または１個の保存的アミノ酸置換を有すること以外はペンブロリズマブにおけるもの（それぞれ配列番号７および８）と同じ重鎖および軽鎖配列を含むモノクローナル抗体を意味し、例えば、変異位置はフレームワーク領域または定常領域内に位置する。換言すれば、ペンブロリズマブおよびペンブロリズマブ変異体は同一ＣＤＲ配列を含むが、それぞれ、それらの完全長軽鎖および重鎖配列における３または６個以下の他の位置における保存的アミノ酸置換を有する点でそれぞれとは異なる。ペンブロリズマブ変異体は、以下の特性、すなわち、ＰＤ−１に対する結合アフィニティ、ならびにＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のそれぞれの結合を遮断する能力の点で、ペンブロリズマブと実質的に同じである。

「沈殿剤」は、濃縮溶液中のポリペプチド、例えば抗体の溶解度を減少させる化合物である。バッチ結晶化法においては、沈殿剤は「沈殿剤溶液」中に含まれ、バルク透析法においては、沈殿剤は「透析溶液」中に含まれる。沈殿剤は、エネルギー的に不利な沈殿剤空乏層をポリペプチド分子の周囲に形成させることにより、結晶化を誘発する。この空乏層の相対量を最小にするために、該ポリペプチドは会合を生成し、最終的には結晶を形成する。この過程はＷｅｂｅｒ（１９９１）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１において説明されている。種々の沈殿剤が当技術分野で公知であり、硫酸アンモニウム、エタノール、イソプロパノール、１，２−プロパンジオール、３−エチル−２，４−ペンタンジオール、およびポリグリコールの多く、例えばポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ３００およびＰＥＧ ４００）を包含する。沈殿剤に加えて、他の物質がポリペプチド沈殿剤溶液に添加されることがある。これらは、溶液のｐＨ（したがって該ペプチド上の表面電荷）を調節するためのバッファー、例えばＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳ、ならびにポリペプチドの溶解度を減少させるための塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウムおよびクエン酸ナトリウムを包含する。

本明細書中で用いる「治療的有効量」または「有効量」は、単独で又は追加的治療用物質と組合せて細胞、組織または対象（被験者）に投与された場合に癌の治療に有効である抗ＰＤ−１抗体の量を意味する。単独で投与される抗ＰＤ−１抗体に適用される場合、治療的有効量はその成分のみに関するものである。組合せに適用される場合、治療的有効量は、組合せ投与、連続的投与または同時投与のいずれであっても、治療効果をもたらす抗ＰＤ−１抗体および追加的治療用物質の組合せ量を意味する。

「組織切片」は、組織サンプルの単一の部分または断片、例えば、正常組織または腫瘍のサンプルから切断された組織の薄片を意味する。

本明細書中で用いる、癌を「治療」または「治療する」は、本発明の医薬組成物を、癌を有する又は癌を有すると診断された対象に投与して、少なくとも１つの陽性（正）の治療効果、例えば、癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、末梢器官内への癌細胞浸潤の速度の低下、または腫瘍転移もしくは腫瘍成長の速度の低下を達成することを意味する。癌における陽性の治療効果は幾つかの方法で測定されうる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）を参照されたい）。例えば、腫瘍成長抑制に関しては、ＮＣＩ標準に従い、Ｔ／Ｃ＜４２％が抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は高い抗腫瘍活性とみなされ、ここで、Ｔ／Ｃ（％）＝治療された腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００である。幾つかの実施形態において、本発明の組合せにより達成される治療は、ＰＲ、ＣＲ、ＯＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳおよびＯＳのいずれかである。ＰＦＳは「腫瘍進行までの時間」とも称され、癌が成長（増殖）しない治療中または治療後の時間の長さを示し、ＣＲまたはＰＲを患者が経験した時間の長さ、およびＳＤを患者が経験した時間の長さを含む。ＤＦＳは、患者が無疾患状態のままである治療中または治療後の時間の長さを意味する。ＯＳは、無処置または未治療の個体または患者と比較した場合の寿命の延長を意味する。幾つかの好ましい実施形態において、本発明の組合せに対する応答は、ＲＥＣＩＳＴ １．１応答基準を用いて評価されるＰＲ、ＣＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳ、ＯＲまたはＯＳのいずれかである。癌患者を治療するのに有効である本発明の組合せのための治療レジメンは、患者の病態、年齢および体重ならびに対象において抗癌応答を惹起する該療法の能力のような要因に応じて変動しうる。本発明の態様のいずれかの実施形態は全ての対象において陽性治療効果を達成するのに有効だとは限らないが、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンケーレ−テルプストラ検定およびウィルコクソン検定により判定された場合、統計的に有意な数の対象においては有効であるはずである。

本明細書中で用いる「トリス」（２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）はＴＲＩＳ、トリス（Ｔｒｉｓ）塩基、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、トリスアミン（Ｔｒｉｓａｍｉｎｅ）、ＴＨＡＭ、トロメタミン（Ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、トロメタモール（Ｔｒｏｍｅｔａｍｏｌ）、トロメタン（Ｔｒｏｍｅｔｈａｎｅ）およびトリスアミノール（Ｔｒｉｓａｍｉｎｏｌ）と同義である。

「腫瘍」は、癌を有すると診断された又は癌を有する疑いのある対象に適用される場合には、任意のサイズの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊を意味し、原発腫瘍または続発性新生物を含む。固形腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない組織の異常成長または塊を意味する。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病（血液の癌）は、一般に、固形腫瘍を形成しない（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｒｍｓ）。

「腫瘍量」は「腫瘍負荷」とも称され、全身に分布する腫瘍物質の総量を意味する。腫瘍負荷は、リンパ節および骨髄を含む身体全体にわたる癌細胞の総数または腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍負荷は当技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば超音波、骨スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）スキャンを用いて全身において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。

「腫瘍サイズ」なる語は、腫瘍の長さおよび幅として測定されうる腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍サイズは技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば骨スキャン、超音波、ＣＴまたはＭＲＩスキャンを用いて全身において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。

