CN107249624B

CN107249624B - 抗人类pd-1单克隆抗体的晶体

Info

Publication number: CN107249624B
Application number: CN201680008370.7A
Authority: CN
Inventors: P.雷谢尔特; W.W.普罗西斯; G.斯卡平; 杨孝育; R.卡诗; C.斯特里克兰
Original assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: TW201639886A; BR112017016434A8; MX2017011003A; WO2016137850A1; JP2018510142A; RU2017133449A; US20180237524A1; EP3261663A4; KR20170120155A; CA2975623A1; AU2016223047A1; KR102622285B1; AU2022200142A1; US11014986B2; CN107249624A; AR103726A1; RU2017133449A3; EP3261663A1; TWI714552B; JP6999419B2

Abstract

提供派姆单抗和结构上类似的抗PD‑1单克隆抗体的晶体，以及产生此类晶体的方法，和包含此类抗体晶体的组合物在例如癌症治疗中的用途。本发明通过提供派姆单抗晶体和产生派姆单抗晶体的方法满足这些需要和更多需要。本发明的方法的一个实施方案产生适合于X射线衍射的晶体，并且本发明人在本文使用此类晶体解析派姆单抗的三维结构至2.3 A分辨率。

Description

抗人类PD-1单克隆抗体的晶体

发明领域

本发明总体涉及单克隆抗体的晶形。更具体地，本发明涉及派姆单抗(pembrolizumab)和其结构变体的晶体，包含此类抗体晶体的药物组合物，和此类组合物在癌症的治疗中的用途。

发明背景

许多肿瘤产生导致针对肿瘤的内源性免疫反应的抗原。然而，此反应通常是无效的，因为肿瘤细胞可活化关键免疫检查点，所述免疫检查点引起局部化的免疫抑制。这些免疫检查点之一是人类细胞表面受体PD-1(程序性死亡-1或程序性细胞死亡-1)，其为表达于活化的T细胞的表面上的抑制性信号传导受体。通过结合其配体PD-L1或PD-L2之一的PD-1抑制性信号传导的活化导致抑制针对肿瘤细胞的T细胞介导的免疫反应。为了对抗此PD-1途径介导的针对肿瘤的抗肿瘤免疫反应的抑制，几个公司正开发与人类PD-1结合且阻断PD-1与其配体之间的相互作用的单克隆抗体(mAb)。

这些抗PD-1 mAb之一是派姆单抗(一种人源化IgG4 mAb)，其在美国被批准用于治疗患有不可切除或转移性的黑色素瘤并在伊匹单抗(如果BRAF V600突变为阳性，则BRAF抑制剂)后疾病进展的患者。派姆单抗在治疗许多其他癌症适应症中的效力和安全性正在研究中。

派姆单抗目前被配制用于静脉内(IV)输注，且包含25mg/ml mAb的派姆单抗冻干制剂和溶液制剂描述于WO2012/135408中。然而，经设计以皮下施用的高浓度制剂可以是合意的替代物，这部分地由于其可使得患者能够自我施用派姆单抗。

治疗性抗体传统上以冻干形式或在溶液中制备。冻干形式可展现增强的长期稳定性，但需要在使用前进行重构，这使得其对于自我施用而言不那么理想。溶液制剂无需重构，但可遭受降低的稳定性并在使用前通常需要冷藏。冻干制剂和溶液制剂可能均无法提供足够高浓度以容许通过皮下施用的高剂量递送，因为1.2ml是用于皮下施用的最大优选体积(Yang, M.X.等人, Proc. Nat’l. Acad. Sci.(USA) 100:6934-1939 (2003))。然而，抗体的高浓度溶液制剂(如果可获得)也可易于脱离溶液，或可能太粘而无法在例如为皮下施用、具体地自我施用所需要的窄距针中递送。

实现高浓度抗体制剂的一种建议方法是制备具有抗体晶体的制剂，参见例如Yang等人，同上；美国专利号7,833,525和WO2012/135035。制备抗体晶体的治疗性抗体组合物的基本原理包括室温下液体溶液中蛋白晶体的改善稳定性、高抗体浓度溶液的降低的粘度和操纵结晶条件以针对期望的受控释放性质实现不同形态的能力(参见例如Yang等人，同上和Basu,S.K.等人，Expert Opin. Biol. Thera. 4:301-317 (2004))。

据信抗体由于重链和轻链的柔性而尤其难以结晶。尽管最近30年已有许多完整抗体结晶的报导，但RCSB蛋白数据库中仅储存四种结构，相比之下，储存超过800种Fab apo或复杂结构。Altus Pharmaceuticals的研究者首次描述了使三种市售单克隆抗体：利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和英利昔单抗(infliximab)结晶的结晶方法(WO02/072636)。其他公开的专利申请描述制备抗IL-13 mAb (WO2005/121177)、抗TNF αmAb(WO2008/057240)、抗骨硬化素mAb(WO2012/135035)和抗IL-23 mAb(WO2014/004436)的晶体的方法。尽管存在用于结晶抗体的方法的这些实例，但蛋白结晶领域通常认为鉴定具体抗体的合适结晶条件仍然是经验性操作，且不存在可应用至具体目标抗体来可靠预测何种结晶条件将产生该抗体的晶体的一般性规则。

因此，存在对于制备派姆单抗的晶形的方法的需求。此类晶体可用于阐明派姆单抗的结构(通过x射线衍射分析)和用于制备用于治疗癌症的改善的派姆单抗药物组合物。

发明概述

本发明通过提供派姆单抗晶体和产生派姆单抗晶体的方法来满足这些需要和更多需要。本发明方法的一个实施方案产生适于X射线衍射的晶体，且本发明人在本文中使用此类晶体将派姆单抗的三维结构解析至2.3Å分辨率。

因此，在一个方面，本发明提供抗PD-1抗体的晶体。抗体是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体。在一个实施方案中，晶体包含抗体和溶剂。在一个实施方案中，晶体的长度在以下范围中的任何之间：1微米至200微米、1微米至100微米、1微米至20微米、5微米至100微米、5微米至50微米或5微米至20微米。在一个实施方案中，抗体晶体的特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群。在一个实施方案中，抗体晶体可将X射线衍射至3.5Å或更高(即少于3.5Å)的分辨率。

在另一个方面，本发明提供产生抗PD-1单克隆抗体(mAb)的晶体的方法，其中mAb是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体。该方法包括：(a)在至少25℃且不大于50℃的温度下使mAb的溶液(抗体溶液)暴露于沉淀剂溶液持续足以形成晶体(结晶)的时间，和(b)收获晶体。在一个实施方案中，暴露步骤在不大于约40℃至约45℃的温度下实施。在一个实施方案中，该方法中所使用的沉淀剂溶液具有约4.0至5.0的pH且包含1.0M至2.5M磷酸二氢铵(ADP)。在一个实施方案中，沉淀剂溶液还包含足够量的缓冲剂以将沉淀剂溶液的pH调节至pH 4.0至5.0。在一个实施方案中，缓冲剂是Tris-HCl或磷酸氢二铵。在一个实施方案中，抗体溶液包含抗PD-1 mAb，其浓度为3mg/ml至100mg/ml、10mg/ml至90mg/ml、20mg/ml至80mg/ml、30mg/ml至70mg/ml、40mg/ml至60mg/ml或约50mg/ml。在一个实施方案中，将抗体实施3天、4天或5天中的至少任一者。在一个实施方案中，抗体溶液包含10mM组氨酸(pH 5.6)。在一个实施方案中，抗体溶液进一步包含聚山梨醇酯，其最大浓度为约0.01%。在一个实施方案中，暴露步骤包括实施选自以下的结晶技术：悬滴式蒸气扩散、坐滴式蒸气扩散、透析、微分批法和分批法。在一个实施方案中，暴露步骤包括混合等体积的抗体溶液和沉淀剂溶液以形成结晶混合物。

在另一个方面，本发明提供使抗PD-1单克隆抗体(mAb)自包含抗PD-1 mAb的溶液结晶的方法，其中抗体是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体。该方法包括：(a)合并抗PD-1 mAb溶液与沉淀剂溶液和抗PD-1 mAb的晶种以产生接种的结晶混合物；(b)在至少20℃且不大于40℃的温度下孵育接种的结晶混合物；和(c)收获晶体。在一个实施方案中，孵育温度为约30℃且沉淀剂溶液包含选自以下的混合物：(1)20%聚乙二醇4000(PEG 4K)和20%异丙醇；(2)18%聚乙二醇10000(PEG 10K)、20%甘油、100mM Tris-HCl(pH 8.5)；和(3)2.0M磷酸二氢铵和100mM Tris-HCl。在另一个实施方案中，孵育温度为约22℃且沉淀剂溶液包含选自以下的混合物：(1)25% PEG 4K、100mM Tris-HCl(pH 8.5)和100mM CaCl₂和(2)1.26M硫酸铵、乙酸钠(pH 4.5)和0.2M NaCl。在一些实施方案中，晶种来自抗PD-1 mAb的晶体的晶种储备物，所述晶体通过在约30℃的温度下在具有4.0至5.0的pH且包含1.0M至2.5M ADP的沉淀剂溶液中结晶来产生。

在又另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含(a)抗PD-1抗体的晶体，其中抗体是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体，和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，赋形剂实施至少一种选自包封晶体、包埋晶体和稳定地维持晶体的功能。在一些实施方案中，组合物中晶体的平均长度为1微米至20微米、5微米至20微米、5微米至50微米或5微米至100微米。在一个实施方案中，组合物包含悬浮于液体介质中的抗PD-1 mAb晶体。在一个实施方案中，组合物中的抗PD-1 mAb浓度为至少约50mg/ml且不大于约250mg/ml。在另一个实施方案中，组合物为固体，其通过将晶体的液体悬浮液脱水或冻干来制备。在一个实施方案中，在将液体或固体药物组合物在室温(例如20℃至25℃)下储存至少一个月后存在抗PD-1 mAb的生物活性的至少95%、97%或99%。

在另一个方面，本发明提供包含上述药物组合物中的任一者的容器。该容器可以是单一剂量小瓶、多剂量小瓶、预填充的注射器或自注射装置。在一个实施方案中，该容器包含单一剂量的约200mg至约250mg的抗PD-1 mAb，即派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药。

在又另一个方面，本发明包括治疗人类主体的癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的上述药物组合物中任一者。在一个实施方案中，该癌症是实体瘤，例如，膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)或三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，该癌症是血红素(Heme)恶性肿瘤，例如，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV阳性DLBCL、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞型大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓细胞白血病-1蛋白(Mc1-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。在一个实施方案中，药物组合物包含至少200mg/ml的派姆单抗且皮下施用。在一个实施方案中，在第一次施用药物组合物前自主体移除的癌症的组织切片对于PD-L1和PD-L2中的一者或两者的表达测试为阳性。在一个实施方案中，组织切片中肿瘤细胞的至少50%通过免疫组织化学(IHC)测定经测试对于PD-L1表达为阳性。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一个有色附图。在要求并支付必要费用之后专利局可提供本专利或专利申请公开的具有彩图的拷贝。

图1显示派姆单抗和本文所述的派姆单抗变体的轻链CDR序列的氨基酸序列(SEQID NO: 1-3)。

图2显示派姆单抗和本文所述的派姆单抗变体的重链CDR序列的氨基酸序列(SEQID NO: 4-6)。

图3显示派姆单抗的重链(图3A)和轻链(图3B)的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 7和8)。

图4显示派姆单抗结晶悬浮液内晶体的显微照片，所述晶体通过在30℃下使用2.0M磷酸二氢铵、100mM Tris-HCl的沉淀剂溶液进行蒸气扩散而获得。100X放大率下的显微照片在3天后使用SONICC成像系统而获得，其中图4A使用SHG模式产生且图4B使用UV-TPEF模式产生。参见实施例1。

图5显示派姆单抗结晶悬浮液内晶体的显微照片，所述晶体通过在30℃下使用2.0M磷酸二氢铵、100mM Tris的沉淀剂溶液在0.02%聚山梨醇酯80存在(图5A)或不存在(FIG 5B)下进行自由界面扩散而获得。100×放大率下的显微照片在2天后使用Fluidigm自动化成像系统而获得。参见实施例 2。

图6显示派姆单抗结晶悬浮液内晶体的显微照片，所述晶体通过在30℃下使用1.5M磷酸二氢铵、100mM Tris-HCl的沉淀剂溶液进行悬滴式蒸气扩散而获得。100×放大率下的显微照片在3天后使用Nikon SMZ1500 Stereo显微镜和Nikon ES400照相机成像系统而获得。参见实施例 4。

图7显示派姆单抗结晶悬浮液内晶体的显微照片，所述晶体通过在30℃下使用1.8M磷酸二氢铵、120mM Tris-HCl的沉淀剂溶液进行分批结晶而获得。参见实施例 5。100×放大率下的显微照片在5天后使用Nikon SMZ1500 Stereo显微镜和Nikon ES400照相机成像系统而获得。双侧箭头指示长度约20微米的晶体。

图8显示派姆单抗三维结构的带状图，其通过在30℃下使用1.8M磷酸二氢铵、100mM Tris-HCl作为沉淀剂的悬滴扩散方法获得的晶体的X射线衍射分析而解析。参见实施例 7。带状图在图8A中以色彩显示，其中两条重链为黄色和青色，且两条轻链为洋红色(FAB-1)和绿色(FAB-2)，而相同带状图在图8B中以灰色色调显示。

图9显示派姆单抗结晶悬浮液内晶体的显微照片，所述晶体通过在30℃下使用1.9M磷酸二氢铵和0.09M磷酸氢铵作为沉淀剂的蒸气扩散而获得。参见实施例 8。70×放大率下的显微照片在3天后使用Rock Imager系统(Formulatrix, Bedford, MA)而获得，且双侧箭头指示20微米的距离。

图10显示通过如实施例13中所述的不同派姆单抗溶液的UPLC-SEC表征产生的图，显示于图10A中的派姆单抗一直未结晶且显示于图10B中的派姆单抗从派姆单抗晶体溶解。

详述

I. 缩写. 在整个本发明的详述和实施例中，将使用以下缩写：

ADP 磷酸二氢铵

AHP 磷酸氢铵

CDR 互补决定区

CHO 中国仓鼠卵巢

DFS 无病存活

FR 框架区

IHC 免疫组织化学或免疫组织化学的

NCBI 国家生物技术信息中心

NCI 国家癌症研究所

PD 进行性疾病

PD-1 程序性死亡1

PD-L1 程序性细胞死亡1配体1

PD-L2 程序性细胞死亡1配体2

PFS 无进展存活

PR 部分反应

OR 总体反应

OS 总体存活

Q2W 每两周一个剂量

Q3W 每三周一个剂量

QD 每天一个剂量

RECIST 实体瘤中的反应评估标准

SD 稳定疾病

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区。

II. 定义

为可更易于理解本发明，下文明确定义某些技术和科学术语。除非在此文件别处明确定义，否则本文所使用的所有其他技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。

如本文(包括随附权利要求)所用，除非上下文明确指示，否则词语的单数形式(例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”)包括其相应多个指示物。

“约”在用于修饰数值定义的参数(例如，溶液中组分的浓度)时意味着该参数可变化高于或低于该参数的所述数值的多达10%。例如，包含约200mg/ml指定抗体的组合物可具有180mg/ml至220mg/ml的抗体。类似地，约30℃的温度意指27℃至33℃的任一温度。

“施用”和“治疗”在其应用至动物、人类、实验主体、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人类、主体、细胞、组织、器官或生物流体接触。“施用”和“治疗”可指例如治疗方法、药物动力学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。细胞的处理涵盖使试剂与细胞接触，以及使试剂与流体接触，其中该流体与细胞接触。“施用”和“治疗”还包括通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一细胞对(例如)细胞的体外和离体处理。术语“主体”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，且最优选人类。

如本文所使用，术语“抗体”是指包括两对相同的多肽链的四聚体，每一对均具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每一链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。

通常，重链和轻链中的每一者的可变区包含三个高变区，其也被称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，使得能够结合至特异性表位。一般而言，从N-末端至C-末端，轻链和重链可变结构域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4(即CDRL1、CDRL2和CDRL3在轻链可变结构域中，而CDRH1、CDRH2和CDRH3在重链可变结构域中)。氨基酸至每一结构域的分配通常根据以下文献的定义：Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat,等人; National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. ;第5版; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv.Prot. Chem. 32:1-75; Kabat,等人, (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616;Chothia,等人, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917或Chothia,等人, (1989) Nature342:878-883。