ＩＩＩ．抗体結晶化
本発明は、部分的には、ペンブロリズマブの結晶化条件の特定に基づく。該結晶化条件は、（１）高塩濃度（すなわち、１．０Ｍ〜２．５Ｍまたは１．５Ｍ〜２．０ＭのＡＤＰ）を含み、酸性ｐＨ（すなわち、４．０〜５．０、４．２〜４．８、４．４〜４．６または４．５のいずれかのｐＨ）を有する沈殿剤溶液、および（２）高温（すなわち、少なくとも２５℃かつ５０℃以下）、の特有の組合せを含む。１つの実施形態において、ｐＨは、沈殿剤溶液中に緩衝剤を含有させることにより必要範囲内に維持されうる。適当な緩衝剤には、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸水素アンモニウム、ヒスチジンおよび水酸化アンモニウムが含まれる。沈殿剤溶液のｐＨは、好ましくは、結晶化を行おうとする温度に応じて決定され、該温度は、１つの実施形態において、２７℃〜約３０℃の温度である。本発明の結晶化条件は幾つかの結晶化技術に適合し、１〜２０ミクロンおよび５〜１００ミクロンを含む種々の長さの抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶形態、および結晶の意図される用途に応じて低い分解能（例えば、３．５オングストローム）または高い分解能（例えば、２．３オングストローム）を示す結晶（３．５オングストロームの回折分解能より劣るもの、種々の回折特性のものを含む）を産生しうる。

タンパク質結晶化の種々の方法が公知である。Ｇｉｅｇｅら（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：３３９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１。そのような技術には、ハンギングドロップ蒸気拡散（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００）、シッティングドロップ蒸気拡散、マイクロバッチおよび透析が含まれる。

ハンギングドロップ蒸気拡散およびシッティングドロップ蒸気拡散は共に、精製タンパク質、バッファーおよび沈殿剤を含有する液滴が、類似バッファーおよび沈殿剤をより高濃度で含有する、より大きなリザーバーと平衡化することを伴う。最初は、タンパク質溶液液滴は、結晶化には不十分である沈殿剤の濃度を含むが、水が液滴から蒸発しレザーバーに移るにつれて、沈殿剤濃度は、結晶化に最適なレベルまで増加する。該系は平衡状態にあるため、これらの最適条件は、結晶化が完了するまで維持される。ハンギングドロップ法は系内のタンパク質溶液の液滴の垂直配向においてシッティングドロップ法とは異なる。

マイクロバッチ法においては、ポリペプチドを沈殿剤と混合して過飽和にし、容器を密封し、結晶が出現するまで放置する。

透析法においては、沈殿剤を含有する溶液と接触した透析膜の一方の側にポリペプチドを保持させる。膜を越えた平衡化は沈殿剤濃度を増加させ、それにより、ポリペプチドは過飽和レベルに達する。

実施例１〜７において更に詳細に記載されているとおり、これらの技術の幾つかは、本発明のペンブロリズマブ結晶を製造するために使用された。そのようなハイスループットの例は、大規模な結晶製造のためではなく、沈殿剤溶液を最適化するためのスクリーニングに最も適している。

本発明の結晶化方法において使用される抗ＰＤ−１ ｍＡｂ溶液は３〜１００ｍｇ／ｍｌの抗体濃度を有し、約５．５のｐＨの約１０ｍＭ ヒスチジンのバッファー中で簡便に提供される。

抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶（例えば、治療用のもの）の大規模製造に関しては、実施例５および９〜１１がバッチ結晶化法を要約している。１つの実施形態において、ペンブロリズマブを溶液から結晶化するためのバッチ法は、１．８〜２．５Ｍ ＡＤＰ中に少なくとも１０ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブを含み、約４．４〜４．６のｐＨを有する結晶化混合物を調製することを含む。１つの実施形態において、結晶化混合物は更に、３％ １，５−ジアミノペンタン二塩酸塩、３％ イソプロパノールおよび４％ プロピレングリコールからなる群から選択される添加剤を含む。結晶は、当技術分野で公知の方法、例えば遠心分離、透析および種々の濾過方法（中空繊維接線流濾過を含む）を用いて、バッチ結晶化混合物から集められうる。

抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶は、その物理的特性、例えば結晶サイズ、形状、表面形態、総表面積および多孔性を調べ又は特徴づけるために、種々の方法により分析されうる。そのような分析技術には、例えば、電子線回折および固体核磁気共鳴（ｓｓＮＭＲ）、光学顕微鏡検査、透過型電子顕微鏡検査、走査電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査および種々の光散乱技術が含まれる。

本発明の結晶における抗ＰＤ−１ ｍＡｂの生物活性および／または生物物理学的特性は、所望の分析技術に適したバッファー中に抗体結晶を「再溶解」または可溶化することにより分析されうる。例えば、可溶化された抗ＰＤ−１ ｍＡｂは、ＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび動的光散乱の１以上により分析されうる。本明細書に記載されている結晶化条件は、ペンブロリズマブの及び構造的に類似した抗ＰＤ−１ ｍＡｂ、すなわち、ペンブロリズマブ変異体およびペンブロリズマブバイオシミラーの結晶懸濁液を製造するためのバッチ結晶化技術において有用である、と本発明者らは本発明において想定している。用いる高い結晶化温度（少なくとも２５℃かつ５０℃以下）ゆえに、これらの条件を用いて製造された結晶懸濁液およびそのような結晶を含む医薬組成物は、抗ＰＤ−１ ｍＡｂの生物活性または安定性における変化をほとんど又は全く伴うことなく、少なくとも１カ月の期間にわたって室温で貯蔵されうる、と本発明者らは想定している。

本発明に従い製造された抗体結晶から可溶化された抗ＰＤ−１ ｍＡｂ（ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体またはペンブロリズマブバイオシミラー）は、結晶化前の出発物質の特性を認容可能な許容範囲内で保有するはずである。種々の機能パラメーターに関する認容可能な許容範囲は、意図される用途に基づいて変動しうるが、結合アフィニティまたは生物活性に関しては、元の（未結晶化）アフィニティまたは活性の少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の保有を包含しうる。例えば、該抗ＰＤ−１ ｍＡｂがＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する能力は、実施例１２に記載されている方法を用いて測定されうる。