如本文所使用，磷酸二氢铵(NH₄H₂PO4)或ADP与单碱式磷酸铵、磷酸一铵和磷酸二氢铵(prim-ammonium phosphate)同义。

如本文所使用，磷酸氢铵((NH₄)₂HPO₄)或AHP与二碱式磷酸铵、磷酸氢二铵(diammonium hydrogen phosphate)和磷酸氢二铵(di-ammonium hydrogen phosphate)同义。

术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物中特征通常在于不受控的细胞生长的生理学病况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、胃肠(道)癌症、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、成神经细胞瘤、胰脏癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。可根据本发明治疗的尤其优选癌症包括特征在于在测试组织样品中PD-L1和PD-L2中的一者或两者的表达升高的那些。

“浓度”在参考本发明的结晶抗体悬浮液使用时是指存在于给定宏观单位体积的溶液中的抗体(例如，派姆单抗)的量。术语浓度以其惯常意义使用，尽管与传统溶液相比，悬浮液具有固有异质性。结晶悬浮液中抗体的浓度等于其中抗体不呈晶形的等效样品的浓度。

“保守修饰的变体”或“保守取代”是指氨基酸取代为本领域技术人员已知且通常可在不改变所得分子的生物活性的情况下进行，甚至在多肽的必需区中。此类示例性取代优选根据下表1中所述的那些进行：

表1

示例性保守氨基酸取代

原始残基	保守取代
		Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys, His
		Asn (N)	Gln; His
Asp (D)	Glu; Asn
		Cys (C)	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn
		Glu (E)	Asp; Gln
Gly (G)	Ala
		His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
		Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; His
		Met (M)	Leu; Ile; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
		Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
		Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
		Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

如整个说明书和权利要求中所用，“基本上由…组成(consists essentiallyof)”和变型(诸如“基本上由…组成”(“consist essentially of”或“consistingessentially of”))指示包括任何所述的要素或要素组，且任选包括具有与所述要素类似或不同的性质且不会显著改变指定剂量方案、方法或组合物的基本或新颖性质的其他要素。作为非限制性实例，基本上由抗体晶体和特定药学上可接受的赋形剂组成的药物组合物也可包括一种或多种不会显著影响药物组合物的性质的其他赋形剂。

如本文所使用，“抗PD-1 mAb晶体”或“结晶抗PD-1 mAb”是指含有以在三维中周期性地重复的晶格结构排列的抗体的晶体。相反，例如，诸如通过冻干溶解于溶液中的mAb产生的固体非晶形形式的mAb并不展现结晶抗体形式特有的光学性质(诸如折射率和双折射)。

如本文所使用，且关于基于透析的结晶方法，“透析溶液”是指针对其透析派姆单抗溶液(“抗体溶液”)以驱动形成本发明结晶抗体的溶液。“保留物”是指透析后的抗体溶液，其可包括抗体的晶体，收获所述晶体。抗体溶液/保留物在透析膜的一侧上，且透析溶液在相对侧上。

术语“微米(micron和micrometer)”在本文中可互换使用且各自意指1米的1/1000000。

如本文所使用，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指实质上均质的抗体的群体，即构成该群体的抗体分子的氨基酸序列相同，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括许多在其可变结构域、具体而言其CDR中具有不同氨基酸序列的不同抗体，所述CDR通常对于不同表位是特异性的。修饰词“单克隆”指示抗体的特征在于从实质上同质的抗体群体获得，且不应理解为需要通过任一具体方法来产生该抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler等人. (1975) Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法来制备，或可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利号4,816,567)。也可使用描述于例如Clackson等人 (1991) Nature 352: 624-628和Marks等人(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597中的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。还参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731。

如本文所使用，“PD-L1”或“PD-L2”表达意指在细胞表面上指定PD-L蛋白或在细胞或组织内指定PD-L mRNA的任何可检测表达水平。可在肿瘤组织切片的IHC测定中利用诊断性PD-L抗体或通过流式细胞术检测PD-L蛋白表达。或者，可使用特异性结合至期望PD-L靶标(例如，PD-L1或PD-L2)的结合剂(例如，抗体片段、亲和体等)通过PET成像检测肿瘤细胞的PD-L蛋白表达。用于检测和测量PD-L mRNA表达的技术包括RT-PCR和实时定量RT-PCR。

已描述用于在肿瘤组织切片的IHC测定中对PD-L1蛋白表达进行定量的几种方法。参见例如Thompson, R. H.,等人, PNAS 101 (49); 17174-17179 (2004); Thompson, R.H.等人, Cancer Res. 66:3381-3385 (2006); Gadiot, J.,等人, Cancer 117:2192-2201 (2011); Taube, J. M. 等人, Sci Transl Med 4, 127ra37 (2012);和Toplian,S. L.等人, New Eng. J Med. 366 (26): 2443-2454 (2012)。

一种方法采用针对PD-L1表达阳性或阴性的简单二进制终点，其中阳性结果在展现细胞-表面膜染色的组织学证据的肿瘤细胞的百分比方面进行定义。对于PD-L1表达为总肿瘤细胞的至少1%且优选5%，将肿瘤组织切片视为阳性。

在另一方法中，在肿瘤细胞中以及在主要包含淋巴细胞的浸润免疫细胞中对肿瘤组织切片中的PD-L1表达进行定量。展现膜染色的肿瘤细胞和浸润免疫细胞的百分比单独定量为<5%、5%至9%，且然后以10%增量至最多100%。对于肿瘤细胞，如果评分<5%评分，则PD-L1表达被视为阴性，且如果评分≥5%，则视为阳性。免疫浸润液中的PD-L1表达被报告为被称为调节的炎症评分(AIS)的半定量测量，其通过膜染色细胞的百分比乘以浸润液强度来确定，其被分级为无(0)、轻度(1的评分，淋巴细胞稀疏)、中等(2的评分，通过淋巴细胞组织细胞聚集物的肿瘤的病灶浸润)或严重(3的评分，弥漫浸润)。如果AIS≥5，则将肿瘤组织切片视为通过免疫浸润物的PD-L1表达阳性。

可将PD-L mRNA表达水平与通常用于定量RT-PCR中的一种或多种参考基因(诸如泛素C)的mRNA表达水平进行比较。

在一些实施方案中，基于与适当对照的PD-L1表达(蛋白和/或mRNA)水平的比较，将恶性细胞和/或肿瘤内浸润免疫细胞的PD-L1表达(蛋白和/或mRNA)的水平确定为“过表达”或“升高”。例如，对照PD-L1蛋白或mRNA表达水平可以是在相同类型的非恶性细胞中或在来自匹配正常组织的切片中进行定量的水平。在一些优选实施方案中，如果肿瘤样品中的PD-L1蛋白(和/或PD-L1 mRNA)比对照多至少10%、20%或30%，则确定该样品中的PD-L1表达升高。

如本文所使用的“派姆单抗”意指(a)具有描述于 WHO Drug Information, Vol.27, No. 2，第161至162页(2013)中的结构且由Merck Sharp & Dohme Corp. (MSD)(控制MSD或由MSD控制的公司)或其权利继承者(个体和共同地，“MSD”)制造的或代表该公司或其权利继承者制造的IgG4单克隆抗体。派姆单抗的每一轻链均包含显示于图1中的三个CDR序列(SEQ ID NO: 1作为CDRL1，SEQ ID NO: 2作为CDRL2且SEQ ID NO: 3作为CDRL3)，且派姆单抗的每一重链均包含显示于图2中的CDR序列(SEQ ID NO: 4作为CDRH1，SEQ ID NO: 5作为CDRH2且SEQ ID NO: 6作为CDRH3)。派姆单抗的全长重链和轻链包含显示于图3中的重链和轻链序列(分别SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8)。

派姆单抗生物仿制药意指由除MSD以外的实体制造且由任一国家的管理机构批准作为派姆单抗生物仿制药出售的生物产品。在一个实施方案中，派姆单抗生物仿制药包含派姆单抗变体作为原料药。在一个实施方案中，派姆单抗生物仿制药具有与派姆单抗相同的氨基酸序列。

如本文所使用，“派姆单抗变体”意指包含与派姆单抗的重链和轻链序列(分别SEQID NO: 7和8)相同的重链和轻链序列的单克隆抗体，除了具有在位于轻链CDR外部的位置处的三个、两个或一个保守氨基酸取代和具有位于重链CDR外部的六个、五个、四个、三个、两个或一个保守氨基酸取代(例如，变体位置位于框架区或恒定区中)。换言之，派姆单抗和派姆单抗变体包含相同CDR序列，但由于在其全长轻链和重链序列中在分别不超过三个或六个其他位置处具有保守氨基酸取代而彼此不同。派姆单抗变体在以下性质方面实质上与派姆单抗相同：与PD-1的结合亲和力和阻断PD-L1和PD-L2中的每一者与PD-1结合的能力。