本明細書の実施例１１〜１２に記載されているとおり、ペンブロリズマブ結晶を溶解することにより得られたペンブロリズマブおよび結晶化されなかったペンブロリズマブの生物活性および生物物理学的特性を、ＥＬＩＳＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて比較したところ、それらは実質的に類似していると判定された。これらの結果は、ヒト対象の治療のための、ペンブロリズマブ結晶を含む医薬組成物の使用を支持している。

ＩＶ．医薬組成物
医薬組成物を製造するために、本発明の抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶またはそのような結晶から可溶化された抗ＰＤ−１ ｍＡｂを少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。本発明の医薬組成物において使用される抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶は、該抗体の生物活性および安定性が所望の範囲内で維持される限り、いずれかの特定の回折特性を有することは要求されない。

幾つかの実施形態において、結晶化の途中または後で結晶化液に賦形剤を直接加える。他の実施形態において、まず、結晶を該液体から集め、安定化溶液中の懸濁により洗浄し、該安定化溶液から集め、ついで、賦形剤を含む液体溶液中に懸濁させる。液体の組成物は任意の医薬上許容される媒体であることが可能であり、例えば水溶液および油中水型混合物を含みうる。

固体形態の結晶の医薬組成物は、例えば、窒素、空気または不活性ガスの気流を該結晶上に通過させることにより、空気乾燥、真空乾燥または凍結乾燥により、結晶と所望の賦形剤とを含む液体懸濁液を乾燥させることにより製造されうる。最終産物中の水分含有率は典型的には１０重量％未満、７重量％未満、５重量％未満または３重量％未満である。

液体懸濁液中または乾燥固体中のペンブロリズマブ結晶から可溶化されたペンブロリズマブを含む医薬組成物は、所望の量の該結晶を医薬上許容される溶解バッファーに加え、結晶が溶解するまで４℃でインキュベートすることにより製造されうる。１つの実施形態において、溶解バッファーは１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）、０．０２％ ポリソルベート８０および４％までのスクロース（ｗ／ｖ）を含む。１つの実施形態において、生じた組成物中の粒状物を投与前に例えば遠心分離または濾過により除去する。

Ｖ．治療方法
特定の患者において特定の癌を治療するための本発明の医薬組成物の適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野で公知である若しくはそのように疑われる又は治療に影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因子を使用することにより、臨床家によりなされうる。例えば、医師は、最適用量または承認された用量より幾らか少ない用量で治療を開始し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が得られるまで、用量を少しずつ増加させることを選択することが可能である。

１つの実施形態において、組成物の用量および投与経路は、２００ｍｇ Ｑ２ＷまたはＱ３Ｗの用量で未結晶化ペンブロリズマブによりもたらされるものに実質的に類似したペンブロリズマブ抗体に対する中間的な曝露をもたらす。

以下に列挙する典型的な特定の実施形態を含む本発明のこれらの及び他の態様は、当技術分野における一般的知識と組合された本明細書に含まれる教示から明らかであろう。

ＶＩ．本発明の典型的な特定の実施形態
１．抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶であって、該ｍＡｂがペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である、結晶。

２．結晶が、１〜２００ミクロン、１〜１００ミクロン、１〜２０ミクロン、５〜１００ミクロン、５〜５０ミクロン、５〜４０ミクロン、５〜３０ミクロン、５〜２０ミクロン、５〜１０ミクロン、１０〜１００ミクロン、１０〜５０ミクロンおよび１０〜２０ミクロンからなる群から選択される範囲内の長さを有することにより特徴づけられる、実施形態１記載の結晶。

３．結晶が、５〜１０ミクロン、５〜２０ミクロンまたは５〜４０ミクロンの長さを有することにより特徴づけられる、実施形態３記載の結晶。

４．結晶が、５０〜１００ミクロンの長さを有することにより特徴づけられる、実施形態２記載の結晶。

５．ａ＝６３．５〜７８．９オングストローム、ｂ＝１１０．２〜１１２．２オングストローム、ｃ＝２６２．５〜３０６オングストローム、α＝９０、β＝９０、γ＝９０°の単位格子寸法、およびＰ２_１２_１２_１の空間群により特徴づけられる、実施形態１〜４のいずれか１項記載の結晶。

６．２．３オングストローム〜３．５オングストローム、２．３オングストローム〜３．０オングストローム、２．３オングストローム〜２．７５オングストローム、２．３オングストローム〜２．５オングストロームおよび２．３オングストロームからなる群から選択される分解能までＸ線を回折しうる、前記実施形態のいずれか１項記載の結晶。

７．同じ抗ＰＤ−１ ｍＡｂの追加的な結晶を含む液体媒体中に懸濁された、前記実施形態のいずれか１項記載の結晶。

８．抗ＰＤ−１ ｍＡｂがペンブロリズマブである、前記実施形態のいずれか１項記載の結晶。

９．抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶の製造方法であって、該ｍＡｂがペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体であり、該製造方法が、結晶形成に十分な時間にわたって、少なくとも２５℃かつ５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下または３７℃以下の温度で、該抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む溶液を沈殿剤溶液に曝露することを含み、ここで、沈殿剤溶液は、４．０〜５．０のｐＨを有し、そして、１．０Ｍ〜２．５Ｍ リン酸二水素アンモニウムを含む、製造方法。

１０．曝露工程が、抗体溶液および沈殿剤溶液を混合して結晶化混合物を得て、そして結晶化プロセスを該混合物に適用することを含む、実施形態９記載の製造方法。

１１．結晶化プロセスが、ハンギングドロップ蒸気拡散、シッティングドロップ蒸気拡散およびバッチからなる群から選択される、実施形態１０記載の製造方法。

１２．結晶化プロセスがバッチプロセスであり、製造方法が、結晶化混合物を抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶で播種することを更に含む、実施形態１１記載の製造方法。

１３．結晶化混合物中の抗体濃度が約１０ｍｇ／ｍｌまたは約２０ｍｇ／ｍｌである、実施形態９〜１２のいずれか１項記載の製造方法。

１４．曝露工程が、３０ｋＤ 分子量カットオフ膜を使用して沈殿剤溶液に対して抗体溶液を透析することを含む、実施形態９記載の製造方法。

１５．抗体溶液が、２〜２００ｍｇ／ｍｌ、３〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ／ｍｌまたは約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む、実施形態９〜１４のいずれか１項記載の製造方法。

１６．沈殿剤溶液が、４．２〜４．８、４．４〜４．６および４．５からなる群からｐＨを有する、実施形態９〜１５のいずれか１項記載の製造方法。

１７．沈殿剤溶液が緩衝剤を更に含む、実施形態９〜１６のいずれか１項記載の製造方法。

１８．緩衝剤が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウムまたはヒスチジンである、実施形態１７記載の製造方法。

１９．沈殿剤溶液が、１．５Ｍ〜２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび１００〜１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌから実質的になる、実施形態９〜１８のいずれか１項記載の製造方法。

２０．沈殿剤溶液がリン酸二水素アンモニウムとリン酸水素アンモニウムとの混合物を含む、実施形態９〜１７のいずれか１項記載の製造方法。

２１．沈殿剤溶液が、１．９Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび０．０９Ｍ リン酸水素アンモニウムから実質的になる、実施形態２０記載の製造方法。

２２．曝露工程を少なくとも３、４または５日間にわたって約３０℃の温度で行う、実施形態９〜２１のいずれか１項記載の製造方法。

２３．抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む溶液から結晶化するための方法であって、ここで、該抗体がペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体であり、そして、該方法が、（ａ）抗ＰＤ−１ ｍＡｂ溶液を沈殿剤溶液および抗ＰＤ−１ ｍＡｂの種晶と一緒にして播種（ｓｅｅｄｅｄ）結晶化混合物を得、（ｂ）少なくとも２０℃かつ４０℃以下の温度で該播種結晶化混合物をインキュベートし、そして、（ｃ）結晶を集めること、を含む方法。

２４．インキュベート温度が約３０℃であり、沈殿剤溶液が、（１）２０％ ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ ４Ｋ）および２０％ イソプロパノール、（２）１８％ ポリエチレングリコール１００００（ＰＥＧ １０Ｋ）、２０％ グリセロール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、ならびに（３）２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、からなる群から選択される混合物を含む、実施形態２３記載の方法。

２５．インキュベート温度が約２２℃であり、そして、沈殿剤溶液が、（１）２５％ ＰＥＧ ４Ｋ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１００ｍＭ ＣａＣｌ_２、ならびに（２）１．２６Ｍ 硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および０．２Ｍ ＮａＣｌ、からなる群から選択される混合物を含む、実施形態２３記載の方法。

２６．種晶が、実施形態９〜２２のいずれか１項記載の製造方法により製造された抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶の種ストックに由来する、実施形態２３〜２５のいずれか１項記載の方法。

２７．抗ＰＤ−１ ｍＡｂがペンブロリズマブである、実施形態９〜２６のいずれか１項記載の方法。

２８．実施形態９〜２７のいずれか１項記載の製造方法により製造される抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶。

２９．（ａ）ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶、及び、（ｂ）少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤、を含む医薬組成物。

３０．賦形剤が、結晶を封入すること、結晶を包埋すること、および結晶を安定に維持すること、から選択される少なくとも１つの機能を果たす、実施形態２９記載の組成物。

３１．抗ＰＤ−１ ｍＡｂのそれぞれが、実施形態１〜８または２７のいずれか１項記載の結晶である、実施形態２９または３０記載の組成物。

３２．液体である、実施形態２９〜３１のいずれか１項記載の組成物。

３３．固体である、実施形態２９〜３１のいずれか１項記載の組成物。

３４．組成物中の抗ＰＤ−１ ｍＡｂ濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌである、実施形態２９〜３２のいずれか１項記載の組成物。

３５．組成物を２０℃〜２５℃で少なくとも１カ月間貯蔵した後に、抗ＰＤ−１ ｍＡｂの生物活性の少なくとも９５％が存在する、実施形態２９〜３４のいずれか１項記載の組成物。

３６．実施形態２９〜３５のいずれか１項記載の医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌に対するヒト対象の治療方法。

３７．癌が、膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、頭頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチ大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、実施形態３６記載の方法。

３８．医薬組成物が少なくとも２００ｍｇ／ｍｌのｍＡｂを含み、そして皮下投与される、実施形態３６または３７記載の方法。

３９．癌が固形腫瘍であり、そして、医薬組成物の最初の投与の前に被験者から摘出された癌の組織切片がＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現に関して陽性の試験結果を示した、実施形態３６〜３８のいずれか１項記載の方法。

４０．該組織切片における腫瘍細胞の少なくとも５０％が免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイによりＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性の試験結果を示した、実施形態３９記載の方法。

本特許または出願書類は、着色して作成された少なくとも１つの図面を含む。着色図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは請求および必要料金の支払いにより当局によって提供される。