“沉淀剂”是使多肽(诸如抗体)在浓溶液中的溶解度降低的化合物。在分批结晶方法中，沉淀剂包括于“沉淀剂溶液”中，并在大量透析方法中，沉淀剂包括于“透析溶液”中。沉淀剂通过在多肽分子周围形成能量上不利的沉淀剂耗尽层而诱导结晶。为了最小化此耗尽层的相对量，多肽形成缔合物，且最终形成晶体。此过程描述于Weber (1991) Advances in Protein Chemistry 41:1中。各种沉淀剂是本领域已知的且包括：硫酸铵、乙醇、异丙醇、1,2丙二醇、3-乙基-2,4戊二醇；和许多聚二醇，诸如聚乙二醇(例如PEG 300和PEG400)。除沉淀剂以外，有时将其他材料添加至多肽沉淀剂溶液中。这些包括用于调节溶液的pH(和因此肽上的表面电荷)的缓冲剂(诸如Tris或HEPES)和用于降低多肽的溶解度的盐(诸如氯化钠、氯化锂和柠檬酸钠)。

如本文所使用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指抗PD-1抗体当单独或与另一治疗剂组合施用于细胞、组织或主体时可有效治疗癌症的量。当应用至单独施用的抗PD-1抗体时，治疗有效量是指该单独成分。当应用至组合时，无论组合、连续或同时施用，治疗有效量均是指引起治疗性效应的抗PD-1抗体和其他治疗剂的组合量。

“组织切片”是指单一部分或单片组织样品，例如，从正常组织或肿瘤的样品切下的组织薄片。

如本文所使用，“治疗(treat或treating)”癌症意指向具有癌症或诊断患有癌症的主体施用本发明的药物组合物，以实现至少一种阳性治疗效果，诸如例如，减少癌细胞数量，减小肿瘤大小，降低癌细胞浸润至外周器官中的速率，或降低肿瘤转移或肿瘤生长的速率。可以许多方式测量癌症的阳性治疗效果(参见W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009))。例如，关于肿瘤生长抑制，根据NCI标准，≦42%的T/C是抗肿瘤活性的最低水平。< 10%的T/C被视为高抗肿瘤活性水平，其中T/C (%)=治疗的中值肿瘤体积/对照的中值肿瘤体积×100。在一些实施方案中，通过本发明的组合实现的治疗为PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一者。PFS也称作“肿瘤进展时间”，其指示在治疗期间和之后癌症不再生长的时间长度，且包括患者已经历CR或PR的时间量，以及患者已经历SD的时间量。DFS是指在治疗期间和之后患者保持无疾病的时间长度。OS是指与原始(naive)或未治疗的个体或患者相比预期寿命的延长。在一些优选实施方案中，对本发明组合的反应是PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中的任一者，其使用RECIST 1.1反应标准来评价。可有效治疗癌症患者的针对本发明组合的治疗方案可根据因素诸如患者的疾病状态、年龄和重量和疗法在主体中引发抗癌反应的能力而变化。尽管本发明方面中的任一者的实施方案可能不会在每一主体中有效实现阳性治疗效果，但应当在统计显著量的主体中实现，如通过本领域已知的任一统计检验(诸如Student氏t检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验)来确定。

如本文所使用，“Tris”(2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇)与TRIS、Tris碱、三羟甲基氨基甲烷(Trizma)、Trisamine、THAM、氨基丁三醇(Tromethamine)、缓血酸胺(Trometamol)、三羟甲基氨基甲烷(Tromethane)和氨丁三醇(Trisaminol)同义。

“肿瘤”在其应用至被诊断患有或怀疑患有癌症的主体时是指具有任一大小的恶性或潜在恶性赘生物或组织块，且包括原发性肿瘤和继发性赘生物。实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的组织的异常生长或块。不同类型的实体瘤针对形成其的细胞类型来命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不会形成实体瘤(NationalCancer Institute, Dictionary of Cancer Terms)。

“肿瘤负荷”也称为“肿瘤载量”，是指分布于整个体内的肿瘤物质的总量。肿瘤负荷是指整个体内的癌症细胞总量或肿瘤的总大小，包括淋巴结和骨髓。肿瘤负荷可通过本领域已知的各种方法来测定，诸如例如当肿瘤从主体移除时例如使用卡尺、或当在体内时使用成像技术(例如超音波、骨扫描、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)扫描)测量其尺寸。

术语“肿瘤大小”是指肿瘤的总大小，其可测量为肿瘤的长度和宽度。肿瘤大小可通过本领域已知的各种方法来测定，诸如例如当肿瘤从个体移除时例如使用卡尺、或当在体内时使用成像技术(例如骨扫描、超音波、CT或MRI扫描)测量其尺寸。

III. 抗体结晶

本发明部分地基于用于派姆单抗的结晶条件的鉴定。结晶条件包含以下的独特组合：(1)沉淀剂溶液，其包含高盐浓度(即，在1.0M至2.5M或1.5M至2.0M的ADP)且具有酸性pH(即，以下4.0至5.0、4.2至4.8、4.4至4.6或4.5中的任一者的pH)；和(2)高温(即，至少25℃且至多50℃)。在一个实施方案中，可通过在沉淀剂溶液中包含缓冲剂将pH维持在所需范围内。合适的缓冲剂包括例如Tris-HCl、磷酸氢铵、组氨酸和氢氧化铵。优选针对待实施结晶的温度来确定沉淀剂溶液的pH，在一个实施方案中，该温度为27℃至约30℃的温度。本发明的结晶条件与几种结晶技术相容，且能够根据比3.5 a衍射分辨率更差的晶体的预期用途（包括不同的衍射特性），产生具有各种长度(包括1微米至20微米和5微米至100微米)的抗PD-1 mAb的晶形以及具有低分辨率(例如，3.5Å)或高分辨率(例如，2.3Å)的晶体。

已知各种蛋白结晶方法。Giege等人. (1994) Acta Crystallogr. D50:339;McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1。此类技术包括悬滴式蒸气扩散(McPherson(1976) J. Biol. Chem. 251:6300)、坐滴式蒸气扩散、微分批法和透析。

悬滴和坐滴式蒸气扩散需要允许含有纯化蛋白、缓冲剂和沉淀剂的小滴与含有较高浓度的类似缓冲剂和沉淀剂的较大贮器进行平衡。最初，蛋白溶液的小滴含有不足以结晶的浓度的沉淀剂，但在水从液滴蒸发并转移至贮器时，沉淀剂浓度增加至结晶最佳的水平。由于系统处于平衡中，所以维持这些最佳条件直至结晶完成。悬滴方法与坐滴方法的不同在于蛋白溶液滴在系统内的垂直定向。

在微分批方法中，将多肽与沉淀剂混合以实现过饱和，且密封器皿，并放在一旁直至晶体出现。

在透析方法中，多肽保留于与含有沉淀剂的溶液接触的透析膜的一侧。跨膜平衡增加沉淀剂浓度，由此使得多肽达到过饱和水平。

使用这些技术中的一些来制备本发明的派姆单抗晶体，如实施例1至7中更详细描述。高通量实例最适于筛选以优化沉淀剂溶液，而非用于大规模晶体产生。

本发明结晶方法中所使用的抗PD-1 mAb溶液将具有3至100mg/ml的抗体浓度并在约10mM组氨酸的缓冲液(约5.5的pH)中方便地提供。

关于例如用于治疗用途的抗PD-1 mAb晶体的大规模产生，实施例5和9-11概述了分批结晶方案。在一个实施方案中，使派姆单抗从溶液结晶的分批法包括制备在1.8M至2.5M ADP中包含至少10mg/ml派姆单抗且具有约4.4至4.6的pH的结晶混合物。在一个实施方案中，结晶混合物进一步包含选自3% 1,5二-氨基戊烷二盐酸盐；3%异丙醇和4%丙二醇的添加剂。可使用本领域已知的方法(诸如离心、透析和各种过滤方法，包括中空纤维切向流过滤)从分批结晶混合物收获晶体。

可通过各种方法分析抗PD-1 mAb晶体来检查或表征其物理性质，诸如晶体大小、形状、表面形态、总表面积和孔隙度。此类分析技术包括例如电子衍射和固态核磁共振(ssNMR)、光学显微术、透射电子显微术、扫描电子显微术、原子力显微术和各种光散射技术。