図１はペンブロリズマブに関する及び本明細書に記載されているペンブロリズマブ変異体に関する軽鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列（配列番号１〜３）を示す。 図２はペンブロリズマブに関する及び本明細書に記載されているペンブロリズマブ変異体に関する重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列（配列番号４〜６）を示す。 図３はペンブロリズマブの重鎖（図３Ａ）および軽鎖（図３Ｂ）のアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号７および８）。 図４は、２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの沈殿剤溶液を使用して３０℃での蒸気拡散により得られたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。３日後、ＳＯＮＩＣＣイメージングシステムを使用して、１００倍の倍率で顕微鏡写真を撮影した。図４Ａは、ＳＨＧモードを使用して得られたものであり、図４Ｂは、ＵＶ−ＴＰＥＦモードを使用して得られたものである。実施例１を参照されたい。 図５は、０．０２％ ポリソルベート８０の存在下（図５Ａ）または非存在下（図５Ｂ）で、２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの沈殿剤溶液を使用して３０℃での自由界面拡散により得られたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。２日後、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用して、１００倍の倍率で顕微鏡写真を撮影した。実施例２を参照されたい。 図６は、１．５Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの沈殿剤溶液を使用して３０℃でのハンギングドロップ蒸気拡散により得られたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。３日後、Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００ Ｓｔｅｒｅｏ ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅおよびＮｉｋｏｎ ＥＳ４００カメライメージングシステムを使用して、１００倍の倍率で顕微鏡写真を撮影した。実施例４を参照されたい。 図７は、１．８Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの沈殿剤溶液を使用して３０℃でのバッチ結晶化により得られたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。実施例５を参照されたい。５日後、Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００ Ｓｔｅｒｅｏ ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅおよびＮｉｋｏｎ ＥＳ４００カメライメージングシステムを使用して、１００倍の倍率で顕微鏡写真を撮影した。両方向矢印は約２０ミクロンの長さの結晶を示す。 図８は、沈殿剤として１．８Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを使用して３０℃でのハンギングドロップ拡散法により得られた結晶のＸ線回折分析により解析されたペンブロリズマブの三次元構造のリボンダイヤグラムを示す。実施例７を参照されたい。該リボンダイヤグラムは図８Ａにおいてはカラー表示されており、２本の重鎖は黄色およびシアン色で示されており、２本の軽鎖はマゼンタ色（ＦＡＢ−１）および緑色（ＦＡＢ−２）で示されており、一方、同じリボンダイヤグラムは図８Ｂにおいては灰色の色調で示されている。 図９は、沈殿剤として１．９Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび０．０９Ｍ リン酸水素アンモニウムを使用して３０℃での蒸気拡散法により得られたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。実施例８を参照されたい。３日後、Ｒｏｃｋ Ｉｍａｇｅｒシステム（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、７０倍の倍率で顕微鏡写真を撮影した。両方向矢印は約２０ミクロンの距離を示す。 図１０は、実施例１３に記載されている種々のペンブロリズマブ溶液のＵＰＬＣ−ＳＥＣ特徴づけにより得られたプロットを示し、図１０Ａにおいては、これまで結晶化されたことがないペンブロリズマブを示し、図１０Ｂにおいては、ペンブロリズマブ結晶から可溶化されたペンブロリズマブを示す。

本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照することによって最も良く理解される。これらの実施例は本発明を特定の実施形態に限定するものではない。ここに記載されている特定の実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項、およびそのような特許請求の範囲が及ぶ均等物の全範囲によって限定されるべきである。

実施例
実施例１：ペンブロリズマブのドロップ蒸気拡散結晶化スクリーニング
３４ｍｇ／ｍｌの完全長ペンブロリズマブの溶液を１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）中で製造した。この溶液を、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭＲＣ９６ウェル結晶化プレートならびにＲｉｇａｋｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）およびＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｅｎａ，ＤＥ，ＵＳＡ）の４つの商業的に入手可能なハイスループットスクリーンにおいて、シッティングドロップ蒸気拡散実験でスクリーニングした。各スクリーンは、以下の表２に要約する９６個の特有の溶液からなるものであった。

各スクリーン実験の場合に、ペンブロリズマブ溶液（０．２μｌ）をスクリーン溶液（０．２μｌ）と混合し、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のＯｒｙｘ結晶化ロボットを使用して、プレートウェル内の８０μｌのスクリーン溶液の上に層状に載せた。各スクリーン溶液に関して４℃、１８℃および３０℃のそれぞれにおいて実験を行った。したがって、合計１，１５２個の異なる結晶化条件を試験した。該プレートウェルを結晶形成に関して顕微鏡で経時的にモニターした。

該試験条件のただ１つ［Ｊｅｎａ ２（Ｓａｌｔ）＃９１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウム）で３０℃］に関して３日後に結晶を観察した。Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＳＯＮＩＣＣイメージングシステムを使用して結晶を可視化した。ＳＯＮＩＣＣシステムは、以下の２つのイメージング法を有する：結晶化度を調べる第２高調波発生（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＳＨＧ）、およびタンパク質サンプルに特異的である紫外線２光子励起蛍光（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＵＶ−ＴＰＥＦ）。観察した結晶のイメージを図４Ａ（ＳＨＧ）および図４Ｂ（ＵＶ−ＴＰＥＦ）に示す。

実施例２：ペンブロリズマブの自由界面拡散結晶化スクリーニング
実施例１における３０℃のみでの結晶形成に基づき、自由界面拡散技術を用いてペンブロリズマブに関するスクリーニング条件を更に調べるために、この温度を選択した。

３４ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブを含有する抗体溶液を、０．０２％ ポリソルベート８０の存在下または非存在下で１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）中で調製し、Ｔｏｐａｚチップおよび晶析装置［Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）］において、実施例１と同じスクリーン溶液を使用してスクリーニングした。該チップを３０℃でインキュベートし、フルイダイム自動イメージング（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ）システムを使用して顕微鏡でモニターした。Ｊｅｎａ ２（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）＃ ９１溶液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５、２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウムのみを使用して、結晶を再び観察した。それらの２つの異なるペンブロリズマブ溶液からの観察した結晶のイメージを図５Ａ（０．０２％ ポリソルベート８０を含有する抗体溶液）および図５Ｂ（ポリソルベート８０を含有しない抗体溶液）に示す。

実施例３：ペンブロリズマブのマイクロシーディング・マトリックス・スクリーニング
この実施例は、既存ペンブロリズマブ結晶で播種された溶液からペンブロリズマブが結晶化されうる条件を検討した。スクリーニングした沈殿剤溶液は、実施例１に記載されているのと同じ４つの商業的に入手可能なスクリーンであった。