呈本发明晶体形式的抗PD-1 mAb的生物活性和/或生物物理性质可通过将抗体晶体“再溶解”或溶解于适于期望分析技术的缓冲液中来分析。例如，可通过ELISA、大小排阻色谱、SDS PAGE和动态光散射中的一种或多种分析溶解的抗PD-1 mAb。本文的本发明人考虑本文所述的结晶条件将可用于分批结晶技术来制备派姆单抗和结构上类似的抗PD-1mAb(即派姆单抗变体和派姆单抗生物仿制药)的结晶悬浮液。由于使用高结晶温度(至少25℃且至多50℃)，本发明人考虑使用这些条件产生的结晶悬浮液和包含此类晶体的药物组合物可在室温下储存至少一个月的时段且抗PD-1 mAb的生物活性或稳定性极少改变或不发生改变。

已从根据本发明制备的抗体晶体溶解的抗PD-1 mAb(派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药)应使结晶前起始材料的性质保持在可接受容限内。各种功能参数的可接受容限可基于预期用途而变化，但关于结合亲和力或生物活性，可包括保留最初(非结晶)亲和力或活性的至少80%、至少90%或至少95%。例如，可使用描述于实施例12中的方法测量抗PD-1 mAb阻断PD-L1结合至PD-1的能力。

如本文实施例11至12中所述，从溶解派姆单抗晶体获得的派姆单抗和尚未结晶的派姆单抗的生物活性和生物物理性质使用ELISA和大小排阻色谱来比较且被确定为实质上类似的。这些结果支持包含派姆单抗晶体的药物组合物用于治疗性治疗人类主体的用途。

IV. 药物组合物

为了制备药物组合物，将本发明的抗PD-1 mAb晶体或从此类晶体溶解的抗PD-1mAb与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。参见例如 Remington's Pharmaceutical Sciences和U.S. Pharmacopeia:National Formulary, Mack Publishing Company,Easton, PA (1984)。不要求用于本发明药物组合物中的抗PD-1 mAb晶体具有任何具体衍射质量，只要抗体的生物活性和稳定性维持在期望范围内。

在一些实施方案中，在结晶期间或之后将赋形剂直接添加至结晶液体。在其他实施方案中，首先从液体收获晶体，通过悬浮于稳定溶液中来洗涤，从稳定溶液收获且然后将其悬浮于包含赋形剂的液体溶液中。组合物的液体可以是任一药学上可接受的介质，且可包括例如水溶液和油包水混合物。

可通过例如通过使氮、空气或惰性气体流在晶体上方穿过、通过空气干燥、真空干燥或冻干来干燥包含晶体和期望赋形剂的液体悬浮液来制备固体形式的晶体药物组合物。最终产品中的水分含量通常将少于10重量%、7重量%、5重量%或3重量%。

呈液体悬浮液或呈干燥固体的包含已从派姆单抗晶体溶解的派姆单抗的药物组合物可通过以下来制备：将期望量的晶体添加至药学上可接受的溶解缓冲液中，并在4℃下孵育直至晶体溶解。在一个实施方案中，溶解缓冲液包含10mM组氨酸(pH 5.6)、0.02%聚山梨醇酯80和至多4%蔗糖w/v。在一个实施方案中，所得组合物中的任何微粒均在施用之前通过例如离心或过滤去除。

V. 治疗方法

可由临床医师例如使用本领域已知或怀疑可影响治疗或预测可影响治疗的参数或因素确定用于治疗具体患者的具体癌症的本发明药物组合物的适当剂量。例如，医师可选择用略少于最佳剂量或批准剂量的剂量来起始治疗，且然后以小增量增加剂量直至相对于任何负面的副作用实现期望或最佳效应。

在一个实施方案中，组合物的剂量和施用途径将提供对派姆单抗抗体的中值暴露，其与由200mg Q2W或Q3W的剂量的未结晶派姆单抗提供的中值暴露实质上类似。

技术人员从结合本领域常识的本文所含的教导将明白本发明的这些和其他方面(包括下文列出的示例性特定实施方案)。

VI. 本发明的示例性特定实施方案

1. 抗PD-1单克隆抗体(mAb)的晶体，其中所述mAb是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体。

2. 实施方案1的晶体，其中所述晶体的特征在于具有选自以下的范围内的长度：1微米至200微米、1微米至100微米、1微米至20微米、5微米至100微米、5微米至50微米、5微米至40微米、5微米至30微米、5微米至20微米、5微米至10微米、10微米至100微米、10微米至50微米和10微米至20微米。

3. 实施方案3的晶体，其中所述晶体的特征在于具有5微米至10微米、5微米至20微米或5微米至40微米的长度。

4. 实施方案2的晶体，其中所述晶体的特征在于具有50微米至100微米的长度。

5. 实施方案1至4中任一项的晶体，其特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群。

6. 上述实施方案中任一项的晶体，其能够将X射线衍射至选自以下的分辨率：2.3Å至3.5Å、2.3Å至3.0Å、2.3Å至2.75Å、2.3Å至2.5Å和2.3Å。

7. 上述实施方案中任一项的晶体，其被悬浮于包含相同抗PD-1 mAb的其他晶体的液体介质中。

8. 上述实施方案中任一项的晶体，其中所述抗PD-1 mAb是派姆单抗。

9. 产生抗PD-1单克隆抗体(mAb)的晶体的方法，其中所述mAb是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体，且所述方法包括在为至少25℃且不大于50℃、45℃、40℃或37℃的温度下使包含所述抗PD-1 mAb的溶液暴露于沉淀剂溶液持续足以形成晶体的时间，其中所述沉淀剂溶液具有4.0至5.0的pH且包含1.0M至2.5M磷酸二氢铵。

10. 实施方案9的方法，其中所述暴露步骤包括混合所述抗体溶液和所述沉淀剂溶液以形成结晶混合物并将结晶方法应用至所述混合物。

11. 实施方案10的方法，其中所述结晶方法选自以下：悬滴式蒸气扩散、坐滴式蒸气扩散和分批法。

12. 实施方案11的方法，其中所述结晶方法是分批方法且所述方法进一步包括用所述抗PD-1 mAb的晶体对所述结晶混合物接种。

13. 实施方案9至12中任一项的方法，其中所述结晶混合物中的抗体浓度为约10mg/ml或约20mg/ml。

14. 实施方案9的方法，其中所述暴露步骤包括使用30kD分子量截留膜针对所述沉淀剂溶液透析所述抗体溶液。

15. 实施方案9至14中任一项的方法，其中所述抗体溶液包含所述抗PD-1 mAb，其浓度为2mg/ml至200mg/ml、3mg/ml至100mg/ml、10mg/ml至90mg/ml、20mg/ml至80mg/ml、30mg/ml至70mg/ml、40mg/ml至60mg/ml或约50mg/ml。

16. 实施方案9至15中任一项的方法，其中所述沉淀剂溶液具有选自以下的pH：4.2至4.8、4.4至4.6和4.5。

17. 实施方案9至16中任一项的方法，其中所述沉淀剂溶液进一步包含缓冲剂。

18. 实施方案17的方法，其中所述缓冲剂是Tris-HCl、磷酸氢铵、氢氧化铵或组氨酸。

19. 实施方案9至18中任一项的方法，其中所述沉淀剂溶液基本上由1.5M至2.0M磷酸二氢铵和100mM至120mM Tris-HCl组成。

20. 实施方案9至17中任一项的方法，其中所述沉淀剂溶液包含磷酸二氢铵和磷酸氢铵的混合物。

21. 实施方案20的方法，其中所述沉淀剂溶液基本上由1.9M磷酸二氢铵和0.09M磷酸氢铵组成。

22. 实施方案9至21中任一项的方法，其中所述暴露步骤是在约30℃的温度下实施至少3天、4天或5天。

23. 使抗PD-1单克隆抗体(mAb)从包含所述抗PD-1 mAb的溶液结晶的方法，其中所述抗体是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体且所述方法包括：(a)合并所述抗PD-1 mAb溶液与沉淀剂溶液和所述抗PD-1 mAb的晶种以产生接种的结晶混合物；(b)在至少20℃且不大于40℃的温度下孵育所述接种的结晶混合物；和(c)收获晶体。