ペンブロリズマブ結晶の種ストックを、実施例１において得られた結晶懸濁液（２．０Ｍ ＡＤＰ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中のペンブロリズマブ結晶）から、１μｌの該ペンブロリズマブ結晶懸濁液と、１．８Ｍ ＡＤＰ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの９９μｌの安定化溶液（２．５Ｍ ＡＤＰおよび１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５の適量のストック溶液を混合することにより調製されたもの）とを一緒にすることにより調製した。３４ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブの抗体溶液を、１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）中で調製した。ＭＲＣ９６ウェル結晶化プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）においてシッティングドロップ蒸気拡散実験を行った。

各スクリーン実験の場合に、該ペンブロリズマブ溶液（０．３μｌ）をスクリーン溶液（０．３μｌ）および０．１μｌの種ストックと混合し、Ｏｒｙｘ結晶化ロボットを使用して、プレートウェル内の８０μｌのスクリーン溶液の上に層状に載せた。各スクリーン溶液に関して２２℃および３０℃のそれぞれにおいて実験を行い、したがって、合計７６８個の結晶化条件を試験した。該プレートウェルを結晶に関して顕微鏡で経時的にモニターし、以下の表３に示す５つの条件から、１週間後、結晶を顕微鏡で観察した。ＳＯＮＩＣＣ（ＵＶ陽性）による結晶の可視化は、観察した結晶の内容物がタンパク質であることを証明した。

実施例４：ＡＤＰ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおける蒸気拡散結晶化の最適化
回折用品質の結晶の製造に適した最適ＡＤＰ濃度およびｐＨ条件を特定するために、８．８〜９．４の種々のｐＨの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと１．６０〜１．７４Ｍの種々の濃度のＡＤＰとの混合物を調べる以下のスクリーニング実験を行った。ＶＤＸ ２４ウェル（６×４アレイ）結晶化プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）においてＯｐｔｉＭａｔｒｉｘ Ｍａｋｅｒ（商標）液体処理システム（Ｒｉｇａｋｕ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して設計された特製最適化スクリーンに対して、ハンギングドロップ蒸気拡散実験において、ペンブロリズマブ（３４ｍｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６）を準備した。各スクリーン実験において、１．０μｌのタンパク質＋１．０μｌのスクリーン溶液からなる懸滴（ハンギングドロップ）を２２ｍｍカバーガラスの下面上に配置し、１ｍｌの該スクリーン溶液を含有するウェル上に配置して、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ成分のｐＨが垂直の４個のウェルにおいて変動し、ＡＤＰ濃度が６個のウェルにわたって水平に変動するようにした。該プレートを３０℃でインキュベートし、顕微鏡で経時的にモニターした。図６は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＡＤＰスクリーン溶液中で３日後に観察された結晶の顕微鏡写真を示す。

実施例５：ＡＤＰ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおけるペンブロリズマブのバッチ結晶化
１０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ ペンブロリズマブ溶液（１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６）を５０μｌの１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、１．８Ｍ ＡＤＰと２２℃で一緒にすることにより、結晶化混合物を調製した。この結晶化混合物を、ＶＤＸプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のウェルの内部に配置されたマイクロ・ブリッジ（Ｍｉｃｒｏ−Ｂｒｉｄｇｅ）（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）内に配置した。該ウェルは１ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、１４４０ｍＭ ＡＤＰを含有していた。該ウェルを、２２ｍｍカバーガラスを使用して密封し、該プレートを３０℃で５日間インキュベートした。生じた結晶懸濁液の顕微鏡写真を図７に示す。約５ミクロン〜少なくとも約２０ミクロンの範囲の結晶サイズが観察された。

実施例６：蒸気拡散結晶化条件を最適化するための添加剤スクリーン
３４ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブの溶液を１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）中で調製した。このペンブロリズマブ溶液を、Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（商標）キット（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して調製された９６個の沈殿剤溶液に対してシッティングドロップ蒸気拡散実験においてスクリーニングした。このキットは９６個の異なる添加剤溶液を含有する。

各添加剤に関して、７２μｌの１．７４ｍＭ ＡＤＰ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０と８．０μｌの添加剤溶液とを含有する８０μｌの沈殿剤溶液をＭＲＣ９６ウェル結晶化プレートのウェルに加えた。該ペンブロリズマブ溶液（０．２μｌ）を該ウェル溶液（０．２μｌ）と混合し、Ｏｒｙｘ結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、８０μｌの該ウェル溶液の上に層状に載せた。該プレートを密封し、該プレートを３０℃でインキュベートし、顕微鏡で経時的にモニターした。３〜７日後に結晶を観察した。１週間後、以下の添加剤の１つを含有するＴｒｉｓ、ＡＤＰ沈殿剤溶液において結晶が観察された：（ａ）３％ １，５−ジアミノペンタン二塩酸塩、（ｂ）３％ イソプロパノール、または（ｃ）４％ プロピレングリコール。しかし、その他の９３個の沈殿剤溶液のいずれにおいても結晶は観察されなかった。このことは、それらの溶液中の添加剤は結晶核形成または成長を妨げたことを示唆している。

実施例７：ペンブロリズマブ結晶のＸ線回折分析
完全長ペンブロリズマブの回折用品質の結晶を、ハンギングドロップ技術を用いて３０℃で成長させた。１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６（１μｌ）中の３４ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブ溶液を１．８Ｍ リン酸二水素アンモニウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０（１μｌ）と一緒にした。結晶を７〜６０日後に集め、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ中の飽和（１００％）スクロース溶液または１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ中の３５％ エチレングリコールを使用して凍結保護した。

Ｘ線回折データを、ＩＤ−１７（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｒｇｏｎｎｅ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）におけるシンクロトロン放射を用いて集め、ａｕｔｏＰＲＯＣ（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ Ｃ．ら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６７：２９３−３０２（２０１１））を使用して処理し、スケーリングした。最良のデータセットはスクロース保護結晶から得られ、２．２８オングストロームまで拡大された。２４個のデータセットに基づけば、ペンブロリズマブの結晶はＰ２_１２_１２_１系に属し、ａ＝６３．５〜７８．９オングストローム、ｂ＝１１０．２〜１１２．２オングストローム、ｃ＝２６２．５〜３０６オングストロームおよびアルファ＝ベータ＝ガンマ＝９０°を有する。

ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０：６５８−６７４（２００７））において実行される分子置換法を用いてＸ線回折データからペンブロリズマブの構造を解析した。抗ＩＬ−２３ｐ１９ ｍＡｂのｆａｂの構造およびＩｇＧ４ ＦＣ構造（ＰＤＢエントリー４Ｃ５４，Ｄａｖｉｅｓ Ａ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．：４２６（３）：６３０−６４４（２０１４））（糖および水が除去されているもの）を検索モデルとして使用した。最初にＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ Ｇ．Ｎ．ら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌ．Ｄ５３：２４０−２５（１９９７））で、ついでａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇら，ＢＵＳＴＥＲ ２．１１．５．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ２０１１）で精密化を行った。ＣＯＯＴにおいてモデル構築を行った（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６：４８６−５０１（２０１０））。最終的なモデルは、完全抗体（２個の軽鎖および２個の重鎖、２個の７残基糖鎖）、凍結保護溶液からの５個の硫酸イオンおよび３個のスクロース分子、ならびに４８０個の水分子を含有する。

ペンブロリズマブ構造は図８に示されており、幅約１４０オングストロームおよび長さ１２０オングストロームの四量体である。Ｆｃドメインは両鎖上のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７においてグリコシル化されている。

実施例８：リン酸アンモニウム混合物における蒸気拡散結晶化
本実施例は、沈殿剤溶液におけるＴｒｉｓ−ＨＣｌ以外のバッファーの使用を検討した。９６個の異なる一塩基性リン酸アンモニウム／二塩基性リン酸アンモニウム混合物（ここで、一塩基性成分と二塩基性成分との比は様々であったが、総ホスファート濃度は１．９９Ｍに一定に維持された）のスクリーニングマトリックスを使用して、ペンブロリズマブ溶液（３４ｍｇ／ｍｌ 抗体、１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６）をシッティングドロップ蒸気拡散実験においてスクリーニングした。Ｏｒｙｘ結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）を使用して、０．２５μｌのペンブロリズマブ溶液＋０．７５μｌのスクリーン溶液からなる液滴をＭＲＣ−２ ９６ウェル結晶化プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のウェル内の８０μｌの同じスクリーン溶液上に分注した。該プレートを３０℃でインキュベートし、Ｒｏｃｋ Ｉｍａｇｅｒ１０００システム（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してモニターした。１〜５６日に結晶を観察した。１．９Ｍ ＡＤＰ、０．０９Ｍ ＡＨＰ沈殿剤溶液中で３日後に観察した結晶の顕微鏡写真を図９に示す。

実施例９：Ｔｒｉｓ／ＡＤＰ中のペンブロリズマブ（１ｍｌスケール）のバッチ結晶化
１６７μｌのペンブロリズマブ溶液（４７ｍｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．５）と８３３μｌの沈殿剤溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４および１．９Ｍ ＡＤＰ）とを４℃で一緒にすることにより、１．５ｍｌ 微量遠心管内で抗体混合物を調製する。該抗体混合物を含有する該管を３０℃で５日間インキュベートした。

実施例１０：Ｔｒｉｓ／ＡＤＰ中のペンブロリズマブのバッチ透析結晶化
２０ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、１．９Ｍ リン酸二水素アンモニウムに対して、３０ｋＤ分子量カットオフ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ ＵＳＡ）を使用して、ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）において、２００μｌのペンブロリズマブ溶液（４７ｍｇ／ｍｌ 抗体，１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．５）を３０℃で５日間透析する。実施例１１に記載されているのと同様にして、結晶懸濁液を集める
実施例１１：結晶懸濁液からのペンブロリズマブ溶液の調製
合計約４００ｍｇのペンブロリズマブ結晶を含有し沈殿剤としてＡＤＰ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを使用する種々の蒸発拡散実験からの多数の液滴を一緒にすることにより、結晶懸濁液の２１０μｌのアリコートを得た。該アリコートを、Ｆｉｓｃｈｅｒ商標の微量遠心管内で５０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。上清（母液）を吸引除去し、ペレット（ペンブロリズマブ結晶）を３００μｌの安定化溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，１．９Ｍ ＡＤＰ）に再懸濁させた。得られた懸濁液を、微量遠心管内で５，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。上清（洗液）を吸引除去し、得られたペレット（ペンブロリズマブ結晶）を５００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．５）に再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。得られたペンブロリズマブ溶液を、微量遠心管内で５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離することにより清澄化した。該清澄化ペンブロリズマブ溶液を、実施例１２および１３に記載されている特徴づけ研究に使用した。

実施例１２および１３：ペンブロリズマブ結晶から可溶化されたペンブロリズマブの特徴づけ
ＥＬＩＳＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、以下のサンプルを特徴づけした。

サンプル１：２００μｌの出発ペンブロリズマブ溶液（１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６中の４０ｍｇ／ｍｌ 抗体）；
サンプル２：５００μｌの可溶化ペンブロリズマブ（実施例１１に記載されているペンブロリズマブ結晶懸濁液から得られた再溶解結晶）；および
サンプル３：５００μｌの１０ｍＭ ヒスチジン，ｐＨ５．６（バッファー対照）。

ＰＤ−Ｌ１との競合に勝ち、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されたＰＤ−１受容体分子に結合するペンブロリズマブの能力を測定する競合結合ＥＬＩＳＡにおいて、サンプル１および２におけるペンブロリズマブの生物活性を測定した。一定濃度のＰＤ−Ｌ１の存在下で前記サンプルの系列希釈を用いて、用量応答曲線を作成した。最大結合の５０％を示すペンブロリズマブの濃度であるＥＣ５０値を、４パラメータ・ロジスティック曲線フィッティング解析プログラムを使用して各サンプルに関して決定した。ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）において用量応答曲線の平行線解析（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を適用して、相対効力を計算した。幾何標準偏差および９５％ 信頼区間と共にサンプル１に対する幾何平均効力として示されている、サンプル２の競合結合効力を以下に示す。