24. 实施方案23的方法，其中所述孵育温度为约30℃且所述沉淀剂溶液包含选自以下的混合物：(1)20%聚乙二醇4000(PEG 4K)和20%异丙醇；(2)18%聚乙二醇10000(PEG10K)、20%甘油、100mM Tris-HCl(pH 8.5)；和(3)2.0M磷酸二氢铵和100mM Tris-HCl。

25. 实施方案23的方法，其中所述孵育温度为约22℃且所述沉淀剂溶液包含选自以下的混合物：(1)25% PEG 4K、100mM Tris-HCl(pH 8.5)和100mM CaCl₂和(2) 1.26M硫酸铵、乙酸钠(pH 4.5)和0.2M NaCl。

26. 实施方案23至25中任一项的方法，其中所述晶种来自通过实施方案9至22中任一项的方法产生的所述抗PD-1 mAb的晶体的晶种储备物。

27. 实施方案9至26中任一项的方法，其中所述抗PD-1 mAb是派姆单抗。

28. 抗PD-1 mAb晶体，其通过实施方案9至27中任一项的方法产生。

29. 药物组合物，其包含(a)抗PD-1单克隆抗体(mAb)的晶体，其中所述抗体是派姆单抗、派姆单抗变体或派姆单抗生物仿制药中的抗体；和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。

30. 实施方案29的组合物，其中所述赋形剂实施选自包封所述晶体、包埋所述晶体和稳定维持所述晶体的至少一种功能。

31. 实施方案29或30的组合物，其中所述抗PD-1 mAb晶体中的每一者均为实施方案1至8或27中任一项的晶体。

32. 实施方案29至31中任一项的组合物，其为液体。

33. 实施方案29至31中任一项的组合物，其为固体。

34. 实施方案29至32中任一项的组合物，其中所述组合物中的抗PD-1 mAb浓度为至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少200mg/ml或至少250mg/ml。

35. 实施方案29至34中任一项的组合物，其中在将所述组合物在20℃至25℃下储存至少一个月之后存在所述抗PD-1 mAb的生物活性的至少95%。

36. 治疗人类主体的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的实施方案29至35中任一项的药物组合物。

37. 实施方案36的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、三阴性乳腺癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV阳性DLBCL、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞型大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。

38. 实施方案36或37的方法，其中所述药物组合物包含至少200mg/ml的所述mAb且皮下施用。

39. 实施36至38中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤，并在第一次施用所述药物组合物之前从所述主体移除的所述癌症的组织切片对于PD-L1和PD-L2中的一者或两者的表达测试为阳性。

40. 实施方案39的方法，其中所述组织切片中所述肿瘤细胞的至少50%通过免疫组织化学(IHC)分析对于PD-L1表达测试为阳性。

参考以下实施例可最好地理解本发明的宽范围，所述实施例并非意欲将本发明限于特定实施方案。本文所述的特定实施方案仅以实例的方式提供，且本发明应受到随附权利要求以及此类权利要求所赋予的等效方案的全部范围的限制。

实施例

实施例1：派姆单抗的滴式蒸气扩散结晶筛选

在10mM组氨酸(pH 5.6)中制备34mg/ml全长派姆单抗的溶液。在来自HamptonResearch (Aliso Viejo, CA, USA)的MRC 96孔结晶板中实施的坐滴式蒸气扩散实验及来自Rigaku Corporation (Seattle, WA, USA)和Jena Bioscience (Jena, DE, USA)的四种市售高通量筛选中筛选此溶液。每一筛选均由96种独特溶液组成，其概述于下表2中。

表2. 筛选溶液的概述

制造商	筛选名称/目录号	溶液组成
			Rigaku Corp.	Wizard Classic 1 & 2 /EB-W12-B	96种独特条件，主要基于PEG、醇和高盐
Rigaku Corp.	Wizard Cryo 1 & 2 /EB-C12-B	96种独特条件，主要基于PEG、醇和高盐
			Jena Biosciences	JB Screen Classic HTS1 /CS-201L	96种独特条件，主要基于PEG
Jena Biosciences	JB Screen Classic HTS1 /CS-202L	96种独特条件，主要基于高盐

对于每一筛选实验，将派姆单抗溶液(0.2μl)与筛选溶液(0.2μl)混合，并使用来自Douglas Instruments, Inc. (Hungerford, Berkshire, UK)的Oryx结晶机器人将其在板孔中在80μl筛选溶液上分层。针对每一筛选溶液在4℃、18℃和30℃中的每一者下实施实验；因此，总共测试1,152种不同结晶条件。显微镜监测板孔随时间的晶体形成。

3天后仅在以下测试条件之一下观察到晶体：30℃，利用Jena 2 (盐) #91 (100mM Tris-HCl, pH 8.5, 2.0 M磷酸二氢铵)。使用来自Formulatrix (Bedford, MA, USA)的SONICC成像系统显现晶体。SONICC系统具有两种成像方法：二次谐波产生(SecondHarmonic Generation，SHG)，其探测结晶度，和紫外线双光子激发荧光(Ultraviolet Two-Photon Excited Fluorescence，UV-TPEF)，其对于蛋白性样品是特异性的。观察到晶体的图像显示于图4A(SHG)和图4B(UV-TPEF)中。

实施例2：派姆单抗的自由界面扩散结晶筛选

基于仅在实施例1中在30℃下形成的晶体，选择此温度使用自由界面扩散技术进一步研究用于派姆单抗的筛选条件。

在10mM组氨酸(pH 5.6)中且在具有或没有0.02%聚山梨醇酯80下制备具有34mg/ml派姆单抗的抗体溶液，并在来自Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA,USA)的Topaz芯片和结晶器中利用与实施例1中使用的相同筛选溶液进行筛选。在30℃下孵育芯片并使用Fluidigm自动化成像系统用显微镜进行监测。仅在Jena 2 (JenaBioscience) # 91溶液(100mM Tris, pH 8.5, 2.0M磷酸二氢铵)下再次观察到晶体。来自两种不同派姆单抗溶液的观察到的晶体的图像显示于图5A(具有0.02%聚山梨醇酯80的抗体溶液)和图5B(没有聚山梨醇酯80的抗体溶液)中。

实施例3：派姆单抗的微晶种基质筛选

本实施例研究派姆单抗可从接种预存在的派姆单抗晶体的溶液结晶的条件。筛选的沉淀剂溶液是实施例1中所述的相同四种市售筛选物。

从在实施例1中通过合并1μl派姆单抗晶体悬浮液和99μl的1.8M ADP、100mMTris-HCl的稳定溶液(通过混合适当量的2.5M ADP和1M Tris-HCl(pH 8.5)的储备溶液制备)产生的晶体悬浮液(2.0M ADP、100mM Tris-HCl中的派姆单抗晶体)制备派姆单抗晶体的晶种储备物。在10mM组氨酸(pH 5.6)中制备34mg/ml派姆单抗的抗体溶液。在MRC 96孔结晶板(Hampton Research)中实施坐滴式蒸气扩散实验。

对于每一筛选实验，将派姆单抗溶液(0.3μl)与筛选溶液(0.3μl)和0.1μl晶种储备物混合并使用Oryx结晶机器人在板孔中在80μl筛选溶液上分层。针对每一筛选溶液在22℃和30℃中的每一者下实施实验；因此，总共测试768种结晶条件。用显微镜监测板孔随时间推移的晶体，并在1周后从显示于下表3中的5种条件中显微镜观察到晶体。晶体通过SONICC(UV阳性)的显现证实观察到的晶体的内容物为蛋白。

表3. 在接种后产生派姆单抗晶体的滴式蒸气扩散条件。

温度	筛选溶液
		30℃	20% PEG 4K, 20%异丙醇
30℃	18% PEG 10K, 20%甘油, 100 mM Tris, pH 8.5, 100 mM NaCl
		30℃	100 mM TRIS, pH 8.5, 2. M磷酸二氢铵
22℃	25% PEG 4K, 100 mM Tris, 100 mM CaCL<sub>2</sub>
		22℃	1.26 M硫酸铵, 乙酸盐, pH 4.5 / 0.2 M NaCl