これらの結果は、結晶化されたことがないペンブロリズマブと、結晶性ペンブロリズマブ懸濁液から集められたペンブロリズマブ結晶から可溶化されたペンブロリズマブとが、競合結合ＥＬＩＳＡにおいて匹敵する生物活性を有することを示している。

室温（２５℃）でＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）系においてＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ２０００カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ；Ｐ／Ｎ：１８６００５２２５）を使用するＵＰ−ＳＥＣアッセイを用いてＳＥＣ特徴づけを行った。サンプラーを４℃で温度制御した。移動相として１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を使用して０．５ｍｌ／分の流速で分離を行った。推奨検出波長としてＡ２１４を用いて、実施時間は５分間であった。Ａ２８０も集めた。サンプル１および２のそれぞれに関する分離プロットを、それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。

本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるという宣誓陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは該参考文献の内容または公開日に関して何ら自認するものでもない。

表４は配列表における配列の簡潔な説明を示す。

Claims (20)

1. 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶であって、抗ＰＤ−１ ｍＡｂがペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である、結晶。
2. 結晶が、１〜２００ミクロン、１〜１００ミクロン、１〜２０ミクロン、５〜１００ミクロン、５〜５０ミクロン、５〜４０ミクロン、５〜３０ミクロン、５〜２０ミクロン、５〜１０ミクロン、１０〜１００ミクロン、１０〜５０ミクロンおよび１０〜２０ミクロンからなる群から選択される範囲内の長さを有することにより特徴づけられる、請求項１記載の結晶。
3. 結晶が、５〜１０ミクロン、５〜２０ミクロン、５〜４０ミクロンまたは５０〜１００ミクロンの長さを有することにより特徴づけられる、請求項２記載の結晶。
4. 抗ＰＤ−１ ｍＡｂがペンブロリズマブであり、結晶がａ＝６３．５〜７８．９オングストローム、ｂ＝１１０．２〜１１２．２オングストローム、ｃ＝２６２．５〜３０６オングストローム、α＝９０、β＝９０、γ＝９０°の単位格子寸法、およびＰ２_１２_１２_１の空間群により特徴づけられる、請求項１〜３のいずれか１項記載の結晶。
5. ２．３オングストローム〜３．５オングストローム、２．３オングストローム〜３．０オングストローム、２．３オングストローム〜２．７５オングストローム、２．３オングストローム〜２．５オングストロームおよび２．３オングストロームからなる群から選択される分解能までＸ線を回折しうる、請求項１〜４のいずれか１項記載の結晶。
6. 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶の製造方法であって、抗ＰＤ−１ ｍＡｂがペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体であり、そして、該製造方法が、結晶形成に十分な時間にわたって、少なくとも２５℃かつ５０℃以下の温度で、抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む溶液を沈殿剤溶液に曝露することを含み、ここで、沈殿剤溶液は、４．０〜５．０のｐＨを有し、１．０Ｍ〜２．５Ｍ リン酸二水素アンモニウムを含む、製造方法。
7. 曝露工程が、抗体溶液および沈殿剤溶液を混合して結晶化混合物を得、そして、結晶化プロセスを該混合物に適用することを含み、ここで、結晶化プロセスは、ハンギングドロップ蒸気拡散、シッティングドロップ蒸気拡散およびバッチからなる群から選択される、請求項６記載の製造方法。
8. 結晶化プロセスがバッチプロセスであり、そして、製造方法が結晶化混合物を抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶で播種することを更に含む、請求項７記載の製造方法。
9. 抗体溶液が、２〜２００ｍｇ／ｍｌ、３〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ／ｍｌまたは約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含み、そして、沈殿剤溶液は、４．２〜４．８、４．４〜４．６および４．５からなる群からｐＨを有する、請求項６〜８のいずれか１項記載の製造方法。
10. 沈殿剤溶液が、（ａ）１．５Ｍ〜２．０Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび１００〜１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、または（ｂ）１．９Ｍ リン酸二水素アンモニウムおよび０．０９Ｍ リン酸水素アンモニウムを含む、請求項６〜９のいずれか１項記載の製造方法。
11. 曝露工程を少なくとも３、４または５日間にわたって約３０℃の温度で行う、請求項６〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
12. 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、抗ＰＤ−１ ｍＡｂを含む溶液から結晶化するための方法であって、ここで、該抗体がペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体であり、そして、該方法が、（ａ）抗ＰＤ−１ ｍＡｂ溶液を沈殿剤溶液および抗ＰＤ−１ ｍＡｂの種晶と一緒にして播種結晶化混合物を得、（ｂ）少なくとも２０℃かつ約４０℃以下の温度で該播種結晶化混合物をインキュベートし、そして、（ｃ）結晶を集めることを含み、ここで、該種晶は、請求項１〜１１のいずれか１項記載の製造方法により製造された抗ＰＤ−１ ｍＡｂの結晶の種ストックに由来する、方法。
13. （ａ）ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブ変異体、またはペンブロリズマブバイオシミラーにおける抗体である抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶、及び（ｂ）少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤、を含む医薬組成物。
14. 組成物中の抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶のそれぞれが請求項１〜５のいずれか１項記載の結晶であるか、または請求項６〜１０のいずれか１項記載の製造方法により製造される結晶である、請求項１３記載の組成物。
15. 抗ＰＤ−１ ｍＡｂ結晶が液体中に懸濁しており、組成物中の抗ＰＤ−１ ｍＡｂ濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１３または１４記載の組成物。
16. 組成物が固体である、請求項１３または１４記載の組成物。
17. 請求項１３〜１６のいずれか１項記載の医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌に対するヒト対象の治療方法。
18. 癌が、膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、頭頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチ大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、請求項１７記載の方法。
19. 医薬組成物が少なくとも２００ｍｇ／ｍｌのｍＡｂを含み、皮下投与される、請求項１８記載の方法。
20. 癌が固形腫瘍であり、そして、医薬組成物の最初の投与の前に被験者から摘出された癌の組織切片が、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現に関して陽性の試験結果を示した、請求項１８または１９記載の方法。

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