实施例4：在ADP/Tris-HCl中蒸气扩散结晶的优化。

为了鉴定适于制备衍射质量晶体的最佳ADP浓度和pH条件，实施以下筛选实验，所述实验检查pH在8.8至9.4之间变化的100mM Tris-HCl和浓度在1.60M至1.74M之间变化的ADP的混合物。相对于在VDX 24孔(6×4阵列)结晶板(Hampton Research)中使用OptiMatrix Maker^TM液体处理系统(Rigaku Corp., Seattle, WA, USA)设计的惯常优化筛选，在悬滴式蒸气扩散实验中设置派姆单抗(34mg/ml,10mM组氨酸，pH 5.6)。对于每一筛选实验，将由1.0μl蛋白+1.0μl筛选溶液组成的悬滴置于22mm盖玻片的下侧上并置于含有1ml筛选溶液的孔上，使得100mM Tris-HCl组分的pH在垂直的4个孔中变化且ADP浓度在水平的6个孔上变化。在30℃下孵育该板并随时间用显微镜监测。图6显示在3天后在100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1.5M ADP筛选溶液中观察到的晶体的显微照片。

实施例5：在ADP/Tris-HCl中派姆单抗的分批结晶。

通过在22℃下将10μl 50mg/ml派姆单抗溶液(10mM组氨酸，pH 5.6)与50μl 120mMTris-HCl(pH 8.5)、1.8M ADP合并来制备结晶混合物。将此结晶混合物置于放置于VDX板(Hampton Research)的孔内侧的Micro-Bridge (Hampton Research)中。该孔含有1ml100mM Tris-HCl (pH 8.5)、1440mM ADP。使用22mm玻璃盖玻片密封该孔并将板在30℃下孵育5天。所得结晶悬浮液的显微照片显示于图7中。观察到在约5微米至至少约20微米范围内的晶体大小。

实施例6：用于优化蒸气扩散结晶条件的添加剂筛选。

在10mM组氨酸(pH 5.6)中制备34mg/ml派姆单抗的溶液。在坐滴式蒸气扩散实验中针对使用Additive Screen HT^TM试剂盒(Hampton Research)制备的96种沉淀剂溶液筛选此派姆单抗溶液。此试剂盒含有96种不同的添加剂溶液。

对于每一添加剂，将80μl含有72μl 1.74mM ADP、100mM Tris-HCl(pH 9.0)的沉淀剂溶液和8.0μl添加剂溶液添加至MRC 96孔结晶板的孔中。将派姆单抗溶液(0.2μl)与孔溶液(0.2μl)混合并使用Oryx结晶机器人(Douglas Instruments)在80μl孔溶液上分层。密封该板并在30℃下孵育并随时间用显微镜监测。在3天至7天后观察到晶体。1周后，在含有以下添加剂之一的Tris、ADP沉淀剂溶液中观察到晶体：(a)3% 1,5二-氨基戊烷二盐酸盐、(b)3%异丙醇或(c)4%丙二醇。然而，在其他93种沉淀剂溶液中的任一者下没有观察到晶体，表明那些溶液中的添加剂阻碍晶体成核或生长。

实施例7：派姆单抗晶体的X射线衍射分析。

使用悬滴技术在30℃下生长全长派姆单抗的衍射质量晶体。将派姆单抗于10mM组氨酸(pH 5.6)(1μl)中的34mg/ml溶液与1.8M磷酸二氢铵、100mM Tris-HCl(pH 8.0)(1μl)合并。在7至60天后收获晶体，并使用于1.5M硫酸铵、0.2M NaCl中的饱和(100%)蔗糖溶液或于1.5M硫酸铵、0.2M NaCl中的35%乙二醇进行低温保护。

在ID-17 (Argonne National Laboratory, Argonne, Ill., USA)处使用同步加速器辐射收集X射线衍射数据，并使用autoPROC (Vonrhein C. 等人, Acta Cryst. D67:293-302 (2011))处理并按比例缩放。从蔗糖保护的晶体获得最好数据集，且延伸至2.28埃(Å)。基于24个数据集，派姆单抗的晶体属于a=63.5至78.9Å、b=110.2至112.2Å、c=262.5至306Å且α=β=γ=90°的P2₁2₁2₁系统。

使用如PHASER中所执行的分子替代程序从X射线衍射数据解析派姆单抗结构(McCoy A.J.等人, J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)))。使用抗IL-23p19 mAb的fab的结构和IgG4 FC结构(PDB条目4C54, Davies A.M. 等人, J. Mol. Biol.: 426(3):630-644 (2014))(其中去除糖和水)作为搜索模型。最初用REFMAC (Murshudov G.N. 等人,Acta Crystall. D53:240-25 (1997))且随后用autoBUSTER (Bricogne G, 等人 BUSTER2.11.5. [Internet]. Cambridge 2011)实施精修。在COOT (Emsley P,等人, Acta Cryst. D66:486-501 (2010))中建立模型。最终模型含有全抗体(两条轻链和两条重链、两条7残基糖链)、5个硫酸根离子和来自低温保护剂溶液的3个蔗糖分子和480个水分子。

说明于图8中的派姆单抗结构是约140Å宽和120Å长的四聚体。Fc结构域在两条链上在CH2结构域在Asn297处糖基化。

实施例8：在磷酸铵混合物中的蒸气扩散结晶。

本实施例研究沉淀剂溶液中除Tris-HCl以外的缓冲剂的用途。在坐滴式蒸气扩散实验中使用96种不同磷酸二氢铵/磷酸氢二铵混合物的筛选基质筛选派姆单抗溶液(34mg/ml抗体，10mM组氨酸，pH 5.6)，其中单碱式组分与二碱式组分的比率变化，但总磷酸盐浓度保持恒定为1.99M。使用Oryx结晶机器人(Douglas Instruments Ltd)，在MRC-2 96孔结晶板(Hampton Research)的孔中将由0.25μl派姆单抗溶液+0.75μl筛选溶液组成的液滴分配于80μl相同筛选溶液上方。在30℃下孵育该板并使用Rock Imager 1000系统(Formulatrix, Bedford, MA)监测。从1至56天观察晶体。在3天后在1.9M ADP、0.09M AHP沉淀剂溶液中观察到的晶体的显微照片显示于图9中。

实施例9：在Tris/ADP中派姆单抗的分批结晶(1ml规模)。

通过在4℃下合并167μl派姆单抗溶液(47mg/ml, 10mM组氨酸，pH 5.5)和833μl沉淀剂溶液(120mM Tris-HCl, pH 8.4，和1.9M ADP)在1.5ml微量离心管中制备抗体混合物。将含有抗体混合物的管在30℃下孵育5天。

实施例10：在Tris/ADP中派姆单抗的分批透析结晶。

在30℃下在DispoDialyzer®中使用30kD分子量截留膜(SpectrumLaboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA USA)针对20ml 100mM Tris-HCl(pH 8.4)、1.9M磷酸二氢铵将200微升派姆单抗溶液(47mg/ml抗体，10mM组氨酸，pH 5.5)透析5天。如实施例11中所述收获结晶悬浮液。

实施例11：从结晶悬浮液制备派姆单抗溶液。

使用ADP/Tris-HCl作为沉淀剂通过合并来自各种蒸气扩散实验的许多液滴获得结晶悬浮液的210μl等分试样，且其含有总共约400mg派姆单抗晶体。在室温下在Fischer牌微量离心机中以5000rpm将等分试样离心5分钟。通过抽吸去除上清液(母液)并将沉淀(派姆单抗晶体)再悬浮于300μl稳定溶液(100 mM Tris-HCl, pH 8.4, 1.9 M ADP)中。在室温下将所得悬浮液在微量离心机中以5,000rpm离心5分钟。通过抽吸去除上清液(洗涤)并将所得沉淀(派姆单抗晶体)再悬浮于500μl溶解缓冲液(10mM组氨酸，pH 5.5)中并在4℃下孵育30分钟。通过在4℃下在微量离心机中以5,000rpm离心5分钟使所得派姆单抗溶液澄清。使用澄清的派姆单抗溶液用于实施例12和13中所述的表征研究。

实施例12和13. 从派姆单抗晶体溶解的派姆单抗的表征。

使用ELISA和大小排阻色谱(SEC)表征以下样品。

样品1：200μl起始派姆单抗溶液(10mM组氨酸中的40mg/ml抗体，pH 5.6)；

样品2：500μl溶解的派姆单抗(从如实施例11中所述的派姆单抗结晶悬浮液获得的再溶解晶体)；和

样品3：500μl 10mM组氨酸(pH 5.6)(缓冲液对照)

在竞争性结合ELISA中测量样品1和2中派姆单抗的生物活性，所述竞争性结合ELISA测量派姆单抗超过PD-L1并结合至固定于ELISA板上的PD-1受体分子的能力。使用上述样品的连续稀释液在恒定浓度的PD-L1存在的情况下生成剂量反应曲线。使用四参数逻辑曲线拟合分析程序确定每一样品的EC50值(展现最大结合的50%的派姆单抗浓度)。通过在SoftMax® Pro 6软件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中应用剂量反应曲线的并行线分析来计算相对功效。以下显示相对于样品1以几何标准偏差和95%置信区间作为几何平均功效报告的样品2的竞争性结合功效。

样品名称	几何平均值% RP(n=4)	%GSD	LCL(95%)	UCL(95%)
					样品1	100	10	86	115
样品2	96	14	78	118

这些结果指示，在竞争性结合ELISA中，一直未结晶的派姆单抗和从结晶派姆单抗悬浮液收获的派姆单抗晶体溶解的派姆单抗具有相当的生物活性。

在环境温度(25℃)下在Waters Acquity UPLC^®系统上使用UP-SEC测定(其采用Waters BEH2000柱(Waters Corp., Milford, MA, USA; P/N: 186005225))实施SEC表征。取样器的温度控制为4℃。使用100mM磷酸钠、100mM NaCl(pH 7.0)作为流动相以0.5ml/min的流速实施分离。运行时间为5分钟，其中A214作为建议的检测波长，且还收集A280。样品1和2中的每一者的分离图分别显示于图10A和图10B中。

本文引用的所有参考文献都通过引用并入，其并入程度如同每一个别出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利均具体且个别地指示通过引用并入一样。通过引用并入的专用阐述(如果存在)包括在说明书内并不以任何方式减弱通过引用并入的此一般阐述。本文中参考文献的引用并非意欲承认该参考文献是相关现有技术，也不意欲构成对该参考文献的内容或出版日期的任何承认。

表4提供序列表中序列的简单描述。

表4

序列标识符

SEQ ID NO:	描述
		1	派姆单抗轻链CDR1
2	派姆单抗轻链CDR2
		3	派姆单抗轻链CDR3
4	派姆单抗重链CDR1
		5	派姆单抗重链CDR2
6	派姆单抗重链CDR3
		7	派姆单抗重链
8	派姆单抗轻链

序列表

<110> REICHERT, PAUL

PROSISE, WINIFRED W.

SCAPIN, GIOVANNA

YANG, XIAOYU

KASHI, RAMESH

STRICKLAND, COREY

<120> 抗人类PD-1单克隆抗体的晶体

<130> 24029

<140> 62/121867

<141> 2015-02-27

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体轻链CDR

<400> 1

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体轻链CDR

<400> 2

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体轻链CDR

<400> 3

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体重链CDR

<400> 4

Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体重链CDR

<400> 5

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体重链CDR

<400> 6

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体重链

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 8

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化轻链

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.抗PD-1单克隆抗体的晶体，其中所述抗PD-1单克隆抗体是派姆单抗，并且所述晶体的特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群。

2.根据权利要求1的晶体，其中所述晶体的特征在于具有以下范围内的长度：1微米至200微米。

3.根据权利要求1或2的晶体，其能够将X射线衍射至2.3Å至3.5Å的分辨率。

4.根据权利要求3的晶体，其能够将X射线衍射至2.3Å至3.0Å的分辨率。

5.根据权利要求4的晶体，其能够将X射线衍射至2.3Å至2.75Å的分辨率。

6.根据权利要求5的晶体，其能够将X射线衍射至2.3Å至2.5Å的分辨率。

7.根据权利要求6的晶体，其能够将X射线衍射至2.3Å的分辨率。

8.产生抗PD-1单克隆抗体的晶体的方法，其中所述抗PD-1单克隆抗体是派姆单抗，并且所述晶体的特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群，且所述方法包括使包含所述抗PD-1单克隆抗体的溶液在27℃-33℃的温度下暴露于沉淀剂溶液持续至少3天以形成晶体，其中所述沉淀剂溶液具有4.0至5.0的pH且包含1.5M至2.0M磷酸二氢铵，其中所述暴露的步骤包括混合所述抗PD-1单克隆抗体溶液和所述沉淀剂溶液以形成结晶混合物并将结晶方法应用至所述混合物，其中所述结晶方法选自：悬滴式蒸气扩散、坐滴式蒸气扩散和分批法，其中所述抗体溶液包含浓度为30mg/ml至70mg/ml的所述抗PD-1单克隆抗体。

9.根据权利要求8的方法，其中所述产生抗PD-1单克隆抗体的晶体的方法是分批法且所述方法进一步包括用所述抗PD-1单克隆抗体的晶体对所述结晶混合物接种。

10.根据权利要求8的方法，其中所述沉淀剂溶液具有4.2至4.8的pH。

11.根据权利要求10的方法，其中所述沉淀剂溶液具有4.4至4.6的pH。

12.根据权利要求11的方法，其中所述沉淀剂溶液具有4.5的pH。

13.根据权利要求8的方法，其中所述抗体溶液包含浓度为40mg/ml至60mg/ml的所述抗PD-1单克隆抗体。

14.根据权利要求13的方法，其中所述抗体溶液包含浓度为50mg/ml的所述抗PD-1单克隆抗体。

15.产生抗PD-1单克隆抗体的晶体的方法，其中所述抗PD-1单克隆抗体是派姆单抗，并且所述晶体的特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群，且所述方法包括使包含所述抗PD-1单克隆抗体的溶液在27℃-33℃的温度下暴露于沉淀剂溶液持续至少3天，其中所述沉淀剂溶液包含(a)1.5M至2.0M磷酸二氢铵和100mM至120mM Tris-HCl或(b)1.9M磷酸二氢铵和0.09M磷酸氢铵，并且具有4.0至5.0的pH，其中所述暴露的步骤包括混合所述抗PD-1单克隆抗体溶液和所述沉淀剂溶液以形成结晶混合物并将结晶方法应用至所述混合物，其中所述结晶方法选自：悬滴式蒸气扩散、坐滴式蒸气扩散和分批法。

16.根据权利要求8至15中任一项的方法，其中所述暴露的步骤实施至少4天。

17.根据权利要求16的方法，其中所述暴露的步骤实施至少5天。

18.使抗PD-1单克隆抗体从包含所述抗PD-1单克隆抗体的溶液结晶的方法，其中所述抗体是派姆单抗，且所述方法包括：(a)合并所述抗PD-1单克隆抗体溶液与沉淀剂溶液和所述抗PD-1单克隆抗体的晶种，以产生接种的结晶混合物；(b)在27℃-33℃的温度下孵育所述接种的结晶混合物；和(c)收获所述晶体，其中所述晶种来自通过权利要求8至17中任一项的方法产生的所述抗PD-1单克隆抗体的晶体的晶种储备物，其中所述沉淀剂溶液包含(a)1.5M至2.0M磷酸二氢铵和100mM至120mM Tris-HCl或(b)1.9M磷酸二氢铵和0.09M磷酸氢铵，并且具有4.0至5.0的pH。

19.药物组合物，其包含：(a)抗PD-1单克隆抗体的晶体，其中所述抗体是派姆单抗，并且所述晶体的特征在于a=63.5Å至78.9Å、b=110.2Å至112.2Å、c=262.5Å至306Å、α=90°、β=90°、γ=90°的晶胞尺寸和P2₁2₁2₁的空间群；和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。

20.根据权利要求19的组合物，其中所述抗PD-1单克隆抗体晶体悬浮于液体中且所述组合物中抗PD-1单克隆抗体浓度为至少50mg/ml。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述组合物中抗PD-1单克隆抗体浓度为至少100mg/ml。

22.根据权利要求21的组合物，其中所述组合物中抗PD-1单克隆抗体浓度为至少200mg/ml。

23.根据权利要求22的组合物，其中所述组合物中抗PD-1单克隆抗体浓度为至少250mg/ml。

24.根据权利要求19的组合物，其为固体。

25.根据权利要求19至24中任一项的药物组合物在制备用于治疗人类主体的癌症的方法的药物中的用途，其中所述方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求19至24中任一项的药物组合物，并且其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、头和颈鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞型大B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或小淋巴细胞性淋巴瘤。

26.根据权利要求25的用途，其中所述药物组合物包含至少200mg/ml的所述单克隆抗体，且皮下施用。

27.根据权利要求25的用途，其中所述癌症是实体瘤，并在第一次施用所述药物组合物之前，从所述主体移除的所述癌症的组织切片对于PD-L1和PD-L2中的一者或两者的表达测试为阳性。

28.根据权利要求25的用途，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。